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Concours allocation de recherche 2015
Ecole Doctorale BIOLOGIE SANTE de Lille (ED446)
CARACTERISATION DU MODE D'ACTION DE PETITES MOLECULES SUR
LES PROCESSUS PATHOLOGIQUES DE LA MALADIE D’ALZHEIMER
Laboratoire : Inserm UMR S1172 (Directeur : Luc Buée)
Equipe : Alzheimer & Tauopathie (Directeur : Dr Luc Buée)
Tuteur : Nicolas Sergeant
Candidate: Caroline Evrard
Résumé
La maladie d’Alzheimer (MA) est une démence neurodégénérative lente et progressive
combinant deux mécanismes physiopathologiques : la pathologie amyloïde et la pathologie Tau.
La pathologie amyloïde intègre les mécanismes moléculaires et cellulaires conduisant à la
formation des peptides β-amyloïdes, constituants essentiels des dépôts amyloïdes
parenchymateux. La pathologie Tau comprend les mécanismes conduisant à l’accumulation et
l’agrégation des protéines Tau microtubulaires anormalement modifiées au niveau des neurones,
formant la dégénérescence neurofibrillaire. Bien que ces deux mécanismes et leur retentissement
sont toujours intensément étudiés, leur possible interaction reste mal connues. Il n’existe à l’heure
actuelle aucun traitement de la maladie, les médicaments disponibles, tels les anticholinenergiques, n’offrent qu’un traitement symptomatique de courte durée. De nouvelles
molécules sont donc nécessaires. Dans ce contexte, une famille de composés, appelés MSBD, a
été synthétisée et testée en collaboration avec le Pr Patricia Melnyk (Equipe Neuro et Oncochimie
de l’UMR S1172). Ces composés ont montré leur potentiel application thérapeutique comme
modulateur des processus pathologiques de la MA en réduisant la libération des peptides Aβ
d’une part et la quantité de protéines Tau hyperphosphorylées d’autre part. Une cible des MSBD
vient d’être découverte et constitue le point de départ du projet de thèse. Les résultats
préliminaires du laboratoire ont identifié la Valosin Containing Protein (VCP/p97) comme ligand
des MSBD. Elle appartient à la famille des ATPases aux fonctions multiples ou AAA-ATPase.
Notre projet devra donc définir le mode d’action des molécules sur l’activité de VCP/p97 et
établir les mécanismes cellulaires de contrôle des pathologies amyloïde et Tau. Ces mécanismes
seront étudiés à l’aide de modèles cellulaires et animaux.
1. Le projet de thèse
Le projet de thèse devra contenir une partie introductive sur la maladie d’Alzheimer, la
physiopathologie, l’homéostasie protéique et le rôle de VCP. Par exemple :
1.1 Système d’élimination des protéines mal repliées et VCP
VCP, aussi appelée p97 et CDC48 fait partie de la famille des AAA-ATPase, les ATPases avec
de multiples activités cellulaires. Un gène VCP unique situé sur le bras court du chromosome 9
code une isoforme VCP de 806 aa. VCP possède trois domaines. Un domaine CDC48 suivi de
deux domaines ATPases D1 et D2, séparés par deux séquences de jonction L1 et L2 (Fig. 1).
Le domaine CDC48 est le domaine d’interaction avec des cofacteurs, le premier domaine ATPase
D1 contribue à l’homohexamérsation et le domaine ATPase D2 est celui qui porte l’activité
catalytique de chaperonne pour rétablir la bonne conformation des protéines. Ainsi, VCP/p97
joue un rôle essentiel pour l’homéostasie protéique et l’élimination des protéines mal repliées via
le système ubiquitine protéasome. Elle est décrite dans le processus de dégradation associée au
réticulum endoplasmique avec les protéines mal-repliées ou mal-conformées (ERAD),
l’endocytose, l’élimination des agrégats via le système UPR (unfolded protein response), la
mitophagie, l’autophagie et la protection des dommages à l’ADN… (Fessart et al., 2013).
1.2 VCP et maladies neurodégénératives
1 Des mutations de VCP sont associées avec le développement de myosites à inclusion associées à
une maladie de Paget et une démence frontotemporale (IBMPFD), supposant une perte de
fonction de VCP et un découplage mitochondriale (Bartolome et al., 2013). L’élimination des
agrégats de Huntingtine polyQ est favorisée par VCP (Kobayashi et al., 2007). VCP régulerait
également de métabolisme de l’APP. Ainsi, la perte d’expression de VCP conduit à une
augmentation de production des peptides Aβ (Wakabayashi et al., 2009). Un stress du réticulum
est décrit dans les neurones en dégénérescence dans la MA. La protéine VCP est retrouvée dans
le compartiment synaptique et co-localise également avec les agrégats de Tau (Abisambra et al.,
2013). Bien que les inhibiteurs pharmacologiques de VCP existants trouvent essentiellement leur
application dans le cancer, VCP pourrait être également une cible thérapeutique intéressante dans
le cadre des maladies neurodégénératives comme la MA.
2. Problématique
Le développement de molécules pharmacologiques suppose, à priori, la connaissance de la cible
et du mode d’action (agoniste, antagoniste ou modulateur …) et, à fortiori, un effet phénotypique
sur des modèles validés de la pathologie. Des études préliminaires ont montré leur potentielle
application thérapeutique comme modulateur des processus pathologiques de la MA. Les résultats
préliminaires établissent une activité phénotypique des molécules MSBD sur la pathologie
amyloïde et la pathologie Tau. Cependant, la cible pharmacologique reste à confirmer et le
mécanisme d’action des molécule à élucider.
3. Etat de l’art
Afin de déterminer la cible potentielle des MSBD, des dérivés ont été synthétisés, couplés à une
matrice d’affinité ou substitués par un groupement benzophenone photoactivable. Soit par
affinité, soit par photocouplage, purification et identification par spectrométrie de masse, les
résultats du laboratoire montrenty que VCP est un ligand des MSBD. En outre, des études
cellulaires préliminaires de surexpression de VCP montrent une diminution de la production des
peptides Aβ et une réduction de la phosphorylation de Tau. De plus, les molécules MSBD
inhiberaient les effets d’un stress du réticulum induit par la tunicamycine. L’ensemble de ces
résultats préliminaires suggère qu’une partie ou la globalité de l’activité des MSBD se fait par la
protéine VCP/p97. Bien que ce faisceau d’arguments semble indiquer que VCP, il faut déterminer
les mécanismes de régulation mis en jeu pas les molécules MSBD.
4. Projet
Après avoir validé l’effet thérapeutique des MSBD sur les pathologies Tau et amyloïde, il faut
connaître la cible. Cela consiste donc à déterminer le site de liaison, les acides aminés engagés
dans cette liaison (Figure 1) la position du pharmacophore des MSBD dans la protéine. Cette
partie du projet sera réalisée en collaboration avec l’équipe de P. Melnyk.
4.1 Mode d’action des molécules MSBD sur VCP
Afin de déterminer le rôle des MSBD (agoniste, antagoniste ou modulateur) sur l’activité de
VCP. Nous disposons au laboratoire de plusieurs modèles cellulaires Tau et APP utilisant une
lignée continue de neuroblastome humain SY5Y.
4.2 L’invalidation et les mutants de VCP
A l’aide d’ARN interférents ou de shRNA, nous réduirons l’expression endogène de VCP dans
les SY5Y naïves, avec ou sans surexpression de l’APP ou de la Tau humaine. Afin de déterminer
si l’effet des MSBD est entièrement dépendant de VCP, nous réaliserons un co-traitement des
cellules dont l’expression de VCP est réduite. La production des peptides Aβ et la
phosphorylation de Tau sera analysée par biochimie (immuno-empreinte, ELISA…). Nous
utiliserons également les mutants de VCP développés dans la première partie du projet.
2 L’expression ectopique de ces mutants dans les cellules n’exprimant pas l’endogène permettra de
répondre en partie à la question de la fonction de VCP qui est modifiée par les MSBD.
4.3 Les partenaires de VCP
L’activité de VCP implique des cofacteurs qui interagissent avec le domaine CDC48 (Ufd1-Upl4,
UBXD1, UBX …) (Fessart et al., 2013). Nous disposons de la VCP humaine dans plusieurs
vecteurs d’expression eucaryote fusionnée à des étiquettes telle que la GFP, le peptide V5 ou la
StrepTagII permettant l’étude de localisation intracellulaire et l’immuno-isolation par affinité (par
exemple, le GFP-Trap® Beads de chez Chromotek). Nous pourrons ainsi dans nos modèles
cellulaires exprimer ces protéines modifiées, étudier leur localisation et les cofacteurs associés en
condition de traitement par les MSBD ou pas. De plus, afin d’étudier plus précisément l’activité
de VCP au regard de l’ERAD et du stress du réticulum (UPR), nous avons développé une
collaboration avec Eric Chenet (Inserm U1045, Bordeaux, France) qui dispose de système
cellulaire d’analyse de substrat de l’ERAD ainsi que de nombreux marqueurs de la voie du stress
du réticulum.
4.4 Modulation de la pathologie amyloïde et la pathologie Tau par les MSBD
Nos résultats préliminaires montrent une interaction entre VCP et l’APP dans notre modèle
SY5Y-APP. De plus, les traitements par les MSBD favorisent la co-localisation de VCP et APP à
la surface de vésicules dont la nature reste à établir. Néanmoins, la conséquence du traitement se
traduit par une réduction de la production des formes pro-agrégatives des peptides Aβ. Cette
partie de notre projet devrait permettre d’établir comment les MSBD modulent l’activité de VCP
sur le métabolisme de l’APP vers la diminution des formes synaptotoxiques des peptides Aβ.
Nous utiliserons à cette fin, les outils moléculaires développés pour déterminer les mécanismes
d’interaction de VCP à l’APP et comment VCP module l’activité γ-secrétase.
Concernant, la pathologie Tau, les données les plus récentes de la littérature supposent une
activation de l’UPR, de l’ERAD et une co-localisation de VCP aux agrégats de Tau. Nous
disposons du modèle transgénique Thy-Tau22 qui reproduit une pathologie Tau hippocampique
associée à une atteinte de la mémoire spatiale (Burnouf et al., 2013). Nos résultats montrent que
le traitement par MSBD maintient la mémoire spatiale et réduit la pathologie Tau dans ce modèle.
Comment intervient VCP dans ce système ? Nous procéderons à une analyse détaillée par
biochimie et immunohistochimie de la localisation de VCP et des voies de signalisation associées
à l’ERAD et l’UPR. Nous envisagerons également de valider ce résultat à l’aide d’un modèle
murin qui exprime le locus du gène Tau humaine, modèle hTau qui devrait se rapprocher
davantage du métabolisme normal de la protéine Tau humaine non-mutée. Ces modèles de
pathologie Tau et l’ensemble des approches expérimentales sont disponibles et utilisés dans le
laboratoire.
5. Résultats escomptés
L’impact de ce travail est double. D’une part, la caractérisation du site d’interaction avec la cible
permet d’envisager le développement d’un test de sélection de nouvelles molécules plus
spécifiques et plus affines. D’autre part, ce travail apporte des éléments de compréhension
fondamentaux aux regards du rôle de VCP pour la modulation du métabolisme de l’APP mais
également sur la réduction des agrégats de Tau. Des modulateurs de l’homéostasie protéique
semblent donc une bonne piste thérapeutique dans les maladies neurodégénératives.
6. L’adéquation du profil du candidat au projet de thèse
La candidate devra avoir une expérience en biologie du vieillissement et en biologie cellulaire.
7. Références
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3 Burnouf S, Martire A, Derisbourg M, Laurent C, Belarbi K, Leboucher A, Fernandez-Gomez FJ, Troquier L, Eddarkaoui S, Grosjean
M-E, Demeyer D, Muhr-Tailleux A, Buisson A, Sergeant N, Hamdane M, Humez S, Popoli P, Buée L & Blum D (2012) NMDA
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Bartolome F, Wu H-C, Burchell VS, Preza E, Wray S, Mahoney CJ, Fox NC, Calvo A, Canosa A, Moglia C, Mandrioli J, Chiò A,
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