Technion - Israel Institute of Technology
© Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library תוכן העניינים תקציר 1 מבוא 3 הסרטן בממלכת בעליהחיים 3 גנים וסרטן 3 מה ניתן ללמוד מהדרוזופילה על הסרטן? 4 גנים מדכאי גידולי מוח בדרוזופילה 6 התפתחות תקינה של דרוזופילה 8 התפתחות תקינה ומוטנטית של המערכת העצבית בדרוזופילה 8 ,bratגן מדכא גידול במות הדרוזופילה 9 מטרות המחקר חומרים ושיטות מצעי גידול 10 11 11 מצע גידול לחיידקים 11 מצע גידול לזבובים 11 זני זבובים 11 בידוד של רוורטנטים חיים 12 הרכבת מפת הגן brat 12 אנליזת רצף לאללים מוטנטים של brat 13 הפקת RNAותספיג 14 הפקת RNAמעוברים ,זחלים וזבובים 14 הפקת ה RNA 15 (northern) RNAPOtm 15 העברת ה RNAלממברנה 16 הכנת גלאי DNAרדיואקטיבי 16 הברידיזציה עם גלאי המסומן רדיואקטיבית 16 אנליזת insitu RNA * ^ ( 17 הכנת העוברים 17 קיבוע עם פרפורמאלדהיד 17 /9 טיפול מקדים 18 ( הברידיזציה 19 *י' שטיפות 19 ן צביעה עם נוגדנים 20 קיבוע של עוברים 20 קיבוע של רקמות הזחל 20 צביעת נוגדנים של עוברים ורקמות הזחל 21 חשיפת הפעילות של /^galactosidaseברקמות הזחל 22 סריקת twohybridבשמרים 22 זן השמרים 22 פלסמידי ביטוי של brat 22 nnrmהפלסמיד הראשון לשמרים 23 הפקת חלבונים משמרים 23 סריקת הספרייה 24 בדיקה עלידי הרמה בפילטר 24 הפקת פלסמידים משמרים 25 אנליזת קישור לקולונת087 25 הכנת האיחויים ל GST 25 הפקת החלבונים 26 הכנת הפלסמידים לראקציית התיעתוק/תרגום במבחנה 26 תיעתוק/תרגום במבחנה וקישור 27 חלבונים מ E. coli 27 UASbrat 28 הכנת תמצית יצירת זבובים טרנסגנים ל סכימה כללית 28 הזרקת DNAלעוברים 29 טיפול שלאחר ההזרקה 29 תוצאות 31 היפוך הפנוטיפ של bratע''י הוצאת הטרנספוזון 31 הלוקוס של brat 32 החלבון Brat 34 משפחת הגנים של brat 34 אופי המוטציות ב brat 35 ביטוי הגן brat 36 bratמתבטא במערכות העצבים המרכזית וההיקפית בעובר 37 © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library צביעה 19 <■/ *י. ך י * * סריקה אתר חלבונים תאיים המגיבים עם החלבון Brat 39 חשיפת הקלונים החיוביים מהסריקה התלויים בביטוי של Bratהיברידי 40 הסריקה השנייה והקלונים החיוביים שלה 41 קלון אחד מקודד ל Pavarotti לחלבון הדומה ל קינזין מיטוטי ,ואילו ארבעה קלונים מקודדים NuMA 43 Pavנקשר באופן עצמאי גם לאזור ה Bboxesוגם ל /?propellerשל Brat במבחנה 43 הביטוי של pavבמהלך ההתפתחות העוברית דומה לזו של bratכשהביטוי מכוון בעיקר לרקמות עצביות 44 ביטוי אקטופי של bratגורם לפגיעה בהתרבות והתמיינות של התאים 45 ביטויייתר של Bratגורם לצמצום רקמות העין והכנף בבוגר 45 ההשפעה של ביטוי מאוחר של Bratעל התפתחות הדיסקים 47 דיון 49 שיבוט הגן brat 49 שלושה מוטיביקישור לחלבון ב Brat 49 אזור ה /?propellerנחוץ לפעילותו של Bratבדיכוי הגידול 50 משפחת החלבונים של Brat 51 הביטוי של bratבמהלך ההתפתחות 53 מתי דרושה פעילות דיכוי הגידול של ?Brat 54 שני חלבונים שהגיבו קושרים את Bratלמערכת המיטוטית של התא 54 תבנית הביטוי של pavבמהלך האמבריוגנזה דומה מאוד לזו של brat 56 ביטויייתר של Bratגורם לפנוטיפים של פגיעה בגדילה והתמיינות הרקמות 57 מהי המטרה של האינטראקציה ?BratPav 59 Bratפועל כנראה במסלול העברת סיגנל חדש 61 רשימת ספרות 64 תקציר )עברית( 1 © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library הביטוי של bratבזחל בשלב שלישי 38 A יי © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library רשימת התמונות והטבלה יי'. תמונה .la 13 תמונה .1 28 תמונה .2 9 תמונה .3 32 תמונה .4 33 תמונה .5 34A תמונה .6 35A תמונה .7 36 תמונה .8 37A תמונה .9 38A תמונה .10 39A תמונה .11 41A תמונה .12 43A תמונה .13 44A תמונה 14 45 תמונה .15 46A תמונה .16 46B תמונה .17 48 תמונה .18 48 תמונה .19 63 1 טבלה .1 40A 1 מחלת הסרטן נובעת ,בין השאר ,מכשל בהתקדמות לקראת התמיינות תקינה ו/או שימורו של המצב הזה ,המושג באמצעות תוכנית מתואמת מבחינה זמנית ומרחבית של שיפעול ואישיפעול של גנים .האחראים לטומורוגנזה מתחלקים לשתי קבוצות ידועות שונות של גנים .אונקוגנים רטרוווירלים דומיננטים וגנים מדכאי גידול ) (tumor suppressor genesהמובילים לטומורוגנזה כשהם במצב מוטנטי ורק לבניאדם אלא מתרחשת בכל החברים בממלכת החיות ,החל במטזואה הפרימיטיבים ביותר דרך חסרי התוליות כמו זבובהפירות דרוזופילה ועד לבעליהחוליות .הודות לירושה של יותר מ 80שנות לימודי גנטיקה ואמבריולוגיה קלאסיים בדרוזופילה שעיצבו טכניקות מחקר מדויקות מאוד בעלות עצמה רבה ,מהווה הדרוזופילה מערכת מודל טובה למחקר ולימוד של מנגנונים גנטיים המבקרים את התרבות התא והתמיינותו. רציסיבי .נאופלסיה אינה מוגבלת אך למעשה ,הגן הראשון שהתגלה כגורם נאופלסיה ממאירה במצבו המוטנטירציסיבי הוא lethal(2)giant larvae ) (l(2)glשל הדרוזופילה מלנוגסטר .מוטנטים ב trnriDn l(2)glנוירובלסטומות וגידולים במוחות ובדיסקים האימגינלים של הזחל ,בהתאמה. ניתן לחלק את הגידולים בדרוזופילה לשתי קטגוריות גסות עלפי הפנוטיפ אותו הם מציגים :נאופלסיה והיפרפלסיה .למרות שבמספר אברים ,כמו ההמיספרות של המוח ,הדיסקים האימגינלים ואברים השייכים למערכת ההמטופוייטית ,נמצאו גידולים משני הסוגים ,ניתן להבחין בהבדלים המורפולוגיים בין שני הסוגים בעיקר בדיסקים האימגינלים .הנאופלסיה בדיסקים האימגינלים מאופיינת בריבוי מסיבי של התאים ההורסים את המבנה החדשכבתי של כל דיסק ,חלק מהדיסקים מתאחים והופכים למסה אמורפית אחת גדולה .התאים מאבדים את מבנם כמלבנים קוטביים והופכים למבנה קוביתי .ניתן לסכם את מאפייני הנאופלסיה בדרוזופילה והמשותפים לנאופלסיה בבעליחוליות כך (1) ,ריבוייתר של התאים (2) ,שינוי מורפולוגי של התאים (3) ,איבוד היכולת להתמיינות (4) ,חדירה של התאים לרקמות בריאות ) (5יכולת נאופלסטית לאחר השתלה במארת .בנוסף, בדומה לגידולי מוח ביונקים שכמעט שאינם בעלי אופי של שליחת גרורות לאברים שמחוץ למוח ,גם גידולי המוח הנאופלסטים בדרוזופילה שנצפו במוטנטים של (brat) brain tumorו Iglחודרים לרקמות שאינן מתחלקות במוח אך אינם שולחים גרורות לאברים שמחוץ למוח .אולם בשני המקרים ,לאחר השתלת הגידולים במארת הם שולחים גרורות חודרניות מאוד לאברים שונים .מאפיינים אלו עוזרים להבחין בנאופלסיה בדרוזופילה ,אולם רק חלק מהגידולים מכילים את כול המאפיינים .היפרפלסיה של הדיסקים האימגינלים ,לעומת זאת ,מאופיינת בריבוי מסיבי של התאים השומרים על מורפולוגיה קוטבית נורמלית כתאים עמודיים .לרוב הדיסקים משוכפלים והופכים לדושכבתיים .בנוסף ,התאים ההיפרפלסטים שומרים על יכולת מסויימת להתמיין ,ומציגים לאחר ההתמיינות תבנית של מבנים קוטיקולרים המאפיינים את תבנית הבוגר .בניגוד לגדילה האגרסיבית בעלת האופי של יצירת גרורות הגורמת למותו של המארח לאחר שהושתלו בו תאים נאופלסטים ,השתלת התאים ההיפרפלסטים במארת אינם גדלים )כמו במקרה של המיספרות המוח או אברים במערכת ההמטופוייטית( או גדלים באופן בינוני )כמו בהשתלת תאי דיסקים אימגינלים היפרפלסטים( .בנוסף תאים היפרפלסטים יוצרים גידולים קומפקטים הנשארים בתוך האבר המקורי ואינם חודרים לרקמות סמוכות .למרות ההבחנות הללו ,בדומה לגידולים בבניאדם ,הסיווג של הגידולים בדרוזופילה סובל מחוסר בסמנים ,מולקולרים או ביוכימיים ,שיהיו קבועים לכל סוג של גידול. J(2)glהגן מדכא הגידול הראשון שזוהה ,הינו גם הגן מדכא הגידול הראשון ששובט .כיום ידועים יותר מ 50גנים מדכאי גידול בדרוזופילה שמתוכם שובטו ואופיינו בין היתר ,את /at J(2)gl lats ,dig ו כ 20 גנים.לפחות לעשרה מהגנים הללו הכוללים, airsנמצאו הומולוגים ממשיים בעכבר או באדם ובמספר גנים אחרים © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library תקציר ץי )/ [ * ו'/ ■ < 11 מוביל לסרקומות של רקמות חיבור וגידולים של תאי הסטרומה בשחלה וכן העכברים היו רגישים מאוד לטיפולים קרצינוגניים .הגן מדכא הגידול האנושי הגורם לסרטן המעי הגס התורשתי והספורדי ,ape ,נקשר ל .hdlgבנוסף ,ישנם רמזים כי חלק מהגנים ההומולוגים הללו עוברים דרגולציה במספר גידולים סרטניים באדם. בנוסף לתפקידם בטומורוגנזה של הגנים מדכאי הגידול בדרוזופילה והתפקידים האפשריים של ההומולוגים להם באדם ,בתקופה האחרונה החלו להיחשף אונקוגנים וגנים מדכאי גידול באדם ,המשתתפים במסלולי סיגנל שמורים מאוד שאופיינו בדרוזופילה .אחד המסלולים השמורים המעניינים ביותר הוא מסלול הסיגנל של Hedgehogו .Patchedמערכת זו ,יחד עם המערכת של Winglessו Frizzledמעורבות בקביעת גורל התא ) (cell identityבדרוזופילה וכן מעורבות בסרטן באדם .מוטציות בהומולוג האנושי של הגן Patched אחראיות למחלה התורשתית המכונה תסמונת ,Gorlinהגורמת לסרטן ממאיר של העור המכונה multiple basal nnpnnn .cell carcinomaעל נתיבי התקשורת הבין והתוך תאיים בדרוזופילה ובבעליחוליות וההקבלה בין המסלולים שופכים אור על המנגנון המולקולרי והביוכימי המוביל לקרצינוגנזה ,בכלל ,ועל ההבנה של מקומם של הגנים מדכאי הגידול ,בפרט ,בתהליך זה. מוטציות רציסיביות בלפחות ארבעה מהגנים מדכאי הגידול בדרוזופילה *™bt M ,dig ,ו bratמובילות לפנוטיפ זהה של נאופלסיה ממאירה בהמיספרות מוח הזחל באזור שיהפוך למרכזים האופטיים של הבוגר. הנאופלסיות הללו מתחילות להראות בשלב הלרוולי השלישוני .המיספרות המוח מגיעות לממדים ענקיים )פי כמה פעמים מגודלם הנורמלי( ולבסוף הזחל מת לפני התגלמותו .מחקרים מולקולרים וביוכימים רומזים כי תוצר הגן של ,l(2)glמשתתף ברשתתקשורת של שלד התא כשהוא מומס בכל הציטופלסמה או קשור לשטחהפנים הפנימי של ממברנת התא הלטרלית באזורים של צמתיתאים .ממצאים אלו רומזים כי tnin Lgl באופן ישיר למבנה ולשימור של הארכיטקטורה התאית ,בעיקר ,שימור קוטביות התא ,ומכאן לכל המבנה הריקמתי .ההומולוג העכברי של ,l(2)glהמכונה ,mgl1בודד בסריקה של חלבונים הנקשרים לחלבוני homeoboxעכברים .ומכאן ש mgl1יכול להיות מבוקר upstreamעלידי חלבוני .homeoboxהגן digמקודד להומולוג של הגן guanylate kinaseמשמרים והינו החלבון הראשון שזוהה כממוקם בצמתים המכונים .(SJ) septate junctionsה SJהינם צמתים בין ממברנות של תאים שכנים בחסריחוליות .מקובל לחשוב שה SJאנלוגים ל tight junctions שבבעליהחוליות מאחר שהם מופיעים באותם מקומות והם חולקים תפקידי הגבלה ומידור דומים .מוטציות מבטלות פעילות ב digגורמות לאיבוד ה ,SJאיבוד הקוטביות apicalbasalשל התא ,איבוד היכולת להתמיין ולבסוף ריבוייתר של תאי הדיסקים האימגינלים .עד היום נמצאו ארבעה גנים הומולוגים שונים ל digבאדם המכונים .hdlgl4החלבון Mbtהינו חלבון גרעיני עשיר בפרולין ומכיל מוטיב חדש של 'אצבע אבץ' .הוא שייך לקבוצת החלבונים מסוג (PcG) Polycombוכנראה מעורב בבקרה של גנים ספציפים עלידי שינוי של מבנה הכרומטין .ההומולוג האנושי שלו ממוקם בכרומוזומים דחוסים בתאים מיטוטיים וכנראה שיש לו תפקיד בהתקדמות תקינה של מעגל חלוקת התא .השיבוט והאיפיון של הגן הרביעי bratהוא נושא מחקר הדוקטורט המוצג כאן. מערכת העצבים של הדרוזופילה שונה ממערכת העצבים הטיפוסית של החרקים בכך שהגנגליונים הבודדים אינם מאורגנים בצורה של קטעיםקטעים ) (segmentsאלא מאוחים למערכת עצבים מרכזית ,המורכבת ממוח דמוי שני חצאיכדור ) (brain hemispheresומגנגליון מורכב ) .(ventral ganglionמערכת העצבים של הזחל מתמיינת בעובר ומורכבת מקליפה תאית חיצונית המקיפה את צבר הנוירונים הממוקמים במרכז .באזור © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library נמצאו מוטיבים המשותפים לגנים בבעליחוליות .לאחרונה הוראה כי השתקה של ההומולוג העכברי של הגן lats ^ ע } < 111 לתת נוירובלסטים גדולים ותאיאם של הגנגליון ) (ganglionmother cellsקטנים יותר .הנוירובלסטים הגדולים נשארים במרכזי ההיווצרות בעוד שתאיהאם של הגנגליון חודרים לחלל שבין שני מרכזי ההיווצרות ויוצרים את הגלומרולי ) (glomeruliהאופטי .כאן תאיהאם של הגנגליון מתחלקים מספר לא ידוע של חלוקות לפני שהם מתמיינים לתאים פרהגנגליונים ולבסוף לנוירונים אופטיים. זחלים מוטנטים הוונטרלי והדיסקים האימגינלים ,נראים נורמלי .אנליזה היסטולוגית מראה שגדילתהיתר של המוח ממוקמת במרכזים האופטיים ,ולייתר דיוק היא נובעת מחלוקה בלתי מבוקרת של נוירובלסטים אופטיים ותאיאם של ל bratבשלב הלרוולי השלישי מכילים המיספרות מוחיות מוגדלות ואילו הגנגליון הגנגליון ,בהתאמה .המיספרות המוח במוטנטי bratיכולות להגיע לממדים ענקיים ,לפעמים פי 0ו מהגודל של מקביליהם הנורמלים .בדומה למוחות מוגדלים של מוטנטי Jglמוטנטי bratגדלים לממדים הענקיים במהלך התארכות חיי הזחל )כלומר מהזמן שבו הזחל הנורמלי אמור להתגלם והלאה( .הנוירובלסטים האופטיים ותאי האם של הגנגליון ,שאינם יכולים להתמיין ,גדלים במוטנטי ה ,(in situ) bratכמו גם לאחר השתלתם בבטן של נקבה בוגרת נורמלית מארחת ) ,(in vivoבאופן חודרני ,ממאיר ולתלי .על אף חוסר המאפיינים הנאופלסטים של דיסקים אימגינלים במוטנטי ,bratגם הם יכולים לשלוח גרורות במארחת. בעבודה זאת שיבטנו את הגן ,bratמאלל של bratששיקף מוטציה שנגרמה כתוצאה מחדירה של טרנספוזון ללוקוס של הגן ,וזיהינו את תוצר הגן brat .מקודד לחלבון באורך 1037 חומצות אמינו ,כאשר בקצהו האמיני ישנו מוטיב של אצבע אבץ מסוג Bboxlואחריו Bbox2ואזור של ,coiledcoilןאילו בקצה הקרבוקסילי ישנו מבנה של /?propellerבעל שישה להבים .כל המוטיבים הללו ידועים כמתווכים של אינטראקציות חלבוןחלבון .אנליזת רצף לארבעה אללים שונים של bratמגלה כי כולם מכילים מוטציות באזור ה yipnn ./?.propellerשל כל המוטציות באזור זה מציע של ז^^קכתק? /תפקיד קריטי בתפקוד התקין של ,Bratוכן הוא מגדיר מוטיב חלבוני חדש המעורב בפעילות של דיכוי גידול .הגן bratמתבטא במערכות העצבים המרכזית וההיקפית בעובר ,כולל במוח העוברי .בזחל בשלב שלישי הביטוי של bratנצפה במערכת העצבים המרכזית של הלרווה ,כולל במוח ובגנגליון הוונטרלי ,בשתי בלוטות ה ring glandוה ,salivary glandובחלק מהמעי הקידמי ה ,gastric caecaesוה .proventirculusבנוסף נמצא וכו נמצאו הומולוגים בנמטודה ,עכבר ,חולדה ואדם. גן חדש בדרוזופילה ההומולוג ל ,brat במערכת של ה twohybridבשמרים בסריקות של ספריית cDNAמדרוזופילה עם 'פיתיונות' שכוללים את שני מוטיבי ה Bboxאו את ה /?propellerשל ,Bratבודדו מספר קלונים חיוביים .אחד ה cDNAsמקודד לקינזין מיטוטי המכונה ,(Pav) Pavarottiהנחוץ לציטוקינזה של תאים מיטוטיים ,ואילו cDNAנוסף מקודד לחלבון חדש בדרוזופילה הדומה לחלבון ,(NuMA) Nuclear Mitotic Apparatusשהינו מרכיב של הכרומוזומים המיטוטיים הנחוץ לאירגון וליציבות של קטבי הכישור משלב מיטוטי מוקדם ועד לתחילת האנאפזה לפחות .אנו הצגנו מספר עדויות נוספות לגבי הקישור של Bratל :Pavראשית ,הראנו במערכת של ה GSTpull downכי Pavהמסומן רדיואקטיבית נקשר פיסית במבחנה גם ל Bboxesוגם ל /?propellerשל .Bratשנית ,תבניות © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library הצידיאוזורי של כל וזציכדור מוחי ישנם בין 13ל 20תאי נוירובלסט המייצגים את המקור למרכזים האופטיים של הבוגר .נוירובלסטים אלו מתחילים להתחלק לאחר בקיעת הזחל מהביצה וממשיכים להתחלק עד לסוף החיים הלרווליים .במהלך השלב הלרוולי הראשון הנוירובלסטים האופטיים הגדולים מתחלקים באופן שווה ויוצרים נוירובלסטים נוספים .בסוף השלב הלרוולי השני הנוירובלסטים נפרדים לשני מרכזים ,מרכז היווצרות פנימי ומרכז היווצרות חיצוני .במהלך השלב הלרוולי השלישי הנוירובלסטים האופטיים מתחלקים באופן בלתי שווה ▼ , י ** © Technion - Israel Institute of Technology, Elyachar Central Library הביטוי של pavבמרחב ובזמן במהלך ההתפתחות העוברית של המערכת העצבית חופפות לאלו של .brat ושלישית ,ביטוי אקטופי של Bratבדיסקיות הבוגר של העיניים והכנפיים מוביל לצמצום גודלם של העיניים ד''' והכנפיים ולפגיעה בהתמיינותם כתוצאה מדיכוי של פרוליפרציה והתערבות אפשרית בסיגנל לקביעת גורל / התאים .אוכלוסיה קטנה של תאים באימג'ינל דיסקים של הכנף המבטאים את Bratבייתר היו גדולים בצורה <*, בלתי רגילה וחלקם הכילו שני גרעינים ,פנוטיפ המזכיר מאוד את הפנוטיפ של .pavהנתונים המצטברים הללו מציעים ש Bratמבקר התרבות והתמיינות של תאים ברקמות עצביות .מאחר שנראה כי Bratנמצא בצומת שבין התרבות התאים לבין התמיינותם ,מפתה לחשוב עליו כ"שומרסף" הקושר ומבקר שלילית אלמנטים מיטוטיים כדוגמת Pavובכך "אומר' לתא "בטוח עכשיו" להיכנס לשלב התמיינותי .לבסוף ,אנו מציעים מודל המאגד את ארבעת הגנים מדכאי הגידול במוח הדרוזופילה ) mbt ,dig Jglו (bratלמסלול סיגנל שמור אחד. ר 4, / ו
© Copyright 2025