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Universidad de Concepción
Dirección de Postgrado
Facultad de Ciencias Biológicas
Programa de Magíster en Ciencias mención Microbiología
Biotransformación de roxarsona por bacterias asociadas
a suelo agrícola y su implicancia en la contaminación de
los sistemas acuáticos.
CARLA GERALDINE LEÓN LEMUS
Profesor Guía: Dr. Víctor Campos Araneda
Dpto. de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad de Concepción
Profesor Co- Tutor: Dra. María Angélica Mondaca Jara
Dpto. de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad de Concepción
CONCEPCIÓN-CHILE
2013
Esta tesis ha sido realizada en el Departamento de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción.
Profesores integrantes Comisión Evaluadora:
______________________________
Dr. Víctor Campos Araneda
Profesor Tutor
Facultad de Ciencias Biológicas
______________________________
Dra. María Angélica Mondaca Jara
Profesor Co-Tutor
Facultad de Ciencias Biológicas
______________________________
Dr. Carlos González Correa
Facultad de Ciencias Biológicas
______________________________
Dr. Roberto Urrutia Pérez
Centro EULA
______________________________
Dra. María Angélica Mondaca Jara
Directora
Programa de Magíster en Ciencias mención
Microbiología
ii
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis sinceros agradecimientos a todos quienes me
apoyaron en esta importante etapa de vida.
Quisiera comenzar con unas palabras de agradecimiento para mi profesor
tutor de Magister, el Dr. Víctor Campos, por su constante apoyo y dedicación.
Además de encontrar un excelente profesor y profesional, lo cual no cabe duda,
encontré una gran persona, capaz de apoyarme, y apoyar a sus alumnos, más allá
de lo académico, cosa no común en el mundo universitario.
También quisiera agradecer a mi co-tutor, a la Dra. María Angélica
Mondaca, por su hospitalidad y ayuda, tanto en lo académico como en lo humano.
Le agradezco por estar siempre dispuesta a ayudarme y a animarme con sus
acertados consejos, los cuales fueron relevantes en mi proceder como
investigador y persona.
A mis compañeros del Programa de Magíster, por sus conversaciones,
manifestaciones de apoyo mutuo y total empatía que hicieron más grata esta
experiencia.
A mis compañeros y amigos del laboratorio de Microbiología Ambiental. En
especial a: Andrea Torres, Guisella Escalante, Víctor Guzmán, Benner
Giacomozzi, Rodrigo Riquelme y Santiago Mafla. Gracias por los buenos y malos
momentos.
Agradezco a mis padres por su amor, preocupación, consejos y su apoyo
incondicional, para que siguiera adelante. A mis queridas hermanas por su
tolerancia durante los días difíciles y a mi sobrino, que alegra cada momento de
nuestras vidas y que hace todo más fácil.
A las instituciones que me apoyaron en el financiamiento de mis estudios de
magister: A la Dirección de Postgrado de la Universidad de Concepción, por
otorgarme la Beca Docente durante el año 2011. Al Programa de Becas de
CONICYT, por otorgarme la Beca Magíster Nacional-2012 y al proyecto
FONDECYT N°1110876.
iii
INDICE GENERAL
Indice de figuras …….. ................................................................................... vi
Indice de tablas ............................................................................................... xi
Resumen ....................................................................................................... xii
Abstract ........................................................................................................ xiv
1. Introducción ............................................................................................... 1
1.1 Roxarsona y su uso en la industria avicola .............................................. 1
1.2 Problemática ambiental asociada al uso de roxarsona ............................ 2
1.3 Biotransformación de roxarsona en el ambiente ...................................... 7
1.4 Biotransformación de arsénico inorgánico ............................................... 9
1.5 Hipótesis ................................................................................................ 12
1.6 Objetivo General .................................................................................... 13
1.7 Objetivos específicos ............................................................................. 13
2. Materiales y métodos ............................................................................... 14
2.1 Toma de muestra ................................................................................... 14
2.2 Experimentos de microcosmos .............................................................. 14
2.3 Evaluación de la biotransformación bacteriana de roxarsona ................ 15
2.4 Detección de ROX y compuestos derivados de su transformación ........ 16
2.5 Detección de la toxicidad de ROX y compuestos derivados de la
biotransformación ........................................................................................ 17
2.6 Detección de la actividad tóxica de roxarsona y compuestos derivados de la
biotransformación en células HUVECs ......................................................... 18
2.7 Perfil metabólico de comunidades bacterianas asociadas a suelos agrícolas
...................................................................................................................... 20
2.8 Caracterización de la comunidades bacterianas asociadas a guano de pollo
y suelo agrícola ............................................................................................. 21
2.8.1 Extracción de ADN desde muestras de suelo y guano de pollo .......... 21
2.8.2 Amplificación del gen ADNr 16S ......................................................... 21
iv
2.8.3 Electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE) ................... 22
2.8.4 Electroforesis en gel de agarosa ......................................................... 24
3. Resultados ............................................................................................... 25
4. Discusión ................................................................................................. 70
5. Conclusión ............................................................................................... 90
6. Proyecciones ........................................................................................... 92
7. Referencias .............................................................................................. 93
v
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Espectrograma de degradación aeróbica de ROX de la muestra
BA…..………..……............................................................................................. 27
Figura 2. Espectrograma de degradación anaeróbica de ROX de la muestra
BA.. .................................................................................................... ..…..…28
Figura 3. Espectrograma de degradación aeróbica de ROX de la muestra
BB........................................................................................................................29
Figura 4. Espectrograma de degradación anaeróbica de ROX de la muestra
BB…. ............................................................................................................ 30
Figura 5. Espectrograma de degradación aeróbica de ROX de la muestra de
agua de pozo .......................................................................................... ..….31
Figura 6. Espectrograma de degradación anaeróbica de ROX de la muestra de
agua de pozo …………………...……………………. …………………..………….32
Figura 7. Cromatograma obtenido por (IP-RP- HPLC), de los compuestos
arsenicales……………………………………………..………………………………33
Figura 8. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de una solución de
roxarsona (0,5mM)………………………………………………………………..…..34
Figura 9. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado
A……………………………………………………………………………………..….34
vi
Figura 10. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado
B……………………………………………………………..………………………….35
Figura 11. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado
C………………………………………………………………………………..……….35
Figura 12. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado
D……………………………………………………………………………...…………36
Figura 13. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de medio
BAA……………………………………………………………………………….…….36
Figura 14. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de medio
BBAN…………………………………...………………………………………………37
Figura 15. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de medio
APAN…………………………………………………………………………………...37
Figura 16. Porcentajes de toxicidad de lixiviados y medios (diluidos y sin diluir),
evaluados mediante el kit Toxi-Chromotest………………………………………..38
Figura 17. Viabilidad celular de HUVEC en presencia de distintos volúmenes de
agua (control) y lixiviado B. ……………………………………….…………………41
Figura 18. Viabilidad celular de HUVEC en presencia de 50 ul de lixiviados
obtenidos en experimento de microcosmos, a 45 días de la aplicación de guano
enriquecido con roxarsona 0,5mM…………………………………………………..42
Figura 19. Viabilidad celular de HUVEC en presencia de 50 ul de medio filtrado
obtenido en experimentos de biotransformación de roxarsona. ………………..44
vii
Figura 20. Respuestas metabólicas promedio de las comunidades microbianas
del estrato aeróbico del suelo en presencia de roxarsona……………………….47
Figura 21. Respuestas metabólicas promedio de las comunidades microbianas
del estrato aeróbico del suelo en presencia de roxarsona……………………….49
Figura 22. Índice de riqueza promedio de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico del suelo incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM), por
45 días………………………………………………………………………………….50
Figura 23. Índice de riqueza promedio de las comunidades microbianas del
estrato anaeróbico del suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5mM), por
45 días. ………………………………………………………………………………...51
Figura 24. Índice H’ promedio de las comunidades microbianas del estrato
aeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM), por 45
días………………………………………………………………………………….….52
Figura 25. Índice H’ promedio de las comunidades microbianas del estrato
anaeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM), por 45
días……………………………………...……………………………………………...53
Figura 26. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
BA, en presencia de roxarsona (0,5mM)...………………………………..………..54
Figura 27. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas
del estrato aeróbico suelo, incubado en presencia de roxarsona (0,5 mM), por
45 días..………………….………………………………………..……………………55
viii
Figura 28. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
BB, en presencia de roxarsona (0,5mM)…………………………..……………….56
Figura 29. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas
del
estrato
aeróbico
suelo,
incubados
en
presencia
de
roxarsona
(0,5mM)…………………………………………………………………...…...……….56
Figura 30. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
CA, en presencia de roxarsona (0,5mM)…..…………………………...………….57
Figura 31. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas
del estrato aeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM)…..57
Figura 32. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
CB, en presencia de roxarsona (0,5mM)………...…………………………………58
Figura 33. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas
del estrato aeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM).….58
Figura 34. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
DA, en presencia de roxarsona (0,5mM)………...…………………………………59
Figura 35. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas
del estrato aeróbico suelo, en presencia de roxarsona……………………...……59
Figura 36. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
DB, en presencia de roxarsona (0,5mM)...…………………………………………60
Figura 37. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas
del estrato aeróbico suelo en presencia de roxarsona……..……………………..61
ix
Figura 38. Perfil de bandas en el gel de gradiente denaturante (DGGE) 40%80%, de muestras de guano y suelo provenientes de las cuatro columnas en
experimento de microcosmos………………………………………………………..65
Figura 39. A) Escalamiento multidimensional del patrón de bandeo obtenidos
mediante DGGE. B) Análisis de similitud (Bray-Curtis) del patrón de bandeo
obtenido mediante análisis del gen ARNr 16s por DGGE………………………..66
x
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Secuencia de partidores y tamaño de los fragmentos amplificados del gen
16S rDNA y región V3 del mismo gen…………………………………………….…..22
Tabla II. Composición de soluciones stock de DGGE………………….……………23
Tabla III. Parámetros físico-químicos de las muestras de suelo……………...……25
Tabla IV. Valores de toxicidad (%) y presencia en porcentajes de las distintas
especies arsenicales………………………………….…………………………………39
Tabla V. Matriz de correlación de Pearson entre el porcentaje de toxicidad y la
presencia en porcentajes de compuestos arsenicales………………………………39
Tabla VI. Análisis de las secuencias de ADNr 16S obtenidas por DGGE………...63
Tabla VII. Riqueza (S), índice de diversidad de Shannon-Weaver (H'), índice de
equidad de Pielou (J´) e índice de dominancia de Simpson (1-Lambda') del patrón
de bandas (OTUS), obtenido mediante el análisis del gen ARNr 16S por
DGGE……………………………………………………………………………………..68
Tabla VIII. Valores de Riqueza límite ponderada o capacidad de carga, de las
comunidades bacterianas de las diferentes muestras evaluadas, derivado del
patrón de bandas (OTUS), obtenido mediante el análisis del gen ARNr 16s por
DGGE…………………………………………………………………………………..…69
xi
RESUMEN
El
compuesto
organoarsenical
roxarsona
(ácido
3-nitro-4-
hidroxifenilarsónico) es utilizado como aditivo en la alimentación de pollos de
engorde. La mayor parte de este se excreta sin cambios en las fecas de las aves y
estas contienen entre 14 y 48 mg/Kg de AS. Los agricultores frecuentemente
utilizan las fecas como fertilizante orgánico. Sin embargo, esta práctica contribuye
a la incorporación de cantidades considerables de arsénico a tierras de cultivo. Por
otra parte, se ha descrito que el nivel máximo de As en el agua potable es de 10
μg/L y que la ingesta de agua con concentraciones por sobre este nivel puede
causar cáncer y otros problemas de salud. Roxarsona es altamente soluble en
agua, por lo que se espera pueda movilizarse rápidamente a través del suelo y
contaminar el agua subterránea y superficial. Además, se ha reportado que este
compuesto puede ser biotransformado en el ambiente, en especies arsenicales
inorgánicas de mayor toxicidad. Sin embargo, tanto los microorganismos como los
procesos biológicos involucrados, no han sido identificados.
Bajo este contexto, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar la
biotransformación de roxarsona en diferentes estratos de suelo, en experimentos
de microcosmos. Cuatro columnas fueron implementadas con suelo agrícola y
guano de pollo tratado con roxarsona (0,5mM) (G-ROX): (A) Suelo estéril-G-ROX
estéril; (B) Suelo-G-ROX; (C) Suelo estéril-G-ROX y (D) Suelo-G-ROX estéril. Las
columnas fueron incubadas a temperatura ambiente y oscuridad durante 45 días,
incorporando agua estéril periódicamente (45ml). La comunidad microbiana de la
zona aeróbica (estrato A) y anaeróbica (estrato B) de cada columna fueron
caracterizadas metabólicamente (BioLog Ecoplate) y molecularmente (PCRDGGE). La biotransformación en los diferentes estratos (A y B) fue analizada por
espectrofotometría. Se evaluó la toxicidad de roxarsona y compuestos generados
de la biotransformación mediante el Kit Toxi-chromotest y toxicidad en HUVECs.
Los resultados obtenidos demostraron que en aerobiosis las comunidades
microbianas del suelo, de ambos estratos, son capaces de transformar la
roxarsona (100%). En anaerobiosis solo el estrato B fue capaz de degradar y/o
xii
reducir significativamente la concentración de roxarsona (52,32%). El patrón de
DGGE demostró que existe un efecto significativo sobre las comunidades en
presencia de roxarsona. El perfil metabólico de la comunidad microbiana presente
en el estrato A de todas las columnas mostró diferencias significativas en la
utilización de sustrato. En cambio la comunidad del estrato B no presenta
diferencias significativas entre las columnas B y D. Los resultados obtenidos
mediante toxi-chromotest demostraron que roxarsona y el lixiviado de la columna
control, presentaron porcentajes de toxicidad bajos (7,5 y 11,4%, respectivamente)
y que las muestras de lixiviado de las columnas B, C y D presentaron mayor
porcentaje de toxicidad (36,9-74,2%), detectándose diferencias significativas entre
los estratos del suelo. Por otra parte, los datos demostraron que el porcentaje de
viabilidad celular disminuyó significativamente en relación a la muestra control en
HUVECs expuestas a 50 ul de Lixiviado B, lixiviado C y lixiviado D, a diferencia de
las células HUVECs cultivadas en presencia de roxarsona y lixiviado A, que no
presentan diferencias significativas con respecto a las células control. De lo
anterior, se concluye que la mayor capacidad de asimilación de sustratos que
presentaron las comunidades en las columnas B y D, se correlaciona con una
mayor diversidad bacteriana, en relación a la columna C. La degradación de
roxarsona y la toxicidad de los compuestos generados, están directamente
relacionados con la estructura de la comunidad bacteriana presente en cada
estrato del suelo. Por último, los resultados demuestran que la presencia de
roxarsona modifica la composición estructural y funcional de las comunidades
bacterianas.
xiii
ABSTRACT
Roxarsone (3-nitro-4-hydroxybenzene arsenic acid) is widely used as a feed
additive in the production of broiler chickens. About 70% of broiler chickens are
feed between 23 and 45 g roxarsone ton -1 for controling coccidial intestinal parasite
and sustain rapid growth. Most of the roxarsone is excreted untransformed in
manure, and fresh manure typically contains between 14 and 48 mg arsenic (As)
kg-1. Farmers commonly apply poultry litter as a valuable source of nitrogen,
potassium and phosphorus. This practice, contributes considerable amounts
arsenic to farm fields that can have polluting side effects. The current maximum
contaminant level for As is 10 ugL-1, ingestion of As contaminated water above
this level has been documented to cause cancer and many other health problems.
The goal of this works was evaluate the biotransformation of roxarsone in different
soil layers, in microcosm experiments. Four columns were implemented with
agricultural soil and chicken manure supplement with Roxarsone (0,5mM) (GROX): (A) sterile soil-G-ROX sterile; (B) Soil-G-ROX; (C) sterile soil-G-ROX y (D)
Soil-G-ROX sterile. The columns were incubated at room temperatura and dark,
during 45 days. Water was supplemented periodically. Bacterial community
(aerobic and anaerobic layers) were characterized by means BioLog Ecoplate
(Metabolic analyses) and PCR-DGGE (Molecular analyses). biotransformation
studies, of different layers (A y B), were performed by spectrophotometry. Toxicity
was assessed for roxarsone and biotransformation of compounds generated by
roxarsone by means Chromotest Toxi-Kit and HUVECs analyses. The results
showed that in aerobic conditions, soil microbial communities of both layers (A and
B), are capable of transforming the roxarsone (100%). In anaerobic conditions,
only layer B was capable of degrading and/or reduce the concentration of
roxarsone (52,32%). The pattern DGGE showed that roxarsone a significant effect
on bacterial communities in soil. The metabolic profile of the microbial community,
present in the layer A of all columns, showed significant differences in substrate
utilization. Instead, the community of stratum B showed no significant difference
between columns B and D. The increased carbon availability, mobilization of
xiv
bacterial species present in the manure to the soil and the use of roxarsone as
carbon source, may positively affect indices diversity and richness obtained by
ecoplate Biolog. Moreover, it was observed that after 30 days, significantly reduces
the richness samples DA and DB BB, which may be attributed to the presence of
inorganic arsenic compounds, most toxic to microorganismsThe results obtained
by toxicological Chromotest showed that roxarsone and column leaching control,
showed low toxicity rates (7.5 and 11.4%, respectively) and leachate samples of
the B, C and D columns, show a higher percentage of toxicity (36.9 to 74.2%),
observed significant differences were detected between soil layers. Moreover, the
data showed that the percentage of cell viability decreased significantly compared
to the control sample in HUVECs exposed to 50 ul of B, C and D leachates, unlike
HUVECs cells cultured in the presence of roxarsone and leached, not significant
differences with respect to control cells. It can be concluded that bacterial
communities present in columns B and D, had the highest absorption capacity of
substrates, which correlates with a higher bacterial diversity in relation to column
C. The degradation of roxarsone and toxicity analysis of the compounds
generated, are directly related to bacterial community structure present in every
soil layers. In addition, the results show that the presence of roxarsone modified
structural and functional composition of the bacterial communities.
xv
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Roxarsona y uso en la producción avícola
El compuesto órganoarsenical roxarsona (ácido 3-nitro- 4-hidrofenilarsonico)
fue descubierto por Morehouse y Mayfield en el año 1945, los cuales informaron
su actividad anticoccidial (Calvert, 1975). Desde entonces se convirtió en el primer
compuesto con arsénico aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) de
los Estados unidos, para uso veterinario, al contener la menor concentración de
arsénico (28,5 %) en cada nivel de uso recomendado en la alimentación animal
(Alpharma, 1999).
Roxarsona se utiliza principalmente en la industria avícola en la producción de
pollos de engorde y este es añadido en los alimentos en concentraciones que
varían de 22.7 a 45.5 g/ton (20.6 – 41.3 mg/kg) (Anderson, 1999 & Alpharma,
1999), con el propósito de controlar la coccidiosis, mejorar la eficiencia de la dieta
y la pigmentación de la carne, estimular el crecimiento y aumentar la producción
de plumas y huevos (Anderson, 1999 & Chapman y Johnson, 2000).
La
coccidiosis es un problema real y una de las enfermedades más importantes a
nivel mundial en aves de corral. Es causada por un parásito protozoario
perteneciente al género Eimeria que invade las células del intestino del ave. Las
especies que afectan comúnmente a los pollos de engorde son Eimeria tenella, E.
cervulina, E. necatrix, E. máxima y E. brunetti. La enfermedad se caracteriza por
causar enteritis, diarrea y mortalidad. El ave presenta una reducida capacidad de
absorber los nutrientes, lo que resulta en la pérdida de peso y eventualmente la
muerte (Chapman y Johnson, 2002). Subclínicamente, se manifiesta por un bajo
rendimiento, deteriorada conversión alimentaria y falta de crecimiento. Coccidios
también pueden dañar el sistema inmunológico, dejando a las aves más
vulnerables a patógenos como Clostridium, Salmonella y E. coli. La enfermedad es
considerada como uno de los problemas de salud más severos en aves de corral,
1
generando importantes pérdidas económicas en la industria avícola a nivel
mundial (Alcaíno et al., 2002).
De acuerdo a EVISA (European Virtual Institute for Speciation Analysis)
roxarsona es vendido actualmente en, Canadá, México, Malasia, Indonesia,
Filipinas, Vietnam, Chile, Argentina, Perú, Venezuela, Brasil, Australia, Pakistán y
Jordania. Según la información facilitada por el NCC (Consejo Nacional del Pollo),
la roxarsona es un tratamiento de elección, y no es administrada a la dieta de
pollos orgánicos, que representan sólo el 1% de los 8,7 mil millones de pollos de
engorde que se producen cada año en los Estados Unidos.
Si bien en los Estados Unidos y la Unión Europea se ha prohibido la
utilización de este compuesto desde el año 2011 y el año 1999, respectivamente,
en Chile la elaboración de suplementos alimenticios de animales con roxarsona en
sus formulaciones está normada y su administración está autorizada solo a pollos
en crecimiento (SAG, 2006).
1.2 Problemática ambiental asociada al uso de roxarsona
Diversos autores han reportado que el uso excesivo de fertilizantes
convencionales (especialmente los nitrogenados), puede causar la degradación de
los suelos y la disminución de la calidad de aguas superficiales y subterráneas. En
los últimos años el uso alternativo de abono orgánico a tomado especial
relevancia, y su uso ha sido enmarcado bajo el contexto de una agricultura
sostenible (Caballero et al., 2000). Entre los abonos más utilizados se destaca el
estiércol de pollo, por su alto contenido en nitrógeno y fósforo (Kilonzo et al.,
2007). Además, este aporta contenido de materia orgánica y nutrientes al suelo, lo
que se traduce en un aumento de, la capacidad de retención de agua, la
conductividad y el pH del suelo (Pereyra et al., 2008).
2
En relación a esto, el uso de roxarsona en la alimentación de pollos de
engorde es discutible, ya que este compuesto órganoarsenical es eliminado sin
cambios en las fecas y por lo tanto, tenderá a acumularse en el estiércol de pollo.
Durante la fase de crecimiento, en los 42 días de administración de roxarsona en
la dieta, cada pollo excreta aproximadamente 150 mg del compuesto (Bednara et
al., 2003) lo que equivale a una concentración de 30 a 50 mg/kg de arsénico en el
estiércol (Gambarino et al., 2003). Cuando estos productos se utilizan como
fertilizantes, se aplican a una tasa de 1 a 2 toneladas por hectárea (Garbarino et
al., 2003). Por lo tanto, en un campo de 100 hectáreas, cerca de 10 kilogramos de
arsénico son introducidos al suelo. Sin embargo, en Chile no existe información al
respecto.
En el año 2000, aproximadamente el 70% de los pollos producidos en los
Estados unidos fueron alimentados con roxarsona (Chapman y Johnson, 2002).
De acuerdo con Muir (2001), 8.26 millones de pollos fueron producidos en los
EEUU en ese año. Teniendo en cuenta el porcentaje, alrededor de 5.8 mil millones
pollos fueron alimentados con roxarsona. El resultado final es 9x10 5 kg de
roxarsona, o más específicamente 2.5x10 5 kg de arsénico estaba presente en el
guano de los pollos de engorde (Rutherford et al., 2003). Estudios realizados por
Wershaw et. al. (1999) concluyen que aproximadamente 1x10 6 kg de roxarsona y
sus productos de degradación se suman anualmente al ambiente en todo el
mundo, debido al uso de desechos de pollo como fertilizantes.
Morrison (1969) informó concentraciones de arsénico de 11.8 a 27 ppm en
el estiércol de aves de corral, cuando fueron alimentados con roxarsona. Otro
autores han reportado valores de entre 14 y 47 ppm (Bednara et al., 2003; Arai et
al., 2003; Garbarino et al., 2003 & Rutherford et a.l, 2003). Morrison (1969)
también informo que al analizar muestras de suelo con una historia de aplicación
de desechos de pollo como fertilizante a una tasa de 4 a 6 ton/acr al año por 20
años, se detectaban concentraciones de 15 a 30 mg/kg de arsénico. A pesar que
sus resultados sugieren que la roxarsona no proporcionaría un aporte significativo
3
de arsénico a los suelos o los cultivos, el agua drenada de los suelos tratados con
el guano contenía 0,29 mg/L de arsénico. Esta concentración es significativamente
más alta que el estándar de arsénico para agua potable, el cual fue recientemente
reducido por la EPA a 10 μg/L (0,01 mg/L) (Brown et al., 2005). Estudios
realizados por Garbarino et al. (2003) y Rutherford et al (2003) en la detección de
especies arsenicales en extractos de suelo, revelaron que los suelos tratados con
estiércol de ave contenían 5 a 6 veces más arsénico que los suelos no tratados.
Por otra parte, Morrison (1969) reportó que el 88% del arsénico presente en
el guano de pollo se encuentra como arsénico orgánico (como roxarsona
principalmente). Sin embargo, estudios posteriores han indicado que la roxarsona
es rápidamente transformada en el suelo a especies arsenicales inorgánicas
(Jackson et al., 2003). Hancock et al. (2002) informaron que la forma inicial de
arsénico en las fecas frescas de las aves fue arsénico orgánico. Sin embargo, el
arsénico en el suelo recogido en las cercanías de los campos agrícolas donde se
utilizaba el guano como fertilizante, fue principalmente arsénico inorgánico.
Investigaciones más recientes han documentado que la roxarsona puede
fácilmente lixiviarse de los desechos de aves de corral. Estudios de Rutherford et
al. (2003) reportaron que el 70 al 75% del contenido total de arsénico en el guano
de pollo es soluble en agua. Hancock et al. (2002) encontraron concentraciones de
arsénico de hasta 27 mg/kg en las heces frescas, mientras que el compost del
guano contenía menos de 2 mg/kg de arsénico, lo que sugiere que la lixiviación
del arsénico había ocurrido durante el proceso de compostaje. Por lo tanto, existe
evidencia clara de que la roxarsona puede permanecer en la superficie del suelo,
como también puede ser movilizada por los procesos de lixiviación y escorrentía
hacia estratos más profundos del suelo agrícola, en donde estaría sujeta a sufrir
procesos de biotransformación a compuestos arsenicales inorgánicos más móviles
y tóxicos.
4
Roxarsona se considera un compuesto inofensivo para el hombre. Sin
embargo, es rápidamente transformada durante el compostaje y almacenaje del
estiércol (Garbarino et al., 2003) y su aplicación como fertilizante en los suelos
agrícolas (Christen, 2001; Jackson et
al., 2003). Entre los productos de la
transformación de roxarsona se incluyen compuestos inorgánicos, como arseniato
(As+5) y arsenito (As+3), así como una variedad de compuestos arsenicales
orgánicos. Sin embargo, no todos los productos de degradación han sido
identificados. Por otra parte, los compuestos arsenicales inorgánico y arsenicales
metilados producto de la transformación de la roxarsona podrían constituir un
riesgo significativo en la salud (Ahmal et al., 2000; Del Razo et al., 2001 &
Tchounwou et al., 2004).
La toxicidad del arsénico está bien establecida y no sólo depende del
estado de oxidación (-3, 0, +3, +5), sino también de su especiación, siendo más
tóxicas las especies inorgánicas. Arsenito (As +3) es de 20 a 100 veces más tóxico
que el Arseniato (As+5) en ambientes marinos (Neff, 1997 & Lin et al., 2008) y 60
veces más tóxico en humanos (Ferguson y Gavis, 1972 & Rahman et al., 2005). El
As (V) es un agente carcinógeno reconocido y la concentración máxima permitida
en el agua, de acuerdo con USEPA, es de 10 ug/l (USEPA, 2001). En la Unión
Europea, los niveles de arsénico en el agua no deben superar los 10 μg/L (CEE,
1998), en el caso de Chile la Normativa permite el consumo de agua con
concentraciones de 50 µg/l (Norma chilena oficial 409/1.Of. 84).
El arsenito (As III) se une a los grupos sulfhidrilo (-SH) de las proteínas, por
los cuales tiene una alta afinidad. Lo que produce una modificación en la
estructura y función de las proteínas y por consiguiente una alteración en los
procesos metabólicos celulares (Kaltreider et al., 2001). La unión de compuestos
As (III) con grupos sulfhidrilo, tienen el potencial para influir en la captación celular
de la glucosa, la gluconeogénesis y la oxidación de ácidos grasos.
5
El arseniato (As V), al ser un análogo del fosfato, entra a la célula por medio
de vías específicas para el transporte de fosfatos, inhibiendo la fosforilación
oxidativa. A pesar de que el As (V) no interactúa directamente con el ADN, los
efectos indirectos del As (V) pueden crear una alteración de la expresión génica, a
través de la interrupción de la metilación del ADN, la inhibición de la reparación del
ADN, del estrés oxidativo, o la alteración de la modulación de las vías de
transducción de señales (Rosen & Zijuan, 2009)
Los humanos pueden estar expuestos al arsénico a partir de una variedad
de fuentes en el ambiente, incluyendo alimentos, agua potable y el aire (Borum y
Abernathy, 1994). Después de la ingestión y la absorción, la mayoría de arsénico
inorgánico se elimina rápidamente de la sangre (vida media de una a dos horas).
Aproximadamente el 40 al 70% del arsénico que es absorbido y metabolizado, se
excreta en 48 horas. A través de análisis de orina, se ha informado que el ácido
monometilarsónico (MMA) y el ácido dimetilarsínico (DMA), son fácilmente y
rápidamente absorbidos (75-85%) a través del tracto gastrointestinal (Buchet et al.,
2000).
Los signos de las enfermedades crónicas con exposición a largo plazo a
bajas concentraciones de arsénico son, decoloraciones de la piel, indigestión
crónica, y calambres en el estómago. La exposición a largo plazo puede producir
cáncer de piel, pulmón, riñón, hígado y otros tipos de cáncer (Chappell et al.,
1994), daño cardiovascular (Wang et al., 2002), depresión del sistema
inmunológico (De la Fuente et al., 2002) y una variedad de otras enfermedades
(Frankerberger, 2002).
Bajo este contexto, la fertilización de suelo agrícola con estiércol de pollo
implicaría un probable transporte de especies arsenicales desde el estiércol al
suelo, con el consecuente impacto en la salud de las personas. Por otro lado,
también existe el riesgo de contaminación con arsénico del agua de consumo,
tales como aguas superficiales o subterráneas.
6
1.3 Biotransformación de roxarsona en el ambiente
Desde el punto de vista de la salud humana, la roxarsona es relativamente
inofensiva. Al ser menos tóxica que las formas inorgánicas de arsénico, el arsenito
[As (III)] y el arseniato [As (V)]. Sin embargo, la roxarsona puede ser transformada,
en el suelo en estas especies arsenicales inorgánicos, generando un problema de
salud pública, debido a la toxicidad que poseen estos compuestos (Stolz et al,
2007 & Chapman y Johnson, 2002). A pesar de que algunos estudios sugieren
que la roxarsona es transformada desde especies arsenicales orgánicas a
especies arsenicales inorgánicas, por
procesos bióticos mediados por
microorganismos del suelo, pocos estudios han examinado las posibles vías de la
biotransformación.
Wershaw et al (1999), reporto que la roxarsona se excreta sin cambios en
las fecas de las aves de engorde. Sin embargo, los investigadores detectaron un
compuesto producto de la biotransformación de la roxarsona denominado ácido 3amino-4-hidroxifelarsónico en la orina de pollos alimentados con roxarsona.
La roxarsona sufre una serie de reacciones tanto aeróbicas, como
anaeróbicas en el ambiente que la transforman a compuestos arsenicales
orgánicos e inorgánicos (pentavalente y trivalente). Cortinas et al. (2006) encontró
que los compuestos derivados del ácido fenilarsónico se transforman en As (III)
bajo condiciones reductoras. Stolz et al. (2007) reportaron que bajo condiciones
anaeróbicas, el anillo bencénico estructural de la roxarsona se oxida en primer
lugar, liberándose el compuesto inorgánico trivalente H 2AsO3-. Además, estos
autores no encontraron evidencia de la degradación de roxarsona en arsénico
orgánico bajo condiciones aérobicas.
Wershaw et al. (1999) informaron que la biodegradación microbiana de
compuestos aromáticos se produce de la siguiente manera: N- y O- desmetilación,
hidroxilación y deaminación, seguido de la fisión del anillo aromático, el
7
acortamiento de la cadena y la remoción oxidativa de los sustituyentes. Los
autores
plantearon que si la roxarsona fuese objeto de esa secuencia de
reacciones, se podría obtener el ácido arsenoalquil y este compuesto podría ser
convertido a alquilarsina, la cual es estable bajo condiciones anaeróbicas. Bajo
condiciones aeróbicas, metilarsinas
pueden ser oxidadas a AsO 43- (Cortinas et
al., 2006).
Entre los posibles mecanismos de biotransformación de la roxarsona, la
reducción del grupo nitro, la fisión oxidativa del anillo aromático y la ruptura del
enlace C-As, han sido mencionados y por lo tanto, los productos de la
biodegradación
de
la
roxarsona
pueden
ser
el
ácido
3-amino-4-
hidroxifenilarsónico, metilarsinas y AsO2-4 (Garbarino et al., 2003). Garbarino et al.
(2003) plantearon la hipótesis de que en un ambiente anaeróbico, las
comunidades bacterianas pueden reducir el arseniato a arsenito y el metilarseniato
a dimetilarseniato.
Los resultados de las investigaciones de Stolz et al. (2007), Cortinas et al.
(2006),
y
Wershaw
et
al.
(1999)
indicaron
que
el
ácido
3-amino-4-
hidrofenilarsónico, el ácido Monometilarsónico (CH 5AsO3; MMA (V)), el ácido
Monometilarsonoso (CH4AsO2; MMA (III)), el ácido dimetilarsínico (C2H7AsO2;
DMA (V)), el ácido Dimetilarsinoso (C2H7AsO; DMA (III)), el óxido de Trimetilarsina
((CH3)3AsO; OTMA (V)), Trimetilarsina ((CH3)3AS; TMA (III)), AsO43-, H2AsO3-, así
como otros compuestos de As (III) podrían ser los posibles productos de
degradación de roxarsona.
En experimentos de laboratorio que simulaban los efectos de los procesos
biológicos aeróbicos que podría sufrir la roxarsona presente en el guano de pollo,
cuando es incorporada al suelo. Garbarino et al. (2003) encontraron que
al
compostar una mezcla de guano y agua a 40 ° C, el arsénico presente el guano se
transformó de arsénico orgánico a As (V) en 30 días. Por otra parte, al aumentar la
cantidad de agua adicionada,
se observó un aumento significativo de la
8
degradación de la roxarsona. Por otra parte, los autores no pudieron detectar
transformación de roxarsona tras esterilizar las muestras por calor, lo que indicaría
que procesos bióticos estarían directamente involucrados en la degradación de la
roxarsona. Sin embargo, en este estudio no se procedió al aislamiento de los
microorganismos responsables de la biotransformación de roxarsona. Stolz et al.
(2007) aislaron e identificaron bacterias del género Clostridium que tenían la
capacidad de transformar roxarsona a arsénico inorgánico en condiciones
anaeróbicas.
Las principales especies arsenicales obtenidas desde análisis de extractos
de lixiviado de guano de pollo son, la roxarsona y As (V). Sin embargo, pequeñas
cantidades de As (III), ácido dimetilarsínico (DMA), ácido Monometilarsónico
(MMA), ácido 3-amino-4-hidroxifenilarsónico han sido detectadas (Garbarino et al.,
2003; Rutherford et al., 2003; Jackson et al., 2003; Cortinas et al., 2006 & Stolz et
al., 2007).Ya que el As (V) es uno de los principales productos de la
transformación de la roxarsona y es una forma más soluble y móvil de arsénico
que la roxarsona, es probable que se adsorba a los componentes del suelo, lixivie
hacia aguas subterráneas o que por escorrentía llegue hacia las aguas
superficiales (Rutherford et al., 2003). Lo que implicaría un potencial riesgo de
contaminación con arsénico del agua de consumo humano.
1.4 Biotransformación de arsénico inorgánico
La biotransformación bacteriana del arsénico inorgánico incluye, la
reducción de As (V) a As (III) y la oxidación de As (III) a As (V). Estas
transformaciones están catalizadas por enzimas especificas ubicadas en el
citoplasma, en el caso de la reducción del As (V) y en el espacio periplásmico en
el caso de la oxidación del As (III).
9
La reducción del As (V) se ha descrito como un mecanismo de resistencia
al arsénico y esta mediado por la presencia del operon ars. El operón ars del
plásmido R733 de Escherichia coli comprende arsA, arsB, arsC, arsD y arsR,
mientras que el locus cromosómico sólo arsB, arsC y arsR (Martin et al., 2001). Un
residuo de cisteína, cerca de la región N-terminal de ArsC se une el arseniato, el
cual es transformado a As (III) con los electrones donados por el glutatión
reducido. As (III) es expulsado desde el citoplasma a través de un transportador
de arsenito ATP- dependiente de formado por ArsAB (Martin et al., 2001 & Silver y
Phung, 2005).
El operón ars en el plásmido pI258 de Staphylococcus aureus contiene sólo
arsB, arsC, arsD (Ji et al. 1994). En este caso, la tiorredoxina reducida provee los
electrones para reducir el As (V), y el arsenito es expulsado de la célula a través
del transportador ATP- independiente ArsB (Ji et al., 1994).
El reciente descubrimiento de bacterias anaerobias heterotróficas capaces
de utilizar el arseniato como aceptor terminal de electrones en la cadena
respiratoria, y por ende como sustrato de soporte, resulta de gran interés. Este
mecanismo es independiente del operon ars y corresponde al sistema arr.
Se han aislado diversas cepas bacterianas
con este potencial y
actualmente se sabe que las bacterias utilizan una enzima denominada arseniatoreductasa, para reducir el arseniato a arsenito, unido a la oxidación de sustratos
orgánicos o de hidrógeno, que en última instancia dan por resultado la producción
de energía, que puede ser utilizada por la bacteria (Ahmann et al.., 1994). El
operón arr a diferencia del operón ars, es relativamente pequeño, ha sido descrito
en la cepa ANA-3 (Shewanella sp.) y se encuentra formado por los genes arrA y
arrB (Afkar et al., 2003 & Simon y Phung, 2005)
La arseniato-reductasa (asociada a la cadena respiratoria anaeróbica), es
una enzima heterodimérica periplásmica soluble que se encuentra unida a la
10
membrana interna y constituida por dos subunidades: una subunidad catalítica
mayor, codificada por el gen arrA, formada por un centro rico en molibdeno y un
grupo de alto potencial [4Fe-4S] ; y una subunidad menor con un centro [Fe-S],
codificada por el gen arrB. La subunidad arrA, contiene un sitio de unión para el As
(V), permitiendo así, su reducción; mientras la subunidad arrB, es la encargada de
acoplar esta acción a la cadena respiratoria (Simon y Phung, 2005).
Otro mecanismo de resistencia a este metaloide es la oxidación microbiana
de As (III) a As (V), la que también puede afectar la movilidad y la especiación del
arsénico en el ambiente (Ehrlich, 2002). Los organismos capaces de realizar este
proceso
son
fisiológicamente
diversos,
e
incluyen
a
heterótrofos
y
quimiolitoautótrofos oxidantes de arsenito. La oxidación heterotrófica de As (III), se
ve como una reacción de detoxificación, que convierte el As (III), ubicado en el
exterior de la membrana celular, en As (V), menos tóxico para la bacteria (Stolz et
al., 2002). En la cepa bacteriana ULPAs1 (Weeger y et al., 1999) se han
identificado dos genes (aox A y aox B) que codifican la enzima arsenito- oxidasa
(heterodímero miembro de la familia de las DMSO reductasas) necesaria para la
oxidación de As (III) (Croal et al., 2004).
El arsénico, ha sido considerado uno de los elementos más tóxicos, que
afectan a millones de personas en todo el mundo. El estudio será útil para
identificar los productos y mecanismos de las comunidades bacterianas,
involucrados en la biotransformación de roxarsona en el suelo, como también
acceder a un mejor entendimiento del ciclo de la roxarsona en el suelo.
11
1.5. HIPÓTESIS DE TRABAJO
Los agricultores frecuentemente utilizan el guano de pollos de engorde
producto de la industria avícola, como fertilizante. Este guano contiene entre 14 y
48
mg/Kg
de
arsénico,
producto
de
la
incorporación
del
compuesto
órganoarsenical roxarsona en la dieta de estas aves. La roxarsona en el guano es
altamente soluble en agua y por lo tanto, es fácilmente movilizada hacia los
estratos más profundos del suelo. Estudios previos han demostrado que la
roxarsona es rápidamente biotransformada por los microorganismos del suelo a
compuestos arsenicales orgánicos e inorgánicos, de mayor movilidad y toxicidad
como: arseniato (As+5), arsenito (As+3), o dimetilarseniato. Los compuestos
arsenicales inorgánicos y algunos compuesto arsenicales metilados, han sido
ampliamente estudiados por representar un importante riesgo para la salud
humana y para el ambiente.
La investigación propuesta en este trabajo plantea la siguiente hipótesis:
Las comunidades bacterianas asociadas en diferentes estratos del suelo,
transforman la roxarsona presente en el guano de pollo, en compuestos altamente
solubles y tóxicos, los cuales pueden ser fácilmente movilizados hacia diferentes
cuerpos de agua.
12
1.6 OBJETIVO GENERAL
Establecer las comunidades bacterianas asociadas a diferentes estratos del suelo,
que transforman la roxarsona en compuestos de mayor movilidad y toxicidad.
1.7 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar la transformación de roxarsona, por poblaciones bacterianas
asociadas
a
diferentes
estratos
del
suelo,
en
experimentos
de
microcosmos.
Evaluación de la toxicidad de roxarsona y compuestos generados de la
biotransformación.
Determinar propiedades metabólicas de las comunidades bacterianas
asociadas a la transformación de roxarsona.
Establecer la estructura y filogenia de las comunidades bacterianas
asociadas a la transformación de roxarsona, a través del análisis del gen
ADNr 16s.
13
2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Toma de muestra
Muestras de suelo fueron obtenidas desde suelos agrícolas de la Provincia
de Ñuble, VIII Región del Bío-Bío, Chile. Estas fueron tomadas a una profundidad
de 50 cm con cores de policarbonatos, de 5 cm diámetro. Las muestras fueron
almacenadas en bolsas estériles y transportadas a 4ºC al laboratorio de
microbiología ambiental de la facultad de Ciencias Biológicas, de la Universidad de
Concepción.
Muestras de guano de pollo fueron recolectadas en una avícola de la región
del Bío-Bío. Estas fueron almacenadas en bolsas estériles y transportadas a 4ºC
al laboratorio de Microbiología Ambiental de la Facultad de Ciencias Biológicas, de
la Universidad de Concepción.
Muestras de agua de pozo fueron recolectadas desde el mismo sitio que se
recolectaron las muestras de suelo. Las muestras fueron almacenadas en
botellas de vidrio de color ámbar de 1000 ml y transportadas a 4ºC al laboratorio
de microbiología ambiental de la facultad de Ciencias Biológicas, de la Universidad
de Concepción.
2.2 Experimentos de microcosmos
Los experimentos de microcoscomos fueron realizados en 4 columnas. Las
columnas fueron fabricadas en vidrio y tuvieron 4 cm de diámetro y 50 cm de
largo. Además estaban implementadas con 3 salidas, dos de ellas fueron
utilizadas para tomar muestras de suelos (estrato aeróbico y anaeróbico del suelo)
y una de ellas para muestrear el lixiviado de la columna.
14
Cada columna contuvo 35 cm de suelo y 10 g de guano de pollo,
previamente tratado con roxarsona (0,5 mM). La primera columna (A) (Control
abiótico), contuvo suelo agrícola estéril y guano de pollo estéril. La segunda
columna (B), contuvo el suelo agrícola y el guano de pollo con la comunidad
bacteriana natural. La tercera columna (C), contuvo suelo estéril y guano pollo con
la comunidad bacteriana natural. La cuarta columna (D), contuvo el suelo con la
comunidad bacteriana natural y guano de pollo estéril. Todas la columnas fueron
suplementadas con 45 ml agua estéril, cada semana (Raizman et al.2011). Las
columnas fueron incubadas a temperatura ambiente y en oscuridad, durante 45
días.
El lixiviado, de cada columna (Lx A, Lx B, Lx C y Lx D) fue analizado
mediante IP/RP/HPLC al término del experimento, para determinar las diferentes
especies arsenicales.
Las muestras de suelo para los análisis microbiológicos y físico-químicos
fueron obtenidas cada 15 días, desde diferentes estratos del suelo en la columna
(microcosmos).
2.3 Evaluación de la biotransformación bacteriana de roxarsona.
10 g de muestras de suelo agrícola, provenientes de los estratos aeróbicos
y anaeróbicos de la columna de suelo B en experimentos de microcosmos (BA y
BB, respectivamente) y 10 ml de agua de pozo (AP), se traspasaron a 100 ml de
medio R2A/2 y medio Stolz suplementados con roxarsona (0,5 mM). Como
controles negativos, se consideraron cada uno de los medios de cultivo
suplementados con roxarsona (0.5 mM), en presencia de muestras BA, BB y AP
esterilizadas por calor. Además, se enriquecieron matraces suplementados con
roxarsona (0,5 mM) y cicloheximida (10 ug ml-1), para estudiar la influencia de la
comunidad fúngica en la transformación de roxarsona. Los matraces fueron
15
incubados a 30°C, bajo condiciones aeróbicas (BAA, BBA y APA) y anaeróbicas
(BAAN, BBAN y APAN), por 14 días.
Para el análisis de las muestras, se tomaron alícuotas de 1 ml de cada
matraz a los 0 y 14 días, las cuales fueron filtradas con filtros millipore (0,2 um),
previa inoculación en las microplacas.
La detección y el cálculo del porcentaje de degradación de roxarsona, fue
realizado mediante espectrofotometría (310nm-500nm), a través del método del
trapezoide de espectrogramas, para lo cual se utilizó un espectrofotómetro de
microplacas EpochTM y el programa Gen5TM (BIOTEK®).
2.4 Detección de la roxarsona y compuestos derivados de su trasformación
Roxarsona y los compuestos derivados de su biotransformación, fueron
detectados mediante cromatografía liquida de alta resolución en fase reversa con
par iónico IP/RP/HPLC. Los analitos (3-NHPAA, As(III), As(V), MMA, DMA, 3AHPAA, 4-HPAA y o-ASA) fueron separados en una columna C18, usando como
fase móvil metanol (0,5%) e hidroxi-metil-tetrabutilamonio (1mM), a pH 4.0.
Roxarsona (3-NHPAA), As (III), As (V), MMA, DMA, 3-AHPAA, 4-HPAA y oASA, se utilizaron como compuestos estándares para los diferentes análisis.
Además, se calculó la presencia en porcentajes de cada especie arsenical
dentro de la muestra, a través del método de normalización de áreas bajo la curva,
en el espectrograma de cada compuesto.
16
2.5 Detección de la toxicidad de roxarsona y compuestos derivados de la
biotransformación
La toxicidad de roxarsona y compuestos derivados de la biotransformación
fue determinada mediante el kit Toxi-Chromotest (Environmental Biodetection
Products Inc., Brampton, Ont.).
Las muestras analizadas en este estudio fueron roxarsona (0,5 mM) (Rx),
lixiviados filtrados provenientes de las cuatro columnas en experimento de
microcosmos (Lx A, Lx B, Lx C y Lx D), muestras filtradas de medio enriquecido
con suelo agrícola y roxarsona (0,5 mM) cultivado bajo condiciones aeróbicas y
anaeróbicas por 14 días (BAA y BBAN, respectivamente) y por último muestra
filtrada de medio enriquecido con agua de pozo y roxarsona (0,5 mM) cultivado
bajo condiciones anaeróbicas por 14 días (APAN). Como controles, se incubaron
células en ausencia de las muestras ensayadas (control negativo) y en presencia
de cloruro de mercurio (control positivo).
Durante el procedimiento las bacterias fueron expuestas a los agentes
tóxicos presentes en las muestras por un corto período de incubación (90
minutos). Luego las bacterias estresadas se mezclaron con un cóctel que contenía
factores esenciales requeridos para la recuperación de las bacterias de las
condiciones de estrés y un inductor específico para la enzima β-galactosidasa. La
capacidad de las células para sintetizar la enzima dependió de su capacidad para
recuperarse del estrés. La actividad de la enzima se detectó por la reacción con un
sustrato cromogénico, lo que resultó en una formación de color azul fácilmente
detectable visualmente y que se pudo medir con un espectrofotómetro de
microplacas EpochTM a una longitud de onda de 615 nm.
Los materiales tóxicos interfieren con la recuperación de las funciones
metabólicas y por lo tanto con la síntesis de la enzima, lo que resulta en una
disminución en el desarrollo de color azul.
17
Para el análisis de los resultados se utilizó la siguiente ecuación:
% de toxicidad = [1 - OD * células tratadas / OD células control] x 100
* Las células tratadas son aquellas que fueron incubadas en presencia de las
muestras ensayadas (compuestos tóxicos). Las células control fueron aquellas
incubadas en ausencia de las muestras ensayadas.
Los porcentajes de toxicidad obtenidos fueron analizados estadísticamente
a través de ANOVA de una vía y test T de Student, utilizando el
software
GraphPad Prism 5®.
Por otra parte, con el fin de establecer posibles relaciones entre el
porcentaje de toxicidad y la presencia en porcentajes de las distintas especies
arsenicales, presentes en las muestras evaluadas, se efectuó una matriz de
correlación de Pearson, utilizando el software GraphPad Prism 5®.
2.6 Detección de la actividad tóxica de roxarsona y compuestos derivados de
la biotransformación en células HUVECs.
Para estudiar el efecto de roxarsona y compuestos derivados de la
biotransformación sobre la viabilidad celular, se utilizaron células endoteliales de
vena umbilical humana (HUVEC), las cuales fueron obtenidas mediante digestión
con colagenasa tipo II (0,2 mg/mL) y mantenidas (37º C, 5% CO 2) en medio de
cultivo primario suplementado con suero.
Con el fin de determinar cuál era el volumen adecuado para estudiar la
toxicidad, células HUVEC fueron transferidas a placas de experimentación (96
pocillos) y una vez que alcanzaron 100% de confluencia, las células se
suplementaron con diferentes volúmenes (0 ul, 50 ul, 100 ul, 135 ul y 200 ul) de
18
muestra filtrada de lixiviado proveniente de la columna B (Lx B), en los
experimento de microcosmos y de agua estéril como control.
Posteriormente, con la técnica estandarizada, se procedió a transferir
células HUVEC a placas de experimentación (96 pocillos). Luego que la células
alcanzaron 100% de confluencia, estas fueron suplementadas con 50 ul de
roxarsona (0,5 mM) (Rx), 50 ul de lixiviados filtrados provenientes de las cuatro
columnas en experimento de microcosmos (Lx A, Lx B, Lx C y Lx D), 50 ul de
muestras filtradas de medio enriquecido con suelo agrícola, proveniente de la
columna B en experimentos de microcosmos (BA y BB) y roxarsona (0,5 mM),
cultivados bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas por 14 días (BAA y BBAN,
respectivamente) y por último 50 ul de muestra filtrada de medio enriquecido con
agua de pozo y roxarsona 0,5 mM cultivado bajo condiciones anaeróbicas por 14
días (APAN). Como controles, se incubaron células HUVEC viables sin
suplementar (C1) y suplementadas con 50 ul de agua estéril (C2).
El recuento celular se realizó utilizando una cámara de Neubauer utilizando
azul de tripán. Se extrajo una muestra de células en suspensión (20 µl) durante la
etapa de tripsinización, en el momento en que se inactivó el efecto de la tripsina
con medio de cultivo M199 y 20% suero (10% bovino fetal y 10% suero recién
nacido). Se añadió el mismo volumen de una solución de azul tripán, la cual tiñe el
medio y las células muertas, permitiendo diferenciarlas de las células vivas que se
observan refringentes. Se contaron los cuadrantes superiores e inferiores. Se
obtuvo un número de células promedio por cuadrante y se multiplicó por el
volumen final de células en suspensión (Barnaby et al. 2011). Los porcentajes de
viabilidad obtenidos fueron analizados estadísticamente a través de ANOVA de
una vía y test T de Student, utilizando el software GraphPad Prism 5®.
19
2.7 Perfil metabólico de comunidades bacterianas asociadas a suelos
agrícolas.
La caracterización metabólica de las muestras de comunidades asociadas a
las muestras de suelo AA, AB, BA, BB, CA, CB, DA y DB, fue realizada mediante
la utilización del sistema Biolog EcoplateTM (Biolog®) (Garland y Mills, 1991).
Biolog EcoplateTM comprende 96 pocillos, los cuales son triplicados de 31 fuentes
de carbono distintas y un control en triplicado sin substrato. Las microplacas
fueron inoculadas con 150 µl de muestras diluidas de cada suelo (10 -4) y fueron
incubadas a 25°C. La densidad óptica (λ= 590 nm) de cada pocillo fue
determinada durante 96 horas con intervalos de 24 horas (Garland, 1997), usando
el lector de microplacas (EpochTM de BIOTEK®), cada 0, 15, 30 y 45 días.
Diversos índices fueron obtenidos y analizados estadísticamente, mediante
el software GraphPad Prism 5®. Entre ellos, el desarrollo de color en los pocillos
de las microplacas (AWCD, de sus siglas en inglés), índice de Shanon-Weaver
(H’) y el índice de riqueza (S) (OD>0,25) (Harch y col., 1990; Garland y col., 1997;
Gomez y col., 2006).
Los resultados de AWCD, H’ y E fueron analizados estadísticamente a
través de ANOVA de una vía y test T de Student, utilizando el software GraphPad
Prism 5®.
Las fuentes de carbono fueron divididas según categorías como;
carbohidratos (N=10), ácidos carboxílicos (N=9), aminoácidos (N=6), polímeros
(N=4) y aminas (N=2) (Garland y Mills, 1991). Luego, se obtuvo el índice AWCD,
para cada uno durante el tiempo y se construyó un análisis del componente
principal (PCA) usando el software MINITAB® (versión 15, USA).
20
2.8 Caracterización de la comunidad bacteriana asociada a guano y suelo
agrícola.
2.8.1 Extracción de ADN desde las muestras de suelo y guano de pollo.
La extracción de ADN se realizó a partir de muestras de suelos y guano de
pollo, a tiempo 0 y 45 días, utilizando el kit Ultra Clean (MO BIO Laboratories,
Inc.), utilizando el protocolo alternativo proporcionado por el fabricante. El ADN
extraído fue utilizado como templado para la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
2.8.2 Amplificación del gen ADNr 16S
La amplificación del gen ADNr 16S se realizó mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), utilizando partidores universales para el dominio
bacterias, EUB I (9-27f) y EUB II (1542r) (Tabla I). El mix de PCR fue realizado
en 50 µl, que contenía 12,5 µl EconoTaq® PLUS GREEN 2X Master Mix
(Lucigen® Corporation), partidores EUB I (9-27f) (1µM) y EUB II (1542r) (1µM), 1µl
de
DNA
templado
y
se
ajustó
al
volumen
final
con
agua
DEPC
(Dietilpirocarbonato). Las condiciones de PCR fueron un paso de denaturación
inicial a 94°C por 5 minutos, luego 35 ciclos de; denaturación a 94°C por 30
segundos, alineamiento a 55,6°C por 45 segundos y elongación a 72°C por 1,5
minutos; y una extensión final de 72°C por 10 minutos.
Posteriormente, utilizando como templado el producto de PCR obtenido con
partidores EUB, se amplificó la región V3 del gen 16S ADNr, utilizando los
partidores P3 (341f) y P2 (534r). El partidor P3 ha sido enriquecido con 40 bases
de GC para permitir la separación en el DGGE (Tabla I). El mix de PCR fue
realizado en 50 µl, que contenía 12,5 µl EconoTaq® PLUS GREEN 2X Master Mix
(Lucigen® Corporation), partidores P3 (341f) (1µM) y P2 (534r) (1µM), 2µl de ADN
templado y se ajustó al volumen final con agua DEPC (Dietilpirocarbonato). Se
21
realizó un PCR-Touchdown con las siguientes condiciones: un paso de
denaturación inicial a 94°C por 5 minutos, luego 20 ciclos de; denaturación a 94°C
por 30 segundos, alineamiento a 65°C por 45 segundos (la temperatura de
alineamiento fue decreciendo 0,5°C en cada ciclo hasta llegar a 55°C) y
elongación a 72°C; a continuación se realizaron 10 ciclos de; denaturación a 94°C
por 30 segundos, alineamiento a 55°C por 45 segundos y elongación a 72°C por
1,5 minutos; para finalizar se realizó una extensión final de 72°C por 10 minutos.
Tabla I. Secuencia de partidores y tamaño de los fragmentos amplificados del gen
16S rDNA y región V3 del mismo gen.
Partidores
Secuencia
Tamaño
Referencia
esperado
EUB I
5’-AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3’
EUB II
5’-AGG GAG TGA TCC ANC CRC A-3’
P3
5’-40 GC+TAG GGG AGG CAG CAG-3’
P2
5’ATT ACC GCG GCT GG-3’
1533 pb
Wang y col., 2008
193 pb
Wang y col., 2008
2.8.3 Electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE)
Posteriormente los productos de PCR obtenidos en la amplificación de la
región V3 del gen ADNr 16S, fueron separados en triplicados mediante
electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE).
Los geles fueron preparados utilizando soluciones Stock de 20%,60% y
80% de denaturante. La composición de las soluciones se detalla en la Tabla II.
22
Tabla II. Composición de soluciones stock de DGGE.
20%
60%
80%
Acrilamida Bis 30%
25 ml
25 ml
25 ml
TAE 50X
2 ml
2 ml
2 ml
Formamida
8 ml
24 ml
32 ml
Urea
8,4 g
25,2 g
33,6 g
Aforar a 100 ml con agua DEPC
Los geles se prepararon con concentración denaturante de entre 40%-80%,
usando 13 ml de cada solución stock para la formación del gradiente. La
polimerización de la poliacrilamida se logró agregando 130 µl de persulfato de
amonio [APS] (BioRad®) 10% y 13 µl de N`-Tetra-metil-etilendiamina [TEMED]
(BioRad®), el gradiente vertical se obtuvo utilizando el formador de gradiente de
proporcionado por el fabricante del equipo siguiendo sus indicaciones.
Para la separación de los amplicones se cargó 18 µl de los productos de
PCR amplificados con partidores P2-P3 en los geles de poliacrilamida mezclados
con buffer de caga en proporción de 4:1 utilizando una microjeringa Hamilton.
El DGGE se realizó en una cámara electroforética DGGE-1001 (C.B.S
Scientific Company®) sumergiendo los geles en buffer TAE 1X (40 mM Trisacetato y 1mM EDTA, pH 8.3 a 25°C) a 100 V por 18 horas a 60°C. La separación
de los fragmentos de ADN se visualizó tiñendo con una solución 2X de SYBR Gold
(Invitrogen®) por 1 hora en oscuridad, para posteriormente visualizar la separación
de las bandas en un transiluminador U.V. y obtener un registro fotográfico de los
patrones de bandas de cada muestra.
Las bandas de DGGE con intensidad de a lo menos 5% de la banda más
intensa en el gel, fueron registradas como presentes o ausente en cada posición
del DGGE usando el software Gel-Pro Analyzer 4.0 (Applied Maths®). Para la
comparación de los perfiles de bandeo, se utilizó una matriz binaria, la cual fue
23
construida basada en la presencia (1) o ausencia (0) de las bandas individuales en
cada línea. Los datos binarios que representan a los patrones de bandas fueron
utilizados para generar una matriz de distancia de comparación de pares. La
matriz de distancia fue usada para construir un diagrama de escalamiento
multidimensional (MDS) un mapa de dos dimensiones con eje artificiales X e Y,
donde se coloca cada muestra del DGGE como un punto de una manera que
muestras similares se representen cercanas o juntas. El análisis de clustering y
MDS fueron realizados con el software PRIMER V.6®.
Por otra parte, las bandas de mayor intensidad, fueron escindidas del gel,
reamplificadas, purificadas, y secuenciadas (Macrogen Inc.). Posteriormente, las
secuencias obtenidas, fueron identificadas por BLAST.
2.8.4 Electroforesis en gel de agarosa
Los productos de PCR se visualizaron realizando una electroforesis en gel
de agarosa 1,5% (corrido a 100 V por 45 minutos) a la cual se le adicionó el
intercalante de ADN GelRedTM (Biotium®) en proporción 1:10.000. Las
electroforesis fueron realizadas, para el gen ADNr 16S (1500 pb) y para la región
V3 del ADNr 16S (190 pb), cargando 5 µl del producto de PCR (EconoTaq®
PLUS GREEN 2X Master Mix posee incorporado Buffer de carga). El tamaño de
los fragmentos amplificados se comprobó comparando con un marcador de peso
molecular de 100 pb (New England, BioLabs®). La visualización fue realizada en
transiluminador de luz U.V.
24
3. RESULTADOS
3.1 Análisis físico-químicos del suelo agrícola en estudio.
Después de 45 días del enriquecimiento de los suelos con guano de pollo, se
observó un aumento en el pH, el contenido de materia orgánica (% MO), el
contenido de N-NH4, el contenido de fosforo (P) y el contenido de cobre (Cu), en
relación al tiempo 0. Por otra parte, no se observaron diferencias significativas en
el contenido de potasio (K) y el contenido de Hierro (Fe), en relación al tiempo 0
(Tabla III).
Tabla III. Parámetros físico-químicos de las muestras de suelo.
Muestra
pH
%MO
Suelo BA1 (0 días)
5.35
Suelo BA (45 días)
2
N-NH4
P
K
-1
Fe
-1
Cu
(mg Kg )
(mg Kg )
(mg Kg )
(mg Kg )
(mg Kg-1)
2.6
22.73
5.4
28.1
39.8
2.0
5.58
2.9
26.43
6.3
29.4
38.7
4.3
Suelo BB (0 días)
5.6
2.0
20.35
4.8
31.8
37.4
1.8
Suelo BB (45 días)
5.8
2.2
23.6
5.9
30.3
36.9
3.5
1
-1
-1
BA: Suelo del estrato aeróbico de la columna B; 2 Suelo del estrado anaeróbico de la columna B
3.2 Evaluación de la biotransformación bacteriana de roxarsona.
Muestras de suelo (BA y BB) y agua de pozo (AP) fueron inoculadas en
medio Stolz y medio R2A diluido a la mitad, suplementados con roxarsona
(0,5mM) o suplementados con roxarsona y cicloheximida (10 ug ml -1), para medir
su capacidad degradadora, bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Como
control negativo, se incubaron muestras esterilizadas por calor. Todos los
experimentos fueron incubados durante 14 días a 30°C.
La detección y el cálculo del porcentaje de degradación de roxarsona, fue
realizado mediante espectrofotometría (310nm-500nm), a través del método del
trapezoide, a los 0 y 14 días.
25
Los análisis de degradación de roxarsona a tiempo 0, bajo condiciones
aeróbicas de las muestras de suelo BA en caldo R2A diluido a la mitad (BAA1 y
BAA2) y la muestra control, demuestran la presencia de roxarsona, el cual generó
un peak de absorbancia de 0,7 a una longitud de onda cercana a los 350 nm
(Figura 1A).
Luego de 14 días de incubación, se observó una desaparición del peak
correspondiente a roxarsona (a una longitud de onda cercana a los 350 nm), en
las muestras BAA1 y BAA2, en relación a la muestra control. Por otra parte, se
detectó un nuevo peak de absorbancia cercano a 1.7, localizado en una longitud
de onda cercana a los 400 nm, en ambas muestras, el cual no fue detectado en la
muestra control (Figura 1B).
26
A
Muestra A (t0) Aeróbico
0,800
0,700
0,600
Absorbancia
0,500
0,400
76,298
64,849 OD.nm
73,649
OD.nm
0,300
0,200
0,100
0,000
-0,100
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
550
600
650
700
Wavel ength (nm)
B
Muestra A (t14) Aeróbico
2,000
1,800
1,600
Absorbancia
1,400
1,200
1,000
210,652 OD.nm
159,471 OD.nm
0,800
0,600
0,400
87,416 OD.nm
0,200
0,000
-0,200
200
250
300
350
400
450
500
Wavel ength (nm)
Figura 1. Espectrograma de degradación aeróbica de ROX de la muestra BA 1 a
tiempo 0 (A) y a 14 días de incubación (B). ( )
Suelo BAA1 estéril + ROX
(0,5mM), ( ) Suelo BAA1 sin esterilizar + ROX (0,5mM) y ( ) Suelo BAA2 sin
esterilizar + ROX (0,5mM). 1 BAA: Suelo BA cultivado aeróbicamente.
Los análisis de degradación de roxarsona a tiempo 0h, bajo condiciones
anaeróbicas de las muestras de suelo BA en medio Stolz (BAAN1 y BAAN2) y la
muestra control, demuestran la presencia de roxarsona, el cual generó un peak de
absorbancia de 1,1 a una longitud de onda cercana a los 400 nm (Figura 2A).
Luego de 14 días de incubación, los resultados demostraron que no existen
diferencias significativas entre los peak de absorbancia del compuesto roxarsona
en las muestras BAAN1, BAAN2 y la muestra control (A=1.04, A=1.05 y A=1.1,
respectivamente) (Figura 2B).
27
A
Muestra A (t0) Anaeróbico
1,200
1,000
Absorbancia
0,800
0,600
102,407
OD.nm
98,622 OD.nm
100,421
OD.nm
0,400
0,200
0,000
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
550
600
650
700
Wavel ength (nm)
B
Muestra A (t14) Anaeróbico
1,400
1,200
Absorbancia
1,000
0,800
0,600
109,649
108,727 OD.nm
107,460
0,400
0,200
0,000
-0,200
200
250
300
350
400
450
500
Wavel ength (nm)
Figura 2. Espectrograma de degradación anaeróbica de ROX de la muestra BA a
tiempo 0 (A) y a 14 días de incubación (B). ( )
Suelo BAAN1 estéril + ROX
(0,5mM), ( ) Suelo BAAN1 sin esterilizar + ROX (0,5mM) y ( ) Suelo BAAN2 sin
esterilizar + ROX (0,5mM). 1 BAAN: Suelo BA cultivado anaeróbicamente.
Se realizaron análisis para determinar la influencia de la comunidad fúngica
del suelo en la biotransformación de roxarsona y los resultados demostraron que
no existen diferencias significativas en el porcentaje de transformación de
roxarsona por los microorganismos presentes en el suelo, en presencia o ausencia
del compuesto antifúngico cicloheximida.
Los datos obtenidos mediante espectrofotometría de la degradación de
roxarsona bajo condiciones aeróbicas de las muestras de suelo BB en caldo R2A
diluido a la mitad (BBA1 y BBA2) y de la muestra control a tiempo 0h, demostraron
la presencia de roxarsona, la cual generó un peak de absorbancia de 0,7 a una
longitud de onda cercana a los 350 nm (Figura 3A). Luego de 14 días de
28
incubación, los resultados demuestran la desaparición del peak de absorbancia
asociado a roxarsona (350 nm) en las muestras BBA1 y BBA2, en relación a la
muestra control. Por otra parte, se detectó la formación de nuevos peaks de
absorbancia para las muestras BBA1 y BBA2, alcanzando valores de absorbancia
cercanos a 1.7 y 2.2 a 400 nm de longitud de onda respectivamente, los cuales no
fueron detectados en la muestra control (Figura 3B).
A
Muestra B (t0) Aeróbico
0,900
0,800
0,700
Absorbancia
0,600
0,500
0,400
77,641
62,376 OD.nm
OD.nm
72,198 OD.nm
0,300
0,200
0,100
0,000
-0,100
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
550
600
650
700
Wavel ength (nm)
B
Muestra B (t14) Aeróbico
2,500
2,000
Absorbancia
1,500
1,000
270,601 OD.nm
177,761 OD.nm
0,500
88,322 OD.nm
0,000
-0,500
200
250
300
350
400
450
500
Wavel ength (nm)
Figura 3. Espectrograma de degradación aeróbica de ROX de la muestra BB a
tiempo 0 (A) y a 14 días de incubación (B). ( )
Suelo BBA1 estéril + ROX
(0,5mM), ( ) Suelo BBA1 sin esterilizar + ROX (0,5mM) y ( ) Suelo BBA2 sin
esterilizar + ROX (0,5mM). 1 BBA: Suelo BB cultivado aeróbicamente.
Para el análisis de degradación de roxarsona, bajo condiciones anaeróbicas
de las muestras de suelo BB en medio Stolz (BBAN1 y BBAN2) y la muestra
control a tiempo 0 h, se observó un peak de absorbancia de 1.2, a una longitud de
onda cercana a los 400 nm, correspondientes a roxarsona, en todas las muestras
(Figura 4A). Luego de 14 días de incubación, los resultados demostraron que
29
existen diferencias significativas entre los peak de absorbancia de roxarsona
detectados para las muestras BBAN1 y BBAN2 (A= 0.7 y A=0.5, respectivamente),
en relación a muestra control (A= 1.2). Además, se observó una disminución de un
52.32% del área bajo la curva de detección de roxarsona para la muestra BBAN1,
en relación a la muestra control y una disminución de un 38.6% del área bajo la
curva de detección de roxarsona para la muestra BBAN2 en relación a la muestra
control (Figura 4B).
A
Muestra B (t0) Anaeróbico
1,400
1,200
1,000
Absorbancia
0,800
0,600
116,065 OD.nm
OD.nm
108,619
100,943 OD.nm
0,400
0,200
0,000
-0,200
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
550
600
650
700
Wavel ength (nm)
B
Muestra B (t14) Anaeróbico
1,400
1,200
Absorbancia
1,000
0,800
0,600
106,540 OD.nm
0,400
65,406 OD.nm
50,802 OD.nm
0,200
0,000
-0,200
200
250
300
350
400
450
500
Wavel ength (nm)
Figura 4. Espectrograma de degradación anaeróbica de ROX de la muestra BB a
tiempo 0 (A) y a 14 días de incubación (B). ( )
Suelo BBAN1 estéril + ROX
(0,5mM), ( ) Suelo BBAN1 sin esterilizar + ROX (0,5mM) y ( ) Suelo BBAN2 sin
esterilizar + ROX (0,5mM). 1 BBAN: Suelo BB cultivado anaeróbicamente.
Los análisis de degradación de roxarsona bajo condiciones aeróbicas de las
muestras de agua de pozo AP en caldo R2A diluido a la mitad (APA1 y APA2) a
tiempo 0, demostraron la presencia del compuesto roxarsona, el cual generó un
peak de absorbancia de 0,7 a una longitud de onda cercana a los 350 nm (Figura
30
5A). Luego de 14 días de incubación, los resultados demuestran una desaparición
del peak correspondiente a roxarsona, a una longitud de onda cercana a los 350
nm, en las muestras APA1 y APA2, en relación a la muestra control, observándose
además la presencia de un nuevo peak, con una absorbancia de 1.9, a una
longitud de onda cercana a los 400 nm, en ambas muestras, el cual no fue
detectado en la muestra control (Figura 5B).
A
Muestra B (t2) Aeróbico
0,900
0,800
0,700
Absorbancia
0,600
0,500
0,400
86,859 OD.nm
80,060
69,345 OD.nm
0,300
0,200
0,100
0,000
-0,100
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
550
600
650
700
Wavel ength (nm)
B
Agua de pozo (t2) Aeróbico
1,000
0,900
0,800
Absorbancia
0,700
0,600
0,500
93,063
91,101 OD.nm
0,400
68,775 OD.nm
0,300
0,200
0,100
0,000
200
250
300
350
400
450
500
Wavel ength (nm)
Figura 5. Espectrograma de degradación aeróbica de ROX de la muestra de agua
de pozo a tiempo 0 (A) y a 14 días de incubación (B). ( ) Agua de pozo (AP)
estéril + ROX (0,5mM), ( ) APA11 sin esterilizar + ROX (0,5mM) y ( ) APA2 sin
esterilizar + ROX (0,5mM). 1 APA: Agua de pozo cultivada aeróbicamente.
Por último, el estudio de la degradación de roxarsona bajo condiciones
anaeróbicas de las muestras AP en medio Stolz (APAN1 y APNA2) a tiempo 0,
indicó que el peak de absorbancia de 1.2, correspondiente a roxarsona, fue
detectado a una longitud de onda cercana a los 400 nm, tanto en las muestras
APAN1 y APAN2, como en la muestra control (Figura 6A). Luego de 14 días de
31
incubación, los resultados demostraron que existen diferencias significativas entre
los peak de absorbancia de roxarsona detectados para las muestras APAN1 y
APAN2 (A= 1.8 y A= 1, respectivamente), en relación a muestra control (A= 1.2).
Además, se observó una disminución de un 2.26% del área bajo la curva de
detección de roxarsona para la muestra APAN1, en relación a la muestra control y
una disminución de un 15.4% del área bajo la curva de detección de roxarsona
para la muestra APAN2 en relación a la muestra control (Figura 6B).
A
Agua de pozo (t2) Anaeróbico
1,400
1,200
1,000
Absorbancia
0,800
0,600
107,412
106,659 OD.nm
103,114
OD.nm
0,400
0,200
0,000
-0,200
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
550
600
650
700
Wavel ength (nm)
B
Agua de pozo (t21) Anaeróbico
1,400
1,200
Absorbancia
1,000
0,800
0,600
108,674 OD.nm
106,213
91,910 OD.nm
0,400
0,200
0,000
-0,200
200
250
300
350
400
450
500
Wavel ength (nm)
Figura 6. Espectrograma de degradación anaeróbica de ROX de la muestra de
agua de pozo a tiempo 0 (A) y a 14 días de incubación (B). ( ) Agua de pozo
(AP) estéril + ROX (0,5mM), ( ) APAN1 1 sin esterilizar + ROX (0,5mM) y ( )
APAN2 sin esterilizar + ROX (0,5mM).
anaeróbicamente.
32
1
APAN: Agua de pozo cultivada
3.3
Detección
de
roxarsona
y
compuestos
derivados
de
la
biotransformación.
La detección de roxarsona y compuestos derivados de la biotransformación
en muestras de lixiviados provenientes de las cuatro columnas en experimento de
microcosmos (Lx A, Lx B, Lx C y Lx D) y muestras de medio BAA1, BBAN1 y
APAN2, fueron estudiadas mediante cromatografía liquida de alta precisión de
fase reversa e intercambio iónico (IP-RP- HPLC). Para efectuar el intercambio
iónico en la corrida cromatografica, se utilizó hidróxido de metiltributilamonio, el
cual presentó un alto grado de selectividad para separar especies arsenicales
orgánicas e inorgánicas.
En la figura 7, se observa el cromatograma de diferentes compuestos
arsenicales utilizados como estándares en el estudio (Roxarsona (3-NHPAA),
As(III), As(V), MMA, DMA, 3-AHPAA, 4-HPAA y o-ASA).
Figura 7. Cromatograma obtenido por (IP-RP- HPLC), de los compuestos
arsenicales, 3-NHPAA, As(III), As(V), MMA, DMA, 3-AHPAA, 4-HPAA y o-ASA,
utilizados como soluciones estándar en el estudio.
En la Figura 8, se observa el cromatograma de una muestra de roxarsona
(0,5mM). La figura muestra un peak con una intensidad de 1250 cps y un tiempo
de retención de 1800000 ms.
33
3-NHPAA
Figura 8. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de una solución de roxarsona
(0,5mM).
El cromatograma de la muestra, obtenido de la columna control (Lixiviado
A), en los experimentos de microcosmos, reveló la presencia de un peak, con una
intensidad de 1000 cps y un tiempo de retención de 1800000 ms, correspondiente
al tiempo de retención de roxarsona (Figura 9)
3-NHPAA
Figura 9. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado A.
El cromatograma de la muestra de lixiviado B, reveló la presencia de 7
peaks, con tiempos de retención similares a DMA, As(III), 4-HPAA y As(V), con
valores de intensidad por sobre los 500 cps (1000 cps, 750 cps, 700 cps y 600
cps, respectivamente). Además, se detectaron pequeñas cantidades de otras 3
especies arsenicales, con tiempos de retención similares al de las soluciones
estándar 3-AHPAA, MMA y 3-NHPAA y con intensidades de 375 cps (Figura 10).
34
As(III)
3-AHPAA
MMA
DMA
4-HPAA
As(V)
3-NHPAA
Figura 10. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado B.
El cromatograma de la muestra lixiviado C, reveló la presencia de 5 peaks.
Cuatro peaks presentaron tiempo de retención correspondientes a DMA, As (III),
4-HPAA y As (V), con 270, 490, 480 y 480 cps de intensidad respectivamente, y
un peak presento un tiempo de retención correspondiente a roxarsona (Figura 11).
3-NHPAA
4-HPAA
DMA
As(III)
As(V)
Figura 11. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado C.
El cromatograma de la muestra de lixiviado D, reveló la presencia de 7
peaks con tiempos de retención similar a DMA, As(V), 4-HPAA, 3-NHPAA, As(III),
3-AHPAA y MMA, con valores de intensidad en cps de, 1000, 1000, 850, 700, 650,
375 y 375, respectivamente (Figura 12).
35
DMA
3-AHPAA
MMA
As(III)
As(V)
4-HPAA
3-NHPAA
Figura 12. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de lixiviado D.
Por otra parte, los cromatogramas de la muestra de medio BAA1, revelaron
la presencia de 7 peaks en el cromatograma. De acuerdo a los tiempo de
retención los compuestos arsenicales presente en la muestra fueron As (III), DMA,
As (V), 4-HPAA, 3-NHPAA, MMA y 3-AHPAA con valores de intensidad de1125,
1000, 750, 700, 500, 500 y 375 cps, respectivamente (Figura 13)
3-AHPAA
MMA
DMA
As(III)
4-HPAA
As(V)
3-NHPAA
Figura 13. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de medio
BAA1.
Los cromatogramas de la muestra de medio BAAN1, revelaron la presencia
de 7 peaks, observándose diferentes valores de intensidad. De acuerdo a los
tiempo de retención los compuestos arsenicales presente en la muestra fueron
DMA, As (V), 4-HPAA y As (III), 3-AHPAA, MMA y 3-NHPAA con valores de
36
intensidad de 1000, 750, 550, 550, 380, 380 y 250 cps, respectivamente (Figura
14)
As(III)
3-AHPAA
MMA
DMA
4-HPAA
As(V)
3-NHPAA
Figura 14. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de medio
BBAN1.
Los cromatogramas de la muestra de medio APAN2, revelaron la presencia
de 7 peaks. Los cuales, de acuerdo a los tiempo de retención de los estándares,
corresponden a As (III), 4-HPAA, MMA y DMA, As (V) y 3-NHPAA con valores de
intensidad de 1125, 750, 650, 500, 480 y 480 cps, respectivamente (Figura 15).
MMA
DMA
As(III)
4-HPAA
As(V)
3-NHPAA
Figura 15. Cromatograma obtenido por IP-RP- HPLC, de la muestra de medio
APAN2.
37
3.4 Detección de la toxicidad de roxarsona y compuestos derivados de la
biotransformación.
El estudio de la toxicidad de roxarsona y compuestos derivados de la
biotransformación presentes en las muestras ensayadas, fue evaluada mediante el
kit Toxi-Chromotest. Los resultados indicaron que las muestras Lx B, Lx C, Lx D,
BAA1, BBAN1 y APAN2 sin diluir, poseen un porcentaje de toxicidad de 36.9%,
44.3%, 37.1%, 71.3%, 56.8% y 74.2%, respectivamente (Figura 16).
Por otra parte, se observó que las células tratadas con muestras de
roxarsona (0,5mM) y lixiviado Lx A sin diluir, presentaron un porcentaje de
toxicidad de 7.5% y 11.4%, respectivamente (Figura 16). Por último, se observó
una disminución proporcional al factor de dilución de la toxicidad en todas las
muestras, llegando a alcanzar porcentajes de toxicidad menores a 20%, con un
factor de dilución de 64 (Figura 16).
80
Toxicidad (%)
60
40
20
0
0
2
4
8
16
32
64
Fa ctor de dilución
Figura 16. Porcentajes de toxicidad de lixiviados y medios, evaluados mediante el
kit Toxi-Chromotest. Muestras ensayadas, ( ) roxarsona (0,5mM), ( ) Lx A, ( ) Lx
B, ( ) Lx C, ( ) Lx D, ( ) BAA, ( ) BBAN y (
son la media ± DS (n =3).
38
) APAN. Los datos representados
Con el fin de establecer posibles relaciones entre el porcentaje de toxicidad
y la presencia en porcentajes de las distintas especies arsenicales (obtenidos
mediante la estandarización del área bajo la curva de cada uno de los compuestos
en el cromatograma), presentes en las muestras evaluadas, se efectuó una matriz
de correlación de Pearson (Tabla IV y Tabla V)
Tabla IV. Valores de toxicidad (%) y presencia en porcentajes de las distintas
especies arsenicales (3-NHPAA, 4-HPAA, As (III), DMA, MMA, As (V) y 3-AHPAA)
Muestra
%
%
%
%
%
%
%
%
Toxicidad*
3-NHPAA
4-HPAA
AS(III)
DMA
MMA
AS(V)
3-AHPAA
ROX
7,47
100,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
LIX A
11,39
100,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
LIX B
36,90
13,83
16,49
21,46
23,83
6,78
12,18
5,42
LIX C
44,27
51,25
17,17
13,65
10,77
0,00
7,15
0,00
LIX D
37,11
26,25
32,43
11,64
0,00
7
21
8
BAA
71,34
8,42
19,09
24,70
19,72
6,07
14,83
7,16
BBAN
56,76
13,75
24,87
19,84
0,00
9,88
20,37
11,29
APAN
74,24
12,14
26,18
21,34
14,57
12,27
13,50
0,00
* Toxi- chromotest
Tabla V. Matriz de correlación de Pearson entre el porcentaje de toxicidad y la
presencia en porcentajes de compuestos arsenicales (3-NHPAA, 4-HPAA, As (III),
DMA, MMA, As (V) y 3-AHPAA).
%
%
%
%
%
%
%
Toxicidad
3-NHPAA
4-HPAA
AS(III)
DMA
MMA
AS(V)
% 3-NHPAA
-0,87
% 4-HPAA
0,74
-0,86
% AS(III)
0,91
-0,96
0,72
% DMA
0,53
-0,58
0,20
0,72
% MMA
0,76
-0,84
0,79
0,75
0,29
% AS(V)
0,70
-0,89
0,94
0,75
0,16
0,81
% 3-AHPAA
0,38
-0,64
0,60
0,53
-0,01
0,54
39
0,83
Y se observaron correlaciones positivas entre los porcentajes de toxicidad y
la presencia en porcentajes de las distintas especies arsenicales presentes en las
muestras ensayadas (4-HPAA, As (III), DMA, MMA, As (V) y 3-AHPAA). Por otra
parte, se observó que roxarsona (3-NHPAA), presentó índices de correlación
negativos con el porcentaje de toxicidad y con los porcentajes de las demás
especies arsenicales (Tabla V).
3.5 Detección de la actividad tóxica de roxarsona y compuestos derivados de
la biotransformación en células HUVECs.
El estudio de toxicidad en HUVECs, fue realizado mediante recuento de
células viables. Los experimentos se realizaron exponiendo a las células a 50 y
100 ul de muestra de lixiviado proveniente de la columna B (Lx B). Los resultados
demostraron una disminución significativa de la viabilidad celular en comparación
a la muestra control (agua estéril) con un p˂ 0,0001 y p= 0,0011, respectivamente.
Además, se observó que las células tratadas con 100 ul de agua estéril
presentaron un porcentaje promedio de viabilidad de un 75%, el cual es
significativamente menor al porcentaje promedio que presentaron al ser tratadas
con 50 ul de agua estéril (90.63%) (p= 0,0020). Por otra parte, en presencia de
135 ul de volumen, tanto de muestra de lixiviado B como de agua estéril, se
obtuvo un disminución significativa (p˂ 0,0001) de la viabilidad celular, alcanzando
porcentajes cercanos al 30%. En cuanto a los resultados obtenidos con 200 ul de
volumen de muestra, se observó una pérdida total de la viabilidad celular en
células expuestas a Lx B (Figura 17).
40
Viabilidad celular (%)
100
80
60
40
20
0
0 L
50 L
100 L
135 L
200 L
Figura 17. Viabilidad celular de HUVEC en presencia de distintos volúmenes de
agua (control) y lixiviado B. HUVEC incubada con: ( ) agua estéril y ( ) lixiviado
proveniente de la columna B en experimento de microcosmos.
Los resultados demostraron que los experimentos eran reproducibles con
50 ul de muestra, por lo tanto, todos los ensayos fueron realizados a este
volumen.
El
recuento
de
células
HUVEC
viables
sin
suplementar
(C1),
suplementadas con 50 ul de agua estéril (C2), 50 ul de roxarsona (Rx) y 50 ul de
lixiviados provenientes de las cuatro columnas en experimento de microcosmos
(Lx A, Lx B, Lx C y Lx D), demostró que los porcentaje de viabilidad celular de las
muestras
provenientes
de
HUVECs
sin
suplementar
fue
de
96.97%,
suplementadas con agua estéril fue de 93.06%, suplementadas con roxarsona fue
de 94.75% y suplementadas con lixiviado proveniente de la columna control (Lx A)
de los experimentos de microcosmos fue de 90.61% (Figura 18).
Los experimentos en presencia de roxarsona, mostraron que no presenta
diferencias significativas en el porcentaje de viabilidad celular con respecto a las
células que no fueron suplementadas (control negativo 1), suplementadas con
agua estéril (control negativo 2) y con las suplementadas con el lixiviado
proveniente de la columna control (Lx A) (p=0,2553, p=0,5381 y p=0,1237,
41
respectivamente). Por otra parte, roxarsona si presenta diferencias significativas
en el porcentaje de viabilidad celular con respecto a las células expuestas a
muestras de lixiviado B (p < 0.0001), lixiviado C (p < 0.0001) y lixiviado D (p=
0,0002) (figura 18).
Los resultados muestran que el porcentaje de viabilidad celular de las
células HUVECs expuestas a 50 ul de Lixiviado B, lixiviado C y lixiviado D fue de
un 68.75%, 59.41% y 77.38%, respectivamente. Por otra parte, no se observaron
diferencias significativas en el porcentaje de viabilidad celular en HUVECs
expuestas a lixiviados B y D (p=0,0945), a diferencia de las células expuestas a
lixiviado C que al mismo volumen, presentaron diferencias significativas en el
porcentaje de viabilidad con células expuestas a lixiviado A (p< 0.0001), lixiviado B
(p=0,0193) y lixiviado D (p=0,0010) (Figura 18).
Viabilidad celular (%)
150
100
50
0
C1
C2
Rx
Lx A
Lx B
Lx C
Lx D
Figura 18. Viabilidad celular de HUVEC en presencia de 50 ul de lixiviados
obtenidos en experimento de microcosmos, a 45 días de la aplicación de guano
enriquecido con roxarsona 0,5mM. HUVEC incubadas: en ausencia de
suplementos (C1), con agua estéril (C2), con roxarsona 0,5 mM (Rx), con Lixiviado
A (Lx A), con Lixiviado B (Lx B), con Lixiviado C (Lx C) y con Lixiviado D (Lx D).
Los datos representados son la media ± DS (n =9). ANOVA de una vía p< 0.0001.
Al realizar el recuento de células HUVEC viables sin suplementar (C1),
suplementadas con 50 ul de agua estéril (C2), 50 ul de roxarsona (Rx) y 50 ul de
42
medio enriquecido con suelo agrícola (BA y BB) y roxarsona (0,5 mM), cultivado
bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas durante 14 días (BAA1 y BBAN1,
respectivamente) y medio enriquecido con agua de pozo y roxarsona (0,5 mM),
cultivado bajo condiciones anaeróbicas por 14 días (APAN2), se obtuvo que los
mayores porcentaje de viabilidad celular se alcanzaron en HUVECs sin
suplementar (96.97%), suplementadas con agua estéril (93.06%) y suplementadas
con roxarsona (94.75%) (Figura 19).
Los experimentos en presencia de roxarsona, mostraron que no presenta
diferencias significativas en el porcentaje de viabilidad celular con respecto a las
células que no fueron suplementadas (control negativo 1) y a las células
suplementadas con agua estéril (control negativo 2) (p=0.2553 y p=0.5381,
respectivamente). Por otra parte, roxarsona presenta diferencias significativas en
el porcentaje de viabilidad celular con respecto a las células que fueron expuestas
a muestras de BAA1 (p < 0.0001), BBAN1 (p < 0.0001) y APAN2 (p < 0.0001)
(Figura 19).
A un volumen de 50 ul de muestra, el porcentaje de viabilidad celular en
HUVEC fue significativamente menor, en relación a las muestras control (C1 y
C2), para aquellas células incubadas tanto con BAA1 (50.95%), como con BBAN1
(39.46%) y APAN2 (57.17%) (Figura 3). Además, se observó que no existen
diferencias significativas de viabilidad entre las células expuestas a BAA1 y
BBAN1 (p= 0,3030), BAA1 y APAN2 (p= 0,4549) y BBAN1 y APAN2 (p=0,0739)
(Figura 19).
43
Viabilidad celular (%)
150
100
50
0
C1
C2
Rx
BAA1
BBAN1
APAN2
Figura 19. Viabilidad celular de HUVEC en presencia de 50 ul de medio filtrado
obtenido en experimentos de biotransformación de roxarsona. HUVEC incubada
con: ausencia de compuestos (C1), agua estéril (C2), roxarsona 0,5 mM (Rx),
medio enriquecido con suelo agrícola y roxarsona 0,5 mM cultivado bajo
condiciones aeróbicas por 14 días (BAA1), medio enriquecido con suelo agrícola y
roxarsona 0,5 mM cultivado bajo condiciones anaeróbicas por 14 días (BBAN1) y
medio enriquecido con agua de pozo y roxarsona 0,5 mM cultivado bajo
condiciones anaeróbicas por 14 días (APAN2). Los datos representados son la
media ± DS (n =9). ANOVA de una vía p< 0.0001.
3.6 Perfil metabólico de comunidades bacterianas asociadas a suelo agrícola
en presencia de roxarsona en experimento de microcosmos
Se determinó el perfil metabólico de las comunidades bacterianas presentes
en suelos agrícolas en presencia de guano enriquecido con roxarsona (0,5 mM) en
experimento de microcosmos, utilizando el sistema Biolog Ecoplate TM.
Mediante este método se determinó la riqueza (S) de fuentes de carbono
utilizadas por las comunidades bacterianas asociadas a distintos estratos del
suelo, tras 96 horas de incubación a 25°C. Además, se determinó la respuesta
44
metabólica promedio (AWCD) y el índice de Shanon-Weaver (H’) para cada
comunidad.
En la figura 20, se muestra la respuesta metabólica de la comunidad
bacteriana del estrato aeróbico del suelo de la columna A (columna con
comunidad microbiana del suelo y guano estériles) (AA), desde el tiempo 0 horas
hasta los 45 días. La cual, presentó valores de AWCD promedio menores a 0,01.
Además, en el día 0 se observó que la comunidad microbiana del estrato aeróbico
presente en la columna C (columna con comunidad microbiana del suelo estéril y
comunidad microbiana del guano sin esterilizar) (CA), también presentó un AWCD
promedio cercano a 0,01.
Por otra parte, se observó que la actividad metabólica promedio exhibida el
día 0 por las comunidades bacterianas de los estratos aeróbicos del suelo de las
columnas B (columna con comunidad microbiana del suelo y guano sin esterilizar)
y D (Columna con comunidad microbiana del suelo sin esterilizar y comunidad
microbiana del guano estéril) (BA y DA, respectivamente), fue significativamente
mayor en comparación a los valores alcanzados por las comunidades microbianas
presentes en los estratos AA y CA. Además, los AWCD promedio de las muestras
BA y DA no presentarían diferencias significativas entre ellas (p=0,3225) (Figura
20).
Después de 15 días de transcurrido el experimento de microcosmos no se
observó diferencia significativa en el promedio AWCD de la muestra CA en
relación al día 0 (p=0,2315). Para la muestra BA se obtuvo que la respuesta
metabólica promedio aumento significativamente de 0.8664 a 1.4864 (p=0,0002).
Lo mismo ocurrió para la muestra DA, cuyos valores AWCD variaron
significativamente de 0.9069 a 1.3058 (p= 0,0044). Por otra parte, se obtuvo que
el promedio AWCD de la muestra BA es significativamente mayor al de la muestra
DA (p= 0,0044) (Figura 20).
45
La figura 20, muestra los resultados obtenidos, desde los experimentos de
microcosmos, después de 30 días de incubación, detectando que existe un
aumento significativo en el promedio AWCD en la muestra CA,
de 0.0144 a
0.3969, entre los 15 y 30 días de incubación, respectivamente (p=0,0002). Por
otra parte,
los valores de AWCD de las muestras BA y DA
fueron
significativamente más alto (p< 0,0001 y p< 0,0001, respectivamente). En relación
a la muestra BA se obtuvo que la respuesta metabólica promedio aumento
significativamente su valor en comparación al día 15, de 1.4864 a 1.7531 (p=
0,0044) y que este valor es significativamente mayor en comparación a la muestra
DA (p=0,0061), cuyo valor AWCD promedio es de 1.4480.
Los resultados obtenidos luego de 45 días, mostraron que existe un
aumento significativo en el promedio AWCD en la muestra CA, de 0.3969 a 0.6970
entre los 30 y 45 días de incubación (p=0,0002). Además, los valores de AWCD
obtenidos para las muestras BA y DA, fueron significativamente mayores (p<
0,0001 y p< 0,0001, respectivamente). En relación a la muestra BA se obtuvo que
la respuesta metabólica promedio aumento significativamente su valor de AWCD
en comparación al día 30, de 1.7531 a 2.4074 (p< 0,0001) y que este valor
alcanzado es significativamente mayor en comparación a la muestra DA (p<
0,0001), cuyo valor AWCD promedio es de 2.0685 (Figura 20).
46
AWCD (590nm)
3
2
1
0
0 Días
15 Días
30 Días
45 Días
Figura 20. Respuestas metabólicas promedio de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico del suelo en presencia de roxarsona. (
(
) AA, (
) BA, (
) CA y
) DA
La figura 21, muestra los análisis de las respuestas metabólicas promedio
(AWCD) de las comunidades microbianas presentes en los estratos anaeróbicos
del suelo de cada columna (A, B, C y D), los cuales mostraron que desde el día 0
hasta el día 45 días de incubación la respuesta metabólica para la comunidad
bacteriana de la columna A (AB), presentó valores menores a 0.01. Además, a
tiempo 0 h se observó que la comunidad microbiana del estrato anaeróbico
presente en la columna C (CB), también presento un valor AWCD cercano a 0.01.
Por otra parte, se observó que la actividad metabólica promedio exhibida el
día 0 por las comunidades bacterianas de los estratos anaeróbicos del suelo de
las columnas B y D (BB y DB, respectivamente), presentó un promedio AWCD
significativamente mayor en comparación a los valores de AWCD alcanzados por
las comunidades microbianas presentes en los estratos AB y CB. Además, los
AWCD promedio de las muestras BB y DB no presentarían diferencias
significativas (p= 0,99) (Figura 21).
Después de 15 días de transcurrido el experimento de microcosmos, no se
observó diferencia significativa en el promedio AWCD de la muestra CB en
relación al día 0 (p= 0,1053). Para la muestra BB se obtuvo que la respuesta
47
metabólica promedio aumento significativamente de 0.1573 a 1.4333 (P= 0,0109).
Lo mismo ocurrió para la muestra DB, cuyos valores AWCD variaron
significativamente de 0.1473 a 1.4388 (p= 0,0099). Por otra, se obtuvo que el
promedio AWCD de la muestra BB es significativamente mayor al de la muestra
DB (p= 0,0013) (Figura 21).
Los resultados obtenidos tras 30 días de incubación del microcosmos,
indicaron que existe un aumento significativo en el promedio AWCD en la muestra
CB,
de 0.0239 en el día 15 a 0.4387 al día 30 (p<0,0001) y que este valor
alcanzado es significativamente menor en comparación a los valores de AWCD de
las muestras BB y DB (p< 0,0001 y p< 0,0001, respectivamente). En relación a la
muestra BB se obtuvo que la respuesta metabólica promedio aumento
significativamente su valor de AWCD (p= 0,0147) en comparación al día 15 (de
1.4333 a 1.5046) y que este valor alcanzado es significativamente mayor en
comparación a la muestra DB (p= 0,0326), cuyo valor AWCD promedio es de
1.6029 (Figura 21).
Los resultados obtenidos luego de 45 días de incubación, mostraron que
existe un aumento significativo en el promedio AWCD en la muestra CB,
de
0.4387 a 0.8725 entre los 30 y 45 días de incubación (p < 0,0001). Estos
resultados son significativamente menor en comparación a los valores de AWCD
obtenidos en las muestras BB y DB (p< 0.0001 y p< 0.0001, respectivamente). En
relación a la muestra BB se obtuvo que la respuesta metabólica promedio
aumento significativamente su valor de AWCD en comparación al día 30, de
1.5046 a 2.2020 (p= 0,0004) y que este valor alcanzado no presenta diferencias
significativas en comparación a la muestra DB (p= 0,1420), cuyo valor AWCD
promedio es de 2.3697 (Figura 21).
48
2.5
AWCD (590nm)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 Días
15 Días
30 Días
45 Días
Figura 21. Respuestas metabólicas promedio de las comunidades microbianas del
estrato anaeróbico del suelo en presencia de roxarsona. (
y(
) AB, (
) BB, (
) CB
) DB
Para comparar la diversidad catabólica entre las diferentes comunidades
microbianas presentes en los estratos aeróbicos y anaeróbicos del suelo de cada
columna, el índice de diversidad de Shannon (H) y la riqueza (S) tras 96 horas de
incubación fueron calculas y se muestran en la figuras 22 y 23.
En general, la riqueza (número de sustratos con valor de OD> 0,25) es igual
a 0 a través de todo el experimento en las muestras extraídas de la columna con
comunidad microbiana del suelo y guano estériles (AA y AB) (Figura 22 y Figura
23)
Los resultados obtenidos para muestras del estrato aeróbico de cada
columna luego de 15 días de incubación, mostraron que existe un aumento
significativo en el promedio de S en relación al días 0, en las muestras BA y DA de
25 a 28 y de 25 a 30 (p<0,0001 y p=0,0003, respectivamente). En cuanto a la
muestra CA, se obtuvo que el índice de riqueza no presentó diferencias
significativas entre el día 0 y los 15 días (S=0 y S=0.5, respectivamente) (p=
0,1817) (Figura 22).
En cuanto a los valores promedio de riqueza obtenidos luego de 30 días de
incubación, se observó que en relación al día 15 no ocurrió un cambio significativo
49
en el valor de S para la muestra BA (p= 0,1817), para la muestra CA el valor de S
aumentó significativamente de 1 a 16 (p<0,0001) y para la muestra DA el valor
promedio de S disminuyó significativamente (p=0,0104) de 30 a 27 (Figura 22).
En el día 45 se observó que en relación al día 30, no ocurrió un cambio
significativo en el valor promedio de S para la muestra BA (p= 0,2070) y que tanto
la muestra CA como la muestra DA, aumentaron significativamente su valor (p=
0,0117 y p=0,0154, respectivamente), alcanzando valores de S de 23 y 31 (Figura
22).
Riqueza (OD > 0.25)
40
30
20
10
0
0 Días
15 Días
30 Días
45 Días
Figura 22. Índice de riqueza promedio de las comunidades microbianas del estrato
aeróbico del suelo incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM), por 45 días.
(
) AA, (
) BA, (
) CA y (
) DA
En el estrato anaeróbico de las columnas de suelo se observó, que la
riqueza en las muestras BB y DB presentó un aumento significativo (p= 0,0167 y
p= 0,0272, respectivamente) a los 15 días de transcurrido el experimento (S=30.5
y S=31, respectivamente) en relación al día 0 (S=27.5 y S=27.5, respectivamente).
Para la muestra CB, se obtuvo que el índice de riqueza no presentó diferencias
significativas entre el día 0 y los 15 días (S=0 y S=0.5, respectivamente) (p=
0,1817) (Figura 23).
En cuanto a los valores promedio de riqueza obtenidos en el día 30 para las
muestras BB, CB y DB, se observó que en relación al día 15, ocurrió una
50
disminución significativa en el valor de S para la muestra BB (p= 0,0170) de 30.5 a
29.5, para la muestra CB el valor de S aumentó significativamente (p<0,0001) de
0.5 a 17.5 y para la muestra DB el valor promedio de S disminuyó
significativamente de 31 a 26.5 (p=0,0104) (Figura 23).
En el día 45 se observó que en relación al día 30, no ocurrió un cambio
significativo en el valor promedio de S para la muestra BB (p= 0,2070) y que tanto
la muestra CB como la muestra DB, aumentaron significativamente su valor (p=
0,0003 y p= 0,0062, respectivamente), alcanzando valores de S de 23 y 30.5
(Figura 23).
Riqueza (OD > 0.25)
40
30
20
10
0
0 Días
15 Días
30 Días
45 Días
Figura 23. Índice de riqueza promedio de las comunidades microbianas del estrato
anaeróbico del suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5mM), por 45 días.
(
) AB, (
) BB, (
) CB y (
) DB.
Al analizar los valores de diversidad del consumo de las fuentes de
carbonos (H’) en muestras del estrato aeróbico de las columnas de suelo, se
observó que tanto las muestras AA y DA, presentaron valores de H cercanos a
2.88 y 3.3, respectivamente y que estos valores se mantuvieron constantes a
través de todo el experimento (ANOVA p= 0,0966 y ANOVA p= 0,9966) (Figura
24).
51
Para el caso de la muestra BA se observó que el valor promedio de H’
aumentó proporcionalmente en el tiempo de 3.18 (tiempo 0) a 3.40 (45 días),
presentándose diferencias significativas entre todas las muestras analizadas
(ANOVA p < 0.0001) (Figura 24).
Por otra parte, los datos obtenidos para la muestra CA mostraron que entre
los día 0, 15 y 30 no existieron diferencias significativas en los valores de H’
(ANOVA p= 0,0938), los cuales fueron cercanos a 3 y que en el día 45 ocurrió un
aumento significativo del valor H’ en relación a los días anteriores, alcanzando un
valor promedio de 3.2 (Figura 24).
Indice Shannon–Weaver
4
3
2
1
0
0 Días
15 Días
30 Días
45 Días
Figura 24. Índice H’ promedio de las comunidades microbianas del estrato
aeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM), por 45 días. (
AA, (
) BA, (
) CA y (
)
) DA
Al analizar los valores de diversidad del consumo de las fuentes de
carbonos (H’) en muestras del estrato anaeróbico de las columnas de suelo se
observó que, las muestras AB, presentaron valores de H’ cercanos a 2.7 y que
estos valores se mantuvieron constantes a través de todo el experimento (ANOVA
p= 0,7981) (Figura 25).
Los datos obtenidos para la muestra BB mostraron que entre los día 0 y 15
hubo un aumento de los valores de H’ (p=0,0046). Posteriormente, este índice se
52
mantuvo
constante
hasta
el
día
30
(p=
0,4504)
y
luego,
aumentó
significativamente hasta alcanzar valores cercanos a 3.39 (p= 0,0099) (Figura 25).
En cuanto a la muestra CB los datos de diversidad mostraron que entre los
día 0, 15 y 30 no hubo un aumento de los valores de H’ (ANOVA p= 0,0980).
Posteriormente, este índice aumentó significativamente en el día 45 alcanzando
valores cercanos a 3.11 (p= 0,0240) (Figura 25).
Para el caso de la muestra DB se observó que el valor promedio de H’
aumentó proporcionalmente en el tiempo de 3.18 (tiempo 0) a 3.40 (45 días),
presentándose diferencias significativas entre todas las muestras analizadas
(ANOVA p < 0.0001) (Figura 25).
Indice Shannon–Weaver
4
3
2
1
0
0 Días
15 Días
30 Días
45 Días
Figura 25. Índice H’ promedio de las comunidades microbianas del estrato
anaeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM), por 45 días.
(
) AB, (
) BB, (
) CB y (
) DB
El estudio de la utilización de los sustratos por las comunidades bacterianas
presentes en los suelos, se realizó mediante análisis de componentes principales
(PCA) de los datos obtenidos para las distintas fuentes de carbono disponibles en
Biolog EcoplateTM (Carbohidratos (N=10), ácidos carboxílicos (N=9), aminoácidos
(N=6), polímeros (N=4) y aminas (N=2), luego de 96 horas de incubación a 25°C.
53
El PCA realizado de los valores de AWCD de las distintas fuentes de
carbono obtenidos de la comunidad bacteriana presente en la muestra BA en
presencia de roxarsona, explica el 95,9% de la varianza,
donde el primer
componente principal (PC1) tiene la mayor correlación positiva con carbohidratos,
aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros. Por otro lado, el segundo
componente principal (PC2) tiene mayor correlación positiva con las aminas.
Además, se observa una alta correlación positiva con el PC1 a los 30 y 45 días de
transcurrido el experimento, mientras que el PC2 solo presenta una correlación
positiva a los 15 días de incubación (Figura 26).
Por otra parte, el AWCD de las distintas fuentes de carbono se observa en
la figura 27, donde se evidencia la alta capacidad oxidativa que presenta BA por
las aminas a diferencia de las demás fuentes de carbono en el día 15.
Figura 26. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
BA, en presencia de roxarsona (0,5mM). ( ) BA Tiempo 0, ( ) BA 15 días, ( ) BA
30 días y ( ) BA 45 días.
54
AWCD (590nm)
3
2
1
0
Carbohidratos
Ac. Carboxílico
Aminoácidos
Polímeros
Aminas
Figura 27. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico suelo, incubado en presencia de roxarsona (0,5 mM), por 45 días.
(
) BA Tiempo 0, (
) BA 15 días, (
) BA 30 días y (
) BA 45 días.
El PCA realizado para la muestra BB en presencia de roxarsona explica el
93,4% de la varianza,
donde PC1 tiene la mayor correlación positiva con
carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros, por otro lado, PC2
tiene mayor correlación positiva con las aminas. Además, se observa una
correlación positiva con el PC1 desde el día 45, mientras que el PC2 presenta
una alta correlación positiva entre los días 15 y 30 (Figura 28).
Por otra parte, el AWCD de las distintas fuentes de carbono se observa en
la figura 29, donde se evidencia la alta capacidad oxidativa que presenta BB por
las aminas a diferencia de las demás fuentes de carbono en los días 15 y 30.
55
Figura 28. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
BB, en presencia de roxarsona (0,5mM). ( ) BB tiempo 0, ( ) BB 15 días, ( ) BB
30 días y ( ) BB 45 días.
AWCD (590nm)
3
2
1
0
Carbohidratos
Ac. Caboxílico
Aminoácidos
Polímeros
Aminas
Figura 29. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico suelo, incubados en presencia de roxarsona (0,5mM). (
tiempo 0, (
) BB 15 días, (
) BB 30 días y (
) BB
) BB 45 días.
El PCA realizado para la muestra CA en presencia de roxarsona explica el
96,1% de la varianza,
donde PC1 tiene la mayor correlación positiva con
carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros, por otro lado, PC2
tiene mayor correlación positiva con las aminas. Además, se observa una
correlación positiva con el PC1 desde el día 30, lo cual se mantiene hasta el día
45, mientras que el PC2 presenta una alta correlación positiva entre los días 0 y
15 (Figura 30).
56
Por otra parte, el AWCD de las distintas fuentes de carbono se observa en
la figura 31, donde se evidencia la alta capacidad oxidativa que presenta CA por
los carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros en los días 30 y
45.
Figura 30. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
CA, en presencia de roxarsona (0,5mM). ( ) CA Tiempo 0, ( ) CA 15 días, ( )
CA 30 días y ( ) CA 45 días.
1.0
AWCD (590nm)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Carbohidratos
Ac. Carboxílico
Aminoácidos
Polímeros
Aminas
Figura 31. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM). (
Tiempo 0, (
) CA 15 días, (
) CA 30 días y (
) CA
) CA 45 días.
El PCA realizado para la muestra CB en presencia de roxarsona explica el
97% de la varianza,
donde PC1 tiene la mayor correlación positiva con
carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros, por otro lado, PC2
tiene mayor correlación positiva con las aminas. Además, se observa una
correlación positiva con el PC1 desde el día 30, lo cual se mantiene hasta el día
57
45, mientras que el PC2 presenta una alta correlación positiva entre los días 0 y
15 (Figura 32).
Por otra parte, el AWCD de las distintas fuentes de carbono se observa en
la figura 33, donde se evidencia la alta capacidad oxidativa que presenta CB por
los carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros en los días 30 y
45.
Figura 32. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
CB, en presencia de roxarsona (0,5mM). ( ) CB tiempo 0, ( ) CB 15 días, ( ) CB
30 días y ( ) CB 45 días.
AWCD (590nm)
1.5
1.0
0.5
0.0
Carbohidratos
Ac. Carboxílico
Aminoácidos
Polímeros
Aminas
Figura 33. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico suelo, incubadas en presencia de roxarsona (0,5 mM). (
tiempo 0, (
) CB 15 días, (
) CB 30 días y (
) CB
) CB 45 días.
El PCA realizado para la muestra DA en presencia de roxarsona explica el
86,8% de la varianza,
donde PC1 tiene la mayor correlación positiva con
58
carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros, por otro lado, PC2
tiene mayor correlación positiva con las aminas. Además, se observa una
correlación positiva con el PC1 desde el día 45, mientras que el PC2 presenta
una alta correlación positiva entre los días 15 y 30 (Figura 34).
Por otra parte, el AWCD de las distintas fuentes de carbono se observa en
la figura 35, donde se evidencia la alta capacidad oxidativa que presenta DA por
las aminas en los días 15 y 30.
Figura 34. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
DA, en presencia de roxarsona (0,5mM). ( ) DA tiempo 0, ( ) DA 15 días, ( ) DA
30 días y ( ) DA 45 días.
AWCD (590nm)
3
2
1
0
Carbohidratos
Ac. Carboxílico
Aminoácidos
Polímeros
Aminas
Figura 35. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico suelo, en presencia de roxarsona. (
días, (
) DA 30 días y (
) DA 45 días.
59
) DA tiempo 0, (
) DA 15
El PCA realizado para la muestra DB en presencia de roxarsona explica el
91,3% de la varianza,
donde PC1 tiene la mayor correlación positiva con
carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros, por otro lado, PC2
tiene mayor correlación positiva con las aminas. Además, se observa una
correlación positiva con el PC1 desde el día 45, mientras que el PC2 presenta
una alta correlación positiva en el día 15 (Figura 36).
Por otra parte, el AWCD de las distintas fuentes de carbono se observa en
la figura 37, donde se evidencia la alta capacidad oxidativa que presenta DB por
las aminas en el día 15.
Figura 36. PCA de los AWCD de las distintas fuentes de carbono de la muestra
DB, en presencia de roxarsona (0,5mM). ( ) DB tiempo 0, ( ) DB 15 días, ( ) DB
30 días y ( ) DB 45 días.
60
AWCD (590nm)
3
2
1
0
Carbohidratos
Ac. Carboxílico
Aminoácidos
Polímeros
Aminas
Figura 37. Respuesta metabólica por grupos, de las comunidades microbianas del
estrato aeróbico suelo en presencia de roxarsona. (
dias, (
) DB 30 dias y (
) DB tiempo 0, (
) DB 15
) DB 45 días.
3.7 Caracterización molecular de la comunidad bacteriana asociada a la
transformación de roxarsona.
Los análisis moleculares de las muestras provenientes de las cuatro
columnas en experimento de microcosmos, fueron realizados mediante la
amplificación de la región V3 del gen ADNr 16s y posterior análisis mediante
DGGE.
Los análisis ecológicos fueron realizados en base al patrón de bandeo
obtenido por DGGE. Para ello las bandas fueron definidas como presente o
ausente, de acuerdo a la diferencia de intensidad de al menos 5% de la banda
más intensa en la muestra, utilizando el software Gel-Pro Analyzer 4,0 (Applied
Maths). Con los perfiles de bandeo obtenidos, se construyó una matriz binaria,
basado en la presencia o ausencia de la banda en el gel, la cual fue utilizada para
la construcción de una matriz de distancia, para análisis de dendogramas y MDS
mediante el paquete estadístico Primer6.
61
El patrón de bandeo de la comunidad bacteriana asociada a muestras de
guano y suelo agrícola, obtenido por DGGE con un gradiente denaturante 40%80%, muestra la presencia de 44 bandas (Figura 38). Las secuencias relativas
más cercanas en GenBank de las secuencias de ADNr 16S obtenidas por DGGE
mostraron la presencia de cuatro grupos de bacterias, alphaproteobacteria,
Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Actinobacteria y
Firmicutes, de los cuales el grupo de las Firmicutes fue el más abundante. Todas
identidades de las bacterias de referencia, fueron confirmadas con 98-100% de
similitud (Tabla VI).
62
Tabla VI. Análisis de las secuencias de ADNr 16S obtenidas por DGGE
Banda
Secuencia relativa más cercana
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Anaeromyxobacter sp.
Enterococcus casseliflavus
Bacillus sp
Uncultured actinobacterium
Bacillus thuringiensis
Uncultured Shewanella sp.
Uncultured Trichococcus
Uncultured Bacteroidetes bacterium
Uncultured gamma proteobacterium
Uncultured Raoultella sp.
Uncultured Burkholderia sp.
Gen Bank
no. acceso
NC011145
GU427719
AY818008
JF988868
JN377791
EU919217
EU919224
AB677827
EU919226
EU919218
EU876657
12
13
14
15
16
17
Uncultured alpha proteobacterium
Uncultured Clostridium sp.
Uncultured Paracoccus sp.
Uncultured beta proteobacterium
Uncultured actinobacterium
Lactobacillus ruminis
EU359945
FJ609997
GQ324230
HM238111
EF188333
JQ805662
Alphaproteobacteria
Firmicutes
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Actinobacteria
Firmicutes
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
JX500190
JX419381
JQ419715
HF_563562
NC_014307
JX110710
GU332269
JQ974826
NC_020181
FR682929
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Betaproteobacteria
Firmicutes
Actinobacteria
Alphaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Betaproteobacteria
28
29
30
31
32
33
Lysinibacillus fusiformis
Bacillus sp.
Bacillus sp.
Bacillus amyloliquefaciens
Ralstonia solanacearum
Tumebacillus sp.
Propionibacterium sp.
Uncultured alpha proteobacterium
Enterobacter aerogenes
Achromobacter sp.
Bacillus subtilis
Hyphomicrobium sp.
Collimonas fungivorans
Clostridium clariflavum
Caulobacter segnis
Desulfovibrio vulgaris
GQ267463
GU479687
NC_015856
NC_016627
NC_014100
NC_011769
Firmicutes
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Firmicutes
Alphaproteobacteria
Deltaproteobacteria
34
35
36
37
38
39
Zymomonas mobilis
Mycobacterium avium
Exiguobacterium sp.
Lysinibacillus sphaericus
Bacillus subtilis
Solibacillus silvestris
NC_018145
NC_002944
NC_012673
NC_010382
NC_018520
NC_018065
Alphaproteobacteria
Actinobacteria
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
63
Grupo bacteriano
Deltaproteobacteria
Firmicutes
Firmicutes
Actinobacteria
Firmicutes
Gammaproteobacteria
Firmicutes
Bacterioidetes
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Betaproteobacteria
Banda
Secuencia relativa más cercana
40
41
42
43
44
Enterococcus sp.
Lactobacillus plantarum
Bacillus licheniformis
Shewanella putrefaciens
Alkaliphilus metalliredigens
Gen Bank
no. acceso
FP_929058
NC_014554
NC_006270
NC_009438
NC_009633
Grupo bacteriano
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Gammaproteobacteria
Firmicutes
Los análisis de similitud, entre las comunidades bacterianas presentes en
las muestras de guano y suelo provenientes de las cuatro columnas en
experimento de microcosmos, se establecieron mediante el método del
escalamiento multidimensional (MDS), que utiliza información contenida en una
matriz de similitud de Bray-Curtis, basado en la presencia o ausencia de las
bandas u OTUS. El cual demostró que las muestras CA45, CB45 y G poseen un
índice de similitud de un 60% en la estructura de sus comunidades bacterianas.
Un segundo grupo de asociación se ve representado en el escalamiento
multidimensional del patrón de bandeo, el cual está formado por las muestras DA0
y BA0, con un 60% de similitud. Por otra parte, las muestras BB0, BB45 y DB0,
forman un tercer grupo de asociación que también presenta un 60 % de similitud.
Un cuarto grupo se ve representado por las muestras BB0, BB45, DB0, CA45,
CB45 y G, con un 50% de similitud. Por último, las muestra BA45, DA45 y DB45
por sí solas, estarían formando un quinto, sexto y séptimo grupo, respectivamente,
al no presentar similitud significativa en la estructura de sus comunidad bacteriana,
con las demás muestras (Figura 39A). El mismo patrón se encontró por análisis
jerárquico de conglomerados (índice de Bray-Curtis) (Figura 39B)
64
BA0
BA45
BB0
BB45 CA45
CB45
DA0
DA45 DB0
DB45
G
30
19
1
17
18
37
38
2
3
4
32
20
39
40
36
5
35
21
22
23
31
6
24
25
7
8
41
42
34
9
33
26
43
44
10
11
12
27
13
14
28
29
15
16
Figura 38. Perfil de bandas en el gel de gradiente denaturante (DGGE) 40%-80%,
de muestras de guano y suelo provenientes de las cuatro columnas en
experimento de microcosmos.
65
A
B
Figura 39. A) Escalamiento multidimensional del patrón de bandeo obtenidos
mediante DGGE. B) Análisis de similitud (Bray-Curtis) del patrón de bandeo
obtenido mediante análisis del gen ARNr 16s por DGGE.
Los valores promedio de riqueza (S), diversidad de Shannon (H'), equidad
de Pielou (J') y dominancia de Simpson, muestran diferencias significativas entre
66
el patrón de bandas (OTUS), obtenido mediante el análisis del gen ARNr 16S por
DGGE, de las muestras evaluadas (Tabla VII).
Se obtuvo que tanto los valores promedio de riqueza, como los valores de
H’, fueron significativamente mayores en las muestras BB45, BB0, DB0 y CA45
(S/H’=39/3.53, S/H’=30/3.29, S/H’=29/3.22 y S/H’=26/3.16, respectivamente).
Valores intermedios de riqueza y H’, fueron obtenidos para las muestras, CB45, G
y DA0 (S/H’=20/2,84, S/H’=19/2.83 y S/H’=16/2.70, respectivamente). Y bajos
valores de riqueza, fueron encontrados para las muestras DA45, BA0, DB45 y
BA45 (S/H’=13/2.50, S/H’=12/2.45, S/H’=5/1.49 y S/H’=4/1.36) (Tabla VII).
Al analizar el índice de equidad de Pielou, se obtuvo que las muestras BA0,
BA45, DA0 y DB45 no presentaron diferencias significativas en los valores de
equidad promedio (J’=0.987, J’=0.984, J’=0.985 y J’=0.990, respectivamente)
(ANOVA p=0,3517). Los valores de J’ obtenidos para las muestras CB45, DA45 y
DB0 (J’=0.957, J’=0.975 y J’=0.961, respectivamente), presentaron diferencias
significativas en relación a todas las demás muestras. Por otra parte, las muestras
BB0, BB45, CA45 y G, no presentaron diferencias significativas en los valores de
equidad promedio (J’=0.967, J’=0.968, J’=0.969 y J’=0.969, respectivamente)
(ANOVA p= 0,6245) (Tabla VII).
Por último, el índice de dominancia de Simpson fue mayor en las muestras
BA45 y DB45 (1-Lambda’=5.18 y 1-Lambda’=2.24, respectivamente), que en las
muestras BA0, BB0, BB45, CA45, CB45, DA0, DA45, DB0 y G (1-Lambda’=1.24,
1-Lambda’=1.06,
Lambda’=1.15,
1-Lambda’=1.04,
1-Lambda’=1.13,
1-Lambda’=1.04,
1-Lambda’=1.07,
Lambda’=1.13, respectivamente) (Tabla VII).
67
1-Lambda’=1.08,
1-Lambda’=2.24
y
11-
Tabla VII. Riqueza (S), índice de diversidad de Shannon-Weaver (H'), índice de
equidad de Pielou (J´) e índice de dominancia de Simpson (1-Lambda') del patrón
de bandas (OTUS), obtenido mediante el análisis del gen ARNr 16S por DGGE
Muestra
S
H'
J'
1-Lambda'
BA0
12
2,45
0,98
1,24
BA45
4
1,36
0,98
5,18
BB0
30
3,29
0,97
1,06
BB45
38,5
3,53
0,97
1,04
CA45
26
3,16
0,97
1,04
CB45
19,5
2,84
0,96
1,08
DA0
15,5
2,70
0,98
1,15
DA45
13
2,50
0,98
1,13
DB0
28,5
3,22
0,96
1,07
DB45
4,5
1,49
1,00
2,24
G
18,5
2,83
0,97
1,13
La tabla VIII, informa valores de capacidad de carga (Rr) significativamente
mayores en las muestras BB0, BB45, CA45, CB45, DA0, DB0 y G (Rr=304.92,
Rr=480, Rr=144, Rr=90.25, Rr=39.2, Rr=219.52 y Rr=51.2). La muestra DA45,
presentó un valor de capacidad de carga media (Rr= 28,8). Y capacidades de
cargas significativamente menores, se obtuvieron para las muestras BA0, BA45 y
DB45 (Rr=6.075, Rr=0.675 y Rr=0,45, respectivamente)
68
Tabla VIII. Valores de Riqueza límite ponderada o capacidad de carga, de las
comunidades bacterianas de las diferentes muestras evaluadas, derivado del
patrón de bandas (OTUS), obtenido mediante el análisis del gen ARNr 16s por
DGGE.
Muestra
Rr
BA0
6,075
BA45
0,675
BB0
304,92
BB45
480
CA45
144
CB45
90,25
DA0
39,2
DA45
28.8
DB0
219,52
DB45
0,45
G
51,2
69
4. DISCUSIÓN
De acuerdo a los parámetros climáticos y edáficos, las muestras de suelo
utilizadas en este estudio, se clasifican como Ultic Palexeralf, cuya principal
característica es que son suelos degradados de textura arcillosa, con fuertes
pendientes (>15%), y densidad aparente de 1,4 g cm-3 (Stolpe, 2005).
En cuanto a los parámetros físico-químicos de los suelos utilizados en este
estudio, se observó que después de 45 días de la aplicación de guano de pollo
enriquecido con roxarsona (0,5 mM), ocurrió un aumento en el pH, el contenido de
materia orgánica (% MO), el contenido de N-NH4, el contenido de P y el contenido
de Cu, en relación al tiempo 0. Diversos autores han informado resultados
similares con la aplicación de guano de pollo como fertilizante orgánico en suelos
agrícolas (Jackson et al., 1975; Garbarino et al., 2003; Rutherford et al., 2003;
Konstantinos et al., 2008).
Se ha reportado, que el pH influye directamente en la movilidad del arsénico
a través del suelo, debido a que protones e iones hidroxilo compiten por la
adsorción en el suelo y/o por los sitios de complejación (Pierzynski et al., 1994;
Carey et al., 1996; Majumdar & Sanyal, 2002). Por otra parte, diversos estudios
han demostrado que, los ácidos húmicos y fúlvicos en la materia orgánica, pueden
interferir fuertemente con la adsorción y aumento de la movilidad del arsénico en
el suelo (Redman et al., 2002). Por lo cual diversos autores, han sugerido que la
materia orgánica juega un papel importante en el control del transporte del
arsénico (Anawar et al., 2003; McArthur et al., 2004). Por último, la aplicación de
guano de pollo aumenta la concentración de fosfato en el suelo (Kingery et al.,
1994; Sharpley, 1997), lo cual serviría para aumentar la competencia por los sitios
de adsorción, haciendo así más móvil el arsénico en el suelo, facilitando su
lixiviación hacia estratos más profundos (Jain & Loeppert, 2000; Su & Puls, 2003).
70
Los análisis de biotransformación bacteriana de roxarsona, a tiempo 0, bajo
condiciones aeróbicas de las muestras BA, BB y AP en caldo R2A diluido a la
mitad,
evidenciaron
la
presencia
del
compuesto
roxarsona
mediante
espectrofotometría, el cual generó un peak de absorbancia de 0,7 a una longitud
de onda cercana a los 350 nm. Luego de 14 días de incubación, se observó una
desaparición del peak correspondiente a roxarsona (a una longitud de onda
cercana a los 350 nm), en todas las muestras analizadas, en relación a la muestra
control. Por otra parte, se detectó un nuevo peak de absorbancia cercano a 1.7,
localizado en una longitud de onda cercana a los 400 nm, en todas las muestras,
el cual no fue detectado en la muestra control. Estos resultados demuestran que
en condiciones aeróbicas la comunidad bacteriana del suelo (de ambos estratos) y
la comunidad bacterianas en el agua de pozo, son capaces de transformar la
roxarsona en un 100%, luego de 14 días de incubación. Además, compuestos
productos de la biotransformación de roxarsona también, pudieron ser detectados
en el medio.
Los análisis de biotransformación bacteriana de roxarsona, a tiempo 0h,
bajo condiciones anaeróbicas de las muestras BA, BB y AP en medio Stolz,
demostraron la presencia de roxarsona por espectrofotometría, el cual generó un
peak de absorbancia de 1,1 a una longitud de onda cercana a los 400 nm. Luego
de 14 días de incubación, los resultados demostraron que solo las comunidades
bacterianas presentes en las muestras BB y AP fueron capaces de degradar y/o
reducir significativamente la concentración de roxarsona en el medio (52,32% y
15,4%, respectivamente).
Cortinas y col. (2006) determinaron que roxarsona se transforma
rápidamente en ausencia de oxígeno, en muestras de guano de pollo y que el
principal compuesto arsenical producto de esta transformación es el ácido 4hidroxi-3-aminofenilarsonico y que este se transforma en As (III) bajo condiciones
reductoras. Stolz y col. (2007) demostraron la biotransformación de roxarsona en
condiciones anaerobias, mediada por especies pertenecientes al género
71
Clostridium, presentes en enriquecimientos con guano de pollo y los principales
productos
de
esta
biotransformación,
fueron
el
ácido
4-hidroxi-3-
aminofenilarsonico y arsénico inorgánico. Además, estos autores no encontraron
evidencia de la degradación de roxarsona en arsénico orgánico bajo condiciones
aérobicas.
Los resultados obtenidos en este estudio confirman la alternativa aeróbica
de degradación de roxarsona por comunidades bacterianas aisladas desde suelo
agrícola, lo cual tiene sentido, ya que el catabolismo aeróbico de compuestos
aromáticos es común dentro de los procesos microbiológicos naturales (Carmona
y
col.,
2009).
Las
reacciones
de
degradación
de
roxarsona
ocurren
cronológicamente: reducción del grupo nitro, fisión oxidativa del anillo aromático y
por último, ruptura del enlace C-As (Wershaw y col., 1999).
Por otro parte, se realizaron ensayos con cicloheximida, con el objeto de
inhibir la comunidad fúngica presente en el suelo y así determinar su participación
en la biotransformación de roxarsona. Los resultados demostraron que la
comunidad fúngica presente en el suelo no influye en la biotransformación de
roxarsona, debido a esto los experimentos de microcosmos fueron realizados sin
la adición de cicloheximida.
La detección de roxarsona y compuestos derivados de la biotransformación
en
muestras de lixiviados en el lixiviado proveniente de la columna control A
(columna con comunidad microbiana del suelo y guano estériles), demostró la
presencia de un solo peak en el cromatograma, con un tiempo de retención,
correspondiente al de roxarsona. Sin embargo, para las muestras de lixiviado B y
lixiviado D y muestras de medio BAA, BBAN y APAN, los resultados revelaron la
presencia de 7 peaks (DMA, As (III), 4-HPAA y As (V), 3-AHPAA, MMA y 3NHPAA).
72
Los resultados obtenidos concuerdan con lo reportado por estudios
realizados por Garbarino, et al. (2003), los cuales determinaron que entre el 7090% del arsénico presente en el guano de pollo puede ser removido por el agua.
Por lo tanto, roxarsona puede permanecer en la superficie del suelo como también
puede ser movilizada verticalmente (lixiviación) o horizontalmente (escorrentía).
Además, estos autores, sugieren que procesos biológicos, mediados por la
comunidad bacteriana presente en el guano de pollo, son responsables de la
transformación de roxarsona. Lo cual se demuestra en este estudio ya que bajo
condiciones abióticas en la columna A, no ocurrió transformación de roxarsona.
Por otra parte, estudios realizados por diferentes autores demuestran que la
transformación de roxarsona puede ser en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, y
que producto de la degradación y transformación de roxarsona en ambas
condiciones, se producen compuestos arsenicales orgánicos como, ácido 4hidroxi-3-amino fenil arsénico (4-HPAA) ácido monometilarsénico (MMA (V)), ácido
monometilarsonoso
(MMA
(III)),
ácido
dimetilarsínico
(DMA
(V)),
ácido
dimetilarsinoso (DMA (III)), óxido de trimetilarsina (TMA (III)). Por otro lado los
compuestos arsenicales inorgánicos, producto de la biotransformación de
roxarsona reportados son, arsenito (As (III)) y en mayor proporción arseniato (As
(V) (Cortinas, et al., 2006, Stolz, et al., 2007, Andra, et al., 2010).
Además, trabajos realizados por Stolz, et al. (2007) y Chovanec, et al.
(2010), han demostrado
que la cepa OhILAs (identificada como Alkaliphilus
oremlandii), tiene la capacidad en condiciones anaeróbicas, de tolerar y
transformar roxarsona (1mM) en arsénico inorgánico, a través de la oxidación del
anillo bencénico de la roxarsona con la participación de proteínas como aldehído
ferredoxina oxidorreductasa y proteínas que contienen molibdopterina. Fisher, et
al. (2008), demostró que Alkaliphilus oremlandii tiene actividad arseniato
reductasa, la cual es expresada constitutivamente y se ha identificado la
participación del operón ars, el cual está involucrado en la resistencia bacteriana
de arsenito y arseniato.
73
Por otro lado, los análisis cromatográficos de la columna C (columna con
comunidad microbiana del suelo estéril y comunidad microbiana del guano sin
esterilizar) demostraron la presencia de solo 5 compuestos (DMA, As (III), 4HPAA, As (V) y 3-NHPAA), luego de 45 días de incubación. Aunque muchos
estudios han mencionados que la roxarsona es excretada sin transformación, en
las heces de los pollos, estos resultados son esperables, debido a que la
comunidad bacteriana del guano corresponden principalmente a microorganismos
anaeróbicos, conocidos por ser capaces de reducir una variedad de compuestos
nitro aromáticos, entre los cuales está Clostridium sp (bacteria reductora de
sulfato) y archaeas metanogénicas, éstos utilizan enzimas como, nitroreductasas,
hidrogenasas y deshidrogenasas, para el proceso de transformación de arsénico
orgánico a arsénico inorgánico (Cortinas, et al., 2006). En general, los resultados
obtenidos en los experimentos de microcosmos (columnas), concuerdan con los
resultados obtenidos por otros autores (Garbarino, et al 2003 y Jackson, et al
2001), demostrando que la comunidad bacteriana presente tanto en el guano de
aves de corral, como en el suelo, transforman rápidamente roxarsona en
diferentes compuestos organoarsenicales y arsénico inorgánico, los cuales
pueden ser fácilmente lixiviado y añadido a acuíferos y manantiales que proveen
de agua a la población.
El estudio de la toxicidad de roxarsona y compuestos derivados de la
biotransformación presentes en las muestras ensayadas, se realizó mediante la
utilización del bioensayo Toxi-Chromotest, el cual se basa en la capacidad de los
materiales tóxicos para inhibir la síntesis de novo de la enzima inducible βgalactosidasa en una cepa mutante de E. coli. Esta cepa bacteriana es altamente
sensible a un amplio espectro de sustancias tóxicas tales como plaguicidas,
micotoxinas y metales pesados. Además, la sensibilidad del ensayo se ve
reforzada por la exposición de las bacterias a condiciones estresantes antes de su
incorporación en los kits de prueba.
74
Los resultados obtenidos mediante este ensayo, indicaron que las muestras
Lx B, Lx C, Lx D, BAA, BBAN y APAN sin diluir, poseen porcentajes
significativamente altos de toxicidad sobre la síntesis de novo de la enzima βgalactosidasa, en las células bacterianas de E. coli (36.9%, 44.3%, 37.1%, 71.3%,
56.8% y 74.2%, respectivamente). Por otra parte, se observó que las células
tratadas con muestras de roxarsona (0,5mM) y Lx A, sin diluir, presentaron
porcentajes significativamente menores en relación a las demás muestras (7.5% y
11.4%, respectivamente). Además, se observó una disminución proporcional al
factor de dilución de la toxicidad en todas las muestras, llegando a alcanzar
porcentajes de toxicidad menores a 20%, con un factor de dilución de 64.
Dado que el agente tóxico se añadió antes de la inducción de las enzimas
de E. coli, la actividad enzimática sería un reflejo de la cantidad de enzima
producida por el cultivo y por lo tanto la inhibición de la actividad de la enzima, se
toma como la inhibición de la biosíntesis de la misma, producto de la presencia de
los iones metálicos en las muestras.
Con el fin de establecer posibles relaciones entre el porcentaje de toxicidad
y la presencia en porcentajes de las distintas especies arsenicales, presentes en
las muestras evaluadas, se efectuó una matriz de correlación de Pearson. Y se
observaron correlaciones positivas entre los porcentajes de toxicidad y la
presencia en porcentajes de las especies arsenicales, 4-HPAA, As (III), DMA,
MMA, As (V) y 3-AHPAA. Esto quiere decir que, cuanto mayor sea el porcentaje
de estas especies arsenicales en las muestras, mayor será el porcentaje de
toxicidad presentado por las células de E.coli. Por el contrario, se observó que
roxarsona (3-NHPAA), presentó índices de correlación negativos con el porcentaje
de toxicidad.
Diversos autores han descrito que el arsenito (As III) se une a los grupos
sulfhidrilo (-SH) de las proteínas, por los cuales tiene una alta afinidad. Lo que
produce una modificación en la estructura y función de las proteínas y por
75
consiguiente una alteración en los procesos metabólicos celulares (Kaltreider et
al., 2001). La unión de compuestos As (III) con grupos sulfhidrilo, tienen el
potencial para influir en la captación celular de la glucosa, la gluconeogénesis y la
oxidación de ácidos grasos. Por otra parte el arseniato (As V), al ser un análogo
del fosfato, entra a la célula por medio de vías específicas para el transporte de
fosfatos, inhibiendo la fosforilación oxidativa. A pesar de que el As (V) no
interactúa directamente con el ADN, los efectos indirectos del As (V) pueden crear
una alteración de la expresión génica, a través de la interrupción de la metilación
del ADN, la inhibición de la reparación del ADN, del estrés oxidativo, o la
alteración de la modulación de las vías de transducción de señales (Rosen & Liu,
2009).
Por otra parte, los compuestos orgánicos como, ácido 4-hidroxi-3-amino
fenil
arsénico
(4-HPAA),
monometilarsonoso
(MMA
ácido
(III)),
monometilarsénico
ácido
dimetilarsínico
(MMA
(DMA
(V)),
ácido
(V)),
ácido
dimetilarsinoso (DMA (III)), óxido de trimetilarsina (TMA (III)), han sido descrito
como de menor toxicidad que las especies arsenicales inorgánicas (Kenyon et al.,
2005; Li et al., 2004)
El estudio de toxicidad en HUVECs, mediante recuento de células viables,
indicó que, tanto muestras de roxarsona (0,5mM), como muestras de lixiviado A,
alcanzaron efectos similares sobre el porcentaje de viabilidad celular, cuyos
valores se mantuvieron por sobre el 90% (94.75% y 90.61%, respectivamente).
Estos resultados eran esperados, ya que el compuesto arsenical, detectado por
IP-RP-HPLC en la muestra de lixiviado A, corresponde a roxarsona.
Estos resultados no concuerdan a los reportados por Zhang et al. (2012),
los cuales compararon el efecto tóxico de roxarsona (1-500 uM) en células V79 y
señalaron que el compuesto organoarsenical roxarsona resultó ser citotóxico a
concentraciones superiores a 10 uM, cuando se evaluó con un kit comercial CCK8, utilizado para evaluar la viabilidad celular, y moderadamente genotóxico en el
76
ensayo de cometa y ensayo de micronúcleos utilizados para evaluar el daño del
ADN.
Por otra parte, las muestras de lixiviados B, C y D y las muestras de medio
BAA, BBAN y APAN, presentaron una disminución significativa de la viabilidad en
relación a las muestras control. Estos resultados pueden ser explicados por la
presencia de los compuestos arsenicales (4-HPAA, As (III), DMA, MMA, As (V) y
3-AHPAA), producto de la biotransformación de roxarsona, de mayor toxicidad.
Petrick et al. (2000) evaluaron la toxicidad in vitro del arseniato, arsenito,
MMA (V), MMA (III), y DMA (V), en hepatocitos humanos (células Chang),
mediante tres ensayos de citotoxicidad (LDH, K1 y XTT) y señalaron que el orden
de toxicidad en hepatocitos humanos fue el siguiente, MMA (III)> arsenito>
arseniato> MMA (V) y DMA (V).
Dopp et al. (2005) compararon los efectos cito/genotóxicos del arseniato,
arsenito, MMA (V), MMA (III), y DMA (V), después de un tiempo de exposición
prolongado y compararon las capacidades de absorción de compuestos
arsenicales por fibroblastos (células CHO-9) y células hepáticas (Hep G2). Y
señalaron que los compuestos arsenicales orgánicos e inorgánicos son absorbidos
en un mayor grado, por los fibroblastos en comparación con células hepáticas. El
metabolito arsenical DMA (III), fue la especie más permeable en las membranas
de ambas líneas celulares e indujo fuertes efectos genotóxicos en células CHO-9
después de un tiempo de exposición de 24 h.
El perfil metabólico fue realizado en presencia de roxarsona para observar
el nivel de estrés metabólico que presentan las comunidades bacterianas en
presencia del compuesto.
Los resultados metabólicos de muestras de suelo BA, DA, BB y DB,
demostraron que el desarrollo de color (AWCD), aumentó rápidamente en el
77
intervalo de 24 a 100 horas (dato no mostrado). Presumiblemente, este período 24
horas representaría una fase adaptación, necesaria para que las células logren
alcanzar una densidad de 108 células ml-1, requerida para el desarrollo del color en
un sistema Biolog (Konopka et al., 1998), lo que sugiere que el desarrollo de color
en estas muestras está dominado por un número de bacterias presentes
inicialmente en gran número, o por aquellas bacterias que poseen altas tasas de
crecimiento (Garland, J. L., 1996).
Los datos obtenidos, generalmente se comparan después de un tiempo de
incubación fijo, cuando los valores de absorbancia para la mayoría de los
sustratos están aumentando, pero no han alcanzado la saturación (Garland, J. L.,
1996). En este estudio, los datos obtenidos en 96 horas se eligieron para su
análisis.
La respuesta metabólica de la comunidad bacteriana del estrato aeróbico
del suelo de la columna A (AA), la cual contenía comunidades microbianas del
suelo estéril y guano estéril, presentaron valores de AWCD promedio menores a
0.01, durante todo el experimento. Esto demuestra que el proceso de esterilización
por calor, dio muerte a todos los microorganismos presentes en las muestras, por
lo cual no existe metabolización de los sustratos, ya que para que un sustrato sea
considerado como utilizado de manera positiva, se requiere de valores de AWCD
mayores a 0.25 (Garland, 1997). Además, entre los 0 y 15 días se observó que la
comunidad microbiana, del estrato aeróbico presente en la columna C, la cual
contenía una comunidad microbiana del suelo estéril y comunidad microbiana del
guano sin esterilizar (CA), también presentó un AWCD promedio cercano a 0,01.
Sin embargo, después de 30 días de incubación, se detectó un aumento
significativo en el promedio AWCD en la muestra CA, atribuyéndose este resultado
a la movilización de microorganismos de la comunidad del guano hacia los
estratos más profundos del suelo. Por otra parte, se observó que la actividad
metabólica promedio exhibida por las comunidades bacterianas de los estratos
aeróbicos del suelo de las columnas B (columna con comunidad microbiana del
78
suelo y guano sin esterilizar) y D (Columna con comunidad microbiana del suelo
sin
esterilizar
y comunidad
microbiana del
guano
estéril)
(BA y DA,
respectivamente), fue significativamente mayor en comparación a los valores
alcanzados por las comunidades microbianas presentes en los estratos AA y CA,
durante todo el experimento. Sin embargo, diferencias significativas entre las
muestras BA y DA, se presentaron desde el día 15 días hasta el termino del
experimento. Estos resultados pueden ser atribuidos a la perdida de la actividad
metabólica de la comunidad del guano en la columna D, tras ser esterilizada por
calor.
La respuesta metabólica de la comunidad bacteriana del estrato anaeróbico
del suelo de la columna A (AB), presentaron valores de AWCD promedio menores
a 0.01 durante todo el experimento, al igual que la comunidad presente en la
muestra AA. Además,
entre los 0 y 15 días se observó que la comunidad
microbiana del estrato anaeróbico presente en la columna C (CB), también
presentó un AWCD promedio cercano a 0,01. Sin embargo, después de 30 días
de incubación, se detectó un aumento significativo en el promedio AWCD en la
muestra CB. Por otra parte, se observó que la actividad metabólica promedio
exhibida por las comunidades bacterianas de las muestras BB y DB, fue
significativamente mayor en comparación a los valores alcanzados por las
comunidades microbianas presentes en los estratos AB y CB, durante todo el
experimento. Y diferencias significativas entre las muestras BB y DB, se
presentarían desde los 15 días de transcurrido el experimento.
Los parámetros calculados, sugieren que la diversidad funcional en suelos
enriquecidos con guano de pollo y roxarsona (0,5mM), fueron significativamente
mayores en relación al tiempo 0 y 15 días de incubación en ambos estratos del
suelo (estrato aeróbico y anaeróbico). Diversos estudios han reportado que los
índices de AWCD han sido útiles para documentar diferencias funcionales en los
suelos que han sido impactados ya sea por la contaminación química o por
aumento, a largo plazo, de materia orgánica (Albiach et al., 2000; Singh &
79
Agrawal, 2008; Frąc et al., 2012; Carrera et al. 2012). En este estudio, el suelo
agrícola parece contener, una población microbiana diversa, cuya capacidad
funcional se ve afectada significativamente por el aumento de la disponibilidad de
carbono, la presencia de roxarsona y la movilización de especies bacterianas
presentes en el guano al suelo. Lo que se reflejó en índices AWCD
significativamente mayores, obtenidos tras 15 días para las muestras BA, DA, BB
y DB, y 30 días para las muestras CA y CB.
Para comparar la diversidad catabólica entre las diferentes comunidades
microbianas presentes en los estratos aeróbicos y anaeróbicos del suelo de cada
columna, el índice de diversidad de Shannon (H) y la riqueza (S) tras 96 horas de
incubación fueron calculas. En general, la riqueza es igual a 0 a través de todo el
experimento en las muestras extraídas de la columna con comunidad microbiana
del suelo y guano estériles (AA y AB). En muestras del estrato aeróbico se
observó que la riqueza en las muestras BA y DA presentaron un aumento
significativo, luego de los 15 días de incubación,
en relación al tiempo 0. En
cuanto a la muestra CA, no existieron diferencias significativas entre el valor
promedio de riqueza a tiempo 0 y tiempo 15 días. Sin embargo, luego de 30 días
el valor de S, para la muestra CA aumentó significativamente. Por otra parte, no se
observó un cambio significativo en el valor de S para la muestra BA y para la
muestra DA el valor promedio de S disminuyó significativamente. En el día 45 se
observó que en relación al día 30, no ocurrió un cambio significativo en el valor
promedio de S para la muestra BA y que tanto la muestra CA como la muestra DA,
aumentaron significativamente su valor de S.
En el estrato anaeróbico de las columnas de suelo se observó, que la
riqueza en las muestras BB y DB presentaron un aumento significativo, después
de 15 y que para la muestra CB, no existieron cambios significativos en el valor
promedio de riqueza, en comparación al día 0. En cuanto a los valores promedio
de riqueza obtenidos en el día 30 para las muestras BB, CB y DB, se observó que
en relación al día 15, ocurrió una disminución significativa en el valor de S para la
80
muestra BB, para la muestra CB el valor de S aumentó significativamente y para la
muestra DB el valor promedio de S disminuyó significativamente (Fig..). En el día
45 se observó que en relación al día 30, no ocurrió un cambio significativo en el
valor promedio de S para la muestra BB y que tanto la muestra CB como la
muestra DB, aumentaron significativamente su valor de S.
Al analizar los valores de diversidad del consumo de las fuentes de
carbonos (H’) en muestras del estrato aeróbico de las columnas de suelo, se
observó que tanto las muestras AA y DA, presentaron valores de H cercanos a
2.88 y 3.3, respectivamente y que estos valores se mantuvieron constantes a
través de todo el experimento. Para el caso de la muestra BA se observó que el
valor promedio de H’ aumentó proporcionalmente en el tiempo, presentándose
diferencias significativas entre todas las muestras analizadas. Por otro parte, los
datos obtenidos para la muestra CA mostraron que entre los día 0, 15 y 30 no
existen diferencias significativas en los valores de H’, los cuales fueron cercanos a
3 y que en el día 45 ocurrió un aumento significativo del valor H’ en relación a los
días anteriores, alcanzando un valor promedio de 3.2.
Al analizar los valores de diversidad del consumo de las fuentes de
carbonos (H’) en muestras del estrato anaeróbico de las columnas de suelo se
observó que, las muestras AB, presentaron valores de H’ cercanos a 2.7 y que
estos valores se mantuvieron constantes a través de todo el experimento. Los
datos obtenidos para la muestra BB mostraron que entre los día 0 y 15 hubo un
aumento de los valores de H’. Posteriormente, este índice se mantuvo constante
hasta el día 30 y luego, aumentó significativamente hasta alcanzar valores
cercanos a 3.39. En cuanto a la muestra CB los datos de diversidad mostraron
que entre los día 0, 15 y 30 no hubo un aumento de los valores de H’.
Posteriormente, este índice aumentó significativamente en el día 45 alcanzando
valores cercanos a 3.11. Para el caso de la muestra DB se observó que el valor
promedio de H’ aumentó proporcionalmente en el tiempo de 3.18 a 3.40,
presentándose diferencias significativas entre todas las muestras analizadas.
81
Lo anterior demuestra, que a los 15 días el aumento de la disponibilidad de
carbono, la movilización de especies bacterianas presentes en el guano al suelo y
la utilización de roxarsona como fuente de carbono, podrían afectar positivamente
los índices de riqueza y de diversidad. Por otra parte se observa que luego de 30
días, esta riqueza disminuye significativamente en las muestras DA, BB y DB, lo
cual puede ser atribuido a la presencia de compuestos arsenicales inorgánicos de
mayor toxicidad para los microorganismos, producto de la metabolización
bacteriana de roxarsona en el suelo (Stolz et al., 2007; Konstantinos et al., 2008;
Yao et al., 2010), que podrían producir muerte celular y/o generar un impacto
negativo sobre de la capacidad metabólica de las bacteriana sensibles, para
consumir todas las fuentes de carbono en el Ecoplate, afectando directamente el
valor de S de cada comunidad. Esto es debido a que los metales pesados en altas
concentraciones pueden causar desnaturalización de proteínas, reaccionar con
ácidos nucleicos y fosfolípidos, destruir la integridad de las membranas celulares,
Por otra parte, los iones metálicos pueden forman compuestos complejos no
específicos en la célula, pudiendo detener la proliferación celular, afectando el
crecimiento, la morfología y metabolismo de los organismos (Giller et al, 1998;..
McGrath et al, 2001). Resultados similares fueron descritos por Jiang et al. (2012),
los cuales demostraron una clara disminución del de valor de AWCD por la adición
de roxarsona al suelo, atribuyendo este fenómeno al efecto toxico que generaría la
presencia de roxarsona en el suelo. Posteriormente, la selección de bacterias
capaces de tolerar los compuestos tóxicos, reestablecerían los valores de S y H’
dentro de las comunidades. Resultados similares de desarrollo de tolerancia, se
han descrito en comunidades microbianas expuestas a metales pesados (Kiran y
Thanasekaran, 2011).
Índices como AWCD, la riqueza de sustrato, y la diversidad de sustrato
proporcionan información acerca del número, la actividad, y la tasa a la que los
sustratos son utilizados, pero proporcionan poca información sobre los tipos de
sustratos utilizados por comunidades bacterianas. Por lo anterior, se dividieron los
82
sustratos de carbono presentes en la placa Biolog ecoplate en 5 categorías,
carbohidratos, ácidos carboxílicos, aminoácidos, polímeros y aminas, según lo
descrito por Garland y Mills (1991). Y el estudio de la utilización de los sustratos
por las comunidades bacterianas presentes en los suelos, se realizó mediante
análisis de componentes principales (PCA) de los datos obtenidos para las
distintas fuentes de carbono disponibles, luego de 96 horas de incubación a 25°C.
El PCA realizado de los valores de AWCD de las distintas fuentes de
carbono obtenidos de la comunidad bacteriana presente en las muestras BA, BB,
CA, CB, DA y DA en presencia de roxarsona, explica que la mayoría de las
variaciones totales observadas en los datos, se explica por los dos primeros
componentes principales (95.9% y 3.4%; 93.4% y 6.3%; 96.1% y 3.9%; 97% y 3%;
86.8% y 11.3%; 91.3% y 7.7%, en PC1 y PC2, respectivamente). PC1 fue
correlacionado positivamente con la oxidación de carbohidratos, aminoácidos,
ácidos carboxílicos y polímeros. Por otra parte, el segundo componente principal
(PC2) tuvo mayor correlación positiva con oxidación de las aminas.
En general se observó que durante los primero 0-15 o 0-30 días, las
comunidades bacterianas evidenciaron una alta capacidad oxidativa por las
aminas (muestras, BA, BB, CA, CB, DA y DB). Posteriormente, a los 45 días se
produjo un cambio en los tipos de sustratos utilizados por las comunidades
bacterianas,
aumentando
la
capacidad
de
oxidación
de
carbohidratos,
aminoácidos, ácidos carboxílicos y polímeros, por sobre la de las aminas
(muestras, BA, BB, DA Y DB). Por el contrario, en las muestras CA y CB a ese
mismo tiempo, se observó una actividad oxidativa para ambos componentes con
una alta correlación positiva.
La oxidación de las aminas en relación a la degradación de roxarsona, se
relaciona por las reacciones que deben ocurrir para la degradación de roxarsona,
que como se discutió anteriormente, la primera reacción es la reducción del grupo
nitro, lo cual transforma a roxarsona en una amina funcional (Wershaw y col.,
83
1999), reforzando la importancia de la oxidación de las aminas de la comunidad
bacteriana. Por otra parte, las comunidades después de 45 días tienen mayor
capacidad oxidativa sobre carbohidratos, aminoácidos, ácidos carboxílicos y
polímeros, lo cual explicaría el aumento significativo de la actividad metabólica.
El análisis de las comunidades bacterianas del suelo y guano por DGGE
indicó que las muestras de suelo BA a tiempo 0 (BA0) y DA a tiempo 0 (DA0), no
difieren significativamente en la riqueza de especies bacterianas. Resultados
similares fueron obtenidos para las comunidades bacterianas presentes en las
muestras de suelo BB a tiempo 0 (BB0) y DB a tiempo 0 (DB0). Sin embargo, al
comparar estos resultados con los obtenidos a tiempo 45 días, estas difieren
significativamente. Además los resultados demuestran un aumento significativo de
la riqueza en las muestras, BB45 en relación a BB0, CA45 en relación a CA0 y
CB45 en relación a CB0. Estos resultados demuestran que la tanto la materia
orgánica,
como
la
presencia
de
compuestos
tóxicos,
producto
de
la
biotransformación de roxarsona, ejercen una presión selectiva significativa sobre
la comunidad bacteriana presente en muestras ambientales.
Los microorganismos han desarrollado diversos mecanismos de tolerancia
para hacer frente a la toxicidad del arsénico. Mientras que algunas bacterias, son
solo capaces de reducir el arseniato como forma de detoxificación, otras, además
utilizan el arseniato como aceptor terminal de electrones dentro del proceso de
respiración anaerobia. La oxidación microbiana de As (III) a As (V) también puede
afectar la movilidad y la especiación del arsénico en el ambiente (Ehrlich, 2002).
Los organismos capaces de realizar este proceso son fisiológicamente diversos, e
incluyen a heterótrofos y quimiolitoautótrofos oxidantes de arsenito. La oxidación
heterotrófica de As (III), se ve como una reacción de detoxificación, que convierte
el As (III), ubicado en el exterior de la membrana celular, en As (V), menos tóxico
para la bacteria (Stolz, J.F. et al, 2002).
84
En el caso de ambientes ricos en arsénico, la reducción del arseniato,
puede representar un aceptor terminal de electrones para la mineralización de
carbono orgánico (Oremland et al., 2000). Brannon y Patrick (1987) encontraron
que la adición de arseniato a un sedimento anaeróbico presentó como resultado
una acumulación de arsenito, demostrando la reducción bacteriana de arseniato a
arsenito. Ahmann et al. (1997) demostraron que los microorganismos nativos eran
responsables del flujo de arsénico en sedimentos anóxicos contaminados.
Harrington et al. (1998) han demostrado la capacidad reductora de arseniato de
microorganismos presentes en sedimentos. Estos investigadores también
encontraron que bacterias reductoras de fierro (DIRB) y bacterias reductoras de
sulfato (SRB) eran capaces tanto de oxidar como reducir arsénico y así contribuir
al ciclo del arsénico en sedimentos.
El índice H' obtenido por el análisis de OTUS, demuestra que existe una
mayor diversidad de especies en las muestras de suelo BB45, BB0, DB0 y CA45.
Por otra parte, El índice J' indica que las abundancias están más uniformemente
distribuidas en las muestras de suelo BA0, BA45, DA0 y DB45. Además, el índice
de dominancia de Simpson nos indicó que existe una mayor dominancia de alguna
de las bandas u OTUS en las muestras BA45 y DB45. Estos resultados son
característicos de ambientes, donde las condiciones del medio son adversas lo
que permite el desarrollo de unas pocas especies dominantes. Sun y col. (2004),
reportaron que en general la enmienda orgánica, promueve la diversidad y
produce una distribución más equitativa de las especies bacterianas dentro de la
comunidad.
Al analizar el patrón de bandeo u OTUS,
mediante el método del
escalamiento multidimensional (MDS). Se demostró que las muestras CA45, CB45
y G poseen un índice de similitud de un 60% en la estructura de sus comunidades
bacterianas. Un segundo grupo de asociación se ve representado en el
escalamiento multidimensional del patrón de bandeo, el cual está formado por las
muestras DA0 y BA0, con un 60% de similitud. Por otra parte, las muestras BB0,
85
BB45 y DB0, forman un tercer grupo de asociación que también presenta un 60 %
de similitud. Un cuarto grupo se ve representado por las muestras BB0, BB45,
DB0, CA45, CB45 y G, con un 50% de similitud. Por último, las muestra BA45,
DA45 y DB45 por sí solas, estarían formando un quinto, sexto y séptimo grupo,
respectivamente, al no presentar similitud significativa en la estructura de sus
comunidad bacteriana, con las demás muestras. Estos resultados concordaron
con los análisis jerárquico de conglomerados (índice de Bray-Curtis), que señaló
claramente la conformación de 7 grupos distintos (Fig. 10B).
El análisis de las comunidades bacterianas por DGGE indicó que tanto, la
presencia de roxarsona, como la presencia de compuestos arsenicales de mayor
toxicidad producto de la biotransformación de roxarsona (As (III), As (V), DMA,
MMA, 3-AHPAA, 4-HPAA), influyeron directamente en la estructura de las
comunidades. Evidenciándose una disminución significativa, de la riqueza de
especies de las comunidades bacterianas en las muestras de suelo recolectadas a
45 días, en relación al tiempo 0. Por otra parte, se conoce que en general los
metales pesados pueden romper la estructura y funcionamiento del ecosistema.
Por la misma razón, se puede esperar que algunas vías metabólicas en los
microorganismos serían más sensibles a roxarsona y a los compuestos productos
de su biotransformación. Esto concuerda además, con los perfiles metabólicos
obtenidos para cada comunidad, que reportaron en general una disminución
significativa de ciertos grupos de fuentes de carbono durante los primeros 15 días.
Pudiendo ocurrir una inhibición selectiva de microorganismos en la comunidad,
cuando aumentó la concentración de especies arsenicales inorgánicas en el
medio. La inhibición selectiva de vías específicas daría lugar a la disminución del
número y la diversidad de organismos que dependan de esas vías (Sobolev &
Begonia, 2008).
Por otra parte la movilización de la comunidad bacteriana del guano al suelo
y las características físico-químicas del mismo (principalmente en el contenido de
materia orgánica), serían otros factores que produjeron cambios en la estructura
86
de las comunidades, lo que se reflejó en importantes variaciones en, los
porcentajes de similitud entre las comunidades de las muestras, como por ejemplo
el grupo conformado por las muestras CA45, CB45 y G que tras 45 días
aumentaron el porcentaje de similitud de 0% a un 60%, como en la riqueza de
especies dentro de cada comunidad, como por ejemplo un aumento significativo
de la riqueza de especies en las muestras BB45, CA45 y CB45, en relación al
tiempo 0. Sun y col. (2004), reportaron mediante la utilización de DGGE, cambios
en la estructura y diversidad de la comunidad bacteriana asociada a suelos
agrícolas fertilizados con estiércol por más de 100 años, describiendo que en
general la enmienda orgánica, enriquece a la comunidad bacteriana del suelo,
promueve la diversidad y produce una distribución más equitativa de las especies
bacterianas dentro de la comunidad. Chu y col. (2007) compararon la fertilización
mineral, con la fertilización orgánica y esta última mostró superioridad en el
aumento de la riqueza y la diversidad de especies bacterianas del suelo. Esto
probablemente puede ser atribuido a, un aumento de la actividad metabólica de
los microorganismos y a un aumento de la biomasa microbiana del suelo (Plaza et
al, 2004; Zhong et al, 2009. & Islam et al, 2011).
El análisis filogenético sugiere que la mayoría de los taxones se encuentran
afiliados al filo Firmicutes (47,7 %) en los suelos utilizados en este estudio,
mientras que Bacteroidetes (Wu y col. 2012) y Proteobacterias (Ge et al, 2008;
Sun et al, 2004,) dominaron el total de taxones bacterianos en sitios fertilizados
durante largos periodos de tiempo con materia orgánica, que en general fue
causado por el tipo de suelo utilizado en cada estudio. Los tipos de suelo en
nuestro estudio han sido clasificados como alfisoles, definitivamente diferentes de
los tipos de suelo regosoles (Wu y col. 2012), franco arenoso (Ge et al., 2008), o
franco limoso (Sun et al., 2004).
Por otra parte, bacterias perteneciente al filo Firmicutes, son conocidas por
ser organismos anaerobios, que viven en el suelo, sedimentos, rumen, heces etc
(Wiegel et al., 2006). De hecho, las bacterias agrupadas en la clase Clostridia, han
87
sido aisladas desde estiércol de pollo (Stolz et al., 2007). Las cuales han
presentado la capacidad de biotransformar el compuestos organoarsenical
roxarsona en compuestos arsenicales inorgánicos (Stolz et al., 2007). Además, se
ha reportado que Bacillus spp, dominan las etapas iniciales del proceso de
compostaje (Ishii et al, 2000 y Dees & Ghiorse, 2001). En las columnas en
experimentos de microcosmos se favoreció la colonización de este tipo de
microorganismos, ya que condiciones de anaerobiosis, pudieron presentarse en
los estratos más profundos del suelo (B) de cada columna y por otra parte, se
desarrolló un proceso de compostaje del guano de pollo adicionado a cada
columna a través del tiempo, en los estratos superiores.
El
segundo
correspondió,
al
grupo
filo
mayormente
representado
Proteobacteria
en
nuestro
(alphaproteobacteria
estudio
(13.6%),
bethaproteobacteria (11.4) y gammaproteobacteria (11.4%)), el cual ha sido
descrito ser muy abundante en suelos agrícolas (Ellis et al., 2003; He et al., 2006).
Y se han relacionado en etapas tempranas de compostaje de materia orgánica
(Yamamoto et al., 2009).
Un 2.3% de las bacterias secuenciadas pertenecieron al filo Bacteroidetes,
las cuales han sino implicadas en la degradación de guano lignocelulósico debido
a su capacidad para degradar biopolímeros complejos (Martínez-Alonso et al.,
2010).
Por otro lado, mucho de los microorganismos presentes en las muestras de
suelo deben ser capaces de transformar también especies inorgánicas de
arsénico. La diversidad de bacterias capaces de reducir arsenito se extiende a
bacterias del grupo de las δ-proteobacteria, ε- proteobacteria, bacterias Gram
positivas del genero Clostridium, Bacillus, Desulfitobacterium y Chrysiogenis
arsenatis (Oremland & Stolz, 2003). En condiciones anaeróbica el As (V) puede
ser utilizado como aceptor final de electrones produciéndose una reducción del
arsénico (Silver & Phung, 2005), este proceso se ha descrito en Pyrobaculum
arsenicum (Oremland & Stolz, 2003) y en una cepa bacteriana Gram positiva de
88
bajo contenido G+C identificada como Desulfotomaculum auripigmentum, en estas
bacterias, el citocromo c entrega
los electrones a una arsenato reductasa
codificada por los genes arr (Silver & Phung, 2005). En el caso de la diversidad de
bacterias arsenito-oxidantes ha sido estudiada principalmente mediante técnicas
moleculares, amplificando el ADNr 16S demostrando que estos microorganismos
pertenecen a los grupos α, β y γ proteobacteria (Santini et al, 2002; Salamassi et
al, 2005; Mokashi & Paknikar, 2002; Simeonova et al, 2004), bacterias del genero
Termus (T. aquaticus y T. termophilus) y también algunas especies del dominio
archaeas, en particular hipertermofílicas Aeropyrum pernix y en Sulfolobus
tokodaii, y también en la bacteria fotosintética Chloroflexus aurantiacus, la que no
estaría relacionada con los genes aso y aox. (Santini et al, 2002; Simeonova et al,
2004).
La capacidad de carga (Rr) de las comunidades bacterianas provenientes
de las muestras de suelo BA0, BA45 y DB45, reportan valores menores a 10,
estos valores se atribuyen a ambientes particularmente adversos o a aquellos
ambientes que restringen la colonización, como por ejemplo suelos contaminados
y que se caracterizan por presentar bajos valores de riqueza de especies
(Marzorati et. al., 2008). Esto concuerda con los valores de S obtenidos para estas
comunidades, cuyos valores fueron significativamente bajos (12, 4 y 4.5,
respectivamente). Por otra parte, se reportó una capacidad de carga media solo
en la comunidad bacteriana proveniente de la muestra DA45. Mientras que para
las muestras BB0, BB45, CA45, CB45, DA0, DB0 y G, se reportaron valores de Rr
mayores a 30, lo cual es típico de ambientes muy habitables (con amplia
capacidad de carga), caracterizados por una alta diversidad microbiana y que
poseen un alto rango de riqueza ponderada (Marzorati et. al., 2008). Esto
concuerda con los valores de riqueza y diversidad analizados previamente para
estas comunidades, cuyos valores de S y H’ variaron de 15.5 a 38.5 y 2.70 a
3.53, respectivamente.
89
5. CONCLUSIONES
Los ensayos utilizando muestras de suelo y agua de pozo en presencia de
roxarsona, evidenciaron la transformación del compuesto organoarsenical,
demostrando además diferencias en los porcentajes de degradación según el
medio de cultivo utilizado.
Los experimentos de microcosmos y en cultivos, demostraron que la
comunidad bacteriana, presente tanto en el guano de pollo como en el suelo
agrícola, son los responsables de la transformación de roxarsona, la cual puede
ocurrir bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
Los principales productos obtenidos de la biotransformación de roxarsona
en cultivos con suelo y agua de pozo, fueron el 4-HPAA, As (III), DMA, MMA, As
(V) y 3-AHPAA,
Los experimentos de microcosmos demostraron diferencias en los
productos de biotransformación de roxarsona presentes en los lixiviados de cada
columna, lo que estaría directamente relacionado con la estructura de la
comunidad bacteriana residente, en las muestras de suelo y guano.
La toxicidad de los compuestos generados por la biotransformación de
roxarsona, fue significativamente alta, tanto en células eucariontes, como en
procariontes y la mayor toxicidad estaría directamente correlacionada con la
presencia, en mayor proporción, de especies arsenicales inorgánicas.
El suelo agrícola contiene una población microbiana diversa, cuya
capacidad metabólica funcional, se ve afectada por el aumento de la disponibilidad
de materia orgánica, la movilización de especies bacterianas presentes en el
guano de pollo y la presencia de roxarsona y compuestos derivados de su
biotransformación.
90
La capacidad oxidativa por aminas de las comunidades bacterianas
presentes en el suelo y guano de pollo, se ve incrementada durante el proceso de
biotransformación de roxarsona.
El análisis de las comunidades bacterianas por DGGE demostró que la
presencia de roxarsona y de compuestos arsenicales de mayor toxicidad, producto
de la biotransformación del compuestos organoarsenical (As (III), As (V), DMA,
MMA, 3-AHPAA, 4-HPAA), influyeron directamente en la estructura de las
comunidades del suelo.
Los experimentos de microcosmos demostraron que la comunidad
bacteriana presente en la muestras de guano migran a los estratos inferiores del
suelo, provocando cambios en la estructura de la comunidad de este.
La capacidad de carga (Rr) de las comunidades bacterianas presentes en
los experimentos de microcosmos, se ve influenciada por la presencia de guano
de pollo enriquecido con roxarsona.
Las comunidades bacterianas asociadas en diferentes estratos del suelo,
transforman la roxarsona presente en el guano de pollo, en compuestos altamente
solubles y tóxicos, los cuales pueden ser fácilmente movilizados hacia diferentes
cuerpos de agua.
91
6. PROYECCIONES
Implementar
metodologías
experimentales,
que
permitan
esclarecer
los
mecanismos de toxicidad celular, de los compuestos arsenicales producto de la
biotransformación de roxarsona.
92
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