Aktuality súčasného biomedicínskeho výskumu I.
Ústav lekárskej biológie a genetiky LF UK v Bratislave a PROBIOLMED Daniel Böhmer a Ľuboš Danišovič Aktuality súčasného biomedicínskeho výskumu I. Asklepios Bratislava 2007 Aktuality súčasného biomedicínskeho výskumu I. Editori: doc. MUDr. Daniel Böhmer, PhD., RNDr. Ľuboš Danišovič Recenzent: prof. MUDr. Gustáv Čatár, DrSc. Vydal: Asklepios, Bratislava, December 2007 ISBN: 978–80–7167–120–6 Obsah 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Predslov ............................................................................................................................ Jozef Adámať, Robert Petrovič, Katarína Kolejáková, Danka Maceková, Mária Fischerová, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Ján Chandoga: Canavanova choroba – biochemický a molekulovo–genetický algoritmus v diagnostike ochorenia ……….. Ľuboš Danisšovič, Juraj Krajčovič, Ján Vojtaššák: Testovanie toxicity chemických látok v podmienkach in vitro ………………………………………………………….. Mária Fischerová, Robert Petrovič, Lívia Lukáčková, Katarína Kolejáková, Jozef Adámať, Ján Futas, Danka Maceková, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Darina Ďurovčíková, Ján Chandoga: Genómový imprinting, molekulárno-genetická diagnostika Prader-Williho/ Angelmanovho syndrómu …………………………….. Paulína Gálfiová, Katarína Bevízová: Morfológia mikrocirkulácie ľudskej sleziny – súčasný stav poznania ..................................................................................................... Alena Hercegová, Eliška Gálová, Andrea Ševčovičová: Štúdium regulácie bunkového cyklu u fotoautotrofných mikroorganizmov ............................................. Lívia Hlavačková, Pavol Janega, Silvia Líšková, Pavel Babál: Changes in endothelial and inducible NO synthase in aortic media after administration of red wine polyphenols ...................................................................................................................... Ivana Hojsíková, Gabriela Pavlíková, Dalibor Hojsík, Peter Križan: Chronická myeloická leukémia z pohľadu genetiky a molekulovej biológie ............................... Dušan Hollý, Jozef Mračna: Využitie augmentačných techník v chirurgickej terapii parodontopatií ................................................................................................................. Roman Hudec, Lýdia Božeková, Milan Kriška: Možnosti monitoringu liekového rizika ................................................................................................................................. Lucia Kalinovská, Silvia Bubeníková, Dušan Bakoš: Enzymatic degradation of chitosan-based microspheres ......................................................................................... Katarína Kolejáková, Robert Petrovič, Mária Fischerová, Danka Maceková, Jozef Adámať, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Darina Ďurovčíková, Ján Chandoga: Biochemická a molekulárno–genetická diagnostika Smith–Lemli–Opitzovho syndrómu ......................................................................................................................... Georgína Kolníková, Vanda Repiská, Peter Kolník, Ľudovít Danihel: Význam HPV v etiopatogenéze prekanceróz a karcinómu krčka maternice ....................................... Martin Kopáni, Michal Behuliak, Peter Celec, Ivan Varga, Miriam Petrová, Štefan Polák: Ultraštruktúrne zmeny indukované alkoholom v mozočku potkana po génovej terapii ................................................................................................................. Martin Kopáni, Ľuboš Danišovič, Dimitris Hatzibougias, Martin Wawruch, Dalibor Hojsík, Michal Korman, Bohuslav Uher, Roman Moravčík, Juraj Bugala, Marek Bučko, Lívia Hlavačková, Alexandra Krištúfková: Identifikácia proteínu PCNA v karcinóme endometria .................................................................................................... Marcela Kopásková, Eva Miadoková, Slavomíra Naďová, Viera Vlčková, Viola Dúhová, Peter Rauko, Pavel Mučaji, Daniel Grančai: Biologicky aktívne látky prírodného charakteru s potenciálnym využitím pri prevencii a terapii nádorových ochorení ...................................................................................................... Miroslav Kubeš, Zohdy Hamid, Ján Vojtaššák: Perspektívy využitia kmeňových buniek z pupočníkovej krvi ............................................................................................ Monika Laššánová, Milada Laššánová, Ján Murín: Znižovanie rizika liečby a adherencia k sekundárnej terapii po infarkte myokardu ........................................... Petr Lesný, Pavla Jendelová, Oldřich Jirsák, Lenka Martinová, Jiří Michálek, Martin Přádný, Eva Syková: Two- and three-dimensional tissue constructs based on nanofiber layers ............................................................................................................... Silvia Letašiová, Soňa Jantová, Ľuboš Čipák: Mitochondrial/caspase-9 dependent cell death of cancer cells growing in suspension induced by plant isoquinoline – berberine .......................................................................................................................... Tomáš Málek, Martin Kopáni, Martin Weis, Ľuboš Danišovič: Účinok vitamínu C na etanolom indukované zmeny fosfolipidovej monovrstvy ............................................ Peter Michalka: EGFR a onkológia? .............................................................................. 3 5 6 9 16 20 23 27 31 34 39 42 46 50 52 55 59 62 68 72 75 80 83 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. Zuzana Párnická, Eva Košková, Ivana Shawkatová: Polymorfizmus HLA-DQB1 pri oligoartritickej forma juvenilnej idiopatickej artritídy (JIA) .................................... Robert Petrovič, Ján Futas, Mária Fischerová, Katarína Kolejáková, Jozef Adámať, Danka Maceková, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Ján Chandoga: Molekulárna a biochemická podstata peroxizómových dedičných ochorení ...................................... Andrej Repický, Soňa Jantová, Silvia Letašiová: Detection of 4-amino-3acetylquinoline induced DNA damage in murine L1210 and NIH-3T3 cells using Comet assay ..................................................................................................................... Ivana Shawkatová, Vanda Repiská: Polymorfizmus génu PSMB9 v slovenskej populácii ........................................................................................................................... Michal Šimera, Viktor Foltin, Ivana Lettrichová, Zuzana Grolmusová, Marcela Morvová, Eva Neu, Janka Foltinová: Výsledky interdisciplinárneho výskumu olova v placente indikujú hyperkinetický syndróm u detí .................................................... Vladimír Šišovský, Ľudovít Danihel, Michal Palkovič, Beata Bučeková, Vanda Repiská, Ľuboš Danišovič, Andrea Ševčovičová, Svetoslav Štvrtina, Dimitris Hatzibougias, Roman Moravčík, Marek Bučko, Michal Korman, Lívia Hlavačková: Identifikácia proteínu PCNA v normálnom endometriu ............................................ Vladimír Šišovský, Ľudovít Danihel, Michal Palkovič, Pavel Babál, Beata Bučeková, Dimitris Hatzibougias, Martin Wawruch, Dalibor Hojsík, Michal Korman, Zuzana Kováčiková, Bohuslav Uher, Roman Moravčík: Ki-67 je vynikajúcim znakom malígnej premeny buniek endometria po menopauze ................................................. Vladimír Šišovský, Beata Bučeková, Miroslav Budaj, Ľudovít Danihel, Vanda Repiská: Identification of protein p53 in correlation with TP53 gene mutation in endometrial carcinoma ................................................................................................... Ľubica Strháková, Regína Behulová, Robert Petrovič, Katarína Kolejáková, Danka Maceková, Mária Fischerová, Jozef Adámať, Pavol Ipóth, Ján Chandoga: Detekcia mikrodelécií Y chromozómu u mužov s poruchami plodnosti ................................... Marica Theiszová, Soňa Jantová, Jana Dragúňová, Lucia Kalinovská: Štúdium biokompatibility biomateriálov na báze prírodných polymérov : mikrokapsule na báze chitozánu a ľudská amniová membrána .............................................................. Marcela Uličná, Ján Vojtaššák: Biologická charakteristika a potenciál kmeňových buniek ............................................................................................................................... Horst Urban, Martin Kopáni, Martin Weis, Július Dekan: Analýza železa v ľudskej slezine ............................................................................................................................... Ivan Varga, Viera Pospíšilová, Kristína Hudecová, Paulína Gálfiová, Katarína Bevízová, Štefan Polák: Faryngová oblasť a neurálna lišta v ontogenéze človeka – ako spolu súvisia vrodené vývinové chyby týmusu, srdca a prištítnych teliesok? .... Patrik Vitazka, M. Lu, MA. Armstrong, Arti Pandya, Andrea Ferreira-Gonzalez: Simultaneous detection of multiple genetic variants associated with hereditary pancreatitis (Molecular diagnostic assay development and validation) .................... Martin Wawruch, Martina Žikavská, Kamil Stratený, Ladislava Wsólová, Magdaléna Kuželová, Jana Tisoňová, Dalibor Hojsík, Vladimír Šišovsky, Štefan Laššán, Viera Kristová: Hodnotenie farmakologickej liečby starších pacientov pomocou vybraných indikátorov ................................................................................................... Tong T. Zhao, Stephen M. Lewis, Martin Holčík: Posttranscriptional regulation of the Inhibitor of Apoptosis protein cIAP1 during cellular stress ................................ 4 86 88 93 97 101 106 109 115 121 124 127 132 135 140 144 148 Predslov Systematické publikovanie získaných výsledkov je integrálnou súčasťou výchovy mladých vedeckých pracovníkov. Občianske združenie PROBIOLMED má v svojej náplni aj podporu takýchto aktivít v biológii a v medicíne. Recenzovaný zborník vedeckých prác, ktorý držíte v ruke, je priesečníkom uvedených realít. Veríme, že bude prvým z dlhého radu a že poskytne priestor na odbornú komunikáciu nielen mladším kolegom a kolegyniam, ale aj skúsenejším odborníkom v celom spektre biomedicínskych disciplín. Editori 5 Canavanova choroba – biochemický a molekulovo–genetický algoritmus v diagnostike ochorenia Jozef Adámať, Robert Petrovič, Katarína Kolejáková, Danka Maceková, Mária Fischerová, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Ján Chandoga Centrum lekárskej genetiky FNsP Bratislava Abstrakt Canavanova choroba je závažné autozómovo recesívne ochorenie, postihujúce najmä centrálny nervový systém. Klinické príznaky (makrocefália, psychosomatická retardácia, hypertónia, leukodystrofické zmeny, špongiózna degenerácia CNS a i.) zvyčajne nastupujú už v prvých mesiacoch života a väčšina pacientov zomiera do 3 rokov života. Ochorenie je spôsobené deficienciou aspartoacylázy (EC3.5.1.15), enzýmu, normálne prítomnéhov gliových bunkách bielej hmoty, ktorého úlohou je hydrolýza N-acetyl-aspartátu na aspartát a acetát. Gén pre ľudskú aspartoacylázu je lokalizovaný na 17. chromozóme (17p13ter), pozostáva zo 6-tich exónov a kóduje proteín s dĺžkou 313 aminokyselín. Deficiencia aspartoacylázy vedie hlavne k akumulácii N-acetyl-aspartátu v mozgu, sprievodná je tiež masívna exkrécia N-acetyl-aspartátu močom. Postnatálna diagnostika je prioritne založená na dôkaze zvýšeného vylučovania Nacetyl-aspartátu močom pomocou GC/MS. V moči spravidla pozorujeme mnohonásobné zvýšenie odpadu metabolitu pri vyšetrení organických kyselín. Molekulárno-genetická diagnostika je prednostne postavená na RFLP analýze 6. exónu, nakoľko výskyt mutácie C914A, lokalizovanej v tomto exóne bol zistený až u 40% pacientov s ochorením (nežidovského pôvodu). V prípade negatívneho nálezu alebo prítomnosti mutácie iba na jednej alele, pristupuje sa k sekvenčnej analýze jednotlivých exónov génu ASPA. Cieľom nášho príspevku je prezentovanie algoritmov diagnostiky Canavanovej choroby. Úvod Canavanova choroba (van Bogaert-Bertrand syndróm, OMIM 271900) je závažné autozómovo recesívne ochorenie, postihujúce najmä centrálny nervový systém. Podstatným nálezom na CNS, zobrazujúcom sa pri MRI, sú výrazné leukodystrofické zmeny, preto je Canavanova choroba zaraďovaná do skupiny vrodených leukodystrofií. Klinické príznaky. Počas prvých mesiacov života sa u detí nemusia pozorovať žiadne závažné zmeny s výnimkou mierneho oneskorovania vývinu a hypotónie. V priebehu ďalšieho vývinu dochádza k zvýrazňovaniu hypotonického syndrómu, je už zreteľná makrocefália a psychosomatická retardácia. U niektorých detí sa, v dôsledku atrofie optického nervu, môžu dostaviť aj poruchy zraku, napr. nystagmus, slabá vizuálna fixácia. Uvedené príznaky vedú lekára k vysloveniu podozrenia na závažnú neurologickú poruchu a indikované MRI vyšetrenie odhalí výrazné difúzne leukodystrofické zmeny. Ochorenie progreduje, zvýrazňujú sa neurologické symptómy a väčšina pacientov do 3 rokov života zomiera. Incidencia sa odhaduje na 1:50 000; u Židov vetvy Aškenazi až na 1:6400. Mutácia Proteín ASPA Etnicita 854A>C E285A Aškenazi 696C>A Y231X Aškenazi 914C>A A305E Európska Tab. 1. Prehľad najčastejších mutácií. 6 Biochemická a molekulárno-genetická podstata ochorenia. Príčinou ochorenia je deficiencia aspartoacylázy (ASPA) (EC3.5.1.15), enzýmu, fyziologicky exprimovaného v gliových bunkách bielej hmoty. Úlohou ASPA je hydrolýza N-acetyl-aspartátu (NAA) na aspartát a acetát. Absencia ASPA vedie k akumulácii NAA v mozgu; sprievodná je tiež masívna exkrécia NAA močom NAA je molekula, nájdená fyziologicky výlučne v nervovom systéme, doposiaľ s nie celkom objasnenou funkciou. Jej množstvá varírujú v závislosti od lokalizácie v mozgu, druhových rozdielov, či pôsobenia exogénnych faktorov. NAA je syntetizovaná z acetyl-CoA a L-aspartátovej kyseliny ezýmom acetyl-CoA-L-aspartát N-acetyltransferáza (EC 2.3.1.2), ktorého distribúcia je podobná ako distribúcia N-acetyl-aspartyl-glutamát (NAAG). Gén pre ľudskú ASPA sa nachádza v oblasti krátkeho ramienka 17. chromozómu (17p13ter). Skladá sa zo šiestich exónov a kóduje proteín s dĺžkou 313 AMK (36kDa). Materiál a metódy Stanovenie organických kyselín v moči. Pozostáva z oximácie moču etoxyamínhydrochloridom. Ako vnútorná štandarda sa k moču pridáva kyselina fenylmaslová. Organické kyseliny sú extrahované do etylacetátu (procedúra sa opakuje dvakrát). Po odparení organického rozpúšťadla sa robí derivatizácia vzorky v zmesi acetonitril, pyridín, BSTFA, dimetylchlorosilán. Samotná GC/MS analýza prebieha na GC/MS analyzátori (GCQ Finnigan MAT) na kapilárnej kolóne DB-XLB s teplotným gradientom (1min. 100°C, 7°C/min. do 150 °C, 12 °C/min. do 280 °C). Registrované sú ióny 50-500 m/z. Molekulárno-genetická detekcia mutácií génu ASPA: Z izolovanej genomickej DNA leukocytov, resp. amniocytov PCR metódou prednostne amplifikujeme 6. exón; následne sa amplifikát štiepi restriktázou HpyCH4V za účelom analýzy dĺžky restrikčných fragmentov (RFLP) tohto exónu, keďže až u 40% pacientov s ochorením bola detekovaná mutácia 914C>A. V prípade negatívneho nálezu – ale biochemických indikácií - amplifikujeme aj ostatné exóny a sekvenujeme ich. Stanovenie ochorenia GC/MS vyšetrením u pacientov, ktorí spravidla vylučujú vysoké množstvá metabolitu (NAA > 700mmol/mol kreatinínu; ref < 35), nepredstavuje diagnostický problém. Vážnejšia situácia môže nastať pri prenatálnej diagnostike, kedy biochemická diagnostika, vzhľadom na nízke hodnoty NAA v plodovej vode (častokrát nedekovateľné), by mohla byť nespoľahlivá. Preto zavedenie molekulárno-genetickej diagnostiky v SR určovali prinajmenšom dva dôvody. Želateľné bolo zistiť, aký typ mutácie je prítomný u pacientov v SR, druhým dôvodom bolo vytvorenie podmienok pre možnú prenatálnu diagnostiku, ktorá by bola postavená na potvrdení, resp. vylúčení mutácií v bunkách plodovej vody. K tomuto účelu boli na našom pracovisku zavedené a optimalizované metodiky PCR amplifikácie 6-tich. exónov génu ASPA. Pre účely prenátálnej diagnostiky sme modifikovali metódu izolácie DNA z amniocytov, súčasne sme preverili optimalizované metódy amplifikácie DNA aj v bunkách plodovej vody. Pre vylúčenie maternálnej bunkovej kontaminácie plodovej vody, sme analyzovali DNA plodu a DNA matky pomocou systému STR polymorfizmov. Výsledky a diskusia Rodina 1: U vyšetreného jednoročného dieťaťa hodnota odpadu NAA bola 9031mmol/mol kreatinínu. Klinický a biochemický nález zodpovedá dg. Canavanova choroba. V rodine boli ďalší traja súrodenci, podľa údajov matky zdraví. Rodičia odmietli akékoľvek ďalšie vyšetrenia (vrátene molekulárno-genetickej analýzy) u postihnutého dieťaťa ako aj u jeho súrodencov. Rodina 2: U štvormesačného chlapca hodnota odpadu NAA predstavovala 1740 mmol/mol kreatinínu. V rodine bolo aj ďalšie dieťa (dcéra) bez klinickej symptomatológie. Molekulárnou analýzou sa odhalilo, že vyšetrovaný pacient je nositeľom mutácie 914C>A v 6. exóne. Matka i otec boli pre túto mutáciu heterozygotmi. Rodina 3: Pacientom bolo dvanásťročné dievča s hodnotami NAA v moči 1102mmol/mol kreatinínu. Hodnota NAA v moči u otca bola 3,85mmol/mol kreatinínu, u matky zistená nebola. Sekvenčnou analýzou sme odhalili homozygotnu mutáciu 914C>A v 6. exóne. U matky pacientky sa vykonala aj prenatálna diagnostika plodu. Metabolit NAA v plodovej vode prítomný nebol, molekulárno-genetickým vyšetrením sa zistilo, že plod je nositeľom mutácie 914C>A v heterozygotnom stave. Canavanova choroba, spolu s Krabbeho chorobou a ochoreniami peroxizómového kompartmentu sú tromi najčastejšími príčinami leukodystrofických zmien mozgu. Biochemické vyšetrenia – hlavne GC/MS VLCFA séra a organických kyselín moču – môžu efektívne napomôcť v 7 diferenciálnej diagnostike Canavanovej choroby, u ktorej je výrazne zvýšený odpad NAA. Pre peroxizómové ochorenia je charakteristickým nálezom zvýšenie hodnôt VLCFA v sére. Potvrdenie diagnózy Krabbeho choroby vyžaduje vyšetrenie enzýmových aktivít v suspenzii leukocytov. V našich troch prípadoch nález odpadu NAA v moči (9031, 1740, 1102 mmol/mol kreatinínu) umožňoval jednoznačné určenie diagnózy Canavanovej choroby. Vyšetrenie tohto parametra v plodovej vode pri prenatálnej diagnostike, aj podľa literárnych prameňov, nemusí byť vždy celkom spoľahlivé. Závery Molekulárno-gentickým vyšetrením bola u oboch pacientov zistená prítomnosť najfrekventovanejšej mutácie (914C>A ), rovnako sme ju detekovali aj u jedného vyšetrovaného z ČR. Preto sa domnievame, že v diagnostickom algoritme je najvhodnejšia (po metabolickom vyšetrení, ako aj pri prenatálnej diagnostike) sekvenčná analýza 6. exónu. CLGFNsP ponúka komplexnú diagnostiku Canavanovej choroby pre pacientov stredoeurópskeho regiónu. Použitá literatúra 1. Beaudet, A.L.: Aspartoacylase deficiency (Canavan disease). In: Scriver, Beaudet, Sly, Valle, Childs, Kinzler, Vogelstein (eds): The meatbolic & molecular bases of inherited disease, vol. IV. 5799–5805, 2001. 2. Gordon, N.: Canavan disease: a review of recent developments. Eur J Paediatr Neurol. 5(2): 65–9, 2001. 3. Kumar, S., Mattan. NS., de Vellis, J.: Canavan disease: a white matter disorder. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 12(2): 157–65, 2006. 4. Matalon, R., Michals-Matalon, K.: Molecular basis of Canavan disease. Eur J Paediatr Neurol. 2(2): 69–76, 1998. 5. Surendran, S., Matalon T.M., Tyring, S.K., Matalon, R.: Molecular basis of Canavan's disease: from human to mouse. J Child Neurol. 18(9): 604–10, 2003. 6. Surendran, S., Michals-Matalon, K., Quast, MJ., Tyring, SK., Wei, J., Ezell, EL., Matalon, R.: Canavan disease: a monogenic trait with complex genomic interaction. Mol Genet Metab. 80(1-2): 74–80, 2003. 8 Testovanie toxicity chemických látok v podmienkach in vitro Ľuboš Danisšovič1, Juraj Krajčovič2, Ján Vojtaššák1 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, 1Ústav lekárskej biológie a genetiky; 2Prírodovedecká fakulta, Ústav bunkovej biológie, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt V dnešnej dobe sa pripraví veľké množstvo chemických látok a materiálov, ktoré sú určené na humánne použitie. Súčasťou ich charakterizácie je aj ich testovanie na potenciálny toxický účinok. V predkladanom článku autori prehľadne opisujú využitie in vitro systémov pri testovaní očnej a kožnej dráždivosti, hepatotoxicity, nefrotoxicity, hematotoxicity, neurotoxicity a embryotoxicity. Úvod V súčasnosti sa vyprodukuje veľké množstvo chemických látok alebo materiálov, ktoré prichádzajú do úzkeho kontaktu s ľudským organizmom. Z tohto dôvodu je potrebné ich testovanie na potencionálny toxický účinok. Klasické toxikologické testy sa vykonávajú na zvieracích modeloch, čo predstavuje enormnú časovú, personálnu a najmä ekonomickú záťaž. Mnoho organizácií poukazuje aj na ich neetickú stránku súvisiacu najmä s neprimerane krutým zaobchádzaním s pokusnými zvieratami. Od druhej polovice osemdesiatych rokov minulého storočia sa stále častejšie in vivo modely nahrádzajú in vitro systémami. Ich využitím dochádza k redukcii pokusných zvierat a k nezanedbateľnému ekonomickému efektu. V mnohých prípadoch na základe ich prediktívnych výsledkov k testovaniu in vivo vôbec nedochádza. Výhodou in vitro systému je aj to, že je možné presné zadefinovanie experimentálnych podmienok s elimináciou externých vplyvov. Okrem testovania toxicity prináša použitie in vitro systému aj poznatky o mechanizmoch pôsobenia testovaných látok, ktoré sa nedajú získať pri pokusoch na zvieratách. Aby však bolo možné získané výsledky plnohodnotne využiť, je potrebná validácia in vitro experimentov. Výsledky procesu validácie sú publikované vo forme špeciálnych odporúčaní a laboratórnych manuálov. Ďalším dôležitým výstupom je vytváranie databáz, ku ktorým majú prístup toxikologické laboratóriá po celom svete. Takto sa získané výsledky z in vitro systému stávajú reprodukovateľné a je možná ich presná interpretácia aj vo vzťahu k živým organizmom. Okrem toho sa získané výsledky používajú aj pre plánovanie ďalších špecifických testov, nevynímajúc experimenty na zvieracích modeloch, pokiaľ je nevyhnutné ich vykonanie. V nasledujúcom texte sú opísané základné informácie o využití in vitro testov pri testovaní očnej a kožnej dráždivosti, hepatotoxicity, nefrotoxicity, hematotoxicity, neurotoxicity a embryotoxicity. In vitro systém a jeho využitie v toxikologických experimentoch Možnosť využitia bunkových a tkanivových kultúr v genotoxikológii a farmakotoxikológii ako prví opísali Pomerat a Leake (1954). V šesťdesiatych rokoch sa problematike využitia in vitro systémov v toxikológii venovali ďalšie tímy, ktoré porovnávali výsledky testovania cytotoxicity na zvieracích modeloch a na in vitro systémoch (Smith et al., 1963). V tomto období boli opísané súvislosti medzi cytotoxicitou in vitro a toxicitou študovanou na zvieracích modeloch. Aj napriek uvedenému sa začali in vitro systémy rutinne používať v toxikologických experimentoch až v druhej polovici osemdesiatych rokov minulého storočia. Ako biologické modely sa najčastejšie používajú primárne izolované bunky alebo definované bunkové línie. V mnohých prípadoch sú geneticky modifikované s cieľom zvýšiť expresiu niektorých špecifických enzýmov alebo dosiahnutia ich imortalizácie (Yeager et Reddel, 1999). Pri testovaní teratogénov je možné použiť embryonálne a dospelé kmeňové bunky. Taktiež sa používajú trojdimenzionálne modely s definovanou geometriou, čo umožňuje sledovanie vzťahov na úrovni štruktúra – funkcia a zachovanie bunkových interakcií. Tieto modely dovoľujú zachovať hlavné bunkové funkcie počas definovaného času a vykazujú nízky stupeň diferenciácie (Zucco et al., 2004). Aj napriek tomu, že je in vitro systém schopný na bunkovej úrovni imitovať niektoré základné fyziologické charakteristiky, mnohé procesy sú izolované od komplexných bunkových, tkanivových a orgánových interakcií in vivo. Z toho dôvodu sa vyvíjajú in vitro modely orgánovej toxicity pre mnoho 9 tkanív a orgánových sústav. Najčastejšie sú používané in vitro modely pre kožnú a očnú dráždivosť. Taktiež je možné testovať v in vitro podmienkach nefrotoxicitu, neurotoxicitu, hepatotoxicitu a hematotoxicitu. Vo všetkých uvedených prípadoch je potrebné použiť in vitro systém na rozdielnom stupni zložitosti – napr. izolované premývané orgány, tkanivové štruktúry, primárne kultúry, bunkové línie alebo subcelulárne frakcie (Spiemann et al., 1998). Výstupy z in vitro testov sú založené na hodnotení porušenia membránovej permeability, poškodenia mitochondrií, zmien morfológie a proliferačnej aktivity buniek. Poškodenie cytoplazmatickej membrány sa najčastejšie zisťuje použitím trypánovej modrej (trypan blue exclusion test) alebo detekciou obsahu intracelulárnych enzýmov alebo niektorých signálnych látok v mimobunkovom priestore (Corsini et Galli, 1998; Faller et Bracher, 2002). Veľmi často je používaný MTT test (Fentem et al., 2001). Používajú sa aj testy zachytávajúce vylúčenie označeného izotopu chrómu (51Cr) alebo test absorpcie uridínu (Holden et al., 1977; Valentin et al., 2001). Poškodenie membrán je možné zistiť aj sledovaním ich konformačných zmien niektorými biofyzikálnymi metódami (Weis et al., 2005). V súčasnosti sú vyvinuté rôzne metódy umožňujúce detekciu apoptózy a nekrózy (Lin et al., 2004). Veľmi často sa využívajú molekulárno-biologické metódy, ktoré umožňujú určiť poškodenie bunky na úrovni nukleových kyselín (Nuwaysir et al., 1999). Taktiež existujú testy na detekciu tvorby toxických voľných radikálov, ktoré zapríčiňujú poškodenie buniek oxidáciou nukleových kyselín, proteínov a membránových lipidov (Kopáni et al., 2006). Výsledky získané z in vitro testov (najmä kvantitatívne parametre) sú používané aj pri testoch na rôznych fyziologických modeloch s cieľom predpovedať vplyv na metabolizmus, transport a farmakodynamiku testovaných látok v in vivo podmienkach (MacGregor et al., 2001). Niektoré možnosti in vitro systémov v uvedenej súvislosti ilustruje obrázok 1. Obr. 1. Predpoklad reakcie človeka na testovanú látku. Využitie dát získaných z in vitro a in vivo experimentov. In vitro testovanie kožnej a očnej dráždivosti Jedným z najznámejších testov, ktoré sa používajú v toxikologických štúdiách je test očnej a kožnej dráždivosti – Draizeho test (Draize et al, 1944). Ako modelový organizmus sa používa králik, do ktorého očí sa pridáva testovaná látka. V definovaných časových intervaloch sa vyhodnocujú morfologické zmeny na rohovke, spojivkách a dúhovke. Tento test a jeho modifikácie má mnoho nedostatkov, medzi ktoré patria napr. neschopnosť poskytnúť informácie o mechanizmoch toxicity, neadekvátna objektivita skórovania, časová a ekonomická náročnosť. V posledných rokoch sa vyvíjajú a využívajú nové in vitro testy, ktoré doplňujú alebo nahrádzajú Draizeho test. Pri in vitro testovaní očnej dráždivosti sa využívajú keratinocyty kultivované v monovrstve a stratifikované 3D modely (Harbell et al., 1997; Curren et al.,1997). Na keratinocytoch kultivovaných v monovrstve je možné testovať kvapalné chemické látky a ich vplyv na poškodenie vonkajšej vrstvy rohovky. Determinuje sa viabilita buniek po krátkodobej alebo dlhodobej expozícii testovanou látkou. Testovanie vo vode nerozpustných materiálov je možné vykonať na 3D modeloch. Ich využitím je možné dosiahnuť experimentálne podmienky podobné in vivo systému. Tieto modely sú pripravené kultiváciou keratinocytov na permeabilných membránach. Povrch takto pripravených tkanív môže byť 10 priamo vystavený testovaným materiálom a ich použitím je možné získať informácie o časovo závislej cytotoxicite a strate bariérovej funkcie (Kruszewski et al., 1997). V súčasnosti sa pri testovaní očnej dráždivosti využívajú aj artificiálne rohovky, ktoré sú pripravované metódami tkanivového inžinierstva z ľudských epitelových a endotelových buniek (Suuronen et al., 2005). Tieto tkanivá sú transparentné a toxický účinok testovaných látok sa prejaví ich eróziou alebo zakalením. Vývojom tohto modelu bude možné získať relevantné údaje o miere poškodenia spojenej so stupňom a trvaním toxického pôsobenia. Pre testovanie kožnej dráždivosti boli vyvinuté viaceré normálne (netransformované) keratinocytové a fibroblastové kultúry, vrátane viacerých trojdimenzionálnych modelov (Botham et al., 1998). Na monovrstvových kultúrach sa testuje vplyv jednotlivých zložiek testovaných látok alebo materiálov na proliferačnú aktivitu, diferenciáciu a expresiu cytokínov. Pri testovaní finálnych výrobkov sa používajú dva rozdielne modely kože. Sú to epidermálne ekvivalenty zložené z keratinocytov kultivovaných vo viacerých vrstvách na syntetických náhradách ECM alebo ekvivalenty kompletnej kože pripravené kultiváciou keratinocytov a fibroblastov na kolagénových matriciach (Ponec et al., 2002). V obidvoch prípadoch dochádza k vytvoreniu organizovaného stratum corneum, ktorý predstavuje funkčnú bariéru. V súčasnosti sú komerčne dostupné mnohé ekvivalenty kože, napr. EpiDerm (MatTek, USA), Episkin (Episkin, Francúzko), Apligraf (Organogenesis Inc., USA) a Skinethic (Skinethic, Francúzko). Uvedené ekvivalenty kože sú v porovnaní s kožou in vivo charakterizované vysokou mierou permeability. Ich využitím je možné zistiť aj veľmi miernu kožnú dráždivosť (Perkins et al., 1999). Pri in vitro testovaní kožnej dráždivosti je potrebné dodržať niekoľko podmienok. Expozícia keratinocytov, fibroblastov alebo ich ko-kultúry testovanou látkou musí zohľadňovať prekutánnu absorpciu in vivo. Vznikajúce metabolity in vitro musia byť analogické tým, ktoré vzniknú in vivo. V prípade, že je použitý iba model pozostávajúci z keratinocytov, je interpretácia výsledkov limitovaná neprítomnosťou ostatných typov buniek, ktoré sa vyskytujú in vivo. Testovanie práškov, gélov, pien a krémov je vhodné vykonať na 3D modeloch. Pri in vitro testovaní toxicity špecifických chemických látok, vrátane liečiv, je dodržanie vymenovaných predpokladov dôležité, ale výsledky je potrebné interpretovať vo vzťahu k výsledkom získaným z in vivo modelov (Davila et al., 1998). In vitro testovanie hepatotoxicity Pečeň je hlavným orgánom metabolizmu. Hepatocyty prejavujú najvyššiu expresiu a katalytickú aktivitu enzýmov, ktoré sú zahrnuté do metabolického procesu. Toto je dôvodom prečo sú in vitro modely pečene najčastejšie používané pri štúdiu metabolizmu rôznych látok, vrátane liečiv (Zucco et al., 2004). Za posledných desať rokov sa ich využitie v toxikologických experimentoch veľmi rozšírilo. Vyvinuli sa in vitro systémy na viacerých úrovniach zložitosti – od perfúznych modelov pečene, cez pečeňové rezy a kultúry hepatocytov až po izolované organely (Silber et al., 1994). Tieto systémy umožňujú determináciu mechanizmov hepatotoxicity, ktoré zahŕňajú napr. zmeny cytoskeletu, narušenie homeostázy katiónov Ca2+ a K+, inhibíciu transportu látok a zlyhanie mechanizmov autoreparácie tkanív (Davila et al., 1998). Toxický vplyv látok na hepatocyty je sprevádzaný rapídnymi zmenami ich biochemizmu, ktoré sa dajú presne zmerať. Dochádza k zníženiu syntézy a sekrécie albumínu, obsahu ATP, k zmenám produkcie žlčových kyselín a bilirubínu. Taktiež je ovplyvnená hladina a aktivita cytochrómu P450, hladiny glutatiónu, alkalickej fosfatázy, asparát a alanín transferáz a glukoneogenéza (Silber et al., 1994). Hepatocytové systémy sa tradične používali ako in vitro modely pri štúdiu funkcie pečene a v toxikologických experimentoch k predikcii toxického účinku rôznych látok. Dôvody pre ich využitie vychádzajú z etických a ekonomických súvislosti a z rozšírenia vedomostí o technických aspektoch izolácie a kultivácie hepatocytov. Významná je aj ich vysoká metabolická kapacita a relatívna jednoduchosť ich získania z čerstvých pečení, ktoré nespĺňajú podmienky pre transplantácie. Okrem vymenovaného majú hepatocyty biotransformačnú schopnosť, pri ktorej vznikajú reaktívne formy chemických látok schopné poškodiť DNA (Blaauboer, 2003). V súčasnosti sa najčastejšie používajú primárne kultúry zvieracích alebo ľudských hepatocytov. Na ich úrovni sa počas definovanej doby prejavujú špecifické funkcie pečene in vivo. Ich dlhodobou kultiváciou (pasážovaním alebo imortalizáciou) niektoré z týchto funkcií postupne zanikajú, napríklad prestávajú syntetizovať izoformy cytochrómu P450 (O'Brien et al., 2004). Tento problém sa podarilo vyriešiť zvládnutím techník kryoprezervácie primárnych hepatocytov (Hengstler et al., 2000). Zmrazené hepatocyty si zachovávajú takmer nezmenenú enzymatickú a syntetickú aktivitu. Okrem toho bola opísaná možnosť kvantitatívnej a špecifickej inhibície izoforiem cytochrómov známymi 11 inhibítormi na rozmrazených ľudských hepatocytoch. Aj z tohto dôvodu sú kultúry hepatocytov vhodným in vitro systémom pre identifikáciu metabolitov a pre vyhodnotenie metabolickej stability (Bayliss et al., 1999). Jednou z možností stanovenia interakčného potenciálu chemickej látky je hodnotenie jej vplyvu na izoformy cytochrómu P450 v podmienkach in vitro na ľudských hepatocytoch. Model intaktných hepatocytov navyše umožňuje sledovať rozdelenie chemických látok medzi plazmou a pečeňou. Výsledky z tohto in vitro systému sú porovnateľné s výsledkami získanými z in vivo modelov. Ďalší dôležitý mechanizmus interakcie chemických látok je indukcia syntézy enzýmov. Aj v tejto súvislosti bolo opísané využitie ľudských hepatocytov (Silva et al., 1998). Okrem kultúr hepatocytov sa pri testovaní hepatotoxicity in vitro používajú pečeňové rezy, ktoré obsahujú aj iné typy buniek a zachovávajú si normálnu architektúru a funkciu pečene (Catania et al., 2003). Validácia ich metabolickej schopnosti sa vykonáva podľa štandardov, ktoré presne definujú biotransformáciu in vitro a in vivo. Na základe uvedeného dochádza k optimalizácii kultivačných podmienok, čím sa zvyšuje ich výpovedná hodnota v predikcii vplyvu rôznych testovaných látok. Mnoho autorov opísalo využitie pečeňových rezov zvieracieho a ľudského pôvodu ako in vitro modelov pri testovaní vplyvu látok na metabolizmus (Price et al., 2004; Vickers et Fisher, 2005). In vitro systémy testovania hepatotoxicity zahŕňajú aj použitie mikrozómov a enzýmov získaných z homogentátov a subcelulárnych frakcií. Ich výhodou, oproti bunkám a tkanivovým rezom, je fakt, že ich môžeme získať aj z dlhodobo zmrazených tkanív (Guengerich, 1996). In vitro testovanie nefrotoxicity Ďalším cieľovým orgánom pre toxický účinok mnohých látok je oblička. Nefrotoxické látky môžu nevratne poškodiť niektoré segmenty nefrónov, najčastejšie proximálny kanálik alebo glomerulus. Tradičné testovanie nefrotoxicity na zvieracích modeloch umožňuje determinovať tieto látky, ale vzhľadom na štruktúrnu a funkčnú heterogenitu tkaniva obličiek nie je v mnohých prípadoch možné určiť presný mechanizmus ich pôsobenia. Použitie in vitro systémov umožňuje presne stanoviť toxický vplyv a mechanizmus na rôznych stupňoch organizácie (Rodriguez-Barbero et al., 2000). Medzi často používané in vitro modely testovania nefrotoxicity patria primárne a imortalizované kultúry tubulárnych buniek, obličkové rezy, perfúzne juxtamedulárne nefróny, izolované obličkové cievy a obličkové kanáliky (Pfaller et Gstraunthaler, 1998). Mnoho autorov opísalo využitie primárnych kultúr tubulárnych buniek (Zager et al., 2004; Martínez-Salgado et al., 2007). Grundemann et al. (1997) dokázali, že tubulárne bunky si v in vitro podmienkach zachovávajú mnoho vlastnosti, ktoré sa vyskytujú in vivo. Na týchto bunkách je možné testovať priamy účinok chemických látok, ich transport a metabolizmus. Zásadný vplyv na aplikáciu v toxikológii má zvýšená proliferačná aktivita týchto buniek, ako aj možnosť ich dlhodobého skladovania. Primárne izolované kultúry sú vhodné modely testovania akútnej nefrotoxicity. V tejto súvislosti bolo opísané testovanie látok na primárnych kultúrach adherovaných tubulárnych buniek, ako aj na bunkách v suspenzii (Boogaard et al., 1990). Okrem tubulárnych buniek sa používajú mesangiálne bunky, ktoré majú niekoľko funkcií, napr. syntéza medzibunkovej hmoty, endocytóza, kontrola glomerulárnej hemodynamiky, glomerulárna kontrakcie, atď. Na mesangiálnych bunkách sa testoval nefrotoxický účinok cyklosporínu A, cisplatiny, kadmia, atď. (Rodriguez-Barbero et al., 2000). Využitie bunkových kultúr je limitované, nakoľko kultivované bunky si zachovávajú pôvodné morfologické a biochemické vlastnosti len počas presne definovaného času. Tieto vlastnosti sa strácajú ich dlhodobou kultiváciou a pasážovaním (Pfaller et Gstraunthaler, 1998). Pri testovaní dlhodobého nefrotoxického efektu sa používajú perfundované obličky, ktoré si zachovávajú morfológiu aj biochemické vlastnosti. Obličkové rezy umožňujú štúdium vplyvu látok na bunkový transport a metabolizmus v štruktúre s relatívne zachovanou architektúrou a bunkovou heterogenitou bez vplyvu obehových zmien (Vickers et al., 2004). Dobre dokumentované je aj využitie izolovaných glomerulov, ktoré sa používajú ako in vitro modely štúdia priameho vazoaktívneho efektu chemických látok a pri testovaní vplyvu na hemodynamiku (Rodriguez-Barbero et al., 2000). In vitro testovanie hematotoxicity Pri testovaní toxického účinku chemických látok sa vykonáva aj testovanie na hematotoxicitu. Toto testovanie na in vivo modeloch vyžaduje vykonať štúdie na minimálne dvoch živočíšnych druhoch, čo je časovo ako aj ekonomicky veľmi náročné. Preto sa väčšina preliminárnych testov čoraz častejšie vykonáva na in vitro modeloch. Tieto modely sú založené najmä na identifikácii cieľových 12 subpopulácií buniek v hematopoetickom tkanive a umožňujú skúmanie mechanizmov, ktorými testovaná látka pôsobí na tieto bunky (Holt et al., 1998). V predikcii hematoxického účinku niektorých chemikálií v podmienkach in vitro sa často používa „colony forming assay“ – CFU, ktorý je dopĺňaný histopatolgickou analýzou kvôli charakterizácii myelotoxicity (Pessina et al., 2005). Prvé štúdie boli vykonané pred vyše tridsiatimi rokmi. Viacerí autori takto testovali vplyv jednotlivých a opakovaných dávok rôznych chemických látok na myelopoézu (Dunn, 1972). V súčasnosti sa vďaka dostupnosti purifikovaných a rekombinantných cytokínov, nevyhnutných pre stimuláciu proliferácie progenitorových buniek in vitro, používa pre každú bunkovú líniu izolovanú z kostnej drene. Výhodou tohto testu je jeho reprodukovateľnosť dosiahnuteľná optimalizáciou kultivačných podmienok, napr. odber, metóda izolácie buniek, atď. (Gribaldo et al., 1996). In vitro testovanie neurotoxicity Nervový systém je jeden z najzložitejších a najkomplexnejších v ľudskom organizme s ohľadom na štruktúru a funkciu. Mnoho chemických látok môže ovplyvniť jeho embryonálny vývin a fungovanie počas dospelosti, preto je nevyhnutné testovanie chemických látok na neurotoxicitu. Klasické in vivo testy sú postupne dopĺňané o alternatívne testovanie na modeloch in vitro. Získané výsledky vychádzajú zo zjednodušených prístupov, ktoré nevyžadujú podstatné ekonomické a časové zaťaženie. Na druhej strane sú vyňaté z kontextu živého organizmu a preto sa považujú za preliminárne testy, ktoré je potrebné doplniť o informácie získané testovaním na zvieracích modeloch (Harry et Tiffany-Castiglioni, 1998). Z modelov in vitro neurotoxicity sa najčastejšie používajú primárne izolované bunky (napr. neuróny, astrocyty, oligodendrocyty) alebo bunkové línie (napr. neuroblastómové a gliómové línie). Schwannove bunky sú využívané pri sledovaní testovaných na myelinizáciu (Costa, 1998). Vyvinuté boli aj modely „bariéry krv – mozog“, ktoré pozostávajú z kokultúry gliových a endotelových buniek (Stanness et al., 1997). Ďalej sa požívajú organotopické a explantové kultúry ako aj tenké rezy rôznych častí mozgu, predĺženej miechy a miechy (Luo et al., 1999; Noraberg et al., 2005). In vitro testovanie embryotoxicity Mnoho chemických látok negatívne ovplyvňuje embryonálny vývin jedinca, čo môže viesť ku vzniku rôznych vývojových chýb. Z tohto dôvodu je potrebné testovanie chemických látok na embryotoxicitu. Klasické testy vyžadujú veľké množstvo embryí a plodov laboratórnych zvierat. Alternatívne in vitro testy sa vykonávajú na bunkových alebo organotopických kultúrach a na kultivovaných embryách. Primárne kultúry a bunkové línie prinášajú základné informácie o vplyve látok na proliferáciu, metabolizmus a diferenciáciu buniek, teda o procesoch, ktoré sú dôležitou súčasťou vývinu (Scholz et al., 1999). Významným in vitro modelom pri testovaní embryototoxicity sú embryonálne kmeňové bunky (Rohwedel et al., 2001). Ich využitie je však v mnohých prípadoch limitované, najmä z etických dôvodov. Uvedené testy sa vykonávajú aj na kompletných embryách kultivovaných in vitro (Piersma et al., 1995). Závery S rastúcou produkciou nových chemických látok pre použitie v medicíne, kozmetickom alebo potravinárskom priemysle bude nevyhnutné ich testovanie na potencionálny toxický účinok. S tým bude súvisieť nielen používanie zaužívaných in vitro testov, ale aj ich modifikácia. Okrem toho bude aj naďalej vyvíjaný tlak na vývoj a zavedenie do praxe úplne nových testov využívajúcich in vitro modelov z dôvodu potrebnej redukcie testov in vivo. Poďakovanie Táto práca bola podporená grantom APVT 20-003104. Použitá literatúra 1. Blaauboer, B.J., Boobis, A.R., Castell, J.V., et al.: The practical applicability of hepatocyte cultures in routine testing. Altern Test Lab Anim. 22: 231–41, 1994. 2. Boogaard, P.J., Nagelkerke, J.F., Mulder, G.J.: Renal proximal tubular cells in suspension or in primary culture as in vitro models to study nephrotoxicity. Chem Biol Interact. 76(3): 251–91, 1990. 3. Botham, P.A., Earl, L.K., Fentem, J.H., et al.: Alternative methods for skin-irritation testing. The current status. ATLA. 26: 195–211, 1998. 13 4. Catania, J.M., Parrish, A.R., Kirkpatrick, D.S., et al.: Precision-cut tissue slices from transgenic mice as an in vitro toxicology system. Toxicol In Vitro. 17(2): 201–5, 2003. 5. Corsini, E., Galli, C.L.: Cytokines and irritant contact dermatitis. Toxicol Lett. 102-103: 277–82, 1998. 6. Costa, L.G.: Biochemical and molecular neurotoxicology: relevance to biomarker development, neurotoxicity testing and risk assessment. Toxicol Lett. 102-103: 417–21 1998. 7. Curren, R.D., Sina, J.F., Feder, P., et al.: IRAG working group 5. Other assays. Interagency Regulatory Alternatives Group. Food Chem Toxicol. 35(1): 127–58, 1997. 8. Davila, J.C., Rodriguez, R.J., Melchert, R.B., et al.: Predictive value of in vitro model systems in toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 38: 63–96, 1998. 9. Draize, J.H., Woodward, G., Calver, H.O.: Methods for the stody of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous mambranes. J Pharmacol Exp Ther. 82: 377–90, 1944. 10. Dunn, C.D.: Cell proliferation and drug resistance in the response of colony-forming units of rat bone marrow to repeated doses of cytotoxic agents. J Natl Cancer Inst. 48(3): 639–49, 1972. 11. Faller, C., Bracher, M.: Reconstructed skin kits: reproducibility of cutaneous irritancy testing. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. 15(Suppl 1): 74–91, 2002. 12. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne, C., et al.: A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. results and evaluation by the Management Team. Toxicol In vitro. 15(1): 57–93, 2001. 13. Gribaldo, L., Bueren, J., Deldar, A. The use of in vitro systems for evaluating haematotoxicity. ECVAM Workshop Report 14. ATLA. 24: 211–31, 1996. 14. Grundemann, D., Babin-Ebell, J., Martel, F., et al.: Primary structure and functional expression of the apical organic cation transporter from kidney epithelial LLC-PK1 cells. J Biol Chem. 272(16): 10408–13, 1997. 15. Guengerich, F.P.: In vitro techniques for studying drug metabolism. J Pharmacokinet Biopharm. 24(5): 521– 33, 1996. 16. Harbell, J.W., Koontz, S.W., Lewis, R.W., et al.: IRAG working group 4. Cell cytotoxicity assays. Interagency Regulatory Alternatives Group. Food Chem Toxicol. 35(1): 79–126, 1997. 17. Harry, G.J., Tiffany-Castiglioni, E.: Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1(4): 701–13, 2005. 18. Hengstler, J.G., Ringel, M., Biefang, K., et al.: Cultures with cryopreserved hepatocytes: applicability for studies of enzyme induction. Chem Biol Interact. 125(1): 51–73, 2000. 19. Holden, H.T., Oldham, R.K., Ortaldo, J.R., et al.: Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells. J Natl Cancer Inst. 58(3): 611–22, 1977. 20. Holt, D.E., Andrews, C.M., Payne, J.P., et al.: The myelotoxicity of chloramphenicol: in vitro and in vivo studies: II: In vivo myelotoxicity in the B6C3F1 mouse. Hum Exp Toxicol. 17(1): 8–17, 1998. 21. Kopáni, M., Celec, P., Danišovič, Ľ., et al.: Oxidative stress and electron spin resonance. Clin Chim Acta. 364(1-2): 61–6, 2006. 22. Kruszewski, F.H., Walker, T.L., DiPasquale, L.C.: Evaluation of a human corneal epithelial cell line as an in vitro model for assessing ocular irritation. Fundam Appl Toxicol. 36(2): 130–40, 1997. 23. Lin, W., Kemper, A., McCarthy, K.D., et al.: Interferon-gamma induced medulloblastoma in the developing cerebellum. J Neurosci. 24(45): 10074–83, 2004. 24. Luo, F.R., Wyrick, S.D., Chaney, S.G.: Comparative neurotoxicity of oxaliplatin, ormaplatin, and their biotransformation products utilizing a rat dorsal root ganglia in vitro explant culture model. Cancer Chemother Pharmacol. 44(1): 29-38, 1999. 25. MacGregor, J.T., Collins, J.M., Sugiyama, Y., et al.: In vitro human tissue models in risk assessment: report of a consensus-building workshop. Toxicol Sci. 59(1): 17–36, 2001. 26. Martínez-Salgado, C., López-Hernández, F.J., López-Novoa, J.M.: Glomerular nephrotoxicity of aminoglycosides. Toxicol Appl Pharmacol. 223(1): 86–98, 2007. 27. Noraberg, J., Poulen, F.R., Blaabjerg, M., et al.:Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4(4): 435–52, 2005. 28. Nuwaysir, E.F., Bittner, M., Trent, J., Barrett, J.C., Afshari, C.A.: Microarrays and toxicology: the advent of toxicogenomics. Mol Carcinog. 24(3): 153–9, 1999. 29. O'Brien, P.J., Chan, K., Silber, P.M.: Human and animal hepatocytes in vitro with extrapolation in vivo. Chem Biol Interact. 150(1): 97–114, 2004. 30. Perkins, M.A., Osborne, R., Rana, F.R., et al.: Comparison of in vitro and in vivo human skin responses to consumer products and ingredients with a range of irritancy potential. Toxicol Sci. 48(2): 218–29, 1999. 31. Pessina, A., Malerba, I., Gribaldo, L.: Hematotoxicity testing by cell clonogenic assay in drug development and preclinical trials. Curr Pharm Des. 11(8): 1055–65, 2005. 32. Pfaller, W., Gstraunthaler, G.: Nephrotoxicity testing in vitro--what we know and what we need to know. Environ Health Perspect. 106(Suppl 2): 559–69, 1998. 33. Piersma, A.H.: Validation of alternative methods for developmental toxicity testing. Toxicol Lett. 149(1-3): 147–53, 2004. 34. Pomerat, C.M., Lezme, C.D.: Short term cultures for drug assays: general considerations. Ann N Y Acad Sci. 58(7): 1110–28, 1954. 14 35. Ponec, M., Boelsma, E., Gibbs, S., Mommaas, M.: Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. 15(Suppl 1): 4–17, 2002. 36. Price, R.J., Renwick, A.B., Walters, D.G., et al.: Metabolism of nicotine and induction of CYP1A forms in precision-cut rat liver and lung slices. Toxicol In Vitro. 18(2): 179–85, 2004. 37. Rodriguez-Barbero, A., L'Azou, B., Cambar, J., et al.: Potential use of isolated glomeruli and cultured mesangial cells as in vitro models to assess nephrotoxicity. Cell Biol Toxicol. 16(3): 145–53, 2000. 38. Rohwedel, J., Guan, K., Hegert, C., et al.: Embryonic stem cells as an in vitro model for mutagenicity, cytotoxicity and embryotoxicity studies: present state and future prospects. Toxicol In Vitro. 15(6): 741–53, 2001. 39. Schulz, G., Pohl, I., Genschow, E., et al.: Embryotoxicity screening using embryonic stem cells in vitro: correlation to in vivo teratogenicity. Cells Tissues Organs. 165(3-4): 203–11, 1999. 40. Silber, P.M., Ruegg, C.E., Myslinski, N.: In vitro methods for predicting human toxicity. Lab Animal. 23: 33–37, 1994. 41. Silva, J.M., Morin, P.E., Day, S.H., et al.: Refinement of an in vitro cell model for cytochrome P450 induction. Drug Metab Dispos. 26(5): 490–6, 1998. 42. Smith, C.G., Grady, J.E., Northam, J.I.: Relationship between cytotoxicity in vitro and whole animal toxicity. Cancer Chemother Rep. 30: 9–12, 1963. 43. Spielmann, H., Liebsch, M., Reinhardt, C.: ERGATT/ECVAM Workshop on Acceptance of Validated Alternative Methods: Amden III. ALTEX. 15(1): 18–22, 1998. 44. Stanness, K.A., Westrum, L.E., Fornaciari, E., et al.: Morphological and functional characterization of an in vitro blood-brain barrier model. Brain Res. 771(2): 329–42, 1997. 45. Suuronen, E.J., Sheardown, H., Newman, K.D., et al.: Building in vitro models of organs. Int Rev Cytol. 244: 137–73, 2005. 46. Valentin, I., Philippe, M., Lhuguenot, J., et al.: Uridine uptake inhibition as a cytotoxicity test for a human hepatoma cell line (HepG2 cells): comparison with the neutral red assay. Toxicology. 158(3): 127–39, 2001. 47. Vickers, A.E., Fischer, R.L.: Precision-cut organ slices to investigate target organ injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1(4): 687–99, 2005. 48. Vickers, A.E., Rose, K., Fisher, R., et al.: Kidney slices of human and rat to characterize cisplatin-induced injury on cellular pathways and morphology. Toxicol Pathol. 32(5): 577–90, 2004. 49. Weis, M., Kopáni, M., Michalka, P., et al.: Conformation study of the membrane models by the Maxwell displacement current technique and oxidative stress. J Biochem Biophys Methods. 65(2-3): 81–7, 2005. 50. Yeager, T.R., Reddel, R.R.: Constructing immortalized human cell lines. Curr Opin Biotechnol. 10(5): 465–9, 1999. 51. Zager, R.A., Johnson, A.C., Hanson, S.Y.: Parenteral iron nephrotoxicity: potential mechanisms and consequences. Kidney Int. 66(1): 144–56, 2004. 52. Zucco, F., De Angelis, I., Testai, E., Stammati, A.: Toxicology investigations with cell culture systems: 20 years after. Toxicol In vitro. 18(2): 153–63, 2004. 15 Genómový imprinting, molekulárno-genetická diagnostika Prader-Williho/ Angelmanovho syndrómu Mária Fischerová, Robert Petrovič, Lívia Lukáčková, Katarína Kolejáková, Jozef Adámať, Ján Futas, Danka Maceková, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Darina Ďurovčíková, Ján Chandoga Centrum lekárskej genetiky FNsP Bratislava, Slovenska Republika, [email protected] Abstrakt Expresia patologického fenotypu u niektorých genetických ochorení závisí na tom, či mutovaná alela bola zdedená od otca, alebo od matky. Rozdiely v génovej expresii medzi alelou zdedenou od matky alebo alelou zdedenou od otca zapríčiňuje genomový imprinting. Imprinting spôsobuje zmenu v chromatíne (špecifická metylácia u rodičov), ktorá ovplyvňuje expresiu génu, ale nie jeho DNA sekvenciu. Imprintovaný gén je definovaný skutočnosťou, že je transkribovaný iba z 1 rodičovskej alely. Prader-Willi (PWS) a Angelmanov syndróm (AS) sú zapríčinené alternatívnou stratou funkcie rozdielnych génov, nachádzajúcich sa na dlhom ramene chromozómu 15(15q11-q13). PWS/AS región obsahuje 6 imprintovaných génov. Za fyziologických okolností sa gény (SNRPN, NDN, MAGEL2, MKRN3) exprimujú len pôvodom z paternálneho chromozómu a gény (UBE3A, ATP10A) sa exprimujú len pôvodom z maternálneho chromozómu. Nefunkčnosť génov na paternálnom chromozóme zapríčiňuje PWS, strata funkcie maternálnych génov je zodpovedná za AS. Tieto syndrómy sa vyskytujú u oboch pohlaví a postihujú všetky rasy. Prevalencia PWS sa odhaduje na 1:10 000 – 15 000 a u AS na 1: 15 000 – 45 000. Molekulárno-genetická diagnostika je založená na metylačne senzitívnej polymerázovej reťazovej reakcii, ktorá odlíši materskú alelu od otcovskej. Úvod Expresia patologického fenotypu u niektorých genetických ochorení závisí na tom, či mutovaná alela bola zdedená od otca, alebo od matky. Rozdiely v génovej expresii medzi alelou zdedenou od matky alebo alelou zdedenou od otca zapríčiňuje genomový imprinting. Imprinting je spôsobený chemickou modifikáciou – metyláciou cytozínov jednej z rodičovských aliel, ktorá sa následne neexprimuje. Imprintovaný gén je definovaný skutočnosťou, že je transkribovaný iba z 1 rodičovskej alely. Alelovo špecifická metylácia postihuje CpG ostrovčeky v DNA (metylácia cytozínu na 5-metylcytozín – obr. 1). NH2 NH2 O CH3 N N O N H cytozín N H 5-metylcytozín Obr. 1. Metylácia cytozínu Prader-Willi (PWS) a Angelmanov syndróm (AS) sú zapríčinené alternatívnou stratou funkcie rozdielnych génov, nachádzajúcich sa na dlhom ramene chromozómu 15(15q11-q13). PWS/AS región obsahuje 6 imprintovaných génov. Za fyziologických okolností sa gény (SNRPN, NDN, MAGEL2, MKRN3) exprimujú len pôvodom z paternálneho chromozómu a gény (UBE3A, ATP10A) sa exprimujú len pôvodom z maternálneho chromozómu (obr. 2.). Nefunkčnosť génov na paternálnom chromozóme zapríčiňuje PWS, strata funkcie maternálnych génov je zodpovedná za AS. 16 SNRPN, NDN, MAGEL2 a MKRN3 sa exprimujú na paternálnom chromozóme. Stratou aktivity alel týchto génov vzniká Prader- Willi syndróm. UBE3A a ATP10A vykazujú orgánovo špecifickú maternálnu expresiu. Stratou aktivity alel týchto génov vzniká Angelmanov syndróm. Tel ATP10A Obr. 2. Schéma imprintovaných génov, PWS/AS regiónu. Materiál a metódy DNA bola izolovaná z leukocytov periférnej krvi pomocou QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). Molekulárno-genetická diagnostika génu SNRPN je založená na metylačne senzitívnej polymerázovej reťazovej reakcii (mPCR), ktorá dokáže odlíšiť maternálnu alelu od paternálnej alely. Jej princípom je chemická premena nukleotidov. Cytozíny sú hydrogénsiričitanovou reakciou pozmenené na uracily, pričom metylované cytozíny ostávajú nezmenené (obr. 3). V následnej mPCR sa uracil páruje s adenínom a metylovaný cytozín s guanínom. Obr. 3. Schematické znázornenie hydrogénsiričitanovej reakcie. Krok 1. sulfonácia, krok 2. hydrolytická deaminácia, ireverzibilná reakcia, krok 3. alkalická desulfonácia Pri alelovo-špecifickej metylačnej PCR sme použili dve sady primerov, ktoré odlíšia metylovanú a nemetylovanú DNA. Použité primery boli publikované v práci Kubota a kol (1997). 20 µl reakčná zmes obsahovala 2x Dynamo SYBR Green premix, 0,3 mmol/l primerov, 50 ng chemicky modifikovanej gDNA a sterilnú vodu doplnenú do výsledného objemu. Časovo-teplotný profil amplifikácie špecifických fragmentov SNRPN génu metódou PCR: iniciálna denaturácia 95°C – 15 min., (denaturácia 95°C – 30 s, hybridizácia primerov 62°C – 30 s, syntéza DNA 72°C - 30s) 35 cyklov, dosyntetizovanie PCR produktov 72°C – 10 min. Získané PCR produkty sme separovali v agarózovom géli. Fragmenty DNA sme vizualizovali ožiarením na UV transluminátore pri 260 nm. Elektroforéza prebehala pri 100 V 30 minút. Alternatívne analýza prebiehala na Real-time PCR termálnom cyklery, pričom sa monitoroval nárast flourescencie SYBR Greenu. Následne prebehla analýza topenia PCR produktov (melting analýza). Metylačne-špecifická PCR a RFLP – v chemicky premenenej DNA sme najprv amplifikovali DNA sekvenciu obsahujúcu CpG dinukleotidy (fragment s dĺžkou 408 bp z 5´regoinu SNRPN génu), 1 µl PCR produktu sme následne pridali do nested PCR a amplifikovaný fragment sa štiepil restrikčnou endonukleázou HhaI (podľa Velinov 2000). Restrikčné štiepenie prebehlo v termostate pri 37°C po dobu 16 hodín. Restrikčné fragmenty boli separované v 2,5% agarózovom géli, vizualizované etídium bromidom, elektroforéza prebehala pri 100 V 40 minút. 17 Výsledky a diskusia 1 2 3 4 170 bp maternálna alela 100 bp paternálna alela Obr. 4. Alelovo – špecifická metylačná PCR , odlíšenie materskej a otcovskej alely pomocou dvoch sád primerov. Dráha 1. marker molekulovej hmotnosti, dráha 2, kontrola– materská alela -fragment 170 bp a otcovská alela - fragment 100 bp, dráha 3. pacient s Prader-Willi syndrómom- chýba otcovská alela, prítomný len fragment 170 bp, dráha 4. pacient s Angelmanovým syndrómom- chýba materská alela, prítomný len fragment 100 bp zodpovedajúci paternálnej alela 340 bp paternálna alela 224 bp maternálna alela Obr. 5. Odlíšenie materskej a otcovskej alely restrikčnou analýzou génu SNRPN pomocou HhaI. Neštiepený fragment 340 bp zodpovedá otcovskej alele, štiepený fragment s dĺžkou 224 bp pripadá materskej alele. Dráha 1. marker molekulovej hmotnosti, dráha 2. kontrola - obsahuje obidva fragmenty, dráha 3. pacient s PWS, dráha 4. pacient s AS kontrola paternálna alela PWS pacient maternálna alela maternálna alela paternálna alela neprítomná Obr. 6. Analýza pomocou alelovo-špecifickej Real-Time PCR. Pri alelovo-špecifickej Real-Time PCR boli použité dve sady primerov. Odlíšenie materskej a otcovskej alely na základe rozdielneho bodu topenia - melting analýzy PCR produktov - (otcovská alela 77,3°C; materská alela 83,7°C). PWS pacienti majú maternálny epigenotyp vyplývajúci z absencie alel pochádzajúcich z oblasti paternálneho chromozómu 15 (15q11-q13) alebo mutácii z imprintingového centra vznikajúcich na otcovských chromozómoch. 70% prípadov vykazuje mikrodelécie úseku chromozómu 15q11-q13 (4 Mb), ktoré vznikajú počas meiotického delenia u muža. Maternálna uniparentálna dizómia predstavuje 28% prípadov, kedy potomkovia zdedia dva chrómozomy 15 od matky a žiadny od otca. Najčastejšie vzniká sekundárne po oprave trizómie, stratou otcovského chromozómu 15 18 v zygote. Menej ako 2% prípadov zapríčiňujú metylačné zmeny imprintingového centra (Rogan, 1998). 65-70% prípadov Angelmanovho syndrómu je spôsobených malými de novo deléciami (menej ako 100kb) v oblasti 15q11-q13 na maternálnom chromozóme. Okolo 5% pacientov vykazuje paternálnu uniparentálnu dizómiu chromozómu 15. Ostatné prípady sú výsledkom bodových mutácii UBE3A génu (Rougeulle 1998). Závery Metylačne senzitívna PCR je vhodnou metódou pri diagnostike ochorení s poruchou imprintingu. Dané molekulárno-genetické vyšetrenie rýchlo a spoľahlivo odhalí PWS/AS aj v tom prípade, ak fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) nedetekovala deléciu tohto regiónu. Táto metodika odhalí takmer všetky prípady PWS (nedetekuje iba veľmi zriedkavú mozaikovú formu tohto ochorenia) a prípady AS spôsobené deléciami a uniparentálnou dizómiou. Bodové mutácie UBE3A génu vyžadujú sekvenčnú analýzu tohto génu. Použitá literatúra 1.Holm, V.A., Cassidy, S.B., Hitler, M.G., et al.: Prader-Willi syndrome: consensus diagnostic criteria. Pediatrics. 91(2): 398-402, 1993. 2. Kubota, T., Das, S., Christian, S.L., et al.: Methylation-specific PCR simplifies imprinting analysis. Nat Genet. 16(1): 16–7, 1997. 3. Rogan, P.K., Seip, J.R., White, L.M., et al.: Relaxation of imprinting in Prader-Willi syndrome. Hum Genet.103(6): 694–701, 1998. 4. Rougeulle, C., Lalande, M.: Angelman syndrome: how many genes to remain silent? Neurogenetics. 1(4): 229–37, 1998. 5. Velinov, M., Gu, H., Genovese, M., et al.: The feasibility of PCR-based diagnosis of Prader-Willi and Angelman syndromes using restriction analysis after bisulfite modification of genomic DNA. Mol Genet Metab. 69(1): 81–3, 2000. 19 Morfológia mikrocirkulácie ľudskej sleziny – súčasný stav poznania Paulína Gálfiová, Katarína Bevízová Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, Ústav histológie a embryológie, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Mikrocirkulácia v slezine je komplikovaná. Týmto problémom sa zaoberali mnohí autori, ich názory sa rôznia. V súčasnosti rozlišujú tri typy mikrocirkulácie – otvorený typ, uzavretý typ a cirkuláciu v perifolikulárnej zóne. Väčšina autorov tvrdí, že v ľudskej slezine dominuje otvorený typ cirkulácie. Nedá sa však jednoznačne a presne určiť, ktorý typ mikrocirkulácie zastáva aký percentuálny podiel. Úvod Základnou úlohou sleziny ľudí je čistenie krvi (Brozman a Jakubovský, 1988). Jej význam spočíva v odstránení všetkého, čo do krvi nepatrí a ponechanie v krvi toho, čo môže byť organizmu užitočné. K procesu čistenia krvi patrí tiež ochrana organizmu, najmä proti patogénnym mikroorganizmom. Proces čistenia zaisťuje usporiadanie cievneho systému tohto orgánu v súčinnosti s faktormi nešpecifickej rezistencie organizmu, aj s imunitným systémom. V práci sa venujeme funkčnej morfológii mikrocirkulácie sleziny. Súčasný stav poznania a diskusia Zásobenie sleziny arériovou krvou pochádza z arteria splenica. A. splenica odstupuje samostatne z tripus Halleri, málokedy spolu s arteria hepatica, vzácne rovno z aorty. Chirurgicky je najvýznačnejší predhilusový úsek arteria splenica (Belko et al., 1992; Bíró et al., 2008). Po vstupe do sleziny sa vetví a v spojivových trabekulách prechádzajú vetvy a. splenica ako trabekulové artérie. Po ich výstupe z trabekúl do pulpy okolo nich postupne pribúdajú periartériové lymfatické pošvy (PALP). Označujú ich arteria centralis. Z a. centralis zavše odstupujú v pravom uhle folikulové artérie. Okolo ich odstupu, v smere krvného prúdu, sa akumuluje lymfoidné tkanivo – lymfatické folikuly. A. centralis sa v istých miestach rozpadá na viacero cievnych priesvitov a tvorí arteriokapilárový zväzok. Ten má spoločnú retikulovu pošvu. Periartériová lymfatická pošva a lymfatické folikuly tvoria bielu pulpu sleziny. Pokračujúce vetvy a. centralis prechádzajú cez zona marginalis do červenej pulpy, kde sa delia na peniciliové arterioly. Peniciliové arterioly sa môžu končiť ako artériové kapiláry v červenej pulpe, alebo sa oblúkovo vrátia cez zona marginalis do folikulov. Končia ako kapiláry v folikuloch, či v zona marginalis. Pred koncom artériových kapilár sú kapiláry v určitom úseku obalené perikapilárovou pošvou. (Brozman a Jakubovský, 1988, Jakubovský et al. 2001; Polák, 2005). Podľa Brozmana a Jakubovského (1988) ju tvoria jemné tenké, aj hrubšie retikulové vlákna. Tvorí ho husté špongiové retikulum. v ňom sú rôzne bunky. Retikulum sa nachádza v červenej pulpe a v zona marginalis. Bunky perikapilárových pošiev majú bledšiu cytoplazmu, oválne jadrá a jemný roztrúsený chromatín bez jadierok. Cytoplazma má veľa hladkého endoplazmového retikula, mitochondrie, lyzozómy. Tvorí tenké interdigitujúce výbežky. Spomínané bunky nereagujú s protilátkami proti lyzozýmu, poskytujú však silne pozitívnu reakciu pri dôkaze nešpecifickej esterázy v periférii pošvy, reduktázy NADH-tetrazólia a ATP-ázy. Tým pripomínajú makrofágy. Blue a Weiss (1981) ich za makrofágy považujú. Podľa Fujitu (1985) možno rozlíšiť lievikový, ampulový, aj komplexný typ ukončenia artérií. Otvormi v zakončeniach artériových kapilár sa krv dostáva extravaskulárne, mimo lúmenu kapilár, do priestorov zona marginalis a červenej pulpy. Takéto usporiadanie cievneho systému označujú ako „otvorený typ mikrocirkulácie“. Ak krv prechádza kontinuálne z artériovovej časti do vénovej časti, hovoríme o „uzavretom type mikrocirkulácie“. Brozman et al. (1983) znázorňujú imunohistochemicky štruktúry, patriace do mikrocirkulácie. Artériový a vénový systém je typický súvislou membrana basalis. Menej nápadná je prerušovaná stena vénových sínusov. Imunohistochemicky opisujú vláknové a lamelové štruktúry vôkol a. centralis v periartériových lymfalických pošvách. V červenej pulpe opisujú špongiové artériové terminály. Môže ísť o morfologické štruktúry. Nimi sa krv vylieva do povrazcov medzi systémom artérií a vén. Občas naliehajú na stenu sínusov, reagujú s protilátkami proti membrana basalis, a majú veľkú aktivitu alkalickej fosfatázy. 20 Viacerí považujú krvný obeh v slezine za otvorený (Brozman et al., 1983; Brozman a Jakubovský, 1988; Goresky a Groom, 1984) Podľa teórie „otvorenej cirkulácie“ sa teda krv dostáva voľne do Billrothových povrazcov červenej pulpy tvorených retikulovou strómou. V nej je veľa makrofágov. Odtiaľ sa musí cez špeciálne štruktúry stien sínusov dostať do lúmenu sínusov a z nich pokračovať uzavretým systémom vén. Povrazce červenej pulpy tvorí trojrozmerná sieť fibroblastových retikulových buniek (FbRB). Ležia medzi rozvetvenými sínusmi. Polák et al. (2007) ich opisujú ako bunky s dlhými výbežkami cytoplazmy, pripomínajúcimi „krídla“. Nimi vzájomne anastomozujú. Za žiadnych okolností sa nemenia na fixné makrofágy. Nezapájajú sa do fagocytózy. Polák (2005) o FbRB píše, že ich cytoplazma obkolesuje retikulové vlákna temer vždy zo všetkých strán, čo však vo svetelnom mikroskope nemožno vždy postrehnúť. Trojrozmerná sieť rozdeľuje povrazce na menšie, navzájom spojené dutiny. Ich výbežky lipnú tiež na vonkajšiu stenu sínusov, kde ležia na membrana basalis, resp. na prstencových vláknach. Možno ich považovať v tomto prípade za adventíciové bunky. Okrem FbRB sú v povrazcoch červenej pulpy aj makrofágy a rôzne krvné bunky. Tieto vlastnia viaceré antigénové determinanty. Podľa Wilkinsa a Wrighta (2000) bunky povrazcov červenej pulpy exprimujú nasledujúce antigény: vretenové bunky (fibroblastové retikulové bunky) - α-SMA, makrofágy - CD 68, erytrocyty –glykoforíny A a C, granulocyty a monocyty - CD 15, kalprotektín, megakaryocyty a krvné doštičky –CD 42b, CD 61 a plazmatické bunky - CD 138, p63, reťazce imunoglobínov. Bunky vystieľajúce sínusy (BVS) majú na povrchu tieto antigény: von Willebrandov antigén asociovaný s hemokoagulačným faktorom VIII, CD 31, VCAM-1, CD 106, CD 8. Antigén CD 8 je v BVS nezvyčajný tým, že ho zvyčajne exprimujú hT lymfocyty Jakubovský et al. (1986) považujú krvný obeh ľudskej sleziny za otvorený a venujú pozornosť začiatočným úsekom systému vén. Sínusy opisujú elektrónovým mikroskopom aj histochemicky. BVS opisujú ako bunky tyčinkové, paralelne orientované s pozdĺžnou osou sínusu. Bunky medzi sebou navzájom spájajú krátke široké bočné výbežky. Medzi nimi sú nepravidelné, vretenovité otvory. Povrch buniek, nasadajúcich na membrana basalis kopíruje jej povrch. Pri membrana basalis obsahujú zahustenia jemných vlákienok priemeru 3-5 nm. Membrana basalis tvorí prstence. V histologickom reze ich vidno ako prerušované hrubé homogénne trámce strednej až malej denzity, medzi ktorými sú rôzne veľké otvory. Weiss (1995) patrí k zástancom teórie otvorenej cirkulácie. Podľa jeho názoru, vénové sínusy vychádzajú z filtrujúcich miest červenej pulpy a zona marginalis ako anastomozujúce, slepo sa začínajúce cievy, bez kontinuity artériového a vénového systému. Krv priteká do sínusov cez štrbiny medzi bunkami vystieľajúcimi sínusy a prstencovými vláknami. Uvažuje aj o existencii kanálov „spájajúcich“ artériové terminály s otvormi vo vénových sínusoch. Predpokladá, že by mohli priblížiť artériový a vénový koniec riečiska. Belko et al. (1992) opisujú uzavretý systém v minoritnom podiele. Zisťujú to dôkazom aktivity dipeptidylpeptidázy IV v BVS. Kashimura a Shibata (1989) opisujú aj tretí typ cirkulácie - mikrocirkuláciu v bielej pulpe a v zona marginalis. Tá má napomáhať pri fagocytovaní cudzorodých častíc z krvi a styku lymfocytov bielej pulpy s antigénmi. O ďalšej možnej cirkulácii hovorí van Krieken (2007). Predpokladá, že 10% krvi prechádza cez priestory perifolikulovej zóny. Definuje ju ako špecializovaný kompartment s vlastnou retikulovou strómou v okolí zona marginalis. Svojím zložením sa odlišuje od zbytku červenej pulpy. Perifolikulová zóna zaberá 8% sleziny a obsahuje erytrocyty, rôzne granulocyty aj agranulocyty v zložení podobnom periférnej krvi. Perifolikulovú zónu Wilkins a Wright (2000) definujú ako priestor medzi bielou a červenou pulpou. Tu sa zdržiavajú lymfocyty pred vstupom do bielej pulpy. Obsahuje aj retikulovú sieť obsahujúcu α-SMA a neutrofilné granulocyty. Mikrocirkulácii sleziny sa z funkčného hľadiska venujú Goresky a Groom (1984). Ľudskú slezinu zaraďujú medzi tzv. sínusový typ sleziny (podobne je to v psovi, potkanpvi, zajacovi, či v morčati). Goresky a Groom (1984) a Groom et al. (1991) sa tiež zaoberajú hypotézou o poškodzovaní erytrocytov v nehostinnom prostredí červenej pulpy (nízke pH, nízky parciálny tlak kyslíka, nízka hladina glukózy). Túto hypotézu nepotvrdili. Podľa nich sa za fyziologických podmienok v normálnej slezine erytrocyty nepoškodzujú, slezina nie je nehostinné prostredie, iba ak za patologických podmienok. Morfológiu mikrocirkulácie ľudskej sleziny opisuje Holibková a Machálek (2000) v korozívnych metakrylátových preparátoch v rastrovacom elektrónovom mikroskope. Okrem iného opisujú anastomózy medzi artériovým a vénovým systémom (arterio-arteriové, arterio-vénové a véno- 21 vénové). K lymfovému systému sa vyjadruje aj Polák (2005). Nachádza tiež podobné jemné priestory už v oblasti PALP či folikulov ako Holíbková a Machálek (2000), ktoré vytvárajú plexy okolo trabekulových artérií. Chlopne však objavuje až na vasa efferentia po výstupe lymfových ciev zo sleziny do hilového spojivového tkaniva. Závery Mikrocirkulácia v slezine je komplikovaná. Názory autorov na ňu sa rôznia. Nedá sa jednoznačne a presne určiť, ktorý typ mikrocirkulácie zastáva aký percentuálny podiel. Možno však podľa tvrdení spomínaných autorov konštatovať, že v ľudskej slezine dominuje otvorený typ cirkulácie. Je však predmetom ďalších výskumov potvrdiť dohady o možnom treťom type cirkulácie a podrobne mofologicky popísať celú mikrocirkuláciu v slezine. Poďakovanie Poďakovanie patrí doc. MUDr. Štefanovi Polákovi, PhD. a prof. MUDr. Jánovi Jakubovskému, DrSc. za ich cenné rady a podporu pri práci. Použitá literatúra 1. Belko, I., et al: Slezina. Osveta, Martin. 1992, 247. 2. Bíró, Cs., Jakubovský, J., Michalka, P., Polák, Š., Guller, L., Beruška, J., Durdík Š.: Morfológia hilusu ľudskej sleziny s ohľadom na lymfatické cievy. Bratislava Med J. 2008 (v tlači). 3. Brozman, M., Chorváth, D., Jakubovský, J., Ružičková, M., Sirníková, E: Imunohistologická štúdia krvného obehu v slezine človeka. Bratisl lek Listy. 79(6): 640–649, 1983. 4. Brozman, M., Jakubovský, J.: Slezina, Štruktúrne základy funkcie. VEDA vydavateľstvo SAV, Bratislava. 242, 1988. 5. Fujita, T., Kashimura, M., Adachi, K.: Scanning electron microscopy and terminal circulation. Experimentia. 41(2): 167–179, 1985. 6. Groom, A.C., Schmidt, E.E., MacDonald, I.C.: Microcirculatory pathways and blood flow in spleen: New insights from washout kinetics, corrosion casts, and quantitative intravital videomicroscopy. Scanning Microsc. 5(1): 159–174, 1991. 7. Goresky, C.A, Groom, A.C.: Microcirculatory events in the liver and spleen. In: Renkin, E.M., Michel, C. (eds.): The microcirculation, handbook of physiology, sec 2, Cardiovascular system IV, Chapter 15, Bethesda, Md, American Physiologycal Society. 741–780, 1984. 8. Holíbková, A., Machálek, L.: Structure and microcirculation in human spleen demonstrated by SEM. Plzeň lék Sborn Suppl. 74: 77–86, 2000. 9. Jakubovský, J., Polák, Š., Durdík, Š., Biró, Cs.: Krvná cirkulácia v ľudskej slezine. Všeobecná angiológia. 1, 2001. 10. Jakubovský, J., Brozman, M., Polák, Š., Babál, P.: Elektrónovomikroskopický obraz vénových sínusov červenej pulpy ľudskej sleziny. Bratisl lek listy. 86(5): 477–490, 1986. 11. Kashimura, M., Shibata, A.: Structure and functions of the human spleen: relationship between microcirculation and splenic functions. Rinsho Ketsueki. 30(8): 1234–8, 1989. 12. Polák, Š., Varga, I.: Funkčná morfológia ľudskej sleziny vo vzťahu k mikrocirkulácii krvi - literárny prehľad doplnený vlastnými mikrofotografiami. Slov Antropol. 9(2): 59–66, 2006. 13. Polák, Š.: Normálna ľudská slezina, Nový pohľad na starý problém. Habilitačná dizertácia, Lekárska fakulta Univerzity Komenského, Bratislava. 2005. 14. Polák, Š., Varga, I., Danišovič, Ľ., Kopáni, M., Mištinová, J.: Ultraštruktúra a funkcia sleziny vo vzťahu k Billrothovým povrazcom červenej pulpy. In: Zborník referátov Morfológia včera, dnes a zajtra. Košice. 157– 161, 2007. 15. van Krieken, J.H.J.M., Orazi, A.: Spleen in Histology for pathologists, Chapter 32. Williams & Wilkins, Philadelphia, USA., 783–797, 2007. 16. Weiss, L.: The structure of the spleen in Williams Hematology (fifth edition), Part II General Hematology, Chapter 5, New York. 38–42, 1995. 17. Wilkins, B.S., Wright, D.H.: Normal structure, developement and functions of the spleen in Illustrates pathology of the spleen, Chapter 2, Cambridge Universtity press, Cambridge. 13–34, 2000. 22 Štúdium regulácie bunkového cyklu u fotoautotrofných mikroorganizmov Alena Hercegová, Eliška Gálová, Andrea Ševčovičová Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra genetiky, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt DNA predstavuje dynamickú štruktúru, neustále vystavenú rôznym endogénnym a exogénnym vplyvom. Poškodenie DNA môže mať mutagénny a/alebo toxický efekt interferujúci so základnými bunkovými procesmi. Počas evolúcie sa vyvinuli a postupne zdokonaľovali rôzne obranné stratégie, umožňujúce bunke prežiť a zachovať si plnohodnotnú genetickú informáciu. Jednotlivé reparačné mechanizmy sa študovali najprv oddelene. V súčasnosti je známe, že mnohé gény zahrnuté v oprave DNA majú pleiotropný účinok. To znamená, že nie sú zodpovedné len za procesy vedúce k oprave poškodenej DNA, ale podieľajú sa tiežna replikácii, transkripcii, metabolických dráhach, aj na aktivácii kontrolných bodov. Práve v nich dochádza k prepojeniu regulácie bunkového cyklu a reparačných mechanizmov. Kontrolné body po narušení integrity genómu indukujú dočasné zastavenie bunkového cyklu a aktiváciu opravného mechanizmu, adekvátneho príslušnému poškodeniu a fáze bunkového cyklu, v ktorej poškodenie DNA nastalo. Na štúdium bunkového cyklu sa využívajú mikroorganizmy, najmä kvasinky a v poslednom čase aj riasy. Prvým identifikovaným mutantom v kontrolnom bode u rias bol mutant uvs11 riasy Chlamydomonas reinhardtii. Úvod Pre život bunky a prežitie organizmov je nevyhnutná presná duplikácia genómu a jeho následné bezchybné rozdelenie do nasledujúcej generácie. Kvôli zaisteniu týchto esenciálnych procesov odpovedajú bunky na poškodenie alebo abnormálnu štruktúru DNA komplexnou odpoveďou, v rámci ktorej dochádza ku koordinácii bunkového cyklu s opravou DNA, remodelingom chromatínu, transkripciou a inými metabolickými zmenami, prípadne s bunkovou smrťou. Zastavenie alebo zadržanie bunkového cyklu poskytuje čas pre reparáciu DNA a je sprostredkované sieťou signálnych dráh označených ako kontrolné body bunkového cyklu („checkpoint control“ alebo „restriction point“). Ak je DNA poškodenie neopraviteľné, kontrolné body eliminujú takéto potenciálne nebezpečné bunky trvalým zablokovaním bunkového cyklu alebo smrťou bunky (LindseyBoltz a kol., 2001). Kontrolné body bunkového cyklu plnia najmenej štyri úlohy: indukujú zablokovanie bunkového cyklu, pomáhajú aktivovať reparáciu DNA, udržiavajú zastavený bunkový cyklus, pokým nie je oprava kompletná a potom aktívne reiniciujú priebeh bunkového cyklu (Bartek a Lukas, 2001). Kontrolné body predstavujú biochemické kaskády zahŕňajúce senzorové proteíny, ktoré monitorujú genóm a zachytávajú rôzne abnormality. Súčasne pomáhajú tvoriť signál, ktorý je amplifikovaný a šírený adaptormi/mediátormi a transduktormi signálu k efektorom, ktoré prepájajú kontrolné body s jadrom aparátu bunkového cyklu. Na počiatku výskumu regulácie bunkového cyklu stál mutant rad9 kvasinky Saccharomyces cerevisiae, ktorá predstavuje základný modelový objekt heterotrofných organizmov. Bunky rad9 mutantného kmeňa, na rozdiel od buniek štandardného typu, nezastavujú bunkový cyklus v G2 fáze po poškodení DNA spôsobenom ionizačným žiarením, ale delia sa ešte jeden alebo viackrát. V dôsledku opakovanej mitózy vytvárajú mikrokolónie 3 až 8 odumretých buniek (Hartwell a Weinert, 1989). Prežívanie mutantov po ožiarení sa zvyšuje po umelom zablokovaní bunkového cyklu v G2 fáze. Tieto experimenty viedli k identifikácii funkcie génu RAD9 ako negatívneho regulátora bunkového cyklu po poškodení DNA a tiež jeho úlohy v prepojení reparácie DNA, transkripcie, replikácie a kontrolných bodov bunkového cyklu. O dôležitosti štúdia priebehu bunkového cyklu a jeho regulácie svedčí udelenie Nobelovej ceny za fyziológiu a medicínu v roku 2001 trom vedcom zaoberajúcim sa touto problematikou (Timothy Hunt, Leland Hartwell a Paul Nurse). Podobný fenotypový prejav ako rad9 mal aj mutant uvs11 riasy C. reinhardtii, ktorý bol izolovaný na Katedre genetiky PriF UK v Bratislave (Vlček a kol., 1987). Výsledky nedávnych štúdií 23 potvrdili úlohu génu UVS11 riasy C. reinhardtii v prepojení medzi poškodením DNA a reguláciou bunkového cyklu, podobne ako génu RAD9 kvasinky S. cerevisiae. Kmeň uvs11 tak predstavuje prvého charakterizovaného mutanta kontrolných mechanizmov u rias (Slaninová a kol., 2002; 2003). U vyšších rastlín bol ako prvý mutant kontrolného bodu identifikovaný kmeň sog1 u Arabidopsis (Preuss a Britt, 2003). Tieto pozorovania naznačili prítomnosť signálnych transdukčných dráh u fotoautotrofov, analogických s heterotrofnými organizmami. Súčasná úroveň vedomostí o regulácii bunkového cyklu a funkcii reparačných procesov u fotoautotrofných organizmov je veľmi nízka. Výhodným modelovým objektom je v tomto prípade jednobunková zelená riasa C. reinhardtii. Je to jednobunkový organizmus, ktorý sa dá jednoducho kultivovať v laboratórnych podmienkach, je vhodný pre klasickú genetickú analýzu (tetrádová analýza bola prvýkrát demonštrovaná na C. reinhardtii), môže existovať v haploidnej aj v diploidnej forme a je ľahko prístupný pre jadrovú i chloroplastovú transformáciu. Využíva sa pri štúdiu rôznych biologických procesov ako je fotosyntéza, biogenéza chloroplastov, asemblácia bičíka a pohyblivosť, fototaxia, cirkadiánny rytmus, gametogenéza a párovanie, bunkový metabolizmus a regulácia bunkového cyklu. Keďže predpokladom štúdia jednotlivých komponentov signálnych dráh je identifikácia ďalších mutantov, zamerali sme sa na analýzu uvsX1 a uvsX2 kmeňov C. reinhardtii, pripomínajúcich fenotypovo uvs11. Sledovali sme: - prežívanie mutantov po pôsobení fyzikálnych a chemických agensov (UV, γ žiarenie a MMS) a odumieranie buniek pred a po delení; - vplyv mikrotubulového inhibítora MBC na zmenu kriviek prežívania a tvorbu mikrokolónií po pôsobení UV, γ žiarenia a MMS u mutantov; - excíziu pyrimidínových dimérov. Materiál a metódy V experimentoch sme pracovali s kmeňmi W1, uvsX1 a uvsX2. Fenotypovú charakteristiku mutantných kmeňov sme robili hodnotením kriviek prežívania po ovplyvnení UV, γ žiarením a alkylačným agensom MMS (metylmetánsulfonát). Prežívanie buniek sme hodnotili mikroskopicky. Osobitne sme hodnotili odumieranie buniek pred a po rozdelení. Pri každom pokuse a každom variante sme hodnotili aspoň dve Petriho misky, na každej minimálne 250 kolónií. Zastavenie bunkového cyklu C. reinhardtii pomocou MBC – v experimentoch sme pracovali s mikrotubulovým inhibítorom metylbenzimidazol-2-ylkarbamátom (MBC, zásobný roztok pre riasy 30 mg v 1 ml DMSO). Mechanizmus jeho účinku spočíva v reverzibilnej destabilizácii tubulínových štruktúr, ktoré tvoria súčasť mitotického aparátu, čím zabraňuje vstupu do mitózy a deleniu bunky. MBC sme nechali pôsobiť v polovici kultúry asi 12 až 14 hodín pred samotným ovplyvňovaním mutagénmi, pričom výsledná koncentrácia MBC v médiu bola 300 mg/ml. MBC zastavuje bunkový cyklus pred mitózou. Ovplyvnenie buniek C. reinhardtii mutagénmi – pri sledovaní vplyvu UV žiarenia sme pripravenú kultúru rozdelili do 4 umelohmotných Petriho misiek po 3 ml a ovplyvňovali UV 254 nm dávkami 50, 100 a 150 J.m-2. Po ožiarení sme nechali bunky inkubovať 1 hodinu s MBC v tme, aby sme zabránili fotoreaktivácii. Pri sledovaní vplyvu MMS sme pripravenú kultúru rozdelili do 4 skúmaviek po 2 ml a pridávali sme MMS (10% zásobný roztok) do výslednej koncentrácie 0,1; 0,2 a 0,3%. Kultúry sme ovplyvňovali 1 hodinu v tme na trepačke. Po ukončení ovplyvňovania sme kultúru scentrifugovali a premytím zbavili zvyškov mutagénu. Pri sledovaní vplyvu γ žiarenia sme pôsobili na bunky rozsuspendované v 3 ml sterilnej vody v umelohmotných skúmavkách dávkami 50, 100 a 200 Gy. Po ožiarení sme nechali bunky 1 hodinu pod vplyvom MBC. Po ukončení ovplyvňovania sme bunky scentrifugovali, premyli v destilovanej vode, aby sme odstránili MBC, nariedili na potrebnú hustotu a vysievali na pevné HSA médium. Petriho misky sme kultivovali na svetelnej polici 5 až 7 dní (stanovenie prežívania), resp. 21 dní (určenie mutability). Detekcia pyrimidínových dimérov pomocou protilátok – rozrastené bunky C. reinhardtii v tekutom médiu sme ovplyvnili UV žiarením 254 nm dávkou 100 J.m-2 s výnimkou kontroly. V čase ožiarenia sme odobrali 5 ml prvej vzorky (0. hodina). Ožiarené kultúry sme nechali v tme, ďalší odber sme uskutočnili v 24. hodine od ovplyvnenia. Z ožiarených buniek sme extrahovali DNA pomocou zmesi fenol:chloroform:izoamylalkohol. RNA sme odstránili inkubáciou vzoriek s RNázou. 24 Koncentráciu DNA sme zmerali na spektrofotometri. Príslušné koncentrácie DNA sme potom nanášali na nylonovú membránu. Po premytí membrány v neutralizačnom roztoku sme ju na 2 hodiny vystavili teplote 80 °C. Membránu s naviazanou DNA sme inkubovali s primárnou monoklonálnou protilátkou (riedenie 1:2500) ab10347 (Abcam) viažúcou sa špecificky na pyrimidínové diméry cyklobutánového typu. Sekundárnu protilátku ab6728 (Abcam) konjugovanú s peroxidázou sme riedili v pomere 1:4000. Na vizualizáciu naviazanej protilátky sme použili chemiluminiscenciu. Výsledky a diskusia Prežívanie mutantných kmeňov závislé od dávky použitého mutagénneho agensu a porovnanie kriviek prežívania s prežívaním štandardného kmeňa poskytuje základnú charakteristiku testovaných kmeňov. Prežívanie buniek závisí od miery ich citlivosti k danému agensu a percento prežívania sa stanovuje mikroskopickým hodnotením na základe počtu vyrastených kolónií z celkového počtu hodnotených buniek. Výsledky účinku UV, γ žiarenia a MMS sme zostavili z priemerných hodnôt viacerých pokusov, prepočítaných na 100% kontrolu. Paralelne s prežívaním sme samostatne hodnotili bunky odumreté pred a po delení. Pri všetkých variantoch sme súčasne sledovali vplyv zastavenia bunkového cyklu pomocou mikrotubulového jedu MBC na prežívanie buniek a ich odumieranie po jednom alebo viacerých deleniach. MBC imituje kontrolný bod G2 fázy bunkového cyklu, v ktorom dochádza k zablokovaniu priebehu bunkového cyklu po poškodení DNA spôsobenom mutagénnymi agensami. Zastavením bunkového cyklu získava bunka čas na opravu poškodenia DNA. Aplikácia MBC vedie preto k zvýšeniu prežívania mutantov s poruchou v regulácii bunkového cyklu. V prípade mutantov s poruchou konkrétnej reparačnej dráhy a štandardného kmeňa zastavenie bunkového cyklu prostredníctvom MBC nemá výrazný vplyv na zmenu prežívania. Na základe mikroskopického hodnotenia prežívania sme zaznamenali vysokú citlivosť mutantov uvsX1, uvsX2 na pôsobenie nielen UV žiarenia, ale aj γ žiarenia a MMS. Zablokovanie bunkového cyklu pomocou MBC viedlo k zvýšeniu prežívania až pri najvyšších dávkach použitých mutagénov. Pri sledovaní priamych mutácií vedúcich k rezistencii na streptomycín sme u mutanta uvsX1 zaznamenali výrazne zvýšenú spontánnu aj indukovanú mutabilitu po pôsobení UV žiarenia aj MMS. Zastavenie bunkového cyklu pomocou MBC nemalo badateľný vplyv na zmenu počtu mutantov. Zvýšená indukovaná mutabilita, ale v menšej miere ako pri uvsX1, bola pozorovaná u mutanta uvs11 (Vlček a kol., 1987). Spontánna aj indukovaná mutabilita je zvýšená pri kmeni uvs14, ktorý má funkčný mechanizmus vyštiepovania pyrimidínových dimérov a nesie typické znaky mutantov s narušenou „long patch mismatch“ korekciou (Modrich, 1991; Vlček a kol., 1997). U mutanta uvsX2 sme zaznamenali zvýšenú spontánnu a indukovanú mutabilitu po pôsobení UV žiarenia, ale v menšej miere ako pri uvsX1. V prípade MMS bola mutabilita porovnateľná so štandardným kmeňom. Mikroskopický obraz hynutia buniek pred (vo forme jednej bunky) a po (vo forme mikrokolónií) delení vyjadruje schopnosť buniek vysporiadať sa s poškodením DNA po pôsobení mutagénnej látky. Zároveň umožňuje rozlíšiť príčiny odumierania buniek. Reparačne deficitné kmene odumierajú vo zvýšenej miere vo forme jednej bunky, v dôsledku neschopnosti opraviť poškodenie DNA indukované mutagénom. Mutanty v kontrolnom bode bunkového cyklu nie sú schopné zastaviť priebeh cyklu v G2 fáze po poškodení DNA a delia sa najmenej jedenkrát. V dôsledku opakovanej mitózy vytvárajú mikrokolónie 3 až 8 odumretých buniek. Zvýšenú tvorbu mikrokolónií sme pozorovali u obidvoch mutantných kmeňov po použití všetkých troch mutagénov. Zastúpenie mikrokolónií sa výrazne nezmenilo ani po zablokovaní bunkového cyklu. To naznačuje, že chemická látka akou je MBC, ktorá len inhibuje tvorbu mitotického aparátu, nemôže úplne nahradiť funkciu príslušných defektných proteínov. Vysoká citlivosť kmeňov uvsX1, uvsX2 na UV žiarenie by mohla byť dôsledkom poruchy excíznej reparačnej dráhy. Na overenie tohto predpokladu sme využili metódu detekcie pyrimidínových dimérov pomocou protilátok. Vychádzali sme z prác Cenkci a kol. (2003) a Wei a kol. (2004). Funkčnosť resp. porucha excíznej reparačnej dráhy je detekovaná na základe neprítomnosti resp. prítomnosti pyrimidínových dimérov po 24 hodinách inkubácie buniek ovplyvnených UV žiarením v tme, vizualizovaných pomocou väzby primárnej a sekundárnej protilátky. Pri analýze funkčnosti vyštiepovania pyrimidínových dimérov pomocou protilátok sme u štandardného kmeňa W1 zachytili prítomnosť dimérov indukovaných UV žiarením hneď po ovplyvnení. Po 24 hodinách sme už ich prítomnosť nedetekovali, čo znamená, že došlo k ich oprave. Pri obidvoch testovaných mutantných kmeňoch sme po 24 hodinách zachytili signál odpovedajúci prítomnosti pyrimidínových 25 dimérov a naznačujúci neschopnosť odstrániť diméry excíznou reparačnou dráhou pri zabránenej fotoreaktivácii. Závery Z výsledkov našich experimentov usudzujeme, že riasa C. reinhardtii disponuje určitým typom kontrolného mechanizmu, ktorý umožňuje zablokovanie bunkového cyklu po pôsobení určitého agensu. Poďakovanie Táto práca bola realizovaná s podporou grantov APVT-20-002604, VEGA 1/3243/06, VEGA 1/2337/05 a SK-CZ-06906. Použitá literatúra 1. Bartek, J., Lukas, J.: Mammalian G1- and S-phase checkpoints in response to DNA damage. Curr Opin Cell Biol. 13: 738–747, 2001. 2. Cenkci, B., Petersen, J.L., Small, G.D.: REX1, a novel gene required for DNA repair. J Biol Chem. 278(25): 22574–22577, 2003. 3. Hartwell, L.H., Weinert, T.A.: Checkpoint controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246: 629–634, 1989. 4. Lindsey-Boltz, L.A., Bermudes, V.P., Hurwitz, J., Sancar, A.: Purification and characterization of human DNA damage checkpoint Rad complexes. Proc Natl Acad Sci USA. 98: 11236–11241, 2001. 5. Modrich, P.: Mechanisms and biological effects of mismatch repair. Ann Rev Genet. 25: 229–253, 1991. 6. Preuss, S.B., Britt, A.B.: A DNA-damage-induced cell cycle checkpoint in Arabidopsis. Genetics. 164: 323– 334, 2003. 7. Slaninová, M., Nagyová, B., Gálová, E., Hendrychová, J., Bišová, K., Zachleder, V., Vlček, D.: The alga Chlamydomonas reinhardtii UVS11 gene is responsible for cell division delay and temporal decrease in histone H1 kinase aktivity caused by UV irradiation. Mutat Res DNA Repair. 2(6): 737–750, 2003. 8. Slaninová, M., Ševčovičová, A., Nagyová, B., Miadoková, E., Vlčková, V., Vlček, D.: Chlamydomonas reinhardtii UVS11 gene is required for cell cycle arrest in response to DNA damage. Archiv fur Hydrologie, Algological Studies. 107: 97–107, 2002. 9. Small, G.D., Greimann, C.S.: Photoreaktivation and dark repair of ultraviolet light-induced pyrimidine dimers in chloroplast DNA. Nucl Acid Res. 4: 2893–2902, 1997. 10. Vlček, D., Miadoková, E., Podstavková, S., Adams, G.M.W., Small, G. D.: General charakteristics, molecular and genetic analysis of two new UV-sensitive mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Mutat Res. 183: 169–175, 1987. 11. Vlček, D., Slivková, A., Podstavková, S., Miadoková, E.: A Chlamydomonas reinhardtii UV-sensitive mutant uvs15 is impaired in a gene involved in several repair pathways. Mutat Res. 385: 243–249, 1997. 12. Wei, S.F., Hwang, S.P.L., Chang, J.: Influence of ultraviolet radiation on the expression of proliferating cell nuclear antigen and DNA polymerase α in Skeletonema costatum (Bacillariophyceae). J Phycol. 40: 655–663, 2004. 26 Changes in endothelial and inducible NO synthase in aortic media after administration of red wine polyphenols Lívia Hlavačková1, Pavol Janega1,3, Silvia Líšková2, Pavel Babál1 1 Department of Pathology; 2Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Comenius University in Bratislava, Slovakia and 3Institute of Normal and Pathological Physiology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia, [email protected] Abstract Inducible NO synthase (iNOS) can be influenced by various stimuli in several cell types including vascular smooth muscle cells, while endothelial NO synthase (eNOS) is basally expressed in endothelial cells. Red wine polyphenols are known to affect activity of these enzymes in endothelial and various cancer cells. Aim of this study was to determine the effect of carbon tetrachloride and the polyphenols on eNOS and iNOS expression in the wall of the aorta of male Wistar rats. No significant changes were observed in the amount of eNOS protein immunoreactivity in the aortic media. Chronic administration of CCl4 with or without parallel administration of polyphenols for 12 weeks resulted in a significant increase of iNOS expression in the media. 3 weeks of spontaneous recovery lead to further increase of iNOS. Polyphenols administration during the recovery period partly decreased the iNOS expression but did not reach the control level. It can be concluded, that CCl4 and red wine polyphenols have no significant effect on eNOS in the aortic media. CCl4 causes an increase of iNOS expression in the wall of aorta, which is not prevented by red wine polyphenols. Changes of iNOS expression may influence functional and morphological changes of the aorta. Key words: red wine, polyphenols, carbon tetrachloride, endothelial NO synthase, inducible NO synthase, aortic media Introduction Endothelial NOS (eNOS) is basally expressed in endothelial cells, and its resting activity accounts for the continuous low-level production of NO that participates in the maintenance of the basal vascular tone (Huang et al. 1995). Various stimuli, like proinflammatory cytokines and endotoxins, are able to induce expression of inducible NO synthase (iNOS) in several cell types including vascular smooth muscle cells (Geng et al. 1992). Red wine polyphenols are able to induce eNOS transcription after short-term administration and thus to increase endothelial NO synthase protein levels in cultivated endothelial cells (Leikert et al. 1992). On the other hand, polyphenolic extracts from red wine suppress the expression of inducible NO synthase and COX-2 in colon tumors induced by azoxymethane (Luceri et al. 2002). Red wine polyphenols also reduced the activity of inducible NO synthase in three different human prostate cancer cell lines along with the NO production (Kampa et al. 2000). Carbon tetrachloride (CCl4) is a toxic substance from which the trichlormethyl radical is formed by P-450 (International Programme on Chemical Safety 1999). Recently, it has been applied as a model of oxidative damage to vascular endothelium (Babál et al. 2006). The aim of this study was to determine the possible effect of carbon tetrachloride and red wine polyphenols on eNOS and iNOS expression in media of the aorta. Materials and methods Male Wistar rats, 3 months old, were divided into six groups, 8 animals in each. The preventive experiment lasting for 12 weeks consisted of four groups: the control group, the group receiving CCl4 0.5 ml/kg of body weight twice a week subcutaneously in a 1:1 solution with olive oil, the group receiving dried red wine extract Provinols™ (30 mg/kg/day) in drinking water and the group receiving Provinols™ + CCl4. In the recovery experiment, the initial 12 weeks of CCl4 treatment were followed by 4 weeks of spontaneous recovery in the first, and recovery with Provinols™ administration in the second group of animals. To make sure that each animal received the complete dose of Provinols™, calculated amount of Provinols™ was given to each rat in the appropriate volume of water. Provinols™ polyphenols content has already been reported (Diebolt et al. 2001). 27 The thoracic aortas were fixed 24 hours in 10 % formalin, routinely processed in paraffin. Deparaffinized and rehydrated 5 µm thick slices cut perpendicularly to the vessel axis were rinsed twice in PBS (pH 7.2). Sections were thereafter incubated with primary monoclonal mouse antieNOS antibodies diluted 1:200 or primary monoclonal mouse anti-iNOS antibodies (Santa Cruz Laboratories, San Francisco, CA) diluted 1:100 in PBS for 1 hour at room temperature. Binding was visualized with EnVision detection system (DAKO, Carpinteria, CA) using 3',3'-diaminobenzidine as chromogen. The slides were briefly counterstained in hematoxylin, air-dried and mounted in plastic resin. The findings were documented with a digital photographic camera GC-X3E (JVC, Japan) and evaluated with ImageJ software (National Institute of Health, Bethesda, USA). Threshold value was determined (from 20 to 160) for positive reaction of anti-eNOS and anti-iNOS antibodies. The numbers of pixels of each color were counted and the percentage of the whole area of the media was calculated. The results were statistically analyzed by unpaired Student’s t-test. Results and discussion We observed no significant differences in the proportional area of anti-eNOS antibody reactivity in the aortic media among the experimental groups. It is generally accepted that the eNOS is produced predominantly by endothelial cells (Huang et al. 1995). Since the aortic intima was not included in our evaluation, the observation of no significant changes of eNOS expression in the aortic media is compliant with the current findings. The average proportional reaction of anti-eNOS antibodies in the media was about 17%, which may be caused at least in part by nonspecific binding of the antibodies. The proportional area with reactivity of the antibody against inducible NO synthase was not significantly changed after administration of red wine polyphenols. Administration of CCl4 significantly increased the expression of inducible NO synthase in aortic media (p>0,05). Simultaneous administration of red wine polyphenols had no significant effect on the iNOS protein expression when compared to the group with carbon tetrachloride only, remaining significantly increased above the control (p>0,05). Interestingly, three weeks of spontaneous recovery caused a further increase of iNOS expression (fig. 1) when compared to the control (p>0,001) and to the group without recovery as well (p>0,05). Red wine polyphenols administered during the recovery period caused only an insignificant difference in this observation, iNOS stayed significantly increased (p>0,01) above control, but the difference from the group with CCl4 was no longer statistically significant (fig. 2). Fig. 1. Reactivity of anti-iNOS antibodies in the aortic media after CCl4 administration and three weeks of spontaneous recovery; enlargement 400x. 28 Fig. 2. Expression of iNOS in the aortic media evaluated as the proportional area of anti-iNOS antibody reactivity. C – CCl4, CP – CCl4 + polyphenols, CR – CCl4 + recovery, CRP – CCl4 + recovery with polyphenols, K– control, P –polyphenols. Significance versus K: p> 0,05 *, p> 0,01 **, p> 0,001 ***; versus C: p>0,05 +. Inducible NOS can be produced by vascular smooth muscle cells (Geng et al. 1992) and its production can be induced by various stimuli. It is possible, that damage caused by chronic administration of carbon tetrachloride provoked the increase in production of iNOS in vascular smooth muscle cells. This effect leads to an increased load of free radicals produced from higher production of NO (Sun et al. 2005) and therefore enhances damage of aortic wall. On the other hand, positive effect of NO on liver cells damaged by carbon tetrachloride was described (Muriel 1998) and should be taken into account in blood vessels as well. Conclusion In conclusion, CCl4 as well as red wine polyphenols have no effect on eNOS expression in the aortic media. CCl4 administration cause increase of iNOS in media and red wine polyphenols cannot prevent nor repair this effect. Acknowledgments This work was in part supported by APVT grant N° 20-025204, 51-017905 and VEGA 1/4279/07. References: 1. Babál, P., Kristová, V., Černá, A., Janega, P., Pecháňová, O., Danihel, L., Andriantsitohaina, R.: Red wine polyphenols prevent endothelial damage induced by CCl4 administration. Physiol Res. 55(3): 245–51, 2006. 2. Carbon tetrachloride In: International Programme on Chemical Safety, Environmental Health Criteria (WHO), no. 208 / WHO, Geneva (Switzerland); International Programme on Chemical Safety,Geneva (Switzerland).http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc208.htm#PartNumber:6 177p, 1999. 3. Diebolt, M., Bucher, B., Andriantsitohaina, R.: Wine polyphenols decrease blood pressure, improve NO vasodilatation, and induce gene expression. Hypertension. 38(2): 159–65, 2001. 4. Geng, Y., Hansson, G.K., Holme, .E: Interferon-gamma and tumor necrosis factor synergize to induce nitric oxide production and inhibit mitochondrial respiration in vascular smooth muscle cells. Circ Res. 71(5): 1268– 76, 1992. 5. Huang, P.L., Huang, Z., Mashimo, H., Bloch, K.D., Moskowitz, M.A., Bevan, J.A., Fishman, M.C.: Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature. 377(6546): 239–42, 1995. 29 6. Kampa, M., Hatzoglou, A., Notas, G., Damianaki, A., Bakogeorgou, E., Gemetzi, C., Kouroumalis, E., Martin, P.M., Castanas, E.: Wine antioxidant polyphenols inhibit the proliferation of human prostate cancer cell lines. Nutr Cancer. 37(2): 223–33, 2000. 7. Leikert, J.F., Räthel, T.R., Wohlfart, P., Cheynier, V., Vollmar, A.M., Dirsch, V.M.: Red wine polyphenols enhance endothelial nitric oxide synthase expression and subsequent nitric oxide release from endothelial cells. Circulation. 106(13): 1614–7, 2002. 8. Luceri, C., Caderni, G., Sanna, A., Dolara, P.: Red wine and black tea polyphenols modulate the expression of cycloxygenase-2, inducible nitric oxide synthase and glutathione-related enzymes in azoxymethane-induced f344 rat colon tumors. J Nutr. 132(6): 1376–9, 2002. 9. Muriel, P.: Nitric oxide protection of rat liver from lipid peroxidation, collagen accumulation, and liver damage induced by carbon tetrachloride. Biochem Pharmacol. 56(6): 773–9, 1998. 10. Sun, Y., Carretero, O.A., Xu, J., Rhaleb, N.E., Wang, F., Lin, C., Yang, J.J., Pagano, P.J., Yang, X.P.: Lack of inducible NO synthase reduces oxidative stress and enhances cardiac response to isoproterenol in mice with deoxycorticosterone acetate-salt hypertension. Hypertension. 46(6): 1355–61, 2005. 30 Chronická myeloická leukémia z pohľadu genetiky a molekulovej biológie Ivana Hojsíková1, Gabriela Pavlíková1, Dalibor Hojsík2, Peter Križan1 1 Medirex, a.s., Oddelenie genetiky, Bratislava; 2Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, Ústav súdneho lekárstva, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Chronická myeloická leukémia je myeloproliferatívne ochorenie. Je jedinečná prítomnosťou markera Philadelphia, ktorý vzniká recipročnou výmenou častí chromatínu z dlhého ramena chromozómu 9 a 22. Tým sa do tesnej blízkosti dostávajú gény BCR a ABL. Ich fúziou vzniká produkt – onkogén BCR/ABL, ktorý dáva vznik onkoproteínu Bcr/Abl zodpovednému za vznik ochorenia. Novovzniknutý proteín má oproti natívnemu proteínu Abl zvýšenú tyrozínkinázovú aktivitu. Tá spôsobuje hromadenie leukemických buniek v krvnom obraze pacienta. Okrem prítomnosti Ph markera je pre toto ochorenie charakteristický trojfázový priebeh ochorenia (chronická a akcelerovaná fáza a blastový zvrat). Neoddeliteľnou súčasťou diagnostiky ochorenia a monitorovania jeho liečby je v súčasnosti molekulová analýza (RT PCR a RQ PCR) a komplexná cytogenetická analýza, ktorá zahŕňa klasickú cytogenetickú analýzu a FISH (fluorescenčná in situ hybridizácia). Úvod Chronická myeloická leukémia je klonálne myeloproliferatívne ochorenie. Vzniká malígnou transformáciou jedinej pluripotentnej hemopoetickej kmeňovej bunky. Táto klonálna transformácia vedie ku neregulovanej proliferácii a akumulácii myeloických buniek v kostnej dreni a v krvi. Predstavuje asi 15 – 25 % všetkých leukémií dospelých (D'Antonio et al., 2006). U detí a adolescentov sa vyskytuje len zriedkavo. Incidencia ochorenia rastie s vekom, podľa klinických štúdií sa najčastejšie vyskytuje v 4. až 5. dekáde života. Podľa epidemiologických štúdií však medián dosahuje až 67 rokov. Až 76 % chorých na CML je starších ako 50 rokov. Diagnostika a liečba CML prebieha na viacerých úrovniach a vyžaduje si spoluprácu odborníkov z viacerých medicínskych i nemedicínskych odborov, a to najmä z oblasti hematológie, cytológie, histológie, imunológie a veľmi dôležité miesto patrí genetike a molekulovej biológii. Hematológovia sa na cytogenetikov obracajú nielen na začiatku ochorenia, teda pri diagnostike a stanovení prognózy, ale aj pri hodnotení odpovede na liečbu a monitorovaní priebehu ochorenia. CML z pohľadu genetiky Chronická myeloická leukémia je unikátna spomedzi všetkých myeloproliferatívnych ochorení, pretože jej charakteristickým znakom je prítomnosť chromozómu Philadelphia v populácii leukemických buniek kostnej drene a periférnej krvi (KD a PK). Jedinečnosť ochorenia spočíva v tom, že marker Philadelphia je jednak znakom, a zároveň aj príčinou ochorenia. Ph vzniká recipročnou translokáciou distálnych častí dlhých ramien chromozómu 9 a 22 – t(9;22)(q34;q11). Miesto zlomu na chromozóme 9 je v oblasti q34 a na chromozóme 22 v oblasti q11. Marker bol nazvaný podľa miesta objavenia. Medzinárodný systém cytogenetického názvoslovia označuje tento abnormálny chromozóm 22 v tejto konkrétnej translokácii ako Ph (Hughes et al., 2006). Recipročnou fúziou vznikajú dva fúzne produkty: na derivovanom ch. 9 vzniká gén 5´ABL/3´BCR s neznámou funkciou a na Ph sa vyskytuje produkt fúzie onkogén 5´BCR/3´ABL, ktorý je príčinou ochorenia. Onkoproteín Bcr/Abl sa oproti natívnemu proteínu Abl líši veľkosťou, výskytom a funkciou. Má zvýšenú tyrozínkinázovú aktivitu, ktorá vedie ku zvýšeniu schopnosti proliferácie a zníženiu schopnosti diferenciácie a apoptózy buniek. Marker Ph sa vyskytuje u 95 % pacientov s CML, pričom cca u 80 – 85 % pacientov je prítomný vo svojej klasickej podobe a možno ho teda dokázať bežnými cytogenetickými metódami vo všetkých vyšetrených mitotických (metafázových) figúrach z jadier buniek v KD a PK. 5 % chorých sú nositeľmi fúzneho génu BCR/ABL, no Ph chromozóm u nich nie je možné dokázať cytogeneticky, ale len metódami FISH a molekulovej biológie. Vtedy hovoríme o maskovanom variante translokácie (9;22), ktorý obsahuje submikroskopické translokácie klasickou cytogenetikou neviditeľné. Ide o kryptickú inzerciu 3´ABL do chromozómu 22. 31 Okrem jednoduchej translokácie 9;22 môžu pri tomto ochorení vznikať aj jej varianty, kedy sú do nej zahrnuté aspoň tri chromozómy, z ktorých dva sú vždy 9 a 22 s rovnakými bodmi zlomu ako pri jednoduchej translokácii. Bod zlomu v treťom chromozóme môže varírovať. Vtedy hovoríme o komplexnom variante translokácie. Tento model sa vyskytuje u 5 – 10 % prípadov. 5% prípadov je cytogeneticky aj metódami molekulovej biológie negatívnych a vtedy hovoríme o tzv. atypickej CML. V týchto prípadoch je prognóza, priebeh ochorenia, ako aj odpoveď na liečbu odlišná a podľa literatúry horšia (Sandberg, 1990; Mufti et al., 1996, Mayer et al., 2002). Podľa niektorých autorov v tomto prípade nemožno toto ochorenie považovať za CML, ale za iné malígne ochorenie krvi (www.infobiogen.com). U asi 10 – 15 % pacientov, nositeľov Ph markera a asi 30 – 40 % pacientov s variantnou formou translokácie bola pomocou metódy FISH detegovaná submikroskopická delécia derivovaného chromozómu 9 – del (9q+). Táto delécia (bežnou mikroskopickou technikou nedetegovateľná) sa pravdepodobne objaví súčasne s Ph translokáciou a môže zahŕňať stratu sekvencie z chromozómu 9, 22 alebo z oboch. Dĺžka deletovaných sekvencií varíruje (od niekoľko kilobáz po niekoľko megabáz) a zvyčajne sú lokalizované v regióne obsahujúcom miesta zlomu BCR/ABL na chromozóme 9 (Calabrese et al., 2006). Podľa viacerých zdrojov literatúry je prognóza pacientov s touto abnormalitou horšia, a to v prípade, že sú liečení chemoterapiou alebo pomocou transplantácie kostnej drene (Kolomietz et al., Sinclair et al. a Huntly et al. in Quintas-Cardama et al, 2004; Calabrese et al., 2005). Po zavedení nového spôsobu liečby pomocou kinázového inhibítora STI571 sa zlepšila situácia pre týchto pacientov, pretože podľa Quintas-Cardamu (2004) je tento liek schopný preklenúť takúto chromozómovú abnormalitu a prognóza pacientov s del (9q+) je rovnaká ako pri bežnej t(9;22). V priebehu ochorenia rozlišujeme tri základné štádiá. Chronická fáza, ktorá sa niekedy nazýva aj benígna fáza a je charakterizovaná výskytom pôvodného leukemického klonu s markerom Ph u 95 % pacientov. Môžeme ho detegovať pomocou aspoň jednej z dostupných genetických vyšetrovacích metód v 90 % leukemických buniek každého pacienta. Za určitých predpokladov v tejto fáze môže pacient prežívať celé mesiace. Akcelerovaná fáza je charakteristická postupným prevládaním určitých klinických a laboratórnych abnormalít a zhoršovaním celkového stavu pacienta. V kostnej dreni sa začnú postupne vyskytovať nové bunkové populácie s prídavnými genetickými zmenami – sekundárnymi aberáciami chromozómov. Tieto nové populácie postupne vytláčajú pôvodný leukemický klon. Fáza blastového zvratu je tiež niekedy označovaná aj ako malígna fáza. Blastový zvrat je typický postupným pribúdaním nových aberácií chromozómov, ktorých počet a kombinácie v jednotlivých prípadoch varírujú . Pri prechode ochorenia z chronickej do akcelerovanej prípadne blastovej fázy sa môžu popri Ph chromozóme v metafázových jadrách vyskytovať chromozómové abnormality viditeľné pri klasickom cytogenetickom vyšetrovaní pomocou mikroskopu, ale aj pomocou FISH. Podľa Dewalda a kol. (1997) 71 % pacientov má okrem t (9;22)(q34;q11) aspoň jednu z týchto chromozómových abnormalít: trizómia 8 (34 %), +Ph (30 %) izochromozóm 17i - i(17q) (20 %), trizómia 19 (13 %), -Y (8 % mužov), trizómia 21 (7 %), trizómia 17 (5 %), monozómia 7 (5 %). Ak sa tieto abnormality vyskytnú v čase diagnózy, znamená to pre pacienta horšiu prognózu ( www.ncbi.nlm.gov/books/bv ). Podľa typu prevládajúcich buniek v kostnej dreni a periférnej krvi rozoznávame dve formy blastovej krízy: lymfoidná, ktorá je menej častá a myeloidná. V tomto smere môže cytogenetika napomôcť pri predpokladaní blastovej krízy. Napríklad chromozómové aberácie týkajúce sa chromozómu 7 sú zväčša spojené s lymfoidnou blastovou krízou. Iné aberácie ako +19, +21, i(17q) alebo +8 predpokladajú myeloidnú blastovú krízu (Sandberg et al., 1990, Mufti et al., 1996). Predpokladá sa, že prechod ochorenia z chronickej do blastovej fázy je výsledkom viacerých aditívnych molekulových zmien (Goldman, 2004). CML z pohľadu molekulovej biológie Z pohľadu molekulovej biológie pri t(9;22), teda pri vzniku génu BCR/ABL dochádza k zlomu v géne ABL (Abelson), pričom presné miesto zlomu sa pohybuje na úseku asi 200 kb medzi dvoma alternatívnymi exónmi Ia a Ib pred exónom 2. Niekedy je miesto zlomu na 5´konci exónu 1b, alebo 3´konci 1a, ale vždy je zlom na 5´konci exónu 2. Produktom nepoškodeného génu je proteín Abl s veľkosťou 145kDa. Vyskytuje sa prevážne v jadre. Nepoškodený gén BCR dáva vznik proteínu Bcr s veľkosťou 160 kDa. Na svojom N – terminálnom konci obsahuje serín-treonínovú doménu. Jeho súčasťou je taktiež SH2 viažuca a C – terminálna doména, ktorá funguje ako GTPáza aktivujúca proteín p21rac. (www.infobiogen.com). 32 V géne BCR (breakpoint cluster region) môže dôjsť k zlomu na troch miestach: M-bcr, zriedkavejšie m-bcr a µ-bcr, avšak najčastejšie sa láme v jednom z intrónov (b2, b3) v oblasti nazývanej major bcr – M - bcr. Spojením génov BCR a ABL vzniká fúzny gén BCR/ABL väčšinou spojením exónov b2 (resp. e13) alebo b3 (resp. e14) génu BCR a a2 génu ABL. Vzniknutý transkript má dĺžku 8,5 kb (dĺžka normálnej mRNA je 6 a 7 kb) (Sawyers, 1999). Celkom ojedinele dochádza k zlomu génu BCR v ďalšej oblasti nazývanej mikro bcr – µ - bcr, kedy vzniká fúzny gén spojením génov BCR a ABL medzi exónmi c3 (resp e19) a a2. Takýchto prípadov CML bolo zatiaľ popísaných 12 (Klener et al., 2002). Ďalej pri CML celkom výnimočne nachádzame zlom génu BCR v 1. dlhom intróne, a toto miesto nazývame minor bcr – m - bcr. Zlom v tomto mieste vedie k spojeniu génov BCR a ABL e1 – a2. (Mayer et al., 2002). Novovzniknutý fúzny gén BCR/ABL kóduje potom nový proteín s hmotnosťou závisiacou od miesta zlomu v BCR, a to 210 (pri M-bcr), 190 (pri m – bcr) alebo 230 kD (pri µ - bcr ). Onkoproteín Bcr/Abl sa oproti natívnemu proteínu Abl líši veľkosťou a miestom výskytu. Nový gén sa vyskytuje výlučne v cytoplazme na rozdiel od Abl proteínu s výskytom najmä v jadre. Najmarkantnejší je rozdiel vo funkcii. Má zvýšenú tyrozínkinázovú aktivitu, ktorá vedie ku zvýšeniu schopnosti proliferácie a zníženiu schopnosti diferenciácie a apoptózy buniek. Dnes už štandardnou metódou pre potvrdenie diagnózy CML je cytogenetické vyšetrenie, pri ktorom sa jednak potvrdí výskyt typickej t(9;22), prípadne jej variantná forma a navyše slúži na vylúčenie ďalších prípadných cytogenetických abnormalít. Zároveň s cytogenetickým vyšetrením sa vykonáva aj fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) a polymerázová reťazová reakcia s využitím reverznej transkriptázy (RT-PCR). Okrem kvalitatívnej PCR (pomocou nej sa zisťuje len prítomnosť fúzneho produktu) sa čoraz častejšie používa aj kvantitatívna PCR, ktorou sa s vysokou citlivosťou zisťuje aj počet fúznych produktov (RQ-PCR). Závery Diagnostika a liečba CML je od svojich počiatkov, teda od objavenia súvislosti Ph a CML úzko spätá s genetikou a molekulovou biológiou. Sú neoddeliteľnou súčasťou diagnostických a monitorovacích metód liečby CML. Pochopenie patogenézy ochorenie sa začalo s objavom Philadelphia (Ph) chromozómu a pokračovalo s objasnením molekulovej podstaty, teda vzniku BCR/ABL fúzneho génu. Pre diagnózu CML a pre monitorovanie liečby je potrebná detekcia t(9;22)(q34;q11) alebo prestavby BCR/ABL. Na tieto účely boli vyvinuté viaceré metódy genetiky a molekulovej biológie. Klasická cytogenetická prúžkovacia analýza sa stala zlatým štandardom týchto metodík, ale bez FISH a RT-PCR, či RQ-PCR si diagnostiku a monitorovanie ochorenia dnes už nevieme predstaviť. Pre správne nastavenie liečby je dôležitá komunikácia medzi hematológmi a genetikmi, či molekulovými biológmi a ich spoločná spolupráca pri interpretácii výsledkov. Dobrá spolupráca a vzájomná dôvera pri odovzdávaní výsledkov vyšetrení tvoria podstatnú časť úspešnosti liečby tohto závažného ochorenia a sú prínosom pre pacientov. Použitá literatúra 1. Calabrese, G., et al.: Fluorescence In Situ Hybridization Analysis of Minimal Residual Disease and the Relevance of the der (9) deletion in imatinib – treated patients with chronic myeloid leukemia. Haematologica. 91: 994– 95, 2006. 2. D'Antonio, J.: Chronic Myeloid Leukemia. Clin J Oncol Nurs. 9(5): 535–538, 2005. 3. Goldman, J.M.: Chronic myeloid leukemia – still a few questions.Exp Hematol. 32: 2–10, 2004. 4. Hughes, T.P, Branford, S.: Molecular monitoring of BCR/ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia. Blood Rev. 20: 29–41, 2006. 5. Klener, P.: Klinická onkologie. Vyd. Galén a Nakladatelství Karolinum. 11–13; 231–232; 573; 576–577, 2002. 6. Mayer, J., Starý, J.: Leukemie. Vyd. Grada Publishing, spol. s r. o. 91–93; 94–97; 300–311, 2002. 7. Mufti, G.J., et al.: An atlas of malignant haematology, cytology, histology and cytogenetics. Martin Dunitz Ltd. London. 171–176; 198–199,1996. 8. Quintas-Cardama, A., et al.: Imatinib mesylate therapy may overcome the poor prognostic significance of deletions of derivative chromosome 9 in patients with chronic myelogenous leukemia. Blood. 105: 2281–86, 2004. 9. Sandberg, A.A.: The Chromosomes in Human Cancer and Leukemia. Elsevier Science Publishing Co., Inc. 427–514, 1990. 10. Sawyers, Ch.L.: Chronic Myeloid Leukemia. New Engl J Med. 340(17): 1330–1340, 1999. 11. www.infobiogen.com 12. www.ncbi.nlm.gov/books/bv 33 Využitie augmentačných techník v chirurgickej terapii parodontopatií Dušan Hollý, Jozef Mračna Univerzita Komenského, Lekárska fakulta, Klinika stomatológie a maxilofaciálnej chirurgie a OÚSA, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Cieľom parodontologického ošetrenia je nielen zvládnutie samotnej choroby, ale tiež regenerácia poškodeného tkaniva. V priebehu ostatných rokov boli navrhnuté rôzne postupy na dosiahnutie tohto cieľa. Riadená tkanivová regenerácia je postupom chirurgickej terapie vyvinutým na základe experimentálnych štúdií. Umožňuje nové vytvorenie závesného aparátu zubov postihnutých parodontitídou, t.j. reattachmentu. Rozumie sa tým úplná regenerácia parodontálnych tkanív: cementu koreňa, alveolárnej kosti, periodoncia a epitelových úponov na zub. Tento relatívne nový spôsob chirurgickej terapie parodontitídy je založený na princípe mechanickej zábrany prístupu epiteliálnych a väzivových buniek gingívy, t.j. buniek orálneho epitelu a následného umožnenia vrastania a osídlenia defektu progenitorovými bunkami (desmodontami) schopnými diferenciácie. Parodontálne vlákna obsahujú tieto bunky s regeneračným potenciálom, ktoré sú ako jediné schopné regenerovať parodontitídou zničený závesný aparát. Úvod Augmentačné techniky pri terapii parodontopatií predstavujú použitie riadenej tkanivovej regenerácie. Klinická metóda, umožňujúca regeneráciu závesného aparátu a kosti zubov poškodených parodontitídou, musí umožniť bunkám parodontálneho ligamenta - desmodontom – pokryť povrch koreňa zuba. Toto je možné dosiahnuť umiestnením okluzívnej membrány, ktorá sformuje priestor medzi membránou a povrchom koreňa, do ktorého môžu vrastať tkanivá závesného aparátu. Membrána taktiež zabráni proliferácii gingiválneho spojivového tkaniva a epitelu k povrchu koreňa v priebehu hojenia.4 Dôležitou požiadavkou pri riadenej tkanivovej regenerácii je schopnosť membrány udržať daný chránený priestor nad defektom a jej rezistencia ku kolapsu spôsobenému tlakom priložených mukoperiostálnych lalokov. To platí hlavne pre resorbovatelné membrány, ktoré strácajú v priebehu degradačného procesu svoju mechanickú odolnosť.V tom prípade je nutné použitie dodatočných podporných techník. Membrána má dvojvrstvovú štrukúru. Jedna vrstva je porózna a prikladá sa ku kosti, čo umožňuje jej vrastanie do defektu. Cez druhú, kompaktnejšiu vrstvu, sa prikladá mukoperiostálny lalok. Tým sa zabráni vrastaniu mäkkých tkanív do ošetrenej rany. Štruktúru si má membrána udržovať aj vo vlhkom prostredí a má byť používaná v kombinácii s podporným materiálom, ktorý vyplní defekt. Materiál a metódy Jedným z najdôležitejších cieľov terapie parodontopatií je eliminácia hlbokých vačkov, pretože práve v nich sa neprestajne zvyšuje počet patogénnych anaeróbnych mikroorganizmov. Redukcia hĺbky vačku (príp. eliminácia) môže byť dosiahnutá postupmi resekčného alebo regeneratívneho charakteru alebo kombináciou oboch. Regeneratívne postupy v parodontológii znamenajú použitie riadenej tkanivovej regenerácie – RTR. Klinické indikácie RTR v parodontológii7: - Furkácie – II.stupeň – mandibula, II.stupeň – maxilla bukálne, III.stupeň – mandibula, ak je vertikálny rozmer ≤ 3mm (podtrieda A - 1-3 mm; Tarnow and Fletcher 1984). - Kostné defekty – 1,2,3 -stenné (1-stenné s nižšou mierou úspešnosti, kostný štep). Kontraindikácie7: - Lokálne faktory - nedostatočná kontrola plaku; nedostatočne endodonticky ošetrené devitálne zuby; silne kývavé zuby bez stabilizácie. - Systémové faktory – fajčenie; dekompenzovaný DM, iné celkové ochorenie, ktoré ovplyvňuje možnosti ošetrenia. 34 Pri klinickom použití sa používajú rôzne materiály. Podľa rôznych charakteristík ich môžeme deliť nasledovne6,10: Podľa aktivity: - osteogénne – obsah preukázateľných buniek, ktoré tvoria kostné tkanivo, - osteoindukčné – stimulujú (indukujú) tkanivá k tvorbe novej kosti, samé nemajú osteogénny potenciál, - osteokondukčné – vypĺňajú priestor defektu, vytvárajú sieť(matrix, podklad), nevytvárajú novú kosť, neindukujú tvorbu kosti. Podľa pôvodu materiálu: - autogénne (autograft, autológne – od toho istého jedinca) - tuber maxillae, z extrakčnej rany, bezzubá časť alveolárneho výbežku, mentálna časť sánky, vzostupné rameno sánky, lopata bedrovej kosti; - isogénne (isograft, syngénne – monozygotné dvojičky, príbuzné osoby) – kortikálna kosť, trabekulárna kosť (a ich kombinácie); - alogénne (allograft, homológne – od rovnakého druhu – odvodené od ľudských kadávrov, sú dostupné cez autorizované a certifikované tkanivové banky) DFDBA (demineralized freeze-dried bone allograft) – demineralizovaný mrazený vysušený kostný štep, FDBA (freeze-dried bone allograft) mrazený vysušený kostný štep, mrazená vysušená kostná dreň; - xenogénne (xenograft, heterogénne, heterológne – od iného druhu) – kolagén, kosť (bovínne - BioOSS, purínne – Puros); - aloplastické (alloplastic graft, syntetické – chemicky cudzí materiál) – „Plaster of Paris”, calcium carbonate, calcium phosphate, keramika, hydroxyapatit (HA), biosklo, beta-trikalcium fosfát (β-TCP), polyméry a iné. Na trhu je dnes široká škála certifikovaných membrán na použitie v stomatológii, vo všeobecnosti ich môžeme deliť na: - Syntetické, neresorbovatelné – Gore-Tex, Gor-Tex Ti, e-PTFE; - Syntetické, resorbovatelné (bioabsorbovatelné) – Vicryl, Guidor, Resolut, Artisorb, a iné; - Naturálne, biodegradovatelné (bovínne, purínne) – Bio-Gide, Biomend, Alloderm. Nároky na optimálnu membránu sú bezpečnosť (zabránenie šíreniu ochorenia), biokompatibilita (netoxická, neimunogénna), adaptovateľnosť na povrch koreňa a kosti (jednoducho a bezpečne), rigidita (aby sa membrána neprevaľovala do defektu), permeabilita (pre potrebné molekuly, nie však pre bunky), integrácia do tkanív (imobilita), dlhodobé udržiavanie priestoru, biodegradácia (kontrolovatelná), ďalšie vlastnosti (antimikrobiálny efekt, biostimulácia)9. Pre riadenú tkanivovú regeneráciu máme možnosť výberu neresorbovatelných a resorbovatelných membrán. V širokom klinickom použití pri RTR sú membrány e-PTFE, u ktorých možno pomerne presne predpovedať výsledok regenerácie. Taktiež dostupné sú titánom zosilené membrány. Použitie nevstrebatelných membrán sprevádzajú určité problémy. Membány e-PTFE sa majú o 4-6 týždňov po aplikácii odstraňovať. Pri sekundárnej operácii, kedy membránu odstraňujeme, často zistíme, že nezrelé novotvorené tkanivo prestupuje membránu, alebo k nej pevne adheruje. Mechanické poškodenie tohto tkaniva, ktoré sprevádza odstránenie membrány, ovplyvňuje proces hojenia. Pokiaľ sa nepodarí novotvorené tkanivo kompletne v priebehu sekundárnej operácie prekryť lalokom, príde k úbytku regenerovaného tkaniva. 2,8 Niekedy je obtiažne v situácii značného odhalenia membrány novotvorené tkanivo dokonale uzavrieť lalokom. Bioresorbovatelné membrány nevyžadujú sekundárnu operáciu, ktorou membránu odstraňujeme. Záťaž je tak menšia ako pre pacienta, tak aj pre ošetrujúceho. To bol taktiež dôvod, prečo došlo k vývoju rôznych vstrebatelných membrán.1,3 Na kompletnú regeneráciu parodontálnych štruktúr, vrátane cementu, parodontálnych ligament, kosti a ďasna je potrebná súhra medzi viacerými pluripotentnými bunkami, extracelulárnymi matrix a proteínovými matrix, systémových hormónov ako aj rastových a diferenciačných faktorov.10 Z týchto faktorov medzi najdôležitejšie patria: PDGF (platelet-derived growth factor – trombocytový rastový faktor), IGF (insuline-like growth factor – od inzulínu odvodený rastový faktor), TGF-β (transforming factor beta – transformujúci rastový faktor beta), BMP (bone morphogenetic proteins -2, -4, -7 – kostné faktory) a FGF (fibroblast growth factor – fibroblastový rastový faktor). 35 Tieto faktory sa používajú čoraz častejšie na vystupňovanie a zlepšenie hojenia parodontu. Zvýšenie hladín rastových faktorov vedie k zlepšeniu novotvorby kosti a rastové faktory trombocytov zároveň urýchľujú hojenie mäkkých tkanív v okolí kosti. Na dosiahnutie tohto cieľa sa v klinických podmienkach používa trombocytový koncentrát (plazma bohatá na trombocyty, PRDP – platelet rich derived plasma) pripravený z odobratej krvi pacienta pred zákrokom a separovaný v krvnej banke. Jeho výhody sú nasledovné: - Urýchľuje endoteliálnu, epiteliálnu a epidermálnu regeneráciu, - Stimuluje angiogenézu, - Podporuje syntézu kolagénu a zvyšuje pevnosť regenerovaného tkaniva, - Pôsobí hemostaticky, - Organizuje krvný hematóm a zmenšuje pooperačný edém, - Znižuje bolestivosť a tým redukuje spotrebu analgetík v pooperačnom období, - Urýchľuje depozíciu extracelulárnej matrix a tým aj uzáver rany, - Vylučuje možnosť prenosu infekcie a imunitnú odpoveď (autológny materiál)5. Výsledky a diskusia Pred chirurgickým výkonom musí byť u pacientov dosiahnutá úprava hygieny, hygienická inštruktáž a predliečený stav parodontu. (obr.1) Samotný chirurgický zákrok spočíva v odklopení mukoperiostálnych lalokov z vestibulárnej aj palatinálnej (lingválnej) strany, kyretáže parodontálnych chobotov, odstránení granulačného tkaniva z mäkkých tkanív (obr.2), zvyškov subgingiválneho zubného kameňa a nekrotických častí cementu koreňa zuba. Gél má ideálne vlastnosti na vyplnenie kostného defektu. Pred jeho aplikáciou do defektu sa odporúča naloženie pomocných stehov. Ich sutúra nasleduje po spomínanej aplikácii gélu a prekrytí kolagénovou membránou (obr.7,8). Potom priklopíme a adaptujeme mukoperiostálne laloky a fixujeme ich definitívnou sutúrou (obr.9). Pooperačne sa podávajú antibiotiká a sú ordinované výplachy dezinfekčnými roztokmi s obsahom chlórhexidínu. Sledovaný je proces osteogenézy a osteointegrácie. Po deviatich mesiacoch sa hodnotí úspech operácie, t.j. znovuvytvorenie parodontálnych štruktúr závesného aparátu – reattachmentu a na rtg nárast kostného tkaniva (obr.10,11). Obr. 1. Obr. 2. Obr. 3. Obr. 4. 36 Obr. 5. Obr. 6. Obr. 7. Obr. 8. Obr. 9. Obr. 10. Obr. 11. Závery Augmentácie v rámci riadenej tkanivovej a kostnej regenerácii v parodontológii sú techniky, ktoré sa v širokom rozsahu používajú na regeneráciu poškodeného závesného aparátu zubov. Prinášajú nové aspekty na terapiu parodontopatií. Súčasná moderná parodontológia smeruje k zlepšovaniu týchto zákrokov pomocou regeneračných faktorov, ktoré sa postupne stávajú súčasťou klinickej praxe. 37 Použitá literatúra 1. Becker W, Becker BE, Mellonig J, et al. A prospective multi-centered study evaluating periodontal regeneration for class II furcation invasions and intrabony defects after treatment with a bioresorbable barrier membrane: 1 year results. J Periodontol 1996; 67: 641-649. 2. Cortellini P, Pini Prato G, Tonetti MS. Periodontal regeneration of human infrabony defects with titanium reinforced membranes. A controlled clinical trial. J Periodontol 1995; 66: 797-803. 3. Cortellini P, Pini Prato G, Tonetti MS. Periodontal regeneration of human intrabony defects with bioresorbable membranes. A controlled clinical trial. J Clin Periodontol 1996 67: 217-223. 4. Fassmann A, Vaněk J, Dvořáková N, et al., Řízená tkáňová a kostní regenerace ve stomatologii. Praha : GRADA, 2002. 200s., ISBN 80-247-0316-5. 5. Marx RE, Carlson ER, Eichstaedt RM, Schimmele SR, Strauss JE, Georgeff KR. Platelet.rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1998;85:638-646 6. Newman MG, Takei HH, Klokkevold PR, Carranza FA, et al., Carranza’s Clinical Periodontology, St.Louis : Saunders Elsevier, 2006. 1328p., ISBN-13: 978-1416024002 7. Stellungsnahme der Deutsche Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Liesegangstr. 17 a - 40211 Düsseldorf, Stand 06/1999 8. Tonetti MS, Pini Prato G, Cortellini P. Periodontal regeneration of human infrabony defects. IV. Determinants of healing response. J Periodontol 1993; 64(10): 934-940. 9. Vojtassák J, Bakos D, Danihel L, Kristín J, Böhmer D, Danisovic L, Blasko M. In vitro cytotoxicity testing of coladerm membrane. Cell Tissue Bank. 2001;2(4):225-33. 10. Wolf HF, Rateitschak EM, Rateitschak KH, Hassel TM, et al., Periodontology - Color Atlas of Dental Medicine. Stuttgart : Georg Thieme Verlag, 2005. 534p., ISBN 3-13-675003-9. 38 Možnosti monitoringu liekového rizika Roman Hudec, Lýdia Božeková, Milan Kriška Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, Farmakologický ústav, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Spontánny monitoring je jednou zo súčastí organizovania farmakovigilancie. Výhodami spontánneho monitoringu je finančná nenáročnosť, jednoduchosť, široký komplexný záber, náhodný výber prebiehajúci kontinuálne. Sledovali sme frekvenciu hlásených nežiaducich účinkov jednotlivých liekov, ako aj ich závažnosť a spektrum v rokoch 1998-2004. Údaje sme čerpali z materiálov Národného centra pre sledovanie nežiaducich účinkov liečiv pri ŠÚKL-i. Vážne NÚL sa podieľajú na hlásení vyrovnane a ich množstvo osciluje okolo hodnoty 200/rok. Získané výsledky hovoria o narastajúcej tendencii v celkovom počte spontánnych hlásení, čo je priaznivý výsledok (z počiatočných 487/rok až na 860/rok). Vnímanie rizika liekov je na Slovensku vo všeobecnosti nízke. Je to aj vďaka nízkej spolupráci lekárov v rámci systému farmakovigilancie a v neposlednom rade vďaka nízkej ochote hlásiť nežiaduce účinky. Postupne sa zvyšuje druh hlásených reakcii, okrem najčastejšie pozorovaných kožných reakcií, aj iné reakcie (extrapyramídová porucha, alebo ischémia myokardu a hypertyreóza). Úvod Spontánny monitoring je jednou zo súčastí organizovania farmakovigilancie. Ide o spontánne hlásenia lekárov o výskyte nežiaducich účinkoch liekov. Hlásenia sa realizujú na špeciálnych tlačivách, ktoré sú zasielané do Centra pre sledovanie nežiaducich účinkov pri Štátnom ústave na kontrolu liečiv (ŠÚKL). Hlásená informácia o možnej kauzálnej súvislosti medzi nežiaducim účinkom a liekom sa označuje ako signál. Tento údaj bol predtým neznámy, alebo nedostatočne dokumentovaný. Pre vznik signálu je potrebných zväčša viac ako jedno hlásenie (Edwards a Aronson, 2000). Výhodami spontánneho monitoringu sú (podľa Wood a kol., 1998): - finančná nenáročnosť - jednoduchosť - široký komplexný záber - náhodný výber prebiehajúci kontinuálne. Nevýhody spontánneho monitoringu sú (podľa Begaud a kol., 1994): - nízky záchyt nežiaducich účinkov - obtiažne sa dá určiť frekvencia NÚL - nedajú sa hodnotiť nežiaduce účinky typu C a D - nízka validita - výsledky z malých populačných celkov. V začiatočných štádiách uvádzania lieku pri klinickom skúšaní je pôsobeniu nového lieku exponovaných asi 1500 pacientov , čo umožňuje zachytiť len najčastejšie NÚL. Na to, aby sme objavili vzácne sa vyskytujúce reakcie je potrebné aby bolo liečivu exponovaných minimálne 30 000 pacientov. Po zavedení lieku do používania sú hlásenia z praxe podstatné pre identifikáciu možných menej častých NÚL (Belton a kol., 1995, Pirmohamed a kol., 1998). Postmarketingové sledovanie je poslednou fázou klinického hodnotenia nového lieku. Prebieha po zavedení lieku do používania a vďaka širokému záchytu je veľmi dobrou možnosťou na hodnotenie nežiaducich účinkov (Waller a kol., 1992, Dunn a Mann, 1999). Materiál a metódy Sledovali sme frekvenciu hlásených nežiaducich účinkov jednotlivých liekov, ako aj ich závažnosť a spektrum. Údaje sme čerpali z materiálov Národného centra pre sledovanie nežiaducich 39 účinkov liečiv pri Štátnom ústave pre kontrolu liečiv Slovenskej republiky. Závažné nežiaduce účinky vedú k poškodeniu pacienta, prípadne až k smrti. Získané údaje o hlásených NÚL sme štatisticky vyhodnotili metódou korelačnej analýzy. Kritická hodnota korelačného koeficientu r pre alfa 0.05 zistená z literatúry je 0,7743. Výsledky a diskusia Spontánne hlásenia nežiaducich účinkov po liekoch sa dlhodobo považujú za najlepší zdroj signálov o riziku liekov a sú externým ukazovateľom percepcie liekového rizika. Možno nepriamo usudzovať o korelácii medzi percepciou rizika a monitorovaním rizika pomocou spontánnych hlásení. Sledovali sme trend v počte všetkých hlásení, ktoré prišli do Národného centra pre nežiaduce účinky (Tab. 1). Tabuľka 1 Všetky hlásené NÚL v rokoch 1998-2004 Počet hlásení * Rok 1998 Rok 1999 Rok 2000 Rok 2001 Rok 2002 Rok 2003 Rok 2004 487 533 565 924 740 772 860 * - signifikantná zmena Najčastejšie lekári hlásili kožné prejavy (erytém, exantém, pruritus) s výnimkou roku 2001. Nárast počtu spontánnych hlásení v sledovanom intervale je signifikantný s výrazným vrcholom v roku 2001, kedy až 37,8 % všetkých hlásení predstavoval kašeľ pri užívaní inhibítorov angiotenzín – konvertujúceho enzýmu. Postupne sa mení štruktúra hlásení a zvyšuje sa počet liekov, po ktorých sa hlásili nežiaduce reakcie (v roku 1998: 235; a v roku 2004: 438), čo predstavuje signifikantný nárast. Sledovanie pôvodu hlásení z hľadiska profesie ukazuje, že v posledných rokoch nastal obrat a hlásenia z ambulancií prevažujú nad hláseniami z nemocníc. Podiel vážnych reakcií na celkovom počte hlásení ukazuje tabuľka (Tab. 2). Tabuľka 2 Hlásené vážne reakcie Rok 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Absolútny počet Percentuálny podiel zo všetkých hlásení 162 213 172 215 200 173 185 33,26 39,39 30,44 23,27 27,03 22,41 21,51 Vážne NÚL sa podieľajú na hlásení vyrovnane a ich množstvo osciluje okolo hodnoty 200/rok. Vzhľadom na vzostup absolútneho počtu hlásení má percentuálny podiel vážnych reakcií klesajúcu tendenciu. Vnímanie rizika liekov je na Slovensku vo všeobecnosti nízke. Je to aj vďaka nízkej spolupráci lekárov v rámci systému farmakovigilancie a v neposlednom rade vďaka nízkej ochote hlásiť nežiaduce účinky. Výsledkom je malý počet spontánnych hlásení zaregistrovaných na Štátnom ústave pre kontrolu liečiv. Predovšetkým organotoxické nežiaduce účinky môžu v príčinnej súvislosti s liečbou uniknúť pozornosti, vzhľadom k latencii nástupu reakcie a ohraničeným možnostiam diagnostiky. Vysvetlením nárastu počtu hlásení v roku 2001 by mohlo byť tzv. indukované hlásenie, ktoré môže byť napr. spôsobené požiadavkou intolerancie ACEI (dráždivý kašeľ) pri preskripcii blokátorov angiotenzínového receptora (sartanov). Získané výsledky hovoria síce o narastajúcej tendencii v počte spontánnych hlásení, čo je priaznivý výsledok, ale v porovnaní s údajmi z konca osemdesiatych rokov, kedy sa počet spontánnych hlásení na Slovensku pohyboval okolo 1000-1500 hlásení za rok, je súčasných okolo 800 hlásení vlastne poklesom. Situácia v zahraničí je podobná, v Taliansku je hlásených asi 12,3 reakcií na 100 000 obyvateľov a rok v období 1998–2004 (u nás to vychádza asi 12,9 hlásenia/100 000 obyvateľov a rok) (Polimeni a kol., 2006). Zaznamenali sme relatívne ustálený počet hlásených závažných nežiaducich účinkov. Postupne sa zvyšuje druh hlásených reakcii, okrem najčastejšie pozorovaných kožných reakcií, aj iné 40 reakcie (extrapyramídová porucha, alebo ischémia myokardu a hypertyreóza). Práve počet závažných reakcií hovorí o kvalite spontánneho monitoringu, pretože práve takéto hlásenia majú vysokú výpovednú hodnotu. V Taliansku napríklad predstavovali záväzné hlásenia NÚL v období 1998–2004 42,6 % (na Slovensku len 27 %) (Polimeni a kol., 2006). Pozitívnu zmenu by prinieslo väčšie zapojenie farmaceutov do spontánneho monitoringu, pretože farmaceuti sú často konfrontovaní s prípadnými problémami pacientov. Podľa posledných informácii zo Štátneho ústavu pre kontrolu liekov sa už objavili prvý spolupracujúci farmaceuti. V zahraničí (USA, či Holandsko) sa farmaceuti podieľajú významným percentom na počte spontánnych hlásení (Van Grootheest a kol., 2004). Závery Vývoj povedomia o riziku farmakoterapie medzi odbornou verejnosťou sa zlepšuje. Prejavuje sa to stúpajúcim počtom spontánnych hlásení v sledovanom intervale. Situáciu v hlásení NÚL by pomohol zlepšiť vyšší počet edukačných akcií . Nedostatočná spolupráca lekárov môže mať viacero príčin: strach z pocitu viny pri výskyte NÚL, nedostatok času pri záťaži klinickou prácou, neodôvodnené uspokojenie, samoľúbosť, chybná viera, že na trh prichádzajú len bezpečné lieky, strach z postihu, ignorancia metódy hlásenia, neochota hlásiť nežiaduce účinky s neistou, len pravdepodobnou kauzalitou, či všeobecná letargia k administratívnej práci. Poďakovanie Práca bola podporená grantom UK/5/2006. Použitá literatúra 1. Begaud, B., Moride, Y., Tubert-Bitter, P. et al.: False positive in spontaneus reporting: should we worry about them? Br J Clin Pharmacol. 38: 401–4, 1994. 2. Belton K.J., Lewis S.C., Payne S. et al.: Attitudinal survey of adverse drug reaction reporting by medical practitioners in the United Kingdom. Br J Clin Pharmacol. 39: 223–6, 1995. 3. Dunn N., Mann R.D..: Prescription-event and other forms of epidemiological monitoring of side-effects in the UK. Clin Exp Allergy. 29(Suppl 3): 217–39, 1999. 4. Edwards I.R.: Spontaneous reporting - of what? Clinical concerns about drugs. Br J Clin Pharmacol. 48(2): 128–34, 1999. 5. Edwards I.R., Aronson J.K.: Adverse drug reactions: definitions, diagnosis, and management. Lancet. 356(9237): 1255–9, 2000. 6. Pirmohamed M., Breckenridge A.M., Kitteringham N.R. et al.: Adverse drug reactions. Br Med J. 316: 1295– 8, 1998. 7. Polimeni G., Salvo F., Cutronea P. et al.: Adverse reactions induced by NSAIDs and antibacterials. Drug Saf. 29(5): 449–59, 2006. 8. Van Grootheest K., van Puijenbroek E.P., de Jong-van den Berg L.T.: Do pharmacists' reports of adverse drug reactions reflect patients' concerns ? Pharm World Sci. 26(3): 155–9, 2004. 9. Waller P.C., Wood S.M., Langman M.J.S. et al.: Review of company postmarketing surveillance studies. Br Med J. 304: 1470–2, 1992. 10. Wood, A.J.J., Stein, C.M., Woosley, R.: Making Medicines Safer - The Need for an Independent Drug Safety Board. N Engl J Med. 339: 1851–4, 1998. 41 Enzymatic degradation of chitosan-based microspheres Lucia Kalinovská, Silvia Bubeníková, Dušan Bakoš Institute of Polymer Materials, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology, Bratislava, Slovak Republic, [email protected] Abstract Biodegradable polymers for localized delivery of antibiotics have emerged as an important approach to treating wound infections. This paper describes the formulation and in vitro evaluation of biodegradable ofloxacin loaded chitosan-tripolyphosphate and chitosan tripolyphosphate - chondroitin sulphate core-shell type microspheres formulated by ionotropic gelation and polyelectrolyte complexation. The study was focused on the mutual relation between the release of ofloxacin from the microspheres and their composition. The amount of released ofloxacin was determined using UV/VIS spectrophotometric measurements. Ofloxacin release from the microspheres was biphasic with an initial burst release followed by a slow release phase. The results obtained showed that the drug release could be controlled by the manipulating the preparation conditions. This should provide a means for formulating sustained release of antibiotics from microspheres for the treatment of infections associated with the wound. Introduction Chitosan is a biocompatible, biodegradable biopolymer with unique cationic character and gel forming properties. Due to these characteristics chitosan has been extensively used in medical and pharmaceutical areas, especially in drug delivery, wound dressing and as an antimicrobial agent (Muzzarelli, 2004; Liu, 2004). Polyelectrolyte complex based on chitosan and tripolyphosphate can be used for the preparation of chitosan beads and microspheres because of its quick gelling ability (Aral, 1998). This binary system exhibits, however, poor mechanical strength, which can be a limiting factor for intended applications (Shu, 2004). To eliminate this drawback high molecular weight polyanion chondroitin sulphate is being used to improve mechanical properties and tailoring permeability, chemical stability and controlled release properties of chitosan-based microspheres. Microspheres with well-known characteristics and good mechanical properties can act as a donor of various active substances. In our study we have chosen ofloxacin, the fluoroquinolone antibiotic with a high activity against a wide range of gram-positive and gram-negative bacteria (Fresta, 2002; Christian, 1996) as a model drug in the in vitro experiments. The goal of this study was to investigate the effects of the preparation conditions on the kinetics of ofloxacin release from three different kinds of microspheres, especially chitosan/tripolyphosphate, chitosan/tripolyphosphate microspheres coated by chondroitin sulphate as well as chitosan/tripolyphosphate/chondroitin sulphate hydrogel microspheres using specific enzymes. Materials and methods High-viscosity chitosan (CHIT) was obtained from Fluka (Germay). Tripolyphosphate (TPP) was purchased by Acros Organics (Belgium). Chondroitin-4-sulphate (CHS) with was obtained from EMD Biosciences, (USA). Lysozyme (LYS) was purchased from Fluka (Germany). Ofloxacin (OF) and Chondroitinase ABC (CHSABC) were obtained from Sigma (USA). All other chemicals were of analytical grade. 1 wt.% of CHIT solution was used for preparation of microspheres. The solution was prepared by dissolving 1 g of CHIT and 0.9 g of NaCl in 60 mL of 0.5 % acetic acid aqueous solution (pH 2.2) under stirring at 40°C for about 4 hours until complete dissolution of CHIT. pH of solution was increased to 5.0 with 1 wt.% NaOH aqueous solution and distilled water was added to have the final mass of solution 100 g. The OF concentration of 2 wt.% in CHIT solution (CHIT/OF) was used in the OF encapsulation and release studies. Solution was centrifuged at 4000 rpm for 1.5 hour before use. Three types of anionic solutions (PA) containing oligoanion TPP and polyanion CHS were prepared: a) 0.5 wt.% TPP dissolved in 0.9 wt.% NaCl, b) mixed TPP and CHS (TPP+CHS) solution 42 containing 0.14 wt.% TPP and 0.06 wt.% CHS, and c) 0.5 wt.% CHS solution in 0.9 wt.% NaCl. The pH of the TPP and (TPP+CHS) solutions were modified with concentrated acetic acid 7.0. The pH of CHS coating solution was 7.0. Three different types of ofloxacin loaded microspheres were prepared depicted in Figure 1. The first type CHIT/TPP microspheres were prepared by dropping CHIT/OF solution to the TPP solution. The second type CHIT/TPP/CHS microspheres were prepared by coating CHIT/TPP microspheres with CHS. The third type CHIT/(TPP+CHS) microspehres was made by dropping CHIT/OF solution to the (TPP+CHS) solution. All types of microspheres were prepared using multi-loop reactor (Anilkumar, 2001). CHIT/OF CHIT/OF TPP CHIT/OF TPP+CHS TPP CHS CHIT/TPP CHIT/TPP/CHS CHIT/(TPP+CHS) Fig. 1. Different types of prepared microspheres. Diameter and membrane thickness were measured by optical microscopy using Kapa 2000 microscope (Kvant, s.r.o. Bratislava, Slovak Republic) equipped with a CCD camera CC63KW1P (Mintron, Malaysia) and capsule imaging software Prover Image Forge 1.1. Texture Analyser TA-2xi (Stable micro systems, Goldaming, United Kingdom) was used to determine the mechanical resistance of microspheres. Mechanical resistance was measured as the force (in grams) necessary to break one microsphere. Applied compression speed was 0.5 mm/s. The force needed for 90 % compression was taken as the characteristics of mechanical resistance of microspheres. The reported force values represent the mean of at least 25 measurements. Determination of release of OF from microspheres was provided using UV/VIS spectrophotometer Cecil CE 7250 (Cecil Instruments Ltd., United Kingdom). All measurements were provided at 25 °C at 293 nm. Results The process of CHIT microspheres formation is driven by the electrostatic interactions. It combines the ionotropic gelling, by interactions between cationic amine groups of CHIT and anionic phosphate groups of TPP, with the polyelectrolyte complexation between cationic amine groups of CHIT and anionic sulfate groups of CHS. Microspheres prepared in this work were formed under different experimental conditions with respect to the process of preparation. Microspheres produced had spherical shape and core-shell structure (Table 1). All microspheres had transparent or semi-transparent membranes. Therefore, the membrane thickness was determined with a relative high precision (± 5 %). The mechanical resistance of microspheres was determined in the 90 % distance and was given in grams per microsphere, which allowed the comparison between different types of experiments (Malgorzata, 2004). Tab. 1. Preparation and storing conditions of CHIT microspheres and their optical and mechanical properties. 43 Microsphere type No. CHIT/TPP CHIT/TPP/CHS CHIT/(TPP+CHS) 1 2 3 Reaction time in PA solution (s) TPP CHS coat TPP+CHS 40 40 - − 300 − − − 40 Diameter (µm)a) Thickness (µm)b) 620 630 920 150 160 140 Force at 90 % deformation (g)c) 2.80±1.70 4.80±1.70 3.98±3.16 a Standard deviation < 10%. Standard deviation < 5%. c The values are the mean±s.d. of 25 experiments. b In vivo application of microspheres can affect release of the active substance as well as their behavior. In organism we find several agents that can lead to faster or slower release of an active substance, one of main enzymes could be considered. Lysozyme is specific enzyme degrading CHIT. Figure 2 shows the affect of lyzosyme to microspheres. The amount of lysozyme used corresponds the amount of enzyme on the surface of the organism. In all cases specific curve for degradation by lysozyme is being observed. Ofloxacin released (% ) 120 100 80 60 1 2 3 40 20 0 0 1 2 3 4 5 140 160 180 Time (hour) Fig. 2. Enzymatic degradation of microspheres using lysozyme. The release of OF using chondroitinase ABC was reached only in microspheres containing CHS. Figure 3 shows the amount of released OF using CHSABC. 44 Ofloxacin released (% ) 120 100 80 60 1 2 3 40 20 0 0 1 2 3 4 5 140 160 180 Time (hours) Fig. 3. Enzymatic degradation of microspheres using chondroitinase ABC. Conclusions The results presented in the paper confirm that a very sensitive formation of the microspheres based on chitosan can be successfully solved using the continual process in the multi-loop reactor, which is connected with adjusting the size, shape and topology of the microspheres. The modification CHI/TPP and CHIT/TPP/CHS microspheres with ofloxacin and comparing these systems showed the difference of OFL release using enzymatic degradation. This drug release application implies a potentiality for controlling this process. Acknowledgement This work was supported by Science and Technology Assistance Agency under the No. APVT-20-015904 and APVV-51-033205. Literature 1. Anilkumar, V., Lacík, I., Wang, T.G.: A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75: 581–9, 2001. 2. Aral, C., Akbuga, J.: Alternative approach to the preparation of chitosan beads. Int J Pharm. 168: 9–15, 1998. 3. Fresta, M., Guccione, S., Beccari, A.R., Furneri, P.M., Puglisi, G.: Combining molecular modeling with experimental methodologies: mechanism of membrane permeation and accumulation of ofloxacin. Bioorg Med Chem. 10: 3871–89, 2002. 4. Christian, J.S.: The quinolone antibiotics. Primary Care Update for OB/GYNS. 3: 87–92, 1996. 5. Liu, H., Du, Y., Wang, X., Hu, Y, Kennedy, J.F.: Interaction between chitosan and alkyl β- -glucopyranoside and its effect on their antimicrobial aktivity. Carbohydr Polym. 56: 243–50, 2004. 6. Lekka, M., Sainz-Serp, D., Kulik, A.J., Wandrey, Ch.: Hydrogel Microspheres: Influence of Chemical Composition on Surface Morphology, Local Elastic Properties, and Bulk Mechanical Characteristics. Langmuir. 20: 9968–77, 2004. 7. Muzzarelli, C., Stanic, V., Gobbi, L., Tosi, G., Muzzarelli, R.: Spray-drying of solutions containing chitosan together with polyuronans and characterisation of the microspheres. Carbohydr Polym. 57: 73–82, 2004. 45 Biochemická a molekulárno–genetická diagnostika Smith–Lemli–Opitzovho syndrómu Katarína Kolejáková, Robert Petrovič, Mária Fischerová, Danka Maceková, Jozef Adámať, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Darina Ďurovčíková, Ján Chandoga Centrum lekárskej genetiky FNsP Bratislava, Slovenska Republika, [email protected] Abstrakt Smith-Lemli-Opitzov syndróm (SLOS) je autozómovo recesívne ochorenie, charakteristické širokým spektrom vrodených anomálií. Celosvetová incidencia SLOS sa odhaduje v intervale 1:10 000 – 1: 60 000. Biochemickou príčinou SLOS je deficitná aktivita enzýmu 7- dehydrocholesterol reduktázy. Genetická porucha je spôsobená širokým spektrom mutácií v DHCR7 géne, ktorý je lokalizovaný na chromozóme 11q12-13. Pre diagnostiku SLOS sme využili biochemické a molekulárno-genetické metódy. GC/MS analýza sterolov séra sa preukázala ako vhodná metóda na biochemickú diagnostiku SLOS. Pri pozitívnom biochemickom náleze sa indikovala sekvenčná analýza génu. U pacientov s biochemicky diagnostikovaným SLOS sme sekvenčnou analýzou identifikovali mutácie: L109P, W151X, V326L, R352Q, G410S. Následne sme pre rýchlu detekciu frekventovaných mutácií zaviedli restrikčnú analýzu a alelovo – špecifickú PCR. Zavedením biochemickej diagnostiky a molekulárno-genetických metód na detekciu mutácií v DHCR7 géne do bežnej klinickej praxe sa zabezpečila komplexná diagnostika SLOS na Slovensku. Úvod Dlhé obdobie bol cholesterol považovaný hlavne za štruktúrny komponent biomembrán, dôležitú zložku myelínu, prekurzor pre biologicky aktívne látky - steroidné hormóny a žlčové kyseliny a významný rizikový faktor srdcovo-cievnych ochorení. Pohľad na význam a úlohu cholesterolu sa rozšíril, keď bol v roku 1993 popísaný Smith-Lemli-Opitzov syndróm (SLOS). Smith-Lemli-Opitzov syndróm je autozómovo recesívne, dedičné metabolické ochorenie. Je charakteristické širokým spektrom vrodených anomálií, z ktorých najčastejšie sú kraniofaciálne anomálie (mikrocefália, mikrognátia, rázštep podnebia), malformácie končatín (polydaktýlia, syndaktýlia druhého a tretieho prstu na nohe), anomálie genitálií, vnútorných orgánov, poruchy CNS, rastová a mentálna retardácia. Pred objasnením biochemickej príčiny SLOS, väčšina autorov rozdeľovala SLOS do dvoch kategórií, na základe závažnosti a početnosti anomálií: SLOS typu I, ktorý bol charakteristický miernejším fenotypom a SLOS typu II, ktorý bol charakteristický závažnejším fenotypom. Keďže medzi SLOS typu I a II je veľa medzistupňov, na hodnotenie fenotypu sa používa aj skóre klinickej závažnosti (Bialer a kol., 1987; Cunniff a kol., 1997; Ryan a kol., 1998; Kelley a Hennekam, 2000). Na základe tohto skóre sa fenotyp SLOS pacientov delí do troch kategórií: mierny fenotyp (<20), klasický fenotyp (25-50), ťažký fenotyp (>50). Celosvetová incidencia SLOS sa odhaduje v intervale 1:10 000 – 1: 60 000 s frekvenciou heterozygotov 0,8 až 2%. Frekvencia SLOS v Európe sa odhaduje v intervale 1:15 000 – 1: 40 000. Incidencia v SR sa odhaduje na 1:15 000 – 1:20 000. Biochemickou príčinou SLOS je deficiencia 7-dehydrocholesterol reduktázy, ktorá katalyzuje NADPH-závislú redukciu C7-8 dvojitej väzby 7-dehydrocholesterolu za vzniku cholesterolu v poslednom kroku Kandutsch-Russell biosyntetickej dráhy cholesterolu. Výsledkom deficiencie 7DHCR aktivity sú abnormálne nízke hladiny cholesterolu v plazme a v tkanivách pacientov a na druhej strane vysoká koncentrácia cholesterolových prekurzorov 7-DHC a 8-DHC. Deficitná aktivita 7-DHCR je spôsobená mutáciami v DHCR7 géne, ktorý je lokalizovaný na chromozóme 11q12-13. Ľudský DHCR7 gén obsahuje 14 kbp genómovej DNA a je organizovaný do deviatich exónov a ôsmych intrónov avšak kódujúca oblasť génu zahŕňa exóny 3 až 9. DHCR7 gén kóduje proteín so 475 aminokyselinami. 7-DHCR je integrálny membránový proteín, lokalizovaný v membráne ER resp. mikrozómov. Do dnešnej doby je celkovo popísaných 121 rôznych mutácií v DHCR7 géne. Dominantné zastúpenie majú substitučné mutácie meniace zmysel genetickej informácie (missense), ktoré tvoria 87,6% z celkového počtu mutácií. Mnohopočetné vrodené anomálie charakteristické pre SLOS, boli objasnené, keď sa zistilo, že cholesterol hrá dôležitú úlohu v embryonálnom vývoji a morfogenéze stavovcov. Je zodpovedný za 46 správnu funkciu hedgehog signálnej dráhy, ktorá aktivuje promótory génov, potrebných pre diferenciáciu tkanív v embryonálnom vývoji. Materiál a metódy Hodnoty celkového cholesterolu a 7-dehydrocholesterolu v sére pacientov sme stanovili pomocou plynovej chromatografie spriahnutej s hmotovou spektrometriou. Hodnotu celkového cholesterolu v sére sme stanovili aj pomocou BIO-LACHEMA-TESTU. Stanovenie je založené na enzýmovom určení celkového cholesterolu. Izolácia DNA z leukocytov periférnej krvi pomocou QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). Na amplifikáciu siedmych exónov DHCR7 génu sme použili metódu PCR. Jednotlivé exóny sme amplifikovali za použitia primerov publikovaných v prácach Fitzky a kol. (1998) a Yu a kol. (2000). 50 µl reakčná zmes obsahovala PCR tlmivý roztok (FINNZYMES) a výsledné koncentrácie 200 µmol/l dNTPs a 0,3 µmol/l primerov. Zmes ďalej obsahovala 1 U DNA polymerázy DyNAzyme (FINNZYMES) a DNA približne v množstve 150 ng - 200 ng. Časovo-teplotný profil amplifikácie jednotlivých exónov DHCR7 génu metódou PCR: iniciálna denaturácia 95°C – 4 min., (denaturácia 95°C – 30 s, hybridizácia primerov 65°C – 30 s, syntéza DNA 72°C - 30s) 30 cyklov, dosyntetizovanie PCR produktov 72°C – 10 min. PCR produkty sme prečistili purifikáciou etanolom, kvantifikovali pomocou Mass Ruller (FERMENTAS) a uskutočnili sekvenačnú reakciu pomocou ABI PRISM Big Dye Terminator v3,0 sequencing Ready Reaction Kit. Automatické sekvenovanie prebehlo na ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Reakčná zmes, v ktorej prebehlo štiepenie obsahovala 22 µl PCR produktu, 5 jednotiek AluI restrikčnej endonukleázy a tlmivý roztok pre AluI restriktázu. Štiepenie sa dosiahlo inkubáciou vzorky v termostate pri 37°C po dobu 16 hodín. Restrikčné fragmenty sme separovali v 2% agarózovom géli. Elektroforéza prebehla pri 100 V 40 minút. PCR prebieha za prítomnosti alelovo – špecifických primerov (Waye a kol., 2002) za podmienok: iniciálna denaturácia 95°C – 4 min., (denaturácia 95°C – 45 s, hybridizácia primerov 68°C – 45 s, syntéza DNA 72°C - 45s) 30 cyklov, dosyntetizovanie PCR produktov 72°C – 10 min. Výsledky a diskusia Analyzovaný súbor tvorilo 12 pacientov s biochemicky diagnostikovaným Smith-LemliOpitzovým syndrómom. V sére pacientov sa merala hladina celkového cholesterolu dvoma metódami – rutinnou enzýmovou metódou a GC/MS metódou a merala sa aj hladina 7 – DHC metódou GC/MS. U všetkých pacientov sa potvrdila zvýšená hladina 7-DHC, kým hladina cholesterolu bola znížená, ako je viditeľné z údajov v tabuľke 1. Hodnoty cholesterolu namerané enzýmovou metódou boli u jednotlivých pacientov výrazne vyššie v porovnaní s hodnotami cholesterolu, ktoré sme namerali pomocou GC/MS metódy. Hodnota cholesterolu meraná enzýmovou metódou je pravdepodobne zvýšená v dôsledku prítomných prekurzorov, ktoré s činidlami dávajú pozitívnu reakciu. Stanovenie cholesterolu enzýmovou metódou nie je teda vhodné, ak sú prítomné vo vysokých koncentráciách prekurzory cholesterolu a diagnóza SLOS by sa nemala opierať iba o tento údaj. Koncentrácia 7-DHC bola u zdravých jedincov v kontrolnom súbore na hranici detekovateľnosti, ale keďže je u pacientov výrazne zvýšená, je tento parameter spoľahlivým ukazovateľom daného ochorenia. Hodnoty cholesterolu v kontrolnom súbore (deti do dvoch rokov) sa pohybovali v rozmedzí 1,9 až 2,8 mmol/l merané obidvoma metódami. Tab. 1. Biochemické parametre SLOS pacientov. 47 U biochemicky potvrdených pacientov sme uskutočnili sekvenčnú analýzu siedmych exónov DHCR7 génu. V súbore pacientov sme identifikovali tri rôzne mutácie v DHCR7 géne: nonssense 2mutáciu W151X a missense mutácie L109P a V326L. U slovenských pacientov v laboratóriu v Brne identifikovali mutácie: R352Q, G410S. Z celkového počtu 32 mutantných aliel sme v súbore identifikovali 54% aliel s mutáciou W151X, 25% s mutáciou V326L, 9% s mutáciou L109P, 6% aliel s mutáciou G410S a 6% aliel s mutáciou R352Q. Genotypy pacientov sú uvedené v tabuľke 2. Tab. 2. Genotypy SLOS pacientov Na rýchlu detekciu najfrekventovanejších mutácií sme využili metódy PCR-RFLP a Alelovo – špecifickú PCR. 1 2 3 4 5 6 7 500 362 bp 282 bp 250 Obr. 1. Restrikčná analýza (AluI) mutácie W151X v exóne 6: Dráha 1, 2: homozygot pre divú alelu (neštiepený fragment, 362 bp), dráhy 3, 4 heterozygot pre mutáciu W151X (restrikčné fragmenty 362 bp + 282 bp), dráhy 5, 6: homozygot pre mutáciu W151X (restrikčný fragment 282 bp) . Dráha 7: marker molekulovej hmotnosti delený po 50 bp 4B 4A 3B 3A 2B 2A 250 bp 1 250 202 bp Obr. 2. Alelovo – špecifická PCR pre mutáciu L109P v exóne 5. Genotypizácia jedinca je založená na prítomnosti PCR produktu iba v jednej alebo v obidvoch reakciách. Pacient 2: homozygot pre štandardnú alelu má PCR produkt prítomný jedine v reakcii slúžiacej na amplifikáciu štandardnej alely génu (dráha 2A, PCR produkt o dĺžke 202 bp), Pacient 3: homozygot pre danú mutáciu má PCR 48 produkt v reakcii slúžiacej na amplifikáciu mutantnej alely (dráha 4B, PCR produkt o dĺžke 202 bp), Pacient 1: heterozygot pre danú mutáciu, má PCR produkt v obidvoch reakciách (dráha 3A a 3B). Kontrolný PCR produkt o dĺžke 250 bp je vo všetkých dráhach. 1: marker molekulovej hmotnosti. 1 2A 2B 3A 3B 241 bp 250 162 bp Obr. 3. Alelovo – špecifická PCR pre mutáciu V326L v exóne 9. Pacient 4: homozygot pre štandardnú alelu má PCR produkt prítomný jedine v reakcii slúžiacej na amplifikáciu štandardnej alely génu (dráha 2A, PCR produkt o dĺžke 162 bp), Pacient 2: heterozygot pre danú mutáciu, má PCR produkt v obidvoch reakciách (dráha 3A a 3B). Kontrolný PCR produkt o dĺžke 241 bp vo všetkých dráhach. 1: marker molekulovej hmotnosti. Závery GC/MS analýza sterolov sa preukázala ako vysoko špecifická a spoľahlivá metóda na biochemickú diagnostiku SLOS. Biochemická diagnostika je postavená na skutočnosti, že u zdravých jedincov sú hodnoty 7-DHC nedetekovateľné zatiaľ, čo u postihnutých je tento metabolit v sére vždy prítomný. Požadovaný cieľ, zaviesť vhodné molekulárno-genetické metódy na detekciu mutácií v DHCR7 géne do bežnej klinickej praxe, sa podarilo splniť, čím sa CLG FNsP stalo pracovisko s komplexnou diagnostikou SLOS v SR. Molekulárna analýza otvára možnosti diagnostiky SLOS pacientov s veľmi miernym fenotypom a hraničnými biochemickými hodnotami, vylúči iné ochorenia s podobným klinickým profilom ako SLOS a umožní reterospektívnu diagnostiku závažných perinatálnych letálnych prípadov, kde nie je k dispozícii materiál na biochemickú analýzu. V postihnutých rodinách môže byť užitočná pre genetické poradenstvo s možnosťou využitia pri prenatálnej diagnostike. Mutácie zistené u SLOS pacientov na Slovensku sú typické pre strednú Európu. Mutácia W151X je treťou a V326L piatou najfrekventovanejšou mutáciou z celého SLOS mutačného spektra. W151X je najfrekventovanejšia v Českej republike a v Poľsku. Zavedením restrikčnej analýzy a alelovo-špecifickej PCR najfrekventovanejších mutácií sme zjednodušili a zrýchlili molekulárno-genetické vyšetrenie a diagnostiku SLOS. Použitá literatúra 1. Bialer, M.G., Penchaszadeh, V.B., Kahn, E., et al.: Female external genitalia and mullerian duct derivates in a 46, XY infant with the Smith-Lemli-Opitz syndrome. Am J Med Genet. 28: 723–731, 1987. 2. Cuniff, C., Kratz, L.E., Moser, A., et al.: Clinical and biochemical spectrum of patients with RSH/SmithLemli-Opitz syndrome and abnormal cholesterol metabolism. Am J Med Genet. 68: 263–269, 1997. 3. Fitzky, B.U., Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., et al.: Mutations in the Delta7-reductase gene at 11q12-13 cause Smith-Lemli-Opitz syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 95: 8181–8186, 1998. 4. Kelley, R.I., Hennekam, R.C.M.: The Smith-Lemli-Opitz syndrome. J Med Genet. 37: 321–335, 2000. 5. Kelley, R.I., Herman, G.E.: Inborn errors of sterol biosynthesis. Rev Genomics Hum Genet. 2: 299–341, 2001. 6. Ryan, A.K., Barlett, K., Clayton, P., et al.: Smith-Lemli-Opitz syndrome: A variable clinical and biochemical phenotype. J Med Genet. 35: 558–565, 1998. 7. Wassif, C.A., Yu, J., Cui, J., et al.: 27-Hydroxylation of 7- and 8-dehydrocholesterol in Smith-Lemli-Opitz syndrome: a novel metabolic pathway. Steroids. 68: 497–502, 2003. 8. Waterham, H.R., Wanders, R.J.A.: Biochemical and genetic aspects of 7-dehydrocholesterol reductase and Smith-Lemli-Opitz syndrome. Biochim Biophys Acta. 1529: 340–356, 2000. 9. Waterham, H.R., Wijburg, F.A., Hennekam, R.C.M., et al.: Smith-Lemli-Opitz syndrome is caused by mutations in the 7-dehydrocholesterol reductase gene. Am J Hum Genet. 63: 329–338, 1998. 10. Waye, J.S., Nakamura, L.M., Eng, B., et al.: Smith-Lemli-Opitz syndrome: carrier frequency and spectrum of DHCR7 mutations in Canada. J Med Genet. 39: E31, 2002. 11. Yu, H., Lee, M. H., Starck, L., et al.: Spectrum of Delta(7)-dehydrocholesterol reductase mutations in patients with Smith-Lemli-Opitz syndrome. Hum Mol Genet. 9: 1385–1391, 2000. 49 Význam HPV v etiopatogenéze prekanceróz a karcinómu krčka maternice Georgína Kolníková1, Vanda Repiská2, Peter Kolník1, Ľudovít Danihel3 1 Cytomed s.r.o. - Cytologické a bioptické laboratórium, Bratislava; 1Ústav lekárskej biológie a genetiky LF UK, Bratislava; 2 Ústav patologickej anatómie LF UK a FN Sasinkova 4, 811 08 Bratislava Abstrakt Karcinóm krčka maternice je druhým najčastejším nádorom ženskej populácie. Postihuje predovšetkým mladé ženy v produktívnom veku. Je to tretia najčastejšia príčina úmrtia na nádorové ochorenie u žien. Celosvetovo je približne 471 000 nových prípadov a 270 000 úmrtí ročne. 80 % úmrtí je v rozvojových krajinách. Na Slovensku zomrie na toto ochorenie približne 500 žien za rok. Predpokladá sa, že vo svete, do roku 2020 bude diagnostikovaných každý rok viac ako 1 milión nových prípadov. Hlavným etiologickým faktorom vo vývoji nielen squamocelulárnych karcinómov, ale aj adenokarcinómov krčka maternice je perzistujúca infekcia s vysokorizikovým typom ľudského papilloma vírusu . Úvod Papilloma vírusy sú druhovo a tkanivovo špecifické. Bolo objavených viac než sto typov. Podľa onkogénneho potenciálu ich delíme na vysoko a nízko rizikové typy. Klinicky ich môžeme deliť na mukokutánne typy (môžu spôsobiť kožné bradavice, laryngeálne papilómy), tzv. epidermodysplasia verruciformis (prvý krát popísali onkogénny potenciál HPV vírusu, na podklade tohto ochorenia, môže vzniknúť squamocelulárny karcinóm) a 40 má anogenitálny biotropizmus. Tvoria samostatnú čeľaď Papillomaviridae. Patria medzi relatívne malé vírusy, kapsida s priemerom asi 55 nm je tvorená 72 penta- alebo hexavalentnými kapsomérami, ktoré sú formované v ikosahedrálnej kapside. Ich genóm tvorí 1 molekula cirkulárnej DNA, ktorá obsahuje gény pre včasné (early, E, Tab. 1) a neskoré (late, L) proteíny, ďalej tzv. nekódujúcu oblasť (LCR, URR) s regulačnými sekvenciami. Proteíny exprimované z včasných génov iniciujú začiatok replikácie vírového genómu v bunke (E1, E2) a môžu sa podieľať na malígnej transformácii buniek (E6, E7). Gény L1 a L2 kódujú majoritný a minoritný kapsidový proteín, majú schopnosť vytvoriť tzv. vírusu podobné čiastočky (virus like particles), ktoré neobsahujú genóm – sú teda neinfekčné. Táto skutočnosť zohrala veľkú úlohu vo výskume a vývoji vakcín. E1 – viaže sa na nekódujúcu regulačnú oblasť v protismere od promótora skorého génu E6/E7. Asociuje s histónom H1 a s cyklínom E. E2 – potláča expresiu génov E6/E7 pri produktívnej infekcii. Indukuje apoptózu. E3- funkcia neznáma. E4- napomáha uvoľňovaniu viriónov. E5- aktivuje bunkové faktory transkripcie. E6 (16-18 kDa)- viaže tumorsupresorový proteín p53 a urýchľuje jeho degradáciu ubiquitínom, najrýchlejšie HPV 16 a HPV 18.(Tieto typy sú zodpovedné za viac ako 70% karcinómov krčka maternice). Degraduje bunkové regulačné proteíny c-Myc, DLG a McM7. E7 (10-14 kDa) viaže proteín Rb a jemu príbuzné bunkové proteíny, ktoré inhibujú proliferáciu buniek. Viaže signálny proteín c-Jun a inhibuje expresiu inhibítorov cyklín dependentných kináz, čím stupňuje pravdepodobnosť proliferácie hostiteľskej bunky. Tab. 1. Skoré štruktúrne proteíny kódované papilomavírusmi HPV infikuje len mitoticky aktívne bunky bazálneho epitelu. Najčastejším miestom infekcie je transformačná zóna krčka maternice (miesto prechodu jednovrstvového cylindrického epitelu na viacvrstvový nerohovatejúci dlaždicovitý epitel). Vstup do bunky sa uskutoční väzbou na špecifický glykoproteínový receptor 64 integrín exprimovaný na povrchu buniek bazálnej epiteliálnej vrstvy. Ďalší vývoj infekcie je možný dvoma smermi: - produktívny – dôjde k syntéze zrelých infekčných čiastočiek, s charakteristickým cytopatickým znakom (koilocyty), morfológia LG-SIL, genetická stabilita, E6/E7 expresia v zrelých bunkách. - neproduktívny – genetická instabilita, aneuploidia, proliferácia hostiteľských buniek, E6/E7 expresia v nezrelých bunkách a morfológia HG-SIL. Väčšina infekcií má tranzientný charakter. Malígna transformácia nastáva pri perzistujúcej infekcii, ak sa vírusový genóm integruje do genómu hostiteľskej bunky do náhodného 50 (nehomologického, sekvenčne špecifického) miesta a pri expresii onkoproteínov E6 a E7. Onkogénna transformácia sa deje interakciou E6 a E7 onkogénnych proteínov vírusu HPV s regulačnými proteínmi epitelových buniek. Onkoproteín pE6 viaže tumorsupresorový proteín p53, čo vedie k jeho ubiquitínom sprostredkovanej degradácii. Onkoproteín E7 viaže nefosforylovanú formu tumorsupresorového proteínu pRb a spôsobuje jeho hyperfosforyláciu a následnú aktiváciu N-myc a c-myc onkogénov. Následkom toho dôjde k nekontrolovanej proliferácii bunky, genómovej instabilite a k nahromadeniu onkogénnych mutácií (napr. delécia 3p, strata heterozygozity 6q, 10 p atď). Vznik neoplastického procesu môže trvať 10 až 12 rokov. Ak onkosupresorové gény sú a priori poškodené (napr. Li-Fraumeni syndróm – zdedená mutácia génu p 53) výskyt karcinómu je 25 x krát vyšší do 50 roku veku ako u bežnej populácii. Dysplastické zmeny (prednádorové stavy) krčka maternice sa týkajú takmer výhradne metaplastického epitelu transformačnej zóny. Sú charakterizované jednak cytomorfologickými zmenami (anizokaryóza, atypické mitózy, zvýšenie pomeru jadra k cytoplazme atď), jednak zmenami architektoniky (porucha stratifikácie, ktorá pripomína rozšírenie bazálnej vrstvy). Dysplázie môžeme deliť na ľahké (syn. CIN I, LG-SIL), stredné (syn. CIN II, HG- SIL), ťažké a carcinoma in situ (syn. CIN III, HG-SIL ). Dysplastické zmeny vďaka imunitnému systému môžu regredovať. Ak imunitný systém je z nejakého dôvodu oslabený ( napr. posttransplantačné stavy, infekcia HIV, imunosupresia z akéhokoľvek dôvodu ) výskyt karcinómu je oveľa pravdepodobnejší. Detekcia HPV DNA V rutinnej praxi sa používajú dve základné metódy detekcie HPV. Metóda založená na priamej hybridizácii HPV – v tomto mikrodoštičkovom teste sa denaturuje HPV DNA pacientky. Pridá sa k zmesi jednovláknových špecifických HPV RNA sond. V miestach, ktoré sú komplementárne vznikajú hybridné DNA/RNA molekuly, tie sa napoja na špecifické anti DNA/RNA protilátky zakotvené na pevnej fáze (povrch jamky mikrotitračnej doštičky). Detekcia sa robí chemoluminiscenčne, značené monoklonálne protilátky sa viažu na viacerých miestach hybridnej molekuly, čím sa signál zosilní. V sete sa nachádza zmes sond pre 5 typov LR HPV (6, 11, 42, 43 a 44) a 13 typov HR HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68), pričom niektoré typy HPV sa v sete nenachádzajú, čo môže vytvoriť skríženú reaktivitu, čo je nevýhodou tejto metódy. Táto metóda umožňuje veľmi rýchlo zistiť prítomnosť alebo neprítomnosť HPV v analyzovanej vzorke, nie typ HPV. Metóda založená na amplifikácii signálu HPV, pri ktorej je úsek HPV DNA je namnožený polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). V ďalšom kroku je na zvýšenie špecifity a na určenie typu HPV použitá hybridizácia. K imobilizovaným typovo špecifickým sondám sa pridáva značený PCR produkt, ktorý je následne detekovaný reakciou s farebným substrátom. PCR diagnostika umožňuje rýchlo a veľmi spoľahlivo zistiť prítomnosť konkrétneho typu infekčného agens. Výhodou je, že sú dostupné kompletné amplifikačné súpravy pre PCR, ktoré obsahujú pozitívnu a negatívnu kontrolu, čím sa zároveň zabezpečí kontrola priebehu samotnej PCR reakcie (268 bp dlhý fragment génu pre ßglobín). Súprava AMPLICOR HPV je určená na genotypizáciu. Detekuje 13 vysoko-rizikových typov ľudských papillomavírusov 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68. Postup je nasledovný: izolácia DNA pomocou kitu Qiagen, množenie DNA metódou PCR (fragment z vysoko konzervovanej oblasti génu L1 HPV s veľkosťou 165 bp, pričom primery sú značené biotínom), hybridizácia PCR produktov s oligonukleotidovými sondami a kolorimetrické stanovenie produktov. Výhodou metód molekulárnej biológie je vysoká senzitivita – umožňuje zistiť aj latentnú infekciu a tým aj pravdepodobnosť vzniku karcinómu. Použitá literatúra 1. Baseman, J., Koutsky, L.: The epidemiology of human papillomavitrus infections. J Clin Virol. 32: S16–S24, 2005. 2. Boyle, P., Ferlay, J.: Cancer incidence and mortality in Europe. Ann Oncol. 16: 481–488, 2005. 3. Bosch, F.X., Lorincz, A., Munoz, N., et al.: .The causal relation between humanpapillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol. 55: 244–265, 2002. 4. Franco, E.L., Franco, E.D., Ferenczy A.: Cervical cancer: epidemiology, prevention and the role of human papillomavirus infection. Can Med Assoc J. 164(7): 1017–25, 2001. 5. Rajčáni, J., Čiampor, F. : Čelaď Papillomaviridae. In: Lekárska virológia, VEDA, Bratislava. 324–335, 2006. 6. Snijders, P., Steenbergen, R., Heideman, D., Meijer, C.J.: HPV-mediated cervical carcinogenesis: concepts and clinical implications. J Pathol. 208: 152–164, 2006. 51 Ultraštruktúrne zmeny indukované alkoholom v mozočku potkana po génovej terapii Martin Kopáni1, Michal Behuliak2, Peter Celec2, Ivan Varga3, Miriam Petrová4, Štefan Polák3 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, 1Ústav patologickej anatómie; 2Ústav patologickej fyziologie; 3Ústav histológie a embryológie; 4Farmakologický ústav, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Centrálny nervový systém je obzvlášť citlivý na toxický účinok alkoholu. Cieľom práce je vyšetrovanie vplyvu dlhodobého podávania alkoholu na ultraštruktúru mozočka potkana po podaní génovej terapie. Nami pripravená a aplikovaná antioxidačná terapia nemala protektívne účinky na alkoholom indukované poškodenie mozočka. Podávanie SOD vo forme plazmidovej DNA spôsobilo patologické zmeny v ultraštruktúre mitochondrií a myelínových pošiev nervových vlákien. Predpokladáme, že nastáva buď izolované zvýšenie aktivity SOD bez adekvátneho zvýšenia aktivity katalázy prípadne glutatión peroxidázy alebo zmena koncentrácie minerálnych látok v stratum granulosum mozočka potkana s následnou peroxidáciou lipidov. Ďalšie plánované experimenty budú zamerané na využitie kombinovaného prístupu antioxidačnej génovej terapie s využitím superoxid dismutázy a katalázy. Úvod Dlhodobé užívanie alkoholu má nepriaznivý účinok na štruktúrne, chemické a fyzikálne vlastnosti buniek (Clarren et al., 1978). Centrálny nervový systém je obzvlášť citlivý na toxický účinok alkoholu. Alkoholom indukované zmeny morfológie dendritov u potkanov študovali v rannom období vývoja (Tavares et al. 1983), v neskoršom období vývoja (Abel et al. 1983) a vo vyššom veku (Pentney, 1982). Štruktúra a tvar mitochondrií sa prispôsobujú vonkajším podmienkam. Mitochondrie pri intoxikácii etanolom sa u potkanov menia aj morfologicky (Porta et al. 1965) aj funkčne (Cederbaum et Rubin, 1975). Zmeny v štruktúre mitochondrií sa prejavujú zmenou ich funkcie (Wakabayashi, 1999, Wakabayashi et Karbowski, 2001). Cieľom práce je vyšetrovanie vplyvu dlhodobého podávania alkoholu na ultraštruktúru mozočka potkana po podaní génovej terapie. Materiál a metódy Potkany kmeňa Wistar (n=27) boli náhodne rozdelené do 4 skupín: 1. kontrolná skupina (CTRL), 2. skupina alkohol (ALC), 3. skupina dismutáza superoxidu (SOD), 4. skupina alkohol + SOD (ALC + SOD). Potkany boli kŕmené ad libitum štandardnou stravou a dostávali buď destilovanú vodu (CTRL, SOD) alebo roztok alkoholu (ALC, ALC + SOD) namiesto pitnej vody počas doby 28 dní. Koncentrácia etanolu postupne každý týždeň stúpala (5, 10, 15, 20%). Konzumácia alkoholu bola denne sledovaná počas celej doby štúdie. Plazmid pcDNA3 kódujúci gén pre mitochodriálnu superoxid dismutázu Mn-SOD (300µg v 100µl fyziologického roztoku; skupiny SOD, ALC + SOD) alebo rovnaký objem fyziologického roztoku (skupiny CTRL, ALC) bol aplikovaný intramuskulárne do musculus biceps femoris ľavej zadnej končatiny jeden krát týždenne. Na konci štúdie boli potkany usmrtené dekapitáciou v celkovej anestéze. Vzorky stratum granulosum potkana sme pre transmisnú elektrónovú mikroskopiu (TEM) spracovali imerznou fixáciou 0.299 mol.l-1 roztokom glutaraldehydu (Serva) tlmeného fosfátmi, pH 7,2 – 7,4; 2 hodiny. Po prepláchnutí tlmivým roztokom nasledovala OsO4 postfixácia (0.0393 mol.l-1, tlmený fosfátmi, pH 7,2 – 7,4; 1 hodinu). Po odvodnení tkaniva v alkohole so stúpajúcou koncentráciou sme tkanivá zaliali do Durcupanu ACM (Fluka) spôsobom, ktorý odporúča výrobca. Ultratenké rezy boli zhotovené ultramikrotómom Om U 3 (Reichert). Rezy na podložných sieťkach bez podložných blán sme kontrastovali uranylacetátom a citrátom olova (Serva). Dokumentácia bola urobená transmisným elektrónovým mikroskopom CM 100 (Philips, Holansko) pri urýchľovacom napätí 40 kV. 52 Výsledky a diskusia V skupine ALC + SOD pozorujeme myelínové pošvy, ktoré sú ložiskovo rozvláknené, občas sa na obvode vlákna strácajú (obr. 1). Vo vláknach vidno profily malých guľatých mitochondrií, rôzne nepočetné vezikuly ohraničené jednoduchou hladkou membránou, ojedinelo stredne husté malé zrná. Niektoré mitochondrie sú značne napučané. Škvrnité prejasnenia v myelínových pošvách. Občas drobné vezikuly vo vrstve myelínových vlákien. Obr. 1. Potkan, mozoček, stratum granulosum. Myelínová pošva so štrbinovými prejasneniami ihlicového tvaru. Ojedinelé profily hladkého ER, zväčša kolabované. V okolitej cytoplazme sú veľké mitochondrie s rôzne veľkými hustými telieskami. V skupine ALC + voda vidíme myelínové pošvy občas rozvláknené s lokálnym prejasnením. Prejasnení je vidno oveľa menej ako v predchádzajúcej skupine. Jemne zrnitá cytoplazma obsahuje jednoduchou membránou ohraničenú vakuolu a denzné telieska. Časté napučané mitochondrie oválneho až tubulového tvaru zrnitej štruktúry. Nápadne jasný matrix mitochodrialis. Nápadné riedke kristy. Iné mitochondrie sú pretiahnutého tvaru, s hustým matrixom a hustejšími kristami. V skupine voda + SOD pozorujeme jadrá hladkého, občas málo zvlneného povrchu. Roztrúsený (dispergovaný) chromatín má prevahu nad kondenzovaným, zväčša nasadajúcim na jadrový obal (obr. 2). Miestami jadrové póry. Občas vidno jednoduché jadrové telieska. Obr. 2. Potkan, mozoček, stratum granulosum. Jadrá miestami s kondenzovaným chromatínom pri jadrovom obale. Roztrúsený (dispergovaný) chromatín má prevahu nad kondenzovaným, zväčša nasadajúcim na jadrový obal. Miestami jadrové póry. Občas vidno jednoduché jadrové telieska. 53 Voľné radikály vznikajúce metabolizmom alkoholu hrajú dôležitú úlohu pri vytváraní zväčšených a poškodených mitochondrií. Zväčšené, napučané mitochondrie sme pozorovali vo všetkých skupinách okrem kontrolnej skupiny. Mitochondrie sa zúčastňujú na znižovaní množstva intracelulárnych kyslíkových radikálov pri oxidačnom strese znížením spotreby kyslíka. Pritom dochádza k tvorbe zväčšených mitochondrií. V niektorých prípadoch môže dochádzať k tvorbe megamitochondrií (Karbowski et al, 1999, Wakabayashi, 2001). Okrem poškodených a zväčšených mitochondrií sme v tých istých skupinách zistili poškodenie myelínu nervových vlákien v stratum granulosum mozočka potkanov. Z pozorovaných výsledkov poškodenia mitochondrií a myelínových pošiev nervových vlákien v stratum granulosum mozočka potkana predpokladáme dve možnosti: a) aplikovaná antioxidačná terapia spôsobovala ultraštruktúrne zmeny v dôsledku izolovaného zvýšenie aktivity SOD bez adekvátneho zvýšenia aktivity katalázy alebo glutatión peroxidázy, enzýmov, ktoré detoxifikujú produkt dismutácie superoxidu – peroxid vodíka b) ultraštruktúrne zmeny boli spôsobené zmenou koncentrácie minerálnych látok v stratum granulosum mozočka potkana s následnou peroxidáciou lipidov. Do úvahy prichádza aj kombinácia týchto dvoch javov. Závery Nami pripravená a aplikovaná antioxidačná terapia nemala protektívne účinky na alkoholom indukované poškodenie mozočka. Naviac, aj samotné podávanie SOD vo forme plazmidovej DNA spôsobilo patologické zmeny v ultraštruktúre mitochondrií a myelínových pošiev nervových vlákien. Tento výsledok indikuje, že nastáva buď izolované zvýšenie aktivity SOD bez adekvátneho zvýšenia aktivity katalázy prípadne glutatión peroxidázy alebo zmena koncentrácie minerálnych látok v stratum granulosum mozočka potkana s následnou peroxidáciou lipidov. Ďalšie plánované experimenty budú zamerané na využitie kombinovaného prístupu antioxidačnej génovej terapie s využitím superoxid dismutázy a katalázy. Poďakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu vedy a vývoja APVT-20-003104. Použitá literatúra 1. Abel, E.L., Jacobson, S., Sherwin B.T.: In utero alcohol exposure: Functional and structural brain damage. Neurobehav Toxicol Teratom. 5(3): 363–366, 1983. 2. Cederbaum A.I., Rubin E.: Molecular injury to mitochondria produced by ethanol and acetaldehyde. Fed Proc. 34(11): 2045–2051, 1975. 3. Clarren, S.K., Alvord, A.C., Sumi, S.M., Streissguth, A.P., Smith, D.W.: Brain malformations related to prenatal exposure to ethanol, J Pediatr. 92(1): 64–67, 1978. 4. Karbowski M, Kurono C, Wozniak M, Ostrowski M, Teranishi M, Nishizawa Y, Usukura J, Soji T, Wakabayashi T.Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Radic Biol Med. 26(3– 4): 396–409, 1999. 5. Pentney, R.J.: Quantitative analysis of ethanol effects on the Purkinje cell dendritic tree. Brain Res. 249(2): 397–401, 1982. 6. Porta E.A., Hartroft W.S., De la Iglesia F.A.: Hepatic changes associated with chronic alcoholism in rats. Lab Invest. 14(8): 1437–1455, 1965. 7. Tavares, M.A., Paula-Barbosa, M.M., Gray, E.G.: A morphometric Golgi analysis of the Purkinje cell dendritic tree after long-term, alcohol consumption in the adult rat. J Neurocytol. 12(6): 939–948, 1983. 8. Wakabayashi T.: Structural changes of mitochondria related to apoptosis: swelling and megamitochondria formation. Acta Biochim Polon. 46(2): 223–237, 1999. 9. Wakabayashi T., Karbowski M. Structural changes of mitochondria related to apoptosis. Biol Signals Recept. 10(1–2): 26–56, 2001. 54 Identifikácia proteínu PCNA v karcinóme endometria Martin Kopáni1, Ľuboš Danišovič2, Dimitris Hatzibougias3, Martin Wawruch4, Dalibor Hojsík5, Michal Korman6, Bohuslav Uher7,8, Roman Moravčík9, Juraj Bugala9, Marek Bučko10, Lívia Hlavačková1, Alexandra Krištúfková1 1 Ústav patologickej anatómie; 2Ústav lekárskej biológie a genetiky; 4Farmakologický ústav; 5Ústav súdneho lekárstva; 6Ústav telesnej výchovy a športu, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; 3Department of Pathology, Medical School, Aristotle University, Thessaloniki, Greece; 7Katedra botaniky, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; 8Ústav botaniky a zoologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita v Brne, Česká republika; 9Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Slovenská republika; 10Oddelenie glykobiotechnológie, Chemický ústav, Centrum glykomiky, Slovenská akadémia vied, Bratislava, Slovenská republika, [email protected] Abstrakt Spolu 40 vo formalíne fixovaných a do parafínu zaliatych bioptických tkanivových vzoriek s endometrioidným G1 (ECG1, 10) a G3 (ECG3, 10), seróznym (SC, 10) a svetlobunkovým (SvC, 10) karcinómom endometria (CaE) sme vyšetrili imunohistochemicky na expresiu proteínu PCNA v jadrách epitelových buniek žliazok endometria. Expresia PCNA bola vysoká a zásadne sa v jednotlivých histologických podtypoch a stupňoch CaE nelíšila, pričom najvyššia expresia PCNA bola u agresívnych (SC, SvC a ECG3) typov CaE. Proteín PCNA nie je vhodným markerom na rozlišovanie jednotlivých histologických podtypov CaE. Úvod Výrazne stúpajúci výskyt zhubných nádorov tela maternice žien (American Cancer Society 2000, Jemal et al. 2005, Pleško et al. 1994, Pleško et al. 2003, Redecha et al. 2004) je predmetom záujmu odborníkov z rôznych vedných odborov. Sú to onkológovia, gynekológovia (Redecha et al. 1996, 2004, 2005, Šuška a Holomáň 1997, Šuška 2003), molekuloví biológovia a genetici (Weismanová et al. 2002, Repiská et al. 2003, Molnárová et al. 2006), patológovia (Deligdisch a Cohen 1985, Robboy et al. 1988, 2002, Danihel et al. 1995, 2002, 2003, 2005, Danihel a Breitenecker 1997, Silverberg et al. 2003, Šišovský et al. 2004, 2006a, 2006b, 2006c, 2006d, 2006e, 2007a, 2007b, 2007c, 2007d, Šišovský 2005, Gomolčák et al. 2005, Budaj a Bučeková 2007a,b). Karcinóm endometria (CaE) je najčastejšia invázna neoplázia ženského pohlavného traktu, 4. najčastejšie diagnostikovaný karcinóm v Spojených štátoch amerických a celosvetovo 5. najčastejší karcinóm u žien (American Cancer Society 2000, Ronnett et al. 2002, Jemal et al. 2005). Imnunohistochemická analýza je veľakrát jedným z rozhodujúcich faktorov stanovenia diagnózy a prognózy nádorovej choroby a výrazne ovplyvňuje jej liečbu (Danihel a Porubský 1991, Danihel et al. 1995, Azumi a Czernobilsky 2002). Antigén jadier proliferujúcich buniek (PCNA) je proteín spojený s proliferáciou buniek. Vzniká v neskorej G1 fáze, s vrcholom v S a zotrváva v G2 a M fáze bunkového cyklu (BC) (Kallakury et al. 1998). Je kofaktorom DNA polymerázy δ (Lee a Hurwitz 1990), kľúčový v syntéze DNA v S fáze BC, počas reparácie DNA (Shivji et al. 1992), v replikácii DNA a v regulovaní progresie BC (Rao et al. 1991). Identifikácia zmien expresie PCNA v epitelových bunkách žliazok imunohistochemicky (IHC) v korelácii s morfologickým nálezom pri CaE. Materiál a metódy Spolu 40 bioptických vzoriek endometria (z archívu Ústavu patologickej anatómie LF UK v Bratislave) z materníc po kyretáži alebo hysterektómii (pre krvácanie z maternice alebo nádor zistený sonografiou) boli zahrnuté v tejto štúdii. Vo formalíne fixované a do parafínu zaliate tkanivové vzorky s endometrioidným (EC) G1 (ECG1, 10x) a G3 (ECG3, 10x) (od žien vo veku 31-61 r.), seróznym (SC, 10x) (39-86 r.) a svetlobunkovým (SvC, 10x) (60-86 r.) CaE sme vyšetrili IHC na expresiu PCNA v jadrách epitelových buniek žliazok endometria. Komplex avidínu a biotínu s peroxidázou (ABC-Px) a s diaminobenzidínom (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) sme použili na vizualizovanie reakčného produktu. Nálezy sme hodnotili svetelným mikroskopom (Nikon Coolpix 990, Tokyo, Japonsko) semikvantitatívne ako: „-“ negatívne, „+/-“ nepravidelne slabo pozitívne (do 55 5% buniek), „+“ pravidelne slabo pozitívne (> 5% a < 25% buniek), „++“ pravidelne stredne silne pozitívne (25% až 50% buniek), „+++“ pravidelne silne pozitívne (> 50% buniek). Výsledky a diskusia Expresia PCNA bola vysoká a zásadne sa v jednotlivých histologických podtypoch a stupňoch CaE nelíšila (obr. 1, 2 a 3), pričom najvyššia miera expresie PCNA súvisela s agresívnym (SC, SvC a ECG3) (obr. 2 a 3) typom CaE (tab. 1). Stav endometria Reakci protilátky proti PCNA Endometrioidný karcinóm endometria, G1 ++ až +++ Endometrioidný karcinóm endometria, G3 +++ Serózny karcinóm endometria +++ Svetlobunkový karcinóm endometria, +++ Tab. 1. Prehľad reakcií protilátky proti PCNA s jadrami epitelových buniek žliazok karcinómu endometria ľudí. Reakcia: − negatívna, +/− nepravidelne slabo pozitívna, + pravidelne slabo pozitívna, ++ pravidelne stredne silne pozitívna, +++ pravidelne silne pozitívna. Obr. 1. Detekcia PCNA v ECG1. Komplex streptavidínu a biotínu s peroxidázou (ABC-Px), 200x. Obr. 2. Pravidelná silne pozitívna expresia PCNA v ECG3. ABC-Px, 200x. Obr. 3. Pravidelná silne pozitívna expresia PCNA v SC. ABC-Px, 100x. Naše výsledky ukazujú dobrú koreláciu expresie PCNA s histologickým podtypom a stupňom diferencovania CaE a sú v zhode s inými publikovanými prácami, ktoré hodnotili validitu PCNA. Elhafey et al. (2001) sledovali expresiu PCNA v EC, v SC a v SvC. Tvrdia, že v EC expresia PCNA koreluje s jeho stupňom histologickej diferenciácie a je nižšia než v agresívnych (SC a SvC) podtypoch CaE - so zlou prognózou. Chen et al. (2001) zistili, že CaE so zlou diferenciáciou alebo v pokročilom klinickom štádiu majú vyššiu expresiu PCNA a sú agresívneho fenotypu, a že expresia PCNA spojená s expresiou ESR/PGR má značnú hodnotu v ich prognóze. Tieto zistenia sú do určitej 56 miery podobné s našimi výsledkami, ktoré ukazujú mierne stúpanie expresie PCNA so stupňom histologickej diferenciácie EC a najvyššiu expresiu PCNA v ECG3, v SC a v SvC, pričom expresia PCNA bola v týchto troch stavoch silná a rovnaká. Expresiu ES1R a PGR sme nezisťovali. Naše zistenia podporujú výsledky Budaja a Bučekovej (2007a,b), ktorí hodnotili expresiu PCNA v CaE. Ich výsledky ukázali pravidelne silne pozitívnu expresiu PCNA v ECG3, SC a SvC. Tiež nezistili zásadnú odlišnosť v expresii PCNA medzi ECG1 a ECG3, kde expresia PCNA bola vysoká. Závery Proteín PCNA nie je vhodným rozlišovacím znakom jednotlivých histologických podtypov CaE. Poďakovanie Štúdia podporená GUK/36/2007. Autori ďakujú za podporu a pomoc pri hodnotení mikroskopických preparátov Prof. MUDr. Ľ Danihelovi, PhD. a MUDr. V. Šišovskému, PhD., a za technickú spoluprácu p. I. Uhnavej. Mikrofotografie pochádzajú z Ústavu patologickej anatómie LF UK v Bratislave. Použitá literatúra 1. American Cancer Society: 2000 cancer statistics. CA Cancer J Clin. 50: 1–64, 2000. 2. Azumi, N., Czernobilsky, B.: Immunohistochemistry. In: Kurman, R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. 5th Edn. Springer – Verlag, New York. 1251–1276, 2002. 3. Budaj, M., Bučeková, B., Šišovský, V., Danihel, Ľ.: Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria. 46. fakultná konferencia ŠVOČ. Zborník prác, LF UK a SAP, Bratislava. 22–25, 2007a. 4. Budaj, M., Bučeková, B., Šišovský, V., et al.: Identification of proliferation markers in correlation with p53 gene mutation in endometrial carcinoma. Vědecká konference studentů českých a slovenských lékařských fakult. Program a abstrakta prednášek, 3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze. 2007b. 5. Danihel, Ľ., Porubský, J.: Prínos monoklonálnych protilátok v bioptickej diagnostike nádorov. Bratisl lek Listy. 92: 460–466, 1991. 6. Danihel, Ľ., Breitenecker, G.: Histologická diagnostika nenádorových a nádorových zmien endometria v peria postmenopauze. In: Šuška, P., Holomáň, K. (Eds): Endometrium v peri- a postmenopauze. SAP, Bratislava. 14–41, 1997. 7. Danihel, Ľ., Babál, P., Porubský, J., et al.: Imunohistochemické markery v diagnostike nádorov maternice. Bratisl lek Listy. 96: 353–360, 1995. 8. Danihel, Ľ., Gomolčák, P., Korbeľ, M., et al.: Expression of proliferation and apoptotic markers in human placenta during pregnancy. Acta Histochem. 104: 335–338, 2002. 9. Danihel, Ľ., Horváth, R., Breitenecker, G., Hatzibugias, I.: Súčasná klasifikácia a charakteristika nádorov endometria. Slov gynek por. 10(Suppl): 14–17, 2003. 10. Danihel, Ľ., Šišovský, V., Palkovič, M., et al.: Karcinóm endometria – histopatologická klasifikácia a charakteristika. Gynekol prax. 3: 9–12, 2005. 11. Deligdisch, L., Cohen, C.J.: Histologic correlates and virulence implications of endometrial carcinoma associated with adenomatous hyperplasia. Cancer. 56: 1452–1455, 1985. 12. Elhafey, A.S., et al.: Computerized image analysis of p53 and proliferating cell nuclear antigen expression in benign, hyperplastic, and malignant endometrium. Arch Pathol Lab Med. 125: 872–879, 2001. 13. Gomolčák, P., Danihel, Ľ., Šišovský, V.: E-cadherin, a-inhibin a calponin – biologicky aktívne látky v štruktúrach trofoblastu. Lojdov histochemický deň. Slovenská histochemická spoločnosť, Ústav patologickej anatómie LF UK, Výskumný ústav srdca SAV. Abstrakty, Bratislava. 8, 2005. 14. Chen, Y.P., Shen, M., Chen, C.: Study on expression of PCNA and estrogen, progesterone receptors in endometrial carcinoma. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao. 26: 123–125, 2001. 15. Jemal, A., Murray, T., Ward, E., et al.: Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 55: 10–30, 2005. 16. Kallakury, B.V., Ambros, R.A., Hayner-Buchan, A.M.: Cell proliferation-associated proteins in endometrial carcinomas, including papillary serous and endometrioid subtypes. Int J Gynecol Pathol. 17: 320–326, 1998. 17. Lee, S.H., Hurwitz, J.: Mechanism of elongation of primed DNA by DNA polymerase delta, proliferating cell nuclear antigen, and activator 1. Proc Natl Acad Sci USA. 87: 5672–5676, 1990. 18. Molnárová, A., Kováčová, E., Majtán, J., et al.: Chlamydia and mycoplasma infections during pregnancy and their relationships to orofacial cleft. Biologia. 61: 719–723, 2006. 19. Pleško, I., et al: Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej republike v roku 1990. Aktual klin Onkol. 1994. 20. Pleško, I., et al: Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej republike 2000. Národný onkologický ústav, Ústav experimentálnej onkológie SAV, Národný onkologický register Slovenskej republiky, Bratislava. 207, 2003. 57 21. Rao, V.V., Schnittger, S., Hansmann, I.: Chromosomal localization of the human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene to or close to 20p12 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 56: 3–4, 169–170, 1991. 22. Redecha, M., Korbeľ, M., Sasko, A.: Histologické nálezy endometria pri krvácaní v klimaktériu a séniu. Prakt Gynek. 3: 61–64, 1996. 23. Redecha, M., Nižňanská, Z., Korbeľ, M.: Výskyt zhubných nádorov tela maternice na Slovensku v rokoch 1990-2000. Gynekol prax. 2: 194–199, 2004. 24. Redecha, M., Nižňanská, Z., Korbeľ, M.: Klinická charakteristika karcinómu endometria. Gynekol prax. 3: 13–16, 2005. 25. Repiská, V., Zummerová, A., Miklóši, M., et al.: Využitie metódy RT-PCR pri detekcii cirkulujúcich mikrometastáz. Rozhledy v chirurgii. 82: 95–102, 2003. 26. Robboy, S.J., Anderson, M.C., Russell, P.: Pathology of the Female reproductive tract. Churchill Livingstone, London, Edinburg, New York, Philadelphia. 929, 2002. 27. Robboy, S.J., Duggan, M.A., Kurman, R.J.: Gynecologic Pathology. In: Rubin, E., Farber, J.L. (Eds): Pathology. J. B. Lippincott Company, Philadelphia. 942–989, 1988. 28. Ronnett, B.M., Zaino, R.J., Ellenson, L.H., Kurman, R.J.: Endometrial Carcinoma. In: Kurman, R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. 5th Edn. Springer Verlag, New York. 501–559, 2002. 29. Shivji, K.K., Kenny, M.K., Wood, R.D.: Proliferating cell nuclear antigen is required for DNA excision repair. Cell. 69: 367–374, 1992. 30. Silverberg, S.G., Kurman, R.J., Nogales, F., et al.: Epithelial Tumors and Related Lesions. In: Tavassoli, F.A., Devilee, P. (Eds): WHO classification of Tumours, Pathology and Genetics, Tumours of the Breast and Female Genital Organs. Tumours of the Uterine Corpus. IARC Press, Lyon. 221–232, 2003. 31. Šišovský, V.: Imunohistochemická analýza endometria za fyziologických a patologických stavov. Dizertačná práca. Univerzita Komenského, Bratislava. 144, 2005. 32. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Expresia kyseliny sialovej v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006c. 33. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Imunohistochemická analýza expresie vybraných proteínov v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006b. 34. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Jakubovský, J., et al.: The identification of sialic acid in normal endometrium and in endometrial carcinoma (85). In: Tribulová, N., Okruhlicová, Ľ. (Eds) Potential therapeutic targets in cardiovascular and other diseases. VEDA, Bratislava. 88, 2006e. 35. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Štvrtina, S., et al.: Angiogenéza v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006a. 36. Šišovský, V., Palkovič, M., Babál, P., et al.: The expresion of the selected proteins in endometrial carcinoma (79-84). In: N. Tribulová, Ľ. Okruhlicová (Eds) Potential therapeutic targets in cardiovascular and other diseases. VEDA, Bratislava. 88, 2006d. 37. Šišovský, V., Palkovič, M., Zeljenková, D., et al.: Pôsobenie derivátov organofosfátov na reprodukčné orgány samíc potkanov Wistar. 12. kongres Slovenskej a Českej spoločnosti patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Bratislava. 48, 2004. 38. Šišovský, V., Palkovič, M., Janega, P., et al.: Expression of the estrogen alpha and progesterone receptor in I. and II. type of endometrial carcinoma. Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Abstracts, Bratislava. 94, 2007. 39. Šišovský, V., Palkovič, M., Janega, P., et al.: Correlation of the proliferation markers expression with the estrogen alpha receptor in endometrial carcinoma. Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Abstracts, Bratislava. 94, 2007. 40. Šišovský, V., Babál, P., Danihel, Ľ., et al.: Sialylated glycoconjugates as prognostic indicator in clear cell endometrial carcinoma? Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Astracts, Bratislava. 95, 2007. 41. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria. Prakt Gynek. 14: 112–120, 2007. 42. Šuška, P.: Nádory maternice. In: Šuška, P. (Ed): Vybrané kapitoly z gynekológie. Univerzita Komenského, Bratislava, 182–200, 2003. 43. Šuška, P., Holomáň, K.: Endometrium v peri- a postmenopauze. SAP, Bratislava. 186, 1997. 44. Weismanová, E., Weismann, P., Vizváryová, M., et al.: New approach to human high-risk papillomavirus (HR-HPV) genotyping. Neoplasma. 49: 217–224, 2002. 58 Biologicky aktívne látky prírodného charakteru s potenciálnym využitím pri prevencii a terapii nádorových ochorení Marcela Kopásková1, Eva Miadoková1, Slavomíra Naďová1, Viera Vlčková1, Viola Dúhová1, Peter Rauko2, Pavel Mučaji3, Daniel Grančai3 1 Katedra genetiky, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava; 2Ústav experimentálnej onkológie, Slovenská Akadémia Vied, Bratislava, 3Katedra farmakognózie a botaniky, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Študovaný extrakt bol získaný z čerstvých nerozvinutých púčikov trvácej bodliakovitej rastliny Cynara cardunculus L., z čeľade Asteracea, ktorá sa pestuje ako zelenina a má široké využitie v ľudovom liečiteľstve. Hlavným cieľom tejto práce bolo hodnotenie potenciálneho antigenotoxického a antioxidačného účinku extraktu Cynara cardunculus L. na rôznych modelových systémoch a rozličnými genetickými metódami. Úvod V súčasnosti sa venuje pozornosť výskumu látok prírodného charakteru. Význam zeleniny, ovocia a strukovín ako zložiek zdravej stravy je úplne zrejmý. Jedným z možných dôvodov ich priaznivých účinkov na zdravie je prítomnosť rôznych antioxidantov, medzi ktoré patria vitamíny C a E, karotenoidy, selén, foláty, fenolové zložky ako aj flavonoidy. Za posledných desať rokov sa výskum takmer vo všetkých vyspelých štátoch zameral na účinky flavonoidov a doterajšie štúdia poukazujú na ich antioxidačné, antikarcinogénne a antimutagénne účinky. Rovnako sa hľadajú také substancie, ktoré by mali význam pri liečbe a prevencií nádorových ochorení, ale i pri srdcovocievnych, respiračných ochoreniach, alergiách...a pod (Miadoková et al., 2002). Náš výskum sme zamerali na štúdium antigenotoxického účinku látok prírodného charakteru, konkrétne extraktu, ktorý bol získaný z rastliny artičoky Cynara cardunculus L.. Je to trváca bylina so vzpriamenou plstnatou stonkou a kožovitými plstnatými listami, zaraďovaná do čeľade Asteracea. Pestuje sa hlavne pre nedozreté úbory (Cynara scolomylus L.) a listy. Kvety Cynara cardunculus L. sa okrem toho v Portugalsku využívajú pri výrobe syrov (Mučaji et al., 1997). Okrem kuchynského využitia majú liečivé účinky. Už starovekí Egypťania a Gréci používali artičoku pri liečbe žalúdočných ťažkostí (Li et al., 2004). V súčasnosti bol popísaný hepatoprotektívny, hypocholesterolemický účinok. Z doterajších štúdií bol zistený obsah látok (napr. luteolín, apigenín, terpenoidy), ktoré sa vyznačujú antioxidačnými, antimutagénnymi, antikarcinogénnymi účinkami. Dnes sa pestujú a používajú predovšetkým pre svoje priaznivé účinky pri chorobách pečene a žlčníka, a pre znižujúci účinok cholesterolu v krvi (Grančai et al., 1992). Hypocholesterolemický účinok sa pripisuje hlavne cynarínu, kyseline kávovej a chlorogénovej, flavonoidom a seskviterpénom, ich synergickému pôsobeniu (Grančai et al., 1992; Schmidtová et al., 1998). Materiál a metódy Extrakt Cynara cardunculus (ECC) bol pripravený na Katedre farmakognózie a botaniky FAF UK, kde rastliny boli dopestované a na extrakt boli použité ich nerozvinuté púčiky. Tie boli následne macerované v 96% etanole, čím bol pripravený etanolový extrakt. Ten bol zahustený na vákuovej odparovačke do sirupovitej konzistencie a následne rozdelený na štyri podiely (chloroformový, etylacetátový, butanolový a vodný). Na izoláciu jednotlivých látok bola použitá chromatografia a IČspektrum. Extrakt, ktorý sme použili bol získaný z etylacetátoveho podielu a obsahoval látky: apigenín (4',5,7-trihydroxyflavón), luteolín (3',4',5,7-tetrahydroxyflavón) a ich glykozidy: apigenín-7-glukozid a luteolín-7-glukozid (cynarozid) (Grančai et al., 1992). Potenciálny genotoxický/antigenotoxický účinok sme stanovovali pomocou batérie genetických testov. Simultánny test fytotoxicity a klastogenity/antiklastogenity sme realizovali na rastlinných druhoch Vicia sativa L. a Vicia faba L. podľa protokolu, ktorý introdukoval v roku 1984 prof. Murín (Murín, 1984). Boli použité dva mutagény: N-metyl-N-nitrózomočovina (MNM) a ofloxacín (OFLX). 59 Mutagenitu/antimutagenitu ECC voči 4-nitrochinolín-N-oxid (4-NQO) a ofloxacínu OFLX sme sledovali na kvasinkovom kmeni Saccharomyces cerevisiae D7, ktorý nám umožňoval pozorovať tri genetické zmeny. Mitotický crossing-over v ade2 génovom lokuse, mitotickú génovú konverziu v trp5 génovom lokuse, reverznú mutáciu v ilv1 génovom lokuse (Zimmermann et al., 1984). Sledovali sme potenciálny mutagénny/antimutagénny účinok ECC Amesovým testom v prítomnosti metabolickej aktivácie S9 zmesi na bakteriálnych kmeňoch Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100, TA102 voči promutagénu 2-aminofluorénu. (Maron a Ames, 1983). Na myšacích leukemických bunkách línie L1210 sme realizovali revitalizačný test, kde sme hodnotili, či skúmaný ECC zvyšuje cytotoxický/cytostatický účinok komerčného chemoterapeutika cis-platiny podľa protokolu Rauko a kol. (Rauko et al., 2003). Stanovovali sme potenciálnu antioxidačnu činnosť ECC na základe vychytávania voľných 1,1difenyl-2-pikrylhydrazyl radikálov. Postup bol upravený a modifikovaný podľa Tagashira a kol. (Tagashira et al., 1998). Výsledky a diskusia Hodnotením potenciálneho antimutagénneho účinku ECC na dvoch rastlinných modelových objektoch z čeľade Fabaceae – Vicia sativa L. a Vicia faba L. pomocou „simultánneho testu fytotoxicity a mutagenity“, výsledky ukázali, že ECC nemal mutagénny účinok na vybrané modelové objekty. U V. sativa L. aj V. faba L. bolo pozorované štatisticky preukazné zníženie mutagénneho/klastogénneho účinku vplyvom ECC pri všetkých použitých koncentráciách MNM a OFLX. Bol tu teda potvrdený antimutagénny/ antiklastogénny účinok ECC. Podobne antimutagénny účinok ECC sa sledoval na modelovom organizme kvasinky S. cerevisiae kmeň D7. Ako pozitívna kontrola boli použité mutagény ofloxacín (OFLX) a 4nitrochinolín-N-oxid (4-NQO). Štatisticky preukazný antimutagénny účinok ECC sa prejavil pri spolupôsobení s 4-NQO. Pri spolupôsobení ECC s OFLX bol náznak antimutagénneho účinku extraktu ECC, ktorý však nebol štatisticky preukazný. Z Amesovho testu s metabolickou aktiváciou vyplýva, že ECC, nemal ani na jeden z kmeňov mutagénny účinok. Zo štatisticky významného zvýšenia počtu histidínových revertantov, ktoré pozorujeme v tomto variante Amesovho testu u kmeňov TA97 a TA98 pri všetkých použitých koncentráciách ECC a u kmeňa TA102 pri dvoch najvyšších koncentráciách vyplýva, že ECC mal komutagénny účinok. Na základe revitalizačného testu možno skonštatovať, že ECC po samotnej aplikácií na leukemické bunky L1210 nevykazoval žiadny toxický efekt v porovnaní s kontrolou ale po aplikácií na bunky poškodené po 24 hod. expozícií cisPt zvyšoval cytostatický/cytotoxický účinok cis-platiny a signifikantne redukoval viabilitu/revitalizáciu cisPt poškodených buniek. V metóde DPPH bola preukázaná silná antioxidačná aktivita ECC, ktorá bola zhodná s antioxidačnou aktivitou kyseliny askorbovej. Štatisticky významné antigenotoxické účinky ECC potvrdené v celom spektre genetických modelových organizmov in vitro sú teda v súlade s našimi poznatkami, že ECC má náležitý potenciál využiteľný pri prevencii a bioterapii nádorov. Flavonoidy ako nutričné faktory hrajú dôležitú úlohu v prevencii rakoviny (Weisburger, 1999). Napriek tomu, že sú už dnes mechanizmy účinkov niektorých flavonoidov pomerne dobre preštudované, ich význam ako súčasti chemopreventívnej výživy alebo výživových doplnkov je však ešte stále len „potenciálny“. Je to v dôsledku toho, že sa ešte presne nevie, či pri svojom pôsobení, a to hlavne u ľudí, zasahujú práve tie cielené miesta, o ktorých sa predpokladá, že sú konečným miestom účinkovania konkrétnych flavonoidov (Walle, 2004). Závery Na základe výsledkov si môžeme dovoliť tvrdiť, že hodnotený extrakt z Cynara cardunculus L. sa vyznačuje antimutagénnymi/antikarcinogénnymi, antiklastogénnymi, ako aj antioxidačnými, terapeuticko/cytotoxickými účinkami. Celkový účinok extraktu z Cynara cardunculus L. závisí od viacerých faktorov, medzi ktoré okrem iného môžeme zaradiť použitý testovací systém (to znamená modelový organizmus, typ použitého mutagénu), spôsob aplikácie a použité koncentrácie ECC a jednotlivých modelových mutagénov. 60 Poďakovanie Touto cestou si dovoľujem poďakovať Prof. RNDr. Eve Miadokovej, DrSc., ako aj všetkým spolupracovníkom a kolegom, ktorí prispeli k uskutočneniu experimentov. Táto práca bola realizovaná aj vďaka finančným prostriedkom APVT-20-002604, VEGA No 1/2337/05, 2/4143/04, 2/4056/24, 1/1311/04. Použitá literatúra 1. Grančai, D., Nagy, M., Ubik, K.: Obsahové látky Cynara carunculus L., I. Steroly a pentacyklické triterpény. Farmaceutický obzor. LXI: 577–580, 1992. 2. Li, H., Xia, N., Brausch, I., Yao, Y., Forstermann, U.: Flavonoids from artichoke (Cynara scolymus L.) upregulate endothelial-type nitric-oxide synthase gene expression in human endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 310(3): 926–32, 2004. 3. Maron, D., Ames, B.N.: Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res. 113: 173–215, 1983. 4. Miadoková, E., Mašterová, I., Vlčková, V., Dúhová, V., Totoh, J.: Antimutagenic potential of homoisoflavonoids from Muscari racemosum. J Ethnopharmacol. 81: 381–386, 2002. 5. Mučaji, P., Grančai, D., Nagy, M.: Kvantitatívne hodnotenie obsahových látok v nadzemnej a podzemnej časti Cynara cardunculus L. Farmaceutický obzor. LXVI: 6–7, 1997. 6. Murín, A.: Simultaneous test of phytotoxic and mutagenic effects of polluted waters and herbicidal chemicals. Biologia. 39, 15–24, 1984. 7. Rauko, P., Bauer, W., Horvath, Z., Hochtl, T., Saiko, P., Karl, D.: Combination effects of Ara-C and 5fluorodeoxyuridine against leukemia cells in vitro and in mice. Anticancer Res. 23(5A): 3841–3846, 2003. 8. Schmidtová, Ľ., Juranová, D., Hózová, R., Valachovič, P., Grančai, D.: Hypolipemický účinok taraxasterolu, β-sitosterolu a extraktu z artičoky u morčiat. Asteroskleróza. 2: 51–55, 1998. 9. Tagashira, M., Ohtake, Y.: A new antioxidative 1,3-benzodioxole from Melissa officinalis. Planta Med. 64: 555–558, 1998. 10. Walle, T.: Serial Review: Flavonoids and isoflavones (Phytoestrogens: absorption, metabolism, and bioactivity). Absorption and metabolism of flavonoids. Free Radic Biol Med. 36: 829–837, 2004. 11. Weisburger, J.H.: Antimutagens, anticarcinogens, and effective worldwide cancer prevention. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 18: 85–93, 1999. 12. Zimmermann, F.K, von Borstel, B.C., von Halle, E.S., Parry, J.M., Siebert, D., Zettenbergm G., Barale, R., Loprieno, N.: Testing of chemicals for genetic activity with Saccharomyces cerevisiae: a report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutat Res. 133: 199–244, 1984. 61 Perspektívy využitia kmeňových buniek z pupočníkovej krvi Miroslav Kubeš1, Zohdy Hamid1, Ján Vojtaššák2 1 Slovenský register placentárnych krvotvorných buniek, o.z., Bratislava; 2Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, Ústav lekárskej biológie a genetiky, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Pupočníková krv (PK) sa stala akceptovaným zdrojom príbuzenských, nepríbuzenských a autológnych kmeňových buniek na obnovu kostnej drene. Nové technológie expanzie a transplantácie 2 čiastočne HLA zhodných jednotiek PK odstraňujú bariéru nedostatku buniek, ktorá limitovala použitie PK u dospelých pacientov. Mezenchýmové kmeňové bunky (MKB), čo sú adherentné stromálne bunky nehematopoietického pôvodu boli nedávno získané aj z PK. Podobne ako MKB z kostnej drene, majú aj tieto schopnosť diferencovať sa do buniek rôznych tkanív ako sú kosť, šľacha, chrupavka, sval a tukové tkanivo a produkovať rastové faktory a cytokíny, ktoré podporujú expanziu a diferenciáciu hematopoietických buniek. Majú tiež antiproliferatívny, imunomodulačný a protizápalový účinok. V budúcnosti môžu mať MKB z PK na liečbu rejekcie alogénneho štepu, choroby štepu proti príjemcovi, ťažkých autoimunitných ochorení a iných porúch, pri ktorých je potrebná tkanivová reparácia. Najnovšie, v PK boli dokázané embryonálnym bunkám podobné kmeňové bunky, ktoré sú schopné diferenciácie do bunkových typov všetkých troch zárodočných listov (endo-, ekto- a mezoderm). Tieto predstavujú vývoja schopnú alternatívu k ľudským embryonálnym bunkám na výskumné účely bez znepokojujúcich etických otázok a majú potenciál posunúť vpred vývoj klinických aplikácií založených na bunkovej terapii. Úvod Kmeňové bunky pupočníkovej krvi (PK) sa stávajú v poslednej dobe čoraz viac stredobodom pozornosti odbornej aj laickej verejnosti z viacerých dôvodov. Prvým je ich jedinečnosť z hľadiska biologického. Majú charakter dospelých kmeňových buniek ale niektoré z nich sú podobné embryonálnym kmeňovým bunkám. Teda z hľadiska perspektív terapeutického využitia sa blížia embryonálnym bunkám, ale bez kontroverzií etickosti ich využitia na výskumné či liečebné účely. O ich pluripotentnom potenciáli a schopnosti diferencovať sa na špecializované typy buniek tkanív a orgánov svedčí stále viac odborných publikácií a objavujú sa aj prvé správy o ich úspešnom klinickom využití. Ďalším dôvodom je jednoduchá dostupnosť PK odberom pri pôrode a možnosťou dlhodobého uskladnenia v hlboko zamrazenom stave. Toto predurčuje kmeňové bunky PK byť výhodným zdrojom kmeňových buniek na prípadné autológne či alogénne využitie počas celého života jedinca a pre iných aj po jeho smrti. Navyše takto uskladnené kmeňové bunky si zachovávajú „novorodenecký“ proliferačný potenciál a sú chránené, na rozdiel od dospelých kmeňových buniek, ktoré si „nosíme“ celý život v kostnej dreni a tkanivách, pred infekciami, poškodením vedľajšími účinkami liečby, či prirodzeným starnutím. V neposlednom rade môžu slúžiť ako zdroj kmeňových buniek pre výskum v oblasti génovej terapie a v budúcnosti ako samotný nástroj génovej terapie závažných ochorení. Krvotvorné kmeňové bunky pupočníkovej krvi V PK sa nachádza niekoľko typov kmeňových buniek, ktoré boli postupne objavené vďaka svojim vlastnostiam a niektoré sú už desiatky rokov aj klinicky využívané. Sú to hlavne krvotvorné kmeňové bunky, ktorých krvotvorný potenciál bol prvýkrát úspešne dokázaný pri HLA identickej súrodeneckej transplantácii v roku 1988 pri liečbe dievčatka s Fanconiho anémiou (10). Ako alogénny zdroj krvotvorných kmeňových buniek sa odvtedy použil vo svete už vyše 8 000 krát a v súčasnosti prvenstvo v početnosti využívania PK pre účely transplantácií krvotvorby majú Japonci. Takmer na polovicu všetkých alogénnych transplantácií používajú v tejto krajine ako zdroj krvotvorných kmeňových buniek PK (33). V spojených štátoch amerických je to zhruba pri 20% transplantácií dospelých pacientov a 50% transplantácií detských pacientov. V každom prípade počet transplantácií s využitím PK vo svete ročne stúpa o 20% a čas plného využitia tohto zdroja krvotvorných kmeňových 62 buniek ešte len príde (33). Je to jednak z dôvodu, že počet zamrazených darovaných jednotiek PK v registroch po celom svete stále pribúda, ale aj z dôvodu veľkého záujmu o adresné zamrazenie a uskladnenie PK pre autológne alebo príbuzenské použitie. Prvý register na svete bol založený Dr. Pablom Rubinsteinom v New Yorku v roku 1993 a dnes je v USA jedným z najväčších registrov s takmer 31 tis. zamrazenými jednotkami PK (www.bmdw.org). Na Slovensku bol založený register PK v roku 1997 ako piaty register na svete a od roku 1998 je členom organizácie Bone Marrow Donor Worldwide (www.bmdw.org). V databáze tejto celosvetovej organizácie je dnes popri 10,75 miliónov evidovaných darcov kostnej drene zaevidovaných už vyše 250 tisíc darovaných jednotiek PK a ročne tento počet narastá asi o 40 tisíc. Celkový počet evidovaných darcov kostnej drene a zamrazených jednotiek PK by mal pri súčasnom trende v júni 2008 dosiahnuť 12 miliónov (www.bmdw.org). Počty jednotiek zamrazených PK v adresných bankách rastú rádovo rýchlejšie. Len v USA je uskladnených dnes vyše 600 tisíc jednotiek a celkový počet vo svete už presahuje 1 milión. V prvom tohtoročnom čísle časopisu Pediatrics (január 2007) (12) bola uverejnená prvá prípadová štúdia transplantácie detskej akútnej lymfoblastickej leukémie na svete vyliečenej autológnou PK u 3 ročného dievčatka. Na Slovensku bola prvýkrát použitá autológna PK v roku 2004 pri liečbe neuroblastómu u 8 mesačného chlapca ako súčasť „anglického protokolu“ na podporu obnovy krvotvorby po jednotlivých dávkach chemoterapie. Dnes má tento malý pacient takmer štyri roky a je zdravý (Dr. Husáková, osobne získaná informácia). Aké sú výhody používania PK ako zdroja krvotvorných kmeňových buniek na účely transplantácií? V prvom rade je to jednoduchá a rýchla dostupnosť vhodného transplantátu. V mnohých prípadoch malígnych ochorení, kedy ide o čas, je táto výhoda rovnajúca sa záchrane života. Pacient totiž môže podstúpiť indikovanú transplantáciu iba v prípade, že sa klinikom podarí navodiť stav remisie ochorenia a v tomto, niekedy veľmi krátkom časovom úseku musí byť k dispozícii transplantát krvotvorných buniek. Vyhľadanie a skontaktovanie dobrovoľného darcu kostnej drene až po samotný odber trvá vo vyspelých krajinách do dvoch až troch mesiacov. Žiaľ, štatistiky úspešností transplantácií často neuvádzajú koľko pacientov z dôvodu premeškania vhodného času podstupuje transplantáciu z horšími vyhliadkami na úspech a u koľkých pacientov nie je vôbec možné pokračovať v liečbe transplantáciou kvôli relapsu ochorenia. Pravdepodobnosti vyhľadania vhodného darcu v svetovej databáze sa v kaukazoidnej populácii pohybujú od 60-85% (BMDW, www.bmdw.org). Horšie sú na tom pacienti z menej početných a ekonomicky menej vyspelých etník. Vyhliadky pacientov, u ktorých je nevyhnutná alogénna transplantácia sa zlepšujú jednak vzhľadom na spomínaný nárast počtu zamrazených jednotiek PK v registroch po celom svete ale aj vzhľadom k novým klinickým skúsenostiam s transplantáciami PK. Na základe klinických štúdií sa potvrdilo, že pri vhodnom transplantáte z PK majú pacienti lepšiu dlhodobú prognózu v porovnaní s rovnako vhodným transplantátom z kostnej drene (37). Úspešnú tranaplantáciu krvotvorných buniek je možné vykonať s PK aj pri menej prísnej zhode v tkanivových antigénoch v porovnaní s transplantáciou kostnej drene. Výsledky transplantácií pri použití PK s nezhodou v dvoch antigénoch HLA systému sú porovnateľne dobré ako pri transplantáciách kostnej drene s nezhodou v jednom HLA znaku. Tento jav sa pripisuje určitej nezrelosti (naivnosti) imunokompetentných buniek novorodenca. Zistenie menšej nevyhnutnej zhody HLA antigénov medzi darcom a príjemcom však logicky vytvorilo aj zvýšenú pravdepodobnosť nájdenia vhodného transplantátu medzi zamrazenými jednotkami PK, takže pri vyhľadávaní vhodného darcu, či transplantátu v medzinárodnej databáze bolo nájdených aj viacej transplantátov PK rovnako vhodných pre daného pacienta (zhoda 4 zo 6 antigénov). Vo väčšine prípadov však boli tieto transplantáty z dôvodu malého množstva buniek jednotlivo nedostatočné pre transplantáciu dospelého pacienta. Pokusy vykonať transplantáciu s dvomi menšími rovnako vhodnými transplantátmi PK dopadli dobre a z hľadiska dlhodobej prognózy pacientov lepšie ako keď bola použitá iba jedna dostatočne veľká PK (1). Lepšia percentuálna úspešnosť liečby bola dosiahnutá pravdepodobne navodením silnejšieho „graft versus leukemia“ (GvL) efektu vzájomnou stimuláciou dvoch transplantátov navzájom. Takto stimulované imunokompetenté bunky zrejme lepšie zlikvidovali v tele pacienta zvyškovú chorobu, čo v opačnom prípade vedie k relapsu ochorenia. Zaznamenaný bol aj znížený výskyt vážnej akútnej choroby štepu proti hostiteľovi (GvHD). Pozoruhodné je, že po troch týždňoch od transplantácie mala dvojitý chimerizmus už iba štvrtina pacientov a že po 100 dňoch od transplantácie mali pacienti krvotvorbu už iba z jedného transplantátu. A to v 75% z toho, ktorý bol podaný ako prvý. Tu sa otvára do budúcnosti zaujímavá možnosť transplantovať aj autológnu PK hoci malého objemu v kombinácii s vhodnou alogénnou PK pri ochoreniach, kde bola doteraz indikovaná iba nepríbuzenská transplantácia. A to 63 práve z dôvodu zabezpečenia dostatočnej reakcie štepu proti zvyškovej leukémii v tele príjemcu - GvL efektu. Pri autológnych transplantáciách sa totiž kvôli chýbajúcemu GvL efektu dosahovali pri niektorých typoch leukémií zlé výsledky. Ak by sa potvrdila správnosť tejto hypotézy klinickou štúdiou, rozšírilo by to značne aplikovateľnosť autológnej PK a zabezpečilo zníženú transplantačnú mortalitu z dôvodov GvHD. Dnes sa na základe trendov prevalencií jednotlivých chorôb v populácii a rozširujúceho sa počtu diagnóz liečiteľných transplantáciou krvotvorných buniek usudzuje, že pravdepodobnosť využitia autológnych krvotvorných kmeňových buniek bude rásť. Pasquini a spol. (31) publikovali pravdepodobnosti podstúpenia autológnej transplantácie a akejkoľvek transplantácie a dospeli k nasledovným pravdepodobnostiam. Podstúpenie AutoTx/Tx do 20 rokov života je 1:5000/1700, do 50 rokov života 1:1100/450, do 75 rokov 1:450/220. Ďalšou výhodou transplantátov z PK je väčšia proliferačná schopnosť jej krvotvorných kmeňových buniek v porovnaní s kmeňovými bunkami kostnej drene a neprítomnosť záťaže navodenej starnutím, získanými vírusovými ochoreniami počas života, či chemoterapiou. Kmeňové bunky PK sa podarilo in vitro množiť a expandovať ich počet na dostatočný pre transplantáciu dospelého pacienta (17,27,28). Výsledky z klinických štúdií transplantácií vykonaných s namnoženými krvotvornými kmeňovými bunkami už preukázali, že takéto transplantácie sú možné a bezpečné (14,34,35). V USA bola už úspešne ukončená I. fáza klinického skúšania amplifikačného kitu CB001 na krvotvorné kmeňové bunky a prejde do II. fázy (www.clinicaltrial.gov). Mezenchýmové kmeňové bunky (MKB) pupočníkovej krvi V roku 2000 boli popísané v PK adherentné fibroblastom podobné bunky, ktoré sa svojimi povrchovými znakmi zhodovali so znakmi MKB získaných z kostnej drene (6). Neskôr viacerí autori nielen potvrdili multilíniový charakter MKB z PK (4) ale opisovali diferenciáciu aj do buniek pochádzajúcich z endo- a ektodermu iných zárodočných listov ako sú svalové bunky (8), nervové a gliálne bunky (3,11), či hepatocyty (15). Predpoklad, že kmeňové bunky z PK majú skutočne pluripotentný potenciál sa podarilo dokázať a opublikovať v roku 2004 (19). Autori dokázali diferencovať takzvané USSC (Unrestricted Somatic Stem Cells) do mezodermových osteoblastov, chondroblastov, adipocytov, hemtopoietických buniek a kardiomyocytov, do ektodermových buniek všetkých troch neurálnych línií ako aj endodermových hepatálnych buniek. USSC je možné ľahko nasmerovať v závislosti od kultivačného média na MKB s multilíniovým potenciálom a kedže nie sú známe povrchové markery, ktorými by sa dali USSC odlíšiť od MKB, tak v imunofenotypových štúdiách sú opisované ako homogénna populácia. Od MKB sa teda zatiaľ dajú odlíšiť iba dokázaním ich diferenciačného potenciálu. Zatiaľ neznámou zostáva, či sa podarí izolovať tieto bunky z každej PK. Z publikovaných výsledkov štúdií vyplýva, že iba z 60% čerstvo odobratých PK sa podarilo izolovať MKB, či USSC (18,20). Zo zamrazených jednotiek PK sa to darí ešte menej. Rozmrazovanie buniek totiž vedie k tvorbe bunkových agregátov a následne k strate časti buniek. Keď sa podarí nájsť taký spôsob zamrazovania alebo spôsob manipulácie s rozmrazenou PK, ktoré nebudú viesť k strate buniek, úspešnosť izolácie MKB sa určite zvýši. Potenciál využitia, ktorý naznačujú publikované štúdie na zvieracích modeloch je totiž značný (41). Napríklad pri podaní MKB dochádza k rýchlejšiemu prihojeniu štepu krvotvorných buniek u NOD/SCID myší (43), pri navodení neovaskularizácie ischemických postihnutí dolných končatín (7,40), pri liečbe neuropatií po aplikácii endoteliálnych prekurzorov derivovaných z buniek PK u diabetických potkanov (30), pri regenerácii ciev srdca alebo mozgu poškodených ischémiou (13,23,25,29,36,38) a ďalšie. Tiež v pokusoch s ex vivo expanziou CD34+ kmeňových buniek z PK boli dosiahnuté lepšie výsledky, keď expanzia prebiehala v prítomnosti množiacich sa MKB (24). Ďalej z in vitro štúdií možno spomenúť prácu Kamolz a spol. (16) ktorí v pokusoch s diferenciáciou na epiteliálne bunky dokázali, že v prítomnosti dospelých ľudských keratinocytov sa kmeňové bunky z PK krvi diferencujú tiež na keratinocyty a tak môžu slúžiť ako štartovací materiál na získanie transplantátov pre pacientov s veľkými kožnými defektmi. Podobne práca El-Badri a spol. (5) potvrdila in vitro neuregeneratívny potenciál MKB z PK indukciou ich neurálnej diferenciácie. Perspektívy vo využití kmeňových buniek z PK v liečbe a reparačných zásahoch v poškodenom mozgu a mieche sú napísané v práci Garbuzova-Davis a spol. (9). Odbery a zamrazovanie PK sa vykonávajú v väčšej miere len niečo cez 10 rokov, takže na možnosť ich autológnej aplikácie v klinických štúdiách ešte nebola príležitosť. Avšak prvé skúsenosti z klinického využitia autológnych MKB z kostnej drene potvrdzujú výsledky získané na zvieracích modeloch opísané vyššie. Napríklad spomínané ischemické poškodenie dolných končatín sa podarilo výrazne zlepšiť u diabetických pacientov podaním ich vlastných z kostnej drene mobilizovaných 64 kmeňových buniek (39,43). Lazarus a spol. (21) publikovali súbor 46 pacientov, ktorí boli transplantovaní s krvotvornými bunkami od svojich HLA identických súrodencov a zároveň dostávali aj ich namnožené MKB. Zaznamenali zrýchlené prihojenie štepu a obnovu krvotvorby a znížený výskyt GvHD alebo jej miernejší priebeh. Podobne Le Blanc a Ringden (22,23) publikovali veľmi sľubné výsledky s liečbou ťažkej na steroidy rezistentnej akútnej GvHD. V USA prebieha v súčasnosti pilotná klinická štúdia, ktorá by mala dať odpoveď, či môže pomôcť transfúzia autológnej PK deťom s diabetom prvého typu (www.clinicaltrials.gov). Americký Cord Blood Registry® (www.cordblood.com) zahájil program s názvom „Newborn Possibilities Program“ (www.newbornpossibilities.com), v ktorom chcú zabezpečiť pre novorodené deti s potenciálnym neurologickým poškodením (deti s nízkym „Apgar skóre“) zamrazenie PK, aby bola v prípade potvrdenia ochorenia (DMO) použitá na ich liečbu. Embryonálnym bunkám podobné kmeňové bunky pupočníkovej krvi V posledných troch rokoch sa objavili v odbornej literatúre veľmi povzbudivé správy z hľadiska nájdenia východiska z etického problému využívania ľudských embryonálnych kmeňových buniek. Ide o objav embryonálnym bunkám podobných kmeňových buniek v PK publikovaný profesorom McGuckinom a spol. z univerzity v Newcastle (26). Tieto bunky majú na svojom povrchu špecifické markery embryonálnych buniek ako sú SSEA-4, SSEA-3, Oct-4 a TRA-1-60, TRA-1-81 protilátkami rozpoznávané markery, ale nie SSEA-1. Boli získané ako adherentné strapcovité kolónie z hustej bunkovej kultúry PK v prítomnosti trombopoietínu, flt3-ligandu a c-kit ligandu v kultivačnom médiu s fetálnym teľacím sérom po 7 dňoch kultivácie. Keď boli tieto bunky štyri týždne kultivované v gravitačnom bioreaktore v hepatocytovom rastovom médiu (IMDM+FCS, HGF, bFGF, EGF, c-kit ligand) začali exprimovať na svojom povrchu hepatocytové špecifické markery ako sú cytokeratín-18, α-fetoproteín a albumín. Tým bol dosiahnutý prvý dôkaz ich pluripotentného diferenciačného potenciálu. Dnes firma založená profesorom McGuckinom a spolupracovníkmi ponúka trojrozmerné hepatálne tkanivo vypestované z takýchto buniek na testy nových liekov farmaceutickým firmám. Do budúcna sa idú zamerať na vývoj 3D modelov ľudských orgánov z kmeňových buniek, ktoré sa budú využívať na testovanie nových liekov. Títo vedci z univerzity v Newcastle v spolupráci s americkou firmou BioE vyvíjali a testovali produkty zlepšujúce techniku spracovania a uskladňovania zamrazenej PK tak, aby sa v nej darilo uchovať aj tieto cenné kmeňové bunky. Najnovšie firma BioE ohlásila, že sa jej pracovníkom podarilo diferencovať kmeňové bunky PK na pľúcne alveolárne bunky II typu (2), čo sľubuje pokrok v liečbe cystickej fibrózy. Podobne Medistem Laboratories testujú platformu Angiostem™ , ktorá by mala slúžiť na liečbu kardiovaskulárnych ochorení a tiež ischemických ochorení končatín. Angiostem™ predstavuje platformu ktorá umožní manipuláciu PK tak, že ju bude možné využiť pre rôznych jedincov bez potreby imunologickej supresie. Následne v roku 2006 sa objavili práce potvrdzujúce výsledky dosiahnuté tímom profesora McGuckina. Zhao a spolupracovníci z Ilinoiskej univerzity v Chicagu identifikovali v PK kmeňové bunky s embryonálnymi charakteristikami (42). Navyše dosiahli in vitro diferenciáciu týchto buniek do buniek s neuronálnou a endoteliálnou charaktristikou a in vivo stimuláciu ich diferenciácie do funkčných, inzulín produkujúcich buniek, ktoré eliminovali hyperglykémiu u diabetických myší. Závery PK sa stala v posledných rokoch dôležitým zdrojom kmeňových buniek, jednak pre výskum a jednak pre klinické aplikácie. Dnes prebieha v USA „regruting“ do 122 nových klinických štúdií s využitím PK (www.clinicaltrials.gov). V Hong-Kongu, Číne a Taiwane sa chystajú zahájiť v roku 2008 rozsiahlu klinickú štúdiu zameranú na využitie kmeňových buniek na liečbu poranení miechy. Do štúdie bude zapojených 400 pacientov s rôznymi typmi poranení. Kmeňové bunky sa budú izolovať z PK HLA kompatilbilného darcu získanej z verejných registrov (The China Post, 9.3.2007). Je preto opodstatnené očakávať, že už blízka budúcnosť ukáže do akej miery sa potvrdia nádeje vkladané do kmeňových buniek PK, jej darovania pre všeobecné terapeutické využitie alebo rodinného uskladňovania. Použitá literatúra 1. Barker, J.N., Weisdorf, D.J., DeFor, T.E., et al.: Transplantation of 2 partially HLA-matched umbilical cord blood units to enhance engraftment in adults with hematologic malignancy. Blood. 105: 1343–1347, 2005. 2. Berger, M.J., Adams, S.D., Tigges, B.M., et al.: Differentiation of umbilical cord blood-derived multilineage progenitor cells into respiratory epithelial cells. Cytotherapy. 8: 480–487, 2006. 65 3. Buzanska, L., Machaj, E.K., Zablocka, B., et al.: Human cord blood-derived cells attain neuronal and glial features in vitro. J Cell Sci. 115: 2131–2138, 2002. 4. Campagnoli, C., Roberts, I.A.G., Kumar, S., et al.: Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood. 98: 2396–2402, 2001. 5. El-Badri, N.S., Hakki, A., Saporta, S., et al.: Cord blood mesenchymal stem cells: Potential use in neurological disorders. Stem Cells Dev. 15: 497–506, 2006. 6. Erice, A., Confer, P., Minguell, J.J.: Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109: 235–242, 2000. 7. Finney, M.R., Greco, N.J., Haynesworth, S.E., et al.: Direct Comparison of Umbilical Cord Blood versus Bone Marrow-Derived Endothelial Precursor Cells in Mediating Neovascularization in Response to Vascular Ischemia. Biol Blood Marrow Tr. 12: 585–593, 2006. 8. Gang, E.J., Neony, J.A., Hong, S.H., et al.: Skeletal Myogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Isolated from Human Umbilical Cord Blood. Stem Cells. 22: 617–624, 2004. 9. Garbuzova-Davis, S., Willing, A.E., Saporta S., et al.: Novel cell therapy approaches for brain repair; In: Aage RM (ed): Progress in Brain Research Reprogramming of the Brain. Elsevier. 207–222, 2006. 10. Gluckman, E., Broxmeyer, H.A., Auerbach, A.D., et al.: Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321: 1174–1178, 1989. 11. Goodwin, H.S., Bicknese, A.R., Chin, S.N., et al.: Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: Expression of bone, fat, and neural markers. Biol Blood Marrow Tr. 2001,581–588, 2001. 12. Hafani, A., Lampeter, E., Viswanatha, D., et al.: First Report of Autologous Cord Blood Transplantation in the Treatment of a Child With Leukemia. Pediatrics. 119: e296–300, 2007. 13. Henning, R.J., Burgas, J.D., Ondrovi, L., et al.: Human umbilical cord blood progenitor cells are attracted to infarcted myocardium and significantly reduce myocardial infarction size. Cell Transplant. 15: 647–658, 2006. 14. Jaroscak, J., Filtry, K., Smith, A., et al.: Augmentation of umbilical cord blood (UCB) transplantation with ex vivo-expanded UCB cells: results of a phase 1 trial using the Zastroj Replicell System. Blood. 101: 5061– 5067, 2003. 15. Kakinuma, S., Tahala, Y., Chinzei, R., et al.: Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells. Stem Cells. 21: 217–227, 2003. 16. Kamolz, L.P., Kolbu, A., Wick N., et al.: Cultured human epithelium: Human umbilical cord blood stem cells differentiate into keratinocytes under in vitro conditions. Burns. 32: 16–19, 2006. 17. Kawada, H., Ando, K., Tsuji, T., et al.: Rapid ex vivo expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitors using a novel culture system. Exp hematom. 27: 904–915, 1999. 18. Kern, S., Eichler, H., Stočce, J., et al.: Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem cells. 24: 1294–1301, 2006. 19. Kotlet, G., Senekem, S., Airey, J.A., et al.: A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med. 200: 123–135, 2004. 20. Kotlet, G., Senekem, S., Wernet P.: Comparative generation and characterization of pluripotent unrestricted somatic stem cells with mesenchymal stem cells from human cord blood. Exp Hematol. 34: 1589–1595, 2006. 21. Lazaru, H.M., Koc, O.N., Devine, S.M., et al.: Cotransplantation of HLA-identical sibling culture-expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem sells in hematologic malignancy patients. Biol Blood Marrow Tr. 11: 389–398, 2005. 22. Le Blanc, K., Ringden, O.: Mesenchymal stem cells: properties and role in clinical bone marrow transplantation. Curr Opin Imunol. 18: 586–591, 2006. 23. Leor, J., Ghetta, E., Feinberg, M.S., et al.: Human umbilical cord blood-derived CD133+ cells enhance function and repair of the infarcted myocardium. Stem cells. 24: 772–780, 2006. 24. Li, M.H., Tian, D., Liu, C.Y., et al.: Expansion ex vivo of human bone marrow mesenchymal stem cells and cord blood CD34+ cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 13: 235–239, 2005. 25. Ma, N., Ladilov, Y., Kaminski, A., et al.: Umbilical cord blood cell Transplantation for Myocardial Regeneration. Transplant Proc. 38: 771–773, 2006. 26. McGuckin, C.P., Forraz, N., Baradez, M.O., et al.: Production of stem cells with embryonic characteristics from human umbilical cord blood. Cell prolif. 38: 245–255, 2005. 27. McNiece, I.: Ex vivo expansion of hematopoietic cells. Exp Hematol. 32: 409–410, 2004. 28. Miller, J.S., McCullar, V., Verfaillie, C.M.: Ex vivo culture of CD34+/Lin-/DR- cells in stroma-derived soluble factors, interleukin-3, and macrophage inflammatory protein-1alpha maintains not only myeloid but also lymphoid progenitors in a novel switch culture assay. Blood. 91: 4516–4522, 1998. 29. Nan, Z.G., Grande, A.W., Sanberg, C.D., et al.: Infusion of human umbilical cord blood ameliorates neurologic deficits in rats with hemorrhagic brain injury. Ann NY Acad Sci. 1049: 84–96, 2005. 30. Naruse, K., Hamada, Y., Nakashima, E., et al.: Therapeutic neovascularization using cord blood-derived endothelial progenitor cells for diabetic neuropathy. Diabetes. 54: 1823–1828, 2005. 66 31. Pasquini, M.C., Logan, B.R., Verter, F., et al.: The likelihood of hematopoietic stem cell transplantation (HCT) in the United States: Implications for umbilical cord blood storage. ASH Annual Meeting Abstracts. 106,1330, 2005. 32. Ringden, O., Uzunel, M., Rasmusson, I., et al.: Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81: 1390–1397, 2006. 33. Rubinstein, P.: Why cord blood? Human imunol. 67: 398–404, 2006. 34. Shpall, E.J., McNiece, I.K., de Lima, M., et al.: Transplantation of ex vivo expanded cord blood. Biol Blood Marrow Tr. 10: 738–738, 2004. 35. Shpall, E.J., Quinones, R., Miller, R., et al.: Transplantation of ex vivo expanded cord blood. Biol of Blood Marrow Tr. 8: 368–376, 2002. 36. Taguchi, A., Soma, T., Tahala, H., et al.: Administration of CD34+ cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesisin a mouse model. J Clin Incest. 114: 330–338, 2004. 37. Wagner, J.E., Barker, J.N., DeFor, T.E., et al.: Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood. 100: 1611–1618, 2002. 38. Xiao, J., Nan, Z., Motorka, Y., et al.: Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev. 14: 722– 733, 2005. 39. Yamaguchi, Y., Yoshida, S., Sumikawa, Y., et al.: Rapid healing of intractable diabetic foot ulcers with exposed bones following a novel therapy of exposing bone marrow cells and then grafting epidermal sheets. Br J Dermatos. 151: 1019–1028, 2004. 40. Yang, C., Zhang, Z.H., Li, Z.J., et al.: Enhancement of neovascularization with cord blood CD133+ cellderived endothelial progenitor cell transplantation. Thromb Haemost. 91: 1202–1212, 2004. 41. Zhang, L., Yang, R., Han, Z.C.: Transplantation of umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells: a promising method of therapeutic revascularisation. Eur J Haematol. 76: 1–8, 2006. 42. Zhao, Y., Wang, H., Mazzone, T.: Identification of stem cells from human umbilical cord blood with embryonic and hematopoietic characteristics. Exp Cell Res. 312: 2454–2464, 2006. 43. Zhou, D.H., Juany, S.L., Juany, K., et al.: Mesenchymal stem cells from human cord blood promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34+ cells in NOD/SCID mice. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 26: 732–735, 2005. 67 Znižovanie rizika liečby a adherencia k sekundárnej terapii po infarkte myokardu Monika Laššánová1, Milada Laššánová2, Ján Murín3 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, 1Farmakologický ústav; 2Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej chémie; 3I. interná klinika, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Vzhľadom k tomu, že kardiovaskulárne lieky predstavujú jednu z najpredpisovanejších liekových skupín, ako aj fakt, že dobrá adherencia lekárov k národným odporúčaniam má potenciál racionalizovať liečbu a znižovať jej riziko, v predkladanej práci sme sa zamerali na analýzu sekundárnej prevencie u pacientov po infarkte myokardu (IM). Do súboru boli zaradení 103 pacienti, ktorí spĺňali kritéria diagnózy IM. Ako prediktívny faktor vzniku nežiaducich účinok liekov a potenciálnych liekových interakcií, sme v súbore sledovali počet liekov. Priemerný počet liekov ± SD pri prijatí bol 3,9 ± 2,8 lieku vs. 6,5 ± 1,9 pri prepustení. Hospitalizácia viedla k signifikantnému nárastu počtu liekov pri prepustení (p<0,001). Preskripcia 4 EBM liekových skupín u pacientov po IM pri preložení alebo prepustení (N=82) bola: antitrombotickú liečbu malo 97,6% (N=80), liečbu inhibítormi enzýmu konvertujúceho angiotenzín malo 91,4% (N=75), beta-blokátory malo 61% (N=50) a 24,3% (N=20) pacientov malo hypolipidemickú liečbu. Pozitívne hodnotíme fakt, že počas hospitalizácie došlo u sledovaných skupín liekov k signifikantnému nárastu ich užívania oproti stavu pri prijatí (p<0,001) pre všetky 4 EBM skupiny. Rezervy vidíme v adherencii lekárov k predpisovaniu beta-blokátorov a hypolipidemík. Úvod Pohľad na bezpečnosť farmakoterapie sa neustále vyvíja. Kým v minulosti sa kládol dôraz predovšetkým na účinnosť terapie, v posledných desaťročiach sa do popredia dostáva okrem účinnosti aj jej bezpečnosť. Problematike nežiaducich účinkov liekov (NÚL) treba venovať zvýšenú pozornosť, nakoľko NÚL signifikantne zvyšujú morbiditu a mortalitu, zvyšujú náklady na liečbu a predstavujú tretiu až šiestu vedúcu príčinu smrti (Schlienger, 2000; Kelly, 2001). Jeden z najdôležitejších rizikových faktorov farmakoterapie predstavuje polypragmázia, ktorá vedie k nárastu liekových interakcií a podieľa sa na vzniku NÚL (Kelly, 2001; Nguyen a kol., 2006; Krähenbühl-Melcher, 2007). Mnohé práce konštatujú, že starší pacienti užívajú v priemere 3-4 lieky, ale nie je zriedkavé užívanie aj 12 liekov súčasne, čím sa výrazne zvyšuje incidencia NÚL (Adamcik a Rhodes, 1993; Nikolaus a kol, 1996). Napríklad pri súčasnom používaní viac ako 6 liekov sa NÚL objavujú u 19,8% hospitalizovaných, u pacientov liečených menej ako 6 liekmi boli NÚL pozorované u menej ako 3,3% pacientov (Perlík, 1999). Na optimalizáciu, racionalizáciu a minimalizáciu rizík liečebného procesu, sa odborníkmi z danej oblasti vypracovávajú odporúčania (guidelines) pre optimálnu diagnostiku a liečbu jednotlivých ochorení. Tieto odporúčania vychádzajú zo spracovaných informácií medicíny založenej na dôkazoch (Evidence based Medicine – EBM) (Sackett a kol., 2000). Štandardné diagnostické a liečebné postupy, odporúčania vznikajú na základe zváženia benefitu a rizík liečby, na základe najnovších poznatkov o používaní liekov s prihliadnutím na ekonomické zdroje a prispievajú k zvýšeniu racionálnej farmakoterapie konkrétneho pacienta (Sackett a kol., 2000; Scholten a kol., 2005). Vzhľadom k tomu, že kardiovaskulárne ochorenia predstavujú vedúcu príčinu mortality a morbidity tak na Slovensku, ako aj celosvetovo a počet úmrtí na kardiovaskulárne ochorenia celosvetovo stúpa, národné kardiologické spoločnosti vypracovávajú odporúčania na liečbu najčastejších kardiovaskulárnych ochorení. Jedným z takýchto guidelinov, sú aj odporúčania na sekundárnu prevenciu po infarkte myokardu, ktoré boli vypracované na základe veľkých, multicentrických štúdií, ktoré demonštrovali efektívnosť a prospešnosť liečby antitrombotikami (predovšetkým antiagregačnými látkami, ATC - B01AC), inhibítormi enzýmu konvertujúceho angiotenzín/inhibítormi angiotenzínových receptorov (ATC – C09), beta-blokátormi (ATC – C07) a liekmi znižujúcimi hladiny lipidov (predovšetkým statínmi, ATC – C10AA), v redukcii morbidity a mortality u pacientov po infarkte myokardu (Braunwald a kol., 2002; Antman a kol., 2004; Smith a kol., 2006). 68 Materiál a metódy Predkladaná práca hodnotí súbor 103 pacientov, ktorí na základe klinického obrazu, EKG záznamu a pozitívnych myokardiálnych markerov, spĺňali kritéria diagnózy – infarkt myokardu (IM), pri prijatí na Koronárnu jednotku I. Internej kliniky Lekárskej fakulty UK v Bratislave od 1.1. 1999 do 31.12. 1999. U týchto pacientov sme následne, retrospektívne sledovali všetky ich ďalšie hospitalizácie na I. Internej klinike LFUK do septembra 2005. V retrospektívnej štúdii sme analyzovali terapiu, s akou boli pacienti prijatí a s akou terapiou odchádzali do ambulantnej starostlivosti po IM. Takto sme monitorovali adherenciu lekárov k národným odporúčaniam k sekundárnej farmakologickej prevencii po IM. Deskriptívna štatistika IM súboru: Spojité premenné sme vyjadrili ako priemer ± smerodajná odchýlka. Diskrétne premenné sme vyjadrili frekvenciou ich výskytu a percentuálnym zastúpením. Štatistické testy: Užívanie liekových skupín pri prijatí a pri prepustení z nemocnice sme porovnali McNemarovým testom. Na zistenie vzťahu medzi diskrétnymi premennými sme použili χ2 test v kontingenčných tabuľkách a v prípade nízkych očakávaných početností Fisherov exaktný test. Na porovnanie spojitých premenných pri prijatí a pri prepustení sme použili párový Studentov t-test resp. párový Wilcoxonov test v závislosti od toho, či nebola alebo bola zamietnutá normalita. Na porovnanie spojitých premenných v dvoch súboroch sme použili 2-výberový Studentov t-test resp. 2výberový Mann-Whitneyov test v závislosti od toho, či nebola alebo bola zamietnutá normalita. Výsledky a diskusia Vzhľadom k tomu, že kardiovaskulárne lieky predstavujú jednu z najpredpisovanejších liekových skupín, ako aj fakt, že dobrá adherencia lekárov k národným odporúčaniam má potenciál racionalizovať liečbu a znižovať jej riziko, v predkladanej práci sme sa zamerali na analýzu sekundárnej prevencie u pacientov po IM. Tá zahŕňa medicínske postupy (4 EBM liekové skupiny) a životosprávne opatrenia, ktoré majú viesť k redukcii komplikácií IM, rekurencii IM a zabráneniu progresie koronárnej aterosklerózy. Do predkladaj štúdie sme zaradili 103 pacientov, ktorí boli na Koronárnu jednotku I. internej kliniky LFUK prijatí od 1.1.1999 do 31.1.1999 s diagnózou infarkt myokardu. V súbore boli zastúpení viac muži (61; 59,2%) ako ženy (42; 40,8%). Priemerný vek ± SD pacientov súboru bol 71,5 ± 11,3 roka (medián 75,0 roka). Ženy boli staršie ako muži. V priebehu hospitalizácie zomrelo 21 (20,4%) a do ambulantnej starostlivosti bolo prepustených 76 (73,8%) pacientov, 6 (5,8%) pacienti boli preložení na iné oddelenie v rámci nemocničnej starostlivosti. Ako prediktívny faktor vzniku nežiaducich účinok liekov a potenciálnych liekových interakcií, sme v súbore sledovali počet liekov, s ktorými prišiel pacient do nemocnice a s ktorými bol preložený alebo prepustený do ambulantnej starostlivosti. Priemerný počet liekov ± SD u 103 pacientov súboru pri prijatí bol 3,9 ± 2,8 lieku. Pri prijatí nemalo 14 (13,5%) pacientov v anamnéze žiadnu medikamentóznu liečbu. Najviac, 15 liekov, mal pri prijatí jeden (0,97%) pacient. U 82 pacientov, ktorí boli preložení, alebo prepustení do ambulantnej starostlivosti bol priemerný počet 6,5 ± 1,9 liekov, pričom minimum mali 2 lieky a maximum 12 liekov pri prepustení. Zaznamenali sme štatisticky významný nárast počtu liekov pri prepustení oproti počtu liekov pri prijatí (p<0,001) (tab. 1). N Priemer SD Minimum liekov Maximum liekov P Počet liekov pri prijatí Celý súbor 103 3,9 2,8 0 15 Počet liekov pri Počet liekov pri prijatí prepustení Preložení/prepustení pacienti 82 82 3,4 6,5 2,5 1,9 0 2 8 12 <0,001 Tab. 1. Počet liekov u pacientov pri prijatí a pri prepustení. Vysvetlivky: SD – smerodajná odchýlka, p – štatistická významnosť podľa Wilcoxon testu. 69 V štúdii Wawrucha a kolektívu došlo u 600 pacientov ≥ 65 ročných tiež k signifikantnému nárastu počtu liekov pri prepustení z nemocnice (Wawruch a kol., 2007). Dôvodom na zvýšenie počtu liekov počas hospitalizácie, môže byť jednak zhoršenie klinického stavu pacienta, alebo diagnostika nového ochorenia. Na druhej strane je práve hospitalizácia vhodným obdobím na prehodnotenie liečby a prípadné vysadenie liekov, ktoré už nie sú nevyhnuté vzhľadom na aktuálny stav pacienta. Práve zníženie počtu liekov signifikantne znižuje riziko vzniku NÚL a interakcií (Bressler a Bahl, 2003). U 2 pacientov sa počet liekov znížil, u 71 pacientov sa zvýšil a u 9 sa nezmenil. Medzi pohlaviami nie je rozdiel v počte liekov pri prepustení a pri prijatí. Starší pacienti (≥ 65 rokov), nemali pri prepustení viac liekov než mladší pacienti. V predkladanom súbore sme taktiež analyzovali výskyt, čiže užívanie, 4 EBM liekových skupín, ktoré majú byť preskribované, na základe medicíny založenej na dôkazoch, všetkým pacientom v rámci sekundárnej prevencii po IM. Tým sme sledovali farmakologickú adherenciu lekárov k národným odporúčaniam kardiologickej spoločnosti po AIM. Podľa ATC klasifikácie sme stanovovali užívanie, čiže preskripciu nasledovných EBM-liekových skupín: B01 – antitrombotiká (B01AA – antagonisty vitamínu K, antikoagulanciá, B01AB – heparíny a B01AC – antiagreganciá), C09 – inhibítory enzýmu konvertujúceho angiotenzín alebo blokátory angiotenzínových receptorov, C07 – beta-blokátory a C10 – hypolipidemiká (C10AA – statíny a C10AB fibráty). Spomínané liekové skupiny na základe EBM zlepšujú prognózu a znižujú mortalitu u pacientov po IM (Antman a kol., 2004, Smith a kol., 2006). Celková preskripcia u pacientov po IM pri preložení alebo prepustení (N=82) bola: antitrombotickú liečbu malo 97,6% (N=80), liečbu inhibítormi enzýmu konvertujúceho angiotenzín malo 91,4% (N=75), beta-blokátory malo 61% (N=50) a 24,3% (N=20) pacientov malo hypolipidemickú liečbu. Analyzovali sme tieto 4 EBM skupiny liekov pri prijatí a pri prepustení u 82 pacientov, ktorí boli preložení alebo prepustení do ambulantnej starostlivosti. Pozitívne hodnotíme fakt, že počas hospitalizácie došlo u sledovaných skupín liekov podľa McNemar Testu k signifikantnému nárastu ich užívania oproti stavu pri prijatí (p<0,001) pre všetky 4 EBM skupiny (graf 1). Z týchto čísel jednoznačne vyplýva potreba zvýšiť adherenciu našich lekárov k predpisovaniu BB a hypolipidemík. 120,00% pri prijatí 100,00% * pri prepustení * p<0,001 80,00% * 60,00% 40,00% * 20,00% 0,00% liečba antitrombotikami liečba ACEi liečba betablokátormi liečba hypolipidemikami Graf 1. EBM liečba pacientov súboru pri prijatí a pri prepustení. Vysvetlivky: * - signifikantný nárast vo všetkých 4 EBM skupinách podľa McNemar testu. Závery V sledovanom súbore hospitalizácia viedla k nárastu počtu liekov pri prepustení, oproti počtu pri prijatí. Pacienti ≥ 65 rokov nemali pri prepustení viac liekov než mladší pacienti. Adherencia lekárov k národným odporúčaniam k sekundárnej prevencii po IM je dobrá. Pri všetkých štyroch EBM liekových skupinách (antitrombotiká, ACEinhibítory, beta-blokátory hypolipidemiká) došlo k nárastu ich preskripcie pri prepustení. Aj napriek tomu vidíme najväčšie rezervy v predpisovaní betablokátorov a hypolipidemík. 70 Použitá literatúra 1. Adamcik, B.A., Rhodes, R.S.: The Pharmacist’s Role in Rational Drug Therapy of the Aged. Drugs Aging. 3(6): 481–48, 1993. 2. Antman, E.M., Anbe, D.T., Armstrong, P.W., et al.: ACC/AHA guidelines for the management of patients with ST-elevation myocardial infarction; A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee to Revise the 1999 Guidelines for the Management of patients with acute myocardial infarction). J Am Coll Cardiol. 44: E1–211, 2004. 3. Braunwald, E., Antman, E.M., Beasley, J.W., Califf, R.M., Cheitlin, M.D., et al.: ACC/AHA guideline update for the management of patients with unstable angina and non-ST-segment elevation myocardial infarction-2002: summary article: a report of the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (Committee on the Management of Patients With Unstable Angina). Circulation. 106(14): 1893–900, 2002. 4. Bressler, R., Bahl, J.J.: Principles of drug therapy for the elderly patient. Mayo Clin Proc. 78: 1564–77, 2003. 5. Kelly, W.N.: Can the frequency and ricks of fatal adverse drug events be determined? Pharmacotherapy. 21(5): 521–7, 2001. 6. Krähenbühl-Melcher, A., Schlienger, R., Lampert, M., Haschke, M., Drewe, J., Krähenbühl, S.: Drug-related problems in hospitals: a review of the recent literature. Drug Saf. 30(5): 379–407, 2007. 7. Nguyen, J.K., Fouts, M.M., Kotabe, S.E., Lo, E.: Polypharmacy as a risk factor for adverse drug reactions in geriatric nursing home residents. Am J Geriatr Pharmacother. 4(1): 36–41, 2006. 8. Nikolaus, T., et al.: Elderly patient´s problems with medications. An in-hospital and follow-up study. Eur J Clin Pharmacol. 49: 255–9, 1996. 9. Perlík, F.: Klinická farmakologie v praxi. 1. vyd. TRITON, Praha. 58–70, 1999. 10. Sackett, D.L., Strauss, S.E., Richardson, W.S., et al.: Evidence-based medicine: How to practice and teach EBM. 2nd edition. Churchill Livingstone, New York. 261, 2000. 11. Schlienger, R.G.: Management of adverse drug effects. Ther Umsch. 57(9): 584–90, 2000. 12. Scholten, R.J., Clarke, M., Hetherington, J.: The Cochrane Collaboration. Eur J Clin Nutr. 59(Suppl 1): S147–9, 2005. 13. Smith, S.C., Allen, J., Blair, S.N., et al.: AHA/ACC guidelines for secondary prevention for patients with coronary and other atherosclerotic vascular disease: 2006 Update, endorsed by the National Heart, Lung, and Blood Institute. Circulation. 113: 2363–72, 2006. 14. Wawruch, M., Zikavska, M., Wsolova, L., et al: Polypharmacy in elderly hospitalised patients in Slovakia. Pharm World Sci. 2007 (In press). 71 Two- and three-dimensional tissue constructs based on nanofiber layers Petr Lesný1,2,3, Pavla Jendelová1,2,3, Oldřich Jirsák4, Lenka Martinová4, Jiří Michálek3,5, Martin Přádný3,5, Eva Syková1,2,3 1 Institute of Experimental Medicine, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague; 2Department of Neuroscience, 2nd Medical Faculty of Charles University, Prague; 3Center for Cell Therapy and Tissue Repair, Prague; 4Department of Nonwovens, Faculty of Textile Engineering, Liberec; 5Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic, [email protected] Abstract The construction of three-dimensional structures is at the center of attention of tissue engineering. Current developments in nanotechnology, primarily the technique of producing nanofiber layers using a Nanospider™ device, led us to investigate the properties of the nanofiber layers with the aim of utilizing them for two- and three-dimensional tissue reconstruction. We prepared nanofiber layers from the copolymer of 2hydroxyethylmethacrylate (HEMA) and ethoxyethylmethacrylate (EOEMA) and cultivated the bone marrow derived mesenchymal stem cells and chondrocytes on them. Both of the cell types grew to confluence on the top of the nanofiber layer, it was possible to cultivate them on the opposite sides of the nanofiber layer. By stacking the nanofiber layers containing the cell types on each other and compressing, we created three-dimensional tissue construct resembling the developing mesenchymal tissue. Introduction The preparation of three-dimensional structures is at the center of attention of tissue engineering. There are many methods available for creating three-dimensional tissue constructs – utilizing macroporous (e.g. fibrous) materials or dispersing the cells in a homogeneous environment, such as an agarose hydrogel or fibrin glue. Electrospun nanofibers have been known for a long time; however, conventional electrospinning methods do not allow their production in sufficient quantities for experiments with tissue engineering. Current developments in nanotechnology, primarily the technique of producing nanofiber layers using a Nanospider™ device [1], led us to investigate their properties with the aim of utilizing such nanofibers for tissue engineering, mainly for threedimensional tissue reconstruction. Materials and methods A Nanospider™ device was used to prepare layers from biocompatible copolymer of 2hydroxyethylmethacrylate (HEMA) and ethoxyethylmethacrylate (EOEMA). The thickness of the layers was between 10 and 100 micrometers. The nanofiber layers were examined using an electron microscope and utilized for cell cultivation. Bone marrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs) and chondrocytes were cultivated on both sides of the nanofiber layers under standard cultivation conditions. We prepared nanofiber layers with BMSCs or chondrocytes on both sides and also layers with BMSCs on top and chondrocytes on the bottom of the nanofiber layer. The growth of the cells was evaluated using confocal microscopy. After reaching confluence, the individual layers were folded, compressed and further cultivated for 21 days. The resulting three-dimensional cell-polymer constructs were examined using standard histological techniques. Results and discussion Although the growth of cells on the layers from the copolymer of HEMA and EOEMA was negligible, both the chondrocytes and BMSCs grew to confluence on nanofiber layers from the copolymer. (Fig. 1, 2). We were able to cultivate chondrocytes and BMSCs on the opposite sides of a nanofiber layer; the interactions between cells on the two sides differed according to the thickness of the nanofiber layer. On the layers 10 micrometers thick, the cell processes were able to grow through the layer to the opposite side, while on layers between 10 and 50 micrometers in thickness, the cells 72 from both layers were in contact through processes growing within the layer (Fig. 3). In nanofiber layers thicker than 50 micrometers, we did not observe any contact between the cells of the two layers. Nanofiber layers containing the same cell type on both sides were placed above each other and compressed. The cells from proximal layers adhered to the adjacent nanofiber layers. Utilizing this approach, 1mm thick constructs were created from 7 – 10 nanofiber layers containing BMSCs (Fig. 4) or chondrocytes (Fig. 5) on both sides. These implants were mechanically stable and resembled developing mesenchymal tissue; however, the accumulation of cartilage-specific extracellular matrix in the chondrocyte based constructs was very low. The growth of many cell types, such as connective tissue, neural, glial and mesenchymal cells, on nanofibers has been described by many authors. The strong adhesion of the cells to the nanofiber layers is probably mediated by the positive charge that is given to the fibers in an electrostatic field and which attracts biomacromolecules and cells to the surface, similarly to the gas-plasma treated layers of tissue plastic. Using the approach of cultivating cells on Nanospider-produced nanofiber layers and mechanically folding the implants to achieve multiple layers, we were able to construct in vitro two- and three-dimensional tissue equivalents. By changing the types of cells growing on the nanofiber layers, we expect that we will be able to construct specific tissues in vitro, including epithelial tissue or parenchymatous organs in the future. A patent application for this method of three-dimensional tissue construct preparation has been filed in the Czech Republic [2]. Fig. 1. The growth of BMSCs, stained with phalloidin (red) and DAPI (blue), on the surface of a nanofiber layer. Scalebar = 50 µm. Fig. 2. A confocal image reconstruction of BMSCs, stained with phalloidin, growing on a slightly sinuated nanofiber layer. The cells copy the surface of the layer. Scalebar = 50 µm. 73 Fig. 3. BMSCs (red) and chondrocytes (green) growing on the opposite sides of a 10 µm thick nanofiber layer. Scalebar = 50 µm. Fig. 4. A three-dimensional construct, stained with haematoxylin and eosin and resembling loose mesenchymal tissue, created by folding layers containing BMSCs together and connecting them via cell growth. Scalebar = 1 mm. Fig. 5. A three-dimensional construct resembling loose mesenchymal tissue created by folding layers containing chondrocytes together and connecting them via cell growth. Staining for collagen II shows its deposition in the proximity of the cells. Scalebar = 50 µm. Acknowledgements Supported by grants GACR 309/06/1246, 1A8697-5, 2B06130 and AVOZ503905703. References 1. Jirsák, O., et al.: CZ 294274 (B6), WO 2005/024101. 2. Lesný, P., et al.: Czech patent application PV2007-54. 74 Mitochondrial/caspase-9 dependent cell death of cancer cells growing in suspension induced by plant isoquinoline – berberine Silvia Letašiová1, Soňa Jantová1, Ľuboš Čipák2 1 Department of Biochemistry and Microbiology, Institute of Biochemistry, Nutrition and Health Protection, Faculty of Chemical and Food Technology, STU; 2Cancer Research Institute, Slovak Academy of Science, Bratislava, Slovakia, [email protected] Abstract Berberine, an isoquinoline plant alkaloid, is known to generate a wide variety of biochemical and pharmacological effects. In our work, we investigated the cytotoxic effects and the way of death of berberine-treated suspension-growing cells, Ehrlich ascites carcinoma (EAC) cells and human promonocytic U937 cells. Berberine exhibited cytotoxic effect which was in a dose-dependent manner. Morphological evidence of apoptosis, including DNA laddering formation was observed when EAC cells were treated with 10 µg.mL-1 for 48 h and U937 cells with 75 µg.mL-1 of berberine for 24 h. Flow cytometry analysis revealed that berberine induced sub-G0 fraction (apoptotic cells) of EAC and U937 cells. Berberine induced significant changes of ∆ψm in berberine-treated U937 cells. The highest tested concentration of berberine (75 µg.mL-1) induced significant decrease in ∆ψm in U937 cells. The cells treated with berberine concentration of 75 µg.mL-1 induced ROS production in a time- dependent manner. The activation of caspase-9 and caspase-3 were also seen in berberine-treated U937 cells. On the other hand, berberine did not significantly activate the caspase-8. Introduction Berberine, an isoquinoline plant alkaloid widely used in traditional Chinese and Ayurvedic medicine, displays a varied pharmacological and biochemical activities. Berberine has demonstrated significant antimicrobial activity (Amin et al 1969). It can also be used as an antidiarrhea, antihypertension, antiarrhythmias and antiinflammatory agent (Kuo et al 1995, Račková et al 2004). Berberine has been demonstrated to posses anticancer activity; significant cytotoxicity has been reported against some human cancer cell lines, murine leukemia cells and L9 rat glioma cell line (Chen et al 1994; Iizuka et al 2000; Jantová et al 2003). In the present work, we evaluated cytotoxic/antiproliferative activity and the ability of berberine to induce apoptosis using suspension-growing cancer cell lines – Ehrlich ascites carcinoma (EAC) cells and human promonocytic U937 cells. We monitored the ability of berberine to induce apoptotic DNA fragmentation, to elevate the production of reactive oxygen species (ROS), to change the mitochondrial membrane potential and to activate the caspases -3, -8 and -9. Materials and methods Berberine (2,3-methylenedioxy-9,10-dimethoxyprotoberberine chloride, Fig. 1), obtained from Sigma (Slovakia), was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO). Final concentration of DMSO never exceeded 1% in either control or treated samples. Fig. 1. Chemical structure of berberine. 75 Ehrlich ascites carcinoma (EAC) cells and human promonocytic U937 cell line (obtained from the ATCC (Rockville, MD, USA)) cells were cultured in minimal Eagle medium (EAC) and RPMI 1640 medium (U937) supplemented with penicillin G (100 µg.mL-1 ), streptomycin (100 µg.mL-1), Lglutamine (292.3 µg.mL-1), and 10% heat-inactivated fetal calf serum at 37˚C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. The cell growth and viability were assessed by 0.4 % trypan blue staining. The cell growth inhibition assay – the starting inoculums of 3.76 x 105 EAC cells mL-1 and of 2.0 x 105 U937 cells mL-1 in the exponential phase of growth were used. Five milliliters of the suspension were added to Petri dishes (diameter 60 mm). Cell growth and viability were assessed by direct counting of 0.4% trypan blue dye – excluding cells. Cell cycle analysis by flow cytometry – the control and berberine – treated cells (0.5 x 106) were harvested, washed twice with PBS and exposed to 0.1% Triton X-100 in PBS supplemented with RNA-ase (50 µg.mL-1, Sigma) for 25 min at 37˚C. Afterwards, DNA was stained by propidium iodide (50 µg.mL-1, Sigma) for 15 min at 4˚C. Samples were analyzed by a Coulter Epics XL (Beckman Coulter Company, Miami, Florida, USA) flow cytometer with the use of System II software provided by the manufacturer. Excitation was elicited at 488 nm with the Argon laser. Electrophoretic analysis of apoptosis – the control and berberine – treated cells (1x106) were harvested, washed with PBS and then lysed in 100 µL of solution (10 mM TRIS, 10 mM EDTA, 0.5% Triton X-100) supplemented with proteinase K (1 mg.mL-1). Samples were then incubated at 37˚C for 1 h and heated at 70˚C for 10 min. Following lysis, RNA-ase (200 µg.mL-1) was added and repeated incubation at 37˚C for 1 h followed. The samples were subjected to electrophoresis at 40 V for 3 h in 2% (w/v) agarose gels complemented with ethidium bromide (1 µg.mL-1). Separated DNA fragments (DNA ladders) were visualized using a UV transilluminator (254 nm, Ultra-Lum Electronic UV Transilluminator, USA). Detection of mitochondrial membrane potential – the changes in mitochondrial membrane potential were determined using 3,3´-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6(3)) by flow cytometry. Detection of reactive oygen species (ROS) – level of ROS was examined using 2,7dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) by flow cytometry and fluorescence microscopy. Caspase-3, caspase-8 and caspase-9 activities assays – the caspase-3, -8 and -9 activities were measured according to the manufacturer´s protocol (CaspACETM Assay System, Promega Corporation, USA). Results and discussion In this study we tested the cytotoxic/antiproliferative activity of berberine on EAC and U937 cells in vitro. The proliferation of EAC and U937 cells during permanent exposure to berberine concentrations ranging from 0.01 to 100 µg.mL-1 is shown in Figure 2. After 12 h (EAC cells) and 24 h (U937 cells) of culturing, the highest tested concentrations (100, 50 and 10 µg mL-1 for EAC cells and 75 µg.mL-1 for U937 cells) had an acute cytotoxic effect manifested by the decrease of viable EAC and the total inhibition of cell proliferation of U937 cells number. After 24 h, part of the cell population proliferated, but after 36 and 48 h of culturing, viable EAC cell number decreased almost to zero. Berberine at concentration of 50 µg.mL-1 for U937 cells induced a delayed cytotoxic effect. After 24 h, a part of the cell population proliferated, but after 48 h, the division of the U937 cells was nearly arrested. The antiproliferative effect of berberine at the next tested concentrations (1.0, 0.1 and 0.01 µg.mL-1 for EAC cells and 25, 10 and 5 µg mL-1 for U937 cells) was directly proportional to the concentration and the time of exposure. Next, the effect of berberine on cell cycle profile of EAC and U937 cells was examined. The flow cytometry revealed that berberine had no effect on the cell cycle profile of EAC and U937 cells. On the other hand, sub-G0 fraction was detected (data not shown). The ability of berberine to induce apoptotic cell death was assessed by the electrophoretic analysis of internucleosomal fragmentation of DNA. Berberine induced apoptotic DNA fragmentation when EAC cells were treated with 10 µg mL-1 for 48 h and when U937 cells were treated with 75 µg.mL-1 for 24 h and 75 and 50 µg.mL-1 for 48 h (data not shown). The mitochondrial membrane potential changes (∆ψm) as markers of mitochondrial function are often associated with apoptosis. To determine the impact of berberine on ∆ψm the cells were treated with 50 and 75 µg mL-1 of berberine for 24 h, and analyzed by flow cytometry. As it is shown in Figure 3 berberine induced significant changes of ∆ψm in U937 cells. The highest tested concentration of berberine induced significant decrease in ∆ψm in more than 90% of U937 cells. 76 Because reactive oxygen species (ROS) play an important role in apoptosis and changes of mitochondrial membrane potential are considered to be involved in ROS production, next we investigated the ability of berberine to generate ROS using fluorescence sensitive probe (H2DCF-DA) that detects various active oxygen species. The cells were exposed to 75 µg mL-1 of berberine for various time (0 - 8 h) and analyzed for presence of ROS by fluorescence microscopy. As it is presented in Figure 4 the generation of ROS due to presence of berberine was time-dependent. After 30 min of incubation, berberine induced significant increase in level of ROS, with the peak between 90 - 120 min. In 2 hours the level of berberine-generated ROS decreased to the level of ROS in untreated cells, with the complete loss of ROS-generated fluorescence after 4 hours. To address the particular role of caspases on berberine-induced apoptosis, we used a general and potent caspase inhibitors, namely Ac-DEVD-pNA (caspase-3), Ac-LETD-pNA (caspase-8) and Ac-LEHD-pNA (caspase-9). The time-dependent spectrophotometric analysis of caspase-3 activity in U937 cells treated with 75 µg mL-1 of berberine is illustrated in Figure 5. As it is presented, berberine induced time-dependent increase in caspase-3 activity (Figure 5B). Stable increase in caspase-3 activity was observed up to 6 h, then caspase activity slightly decreased. The time-dependent luminometric analysis of caspase-8 and caspase-9 activity in U937 cells treated with 75 µg mL-1 of berberine is illustrated in Figure 5. As it is shown, the value of caspase-9 activity was comparable to caspase-9 activity of U937 cells induced by 180 µg mL-1 of cisplatin (positive control for caspase-9 activation) (Figure 5A). Stable increase in caspase-9 activity was observed up to 30 min, then activity slightly decreased. Contrary to the above results, berberine does not significantly activate the caspase-8 (Figure 5C), as the minimal difference between untreated and berberine-treated cells was observed. A B 4500000 4000000 3500000 control 0.01 0.1 1 10 50 100 Number of cells 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 12 24 36 48 60 Time (h) Fig. 2. Cell proliferation of EAC (A) and U937 (B) cells in response to berberine in the course of 48 h. Concentration of berberine is µg.mL-1. Each point represents the mean ± SD of three experiments. Fig. 3. Detection of mitochondrial membrane potential changes by flow cytometry using DiOC6(3) in berberine-treated U937 cells. Data represent mean values±SD from three independent experiments. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 77 A B Fig. 4. Monitoring of the reactive oxygen species production using H2DCF-DA by flow cytometry (A) and fluorescence microscopy (B) in U937 cells treated with 75 µg.mL-1 of berberine. Data repre-sent mean values ± SD from three independent experiments. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. A B C Fig. 5. Effect of berberine on activation of caspase-9 (A), caspase-3 (B) and caspase-8 (C) in U937 cells treated with berberine at concentration of 75 µg.mL-1 for 24 h (for caspase-3) or 20 h (for caspase-8 and caspase-9). Data represent mean values ± SD from three independent experiments. PC, positive control (6 µM cisPt); nc, negative control (U937 cells treated with solvent – DMSO); berb, U937 cells treated with berberine-concentration of 75 µg.mL-1. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Conclusions Berberine induced different cytotoxic effects in EAC and U937 cells which were concentration- and time-dependent. Cell cycle analysis and agarose gel electrophoresis confirmed that berberine induced apoptosis in both tested cell lines. In U937 cells berberine induced ROS production in a time-dependent manner and decrease in ∆ψm which correlates with the activation of caspase-9 and caspase-3. The data presented here suggests that berberine induces apoptosis in U937 cells through a mitochondrial/caspase-9 dependent pathway. Acknowledgment This study was supported by Science Grant Agency 1/4305/07 and Science and Technology Assistance Agency under contract No. APVT-20-007304. 78 References 1. Amin, A.H., Subbahaiah, T.V., Abbasi. K.M.: Berberine sulfate: antimicrobial activity, bioassay, and mode of action. Can J Microbiol. 15: 1067–1076, 1969. 2. Chen, K.I., Hao, D.M., Liu, Z.X., Chen, Y.C., You, Z.S.: Effect of berberine alone or in combination with argon ion laser treatment on 9L rat glioma cell line. Chin Med J. 107: 808–812, 1994. 3. Iizuka, N., Miyamoto, K., Okita, K., Tangoku, A., Hayashi, H., Yosino, S., Abe, T., Morioka, T., Hazama S., Oka, M.: Inhibitory effect of Coptidis Rhizoma and berberine on the proliferation of human esophageal cancer cell lines. Cancer Lett. 148(1): 19–25, 2000. 4. Jantová, S., Čipák, L., Čerňaková, M., Košťálová, D.: Effect of berberine on proliferation, cell cycle and apoptosis in HeLa and L1210 cells. J. Pharm. Pharmacol. 55: 1143–1149, 2003. 5. Kuo, C.L., Chou, C.C., Yung, B.Y.M.: Berberine complexes with DNA in the berberine-induced apoptosis in human leukemic HL-60 cells. Cancer Lett. 93: 193–200, 1995. 6. Račková, L., Májeková, M., Košťálová, D., Štefek, M.: Antiradical and antioxidant activities of alkaloids isolated from Mahonia aquifolium. Structural aspects. Bioorg Med Chem. 12: 4709–4715, 2004. 79 Účinok vitamínu C na etanolom indukované zmeny fosfolipidovej monovrstvy Tomáš Málek1, Martin Kopáni1, Martin Weis2, Ľuboš Danišovič3 1 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, Ústav patologickej anatómie; 2Slovenská technická univerzita, Fakulta elektrotechniky a informatiky, Katedra fyziky; 3Univerzita Komenského, Lekárska fakulta, Ústav lekárskej biológie a genetiky, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Vplyv molekúl etanolu na vlastnosti membrán je predmetom mnohých štúdií. Cieľom práce je vyšetrovanie štruktúrnych, elektrických a mechanických vlastností dipalmitoylfosfátidylcholínovej (DPPC) monovrstvy nachádzajúcej sa na povrchu subfázy metanol – voda a etanol – voda po pridaní vitamínu C. Pri monovrstve DPPC na subfáze etanol – voda dochádza k adsorpcii/ absorpcii molekúl etanolu na fosfátocholínovú (PO2) skupinu molekuly DPPC. Po pridaní vitamínu C do roztoku etanol – voda pozorujeme, že molekuly vitamínu C ovplyvňujú interakciu molekúl etanolu s molekulami monovrstvy DPPC. Otázkou zostáva, či by sa účinok vitamínu C prejavil pri fyziologickej funkcii membrán in vivo v koncentráciách blízkych koncentrácii v plazme alebo interstíciu. Úvod Mechanizmy toxického účinku etanolu pri jeho chronickom príjme boli predmetom mnohých štúdií. Etanol je výrazným induktorom oxidačného stresu. Protektívne účinky antioxidantov v tomto kontexte sa potvrdili v mnohých štúdiách (Ďuračková et al., 1993). Vitamín C je pre človeka esenciálnou látkou. Je potrebný na syntézu proteínov. V práci ukazujeme iný účinok vitamínu C voči toxickým účinkom etanolu. Cieľom práce je sledovanie štruktúrnych a mechanických zmien monovrstvy dipalmitoyl-fosfatidylcholínu (DPPC) na subfáze etanol – voda po pridaní vitamínu C. Materiál a metódy Na meranie sme použili rovnaké meracie zariadenie ako v práci Weis et al. (2006). Koncentrácia vitamínu C je 100mM/l. Výsledky a diskusia Pri monovrstve DPPC na subfáze etanol – voda dochádza k adsorpcii/ absorpcii molekúl etanolu na fosfátocholínovú (PO2) skupinu molekuly DPPC (obr.1). Po pridaní vitamínu C do roztoku etanol – voda pozorujeme, že molekuly vitamínu C ovplyvňujú interakciu molekúl etanolu s molekulami monovrstvy DPPC (resp. PO2 skupinou). Obr. 1. Etanol sa viaže na fosfátocholínovú skupinu molekuly DPPC, čím vytláča vodu z jej pozície (detail vpravo). V – molekuly vody, E – molekuly etanolu, P – fosfátocholínová skupina molekuly DPPC. 80 Výsledky merania ukazujú, že pri monovrstve DPPC na subfáze etanol – voda + vitamín C je plocha molekuly DPPC väčšia ako pri monovrstve DPPC na subfáze etanol – voda. Z grafu závislosti modulu pružnosti monovrstvy DPPC na vode, etanol + voda a etanol – voda + vitamín C sme zistili nárast modulu pružnosti DPPC monovrstvy na subfázach etanol - voda a etanol – voda + vitamín C. Výsledkom interakcie monovrstvy DPPC s molekulami vody a etanolu môže byť zmena elektrického náboja povrchu membrány, mechanických vlastností, permeability a difúzie iónov cez membránu. Patra et al. (2006) predpokladajú, že alkohol mení štruktúru membrány. Alkohol spôsobuje, že proteíny membrány vytvárajú nevhodnú štruktúru, ktorá zabraňuje vykonávať ich fyziologickú funkciu. Klemm et Williams (1996) zistili, že etanol mení usporiadanie molekúl vody okolo fosfátocholínovej skupiny. Nadviazaním molekúl etanolu na túto skupinu sa molekuly vody posunú a vytvoria nahromadenie okolo alkylovej skupiny alkoholu Chiou et al. (1992) pozorovali pomocou FTIR spektroskopie, že po pridaní etanolu do roztoku reverzných micél tvorených DPPC je časť vody nadviazaná vodíkovými väzbami na molekuly DPPC nahradená molekulami etanolu. Autori konštatujú, že interakcia alkoholov s fosfátocholínovou skupinou lipidov membrán spôsobuje slabnutie interakcie membrána – voda a destabilizuje membránu. Etanol spôsobuje dehydratáciu biomembrán. Vitamín C môže spôsobiť dva javy: a) molekuly vitamínu C interagujú s molekulami DPPC alebo b) molekuly vitamínu C sa prednostne viažu na molekuly etanolu a tak zabraňujú nadväzovaniu molekúl etanolu na molekuly DPPC. Predpokladáme, že molekuly vitamínu C ovplyvňujú molekuly DPPC. Molekuly vitamínu C sa adsorbujú k monovrstve tvorenej molekulami DPPC a zabraňujú nadväzovaniu molekúl etanolu. Z výsledkov meraní plochy molekuly DPPC predpokladáme, že molekuly vitamínu C pôsobia proti zmenšovaniu rozmeru obalu vytvoreného molekulami vody okolo fosfátocholínovej skupiny molekuly DPPC. Mechanické vlastnosti bunkovej membrány hrajú dôležitú úlohu v mnohých biologických procesoch. Pružnosť membrány hovorí o jej mechanickej pevnosti. Mechanické vlastnosti sú do veľkej miery ovplyvnené prítomnosťou molekúl etanolu, aj keď sa tieto molekuly priamo neabsorbujú do monovrstvy. Zo získaných výsledkov merania pružnosti predpokladáme postupné zvyšovanie tuhosti membrány. Vitamín C výrazne nezmenšuje tuhosť DPPC monovrstvy po adsorpcii molekúl etanolu. Monovrstva tvorená molekulami DPPC na vode je pružnejšia a flexibilnejšia voči vonkajším mechanickým vplyvom ako monovrstva DPPC na subfáze etanol – voda + vitamín C. Podľa vyššie uvedených výsledkov uvažujeme o vplyve etanolu in vivo na funkciu biomembrán. Otázkou však zostáva, do akej miery má etanol vplyv na fyziologickú funkciu biomembrán in vivo, najmä v koncentráciách blízkych koncentrácii v plazme, respektíve v interstíciu. Do akej miery sa môžu prejaviť jeho dehydratačné vlastnosti v živých systémoch? Ako model pre úvahu môžu slúžiť práce zaoberajúce sa mechanizmom účinku celkových anestetík. Lipidová teória o mechanizme účinku celkových anestetík a aj alkoholov predpokladá zmeny vo funkcii biomembrán. Ak by mal etanol výraznejšie účinky na biomembrány, mohlo by ísť o jeden z mechanizmov toxicity etanolu, ešte pred jeho oxidáciou na acetaldehyd. Ako bolo uvedené vyššie, dehydratáciou biomembrány sa menia jej fyzikálne vlastnosti (permeabilita, difuzibilita) a biologické vlastnosti vychádzajúce zo zmeny vo fyzikálnych vlastnostiach (zmeny funkcie proteínov). Závery Z nameraných hodnôt usudzujeme, že protektívny účinok vitamínu C môže spočívať aj v súvislosti inej ako antioxidačnej. Domnievame sa, že môžeme očakávať analogický efekt aj v podmienkach in vivo a in vitro. V našom experimente bol použitý vitamín C v prostredí bez metabolizmu, ktorým by sa produkovali reaktívne radikály kyslíka. Neuplatňovali sa antioxidačné účinky vitamínu C v relevantnej miere. Otázkou zostáva, či by sa účinok vitamínu C prejavil pri fyziologickej funkcii membrán in vivo v koncentráciách blízkych koncentrácii v plazme alebo interstíciu. Poďakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu vedy a vývoja č. APVT-20-003104. 81 Použitá literatúra 1. Durackova, Z., Bergendi, L., Liptakova, A., Muchova, J.: Free radicals derived from oxygen, and medicine. Bratisl Lek Listy. 94: 419–434, 1993. 2. Chiou, J.S., Krishna, P.R., Kamaya, H., Ueda, I.: Alcohols dehydrate lipid membranes: an infrared study on hydrogen bonding. Biochim Biophys Acta. 1110: 225–233, 1992. 3. Klemm, W.R., Williams, H.J.: Amphiphilic binding site of ethanol in reversed lipid micelles. Alcohol. 13: 133–1388, 1996. 4. Patra, M., Salonen, E., Terama, E., Vattulainen, I., Faller, R., Lee, BW., Holopainen, J., Karttunen, M.: Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophys J. 90: 1121–1135, 2006. 5. Weis, M., Kopan,i M., Jakubovsky, J., Danihel, L.: Ethanol and methanol induced changes in phospholipid monolayer. Appl Surf Sci. 253: 2425–2431, 2006. 82 EGFR a onkológia? Peter Michalka Interné oddelenie, Národný onkologický ústav,Bratislava, Slovenská republika, [email protected] Abstrakt Nové terapeutické možnosti, ako napríklad ovplyvnenie EGFR receptora, naznačujú možnú cestu v liečbe malígnych chorôb. EGFR (erbB1, receptor pre epidermový rastový faktor) je jeden zo štyroch membránových proteínov známych ako HER1-4, ktorý hrá kľúčovú úlohu v homeostáze normálnych tkanív a fetálneho vývaja organizmov. Zmeny v tejto rodine receptorov vyúsťujú ku vzniku nádorových chorôb. U karcinómu pľúc ide o bodovú mutáciu a u karcinómu prsníka dochádza k amplifikácii. EGFR je aktivovaný rastovými faktormi (EGF, TGF-α) – ligandmi, ktoré sa viažu na extracelulárnu doménu receptora. Pri aktivácii dochádza k autofosforylácii intracelulárnej tyrozínkinázovej domény. Tím je zahájená signálna kaskáda, ktorou je prenesený signál až do jadra. V jadre sa prenesená informácia prejaví aktiváciou transkripcie cieľových génov. Liečba založená na inhibícii EGFR dokáže podľa doterajších výskumov inhibovať prenos proliferačných signálov. Medzi ovplyvnenia EGFR patrí použitie monoklonových protilátok voľných alebo s naviazanými toxínmi, či rádionuklidom, použitie tyrozínkinázových inhibítorov, antisense oligonukleotidov alebo protinádorové vakcíny. V úvahe je aj génová terapia. V súčastnosti sú k dipozícii najmenej 4 anti-EGFR monoklonové protilátky. Ovplyvnenie EGFR receptora v liečbe malígnych chorôb nazývame ako cielenú liečbu. Tieto nové terapeutické možnosti naznačujú možnú cestu v liečbe nádorových chorôb. Príchod neustále nových informácií z oblasti molekulovej biológie a patogenézy nádorov nám naznačenú cestu začínajú pomaly dláždiť a spriechodňovať. EGFR (erbB1, receptor pre epidermový rastový faktor) je jeden zo štyroch proteínov skupiny membránových proteínov známych ako HER1-4. Ďalšie proteíny sú erbB2 (HER2/neu), erbB3 (HER3) a erbB4 (HER4). Proteíny obsahujú extracelulárnu doménu a intracelulárnu kinázovú časť. HER3 proteín je defektný, a preto potrebuje na dimerizáciu iného člena zo skupiny HER. HER2 nemá prirodzený ligand a zvyčajne podlieha heterodimerizácii, ale môže aktivovať aj homodimerizáciu (vo vysokých koncetráciách) aj pri absencii ligandu. EGFR je transmembránový proteín ako už bolo povedané s extracelulárnou doménou, transmembránovým lipidovým segmentom a intracelulárnou tyrozínkinázovou doménou. Tento receptor je exprimovaný na všetkých epitelových bunkách a mnohých iných bunkách. EGFR ako súčasť rodiny epidermových receptorov rastových faktorov, hrá kľúčovú úlohu v homeostáze normálnych tkanív a fetálneho vývaja organizmov. Zmeny v tejto rodine receptorov sú sprevádzané vznikom nádorových chorôb. Gén kódujúci EGFR patrí medzi protoonkogén sídliaci na chromozóme 7q22. Protoonkogény sú gény, ktoré hrajú kľúčovú úlohu v kaskáde odovzdávania signálov dôležitých pre proliferáciu, adhezivitu, migráciu a dĺžku života buniek. Prerušenie tohto jemne ladeného systému odovzdávania signálov môže viesť k malígnej transformácii buniek. Medzi produkty protoonkogénov patria: rastové faktory, receptory pre rastové faktory, produkty potrebné pre transdukciu mitogénnych signálov z bunkovej membrány cez cytoplazmu do bunkového jadra. Modifikáciu alebo amplifikáciu protoonkogénov môžu zapríčiniť genetické zmeny vyvolané účinkom chemických látok, radiáciou alebo vírusmi. Na zmenenú expresiu protoonkogénu stačí zmena v jednej alele príslušného génu. Zmeny v géne môžu spôsobiť mutácie (najčastejšie bodové), amplifikácia protoonkogénu alebo chromozómové translokácie. U karcinómu pľúc ide o bodovú mutáciu (EGFR – erbB1) a u karcinómu prsníka dochádza k amplifikácii (HER 2/neu – erbB2). Bodovou mutáciou EGFR – erbB1 dochádza ku vzniku abnormálneho (skráteného) EGF receptora a ten je zodpovedný za tvorbu abnormálneho signálu pre proliferáciu bunky. Aktivácia mutovaného HER1/EGFR iniciuje proliferáciu nádorových buniek a rezistenciou k apoptóze. HER1/EGFR je pri karcinómoch často dysregulovaný. Zvýšená expresia HER1/EGFR sa spája so zlou prognózou, lebo koreluje s progresiou nádoru do potencovaného 83 malígneho fenotypu. Z viac ako 200 štúdií v ktorých bol hodnotený vzťah expresie EGFR k prognóze vyplýva, že u karcinómu hlavy a krku, vaječníkov, cervixu, močového mechúra a karcinómu pažeráku je výrazne zvýšená expresia EGFR spojená s kratšou dobou do relapsu i kratším celkovým prežívaním. U karcinómu žalúdka, prsníka, endometria a kolorektálneho karcinómu je prognóza na základe expresie EGFR menej jednoznačná. U karcinómu hlavy a krku, cervixu, vaječníkov a močového mechúra bol EGFR potvrdený aj ako nezávislí prognostický faktor. Existuje taktiež spojenie medzi zvýšenou expresiou receptorov rodiny EGFR a rezistencii k hormonálnej terapii, chemoterapii a rádioterapii. EGFR je aktivovaný rastovými faktormi (EGF, TGF-α) – ligandmi, ktoré sa viažu na extracelulárnu doménu receptora. Pri aktivácii dochádza k autofosforylácii intracelulárnej tyrozínkinázovej domény. Táto fosforylácia vedie k dimerizácii receptorov. Tím je zahájená signálna kaskáda, v ktorej je rada na seba nadväzujúcich fosforylácii, a takto je prenesený signál až do jadra. V jadre sa prenesená informácia prejaví aktiváciou transkripcie cieľových génov. V kaskáde intracelulárnych signálov pri aktivácii EGFR je aj účasť proteínkináz MAPK a P13K/Akt, ktoré vedú k proliferácii, rezistencii k apoptóze a zvýšenej tendencii k angiogenéze. V posledných prácach sa uvádza, že mutácie KRAS môžu byť prediktývnym faktorom úspechu alebo neúspechu liečby tzv. cielenou liečbou. Tento vzťah bol najlepšie pozorovaný u kolorektálneho karcinómu, kde mutácia KRAS predurčuje vo väčšom percente neúspech cielenej liečby a kratšie prežívanie pacientov. Preto v španielsku týmto pacientom nie je ani cielená liečba ponúknutá. U karcinómu pľúc tento vzťah zatiaľ nebol pozorovaný resp. potvrdený. Iné gény môžu slúžiť ako biomarker, ktorý môže predurčiť typ liečby a prežívanie pacientov. Ako napríklad gén BRCA1, ktorý sa spája s karcinómom prsníka. Najnovšie práce poukazujú na to, že vysoká expresia BRCA1 u nemalobunkového karcinómu pľúc poukazuje na zlú odpoveď tumoru pri liečbe platinovými derivátmi. Títo pacienti lepšie odpovedajú ak je v liečbe Taxán. Taktiež poukazuje na kratšie obdobie do recidívy tumoru a vyššiu úmrtnosť. Liečba založená na inhibícii EGFR dokáže podľa doterajších výskumov inhibovať prenos proliferačných signálov. Preto vývoj liekov tejto skupiny dodáva nádej v liečbe onkologických chorôb. Medzi ovplyvnenia EGFR patrí použitie monoklonových protilátok voľných alebo s naviazanými toxínmi, či rádionuklidom, použitie tyrozínkinázových inhibítorov, antisense oligonukleotidov alebo protinádorové vakcíny. V úvahe je aj génová terapia. V súčastnosti sú k dipozícii najmenej 4 anti-EGFR monoklonové protilátky. Výsledky klinickej štúdie I. fázy však boli sklamaním lebo pri použití myších protilátok sa u pacientov vytvárali protilátky HAMA (human anti-mouse antibody), ktoré myšie protilátky neutralizovali. Následne bola vytvorená chimerická monoklonová protilátka C225 (cetuximab). Výhodou celkovo alebo čiastočne humanizovaných protilátok je dlhší polčas rozpadu, minimálny vývoj protilátok proti monoklonovým protilátkam (HAMA) a výrazne zlepšená aktivácia imunitného systému pacienta. Výhodou liečby monoklonovými protilátkami je nulová hematologická a gastrointestinálna toxicita. U pokročilých chorôb sa monoklonovými protilátkami dosahuje často stabilizácia. Do tejto skupiny patrí napr. Cetuximab. Ako už bolo spomínané monoklonové protilátky môžu byť využité ako nosiče rádioaktívneho izotopu alebo toxínu. Po naviazaní protilátka dôjde k aktivácii receptora a zároveň je internalizovaný toxín, ktorý nádorovú bunku usmrtí. V prípade naviazaného rádioaktívneho izotopu je zdroj žiarenia v priamom kontakte s nádorovou bunkou a môže ju zničiť. Tieto protilátky okrem liečebného účinku, môžu byť využité aj na diagnostiku. Predklinicky sa overujú možnosti využitie imunotoxínov naviazaných na monklonovú protilátku proti EGFR. Ako imunotoxín sa skúša pseudomonádový exotoxin A. Vzhľadom k nevyhnutnej internalizácie toxínu sú využívané fragmenty protilátky (variabilná časť ťažkého a ľahkého reťazca protilátky), na ktorú je exotoxín naviazaný. Priechod bunkovou membránov je takto uľahčený, a takto konštruovaný toxín má výraznú protinádorovú aktivitu. Pilotné štúdie sa robia u karcinómov pľúc. Využiteľnosť imunotoxínov je však často obmedzená z dôvodu malého účinku a výraznejšej toxicity. Behom posledného desaťročia bolo vytvorené veľké množstvo inhibítorov blokujúcich tyrozínkinázovú aktivitu EGFR. Malé molekuly týchto aktívnych látok sa kompetitívne viažu na väzobné miesto pre makroergický fosfát ATP na intracelulárnu doménu EGF receptora. Takto dôjde k zablokovaniu fosforylácie a prenosu signálu. V tejto skupine sú perorálne lieky s veľmi dobrou toleranciou. Nežiadúcimi účinkami sú hnačky a kožná toxicity. Ďalšie analýzy štúdií ukázali, že bol vyšší efekt u žien, u japonských pacientov a pri histologickom type bronchoalveolárny karcinóm. Do tejto skupiny liečiv patrí Cefitinib (ZD1839, Iressa), Erlotinib (OSI-774, Tarceva, CP-358). 84 Antisense oligonukleotidy ovplyvňujúce expresiu receptoru pre epidermový rastový faktor sú krátke jednoreťazové sekvencie oligonukleotidov komplementárnych ku známej sekvencii báz cieľovej mRNA. Zmyslom týchto látok je znížiť expresiu určitého génu. Ako EGFR, tak aj jeho ligandy (TGF-α, EGF) môžu byť cielom tejto liečebnej stratégie. Z predklinických výskumov in vitro vyplýva, že použitie EGFR antisense oligonukleotidov vedie ku zníženiu expresie EGFR, ihibície proliferácie nádorových buniek a indukcii apoptózy. Tento účinok môže byť zosilnený súčasným použitím cytostatík. Uplatnenie v klinickej praxi však tieto látky zatiaľ nenašli. Záverom možno povedať, že liečba ovplyvnením EGFR prináša nádej pre pacienta a začína písať nové kapitoly liečby a prežívania pacientov. Novú nádej v liečbe hrá aj molekulová biológia a zdá sa, že onedlho za pomoci metód molekulovej biológie bude môcť ušiť liečbu na mieru pre každého pacienta. Použitá literatúra 1. Adam, Z., Vorlíček, J., Kostíková, J. et al: Obecná onkológia a podporná liečba. Vydavateľstvo Grada, Praha, 2003. 2. Variola, R.: Čo dnes vieme o chemoterapii pokročilého nemalobunkového karcinómu pľúc. Vydavateľstvo Osveta, Martin, 2005. 3. Chustecka, Z.: BRCA1 Expression May Guide Chemotherapy for NSCLC. Conference Coverage, Medscape Hematology-Oncology, September 2007. 4. Dacic, S., Flanagan, M., Cieply, K., Ramalingam, S., Luketich, J., Belani, Ch., Yousem, S.A.: Significance of EGFR Protein Expression and Gene Amplification in Non-Small Cell Lung Carcinoma. Journal Article, Am J Clin Pathol, June 2006. 5. Kelly, K.: Is It Time to Consider the Implications of Sequencing EGFR-Targeted Therapy With Other Targeted Agents? www.medscape.com, Slide/Lecture Presentation, September 2007. 6. Mladosievičová, B.: Patofyziológia nádorových chorôb. In: Hulín et al: Patofyziológia, Slovak Academic Press, Bratislava: 120-137, 1998. 7. Tsuta, K., Takano, T., Fukui, T., Yokozawa, K., Sakamoto, H., Yoshida, T., Maeshima, A.M., Shibata, T., Furuta, K., Ohe, Y., Matsuno, Y.: Detection of EGFR Mutations in Archived Cytologic Specimens of NonSmall Cell Lung Cancer Using High-Resolution Melting Analysis. Journal Article, Am J Clin Pathol, October 2006. 8. www.cancernetwork.com 85 Polymorfizmus HLA-DQB1 pri oligoartritickej forma juvenilnej idiopatickej artritídy (JIA) Zuzana Párnická1, Eva Košková2, Ivana Shawkatová1 1 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska Fakulta, Imunologický ústav, Bratislava; 2Národný ústav reumatických chorôb, Piešťany, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Cieľom práce bolo porovnanie alelovej frekvencie lokusov HLA DQB1 u pacientov trpiacich oligoartritickou formou juvenilnej idiopatickej artritídy (JIA) s alelovou frekvenciou v zdravej slovenskej populácii. Vyšetrovaný súbor predstavovalo 30 pacientov trpiacich oligoartritickou formou JIA. Diagnóza bola stanovená na podklade kritérií ILAR (The International League of Associations for Rheumatology). Kontrolnú populáciu predstavoval súbor 143 osôb. Autori na určenie HLA alel použili metódu PCR-SSP (polymerázová reťazová reakcia so sekvenčne špecifickými primermi). Na štatistické vyhodnotenie použili Fisherov exaktný test. Vo vyšetrenom súbore sme zaznamenali vyšší výskyt aliel HLA-DQB1* 04 a *05. Výskyt HLA-DQB1* 02 bol výrazne nižší v porovnaní s kontrolou. Úvod Podľa klasifikácie ILAR, juvenilná idiopatická artritída (JIA) predstavuje ochorenie detského veku (tj. začína pred 16. rokom života ) neznámej etiológie, ktoré charakterizuje artritída pretrvávajúca viac ako 6 týždňov. Pacienta zaraďujeme do jedného zo siedmych subtypov prípadne do skupiny „nezaradených“ šesť mesiacov po stanovení diagnózy JIA1. Tieto podskupiny sa líšia počtom postihnutých kĺbov na začiatku ochorenia, resp. ďalšími klinickými a laboratórnymi nálezmi2. Na genetickej determinácii JIA sa podieľajú aj gény hlavného histokompatibilného komplexu (HLA). Gény HLA predstavujú najpolymorfnejší systém ľudského genómu. Cieľom našej práce bolo porovnanie alelovej frekvencie lokusov HLA DQB1 u pacientov trpiacich oligoartritickou formou JIA s alelovou frekvenciou v zdravej slovenskej populácii4. Tieto výsledky v diskusii porovnávame s dátami získanými z iných svetových pracovísk. Spojitosť medzi HLA a JIA je známa už od sedemdesiatych rokov 20. storočia3. Na Slovensku táto téma v súvislosti s HLA alelami triedy II nebola komplexne spracovaná. Prehľad asociácií HLA a JIA nájdeme napr. v prácach Bošáka2, Černej, Alberta a Scholza1, Thomsonovej8. Uvádza sa, že oligoartritická forma (pauciartikulárna forma) JIA je asociovaná s HLA-DQB1* 0301 a 0402. Materiál a metódy Vyšetrili sme súbor 30 pacientov trpiacich oligoartritickou formou juvenilnej idiopatickej artritídy. Chorí sú v zdravotníckej starostlivosti NÚRCH v Piešťanoch. Vek pacientov sa pohyboval od 4 do 16 rokov. Diagnóza bola stanovená na podklade kritérií ILAR. Kontrolnú populáciu predstavoval súbor 143 zdravých nepríbuzných osôb5. Metódy DNA-typizácie majú na pracoviskách Lekárskej fakulte UK bohatú tradíciu a viedli k vyriešeniu problémov, ktoré by boli inými metódami nemožné alebo len ťažko realizovateľné, napr. v práci Repiskej a kol.8. Z dôvodov veľkej presnosti HLA alely (určovali metódou PCR-SSP (polymerázová reťazová reakcia so sekvenčne špecifickými primermi)7; sondy pochádzali z firmy Olerup SSPAB, Švédsko. Štatistické vyhodnotenie sme robili Fisherovým exaktným testom. Výsledky a diskusia Pri určovaní DQ-alel sme zistili zvýšenú frekvenciu HLA-DQB1*04 (6,7% u pacientov s JIA oproti 4,5% v zdravej populácii, p = 0,5129, odds ratio /OR/ = 1,44) a HLA-DQB1*05 (28% u pacientov s JIA oproti 19,6% v zdravej populácii, p = 0,1609, odds ratio /OR/ = 1,44) (Tab. 1). Výrazne znížená bola frekvencia HLA-DQB1*02 (13% u pacientov s JIA oproti 21% v zdravej populácii, p = 0,2, odds ratio /OR/ = 0,63). Výsledky odzrkadľujú tendenciu naznačenú aj v prácach 86 iných autorov (3 a 9). Žiaden z výsledkov Fisherovho testu nedosiahol signifikantnú úroveň, ale naznačil trend, ktorý je charakteristický aj v iných populáciách. HLA- DQ sú vo väzbovej nerovnováhe s alelami HLA-DRB1. Znamená to, že z rozdielov frekvencií medzi chorými a kontrolou sa nedá usúdiť, či asociácia s DQ je primárna alebo je iba odrazom asociácie s DR. Objasnenie tejto skutočnosti si bude vyžadovať ďalší výskum. HLA-DQB1 poč. Frekvencia a=60 *0201-3 8 f pac. 0,1333 f kontr. 0,2098 Fisher (p)2-str. OR 0,2085 0,6303 *0301-13 20 0,3333 0,3426 1 0,9738 *0401-2 4 0,0667 0,0455 0,5129 1,444 *0501-4 17 0,2833 0,1958 0,1609 1,444 *0601-20 11 0,1833 0,2063 0,7258 0,8827 Tab.1. Frekvencia aliel HLA-DQB1 slovenských pacientov s oligoartritickou formou JIA. Závery Naše výsledky sú v zhode s výsledkami autorov z iných krajín. Najvyššia bola frekvencia aliel HLA-DQB1*04 a najnižšia HLA-DQB1*02. Poďakovanie Práca bola podporená grantom VEGA1/3437/06. Použitá literatúra 1. Albert, E.D., Scholtz, S.: Juvenile arthritis: genetic update. Bailliére s Clin Reumatol. 12: 209–18, 1998. 2. Bardfeld, R.: Juvenilní idiopatická artritida. In: Rovenský, J., Pavelka, P. (eds.) Klinická reumatológia. Osveta, Martin. 253–264, 2000. 3. Bošák, V.: Imunogenetika reumatických chorôb. In: Rovenský, J. (ed.) Reumatológia v teórii a praxi IV. Osveta, Martin. 191–209, 1996. 4. Bošák, V.: HLA- systém a jeho význam v revmatologii. In: Pavelka, K., Rovenský, J. Klinická revmatologie. 110, 2003 5. Buc, M., Nyulassy, Š., Štefanovič, J., Michalko, J., Mozolová, D.: HL-A system and juvenile rheumatoid arthritis. Tissue Antigens. 4: 395–397, 1974. 6. Fazekašová, H., Shawkatová, I., Buc, M., Ferenčík, S.: Frekvencia alel lokusov HLA-DRB1 a HLA-DQB1 v slovenskej populácii. Bratisl lek Listy. 99(11): 601–604, 1998. 7. Olerup, O., Zetterquist, H.: HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matchingin cadaveric transplantation. Tissue Antigens. 39: 225–235, 1992. 8. Repiská, V., Vojtaššák, J., Danihel, Ľ., Korbeľ, M., Böhmer, D., Malová, J., Zábudlá, K.: Application of DNA polymorphism analysis to detection of complete hydatidiform mole origin. Biologia. 58(3): 403–408, 2003. 9. Thomson, W., Donn, R.: Genetic epidemiology: Juvenile idiopathic arthritis genetics- What´s new? What´s next? Arthritis Res. 4(5): 302–306, 2002. 87 Molekulárna a biochemická podstata peroxizómových dedičných ochorení Robert Petrovič, Ján Futas, Mária Fischerová, Katarína Kolejáková, Jozef Adámať, Danka Maceková, Ľubica Strháková, Pavol Ipóth, Ján Chandoga Centrum lekárskej genetiky FNsP Bratislava, Slovenska Republika, [email protected] Abstrakt Peroxizómy predstavujú subcelulárne štruktúry, ktoré sa nachádzajú u eukaryotických mikroorganizmov a vo väčšine buniek živočíšneho alebo rastlinného pôvodu. Metabolické funkcie peroxizómov zahŕňajú oxidáciu širokého spektra látok za prítomnosti kyslíka. Z hľadiska bunkovej patológie sú najvýznamnejšie procesy α a β-oxidácie karboxylových kyselín, zvlášť významná je β-oxidácia karboxylových kyselín s veľmi dlhým reťazcom (VLCFA), ktorá prebieha výlučne v peroxizómoch. Mutácie peroxizómových génov spôsobujú závažné metabolické poruchy. V súčasnosti sú známe takmer dve desiatky peroxizómových dedičných ochorení, ktoré sa rozdeľujú na generalizované (porucha biogenézy peroxizómov) a na izolované defekty jednotlivých peroxizómových enzýmov. Kombinovaná incidencia peroxizómových dedičných ochorení sa v Európe odhaduje na 1:10 000. Všetky ochorenia okrem X-viazanej adrenoleukodystrofie sa vyznačujú autozómovo-recesívnym typom dedičnosti. V diagnostike peroxizómových dedičných ochorení (PDO) sa využívajú biochemické a molekulárno-genetické metódy, ktoré zachytia viaceré abnormality a zmeny prejavujúce sa na rôznych úrovniach postihnutého organizmu. Táto škála metód umožňuje nielen postnatálnu, ale aj prenatálnu diagnostiku. Úvod Peroxizómy predstavujú subcelulárne štruktúry kategórie mikroteliesok, nachádzajú sa tak u jednobunkových eukaryotov ako aj u väčšiny živočíšnych a rastlinných buniek. Peroxizómy sú prítomné vo väčšine cicavčích buniek, ale ich veľkosť a množstvo je variabilné. Peroxizómy sú okrúhle alebo oválne organely s veľkosťou 0,2 až 1 µm a obsahujú približne 50 enzýmov s vysokou variabilitou v ich spektre a množstve, v závislosti od nutričných podmienok a vplyvu xenobiotík tzv. peroxizómových proliferátorov. Peroxizómy vznikajú delením existujúcich štruktúr, po importe proteínov alebo formovaním de novo. K biogenéze peroxizómov sú potrebné cytosólové bielkoviny, membránové importné proteíny a typické zoskupenie aminokyselín v polypeptidových reťazcoch, ktoré má charakter topogénneho signálu – PTS (peroxisomal targeting signal). Funkciu PTS zabezpečuje C-koncový tripeptid zložený spravidla z aminokyselín serínu, lyzínu a leucínu (SKL tripeptid - PTS1) alebo N-koncový PTS2 charakterizovaný konsenzom sekvencie AMK Arg-Leu/IleXXXXX-Gln/His-Leu (X-ľubovoľná AMK). Pre biogenézu peroxizómov sú nevyhnutné membránové proteíny – peroxíny, kódované PEX génmi. Rozsiahlymi štúdiami na kvasinkách sa identifikovalo 32 PEX – génov (Wanders and Waterham, 2005). Produkty týchto génov sú nevyhnutné pre normálny import proteínov do peroxizómov. Medzi tieto proteíny sa zaraďujú receptor pre PTS1 (kódovaný génom PEX5), receptor pre PTS2 (kódovaný génom PEX7), ďalej sem patria rôzne proteíny zabezpečujúce kotvenie a stabilitu receptorov, proteíny translokácie a ďalšie, ktoré sa zúčastňujú na peroxizómovej biogenéze. Expresia jadrových génov kódujúcich peroxizómové proteíny je regulovaná nukleárnymi receptormi, ktoré sú aktivované peroxizómovými proliferátormi (PPAR- peroxisome activated receptors). C-doména týchto receptorov sa viaže na špecifickú oblasť promótorov peroxizómových génov (PPRE – peroxisomal proliferator response elements) obsahujúcu najčastejšie tandemové usporiadanie sekvencie TGACCT. Mutácie peroxizómových génov často spôsobujú závažné metabolické poruchy. Metabolické funkcie peroxizómov zahŕňajú oxidáciu širokého spektra látok za prítomnosti kyslíka, pričom produkovaný peroxid vodíka môže byť degradovaný pomocou katalázy, respektíve využitý ďalej v peroxidázovej reakcii. V reakciách katalyzovanými katalázou a superoxiddizmutázou sa bunky pozbavujú toxického superoxidového aniónu (Wanders and Denis, 1992). Z hľadiska bunkovej patológie sú najvýznamnejšie procesy α a β oxidácie karboxylových kyselín a syntéza plazmalogénov. 88 Zvlášť významná je β-oxidácia karboxylových kyselín s veľmi dlhým reťazcom, ktorá prebieha výlučne v peroxizómoch. V súčasnosti je známych 16 ochorení, ktorých príčinou je buď generalizovaná porucha v biogenéze peroxizómov, alebo deficiencia jednotlivých peroxizómových enzýmov (tabuľka č.1). Väčšina sa manifestuje neurologickými poruchami a všetky okrem X-viazanej adrenoleukodystrofie sa vyznačujú autozómovo-recesívnym typom dedičnosti. Odhady o frekvencii výskytu peroxizómových chorôb sú veľmi rozdielne, v západnej Európe sa odhaduje výskyt jedného prípadu na 10 000 - 20 000 novorodencov. Peroxizómové poruchy sa členia do dvoch skupín podľa rozsahu poškodenia metabolických funkcií. Skupinu A tvoria ochorenia s generalizovanou stratou peroxizómových funkcií, vyznačujúce sa stratou alebo výrazným znížením počtu peroxizómov. Príčinou tejto skupiny chorôb je defektná biogenéza peroxizómov. B skupina sa vyznačuje iba izolovaným defektom a stratou jednej peroxizómovej funkcie (Moser, 2000). Ochorenie Skratka Defektný proteín Poruchy v peroxizómovej biogenéze Zellwegerov syndróm ZS Peroxíny Neonatálna NALD Peroxíny adrenoleukodystrofia Infantilná Refsumova choroba IRD Peroxíny Rhizomelická RCDP 1 Pex7p chondrodysplázia punctata typ1 Hyperpipekolová acidémia HPA ? Defekty v jednotlivých peroxizómových proteínoch a enzýmoch X-viazaná drenoleukodystrofia X-ALD ALDP Defekt Acyl-KoA oxidázy ACOX1acyl-KoA oxidáza (pseudo-neonatálna ALD) deficiency Defekt D-bifunkčného proteínu D-BP D-BP/MF2/ deficiency MFEII/D-PBE Defekt 2-methylacyl-KoA Racemase AMACR racemázy deficiency Rhizomelická RCDP 2 DHAPAT chondrodysplázia punctata typ2 Rhizomelická RCDP 3 ADHAPS chondrodysplázia punctata typ3 Refsumova choroba (defekt ARD Fytanoyl-KoA fytanoyl-KoA hydroxylázy) hydroxyláza Primárna hyperoxalúria typ1 PH1 Alanín:glyoxylát aminotransferáza Mulibrey nanizmus MUL Trim37p Akatalazémia Kátaláza Glutárová acidémia typ3 GA3 ? Gén Chromozóm MIM # PEX-gény PEX-gény Viac lokusov Viac lokusov 214100 214110 PEX-gény PEX7 Viac lokusov 6q21-q22.2 202370 215100 ? ? 266510 ABCD1 ACOX1 Xq28 17q25.1 300100 264470 HSD17B4 5q2 261515 AMACR 5p13.3-p12 604489 GNPAT 1q42.1-42.3 222765 AGPS 2q33 600121 PHYH/ PAHX AGXT 10p15-p14 266500 2q37.3 259900 TRIM CAT ? 17q22-23 11p13 ? 253250 115500 ? Tab.1. Peroxizómové dedičné ochorenia. Zmeny v biochemických parametroch pri peroxizómových ochoreniach sa rutinne využívajú v diagnostike, zvlášť akumulácia VLCFA v plazme u pacientov s poruchou peroxizómovej biogenézy (PBD), X-adrenoleukodystrofiou, s defektom Acyl-KoA oxidázy a D-bifunkčného proteínu je jav ktorý si našiel veľmi skoré uplatnenie v diagnostike. Pre uvedené ochorenia je charakteristický nález zvýšených hladín VLCFA v plazme – zvýšené sú hladiny kyseliny cerotovej (C26:0) a súčasne je výrazne zvýšený pomer C26:0/C22:0 a taktiež C24:0/C22:0. Biochemická diagnostika sa dá uskutočniť pomocou plynovej chromatografie. Pri určení definitívnej diagnózy sa ďalej využívajú zmeny v plazmatických hladinách kyseliny fytánovej, pristánovej, pipekolovej ako aj prítomnosť abnormálnych koncentrácii žlčových kyselín - THCA, DHCA. Keďže u viacerých peroxizómových dedičných ochorení je defektná syntéza plazmalogénov, využívajú sa v diagnostike aj analytické údaje o ich zastúpení v erytrocytoch. De novo syntéza plazmalogénov je nedostatočná u PBD a RCDP. Oproti tomu u X-ALD a ďalších je biosyntéza neporušená. Molekulárno-genetická analýza zahŕňa priame sekvenovanie zodpovedného génu, alebo v prípade častej mutácie je možné využiť aj metódu PCR/RFLP. Medzi skríningové metódy patria dHPLC (Montagna a kol., 2005) a SSCP (Lachtermacher a kol., 2000). 89 Materiál a metódy Analýza karboxylových kyselín (VLCFA, fytánová a pristánová kyselina) v sére: VLCFA, fytánová a pristánová kyselina boli zo séra alebo plazmy extrahované Folchovou metódou (Folch a kol., 1957), následne derivatizované (metylované) (Lepage and Roy, 1986) a analyzované pomocou GC/MS. Analýza pipekolovej kyseliny v sére a moči: Derivatizácia – príprava N[O,S]-etoxykarbonyl etyl esterov aminokyselín bola uskutočnená podľa Hušeka (1991). Celé spektrum aminokyselín (vrátane pipekolovej kyseliny) sére a moča bolo analyzované pomocou GC/MS podľa Petroviča a kol. (2005). Analýza plazmalogénov v erytrocytoch: Hladiny plazmalogénov boli determinované na základe pomerov C16:0 dimetylacetálov ku kyseline palmitovej (C16:0) a C18:0 dimetylacetálov ku kyseline steárovej (C18:0) pomocou GC/MS s modifikovanou metodikou podľa Bjorkhema a kol. (1986). Molekulárna analýza génu ABCD1: cDNA slúžila ako templát pre 4 PCR reakcie, ktoré pokrývali celý kódujúci úsek ABCD1 génu, ktorý je defektný pri X-ALD. PCR produkty boli priamo osekvenované na automatickom genetickom analyzére ABI 310. Zistené nové, doposiaľ nepopísané mutácie boli verifikované pomocou PCR/RFLP. Molekulárna analýza vybraných exónov niektorých PEX génov: Vybrané exóny PEX génov PEX1 (13. 15. a 18. exón), PEX26 (1. a 2.), PEX6 (1.), PEX12 (2. a 3.), PEX10 (3. 4. a 5.) a PEX2 (4.) boli amplifikované pomocou PCR (Steinberg a kol., 2004) a priamo osekvenované pomocou automatického genetického analyzéra ABI 310. Výsledky a diskusia Poruchy v biogenéze peroxizómov, X-ALD, deficit ACOX a D-BP sa biochemicky manifestujú zvýšenou hladinou kyseliny cerotovej (C26:0) a pomerov C26:0/C22:0 a C24:0/C22:0. Zistené hodnoty diagnosticky významných parametrov VLCFA u kontrolných jedincov a pacientov s peroxizómovým ochorením a ich porovnanie s publikovanými údajmi je zosumarizované v tabuľke č.2. Na podklade výsledkov kontrolnej skupina boli stanovené následovné horné hranice referenčných hodnôt (priemer + 2SD): C26:0 <0,037 µg/ml, C26:0/C22:0 <0,018, C24:0/C22:0 <1,08. Počet vzoriek Kontrolné vzorky táto štúdia 131 Moser a kol. (1999) 29.000 Takemoto a kol. (2003) 50 Poruchy peroxizómovej biogenézy táto štúdia 3 Moser a kol. (1999) Takemoto a kol. (2003) 8 X-viazaná adrenoleukodystofia táto štúdia 7 Moser a kol. (1999) 239 Takemoto a kol. (2003) 11 C26:0 [µg/ml] C26:0/C22:0 C24:0/C22:0 0.21 ± 0.08 0.24 ± 0.16 0.17 ± 0.01 0.010 ± 0.004 0.014 ± 0.006 0.012 ± 0.005 0.85 ± 0.11 0.81 ± 0.09 1.04 ± 0.15 3.51 ± 0.88 3.66 ± 1.50 7.24 ± 3.22 0.458 ± 0.239 1.187 ± 0.723 1.34 ± 0.24 3.14 ± 0.64 1.22 ± 0.36 1.36 ± 0.48 1.14 ± 0.58 0.060 ± 0.027 0.066 ± 0.025 0.106 ± 0.045 1.61 ± 0.25 1.57 ± 0.25 2.01 ± 0.32 Tab.2. Hodnoty VLCFA u kontrol a pacientov s peroxizómovým ochorením. Pipekolová kyselina sa akumuluje v moči a sére pacientov s poruchou biogenézy peroxizómov (obrázok č.1). Pipekolová kyselina bola zvýšená u všetkých 3 PBD pacientov ako v sére (101, 26 a 21 µmol/l, ref. <5) tak aj v moči (53, 66 a 41 mmol/mol kretinínu, ref. <10), ale nezvýšená u pacientov s izolovaným enzýmovým defektom. Veľmi významným je aj zistenie, že nedochádza k prekryvu hodnôt pipekolej kyseliny u pacientov s PBD a referenčných vzoriek, čo umožňuje rutinnú a spoľahlivú diagnostiku u generalizovaných peroxizómových ochorení zo vzoriek moča. Analýza plazmalogénov v erytrocytoch v kombinácii s VLCFA analýzou dáva dôležitú informáciu o charaktere peroxizómového ochorenia (či sa jedná o generalizovnú formu alebo deficienciu jedného proteínu). Na obrázku č.1 je znázornený takmer úplný deficit plazmalogénov v erytrocytoch u pacienta s PBD. 90 Obr. 1. GC-MS chromatogram plazmalogénov v erytrocytoch. Fyziologický záznam (vľavo) a patologický (vpravo). Pre toto závažné najfrekventovanejšie peroxizómové ochorenie vyznačujúce sa X-viazaným recesívnym typom dedičnosti je charakteristické zvýšenie hladín VLCFA v sére. Na našom pracovisku sme zachytili 5 nepríbuzných rodín s X-ALD a u každej sa vyskytla privátna mutácia (tabuľka č.3). # číslo rodiny pacient #1 proband #1 brat #2 proband #2 matka #3 proband #3 matka #3 stará matka #4 proband #5 proband #5 brat kontrolné vzorky VLCFA (GC-MS) C26:0 C26:0/ C24:0/ [µg/ml] C22:0 C22:0 1.34 0.036 1.44 1.57 0.112 1.65 1.19 0.048 1.58 0.35 0.020 1.16 1.73 0.072 1.32 0.86 0.041 1.12 0.17 0.007 0.79 0.75 0.070 1.50 1.09 0.046 1.70 0.86 0.036 2.09 <0.39 <0.019 <1.05 Genotyp Fenotypa Terapiab Nástup ochorenia R104G/R104G/L160P/L160P/WT R324P/R324P*/WT WT/WT S633I‡/R660P‡/R660P/WT/WT AMN AMN ADO ADO ccALD ccALD Asympt. - žiadna žiadna žiadna žiadna LO LO BMT - 10 r. 15 r. 34 r. 22 r. 6 r. 7 r. - Tab. 3. Biochemický a molekulárny nález u X-ALD rodín zo Slovenska. a Fenotypy: ccALD-detská cerebrálna forma, AMN-adrenomyeloneuropathy, ADO-adultná forma, Asympt- doteraz asymptomatická forma b Terapia: LO-Lorenzov olej, BMT – transplantácia kostnej drene *mutácia vzniknutá de novo ‡ Mutácia u týchto pacientov popísaná aj predtým Dvořákovou a kol. (2001). Príklad – Rodina č. 3: #3 proband: 27-ročný pacient, s prvými neurologickými prejavmi v 22-tich rokoch. Neskoršie sa u neho vyvinula paraparéza, tažká demencia a apatia. U probanda bola zistená mutácia v 2. exóne, c.971G>C (R324P), ktorá vytvorila restrikčné miesto pre NlaIV, matka je heterozygotná pre túto mutáciu, ale matkina matka je homozygot pre divý typ (obrázok č.2). Obr. 2. Molekulárna analýza ABCD1 v rodine č.3. Čiastkový chromatogram zachytávajúci novú mutáciu c.971G>C (R324P) v ABCD1, ktorá vytvára restrikčné miesto pre NlaIV – šípka poukazuje 91 na miesto mutácie. (A) hemizygozný proband, (B) heterozygotná matka probanda , (C) probandova stará matka (divý typ) (D) RFLP analýza – štiepenie 268 bp PCR produktu – mutantná alela (3 fragmenty 97, 95 a 76 bp), divý typ (2 fragmenty 173 a 95 bp). 1. dráha – 50 bp ladder; 2 – kontrola proband; 3 – probandova stará matka; 4 – proband; 5 - probandova matka. Závery Podarilo sa nám zaviesť biochemické metódy založené na plynovej chromatografii spriahnutej s hmotovou spektrometriou, pomocou ktorých sme dosiahli analýzu plazmalogénov v erytrocytoch, pipekolovej kyseliny v sére a moči. Ďalej sme zdokonalili analýzu mastných kyselín s veľmi dlhým reťazcom, kyseliny fytánovej a pristánovej v sére. Pomocou týchto metód sa nám podarilo skompletizovať biochemický algoritmus diagnostiky dedičných peroxizómových ochorení. Zaviedli sme digitonínový permeabilizačný test na kultivovaných fibroblastoch, pomocou ktorého je možné zistiť poruchu v peroxizómovej biogenéze. Ďalej sme zaviedli a optimalizovali molekulovú analýzu všetkých 10-tich exónov génu ABCD1 (pomocou priameho sekvenovania cDNA, ktorá bola získaná reverzným prepisom príslušnej mRNA). Zistené mutácie sme verifikovali pomocou restrikčného štiepenia (PCR/RFLP). Vybrané exóny génov PEX1, PEX2, PEX6, PEX10, PEX12 a PEX26 (celkovo 14 amplikónov) sme analyzovali pomocou sekvenovania PCR produktov, pre ktoré bola templátom genómová DNA. Taktiež sme zaviedli PCR metódu na detekciu Pro12Ala polymorfizmu v PPARG géne. Pomocou vyššie uvedených novozavedených metód sa nám podarilo identifikovať 4 nové, doposiaľ nepopísané, mutácie v géne ABCD1 u pacientov s X-viazanou adrenoleukodystrofiou a definitívne biochemicky alebo molekulárne potvrdiť diagnózu peroxizómového dedičného ochorenia u viac ako 20-tich slovenských pacientov. Použitá literatúra 1. Bjorkhem, I., Sisfontes, L., Bostrom, B., et al.: Simple diagnosis of the Zellweger syndrome by gas-liquid chromatography of dimethylacetals. J Lipid Res. 27: 786–791, 1986. 2. Dvorakova, L., Storkanova, G., Unterrainer, G., et al. Eight novel ABCD1 gene mutations and three polymorphisms in patients with X-linked adrenoleukodystrophy: The first polymorphism causing an amino acid exchange. Hum Mutat. 18: 52–60, 2001. 3. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G.H.: A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226: 497–509, 1957. 4. Husek, P.: Amino acid derivatization and analysis in five minutes. FEBS Lett. 280: 354–360, 1991. 5. Lachtermacher, M.B., Seuanez, H.N., Moser, H.W., Smith, K.D.: One-step multiplex PCR strategy for identification of mutations by SSCP and DNA sequencing. Biotechniques. 29: 234–236, 2000. 6. Lepage, G., Roy, C.C.: Direct transesterification of all classes of lipids in a one-step reaction. J Lipid Res. 27: 114–120, 1986. 7. Montagna, G., Di, B.A., Cappa, M., et al.: Identification of seven novel mutations in ABCD1 by a DHPLCbased assay in Italian patients with X-linked adrenoleukodystrophy. Hum Mutat. 25: 222, 2005. 8. Moser, A.B., Kreiter, N., Bezman, L., et al.: Plasma very long chain fatty acids in 3,000 peroxisome disease patients and 29,000 controls. Ann Neurol. 45: 100–110, 1999. 9. Moser, H.W.: Molecular genetics of peroxisomal disorders. Front Biosci. 5: D298–306, 2000. 10. Petrovic, R., Futas, J., Chandoga, J., Jakus, V.: Rapid and simple method for determination of N(epsilon)(carboxymethyl)lysine and N(epsilon)-(carboxyethyl)lysine in urine using gas chromatography mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 19: 649–654, 2005. 11. Steinberg, S., Chen, L., Wei, L., et al.: The PEX Gene Screen: molecular diagnosis of peroxisome biogenesis disorders in the Zellweger syndrome spectrum. Mol Genet Metab. 83: 252–263, 2004. 12. Takemoto, Y., Suzuki, Y., Horibe, R., et al.: Gas chromatography/mass spectrometry analysis of very long chain fatty acids, docosahexaenoic acid, phytanic acid and plasmalogen for the screening of peroxisomal disorders. Brain Dev. 25: 481–487, 2003. 13. Wanders, R.J., Denis, S.: Identification of superoxide dismutase in rat liver peroxisomes. Biochim Biophys Acta. 1115: 259–262, 1992. 14. Wanders, R.J., Waterham, H.R.: Peroxisomal disorders I: biochemistry and genetics of peroxisome biogenesis disorders. Clin Genet. 67: 107–133, 2005. 92 Detection of 4-amino-3-acetylquinoline induced DNA damage in murine L1210 and NIH-3T3 cells using Comet assay Andrej Repický, Soňa Jantová, Silvia Letašiová Institute of Biochemistry, Nutrition and Health Protection, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology, Bratislava, Slovakia, andrej.repický@stuba.sk Abstract Quinolines are known to be multitarget agents with broad spectrum of biological activity. In our previous study we showed that newly prepared 4-amino-3-acetylquinoline (AAQ) possesses cytotoxic/antiproliferative effects on cancer cell lines HeLa and L1210 and on non-cancer NIH-3T3 cells. In this study, we investigated genotoxic influence AAQ on murine L1210 leukemia cells and non-cancer fibroblast NIH-3T3 cells. Results from Comet assay showed that AAQ caused DNA damage which was concentration- and time-dependent. Genotoxic effect on leukemia L1210 cells was higher than that on non-cancer NIH-3T3 cells. Introduction Quinoline derivatives are known to possess a variety of biological activities and represent the basis for the preclinical and clinical development of novel antimalarial, antipsychotic and antitumor agents. Some of these agents are in use as potent drugs and some are used in combination with other anticancer drugs to overcome multidrug resistance of some tumors. Quinolines may induce cell cycle arrest, generation of reactive oxygen spesies (ROS), disruption of mitochondrial membrane potential, DNA single-strand breaks, activation of caspases and interact with DNA (Kaur et al. 2007, Shenoy et al. 2007). Based on above mentioned effects of quinoline a new series of substituted nitrogen atom containing heterocyclic compounds was prepared for screening of their antibacterial and cytotoxic activities in vitro. The strongest biological activities was found for 4-amino-3-acetylquinoline (AAQ). AAQ induced concentration-dependent G2/M cell cycle arrest increasing with the time of treatment and apoptotic death of L1210 cells. On the other hand, AAQ cytotoxic concentrations caused necrotic death of NIH-3T3 cells. Here we report studies of the genotoxic effects of AAQ on leukemia L1210 cells and fibroblast cells NIH-3T3. Materials and methods The murine leukemia cell line L1210 and murine fibroblast cell line NIH-3T3 (Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) were used. They were grown in RPMI medium (L1210) or minimal Eagle medium (NIH-3T3) supplemented with 10% fetal bovine serum and penicillin and streptomycin (100 µg/ml) at 37°C in a 5% CO2 95% air humidified incubator. L1210 cells grew in suspension and were subcultivated three times a week. The suspension of cells was blown and total cell number of cells as their viability was stated. Before an uniform monolayer of NIH-3T3 cells was formed, cells were freed from the surface of culture dish by 0.25% solution of trypsin and subcultivated two-three times a week. Cell viability was determined by 0.4% Trypan blue exclusion test. The studied 4-amino-3-acetylquinoline (fig. 1) was prepared by Cernuchova et al.(2005). Chromatographically pure quinoline was dissolved directly in 100% dimethyl sulfoxide (DMSO), its final concentration never exceeded 0.5% (v/v) in either control or treated cell samples. The solutions of tested derivative were prepared freshly before each test. Culture media, fetal bovine serum and antibiotics (penicillin G, streptomycin) were obtained from Biocom (Bratislava, Slovakia). Other chemicals were purchased from Sigma (St Louis, MO, USA). Fig. 1. Chemical structure of 4-amino-3-acethylquinoline. 93 Comet assay is based on the ability of DNA strand breaks to migrate in a weak electric field in the direction of anode, giving the nucleus the appearance of the tail of a comet when visualised by fluorescence microscopy. The procedure of Comet assay was used with minor changes suggested by Slamenova et al. (1999) and Gabelova et al (1997). A base layer of 100 µl of 0.75% NMP agarose in PBS buffer was placed on microscope slides. Cells were treated with quinoline in concentrations of 53.7, 26.9, 5.37, 0.54 and 0.054 µmol/l for 24 h. Treated as well as untreated (control) cells were suspended in 0.75% LMP agarose. 85 µl of LMP agarose containing 2x104 cells was spread on the base layer. Triplicate slides were prepared per sample. The agarose was allowed to solidify and the slides were placed in lysis mixture (2.5 mol/l NaCl, 100 mmol/l, Na2EDTA, 10 mmol/l, Tris-HCl (pH 10.0) and 1% Triton X-100) at 4°C. The slides were transferred to an electrophoresis box containing an alkaline solution at pH>13.0 (300 mmol/l NaOH, 1 mmol/l Na2EDTA) and kept in this solution for 40 min at 4°C for DNA strands to unwide. A voltage of 25 V (current of 300 mA) was applied for 30 min. The slides were removed, neutralised by 2x10 min washing in Tris-HCl (0.4 mmol/l, pH 7.5) and stained with 20 µl ethidium bromide (EtBr, 10 µg/ml). EtBr stained nucleus were evaluated with a Zeiss Jenalumar fluorescence microscope (magnification 200x). For each sample 100 comets were scored by computerised image analysis (Comet 5.5 Europe, Kineting Imaging, Liverpool, UK) for determination of DNA in tail, lineary related to the frequency of DNA strand breaks. Results are shown as the arithmetic means ± standard deviations of the mean of three separate experiments, each concentration was done in five Petri dishes. The significance of differences between values acquired by Comet assay was evaluated by Student’s t-test, statistically different from control: *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Results and discussion With the aim of obtaining new antitumor agents a series of seventeen substituted nitrogen atom containing heterocyclic compounds was prepared. Previous testing of these compounds for cytotoxic properties in vitro on four bacterial strains, four yeast strains and two filamentous fungi strains has been reported. The antimicrobial activity was not found for AAQ. On the other hand, AAQ manifested significant in vitro cytotoxic/antiproliferative effect on the cell line HeLa and L1210 (Černuchová et al. 2005, Repický et al. 2007). AAQ induced concentration-dependent G2/M cell cycle arrest increasing with the time of treatment and apoptotic death of L1210 cells. AAQ elevated the level of ROS, decreased the mitochondrial membrane potential and activated caspases-9 and -3 in time-dependent manner. It can be concluded that AAQ induced apoptosis in L1210 cells through mitochondrial/caspase-9/caspase-3-dependent pathway. No effect of AAQ on the cell cycle profile and induction of apoptotic DNA fragmentation of NIH-3T3 cells was detected. On the other hand, AAQ induced necrotic death of NIH-3T3 cells. However, cytotoxic effect of AAQ on non-cancer NIH-3T3 cells was two-four times weaker than on leukemia L1210 cells (Jantová et al. 2007, Repický et al. 2007). DNA damage could be one of the cause of cytotoxic effect of AAQ and therefore the aim of present study was to examine the genotoxic effect of AAQ on murine leukemia L1210 cells and noncancer fibroblast NIH-3T3 cells. The ability of AAQ to induce DNA damage was investigated using Comet assay. We examined the formation of DNA damage induced by AAQ concentrations of 53.7, 26.9, 5.4, 0.54 and 0.054 µmol/l on L1210 and NIH-3T3 cells after 24 h treatment. As it is evident from Figure 2, the level of direct DNA strand breaks increased proportionally to the increased concentration of used derivative in both used cell line. After comparing the genotoxic effects of AAQ on L1210 cells and on NIH-3T3 cells, as it is shown in Table1, it can be concluded that leukemia L1210 cells are more sensitive to the tested derivative than non-cancer fibroblast NIH-3T3 cells. The genotoxic effect of the highest tested concentration of AAQ (53.7 µmol/l ) on L1210 cells was almost 60% while in NIH-3T3 it caused approximately 37% of DNA damage. 94 ** 50 40 30 20 ** 60 % of D N A dam age * ** 40 ** * *** % of D N A dam age 80 20 10 0 0 NC 53.70 26.85 5.37 0.54 0.054 NC 53.70 26.85 5.37 0.54 0.054 concentration (µmol/l) concentration (µmol/l) A B Fig. 2. Detection of DNA damage in L1210 (A) and in NIH-3T3 (B) cells after 24 h treatment with AAQ concentration of 53.70-0.054 µmol/l . NC is negative control (cells treated with 0.5% DMSO). *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05. A AAQ concentration % of damage SD NC 15.30 ±0.60 53.7 59.41 ±7.37 26.85 57.51 ±3.91 5.37 39.89 ±8.57 0.54 30.74 ±2.91 0.054 16.94 ±2.95 B AAQ concentration NC 53.7 26.85 5.37 0.54 0.054 % of damage 9.17 37.35 30.00 28.18 14.51 10.48 SD ±0.03 ±4.20 ±4.00 ±1.05 ±5.20 ±0.64 Tab.1: Percentage values of DNA damage in L1210 (A) and in NIH-3T3 cells (B) after 24 h treatment with AAQ concentration of 53.70-0.054 µmol/l. Values are the arithmetic means ± standard deviations for three separate experiments, each concentration was done in five separate Petri dishes. NC is negative control (cells treated with 0.5% DMSO). Conclusion AAQ is a new prepared quinoline which in our preliminary studies demonstrated cytotoxic/antiproliferative effects on leukemia cell line L1210. In this work, the ability of AAQ to induce DNA damage was examined on L1210 cells and non-cancer NIH-3T3 cells using Comet assay. Based on the obtained results can be concluded that AAQ caused genotoxic effects. Induction of DNA breaks in murine treated cells was concentration- and time- dependent. Comparison of percentage values of DNA damage showed higher sensitivity of cancer L1210 cells than that in NIH-3T3 cells. Acknowledgements This study was supported by the Grant Agency for Science Research of the Ministry of education of the Slovak Republic, VEGA number 1/1173/04 and Technology Assistance Agency under the contract No. APVT 20-007304. 95 References 1. Černuchová, P., Vo-Thanh, G., Milata, V., Loupy, A., Jantová, S., Theiszová, M.: Utilization of 2ethoxymethylene-3-oxobutanenitrile in the synthesis of heterocycles possessing biological activity. Tetrahedron. 61: 5379–5387, 2005. 2. Gábelová, A., Slameňová, D., Ružeková, Ľ., Farkašová, T., Horváthová, E.: Measurement of DNA strand breakage and DNA repair induced with hydrogen peroxide using single cell gel electrophoresis, alkaline DNA unwinding and alkaline elution of DNA. Neoplasma. 44: 380–388, 1997. 3. Jantová, S., Repický A., Čipák, Ľ., Janikovicsová, M.: Cytotoxic activity of quinoline AAQ on leukemia cell lines. Zborník príspevkov: XXIV. Xenobiochemické sympózium 22.-24.5.2007 Liptovský Ján SR, 66, 2007. 4. Kaur, K., Patel, S.R., Patil, P., Jain, M., Khan, S.I., Jacob, M.R., Ganesan, S., Tekwani, B.L., Jain, R.: Synthesis, antimalarial, antileishmanial, antimicrobial, cytotoxicity and methemoglobin (MetHB) formation activities of new 8-quinolinamines. Bioorg Med Chem. 2: 915–930, 2007. 5. Repický, A., Jantová, S., Milata, V.: cytotoxic activity of novel synthetic heterocyclic compounds on leukemia cell line L1210. Book of abstrakts from the conference Synthetic and natural compounds in cancer therapy and prevention. March 28-30. 2007 Bratislava SR, 70, 2007. 6. Shenoy, S., Vasania, V.S., Gopal, M., Mehta, A.: 8-Methyl-4-(3-diethylaminopropylamino) pyramido [4´,5´;4,5] thieno (2,3-b) quinoline (MDPTQ), a quinoline derivative that causes ROS-mediated apoptosis in leukemia cell lines. Toxicol Appl Pharmacol. 1: 80–88, 2007. 7. Slameňová, D., Tabelová, A., Ružeková, Ľ., Chalupa, I., Horváthová, E., Farkašová, T., Bozsakyová, E., Štětina, R.: Detection of MNNG-induced DNA lesions in mammalian cells; validation of comet assay against DNA unwinding technique, alkaline elution of DNA and chromosomal aberrations. Mutat Res. 383: 243–252, 1999. 96 Polymorfizmus génu PSMB9 v slovenskej populácii Ivana Shawkatová1, Vanda Repiská2 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, 1Imunologický ústav; 1Ústav lekárskej biológie a genetiky, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt V génovej oblasti HLA sa nachádzajú okrem iných aj gény s účasťou na opracovaní proteínov prezentovaných HLA-molekulami triedy I. Dva z týchto génov (PSMB9 a PSMB8) kódujú enzýmové podjednotky proteazómového komplexu. Tieto gény sú polymorfné, i keď podstatne menej ako klasické HLA-gény. Práve variabilita týchto génov je už dlhšie predmetom skúmania pre jej potenciálny funkčný význam. Naším cieľom bolo zaviesť metódu na genotypizáciu polymorfizmu lokusu PSMB9 a určiť frekvencie alel PSMB9 génu v populačnej vzorke slovenskej populácie s perspektívou skúmať potenciálny vplyv polymorfizmu génov PSMB v patogenéze autoimunitných chorôb. Frekvencie dvoch alel génu PSMB9 a genotypové frekvencie sme určili v súbore 96 zdravých osôb. Distribúcia zistených alel a genotypov v našej populácii nie je (podľa očakávania) signifikantne odlišná od distribúcie v iných sledovaných kaukazoidných populáciách. Úvod V HLA-oblasti sa nachádzajú štyri gény zodpovedné za opracovanie antigénov prezentovaných HLA-molekulami triedy I. Dva z týchto génov (PSMB9 a PSMB8, donedávna označované ako LMP2 a LMP7) kódujú enzýmové podjednotky proteazómového komplexu, v ktorom dochádza k degradácii proteínov na malé peptidy. Ďalšia dvojica (TAP1 a TAP2) kóduje transportné proteíny prenášajúce vzniknuté peptidy k HLA-molekulám triedy I, ktoré ich prezentujú v imunitnej odpovedi (Beck et al., 1992). Gény TAP a PSMB vykazujú určitú variabilitu a preto je predpoklad, že rôzne alelové varianty sú zodpovedné za zmeny v opracovaní antigénu, ktoré môžu v konečnom dôsledku viesť k vzniku autoimunitných chorôb. Funkčný význam polymorfizmu týchto génov nie je definitívne jasný a je stále predmetom skúmania. Gén PSMB9 má iba 2 alely, ktoré sa líšia nukleotidovou substitúciou guanínu za adenín v pozícii 194. Výsledkom je aminokyselinová substitúcia histidínu za arginín v kodóne 60. Tieto dve alely sú v literatúre označované písmenami H/R (Powis et Teisserenc 1997). Vyšetrovaný súbor a metódy Na Imunologickom ústave LF UK sme v priebehu ostatných rokov zozbierali vzorky DNA získané od nepríbuzných zdravých osôb slovenskej populácie (väčšinou dobrovoľných darcov krvi alebo kostnej drene z rôznych oblastí Slovenska z Kliniky hematológie a transfúziológie Fakultnej nemocnice v Bratislave). Z tohto súboru náhodne vybraných vzoriek zdravej populácie sme čerpali pri rôznych populačných štúdiách v HLA-oblasti ako aj pri populačnej analýze polymorfizmu génu PSMB9 (Čechová et al., 1998). Vzorky boli získané s informovaným súhlasom zúčastnených osôb. Genómovú DNA sme izolovali z periférnej krvi postupom, ktorý je modifikáciou štandardnej vysoľovacej metódy (Miller et al. 1988). Typizáciu génu PSMB9 sme uskutočňovali pomocou metódy PCR-RFLP. Gén PSMB9 sme najprv amplifikovali metódou PCR a následne štiepili restrikčným enzýmom Cfo I. Ak v sekvencii nukleotidov bolo prítomné restrikčné miesto (substitúcia G za A v nukleotide 194), štiepením vznikli dva menšie fragmenty (Powis et Teisserenc 1997). PCR amplifikácia prebiehala v celkovom objeme 25 µl v 0,2 ml PCR-platničkách na termálnom cykleri PTC-100™-MJ Research Inc. (USA). Reakčná zmes obsahovala genómovú DNA (100 ng), pár oligonukleotidových primerov so sekvenciami 5´GGC AGT GGA GTT TGA CGG - 3´ a 5´- GGC TGT CGA GTC AGC ATT C - 3´ (po 50 pM), deoxynukleozidtrifosfáty (po 100 µM z každého), Taq-polymerázu (0,15 U) a tlmivý roztok (50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2). Teplotný algoritmus amplifikácie bol nasledovný: horúci štart 5 min pri 94,5 °C, 30 cyklov pozostávajúcich z troch krokov: 1. denaturácia 1 min pri 94 °C, 2. hybridizácia 6 min pri 59 °C, 3. syntéza DNA 1 min pri 72 °C, na záver syntéza DNA 10 min pri 72 °C. 97 Amplifikovaný fragment s dĺžkou 2 255 bp sme štiepili restrikčným enzýmom Cfo I (Gibco, Anglicko) vo výslednom objeme 15 µl reakčnej zmesi v zložení: 9 µl produktu PCR, 10 U enzýmu Cfo I, 1,5 µl 10x reakčného tlmivého roztoku pre enzým, 3,5 µl redestilovanej vody. Reakcia prebiehala v mikroskúmavkách 2 hod. pri teplote 37 °C. V prípade prítomnosti restrikčného miesta vznikli dva fragmenty s dĺžkou 1167 bp a 1088 bp, prislúchajúce alele označovanej písmenom H, resp.R (obr.1). Fragmenty sme vizualizovali na UV-transiluminátore po elektroforetickej separácii v 1,5 % agarózovom géli (1 hod pri napätí 5 V/1 cm gélu). Pre lepšiu orientáciu sme používali 100 bp marker relatívnej molekulovej hmotnosti. Obr. 1. Výsledok typizácie PSMB9 génu metódou PCR-RFLP po elektroforéze v 1,5 % agarózovom géli: 1 - genotyp HH, 2 - genotyp HR, 3 - genotyp RR. Výsledky a diskusia Na našom pracovisku sme zaviedli metódu PCR-RFLP na typizáciu dimorfizmu génu PSMB9, pričom sme vychádzali z údajov publikovaných v literatúre (Powis et Teisserenc 1997). Frekvencie dvoch alel génu PSMB9 a genotypové frekvencie sme určili v súbore 96 zdravých osôb. Zistili sme, že v našej populácii má alela označovaná písmenom H frekvenciu 32,8 % a alela R frekvenciu 67,2 % (tab. č. 1). Pre porovnanie uvádzame aj frekvencie alel v niektorých iných populáciach (prehľadne Rueda Faucz et al. 2000). Distribúcia alel v našej populácii nie je (podľa očakávania) signifikantne odlišná od distribúcie v iných sledovaných kaukazoidných populáciach. Genotypové frekvencie sú uvedené v tabuľke č. 2. Rovnako distribúcia jednotlivých genotypov nie je štatisticky preukazne odlišná od distribúcie pozorovanej v kaukazoidnej populácii USA (Maksymowych et al. 2000). Frekvencie genotypov sú v súlade s Hardyho – Weinbergovým zákonom. alela f (KAN) f (FRA) f (USA) f (SEN) f (SLO) (n = 420) (n = 324) (n = 372) (n = 234) (n = 192) 24,0 24,5 26,0 34,0 PSMB9*H 32,8 76,0 74,5 74,0 66,0 PSMB9*R 67,2 Tab. 1. Frekvencie alel PSMB9 v slovenskej populácii v porovnaní s frekvenciami v iných populáciách. SLO-slovenská, KAN-kanadská, FRA-francúzska, USA-kaukazoidná z USA, SENsenegálska, f – alelová frekvencia (%), n – počet vyšetrených alel. genotyp f (SLO) (2n = 96) f (USA) (2n = 282) PSMB9*HH PSMB9*HR PSMB9*RR 7,4 15,6 38,7 34,4 53,9 50,0 Tab. 2. Frekvencie genotypov PSMB9 v slovenskej populácii a v kaukazoidnej populácii USA. SLOslovenská, USA-kaukazoidná z USA, f – genotypová frekvencia (%), 2n – počet vyšetrených osôb. Pre analýzu mikropolymorfizmu PSMB-oblasti sme sa rozhodli z viacerých dôvodov. Distribúcia alel PSMB9 v našej populácii ešte nebola sledovaná. Populačno-genetické štúdie sú jedným z prostriedkov skúmania evolučného a funkčného významu genetického polymorfizmu. Ďalej, vzhľadom na biologickú funkciu produktov PSMB-génov, môžeme predpokladať ich vplyv vo vzťahu 98 k autoimunitných chorobám. Variabilita, prejavujúca sa zámenou histidínu za arginín v podjednotke proteazómu, môže teoreticky ovplyvňovať štiepenie peptidov (napr. veľkosť výsledných fragmentov) a tým aj celú prezentáciu antigénu. Môžeme tiež uvažovať tak, že keďže sú gény PSMB lokalizované v oblasti HLA triedy II, dá sa predpokladať ich synergetické pôsobenie s klasickými HLA-génmi (Djilali-Saiah at al. 1996). Otázku funkčného významu variability génov PSMB, resp. TAP je možné skúmať aj na úrovni ich produktov - pomocou analýzy spektra generovaných, (resp. transportovaných a prezentovaných) peptidov. Napríklad podľa Quadriho a Singala (1998) polymorfizmus génu TAP1 ovplyvňuje selekciu peptidov v ľudských lymfoblastoidných a nádorových líniách. V ostatných rokoch vzniklo niekoľko prác skúmajúcich vzťah PSMB, resp. TAP génov k autoimunitným chorobám. Prvé publikácie poukazovali na ich asociáciu s viacerými autoimunitnými chorobami (napr. s diabetes mellitus I. typu a reumatoidnou artritídou) (Caillat-Zucman et al. 1993, Deng et al. 1995). Vzápätí niektorí kritici poukazovali na to, že rozdielne frekvencie TAP, resp. PSMB alel v súboroch pacientov oproti zdravej populácii často vyplývajú z väzbovej nerovnováhy s klasickými HLA lokusmi, primárne asociovanými so sledovanou chorobou (Chauffert et al. 1997, Heward et al. 1999). Dokazujú to štúdie, v ktorých autori pri interpretácii výsledkov zohľadnili existenciu silnej väzbovej nerovnováhy medzi niektorými lokusmi HLA oblasti triedy II (Djilali-Saiah et al. 1996). Sia (2005) novšie publikoval prácu vychádzajúcu z viacerých nezávislých štúdií, v ktorej dokazuje nezávislý vplyv TAP a PSMB génov na vznik autoimunitného diabetu. PSMB-gény zohrávajú úlohu aj v patogenéze ankylozujúcej spondylitídy. Polymorfizmus génu PSMB9 pravdepodobne ovplyvňuje fenotyp choroby a to nezávisle na polymorfizme iných HLA-lokusov (Maksymowych et al. 2000). Vznikli aj ďalšie zaujímavé práce nasvedčujúce tomu, že variabilita v TAP a PSMB oblasti ovplyvňuje protilátkovú odpoveď po vakcinácii, či priebeh HIV-1 infekcie (Hayney et al. 1997, Kaslow et al. 1996). Závery Populačná genetika umožňuje skúmanie evolučného a funkčného významu genetického polymorfizmu. Diverzita génov PSMB a TAP, ktorých produkty sa zúčastňujú v imunitnej odpovedi na opracovaní proteínov prezentovaných HLA-molekulami triedy I, zatiaľ nebola v rôznych populáciách dostatočne preskúmaná. V práci prezentujeme alelové frekvencie jedného z tejto skupiny génov - génu PSMB9 určené v slovenskej populácii. Štúdiu plánujeme rozšíriť o analýzu polymorfizmu génov PSMB8, TAP1 a TAP2 a to predovšetkým vo vzťahu k niektorým autoimunitným chorobám. Použitá literatúra 1. Beck, S., Kelly, A., Radley, E., Kurshid, F., Alderton, R.P., Trowsdalw, J.: DNA sequence analysis of 66 kb of human MHC class II region encoding a cluster of genes for antigen processing. J Mol Biol. 228: 433, 1992. 2. Caillat-Zucman, S., Bertin, E., Timsit, J., Boitard, C., Assan, R., Bach, J. F.: Protection from insulin dependent diabetes mellitus is linked to a peptide transporter gene. Eur J Immunol. 23: 1784–1788, 1993. 3. Čechová, E., Fazekašová, H., Ferenčík, S., Shawkatová, I., Buc, M.: HLA-DRB1, -DQB1 and -DPB1 polymorphism in the Slovak population. Tissue Antigens. 51: 574–576, 1998. 4. Deng, G.Y., Muir, A., MacLaren, N.K., She, J.X.: Association of LMP2 and LMP7 genes within the major histocompatibility complex with insulin-dependent diabetes mellitus: population and family studies. Am J Hum Gen. 56: 528, 1995. 5. Djilali-Saiah, I., Benini, V., Daniel, S., Assan, R., Bach, J. F., Caillat-Zucman, S.: Linkage disequilibrium between HLA class II (DR, DQ, DP) and antigen processing (LMP, TAP, DM) genes of the major histocompatibility complex. Tissue Antigens 48: 87–92, 1996. 6. Hayney, M.S., Poland, G.A., Dimanling, P., Schaid, D.J., Jacobson, R.M., Lipsky, J.J.: Polymorphisms of the TAP2 gene may influence antibody response to measles vaccine virus. Vaccine. 15: 3–7, 1997. 7. Chauffert, M., Cisse, A., Chevenne, D., You, J.F., Michel, S., Trivin, F.: Susceptibility to type 1 diabetes in Senegalese population is linked to HLA-DQ and not TAP and LMP genes. Diabetes Care 20: 1299–1303, 1997. 8. Heward, J.M., Allahabadia, A., Sheppard M.C., Barnett A.H., Franklyn J.A., Gough, S.C.: Association of large multifunctional proteasome (LMP2) gene with Graves´ disease is a result of linkage disequilibrium with the HLA haplotype DRB1*0304-DQB1*02-DQA1*0501. Clin Endocrinol. 51: 115–118, 1999. 9. Kaslow, R.A., Carrington, M., Apple, R., Park, L., Munoz, A., Goedert, J.J., Winkler, C., Rinaldo, C., Detels, R., Blattner, W., Phair, J., Erlich, H., Mann, D.L.: Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature Medicine. 2: 405–410, 1996. 99 10. Maksymowych, W.P., Tao, S., Vaile, J., Suarez-Almazor, M., Ramos-Remus C., Russell, A.S.: PSMB9 polymorphism is associated with extraspinal disease in HLA-B27 negative Caucasian and Mexican Mestizo patients with ankylosing spondylitis. J Rheumatol. 27: 183–189, 2000. 11. Miller, S.A., Dykes, D.D., Polesky, H.F.: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl Acids Res. 16: 1215, 1988. 12. Powis, S.H., Teisserence, H.: TAP, LMP and HLA-DM typing protocols. In: HLA 1997, Vol.1 (ed. by K. Tsuji, M. Aizawa, T. Sasazuki), Oxford University Press, Oxford, s. 226, 1997. 13. Quadri, S.A., Singal, D.P.: Peptide transport in human lymphoblastoid and tumor cells: effect of transporter associated with antigen presentation (TAP) polymorpism. Immunol Letters. 61: 25, 1998. 14. Rueda Faucz, F., Macagnan Probst, C., Petzl-Erler, M.L.: Polymorphism of LMP2, TAP1, LPM7 and TAP2 in Brazilian Amerindians and Caucasoids: implications for the evolution of allelic and haplotypic diversity. Eur J Immunogen. 27: 5–16, 2000. 15. Sia, C., Weinem, M.: Genetic susceptibility to type 1 diabetes in the intracellular pathway of antigen processing – a subject review and cross-study comparison. Rev Diabet Stud. 2(1): 40–52, 2005. 100 Výsledky interdisciplinárneho výskumu olova v placente indikujú hyperkinetický syndróm u detí Michal Šimera1,2, Viktor Foltin2, Ivana Lettrichová1,3, Zuzana Grolmusová1,2, Marcela Morvová3, Eva Neu4, Janka Foltinová1 1 Ústav Histológie a embryológie, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava, Sasinkova 4, 81108 Bratislava; 2Katedra experimentálnej Fyziky – oddelenie fyziky plazmy, Fakulta matematiky, fyziky a informatiky, Univerzita Komenského, Bratislava; 3Katedra astronómie, fyzika zeme a meteorológie – oddelenie fyziky životného prostredia, Fakulta matematiky, fyziky a informatiky, Univerzita Komenského, Bratislava, Slovensko; 4 Umweltmedizin Institut, Feucht bei Nurnberg, Germany, [email protected] Abstrakt Pre každé zdravo vyvíjajúce sa dieťa je nevyhnutná zdravá placenta. Tak ako kruhy na pni zrezaného stromu nám povedia históriu stromu, tak aj placenta nám odhalí históriu tehotenstva. Vplyv znečistenia životného prostredia môže zanechať zmeny na mikroskopickej štruktúre placenty. Ešte neuplynula dlhá doba od vtedy, čo sa prestal používať olovnatý benzín, a tak sa dnes prejavuje kumulácia olova a jeho následky u generácií detí matiek 25 až 30 ročných. Sú to dievčatá, ktoré žili v čase keď ešte nebol v plnom rozsahu používaný bezolovnatý benzín. Pre ťažké kovy je charakteristické, že sa z organizmu vylučujú veľmi pomaly. Nález olova v klkoch placenty je pre dnešnú dobu potrebné konzultovať na interdisciplinárnej úrovni. Toto viedlo autorov k myšlienke: previesť histochemický dôkaz Pb v placente a analýzu tohoto neurotoxického kovu v pupočníkovej krvi pomocou infračervenej spektroskopie (IR). V článku uvádzame priebežné výsledky, ktoré sú súčasťou formujúcich sa prác. Zameriavame sa na adekvátne lokality na území Slovenskej Republiky s vysokou prítomnosťou olova v životnom prostredí a s rastúcim výskytom hyperkinetického syndrómu (ADHD) u detí. V práci sme preštudovali výskyt ADHD u detí z okolia Bratislavy za obdobie od rokov 2003 až 2006. Úvod Posledné štúdie ukazujú, že placenta nie je účinnou bariérou pre ťažké kovy ako Cd a Pb. Predpokladá sa, že tieto látky prechádzajú cez transplacentárnu barieru viacerými transportnými mechanizmami ako sú jednoduchá difúzia pre malé molekuly, aktívny transport pre molekuly s molekulovou hmotnosťou menšou ako 400 000 a pinocytóza pre makromolekuly (Goyer, 1990). V poslednom čase sa ukazuje, že vplyv Pb na organizmus nie je zanedbateľný a môže spôsobovať vznik ADHD u detí. Do organizmu sa Pb dostáva inhaláciou, orálnou cestou a výnimočne aj rezorpciou cez porušenú kožu. Olovo má schopnosť prenikať do telových tkanív v závislosti od dávok, koncentrácie, veku a tiež cesty expozície. Dospelý jedinec môže prijať v potrave približne 10–15% olova a u detí to predstavuje viac ako 50% olova, vzhľadom na hmotnosť jedinca. Olovo sa po rezorpcii distribuuje krvou do tkanív, svalov, CNS (najmä striatum). V krvi sa viaže na bielkoviny plazmy a vstupuje do erytrocytov. Najväčšie zásoby olova v tele sú v kostnom tkanive a v zuboch. V mozgu sa koncentruje v sivej hmote a v niektorých jadrách. Olovo sa vylučuje z tela dlhodobo. Karcinogénne účinky olova u človeka sa zatiaľ jednoznačne nepotvrdili, ale ani nevylúčili (Goyer, 1990). Olovo prechádza pupočníkovou krvou k plodu už v treťom mesiaci tehotenstva a samotný plod je vystavený vysokej expozícii (Reichrtová a kol., 1998, Foltinová a kol., 2006). Najnovšie štúdia ukazuje, že vznik ADHD má biologickú vývojovú podstatu (Drtílková, Šerý a kol., 2007). Aká neurologická, alebo biochemická skutočnosť špecifické poruchy správania vyvoláva, nie je celkom jasné. Niektorí autori uvádzajú genetické vplyvy, iní oneskorené neurologické dozrievanie, poškodenie plodu pred narodením, či počas komplikácii pri pôrode a po narodení, vplyv rádioaktivity a ťažkých kovov, niektorých liekov prípadne konzervačných látok a farbív. Hypotéza o vplyve konzervačných látok a farbív v potravinách ako o potenciálnom riziku vzniku ADHD u detí bola veľmi populárna v 80. rokoch minulého storočia, avšak pre nedostatok dôkazov sa od nej upustilo. Najnovšie štúdie potvrdzujú, že najmä placenta nie je účinnou bariérou pre niektoré rizikové látky, 101 ktoré priamo ohrozujú vyvíjajúci sa plod. Napríklad expozícia olovom behom intrauterinného alebo postnatálneho vývoja môže spôsobiť neurokognitívne poškodenie a teda aj vznik ADHD. Štúdie ukazujú, že hodnota Pb v placente u donosených detí je 0,29 ± 0,9 µg/g hodnota Pb v placente u predčasne narodených detí je 0,45 ± 0,32 µg/g (Goyer, 1990). Najmä bazálne gangliá sú veľmi citlivé na hypoxiu a zmenu metabolizmu, čo má významnú úlohu v patofyziológii hyperkinetickej poruchy. Predpokladá sa, že olovo, ktoré je transportované cez transplacentárnu barieru do plodu, okrem iného atakuje aj dopamínové dráhy v strednom mozgu (napr. striatum). Dopamínové neuróny v strednom mozgu regulujú motorickú kontrolu a emócie a sú zapojené do kognitívnych procesov a rôznych foriem pamäti. V lokalite striatum dopamín zodpovedá za správnu koordináciu pohybov končatín. Degenerácia dopamínových dráh a následná deplécia dopamínu, ktoré môžu byť spôsobené expozíciou neurotoxického jedu Pb, vedú k hypokinéze. Dopamín je dôležitý pri ovplyvňovaní psychomotoriky a pozornosti, čo je dysfunkčné u ADHD. Jedinci s ADHD majú hypoaktivitu kortikálneho dopamínového systému a hyperaktivitu striatového dopamínového systému (Drtílková, Šerý a kol., 2007). Materiál a metódy V našej práci sme pozorovali a vyhodnotili 104 excízií z placent, ktoré boli odobraté ihneď po pôrode. Z anamnestických údajov sme do úvahy brali: 1. 2. 3. 4. bydlisko matky od narodenia a počas tehotenstva; vek matky; počet tehotenstiev a ich priebeh; fajčenie, užívanie psychotropných látok a iné. Excízie z placent boli fixované v AFO – alkohol:formol:kyselina octová v pomere 12:6:1 a vo formole 1:9. Na 7 µm hrubých parafínových rezoch sme previedli nasledujúce farbiace metódy: 1. hematoxylin – eozín 2. Parker a Mallory hematoxylín, pozitivita olova je zobrazená tyrkysovo zelenou farbou. Preparáty boli študované v svetelnom mikroskope Nikon Labophot 2, (Japonsko) pri zväčšeniach 100 – 400x. Dokumentáciu sme previedli vstavaným fotoaparátom Olympus Camedia C707. Vzorky pupočníkovej krvi na IR spektroskopiu boli spracované KBr tabletovacou technikou. Do práškového bromidu draselného sme pridali asi 3 kvapky pupočníkovej krvi (v pomere krv:KBr asi 1-5 mg:300-1000 mg), takto vytvorenú zmes sme zhomogenizovali. Vzniknutý homogenát sme naplnili do foriem na lisovanie tabliet a zlisovali pomocou lisu firmy Carl Zeiss na priesvitnú kompaktnú tabletku pri postupne sa zvyšujúcom tlaku až na hodnotu 220 atmosfér. Pri meraniach pomocou infračervenej spektroskopie je mimoriadne dôležité zbaviť vzorku vody, ktorá by prekryla pásy vzorky, čo sme realizovali jednak dôsledným homogenizovaním a vysúšaním v IR lampe a tiež počas lisovania použitím rotačnej vývevy, ktorá zbavuje tabletku zbytkových vodných pár. Spektrum vzorky (pozri graf 1) sme analyzovali spektrometrom Perkin Elmer Spectrum BX USA. Ďalej sme vyhodnotili chorobopisy 120 detí s ADHD hospitalizovaných na Klinike detskej psychiatrie Detskej Fakultnej nemocnice Kramáre v Bratislave v rokoch 2003 až 2006. Výsledky a diskusia Predpokladá sa, že syncytiotrofoblast, syntetizuje špecifický proteín metalothionenin, ktorý prednostne viaže ťažké kovy ako Cd a Pb (Goyer, 1990). V našej práci sa zameriavame na štúdium prítomnosti Pb v mikroskopických štruktúrach placenty. Je známe, že syncytiotrofoblast fagocytuje tieto látky (Reichrtová a kol., 1998, Foltinová a kol., 2006, Vráblová a kol., 2006). Presná väzba a mechanika samotného transportu zatiaľ nie sú známe. Naše histologické nálezy potvrdzujú pozitívny výskyt Pb v krvi matky a následný transport cez transplacentárnu bariéru do fetálnej krvi. Zaznamenali sme prítomnosť Pb v erytrocytoch matky v intervilóznych priestoroch placenty a v erytrocytoch fetálnej krvi v cievach placentárnych klkov pozri obr. 1. 102 Výsledná pozitivita na Pb je tyrkysovo zelené sfarbenie. Na obr. 1 vidíme prítomnosť Pb v histologickom preparáte placenty matky. Graf 1 zobrazuje spektrum ťažkých kovov v pupočníkovej krvi. Obr. 1. Prítomnosť Pb v erytrocyte matky ◀ (v ľavo) a v erytrocyte plodu ◀ (v pravo), zväčšenie 400x. Graf 1. Infračervené spektrum z pupočníkovej krvi. Prítomnosť Pb3O4 singlet 670 cm-1. V nameranom spektre sme zistili aj prítomnosť arzénu As2O3 (dublet pri 330 až 350 cm-1) a prítomnosť olova vo forme Pb3O4 (singlet 670 cm-1). V štúdii sme sa ďalej zamerali na vzorku 120 detských pacientov vo veku od 2 do 18 rokov, ktorí boli v rokoch 2003 až 2006 hospitalizovaný na Klinike detskej psychiatrie Detskej fakultnej nemocnice s poliklinikou v Bratislave. Takmer u polovice detí s ADHD sa v chorobopise uvádza rizikový priebeh tehotenstva (pozri graf 2), ktorý bol spôsobený napr. predčasným odlupovaní placenty, zlou polohou plodu, nedostatočnosťou fetoplacentárnej jednotky alebo zlou životosprávou matky počas tehotenstva (fajčenie, užívanie psychotropných látok a iné). Takmer väčšina pacientov s diagnózou ADHD sú chlapci, avšak tvrdenie, že ochorenie sa výhradne týka len chlapcov je nesprávne. V danej populácii sa vyskytuje aj nezanedbateľný počet dievčat (pozri graf 3). Táto významná skutočnosť podporuje teóriu o vzájomnom vzťahu metabolizmu mužských pohlavných hormónov a olova. Hyperaktivita sa vyskytuje u detí v rôznom veku. Najčastejšie sa jedná o deti od 6 roku života až po obdobie puberty . Nie je jednoduché presne určiť začiatok ochorenia nakoľko deti sú hospitalizované až vtedy, keď príznaky presiahnu únosnú mieru tolerancie správania pre ich rodičov a okolie. 103 diagnózou ADHD 40% priebeh tehotenstva tehotenstva 60% Graf 2. Priebeh tehotenstva u 120 žien, ktorých deti boli hospitalizované pre ADHD. Pohlavie detí s diagnózou ADHD 10% Chlapci 90% Graf 3. Pohlavie 120 detí s diagnózou ADHD. Závery V našej práci sme lokalizovali kumuláciu olova v placente. Počas tehotenstva hormonálne zmeny vedú k uvoľneniu Pb z kostných depozitov. Pomocou IR spektroskopie sme dokázali výskyt Pb v pupočníkovej krvi vo forme Pb3O4. Vyhodnotili sme chorobopisy 120 detí s ADHD hospitalizovaných na Klinike detskej psychiatrie Detskej Fakultnej nemocnice Kramáre v Bratislave v rokoch 2003 až 2006. Predpokladáme, že olovo ako neurotoxický jed, môže spolu s inými faktormi spôsobovať vznik hyperkinetického syndrómu u detí, ktorý má v dnešnej dobe nezanedbateľný výskyt v populácii. Výskyt tohoto ochorenia má stúpajúcu tendenciu vo svete. Poďakovanie Touto cestou chceme poďakovať prednostovi Kliniky detskej psychiatrie Detskej fakultnej nemocnice s poliklinikou v Bratislave doc. MUDr. Igorovi Škodáčkovi, CSc. za cenné rady pri štúdiu ADHD, prednostovi Ústavu histológie a embryológie LFUK doc. MUDr. Štefanovi Polákovi, PhD. za možnosť realizovať a ďalej rozvíjať túto prácu na jeho ústave a Vierke Haraslínovej za pomoc pri príprave histologických preparátov. Použitá literatúra 1. Foltinová, J.: Histológia pre poslucháčov biomedicínskej fyziky. Vysokoškolská učebnica. Univerzita Komenského Bratislava. 242, 2003. 2. Foltinová, J., Morvová M., Foltin V., et al.: Lead-dangerous metal for the developing fetus. Interdisciplinary study. Programme and Abstract Book of the 41st International Congress of Slovak Anatomical Society. Bratislava. 39, 2007. 3. Foltinová, J., Morvová, M., Foltin, V., Neu, E.: Placenta. Umbilical blood and polluted enviroment. In: Proceedings of International Congress on Enviromental Health. Hanover. Germany. Fraunhofer. ITA. 80, 2000. 4. Foltinová, J., Foltin, V., Šimera, M., et al.: Lead in placenta-hazardous prognosis for postnatal development of the child. Int J Prenatal Perinatal Psychology and Medicine. 18: 19–26, 2006. 104 5. Pounds, J.G., Long, G.J., Rosen, J.F.: Cellular and molecular toxicity of lead in bone. Environ Health Persp. 91: 17–32, 1991. 6. Goyer, R.A.: Transplacental transport of lead. Environ Health Persp. 89: 101–105, 1990. 7. Reichrtová, E., Doročiak, P., Palkovičová, L.: Sites of lead and nickel accumulation in the placental tissue. Hum Exp Toxical. 176–181, 1998. 8. Ross, M.H., Pawlina W.: Histology a text and atlas with correlated cell molecular biology. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore. 906, 2006. 9. Simons, T.J.B.: Passive transport and binding of lead by human red blood cells. J Physiol Great Britain. 387: 267–286, 1986. 10. Vráblová, V., Šimera, M., Seidenbusch, W.: Interdisciplinary approach to study of placenta. Morfológia v Súčasnosti. Zborník. Univerzita Komenského v Bratislave Lekárska Fakulta. 90–94, 2006. 105 Identifikácia proteínu PCNA v normálnom endometriu Vladimír Šišovský1, Ľudovít Danihel1, Michal Palkovič1, Beata Bučeková1, Vanda Repiská2, Ľuboš Danišovič2, Andrea Ševčovičová3, Svetoslav Štvrtina1, Dimitris Hatzibougias4, Roman Moravčík5, Marek Bučko6, Michal Korman7, Lívia Hlavačková1 1 Ústav patologickej anatómie; 2Ústav lekárskej biológie a genetiky; 7Ústav telesnej výchovy a športu, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; 3Katedra genetiky, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; 4Department of Pathology, Medical School, Aristotle University, Thessaloniki, Greece; 5 Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Slovenská republika; 6Oddelenie glykobiotechnológie, Chemický ústav, Centrum glykomiky, Slovenská akadémia vied, Bratislava, Slovenská republika, [email protected] Abstrakt Endometrium je špecializované tkanivo, ktorého morfologický vzhľad ako aj prítomnosť mnohých proteínov v ňom sa neustále mení v priebehu biologického veku ženy aj počas menštruačného cyklu. Spolu 30 vo formalíne fixovaných a do parafínu zaliatych bioptických tkanivových vzoriek s proliferujúcim (PE, 10), sekrečným (SE, 10) a atrofickým (AE, 10) endometriom sme vyšetrili imunohistochemicky (IHC) na expresiu proteínu PCNA v jadrách epitelových buniek žliazok endometria. Expresia PCNA bola vysoká v PE, s výrazným poklesom v SE. V AE sme expresiu PCNA nezistili. Súhrnne možno konštatovať, že proteín PCNA je výborným znakom proliferujúcich buniek PE. Jeho hodnotenie pomocou IHC je pomerne lacnou a jednoduchou metódou s implikáciou pre klinickú prax. Úvod Endometrium je špecializované tkanivo, ktorého morfologický vzhľad ako aj prítomnosť mnohých proteínov v ňom sa neustále mení (Mutter a Ferenczy 2002). Mení sa v priebehu biologického veku ženy aj počas menštruačného cyklu (Mutter a Ferenczy 2002). Expresia niektorých proteínov môže byť prvotriednym indikátorom bunkovej diferenciácie a proliferácie. Antigén jadier proliferujúcich buniek (PCNA) je proteín o molekulovej hmotnosti 36 kDa (Zuber et al. 1989). Je spojený s proliferáciou buniek. Vzniká v neskorej G1 fáze, s vrcholom v S a zotrváva v G2 a M fáze bunkového cyklu (BC) (Kallakury et al. 1998). Má veľmi dlhý polčas životnosti, v bunke pretrváva i neskôr. Je kofaktorom DNA polymerázy δ (Lee a Hurwitz 1990), kľúčový v syntéze DNA v S fáze BC, počas reparácie DNA (Shivji et al. 1992), v replikácii DNA a v regulovaní progresie BC (Rao et al. 1991). Cieľom prezentovanej práce je identifikácia zmien expresie proteínu PCNA v epitelových bunkách žliazok imunohistochemickými (IHC) metódami, v korelácii s morfologickým nálezom, pri normálnom endometriu. Materiál a metódy Spolu 30 archívnych bioptických vzoriek endometria (z Ústavu patologickej anatómie Lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave, r. 1997-2007) z materníc po kyretovaní alebo hysterektómii (pre krvácanie z maternice alebo nádor zistený sonografiou či výsledok predchádzajúcej biopsie) boli zahrnuté v tejto štúdii. Vo formalíne fixované a do parafínu zaliate tkanivové vzorky s proliferujúcim (PE, 10x), sekrečným (SE, 10x) (ženy vo veku 26-45 r.) a pomenopauzovým atrofickým (AE, 10x) (60-86 r.) endometriom sme vyšetrili IHC. Expresiu PCNA v jadrách epitelových buniek žliazok endometria sme detegovali monoklonovou myšou protilátkou (DakoCytomation, Glostrup, Denmark). Nepriamu metódu s komplexom streptavidínu a biotínu s chrenovou peroxidázou (ABC-Px) a s 3,3´-diaminobenzidínom (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) ako chromogénu sme použili na vizualizovanie reakčného produktu (DakoCytomation 2004, Azumi a Czernobilsky 2002). Nálezy sme hodnotili svetelným mikroskopom (Nikon Coolpix 990, Tokyo, Japonsko) semikvantitatívne ako: „-“ negatívne, „+/-“ nepravidelne slabo pozitívne (do 5% buniek), „+“ pravidelne slabo pozitívne (> 5% a < 25% buniek), „++“ pravidelne stredne silne pozitívne (25% až 50% buniek), „+++“ pravidelne silne pozitívne (> 50% buniek). Použité postupy (výber materiálu do súboru) zodpovedali príslušným národným a medzinárodným etickým štandardom (rev. Helsinskej deklarácie z r. 2002) a pravidlám príslušných etických komisií o právach pacienta (Jakubovský 2003). 106 Výsledky a diskusia Výsledky hodnotenia expresie PCNA sú zhrnuté v tabuľke 1. Expresia PCNA bola vysoká v PE (obr. 1), s výrazným poklesom v SE (obr. 2). V AE sme expresiu PCNA nezistili (obr. 3). Stav endometria Reakcia protilátky proti PCNA +++ +/- až - Proliferujúce endometrium Sekrečné endometrium Atrofické endometrium Tab. 1. Prehľad reakcií protilátky proti PCNA s jadrami epitelových buniek žliazok endometria ľudí. Reakcia: − negatívna, +/− nepravidelne slabo pozitívna, + pravidelne slabo pozitívna, ++ pravidelne stredne silne pozitívna, +++ pravidelne silne pozitívna. Obr. 1. Pravidelná silne pozitívna expresia PCNA v PE. Komplex streptavidínu a biotínu s peroxidázou (ABC-Px), 120x. Obr. 2. Neprítomnosť expresie PCNA v SE. ABC-Px, 120x. Obr. 3. Neprítomnosť expresie PCNA v cystickom AE (po menopauze). ABC-Px, 100x. 107 Naše výsledky ukazujú dobrú koreláciu expresie PCNA so stavom endometria a sú v zhode s inými publikovanými prácami. PCNA je proteín jadier buniek spojený s proliferáciou buniek (Azumi a Czernobilsky 2002). Endometrium pred ovuláciou charakterizuje proliferácia buniek žliaz, strómy a endotelu ciev, maximálny počet buniek endometria syntetizujúcich jadrovú DNA s maximálnou aktivitou mitóz (Aronica a Katzenellenbogen 1991). Hareyama (1994) opisuje v neskorej fáze PE signifikantne vyšší index PCNA (% jadier s obsahom PCNA) než v skorej fáze PE a než skorej a strednej fáze SE. Tieto nálezy sú podobné s našimi zisteniami, kde expresia PCNA v PE bola vysoká, ale v SE došlo k výraznému poklesu expresie PCNA. Skoré a neskoré fázy PE, resp. SE sme samostatne nehodnotili. Naše zistenia podporujú výsledky Budaja a Bučekovej (2007a,b), ktorí hodnotili expresiu PCNA v PE, SE aj v AE. Ich výsledky ukázali pravidelne silne pozitívnu expresiu PCNA v PE, nepravidelne slabo pozitívnu expresiu v SE a žiadnu expresiu PCNA v AE. Závery Súhrnne možno konštatovať, že proteín PCNA je výborným markerom proliferujúcich buniek endometria proliferujúcej fázy. Jeho hodnotenie pomocou IHC je pomerne lacnou a jednoduchou metódou s implikáciou pre klinickú prax. Poďakovanie Štúdia realizovaná s podporou (finančným príspevkom) Lions Club International LC Bamberg-Mischelsberg a LC Kremnica a čiastočne grantom UK/36/2007. Autori ďakujú za technickú spoluprácu laborantke p. I. Uhnavej. Prvý autor ďakuje za podporu Guvernérovi 2006-2007 Lions Club International District D-122 Česká republika a Slovenská republika p. Dipl. Ing. T. Bučekovi. Použitá literatúra 1. Aronica, S.M., Katzenellenbogen, B.S.: Progesterone receptor regulation in uterine cells: stimulation by estrogen, cyclic adenosine 3´,5´-mono-phosphate and insulin-like growth factor I and suppression by antiestrogens and protein kinase. Endocrinology. 128: 2045–2052, 1991. 2. Azumi, N., Czernobilsky, B.: Immunohistochemistry. In: Kurman, R.J. (ed) Blaustein´s pathology of the female genital tract. 5th Edn. Springer – Verlag, New York. 1251–76, 2002. 3. Budaj, M., Bučeková, B., Šišovský, V., Danihel, Ľ.: Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria. 46. fakultná konferencia ŠVOČ. Zborník prác, Bratislava: LF UK a Slovak Academic Press. 22– 25, 2007. 4. Budaj, M., Bučeková, B., Šišovský, V., et al.: Identification of proliferation markers in correlation with p53 gene mutation in endometrial carcinoma. Vědecká konference studentů českých a slovenských lékařských fakult. Program a abstrakta prednášek. 3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze. 2007. 5. DakoCytomation: DakoCytomation 2004/05 Catalog. Denmark: Glostrup. 359, 2004. 6. Hareyama, H: Proliferative activity of normal endometrial cells, endometrial hyperplasia cells and endometrial cancer cells using the monoclonal antibody to PCNA. Hokkaido Igaku Zasshi. 69(6): 1427–31, 1994. 7. Jakubovský, J.: Nekorektnosť vo vedeckom bádaní. In: Hulín, I. (Ed): Základy vedeckej práce. Slovak Academic Press, Bratislava. 424–442, 2003. 8. Kallakury, B.V., Ambros, R.A., Hayner-Buchan, A.M., et al.: Cell proliferation-associated proteins in endometrial carcinomas, including papillary serous and endometrioid subtypes. Int J Gynecol Pathol. 17: 320– 326, 1998. 9. Lee, S.H., Hurwitz, J.: Mechanism of elongation of primed DNA by DNA polymerase delta, proliferating cell nuclear antigen, and activator 1. Proc Natl Acad Sci USA. 87: 5672–5676, 1990. 10. Mutter, G.L., Ferenczy, A.: Anatomy and histology of the uterine corpus. In: Kurman, R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. Springer-Verlag, New York. 383–419, 2002. 11. Rao, V.V., Schnittger, S., Hansmann, I.: Chromosomal localization of the human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene to or close to 20p12 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 56: 169–170, 1991. 12. Shivji, K.K., Kenny, M.K., Wood, R.D.: Proliferating cell nuclear antigen is required for DNA excision repair. Cell. 69: 367–374, 1992. 13. Zuber, M., Yasui, W., Tan, E.M., Ryoji, M.: Quantitation and subcellular localization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA/cyclin) in oocytes and eggs of Xenopus lae laevis. Exp Cell Res. 182: 384–393, 1989. 108 Ki-67 je vynikajúcim znakom malígnej premeny buniek endometria po menopauze Vladimír Šišovský1, Ľudovít Danihel1, Michal Palkovič1, Pavel Babál1, Beata Bučeková1, Dimitris Hatzibougias2, Martin Wawruch3, Dalibor Hojsík4, Michal Korman5, Zuzana Kováčiková6, Bohuslav Uher7,8, Roman Moravčík9 1 Ústav patologickej anatómie; 3Farmakologický ústav; 4Ústav súdneho lekárstva; 5Ústav telesnej výchovy a športu, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave; 2Department of Pathology, Medical School, Aristotle University, Thessaloniki, Greece; 6Katedra živočíšnej fyziológie a etológie; 7Katedra botaniky, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, 8Ústav botaniky a zoologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita v Brne, Česká republika; 9Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Slovenská republika, [email protected] Abstrakt Endometrium je špecializované tkanivo, ktorého morfologický vzhľad ako aj prítomnosť mnohých proteínov v ňom sa neustále mení v priebehu biologického veku ženy, počas menštruačného cyklu a výrazne v nádorových procesoch. Spolu 70 vo formalíne fixovaných a do parafínu zaliatych bioptických tkanivových vzoriek s proliferujúcim (PE, 10), sekrečným (SE, 10) a atrofickým (AE, 10) endometriom, endometrioidným G1 (ECG1, 10) a G3 (ECG3, 10), seróznym (SC, 10) a svetlobunkovým (SvC, 10) karcinómom endometria (CaE) sme vyšetrili imunohistochemicky (IHC) na expresiu proteínu Ki-67 v jadrách epitelových buniek žliazok endometria. Expresia Ki-67 bola vysoká v PE, s výrazným poklesom v SE. V CaE expresia Ki-67 bola vysoká a zásadne sa nelíšila od expresie v PE a v jednotlivých histologických podtypoch a stupňoch CaE, pričom najvyššia expresia Ki-67 bola u agresívnych (najmä SC a ECG3, menej SvC) typov CaE. V AE sme expresiu Ki-67 nezistili. Súhrnne možno konštatovať, že Ki-67 je výborným markerom malígnej premeny buniek endometria po menopauze. Jeho hodnotenie pomocou IHC je pomerne lacnou a jednoduchou metódou pre klinickú prax. Úvod Výrazne stúpajúci výskyt zhubných nádorov tela maternice žien (American Cancer Society 2000; Jemal et al. 2005; Pleško et al. 1994; Pleško et al. 2003; Redecha et al. 2004) je predmetom záujmu mnohých odborníkov z rôznych vedných odborov. Sú to onkológovia, gynekológovia (Redecha et al. 1996; 2004; 2005; Šuška a Holomáň 1997; Šuška 2003), molekuloví biológovia a genetici (Weismanová et al. 2002; Repiská et al. 2003; Molnárová et al. 2006), patológovia (Deligdisch a Cohen 1985; Robboy et al. 1988; 2002; Breitenecker a Lax 1994; Danihel et al. 1995; 2002; 2003; 2005; Danihel a Breitenecker 1997; Silverberg et al. 2003; Šišovský et al. 2004; 2006a, 2006b; 2006c; 2006d; 2006e; 2007a; 2007b; 2007c; 2007d; Šišovský 2005; Gomolčák et al. 2005; Budaj a Bučeková 2007a,b). K rozšíreniu poznatkov o tejto malignite výrazne prispievajú patológovia, najmä z hľadiska stanovenia presnej diagnózy. Karcinóm endometria (CaE) je najčastejšia invázna neoplázia ženského pohlavného traktu, 5. najčastejší karcinóm u žien (American Cancer Society 2000; Ronnett et al. 2002; Jemal et al. 2005) a má výrazne stúpajúci výskyt. Vrátane Slovenskej republiky, kde ich počet vzrástol podľa Národného onkologického registra SR za posledných 20 rokov (1980 až 2000) takmer o tretinu (Pleško et al. 1994; 2003). CaE sa na Slovensku dotýka každoročne asi 700 žien, pričom asi 200 ich končí fatálne. Imnunohistochemická (IHC) analýza je veľakrát jedným z rozhodujúcich faktorov stanovenia diagnózy a prognózy nádorovej choroby a výrazne ovplyvňuje jej liečbu (Danihel a Porubský 1991; Danihel et al. 1995; Azumi a Czernobilsky 2002). Endometrium je špecializované tkanivo, ktorého morfologický vzhľad ako aj prítomnosť mnohých proteínov v ňom sa neustále mení (Mutter a Ferenczy 2002). Mení sa v priebehu biologického veku ženy, počas menštruačného cyklu (Mutter a Ferenczy 2002) a výrazne v nádorových procesoch (Ronnett et al. 2002). Expresia niektorých proteínov môže byť prvotriednym indikátorom bunkovej diferenciácie, proliferácie a skorým znakom ich malígnej premeny. Antigén Ki-67 združený s proliferáciou buniek (Ki-67) je proteín jadra bunky. Súvisí s aktivitou mitóz (Aronica a Katzenellenbogen 1991) a s proliferovaním buniek. Ki-67 je preferenčne 109 tvorený počas aktívnych fáz bunkového cyklu (G1, S, G2 a M), najmä v S a M fáze. Antigén je rýchlo ničený ak bunka vstupuje do neproliferujúceho stavu (Scholzen a Gerdes 2000). Chýba v pokojových bunkách, či v neaktívnej (G0) fáze (Gerdes et al. 1984). Cieľom prezentovanej práce je identifikácia zmien expresie Ki-67 v epitelových bunkách žliazok IHC metódami, v korelácii s morfologickým a klinickým nálezom, pri CaE. Materiál a metódy Spolu 70 archívnych bioptických vzoriek endometria (z Ústavu patologickej anatómie Lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave, r. 1997-2007) z materníc získaných kyretovaním alebo hysterektómiou (pre krvácanie z maternice alebo nádor zistený sonografiou či výsledok predchádzajúcej biopsie) boli zahrnuté v tejto štúdii. Vo formalíne fixované a do parafínu zaliate tkanivové vzorky s proliferujúcim (PE, 10x) a sekrečným (SE, 10x) (ženy vo veku 26-45 r.) a atrofickým (pomenopauzovým) (AE, 10x) (60-86 r.) endometriom, endometrioidným (EC) G1 (ECG1, 10x) a G3 (ECG3, 10x) (31-61 r.), seróznym (SC, 10x) (39-86 r.) a svetlobunkovým (SvC, 10x) (60-86 r.) histologickým podtypom CaE sme vyšetrili IHC. Expresiu Ki-67 v jadrách epitelových buniek žliazok endometria sme detegovali monoklonovou myšou protilátkou (DakoCytomation, Glostrup, Denmark). Nepriamu metódu s komplexom streptavidínu a biotínu s chrenovou peroxidázou (ABC-Px) a s 3,3´-diaminobenzidínom (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) ako chromogénu sme použili na vizualizovanie reakčného produktu (DakoCytomation 2004, Azumi a Czernobilsky 2002). Nálezy sme hodnotili svetelným mikroskopom (Nikon Coolpix 990, Tokyo, Japonsko) semikvantitatívne ako: „-“ negatívne, „+/-“ nepravidelne slabo pozitívne (do 5% buniek), „+“ pravidelne slabo pozitívne (> 5% a < 25% buniek), „++“ pravidelne stredne silne pozitívne (25% až 50% buniek), „+++“ pravidelne silne pozitívne (> 50% buniek). Iba reakčnú pozitivitu jadier buniek sme považovali za špecifickú. Rezy inkubované s obyčajným pufrom namiesto primárnej protilátky sme stanovili ako negatívnu kontrolu. Použité postupy (výber materiálu do súboru) zodpovedali príslušným národným a medzinárodným etickým štandardom (Helsinská deklarácia r. 2002) a pravidlám príslušných etických komisií o právach pacienta (Jakubovský 2003). Výsledky a diskusia Výsledky hodnotenia expresie Ki-67 sú zhrnuté v tabuľke 1. Expresia Ki-67 bola vysoká v PE (obr. 1) s výrazným poklesom v SE (obr. 2). V CaE expresia Ki-67 bola vysoká a zásadne sa nelíšila od expresie Ki-67 v PE a v jednotlivých histologických podtypoch CaE, pričom najvyššia miera expresie Ki-67 súvisela s agresívnym (najmä SC a ECG3, menej SvC) typom CaE (obr. 4, 3). V AE sme expresiu Ki-67 nezistili (obr. 5). Stav endometria Reakcia protilátky proti Ki-67 Proliferujúce endometrium Sekrečné endometrium Atrofické endometrium Endometrioidný karcinóm endometria, G1 Endometrioidný karcinóm endometria, G3 Serózny karcinóm endometria Svetlobunkový karcinóm endometria ++ až +++ - až +/++ ++ až +++ +++ ++ Tab. 1. Prehľad reakcií protilátky proti Ki-67 s jadrami epitelových buniek žliazok endometria ľudí. Reakcia: − negatívna, +/− nepravidelne slabo pozitívna, + pravidelne slabo pozitívna, ++ pravidelne stredne silne pozitívna, +++ pravidelne silne pozitívna. 110 Obr. 2. Neprítomnosť expresie Ki-67 v SE. ABC-Px, 100x. Obr. 3. Detekcia Ki-67 v ECG3. ABC-Px, 150x. Obr. 4. Pravidelná silne pozitívna expresia Ki-67 v SC. ABC-Px, 100x. Obr. 5. Pravidelná silne pozitívna expresia Ki-67 v CaE (hrubá šípka). Neprítomnosť expresie Ki-67 v cystickom (pomenopauzovom) AE (tenká šípka). ABC-Px, 100x. 111 Naše výsledky ukazujú dobrú koreláciu expresie proteínu Ki-67 s histologickým podtypom a stupňom diferencovania a sú v zhode s inými publikovanými prácami, ktoré hodnotili validitu tohto znaku. Ki-67 je proteín jadier buniek spojený s proliferáciou buniek (Azumi a Czernobilsky 2002). Endometrium pred ovuláciou charakterizuje proliferácia buniek žliaz, strómy a endotelu ciev, maximálny počet buniek endometria syntetizujúcich jadrovú DNA, čo korešponduje s maximálnou aktivitou mitóz (Aronica a Katzenellenbogen 1991) a s expresiou Ki-67 (Tabibzadeh 1990). Výsledky Ito et al. (1997) ukázali, že v SE je expresia Ki-67 signifikantne nižšia než v PE a než v EC. Ich zistenia našli podporu v našich nálezoch, ktoré ukazujú vysokú expresiu Ki-67 v PE a výrazný jej pokles v SE, kde bola výrazne nižšia než v ostatných nami sledovaných stavoch. Naše zistenia podporujú aj výsledky Budaja a Bučekovej (2007a,b), ktorí zistili vysokú expresiu Ki-67 v PE a výrazný jej pokles v SE. Ito et al. (1997) ďalej zistili v EC signifikantne vyššiu expresiu Ki-67 než v PE. Tieto nálezy naše zistenia potvrdili len čiastočne; v PE bola expresia Ki-67 rovnaká ako v EC. Výsledky Budaja a Bučekovej (2007a,b) ukázali, že expresia Ki-67 v PE, ECG1, ECG3, SC a SvC je vysoká a zásadne sa v týchto stavoch endometria neodlišuje. Ich zistenia našli podporu v našich nálezoch. Budaj a Bučeková (2007a,b) ďalej tvrdia, že AE Ki-67 netvorí. Tieto nálezy naše zistenia potvrdili; v AE sme expresiu Ki-67 nezistili. Lax et al. (1998) sa domnievajú, že SC a SvC nezávisia od estrogénov a majú vysoký index Ki-67 (% jadier obsahujúcich Ki-67). Na rozdiel od SC, vo SvC zriedkavejšie dochádza k výraznej expresii p53. Preto usudzujú, že patogenéza SvC sa líši od patogenézy EC a SC. Tieto nálezy našli podporu v našich výsledkoch, ktoré ukázali v ECG3 a v SC najvyššiu expresiu Ki-67, ale v ECG1 a v SvC expresia Ki-67 bola mierne nižšia. Naše výsledky podporujú výsledky Salvesena et al. (1998), ktorí hovoria, že v CaE expresia Ki-67 koreluje s jeho histologickým podtypom a s FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO) štádiom, a že expresia Ki-67 a štádium anatomického rozsahu sú významným faktorom prognózy vývoja CaE. Závery Súhrnne možno konštatovať, že proteín Ki-67 je výborným znakom malígnej premeny buniek endometria po menopauze, ktoré za normálnych okolností Ki-67 netvorí. Jeho hodnotenie pomocou IHC je pomerne lacnou a jednoduchou metódou s implikáciou pre klinickú prax. Poďakovanie Táto štúdia bola realizovaná s podporou (finančným príspevkom) Lions Club International LC Bamberg-Mischelsberg a LC Kremnica a čiastočne grantom UK/36/2007. Autori ďakujú za technickú spoluprácu laborantke p. I. Uhnavej. Prvý autor ďakuje za podporu Guvernérovi 2006-2007 Lions Club International District D-122 Česká republika a Slovenská republika, p. Dipl. Ing. T. Bučekovi. Použitá literatúra 1. American Cancer Society: 2000 cancer statistics. CA Cancer J Clin. 50(1): 1–64, 2000. 2. Aronica, S.M., Katzenellenbogen, B.S.: Progesterone receptor regulation in uterine cells: stimulation by estrogen, cyclic adenosine 3´,5´-mono-phosphate and insulin-like growth factor I and suppression by antiestrogens and protein kinase. Endocrinology. 128: 2045–2052, 1991. 3. Azumi, N., Czernobilsky, B.: Immunohistochemistry. In: Kurman,R.J. (Ed). Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. 5th Edn. Springer – Verlag, New York. 1251–1276, 2002. 4. Breitenecker, G., Lax, S.: Tumoren des Corpus uteri einschliesslich der Plazenta. In: Histologische Tumor Klassifikation. Springer – Verlag, Wien, New York. 97–102, 1994. 5. Budaj, M., Bučeková, B., Šišovský, V., Danihel, Ľ.: Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria. 46. fakultná konferencia ŠVOČ. Zborník prác, Bratislava: LF UK a Slovak Academic Press. 22– 25, 2007a. 6. Budaj, M., Bučeková, B., Šišovský, V., et al.: Identification of proliferation markers in correlation with p53 gene mutation in endometrial carcinoma. Vědecká konference studentů českých a slovenských lékařských fakult. Program a abstrakta prednášek. 3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze, 2007b. 7. DakoCytomation: DakoCytomation 2004/05 Catalog. Denmark: Glostrup, 359, 2004.. 8. Danihel, Ľ., Porubský, J.: Prínos monoklonálnych protilátok v bioptickej diagnostike nádorov. Bratisl lek Listy. 92(9): 460–466, 1991. 112 9. Danihel, Ľ., Breitenecker, G.: Histologická diagnostika nenádorových a nádorových zmien endometria v peria postmenopauze. In: Šuška, P., Holomáň, K. (Eds): Endometrium v peri- a postmenopauze. Slovak Academic Press, Bratislava. 14–41, 1997. 10. Danihel, Ľ., Babál, P., Porubský, J., et al.: Imunohistochemické markery v diagnostike nádorov maternice. Bratisl lek Listy. 96(7): 353–360, 1995. 11. Danihel, Ľ., Gomolčák, P., Korbeľ, M., et al.: Expression of proliferation and apoptotic markers in human placenta during pregnancy. Acta Histochem. 104(4): 335–338, 2002. 12. Danihel, Ľ., Horváth, R., Breitenecker, G., Hatzibugias, I.: Súčasná klasifikácia a charakteristika nádorov endometria. Slov gynek por. 10(Suppl 1): 14–17, 2003. 13. Danihel, Ľ., Šišovský, V., Palkovič, M., et al.: Karcinóm endometria – histopatologická klasifikácia a charakteristika. Gynekol prax. 3(1): 9–12, 2005. 14. Deligdisch, L., Cohen, C.J.: Histologic correlates and virulence implications of endometrial carcinoma associated with adenomatous hyperplasia. Cancer. 56(6): 1452–1455, 1985. 15. Gerdes, J., Lemke, H., Baisch, H., et al.: Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol. 133(4): 1710–1715, 1984. 16. Gomolčák, P., Danihel, Ľ., Šišovský, V.: E-cadherin, a-inhibin a calponin – biologicky aktívne látky v štruktúrach trofoblastu. Lojdov histochemický deň. Slovenská histochemická spoločnosť, Ústav patologickej anatómie LF UK, Výskumný ústav srdca SAV, Bratislava. 8, 2005. 17. Ito, K., Sasano, H., Yabuki, N., et al.: Immunohistochemical study of Ki-67 and DNA topoisomerase II in human endometrium. Mod Pathol. 10(4): 289–294, 1997. 18. Jakubovský, J.: Nekorektnosť vo vedeckom bádaní. In: Hulín, I. (Ed): Základy vedeckej práce. Slovak Academic Press, Bratislava. 424–442, 2003. 19. Jemal A, Murray T, Ward E, Samuels A, Tiwari RC, Ghafoor A, Feuer EJ, Thun MJ: Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin, 55, 2005, 1, 10-30. Erratum in: CA Cancer J Clin, 55, 2005, 4, 259. 20. Lax, S.F., Pizer, E.S., Ronnett, B.M., Kurman, R.J.: Clear cell carcinoma of the endometrium is characterized by a distinctive profile of p53, Ki-67, estrogen, and progesterone receptor expression. Hum Pathol. 29: 551–558, 1998. 21. Molnárová, A., Kováčová, E., Majtán, J., et al.: Chlamydia and mycoplasma infections during pregnancy and their relationships to orofacial cleft. Biologia. 61(6): 719–723, 2006. 22. Mutter, G.L., Ferenczy, A.: Anatomy and histology of the uterine corpus. In: Kurman, R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. Springer–Verlag, New York. 383–419, 2002.. 23. Pleško, I., et al: Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej republike v roku 1990. Aktual klin Onkol. 115, 1994. 24. Pleško, I., et al: Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej republike 2000. Národný onkologický ústav, Ústav experimentálnej onkológie SAV, Národný onkologický register Slovenskej republiky, Bratislava. 207, 2003. 25. Redecha, M., Korbeľ, M., Sasko, A.: Histologické nálezy endometria pri krvácaní v klimaktériu a séniu. Prakt Gynek. 3: 61–64, 1996. 26. Redecha, M., Nižňanská, Z., Korbeľ, M.: Klinická charakteristika karcinómu endometria. Gynekol prax. 3(4): 13–16, 2005. 27. Redecha, M., Nižňanská, Z., Korbeľ, M.: Výskyt zhubných nádorov tela maternice na Slovensku v rokoch 1990–2000. Gynekol prax. 2(4): 194–199, 2004. 28. Repiská V, Zummerová A, Miklóši M, et al.: Využitie metódy RT-PCR pri detekcii cirkulujúcich mikrometastáz. Rozhledy v chirurgii. 82(2): 95–102, 2003. 29. Robboy, S.J., Anderson, M.C., Russell, P.: Pathology of the Female reproductive tract. Churchill Livingstone, London – Edinburg – New York – Philadelphia. 929, 2002. 30. Robboy, S.J., Duggan, M.A., Kurman, R.J.: Gynecologic Pathology. In: Rubin, R., Farber. J.L. (Eds): Pathology. J. B. Lippincott Company, Philadelphia. 942–989, 1988. 31. Ronnett, B.M., Zaino, R.J., Ellenson, L.H., et al.: Endometrial Carcinoma. In: Kurman, R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. Springer Verlag, New York. 501–559, 2002. 32. Salvesen, H.B., Iversen, O.E., Akslen, L.A.: Identification of high-risk patients by assessment of nuclear Ki67 expression in a prospective study of endometrial carcinomas. Clin Cancer Res. 4: 2779–2785, 1998. 33. Scholzen, T., Gerdes, J.: The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182(3): 311– 322, 2000. 34. Silverberg, S.G., Kurman, R.J., Nogales, F., et al.: Epithelial tumors and related lesions. In: Tavassoli, F.A., Devilee, P. (Eds): WHO classification of tumours, pathology and genetics, tumours of the breast and female genital organs. Tumours of the uterine corpus. IARC Press, Lyon. 432, 2003 35. Šišovský, V.: Imunohistochemická analýza endometria za fyziologických a patologických stavov. Dizertačná práca. Univerzita Komenského, Bratislava. 144, 2005. 36. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Expresia kyseliny sialovej v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006c. 113 37. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Imunohistochemická analýza expresie vybraných proteínov v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006b. 38. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Jakubovský, J. et al.: The identification of sialic acid in normal endometrium and in endometrial carcinoma (85). In: Tribulová, N., Okruhlicová, Ľ. (Eds): Potential therapeutic targets in cardiovascular and other diseases. VEDA, Bratislava. 88, 2006e. 39. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Štvrtina, S., et al.: Angiogenéza v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006a. 40. Šišovský, V., Palkovič, M., Babál, P., et al.: The expresion of the selected proteins in endometrial carcinoma (79-84). In: Tribulová, N., Okruhlicová, Ľ. (Eds): Potential therapeutic targets in cardiovascular and other diseases. VEDA, Bratislava. 88, 2006d. 41. Šišovský, V., Palkovič, M., Zeljenková, D., et al.: Pôsobenie derivátov organofosfátov na reprodukčné orgány samíc potkanov Wistar. 12. kongres Slovenskej a Českej spoločnosti patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Bratislava. 48, 2004. 42. Šišovský, V., Palkovič, M., Janega, P., et al.: Expression of the estrogen alpha and progesterone receptor in I. and II. type of endometrial carcinoma. Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Abstracts, Bratislava. 94, 2007. 43. Šišovský, V., Palkovič, M., Janega, P., et al.: Correlation of the proliferation markers expression with the estrogen alpha receptor in endometrial carcinoma. Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Abstracts, Bratislava. 94, 2007. 44. Šišovský, V., Babál, P., Danihel, Ľ.: Sialylated glycoconjugates as prognostic indicator in clear cell endometrial carcinoma? Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Astracts, Bratislava. 95, 2007. 45. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria. Prakt Gynek. 14(3): 112–120, 2007. 46. Šuška, P.: Nádory maternice. In: Šuška, P. (Ed): Vybrané kapitoly z gynekológie. Univerzita Komenského. 254, 2003. 47. Šuška, P., Holomáň, K.: Endometrium v peri- a postmenopauze. Slovak Academic Press. Bratislava. 186, 1997. 48. Tabibzadeh, S.: Immunoreactivity of human endometrium: correlation with endometrial dating. Fertil Steril. 54: 624–631, 1990. 49. Weismanová, E., Weismann, P., Vizváryová, M., et al.: New approach to human high-risk papillomavirus (HR-HPV) genotyping. Neoplasma. 49(4): 217–224, 2002. 114 Identification of protein p53 in correlation with TP53 gene mutation in endometrial carcinoma Vladimír Šišovský1, Beata Bučeková1,2, Miroslav Budaj1,2, Ľudovít Danihel1, Vanda Repiská2 1 Department of Pathology, 2Institute of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Comenius University in Bratislava, Slovak Republic, [email protected] Abstract Endometrium is a specialized tissue characterized by intravital changes of its morphological appearance as well as of the expression of different proteins. It undergoes changes throughout the productive life of females, during menstrual period and significantly in neoplastic transformation. A total of 50 archival formalin-fixed and paraffin-embedded biopsy hysterectomy and curettage tissue specimens with proliferative endometrium (PE), endometrioid G1 (ECG1) and G3 (ECG3), serous (SC) and clear cell (CCC) ECa were evaluated immunohistochemically (IHC) for the expression of the protein p53 in nuclei of endometrial epithelial cells. Tissue specimens with the mentioned endometrial states were analyzed for the DNA polymorphism of codon 72 of TP53 gene by polymerase chain reaction using specific primers; product was restricted by restriction endonuclease BstU I (palindrome CGCG) and detected by agar gel electrophoresis. The expression of p53 was related only to aggressive (SC and ECG3; less CCC) types of ECa and to the worse clinical behavior of the tumor. The DNA polymorphism of codon 72 of TP53 was identified in SC. In conclusion, the increased expression of protein p53 is important prognostic markers of ECa. Evaluation of this protein by IHC is a relatively inexpensive and simple method with implications for clinical practice. In SC the expression of the mentioned protein is the highest and correlates with the TP53 gene alterations, with aggressive phenotype and the worse clinical behavior of the tumor. Introduction The increasing incidence of malignant tumors of the uterine corpus (American Cancer Society 2000, Jemal et al. 2005, Pleško et al. 1994, Pleško et al. 2003, Redecha et al. 2004) is becoming the subject of interests of various experts from different science disciplines. There are oncologists, gynecologists (Redecha et al. 1996, 2004, 2005, Šuška a Holomáň 1997, Šuška 2003), molecular biologists and genetics (Repiská et al. 2003) and pathologists (Breitenecker & Lax 1994, Danihel & Breitenecker 1997, Robboy et al. 2002, Danihel et al. 1995, 2003, 2005, Silverberg et al. 2003, Šišovský et al. 2004, 2006a,b,c,d,e, 2007a,b,c,d, Šišovský 2005, Budaj & Bučeková 2007a,b). Endometrial carcinoma (ECa) is the most common invasive neoplasm of the female genital tract, the 4th most frequently diagnosed cancer in the United States and worldwide the 5th most common cancer in women (American Cancer Society 2000, Ronnett et al. 2002, Jemal et al. 2005) and having an increasing incidence in the Slovak Republic (Pleško et al. 1994, 2003). Immunohistochemical (IHC) analysis is frequently one of the determining factor of diagnosis and prognosis of oncological illnesses with implications on their cure (Danihel a Porubský 1991, Danihel et al. 1995, Azumi a Czernobilsky 2002). Endometrium is a specialized tissue characterized by intravital changes of its morphological appearance as well as of the expression of different proteins (Mutter a Ferenczy 2002). It undergoes changes throughout the productive life of females, during menstrual period (Mutter a Ferenczy 2002) and significantly in neoplastic transformation (Ronnett et al. 2002). Expression of some proteins may be the first indicator of cell differentiation grade, proliferation and malignant change, as well as of clinical behavior of ECa. The TP53 is a tumor suppressor gene located on chromosome 17 (17p13.1) (Isobe et al. 1986, Kirsch a Kastan 1998) encoding a DNA-binding phosphoprotein p53 (Sekido et al. 2003) that is involved in the regulation of the CC (at the G1 checkpoint); has an inhibitory effect on cell proliferation and transformation and an activating effect on DNA repair and apoptosis (Kirsch a Kastan 1998, Sekido et al. 2003). 115 Mutation of the TP53 results in a mutant p53 with a longer half-life that accumulates in the cells (Kerns et al. 1992, Lodish et al. 2004) and lack of the above presented functions (Blagosklonny 2002, Ronnett et al. 2002). TP53 genetic alterations are associated with accelerated cell proliferation and aggressive phenotype of tumors (Kirsch a Kastan 1998) in a variety of human malignancies (Saffari et al. 2005). Molecular genetic studies have shown allelic deletion of chromosome 17p resulting in a mutated p53 in many malignant tumors including ECa (Okamoto et al. 1991). To evaluate IHC changes of expression of the protein p53 in correlation with the presence of TP53 codon 72 polymorphism with morphological appearance and clinical findings of ECa. Materials and methods A total of 50 endometrial biopsies (from the archives of Department of Pathology, Faculty of Medicine, Comenius University in Bratislava, during in years 1997-2007), that were obtained from endometrial curettage and hysterectomy specimens were included in this study. Formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples, classified by light microscopy, with proliferative endometrium (PE) (from woman 26-45 years of the age), endometrioid (EC) G1 (ECG1) (31-61 y.) and G3 (ECG3) (3161 y.), serous (SC) (39-86 y.) and clear cell (CCC) (60-86 y.) histological subsets of ECa were evaluated by IHC. The expression of the protein p53 in nuclei of endometrial epithelial cells was detected with monoclonal mouse antibody anti human p53 (DakoCytomation, Glostrup, Denmark). The indirect streptavidin-biotin – horseradish peroxidase complex (ABC-Px) technique with 3,3´diaminobenzidine (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) as chromogen was used to visualize the reaction product (DakoCytomation 2004, Azumi a Czernobilsky 2002). Findings (the protein expression / antibody reaction) were evaluated by light microscopy (Nikon Coolpix 990, Tokyo, Japan) semiquantitatively by scoring: negative – „-“, irregular weak positivity (up to 5% cells) – „+/-“, regular weak positivity (> 5% and < 25% cells) – „+“, regular moderate positivity (25% to 50% cells) – „++“, regular strong positivity (> 50% cells) – „+++“. Only nuclear staining was considered specific. Slides incubated with plain buffer instead of primary antibody were considered as negative control (NC). Tissue specimens with the mentioned endometrial states were analyzed for the DNA polymorphism of codon 72 (exon 4, presents the arginine (Arg) or proline (Pro) allelotypes) in the TP53 gene (17p13.1). DNA was isolated from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples by the solting-out procedure (Qiagen GmBH, Hilden; Invitrogen, USA) and amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers for codon 72 of the TP53 (Genecraft, Germany). PCR product (size 296 bp) was restricted by restriction endonuclease BstU I (palindrome CGCG) (New England Biolabs, USA) and detected by agar gel electrophoresis (Amresco, USA). Used methods/techniques corresponded to national and international ethical standards (Helsinki declaration in year 2002) (Jakubovský 2003). Results and discussion The expression of p53 was related only to aggressive (mainly SC and ECG3; less CCC) types of ECa (Fig. 3, 4, 5) and to the worse clinical behavior of the tumor. No expression of p53 was detected in PE and ECG1 (Fig. 1 a 2) (Tab. 1). The DNA polymorphism of codon 72 of TP53 was identified only in SC (70%), and correlated with the strong p53 immunoreactivity. The same polymorphism was not found in PE, ECG1, ECG3 and CCC (wild type allelotype) (Fig. 6). Endometrial status anti p53 antibody reaction Proliferative endometrium Endometrioid endometrial carcinoma, G1 Endometrioid endometrial carcinoma, G3 Serous endometrial carcinoma Clear cell endometrial carcinoma ++ +++ + Tab. 1. View of the anti p53 antibody reactions with nuclei of human endometrial glandular epithelial cells. Reaction: − negative, +/− irregular weak positivity, + regular weak positivity, ++ regular moderate positivity, +++ regular strong positivity 116 Fig. 1. Note the absence of p53 in PE. Avidin-biotin – peroxidase complex (ABC-Px), 100x. Fig. 2. Note the absence of p53 in ECG1. ABC-Px, 100x. Fig. 3. p53 detection in ECG3. ABC-Px, 200x. Fig. 4. Regular intense expression of p53 in SC. ABC-Px, 100x. Fig. 5. Regular weak expression of p53 in CCC. ABC-Px, 120x. 117 Fig. 6. The DNA polymorphism of codon 72 of TP53 detection in SC (side rail). Line (DNA restriction): known allelotypes (1-3): Pro/Pro (1), Arg/Arg (2), Arg/Pro (3); ECa (4-7), PE (8), NC (9), weight marker (mw) 100 bp ladder. Our results show a good correlation of expression of the protein p53 with histological grade of differentiation and are in agreement with other published works. To our best knowledge this is the first study evaluating the action of the protein p53 in correlation with the presence of TP53 codon 72 polymorphism in the endometrial glandular epithelial cells. Mutation of the p53 gene results in a mutant protein with a longer half-life that accumulates in the cell, and does not have the suppressor function for cell proliferation and transformation (Ronnett et al. 2002). Mutations in p53 are found in approximately 10% of all EC (Okamoto et al. 1991), and in approximately 50% of ECG3, and have not been identified in ECG1 (Parazzini et al. 1995), which was found as increased expression of p53 in ECG3 and no expression of p53 in ECG1 and PE in our material. In SC, the TP53 was shown to be altered in a significant number, with mutation identified in almost 90% of cases. Furthermore, approximately 75% of endometrial intraepithelial carcinomas, the putative precursor of SC, have mutations in TP53 (p53) (Tashiro et al. 1997). These findings suggest that in SC TP53 (p53) mutations occur relatively early and are central to the development of this tumor type. This is in contrast to EC, in which TP53 (p53) mutations are relatively uncommon and when they do occur, they are largely confined to ECG3 (Parazzini et al. 1995, Tashiro et al. 1997). This sentence found support in our results; in SC there was the highest increase of p53 expression, slightly lower expression was in ECG3. Thus, it is possible that the mutation of p53 early in the pathogenesis of SC is an important factor that accounts for its aggressive behavior (Soong et al. 1996). Malignant potencial of SC is similar to CCC (Danihel a Breitenecker 1997) when compared to EC (Sakuragi et al. 2000). Nonetheless, CCC is probably distinct from SC (and also EC) based on the significantly lower expression of p53 detected by IHC (Lax et al. 1998). This change corresponds to the result of our analysis, in which CCC demonstrated lower expression of p53 then SC. Results of Elhafey et al. (2001) showed, that expression of p53 was higher in the poor prognostic categories (SC and CCC) than in EC; in EC, p53 expression correlated with grade. The expression of p53 has a prognostic value in ECa (Hamel et al. 1996), and is an independent prognostic indicator in human ECa (Soong et al. 1996). Mutation or overexpression of p53 protein in ECa has been generally related to higher FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) stage, aggressive cell types (particularly SC), increased histological grade and depth of myometrial invasion (napr. Khalifa et al. 1994, Tashiro et al. 1997, Geisler et al. 1996, Lax et al. 1998). Saffari et al. (2005) examined p53 for genetic alterations (p53 mutations in exons 2-11 and p53 codon 72 single nucleotide polymorphisms (SNP) with an Arg/Pro allelotype) in 59 EC; twelve mutations (20.3%) and seven of the nine polymorphisms in codon 72 SNP with an Arg/Pro allelotype were identified. This finding do not corresponds to the result of our analysis, in which the same polymorphism of codon 72 of TP53 was not found in EC. Results of Saffari et al. (2005) showed, that the women with p53 genetic alterations (p53 mutation or p53 codon 72 SNP) had a lower overall survival rate than women whose tumors lacked alterations in the p53 gene. Among women with p53 alterations, adjuvant radiotherapy substantially increased survival. Conclusions The findings support the importance of IHC in detection of p53 protein in endometrium and possibilities in classification of various histological subsets and grades of ECa. The expression of p53 is related only to aggressive (SC and ECG3; less CCC) types of ECa. In SC the expression of the mentioned protein is the highest and correlates with the TP53 alterations, with aggressive phenotype and the worse clinical behavior of the tumor. In conclusion, the increased expression of protein p53 is 118 important prognostic markers of ECa. Evaluation of this protein by IHC is a relatively inexpensive and simple method with implications for clinical practice – on oncological illness cure. Acknowledgements This work was supported by grant of Lions Club International LC Bamberg-Mischelsberg and LC Kremnica and by UK/36/2007. Authors thank for the kind technical support to Mrs. I. Uhnavá. The first author wish to acknowledge District Governor 2006-2007 of Lions Club International District D-122 Czech Republic and Slovak Republic Mr. Dipl. Ing. Tibor Buček for his kind support. References 1. American Cancer Society: 2000 cancer statistics. CA Cancer J Clin. 50(1): 1–64, 2000. 2. Azumi, N., Czernobilsky, B.: Immunohistochemistry. In: Kurman, R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. 5th Edn. Springer – Verlag, New York. 1251–1276, 2002. 3. Blagosklonny, M.V.: P53: An ubiquitous target of anticancer drugs. Int J Cancer. 98: 161–166, 2002. 4. Breitenecker, G., Lax, S.: Tumoren des Corpus uteri einschliesslich der Plazenta (97-102). In: Histologische Tumor Klassifikation. Springer-Verlag, Wien, New York. 432, 1994. 5. Budaj, M., et al.: Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria. 46. fakultná konferencia ŠVOČ. Zborník prác. LF UK a Slovak Academic Press, Bratislava. 22–25, 2007a. 6. Budaj M, et al.: Identification of proliferation markers in correlation with p53 gene mutation in endometrial carcinoma. Vědecká konference studentů českých a slovenských lékařských fakult. Program a abstrakta prednášek, 3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze. 2007b. 7. DakoCytomation: DakoCytomation 2004/05 Catalog. Denmark: Glostrup. 359, 2004. 8. Danihel Ľ, Breitenecker G: Histologická diagnostika nenádorových a nádorových zmien endometria v peria postmenopauze. In: Šuška, P., Holomáň, K. (Eds): Endometrium v peri- a postmenopauze. Slovak Academic Press, Bratislava. 14–41, 1997. 9. Danihel, Ľ., Porubský, J.: Prínos monoklonálnych protilátok v bioptickej diagnostike nádorov. Bratisl lek Listy. 92: 460–466, 1991. 10. Danihel, Ľ., et al.: Imunohistochemické markery v diagnostike nádorov maternice. Bratisl lek Listy. 96: 353– 360, 1995. 11. Danihel, Ľ., Horváth, R., Breitenecker, G., Hatzibugias, I.: Súčasná klasifikácia a charakteristika nádorov endometria. Slov gynek por. 10(Suppl): 14–17, 2003. 12. Danihel, Ľ., Šišovský, V., Palkovič, M., et al.: Karcinóm endometria – histopatologická klasifikácia a charakteristika. Gynekol prax. 3: 9–12, 2005. 13. Elhafey, A.S., et al: Computerized image analysis of p53 and proliferating cell nuclear antigen expression in benign, hyperplastic, and malignant endometrium. Arch Pathol Lab Med. 125: 872–879, 2001. 14. Geisler, J.P., et al: p53 as a prognostic indicator in endometrial cancer. Gynecol Oncol. 61: 245–248, 1996. 15. Hamel, N.W., Sebo, T.J., Wilson, T.O., et al.: Prognostic value of p53 and proliferating cell nuclear antigen expression in endometrial carcinoma. Gynecol Oncol. 62: 192–198, 1996. 16. Isobe, M., Emanuel, B.S., Givol, D., et al.: Localization of gene for human p53 tumour antigen to band 17p13. Nature. 320: 84–85, 1986. 17. Jakubovský, J.: Nekorektnosť vo vedeckom bádaní. In: Hulín, I. (Ed): Základy vedeckej práce. Slovak Academic Press, Bratislava. 424–442, 2003. 18. Jemal, A., Murray, T., Ward, E., et al.: Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 55: 10–30, 2005. 19. Kerns, B.J., Jordan, P.A., Moore, M.B., et al.: p53 overexpression in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue detected by immunohistochemistry. J Histochem Cytochem. 40: 1047–1051, 1992. 20. Khalifa, M.A., Mannel, R.S., Haraway, S.D., et al.: Expression of EGFR, HER-2/neu, P53, and PCNA in endometrioid, serous papillary, and clear cell endometrial adenocarcinomas. Gynecol Oncol. 53: 84–92, 1994. 21. Kirsch, D.G., Kastan, M.B.: Tumor-suppressor p53: implications for tumor development and prognosis. J Clin Oncol. 16: 3158–3168, 1998. 22. Lax, S.F., et al.: Clear cell carcinoma of the endometrium is characterized by a distinctive profile of p53, Ki67, estrogen, and progesterone receptor expression. Hum Pathol. 29: 551–558, 1998. 23. Lodish, H., et al.: Molecular cell biology. W.H. Freeman and company, New York. 2004. 24. Mutter, G.L., Ferenczy, A: Anatomy and histology of the uterine corpus. In: Kurman, R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. 5th Edn. Springer-Verlag, New York. 383–419, 2002. 25. Okamoto, A., Sameshima, Y., Yamada, Y., et al.: Allelic loss on chromosome 17p and p53 mutations in human endometrial carcinoma of the uterus. Cancer Res. 51: 5632–5635, 1991. 26. Parazzini, F., La Vecchia, C., Negri, E.: Smoking and risk of endometrial cancer: results from an Italian casecontrol study. Gynecol Oncol. 56: 195–199, 1995. 27. Pleško, I., et al.: Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej republike v roku 1990. Aktual klin Onkol. 115, 1994. 119 28. Pleško, I., et al.: Incidencia zhubných nádorov v Slovenskej republike 2000. Národný onkologický ústav, Ústav experimentálnej onkológie SAV, Národný onkologický register SR, Bratislava. 207, 2003. 29. Redecha, M., Korbeľ, M., Sasko, A.: Histologické nálezy endometria pri krvácaní v klimaktériu a séniu. Prakt Gynek. 3: 61–64, 1996. 30. Redecha, M., et al.: Klinická charakteristika karcinómu endometria. Gynekol prax. 3: 13–16, 2005. 31. Redecha, M., Nižňanská, Z., Korbeľ, M.: Výskyt zhubných nádorov tela maternice na Slovensku v rokoch 1990-2000. Gynekol prax. 2: 194–199, 2004. 32. Repiská, V., Zummerová, A., Miklóši, M., et al.: Využitie metódy RT-PCR pri detekcii cirkulujúcich mikrometastáz. Rozhledy v chirurgii. 82: 95–102, 2003. 33. Robboy, S.J., Anderson, M.C., Russell, P.: Pathology of the Female reproductive tract. Churchill Livingstone, London, Edinburg, New York, Philadelphia. 929, 2002. 34. Ronnett, B.M., Zaino, R.J., Ellenson, L.H., Kurman, R.J.: Endometrial Carcinoma. In: Kurman R.J. (Ed): Blaustein´s Pathology of the Female Genital Tract. 5th Edn. Springer Verlag, New York. 501–559, 2002. 35. Saffari, B., Bernstein, L., Hong, D.C., et al.: Association of p53 mutations and a codon 72 single nucleotide polymorphism with lower overall survival and responsiveness to adjuvant radiotherapy in endometrioid endometrial carcinomas. Int J Gynecol Cancer. 15: 952–963, 2005. 36. Sakuragi, N., Hareyama, H., Todo, Y., et al.: Prognostic significance of serous and Clar cell adenocarcinoma in surgically staged endometrial carcinoma. Acta Obstet Gynecol Scand. 79: 311–316, 2000. 37. Sekido, Y., Fong, K.M., Minna, J.D.: Molecular genetics of lung cancer. Annu Rev Med. 54: 73–87, 2003. 38. Silverberg, S.G., Kurman, R.J., Nogales, F., et al.: Epithelial tumors and related lesions. In: Tavassoli, F.A., Devilee, P. (Eds): WHO classification of Tumours, Pathology and Genetics, Tumours of the Breast and Female Genital Organs. Tumours of the Uterine Corpus. IARC Press, Lyon. 432, 2003. 39. Soong, R., Knowles, S., Williams, K.E., et al.: Overexpression of p53 protein is an independent prognostic indicator in human endometrial carcinoma. Br J Cancer. 74: 562–567, 1996. 40. Šišovský, V.: Imunohistochemická analýza endometria za fyziologických a patologických stavov. Dizertačná práca. Univerzita Komenského, Bratislava. 144, 2005. 41. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Expresia kyseliny sialovej v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác. Mojmírovce. 2006c. 42. Šišovský, V., et al.: Imunohistochemická analýza expresie vybraných proteínov v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006b. 43. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Jakubovský, J., et al.: The identification of sialic acid in normal endometrium and in endometrial carcinoma (85). In: N. Tribulová, Ľ. Okruhlicová (Eds) Potential therapeutic targets in cardiovascular and other diseases. VEDA, Bratislava. 88, 2006e. 44. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Štvrtina, S., et al.: Angiogenéza v endometriu za fyziologických stavov, v hyperplázii endometria a v karcinóme endometria. XIV. vedecká konferencia slovenských a českých patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Mojmírovce. 2006a. 45. Šišovský, V., Palkovič, M., Babál, P., et al.: The expresion of the selected proteins in endometrial carcinoma In: Tribulová, N., Okruhlicová, Ľ. (Eds): Potential therapeutic targets in cardiovascular and other diseases. VEDA, Bratislava. 79–84, 2006d. 46. Šišovský, V., Palkovič, M., Zeljenková, D., et al.: Pôsobenie derivátov organofosfátov na reprodukčné orgány samíc potkanov Wistar. 12. kongres Slovenskej a Českej spoločnosti patológov s medzinárodnou účasťou. Zborník vedeckých prác, Bratislava. 48, 2004. 47. Šišovský, V., Palkovič, M., Janega, P., et al.: Expression of the estrogen alpha and progesterone receptor in I. and II. type of endometrial carcinoma. Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Abstracts, Bratislava. 94, 2007. 48. Šišovský, V., Palkovič, M., Janega, P., et al.: Correlation of the proliferation markers expression with the estrogen alpha receptor in endometrial carcinoma. Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Abstracts, Bratislava. 94, 2007. 49. Šišovský, V., Babál, P., Danihel, Ľ., et al.: Sialylated glycoconjugates as prognostic indicator in clear cell endometrial carcinoma? Morphology 2007 - 41st International Congress of Slovak Anatomical Society and 44th Lojda Symposium on Histochemistry “Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry”. Programme and Astracts, Bratislava. 95, 2007. 50. Šišovský, V., Danihel, Ľ., Babál, P., et al.: Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria. Prakt Gynek. 14: 112–120, 2007. 51. Šuška, P.: Nádory maternice. In: Šuška, P. (Ed): Vybrané kapitoly z gynekológie. Univerzita Komenského, Bratislava. 182–200, 2003. 52. Šuška, P., Holomáň, K.: Endometrium v peri- a postmenopauze. SAP, Bratislava. 186, 1997. 53. Tashiro, H., Isacson, C., Levine, R.,e t al.: p53 gene mutations are common in uterine serous carcinoma and occur early in their pathogenesis. Am J Pathol. 150: 177–185, 1997. 120 Detekcia mikrodelécií Y chromozómu u mužov s poruchami plodnosti Ľubica Strháková, Regína Behulová, Robert Petrovič, Katarína Kolejáková, Danka Maceková, Mária Fischerová, Jozef Adámať, Pavol Ipóth, Ján Chandoga Centrum lekárskej genetiky FNsP Bratislava, Slovenska Republika, [email protected] Abstrakt Y chromozóm je najmenší z ľudských chromozómov. Na dlhom ramienku Y chromozómu sa nachádza AZF oblasť (azoospermia factors). Delécie v tejto oblasti spôsobujú poruchy spermatogenézy a pacienti trpia rôznymi poruchami plodnosti. AZF oblasť je rozdelená na tri podoblasti: AZFa, AZFb a AZFc. Na základe Európskych guidelines pri poruchách fertility sa odporúča vyšetrovať šesť sekvencií sY 84, sY 86, sY 127, sY 134, sY 254, sY 255, ktoré sa nachádzajú v jednotlivých podoblastiach a SRY gén (tzv. TDF - testes determing factor), ktorý sa nachádza na krátkom ramienku Y chromozómu. Na identifikáciu AZF delécii sme použili PCR metódu. V sledovanom súbore 822 pacientov sme delécie AZF oblasti zaznamenali u 38 pacientov, čo predstavuje 4,62%. Úvod Príčiny porúch plodnosti sú založené buď na biologickom podklade alebo sú spôsobené vplyvom vonkajších podmienok. Z vonkajších faktorov je to najmä fajčenie, alkohol, toxické látky. Z biologických sú to rôzne druhy infekcií, produkcia antispermatických protilátok, varikokela, tumory testes. K vývojovým a štrukturálnym vadám patria kryptorchizmus, Klinefelterov syndróm XXY, mikrodelécie v AZF lokuse (13% azoospemických mužov, 1-7 %oligospermických mužov), „sex reversal“ syndróm- 46,XX s mužským fenotypom s výskytom 1:20000 chlapcov, SCO (Sertoli cell only) syndróm a chromozómové abnormality (trizómia). Mikrodelécie Y chromozómu sú druhou najčastejšou genetickou príčinou porúch spermatogenézy u mužov s poruchami plodnosti. Molekulárna diagnostika týchto mikrodelécií sa stala dôležitým diagnostickým krokom laboratórneho vyšetrenia mužov s poruchou plodnosti (Vogt a kol., 1996). Y chromozóm má dĺžku 60Mb (Brdička a kol., 1995). Gény ležiace na tomto chromozóme majú esenciálnu úlohu v determinácii mužského pohlavia. 95 % Y chromozómu tvorí mužský špecifický región (MSY), ktorý je ohraničený pseudoautozomálnymi oblasťami. V MSY regióne sa nachádzajú 3 AZF oblasti : AZFa, AZFb, AZFc (Vogt a kol., 1996) (obr.1). Tiepollo a Zuffardi lokalizovali AZF oblasť do regiónu Yq11.23 (Tiepollo, Zuffardi, 1976). Mikrodelécie sú relatívne časté u pacientov s poruchami plodnosti, hoci ich incidencia môže značne varírovať v závislosti na selekčných kritériách, podľa ktorých sú pacienti vyberaný. Azoospermici majú vyšší výskyt mikrodelécií ako oligospermici, a preto sa frekvencia delécií pri vyšetrení v rôznych laboratóriách pohybuje v pomerne širokom rozpätí 2-10 % ( Krausz a McElreavey, 1999, Krausz a kol., 2001). Obr. 1. Schematické znázornenie AZF oblasti a jej 3 podoblastí AZFa, AZFb, AZFc. 121 Materiál a metódy Do Centra lekárskej genetiky FNsP Bratislava bolo od roku 1998 do roku 2006 zaslaných 822 pacientov s požiadavkou vyšetrenia mikrodelécií AZF oblasti Y chromozómu v dôsledku rôznych porúch mužskej neplodnosti. Klinickým materiálom zaslaným z iných pracovísk na vyšetrenie je periférna krv v roztoku EDTA (výsledná koncentrácia 5 mmol), prípadne už naizolovaná DNA. DNA sme izolovali klasickou vysoľovacou metódou, resp. použitím komerčného setu FlexiGene DNA Kit. Na detekciu mikrodelécií v AZF sme použili metódu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR): denaturácia 94 ° C/5min, (denaturácia 94° C/ 1 min, annealing primerov 61° C/ 1min, polymerizácia 72° C/ 1 min) 30 cyklov, záverečná dlhá polymerizácia 72° C/5 min. Ako pozitívnu kontrolu sme použili DNA zdravého muža, ako negatívnu kontrolu DNA zdravej ženy, ako internú kontrolu sekvencie ZFY/ZFX a PABX. PCR produkty sme elektroforeticky separovali v 2% agarózovom géli pri laboratórnej teplote, v TBE tlmivom roztoku pri 200 mA. DNA sme vizualizovali pomocou EtBr (etídium bromid), ktorý sme pridali priamo do gélu s presvietením na UV transluminátore. Výsledky a diskusia Diagnózy zaslaných pacientov do CLG FNsP sme rozdelili do 4 skupín: azoospermia, oligospermia, oligoasthenospermia a iné. Do skupiny iné sme zaradili diagnózy s nízkym zastúpením u pacientov (oligoasthenoteratospermia, teratospermia, nekrospermia a patologický karyotyp). V sledovanom súbore 822 pacientov bolo 349 pacientov s azoospermiou (42%), 92 pacientov s oligospermiou (11%), 196 pacientov s oligoasthenospermiou (24%) a 185 pacientov sme zaradili do skupiny iné (23%), ktorá zahŕňa málopočetné diagnózy. Priemerný vek pacientov bol 31,74. Z každej z troch definovaných AZF podoblastí- AZFa, AZFb a AZFc sme vybrali sekvencie, ktoré sme použili na zistenie mikrodelécií. Z AZFa podoblasti sú to sekvencie sY 85, sY 84, sY 86, z AZFb podoblasti sY 129, sY 164, sY 139, sY 143, sY 127, sY 134 a z AZFc podoblasti sekvencie sY 147, sY 158, sY 243, sY 273, sY 220, sY 277, sY 283, sY 254, sY 255. Spolu to predstavovalo 18 sekvencií, ktoré sa nachádzajú na dlhom ramienku Y chromozómu v AZF oblasti. V súbore pacientov sme zachytili 38 pacientov s deléciou, čo predstavuje 4,62%. 24 pacientov s deléciou je v súbore pacientov s azoospermiou, čo predstavuje 6,88%, 4 pacienti sú v súbore s oligospermiou (4,35%), 9 pacientov je v súbore oligoasthenospermiou (4,59%) a jeden pacient je zo súboru iné (0,54%). V súbore pacientov s azoospermiou a oligospermiou sme zistili 28 pacientov s deléciou (6,35%). Najvyššie zastúpenie delécií je z podoblasti AZFc (52%), z podoblasti AZFb je to 29% a najnižšie zastúpenie má podoblasť AZFa (19%). Percentuálne zastúpenie delécií z oblasti AZFbc je 80,7%. Najčastejšie deletovanou sekvenciou bola sekvencia sY 283, ktorá nebola diagnostikovaná v 72% pacientov so zistenou deléciou. Delécia sekvencie sY 243 nebola diagnostikovaná ani v jednom prípade. Obe sekvencie sa nachádzajú v AZFc podoblasti. Z celkového počtu 822 pacientov s požiadavkou na vyšetrenie mikrodelécií AZF oblasti sme delécie zaznamenali v 38 prípadoch (4,62%). Literárne zdroje uvádzajú, že 10-15% pacientov s azoospermiou a 5-10% pacientov s oligospermiou má mikrodelécie v AZF oblasti (Cram a kol., 2000, McElvearey, Krausz, 1999). Naša hodnota 4,62% je pod udávanou frekvenciou pacientov s oligospermiou. Jedným z dôvodom veľkého rozpätia intervalu frekvencií delécií je etnické zloženie študovaných pacientov (Krausz a kol., 2001, Maurer a kol., 2001). Zo sledovaného súboru 822 pacientov sme delécie AZF oblasti zistili v 38 prípadoch (4,62%), 24 pacientov pochádza zo súboru pacientov s azoospermiou (6,88%), 4 pacienti s deléciami mali diagnostikovanú oligospermiu (4,35%), 9 pacientov s deléciami oligoasthenospermiu (4,59%) a jeden pacient je zo súboru iné s presne neurčenou gonozómovou anomáliou. Brandell a kol. a Martinez a kol. uvádzajú, že mikrodelécie Y chromozómu majú zastúpenie v 6-18% pacientov s azoospermiou a oligospermiou (Brandell a kol., 1998, Martinez a kol., 2000). V našom súbore pacientov sme zistili 6,3% zastúpenie pacientov s mikrodeléciami AZF oblasti u pacientov s azoospermiou a oligospermiou, čo zapadá do uvedeného intervalu. Závery PCR metóda sa ukázala ako dostatočne spoľahlivá, rýchla a citlivá metóda na zistenie mikrodelécií AZF oblasti. 122 V budúcnosti doporučujeme zamerať sa j na iné gény, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v determinácii pohlavia (DAX1 gén) a ich identifikáciu pomocou časovo a finančne nenáročných metód, napríklad real time PCR. Použitá literatúra 1. Brdička, R., Siegelova, Z.: Lidský genom - Y chromozom. Časopis Lékařu českých. 134: 798–800, 1995. 2. Brandell, R.A., Mielnik, A., Liotta, D., et al.: AZFb deletions predict the absence of spermatozoa with testicular sperm extraction: preliminary report of a prognostic genetic test. Hum Reprod. 13: 2812–2815, 1998. 3. Cram, D.S., Ma, K., Bhasin, S., et al.: Y chromosome analysis of infertile men and their sons conceived through intracytoplasmic sperm injectin: vertical transmission of deletions and rarity of the de novo deletions. Fertil. Steril. 74(5): 909–915, 2000. 4. Krausz, C., McElreavey, K.: Y chromosome and male infertility. Frontiers in Bioscience. 4: E1–8., 1999. 5. Krausz, C., Rajpert - De Meyts, E., Larsen, L.F., et al.: Double blind screening for microdeletions Y chromosome genes in infertile and fertile/normospermic danish men. J Clin Endocrinol Metabolism. 86: 2638–2642, 2001. 6. Martinez, M.C., Bernabe, M.J., Gomez, E., et al.: Screening for AZF deletion in a large series of severely impaired spermatogenesis patients. J Androl. 21: 651–655, 2000. 7. Maurer, B., Gromoll, J., Simoni, M., Nieschlag, E.: Prevalence of Y chromosome microdeletions in infertile men who consulted a tertiary care medical centre: the Munster experience. Andrologia. 33: 27–33, 2001. 8. Tiepolo, L., Zuffardi, O.: Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Ychromosome long arm. Hum Genet. 34: 119–124, 1976. 9. Vogt, P.H., Edelmann, A., Kirsch, S.: Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet. 5: 933–43, 1996. 123 Štúdium biokompatibility biomateriálov na báze prírodných polymérov : mikrokapsule na báze chitozánu a ľudská amniová membrána Marica Theiszová1, Soňa Jantová1, Jana Dragúňová2, Lucia Kalinovská3 1 Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Bratislava; 2Centrálna tkanivová banka, Klinika popálenín, FNsP Ružinov, Bratislava; 3Ústav polymérnych materiálov, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Bratislava, Slovenská Republika Abstrakt Štúdium biokompatibility biomateriálov predpisujú toxikologické smernice ISO. V tejto práci sa študovala cytotoxicita štyroch typov mikrokapsúl na báze chitozánu na NIH3T3 bunkách sledovaním množstva uvoľneného LDH a vhodnosť použitia ľudskej amniovej membrány na kultiváciu a liečbu deficiencie limbálnych kmeňových buniek. Testy cytotoxicity potvrdili netoxický charakter všetkých typov mikrokapsúl a vhodnosť použitia amniovej membrány pri reepitalizácii rohovky. Úvod V súčasnosti sa biomateriály používajú pri obnovení alebo zlepšení funkcií ľudského tela ako umelé bedrové kĺby, umelé srdcové chlopne, umelé šlachy a cievy, ale čoraz častejšie nachádzajú svoje uplatnenie aj v maxilofaciálnej a plastickej chirurgii. Mikrokapsule na báze chitozánu predstavujú polymérny typ biomateriálu, ktorého základ tvorí lineárny polysacharid pozostávajúci z (1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glukopyranózy. Chitozán má v medicíne široké uplatnenie (ortopédia, oftalmológia, farmácia). Mikrokapsule na báze chitozánu boli pripravené s cieľom ich medicínskeho využitia ako nosičov pre antibiotiká. Amniová membrána-vnútorná membrána fetálnej membrány predstavuje prírodný biomateriál, ktorý má výborné biologické vlastnosti (antibakteriálne, chráni pred poranením, mierni bolesť, potláča fibrózu, napomáha epitelizácii rohovky). Pre tieto vlastnosti sa využíva v rôznych odvetviach medicíny (transplantácia kože, obväz na otvorené rany, oftalmológia). V oftamológii sa používa pri rekonštrukciách a epitelizácii rohovky u pacientov s čiastočnou alebo úplnou deficienciou limbálnych kmeňových buniek (http://www.dcmsonline.org/jax-medecine/2002journals/augsept2002/amniotic. html; Schwab et al. 2000; Tsai et al. 2000). Nami pripravená amniová membrána obsahujúca epitelovú vrstvu sa použila na kultiváciu limbálnych kmeňových buniek. Biomateriály môžu pre človeka predstavovať nízke, stredné alebo vysoké potencionálne riziko zdravotnej bezpečnosti v závislosti od typu rozsahu biomateriálu s pacientovým telom. Jedným z kritérií hodnotenia je štúdium cytotoxicity – škodlivosti až jedovasti biomateriálu pre bunkový systém. V tejto práci sme študovali cytotoxický účinok štyroch typov mikrokapsúl na báze chitozánu na fibroblastových myšacích NIH-3T3 bunkách a ľudskej amniovej membrány na limbálnych kmeňových bunkách. Materiál a metódy Mikrokapsule štyroch typov sa pripravili jednokrokovým kontinuálnym spôsobom vo viacslučkovom reaktore. Prvý a druhý typ mikrokapsúl neobsahovali vo vnútri antibiotikum ofloxacín, tretí a štvrtý typ obsahovali antibiotikum ofloxacín. Amniová membrána sa získala po cisárskom reze z plodového obalu zdravej rodičky. Potom transporte do Centrálnej tkanivovej banky FNsP v Ružinove sa do 1 h za sterilných podmienok membrána preniesla do roztoku antibiotík (antimykotiká : 50 µg/ml penicilín, 50 µg/ml streptomycín a 2,5 µg/ml amfotericín B) a lavážovala sa 24 hodín pri 4°C. Potom sa premyla sterilným fyziologickým roztokom, oddelil sa amnion od chorionu a od krvi očistená amniová membrána sa zabalila do špecialného obalu a uskladnila v kryokonzervačnom médiu pri teplote -80°C. Amniová membrána sa pred testovaním rozmrazila vo vode (37°C). Kryokonzervačné médium sa odstránilo niekoľkonásobným premytím amniovej membrány v sterilnom fyziologickom roztoku. Myšacie adherentné fibroblastové bunky NIH-3T3 izolované z embrya švajčiarskeho myšacieho albína sa kultivovali v DMEM médiu, ktoré bolo obohatené penicilínom (100 µg/ml), 124 streptomycínom (100 µg/ml) a 10 % FS, v termostate pri 37°C a vlhčenej atmosfére obsahujúcej 5 % CO2. Adherentné ľudské limbálne bunky sa izolovali z limbusu ľudskej rohovky. Na kultiváciu primokultúry sa použilo kultivačné médium DMEM/ HAM F12 obohatené 10 % ITS a rastovým faktorom EGF (10 ng/ml). Primokultúra sa kultivovala v termostate pri 37°C a vlhčenej atmosfére obsahujúcej 5 % CO2. Morfológia buniek sa pozorovala v svetelnom mikroskope. Sledovali sa zmeny v tvare, veľkosti a bunkovej adherencii. Viabilita buniek sa hodnotila vitálnym testom farbením roztokom neutrálnej červenej. Morfológia sa pozorovala mikroskopom Carl Zeiss Axion Imager. Množstvo uvoľnenej LDH sa stanovilo podľa Bergmeiera [1970]. Oxidácia NADH sa merala na spektrofotometri PU 8759 UV/VIS značky PHILIPS pri vlnovej dĺžke λ= 340 nm. Limbálne bunky (fixované metanolom na krycom sklíčku) sa 60 min. inkubovali s primárnou protilátkou (α -enoláza značená FITC, cytokeratín 12) pri teplote 37°C, potom sa premývali 4x10 min. 0,2 % Tweenom 20 v PBS. Takto pripravené bunky sa 60 min. inkubovali s fluorescenčne značenou sekundárnou protilátkou pri 37°C. Po inkubácii sa 4x10 min. premývali roztokom PBS a takto pripravené preparáty sa analyzovali a fotografovali pomocou fluorescenčného mikroskopu Carl Zeiss Axion Imager (FITC-protilátka : excitačná vlnová dĺžka 493 nm, emisná vlnová dĺžka 517 nm). Výsledky a diskusia Rast buniek NIH-3T3 na povrchu mikrokapsúl sa hodnotil po 72, 120 a 168 h kultivácii meraním množstva uvoľneného enzýmu laktátdehydrogenázy (obr. 1) a viability buniek detekovanej neutrálnou červenou. Ako kontrola, voči ktorej sa účinok mikrokapsúl porovnával, sa použili NIH-3T3 bunky kultivované v sterilných skúmavkách bez prítomnosti mikrokapsúl. Ako vyplýva z obrázku 1, množstvo uvoľneného enzýmu LDH z NIH-3T3 buniek kultivovaných na povrchu mikrokapsúl všetkých typov s časom kultivácie klesalo a po 168 h kultivácie bolo oproti kontrole 3,3 – 2,2 – krát nižšie. Testovaná koncentrácia ofloxacínu (2,76.10-5 mol/L) v mikrokapsuliach typu 3 a 4 nevyvolala na NIH-3T3 bunkách cytotoxický účinok. Výsledky zo sledovanie viability NIH-3T3 buniek v/ bez prítomnosti mikrokapsúl potvrdili výsledky z merania hladiny uvoľneného enzýmu LDH. Bunky kultivované na povrchu mikrokaspúl sa fabili počas celého experimentu neutrálnou červenou a boli živé (obrázky neuvádzame). Z uvedeného možno konštatovať, že mikrokapsule všetkých testovaných typov zlepšili oproti kontrole proliferáciu buniek, pretože s časom kultivácie sa zvyšovala neuvoľnená bunková hladina laktátdehydrogenázy NIH-3T3 buniek. množstvo uvoľnenej LDH (%) 70 K Typ1 Typ2 Typ3 Typ4 60 50 40 30 20 10 0 120 72 72 čas (h) 168 172 Obr. 1. Množstvo uvoľneného enzýmu LDH po 72, 120 a 168 h kultivácii NIH-3T3 buniek na vrstve mikrokapsúl. K = kontrola, Typ 1 = chitozán/tripolyfosfát, Typ 2 = chitozán/(tripolyfosfát a chondroitínsulfát), Typ 3 = (chitozán+ofloxacín)/ tripolyfosfát, Typ 4 = (chitozán a ofloxacín)/ (tripolyfosfát a chondroitínsulfát). Na identifikáciu limbálnych kmeňových buniek rastúcich v primokultúre odobratej od pacienta a ich diferencovaných typov buniek sa používajú rôzne charakteristické proteíny ako napr. α- 125 enoláza pre limbálne kmeňové bunky a cytokeratín 12 pre diferencované bunky. Ako vidieť z obr. 2 (a) v cytoplazme limbálnych buniek bola lokalizovaná α-enoláza (svietiaca zelená farba), čo možno považovať za dôkaz prítomnosti limbálnych kmeňových buniek v kultúre. Zároveň sa zisťovalo, či sa tieto bunky v priebehu 7-dňovej kultivácie v Petriho miske diferencovali na epiteliálne bunky rohovky. Na identifikáciu sa použila protilátka cytokeratín 12. Prítomnosť cytokeratínu 12 sme nedokázali (žiadne zeleno sfarbené bunky) a teda cytokeratín 12 nebol vhodný na identifikáciu limbálnych kmeňových buniek rastúcich v primokultúre. Limbálne bunky po preočkovaní z Petriho misky na povrch amniovej membrány rástli a po 14. dňoch kultivácie vytvorili konfluentnú vrstvu (obr. 2b). Pri experimentoch sme použili amniovú membránu, na ktorej bola zachovaná epiteliálna vrstva amnionu. Pomocou MTT testu sme zistili, že epiteliálne bunky boli vitálne (farbili sa na modro), ale neproliferovali (bunky amniovej membrány netvorili ani po 14. dňoch orgánovú kultúru). Toto bolo pravdepodobne príčinou dobrej proliferácie limbálnych kmeňových buniek na povrchu amniovej membrány bez toho, aby sa pridali do kultivačného média rastové faktory alebo mitomycínom ovplyvnené myšacie NIH-3T3 bunky. Použitie amniovej membrány s epiteliálnou vrstvou je jedinečné z hľadiska pacienta, kde nedochádza k nevhodnej imunitnej reakcii na myšací antigén prítomný v NIH-3T3 bunkách. a b a b Obr. 2. Fluorescenčná mikroskopia limbálnych kmeňových buniek. (a) identifikácia limbálnych buniek pomocou protilátky α-enoláza a (b) 14. dňový rast limbálnych kmeňových buniek na povrchu amniovej membrány. Zväčšenie 200x (a) a 100x (b). Závery Na základe uvedených výsledkov možno konštatovať, že testované mikrokapsule nevyvolali na NIH-3T3 bunkách cytotoxický účinok. Bunky rastúce na povrchu všetkých typov mikrokapsúl boli živé (farbili sa neutrálnou červenou) a proliferovali. Použitie amniovej membrány ako povrchu pre kultiváciu limbálnych buniek je veľmi vhodným modelom pri liečbe deficiencie limbálnych buniek. Poďakovanie Práca bola podporená Agentúrou pre výskum a vývoj SR, projekt APVV 20-015904. Použitá literatúra 1. Bergmeier, H.U.: Methoden der enzymatischen Analyse. 2nd ed.. Akademie Verlag, Berlin. 1970. 2. http://www.dcmsonline.org/jax-medecine/2002journals/augsept2002/amniotic.html 3. Schwab, I.R., Reyes, M., Isseroff, R.R.: Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease. Bornea. 19: 421– 426, 2000. 4. Tsai, R.J.F., Li, L.M., Chen, J.K.N.: Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. Engl J Med 343: 86–93, 2000. 126 Biologická charakteristika a potenciál kmeňových buniek Marcela Uličná, Ján Vojtaššák Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, Ústav lekárskej biológie a genetiky, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Kmeňové bunky, vzhľadom na svoje biologické vlastnosti, predstavujú unikátny „nástroj“ pre regeneračnú medicínu. V predkladanom článku prehľadne opisujeme charakteristiky a potenciál mezenchýmových kmeňových buniek. Úvod Kmeňové bunky (KB) sú vo všeobecnosti definované ako klonogénne, nediferencované bunky schopné sebaobnovy z ktorých môže vzniknúť jeden alebo viac typov diferencovaných buniek (Jakubovský et al., 2007). Dodnes boli izolované a charakterizované z embryonálneho, fetálneho a dospelého tkaniva. Embryonálne kmeňové bunky (EKB) sú pluripotentné, schopné vytvoriť bunky všetkých troch zárodočných listov a sú schopné neobmedzenej proliferácie v nediferencovanom stave (Thomson et al., 1998). Fetálne kmeňové bunky izolované z veľkého množstva vyvíjajúcich sa orgánov majú značný proliferačný potenciál a schopnosť diferenciácie. Sú prostriedkom medzi EKB, ktoré sú úplne nezadané a potrebujú diferenciačný stimul aby sa stali diferencovaným tkanivom, a dospelými progenitorovými alebo kmeňovými bunkami ktoré sú zadané, ale môžu vyžadovať určité stimuly (Olivier et al., 2004; Svendsen, 2002). Postnatálne KB, známe ako dospelé KB boli izolované a charakterizované z množstva tkanív (kostná dreň, tukové tkanivo, kostrový sval, koža, cievy a srdce, tráviaci systém, pečeň, pankreas, obličky, pľúca a nervový systém). Ich diferenciačný potenciál odzrkadľuje ich lokálne prostredie – membránové komponenty, difundabilné faktory, molekuly extracelulárnej matrix (Petersen et al.,1999; Despars et al., 2004; Gordon, 1988; Gordon et al., 1988; Quesenberry et al., 2004). Dospelé KB majú obmedzený vývin na určité špecifické bunkové línie v závislosti od toho, v ktorom tkanive sa nachádzajú ale takisto majú schopnosť transdiferenciácie – plasticity. Plasticita umožňuje určitým tkanivovo špecifickým kmeňovým bunkám produkovať nielen fixné typy potomstva ale pri umiestnení v novej niche vytvárať nové špecializované skupiny buniek (Alison et al., 2000; Azizi et al., 1998; Bjornson et al., 1999; Filip et al., 2004; Lagasse et al., 2000). Mezenchýmové kmeňové bunky Mezenchýmové kmeňové bunky (MKB) sú multipotentné bunky dávajúce vznik tkanivám mezenchýmového pôvodu (kosť, chrupka, tuk, šľachy a svaly). Sú schopné sebaobnovy a môžu produkovať diferencované bunky (Weissman et al., 2001; Smith, 2001). Na rozdiel od hematopoetických KB sú MKB relatívne slabo molekulárne charakterizované. MKB sú momentálne definované kombináciou morfologických, fenotypických a funkčných vlastností, mnohé z nich sú ale spochybniteľné a biologicky nerelevantné (Javazon et al., 2004). Dnes najviac používaným zdrojom MKB je kostná dreň (KD) a najviac charakterizovanými MKB sú práve KB izolované z kostnej drene. KD je najbohatším a najprístupnejším zdrojom, izolácia je jednoduchá, po denzitno-gradientovej centrifugácii nasleduje priamy výsev. MKB ale predstavujú iba 0,001% až 0,01% z celkovej populácie jadrových buniek v kostnej dreni (Shanti et al., 2007). Okrem MKB a množstva iných buniek sa v kostnej dreni nachádzajú aj hematopoetické kmeňové bunky (HKB). MKB predstavujú mechanickú podporu pre diferencujúce sa HKB a produkujú pozitívne bunkovo signalizujúce hematopoetické molekuly ktoré prispievajú k maturácii krvných buniek (Taichman et al., 1998). Okrem toho MKB zohrávajú dôležitú úlohu pri obnove poškodených alebo zničených tkanív v organizme. To je zabezpečené lokalizáciou KB a to, že sú umiestnené v perivaskulárnych niche, čo poskytuje ľahký prístup k poškodeným orgánom alebo tkanivám. Je možné, že migrácia kmeňových buniek kostnej drene v tele pôsobí v podstate ako podporný systém schopný v extrémnej situácii zväčšiť vnútornú regeneračnú kapacitu orgánu. Za vhodných podmienok majú MKB schopnosť intenzívnej ale obmedzenej proliferácie. Je to dôležitá vlastnosť, ktorá môže eliminovať potenciálnu tumorogenicitu buniek po transplantáciách in vivo. Klinické použitie je ale skôr limitované ich imunologickými vlastnosťami. Vo všeobecnosti sú 127 MKB považované za neimunogénne, podľa HLA I+, HLA II-, CD40-, CD80- a CD86- fenotypu (Javazon et al., 2004; Le Blanc et al., 2003). Najlepšie známym MKB markerom je Stro-1 (stromal derived factor-1). Stro-1 negatívne bunky nie sú schopné formovať kolónie CFU-F (colony-forming unit-fibroblast) (Petersen et al.,1999). Stro-1 pozitívne bunky môžu diferencovať na podporné fibroblasty pre HKB, osteoblasty, chondroblasty, adipocyty a bunky hladkej svaloviny (Landsdorp, 1995). Napriek tomu je Stro-1 nespoľahlivým všeobecným markerom pre MKB a to z troch dôvodov. Neexistuje myší náprotivok ľudského Stro-1, expresia Stro-1 nie je jedinečná pre MKB a expresia na MKB sa počas kultivácie postupne stráca. Použitie Stro-1 je teda limitované na izoláciu alebo skoré pasáže. Nakoľko presná funkcia Stro-1 antigénu nie je známa, nie je ani jasné či strata expresie má vplyv na kmeňovosť buniek. Znak CD160 alebo VCM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) je exprimovaný na endotelových bunkách ciev, je pravdepodobné, že CD160 je funkčným markerom MKB pretože má vplyv na bunkovú adhéziu, chemotaxiu a signálnu transdukciu (Carter et al., 2001; Kolf et al., 2007). Kombinácia znakov Stro-1 a CD160 predstavuje dobrý marker pre MKB, pretože Stro-1+ a CD160+ bunky vykazujú všetky charakteristiky kmeňovej bunky ako sú multilíniový potenciál, expresia telomerázy a vysoká proliferácia in vitro (Gronthos, 2003). Znak CD73 (lymphocyte-vascular adhesion protein 2) je 5´-nukleozidáza. Hoci je tiež exprimovaný na mnohých iných bunkách, dve monoklonálne protilátky proti CD73 (SH-3 a SH-4) boli vyvinuté špecificky pre bunky odvodené z mezenchýmového tkaniva (Haynesworth et al., 1992). Tieto protilátky sa neviažu na HKB, osteoblasty, osteocyty a ani na žiadne bunky, ktoré by potenciálne mohli kontaminovať adherentné bunky. Podľa viacerých publikácií sú ale najpoužívanejšími markermi kombinácia znakov Stro-1, CD73 a CD160 hoci ich funkcia nie je stále presne určená (Honczarenko et al., 2006; Kolf et al., 2007). Cytometrické analýzy tiež dokázali, že CFU-F prekurzory sú pozitívne aj na Thy-1 (CD90), rodinu integrínov CD29/CD49, CD10, CD13 a receptory pre PDGF, EGF, IGF-1 a NGF. MKB ešte exprimujú množstvo receptorov pre bunkovú adhéziu s HKB a extracelulárnou matrix ako napríklad ICAM (CD50, CD54, CD120) - integrínová rodina zodpovedná za väzbu fibronektínu, laminínu alebo kolagénu; VCAM – CD106 (vascular cell adhesion molecule); NCAM – CD56 (neural cell adhesion molecule), L-selectin (CD62). MKB neexprimujú znaky CD11b (marker imunitných buniek), CD45 (marker všetkých hematopoetických línií) alebo glycophorin-A (marker erytroidnej línie). Negatívna selekcia proti glycophorin-A spolu s pozitívnou na Stro-1 obohacujú bunky z kostnej drene na CFU-U až 10násobne (Gronthos, 2003). CD34 je marker primitívnych hematopoetických buniek a zriedkavo je exprimovaný aj na MKB, u myší je pozitívny. CD31 (PECAM-1) exprimovaný na endotelových a hemotopoetických bunkách a CD117 hematopoetických kmeňových a progenitorových bunkách je takmer vždy neprítomný u ľudí aj u myší. CD40 má afinitu ku hyaluronovej kyseline, fibronektínu a sialomucínom ako CD34 a CD43. Multilíniový diferenciačný potenciál MKB sú za vhodných podmienok schopné diferencovať sa na bunky mezenchymálneho pôvodu a to osteoblasty, chondroblasty, adipocyty, myoblasty a tendonálne bunky (Pittenger et al., 1999; Wakitani et al., 1995; Altman et al., 2002; Danišovič et al., 2006). Hoci molekulárny mechanizmus riadiaci diferenciáciu MKB nie je úplne známy, je ale dokázané, že diferenciáciu v mezenchymálnej línii riadi množstvo rastových faktorov ako BMP (bone morphogenetic protein), FGF (fibroblast growth factor) a Wnts - rodina protoonkogénov (Sekiya et a., 2005; Luo et a., 2004; Boland et a., 2004). Myslelo sa, že diferenciačný potenciál MKB je obmedzený iba na mezenchýmovú líniu ale niektoré publikácie dokazujú, že za vhodných podmienok môžu MKB transdiferencovať na bunky ktoré vykazujú morfologické a biochemické vlastnosti neurálneho tkaniva ektodermálneho pôvodu (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999). Osteogenézu silno podporuje skupina proteínov BMP (Chen et al., 2004; Friedman et al., 2006). BMP-2 indukuje p-300 acetyláciu Runx2 čo je hlavný osteogenický gén čím zlepšuje jeho transaktivačnú schopnosť. Cytokín TNF-α (tumor necrosis factor-α), ktorý je zapojený do zápalomsprostredkovanej kostnej degradácie dereguluje Runx2. Wnts má v osteogenéze dôležitú modelačnú funkciu, vysoké hladiny ju umožňujú, zatiaľ čo nízke hladiny osteogenézu inhibujú (Gaspar et al., 2004). Vďaka týmto zisteniam sa tkanivové inžinierstvo zamerané na obnovu kosti za pomoci MKB, orientuje na BMP, Runx2 a histónové deacetyltransferázy. TNF-α by sa mohol využiť v imunoterapii 128 kostných ochorení (Kaneki et al., 2004; Gaspar et al., 2004). Ďalší výskum zameraný na transkripčné mechanizmy zabezpečujúce rovnováhu medzi formáciou a degradáciou kosti, najmä hlavný osteogenický gén Runx2 a špecifické osteogenické homeoboxy, ktoré sú považované za dva najsilnejšie regulátory transkripcie v osteogenéze, prinesie nové poznatky v osteogénnej diferenciačnej línii. Chondrogénna diferenciácia in vitro plne napodobňuje vývoj chrupiek in vivo. U chondrocytov odvodených z MKB boli pozitívne charakterizované mnohé markery ako transkripčné faktory (sox-9, scleraxis), gény extracelulárnej matrix (kolagén typ II a IX, agrekán, biglykán, dekorín a chrupkový oligomerický matrixový proteín) (Tuan et al., 2003; Baksh et al., 2004; Danišovič et al., 2007). Napriek tomu signalizačné dráhy , ktoré indukujú expresiu týchto chondrogenických génov ostávajú neznáme. Molekulárno genetické štúdie u prirodzene sa vyskytujúcich mutácií identifikovali niektoré signálne molekuly ako TGF-β (transforming growth factor-β), BMP (bone morphogenetic protein), GDF (growth and differentiation factor) a Wnt ligandy (Massague et al., 2000; Chen et al., 2004; Hartman et al., 2006). Rekombinantné proteíny a/alebo adenovírusové infekcie MKB s TGF-β1 a TGF-β3, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-12, BMP-13 a GDF-5 dokázali rapídnu indukciu chondrogenézy u mezodermálneho tkaniva z rôznych zdrojov (Boskey et al., 2002; Gooch et al., 2002; Nochiet al., 2004). Najviac prác ohľadom myogenézy MKB je založených na malej polpulácii KB odvodených od kostrových svalov alebo od satelitných buniek. Nedávne práce zase poukazujú vysokú úspešnosť indukcie myogenézy u dospelých KB po transfekcii aktivovaným Notch 1, ale mechanizmus ostáva neznámy (Dezawa et al., 2005). Pri kardiomyogenéze sa zistila dôležitosť bunkových kontaktov pri koklutivácii MKB a kardiomyocytov, ktoré stimulujú kardiomyogenézu u týchto MKB na potkaňom modeli (Li et al., 2006). Kritický regulátor adipogenézy je jadrový receptor pre hormón PRARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), u MKB sprostredkuje adipogenézu zatiaľ čo potláča osteogenézu (Nuttall et al., 2004). To dokazuje, že z jednej MKB môžu byť odvodené obe línie. Vytváranie šliach in vivo umožňuje GDF, člen TGF-β superrodiny (Wolfman et al., 1997). Študovanie vývoja šliach in vitro je obtiažne, pretože okrem špeciálneho média a kultivačných podmienok je potrebné aj mechanické navíjanie, ktoré je kritické pri vytváraní vláken (Altman et al., 2002). Závery Ďalšia analýza bunkovej migrácie, cytoskeletálnej odozvy, membránových proteínov, signalizačných a stimulačných ciest je dôležitá pre lepšie pochopenie diferenciačných procesov. Tiež aj identifikácia špecifických signálnych sietí a „hlavného“ regulačného génu ktorý riadi diferenciačné línie zostáva výzvou. Schopnosť ovplyvniť biologické efektory aby udržiavali zvolený diferenciačný program MKB, alebo naopak možnosť predísť neželanej diferenciácii je nevyhnutné pre efektívnu klinickú aplikáciu, tkanivové inžinierstvo a regeneráciu tkanív. Poďakovanie Práca bola podporená grantovou úlohou UK/326/2007. Použitá literatúra 1. Alison, M.R., Poulsom, R., Jeffery, R., et al.: Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells. Nature. 406: 257, 2000. 2. Altman, G.H., Horan, R.L., Martin, I., et al.: Cell differentiation by mechanical stress. FASEB J. 16: 270–272, 2002. 3. Azizi, S.A., Stokes, D., Augelli, B.J., et al.: Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats - similarities to astrocyte grafts. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 3908– 3913, 1998. 4. Baksh, D., Song, L., Tuan, R.S.: Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8: 301–316, 2004. 5. Bjornson, C.R., Rietze, R.L., Reynolds, B.A., et al.: Turning brain into blood: A hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science. 283: 534–537, 1999. 6. Boland, G.M., Perkins, G., Hall, D.J., et al.: Wnt 3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 93: 1210–30, 2004. 7. Boskey, A.L., Paschalis, E.P., Binderman, I., Doty, S.B.: BMP-6 accelerates both chondrogenesis and mineral maturation in differentiating chick limb-bud mesenchymal cell cultures. J Cell Biochem. 84: 509–519, 2002. 129 8. Carter, R.A., Wicks, I.P.: Vascular cell adhesion molecule 1 (CD106): a multifaceted regulator of joint inflammation. Arthritis Rheum. 44: 985–994, 2001. 9. Chen, D., Zhao, M., Mundy, G.R.: Bone morphogenetic proteins. Growth Factors. 22: 233–241, 2004. 10. Danišovič, Ľ., Lesný, P., Jendelová, P., et al.: Chondrogenic potential of human bone marrow mesenchymal stem cells and adipose-derived mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 8(Suppl.1): 191, 2006. 11. Danišovič, Ľ., Lesný, P., Havlas, V., et al.: Chondrogenic differentiation of human bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Appl Biomed. 5: 139–150, 2007. 12. Despars, G., O´Neill, H.C.: A role niches in the development of multiplicity of dendritic cell subsets. Exp Hematol. 32: 235–243, 2004. 13. Dezawa, M., Ishikawa, H., Itokazu, Y., et al.: Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration. Science. 309: 314–317, 2005. 14. Filip, S., English, D., Mokrý, J.: Issues stem cell plasticity. J Cell Mol Med. 8: 572–577, 2004. 15. Friedman, M.S., Long, M.W., Hankenson, K.D.: Osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells is regulated by bone morphogenetic protein-6. J Cell Biochem. 98: 538–554, 2006. 16. Gaspar, C., Fodde, R.: APC dosage effects in tumorigenesis and stem cell differentiation. Int J Dev Biol. 48: 377–386, 2004. 17. Gooch, K.J., Blunk, T., Courter, D.L., et al.: Bone morphogenetic proteins-2, -12, and -13 modulate in vitro development of engineered cartilage. Tissue Eng. 8: 591–601, 2002. 18. Gordon, M.Y.: Adhesive properties of haematopoietic stem cells. Br J Haematol. 68: 149–151, 1998. 19. Gordon, M.Y., Dowding, C.R., Riley, G.P., et al.: Altered adhesive properties of haematopoietic progenitor cells in chronic myeloid leukemia. Nature Lond., 328, 342–344, 1987. 20. Gronthos, S., Zannettino, A.C., Hay, S.J., et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J Cell Sci. 116: 1827–1835, 2003. 21. Hartmann, C.: A Wnt canon orchestrating osteoblastogenesis. Trends Cell Biol. 16: 151–158, 2006. 22. Haynesworth, S.E., Baber, M.A., Caplan, A.I.: Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone. 13: 69–80, 1992. 23. Honczarenko, M., Le, Y., Swierkowski, M., Ghiran, I., Glodek, A.M., Silberstein, L.E.: Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors. Stem Cells. 24: 1030–1041, 2006. 24. Jakubovský, J., Novotný, J., Michalka, P., et al.: Knowledge concerning regeneration. I. New view of old problem. Kontakt. 2: 373–377, 2007. 25. Javazon, E.H., Beggs, K.J., Flake A.W.: Mesenchymal stem cells: Paradoxes of passaging. Exp Hematol. 32: 414–425, 2004. 26. Kaneki, H., Guo, R., Chen, D., et al.: Tumor necrosis factor promotes Runx2 degradation through upregulation of Smurf1 and Smurf2 in osteoblasts. J Biol Chem. 281: 4326–4333, 2006. 27. Kolf, C.M., Cho, E., Tuan, R.S.: Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res and Ther. 9: 204, 2007. 28. Kopen, G.C., Prockop, D.J., Phinney, D.G.: Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proc Natl Acad Sci USA. 96: 10711–6, 1999. 29. Lagasse, E., Connors, H., Al-Dhalimy, M., et al.: Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 6: 1229–34, 2000. 30. Lansdorp, P.M.: Developmental changes in the function of hematopoietic stem cells. Exp Hematol. 23: 187– 91, 1995. 31. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., et al: HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31: 890–6, 2003. 32. Li, H., Yu, B., Zhang, Y., et al.: Jagged1 protein enhances the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. 341: 320–325, 2006. 33. Luo, Q., Kang, Q., Si, W., et al.: Connective tissue growth factor (CTGF) is regulated by Wnt and bone morphogenetic proteins signaling in osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells. J Biol Chem. 27: 55958–9, 2004. 34. Massague, J., Blain, S.W., Lo, R.S.: TGFβ signaling in growth control, cancer, and heritable disorders. Cell. 103: 295–309, 2000. 35. Mastrogiacomo, M., Cancedda, R., Quarto, R.: Effect of different growth factors on the chondrogenic potential of human bone marrow stromal cells. Osteoarthritis Cartilage. 9, 36–40, 2001. 36. Nochi, H., Sung, J.H., Lou, J., et al.: Adenovirus mediated BMP-13 gene transfer induces chondro-genic differentiation of murine mesenchymal progenitor cells. J Bone Miner Res. 19: 111–122, 2004. 37. Nuttall, M.E., Gimble, J.M.: Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol. 4: 290–294, 2004. 38. Olivier, V., Faucheux, N., Hardouin, P.: Biomaterial challenges and approaches to stem cell use in bone reconstructive surgery. Drug Discov Today. 9: 803–11, 2004. 39. Petersen, B.E., Bowen, W.C., Patrene, K.D., et al.: Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science. 284: 1168, 1999. 130 40. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., et al.: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284, 143–7, 1999. 41. Shanti, R.M., Li, W., Nesti, L.J., et al.: Adult mesenchymal stem cells: Biological properties, characteristics, and applications in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 65: 1640–1647, 2007. 42. Quesenberry, P.J., Abedi, M., Aliotta, J. et al.: Stem cell plasticity: an owerview. Blood Cell Mol Dis. 32: 1– 4, 2004. 43. Sekiya, I., Larson, B.L., Vuoristo, J.T., et al.: Comparison of effect of BMP-2, −4, and −6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320: 269–76, 2005. 44. Svendsen, C.: Stem cells: Hype or hope? Drug Discov Today. 7: 455–456, 2002. 45. Taichman, R.S., Emerson, S.G.: The role of osteoblasts in the hematopoietic microenvironment. Stem Cells. 16: 7–15, 1998. 46. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., et al.: Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts [published erratum appears in Science 282:1827, 1998]. Science. 282: 1145–47, 1998. 47. Tuan, R.S., Boland G, Tuli R: Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering. Arthritis Res Ther, 5:32-45, 2003. 48. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A.I.: Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18: 1417–26, 1995. 49. Wolfman, N.M., Hattersley, G., Cox, K., et al.: Ectopic induction of tendon and ligament in rats by growth and differentiation factors 5, 6, and 7, members of the TGF-β gene family. J Clin Incest. 100: 321–330, 1997. 131 Analýza železa v ľudskej slezine Horst Urban1, Martin Kopáni1, Martin Weis2, Július Dekan3 1 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta,Ústav patologickej anatómie; Slovenská technická univerzita, Fakulta elektrotechniky a informatiky, 2Katedra fyziky, 3Katedra jadrovej fyziky, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Železo v tkanive mozgu zohráva dôležitú úlohu pri vzniku neurodegeneračných chorôb a v procese starnutia. Je jedným z biogénnych prvkov, ktorého nadmerné množstvo je induktorom oxidačného stresu. Cieľom práce je určiť štruktúru železa v tkanive ľudskej sleziny a jeho oxidačný stav. Pomocou MS sme v každej vzorke tkaniva sleziny zistili prítomnosť dvoch odlišných fáz paramagnetického železa. Obe fázy boli zložené z Fe3+. Vo vzorkách sme identifikovali 4 rôzne fázy oxidov železa. Vyšetrenia svetelným mikroskopom tkanív ľudskej sleziny farbenej Perlsovou reakciou sme zistili výraznú akumuláciu železa vo vzorkách s diagnózou hemochromatózy a hereditárnej sférocytózy. V tretej vzorke bola rekcia negatívna. EDX mikroanalýza vzoriek ukázala mnohoprvkové zloženie častíc železa. Prítomnosť iných prvkov výrazne ovplyvňuje štruktúru, chemické zloženie a stechiometriu oxidov železa. Predpokladáme, že pH a rôznorodé prvkové zloženie môžu výrazným spôsobom ovplyvňovať biomineralizáciu železa v ľudskom tkanive. Úvod Železo v tkanive zohráva dôležitú úlohu pri vzniku neurodegeneračných chorôb a v procese starnutia.. Je jedným z biogénnych prvkov, ktorého nadmerné množstvo je induktorom oxidačného stresu. Doterajšie znalosti o prítomnosti železa v mozgu pochádzajú hlavne z výsledkov merania nukleárnou magnetickou rezonanciou (NMR, Weir et al., 1984). Nevýhodou získaných výsledkov sú iba kvalitatívne informácie o železe vo vyšetrovanom tkanive. Histochemické metódy majú vyššiu citlivosť a vyššiu mieru špecificity ako NMR. Neposkytujú však informácie o fyzikálno-chemických vlastnostiach železa a jeho zlúčenín vo vyšetrovanom tkanive. Ďalšou nevýhodou histochemických metód je neschopnosť zobrazenia zlúčenín železa, ak ich rozmer či množstvo je pod hranicou rozlišovacej schopnosti svetelného mikroskopu. Keďže je železo v organizme prítomné v dvoch oxidačných stavoch (Fe2+, Fe3+) je dôležitá identifikácia a rozlíšenie jeho oxidačných stavov. Železo sa v ľudskom tele nachádza predovšetkým v podobe feritínu (Quintana et al., 2004). Tento proteín tvorí sférický útvar veľkosti 12 nm. Jadro feritínu je veľké 8 nm a pozostáva z ferihydritu – 5Fe2O3.9H2O. Železo sa v ňom nachádza v podobe iónov Fe3+. Úlohou polypeptidového obalu feritínu (Ft-H forma) je katalýza oxidácie iónov Fe2+ na ióny Fe3+. Ft-L forma polypeptidového obalu napomáha k mineralizácii železa. Cieľom práce je určiť štruktúru železa v tkanive ľudskej sleziny a jeho oxidačný stav. Materiál a metódy Histologické rezy sleziny sme pripravili pre vyšetrenie vo svetelnom mikroskope a farbili Perlsovou reakciou na prítomnosť železitých iónov Fe3+. Energo–disperznú analýzu (EDX) sme vykonali rastrovacom elektrónovom mikroskope JEOL 840 XA (Jeol, Japonsko) na 3 vzorkách tkaniva ľudskej sleziny. 57Fe Mössbauerova spektroskopiu (MS) sme vykonali na 3 práškových vzorkách sleziny pri izbovej teplote aj pri teplote kvapalného dusíka v transmisnej geometrii so zdrojom 57Co(Rh). Výsledky a diskusia Vyšetrenia svetelným mikroskopom tkanív ľudskej sleziny farbenej Perlsovou reakciou sme zistili výraznú akumuláciu železa vo vzorkách s diagnózou hemochromatózy a hereditárnej sférocytózy (obr. 1). V tretej vzorke bola rekcia negatívna. 132 Obr. 1. Ľudská slezina, hereditárna sférocytóza, svetelný mikroskop (vľavo). Elektrónogram z REM zobrazuje častice obsahujúce horčík, fosfor, vápnik a železo. Pomocou MS sme v každej vzorke tkaniva sleziny (tab. 1a, 1b, 1c) zistili prítomnosť dvoch odlišných fáz paramagnetického železa. Obe fázy boli zložené z Fe3+. Vo vzorkách sme identifikovali 4 rôzne fázy oxidov železa (Tab. 1d, Cornell et Schwertmann, 2003). Zložka Izomérny posun [mm/s] quadrupólové rozštiepenie [mm/s] Podiel [%] 1 2 0,37 0,4 0,68 0,4 67 33 Tab. 1a. Výsledky izomerného posunu a quadrupólového rozštiepenia vzorky sleziny s diagnózou hemochromatózy. EDX analýza ukázala prítomnosť spektrálnych čiar Mg, Al, P, Si, S, Ca, K, Zn a Fe. Zložka 1 2 Izomerný posun [mm/s] 0,36 0,37 Quadrupólové rozštiepenie [mm/s] 0,8 0,46 Podiel [%] 50 50 Tab. 1b. Výsledky izomerného posunu a quadrupólového rozštiepenia vzorky sleziny po splenektómii bez známok hromadenia železa. EDX analýza ukázala prítomnosť spektrálnych čiar Mg, Al, P, Si, S, Ca, K, Zn a Fe. Zložka 1 2 Izomérny posun [mm/s] 0,32 0,31 Quadrupólové rozštiepenie [mm/s] 0,60 0,34 Podiel [%] 40 60 Tab. 1c. Výsledky izomerného posunu a quadrupólového rozštiepenia vzorky sleziny s diagnózou hereditárnej sférocytózy. EDX analýza ukázala prítomnosť spektrálnych čiar Mg, P, Ca a Fe. Fáza oxidu železa Lepidokrokit γ-FeO(OH) Feroxyhyt δ-FeO(OH) Ferihydrit 5 Fe2O3 · 9 H20 FePO4 Izomérny posun [mm/s] Quadrupólové rozštiepenie [mm/s] 0.37 0.53 0.36 0.69 0.35 0.71 0.38 0.80 Tab. 1d. Zoznam štyroch rôznych fáz oxidov železa nachádzajúcich sa vo vyšetrovaných vzorkách tkaniva sleziny. 133 EDX mikroanalýza vzoriek ukázala mnohoprvkové zloženie častíc železa. V normálnom tkanive sa feritín nachádza v podobe ferihydritu - 5Fe2O3.9H2O s rôznym množstvom fosforu. Výsledky izomerného posunu a quadrupólového rozštiepenia vzorky sleziny po splenektómii bez známok poškodenia sleziny môžu ukazovať prítomnosť ferihydritu (tab. 1b, 1d). Ióny kovov hrajú dôležitú úlohu v transformácii biogénneho železa prítomného v organizme na abiogénne formy, ktoré sú pre organizmus toxické. Fosforečnany značne ovplyvňujú morfológiu oxidov železa, keď ich prekurzorom je ferihydrit. Množstvo fosforu v oxidoch železa ovplyvňuje oxidáciu železa. Jurado et al. (2003) predpokladajú, že fosfor viazaný na železo spôsobuje jeho pravdepodobne abiogénny charakter. Naviac stopové množstvá iných prvkov výrazne ovplyvňujú štruktúru, chemické zloženie a stechiometriu oxidov železa (Borch et al., 2007). Fosfor výrazne ovplyvňuje morfológiu železa a jeho oxidáciu (Cumplido et al., 2000). Interakcia železa Fe2+ s ferihydritom vedie k precipitátom goethitu, lepidokrokitu a magnetitu (Hansel et al., 2005, Liu et al., 2007). Magnetit a goethit sú v patologických tkanivách zložkou hemosiderínu (Meyrick et al., 2002). V našom prípade sme ani magnetit a goethit nepozorovali (tab. 1a,b,c,d). Predpokladáme, že pH a rôznorodé prvkové zloženie môžu výrazným spôsobom ovplyvňovať biomineralizáciu železa v ľudskom tkanive. Závery Pomocou MS sme v každej vzorke tkaniva sleziny zistili prítomnosť dvoch odlišných fáz paramagnetického železa. Obe fázy boli zložené z Fe3+. Vo vzorkách sme identifikovali 4 rôzne fázy oxidov železa. EDX mikroanalýza vzoriek ukázala mnohoprvkové zloženie častíc železa. Prítomnosť iných prvkov výrazne ovplyvňuje štruktúru, chemické zloženie a stechiometriu oxidov železa. Predpokladáme, že pH a rôznorodé prvkové zloženie môžu výrazným spôsobom ovplyvňovať biomineralizáciu železa v ľudskom tkanive. Použitá literatúra 1. Borch, T., Masue, Y., Kukkadapu, R.K., Fendorf, S.: Phosphate imposed limitations on biological reduction and alteration of ferrihydrite. Environ Sci Technol. 41: 166–172, 2007. 2. Cornell, M., Schwertmann, U.: The Iron Oxides. Wiley-VCH Verlag, s. 149, 2003. 3. Cumplido, J., Barrón, V., Torrent, J.: Effect of phosphate on the formation of nanophase lepidocrocite from Fe(II) sulfate. Clays Clay Miner. 48: 503–510, 2000. 4. Hansel, C.M., Benner, S.G., Fendorf, S.: Competing Fe(II)-induced mineralization pathways of ferrihydrite. Environ Sci Technol. 39: 7147–7153, 2005. 5. Jurado M.J., Barron V., Torrent J.: Can the presence of structural phosphorus help to discriminate between abiogenic and biogenic magnetites? J Biol Inorg Chem. 8: 810–814, 2003. 6. Liu, H., Li, P., Zhu, M., Wei, Y., Sun, Y.: Fe(II)-induced transformation from ferrihydrite to lepidocrocite and goethite. J. Solid State Chem. 180: 2121–2128, 2007. 7. Meyrick, D., Webb, J., Cole, C.: Iron and iron proteins found in the genetic disease, hereditary spherocytosis. Inorg Chim Acta. 339: 481–487, 2002. 8. Quintana, C., Cowley, J.M., Marhic, C.: Electron nanodiffraction and high-resolution electron microscopy studies of the structure and composition of physiological and pathological ferritin. J Struct Biol. 147: 166–178, 2004. 9. Weir, M.P., Gibson, J.F., Peters, T.J.: Effect of dexamethasone on glutamine-synthetase and glial fibrillary acidic protein in normal and transformed astrocytes. Biochem J. 223: 31–38, 1984. 134 Faryngová oblasť a neurálna lišta v ontogenéze človeka – ako spolu súvisia vrodené vývinové chyby týmusu, srdca a prištítnych teliesok? Ivan Varga1, Viera Pospíšilová1, Kristína Hudecová2, Paulína Gálfiová1, Katarína Bevízová1, Štefan Polák 1 Univerzita Komenského v Bratislave, Lekárska fakulta, 1Ústav histológie a embryologie; 2Ústav patologickej fyziológie, Bratislava, Slovenská Republika, [email protected] Abstrakt Vo vývine človeka vzniká z epitelu faryngových vačkov časť vnútorného ucha, podnebná mandľa, týmus, prištítne telieska aj bunky štítnej žľazy produkujúce kalcitonín (parafolikulárne bunky). S normogenézou faryngovej oblasti súvisí aj vcestovanie multipotentných buniek z neurálnej lišty, ktoré sa oddelia od vznikajúceho centrálneho nervového systému a migrujú do celého tela embrya. Bunky neurálnej lišty zohrávajú kľúčovú úlohu aj v septácii výtokovej časti srdca. Autori poukazujú na súvislosť medzi vrodenými chybami srdca, týmusu a ďalších orgánov, ktorých normálny vývin je indukovaný bunkami neurálnej lišty. Úvod Faryngová (hltanová, branchiálna, žiabrová) oblasť sa stala klasickou oblasťou, na ktorej bol dokázaný vzťah medzi ontogenézou a fylogenézou živočíchov. Je to oblasť, v ktorej sa pomerne konzervatívne rekapituluje vývoj žiabrí (branchiae) v ontogenéze všetkých stavovcov. Faryngová oblasť prekonala v procese evolúcie výrazné zmeny. Kým u vodných živočíchov zabezpečovala okysličovanie krvi a reguláciu stálosti vnútorného prostredia, u suchozemských stavovcoch sa musela prispôsobiť novým funkciám. Keďže oxygenáciu krvi prevzali pľúca a reguláciu iónovej rovnováhy slinné žľazy ústnej dutiny, z faryngovej oblasti sa u človeka vývíjajú imunitné orgány: týmus a podnebná mandľa, endokrinné orgány: prištítne telieska a parafolikulárne bunky štítnej žľazy produkujúce kalcitonín (pôvodne ako samostatné ultimobranchiálne telieska), ako aj časť ucha. K normogenéze faryngovej oblasti sú však potrebné aj bunky neurálnej lišty, ktoré cez faryngové oblúky migrujú do srdca. Preto sú často spojené vrodené chyby srdca aj s poruchami imunity (ako dôsledok nevyvinutia týmusu) alebo s nízkou hladinou vápnika (hypokalciémia, ako dôsledok nevyvinutia prištítnych teliesok). Vývin faryngovej oblasti Embryonálny hltan (tzv. faryngové črevo) má u človeka podobu ventrodorzálne sploštenej nálevky, značne rozšírenej v rovine frontálnej. Po stranách sa faryngové črevo vychlipuje ako endodermové faryngové (branchiálne) vačky. Proti nim sa zvonka prehlbujú ektodermou vystlané faryngové (branchiálne) brázdy, až ektoderm takmer nalieha na endodermu, čím vznikne membrana obturans. K pretrhnutiu týchto membrán a k vytvoreniu žiabrových štrbín vo vývine človeka nedochádza, medzi ektodermou a endodermou zostáva tenká vrstvička mezenchýmu. Výnimku tvorí 2. brázda, kde sa toto spojenie preruší a vačok komunikuje s brázdou rôzne dlhý čas. U ľudských embryí sa toto spojenie preruší v 5. týždni vývinu (4,5 mm dĺžka temeno-kostrč) (Pospíšilová et Slípka, 1994; Slípka et Pospíšilová, 1995). Z epitelu faryngových (branchiálnych) vačkov sa vyvíjajú branchiogénne orgány. Medzi ne patrí stredná časť ucha, tonsilla palatina, thymus, glandulae parathyroideae a ultimobranchiálne teliesko (corpusculum ultimobranchiale). V priebehu 4. týždňa vývinu sa u všetkých stavovcov aj človeka na hlavovom konci embrya po stranách zjavujú párové poloblúkovité vyvýšeniny – žiabrové oblúky (arcus branchialis). Vznikajú nahromadením mezenchýmu medzi povrchovou ektodermou a vnútornou endodermou faryngového čreva. U ľudského embrya sa vytvorí postupne kraniokaudálnym smerom päť párov žiabrových oblúkov. Medzi nimi sú štyri faryngové vačky (zvnútra) a štyri žiabrové brázdy (zvonku). Žiabrové oblúky sú vo vývine človeka len prechodnými štruktúrami a ich architektúra sa rýchlo mení počas formovania sa kraniálnej časti embrya (Kapeller et Pospíšilová, 2001). 135 Mezenchým žiabrových oblúkov pohádza z dvoch zdrojov – má mezoektodermálny pôvod. Bunky mezenchýmu sa diferencujú z mezodemy v blízkosti faryngovej membrány a z neuroektodermy neurálnej lišty (ektomezenchým) v okolí základu mozgu (z rombencefala, zo segmentovito usporiadaných 8 rombomér (R1 – R8) a aj z časti prozencefala). Z mezenchýmu mezodermového pôvodu sa diferencujú svaly, pochádzajúce z materiálu oblúkov, z mezenchýmu neuroektodermového pôvodu sa diferencuje najmä spojivo dolných častí tváre a prednej časti krku (Vacek, 2006). Vývin faryngovej oblasti a neurálna lišta Neurálna lišta je zvláštna, párová štruktúra, nakoľko sa objavuje len vo včasnom embryonálnom vývine a má len krátkodobú existenciu. Jej bunky rýchlo migrujú do celého tela embrya a menia sa na iné typy buniek (Kirby et Waldo, 1990). Bunky neurálnej (gangliovej) lišty (neural crest cells) sú nielen významným zdrojom mezenchýmu, ale súčasne sú potrebné aj pre vlastnú diferenciáciu žiabrových oblúkov (Graham, 2003). Bunky neurálnej lišty vznikajú počas neurulácie embrya. Neuruláciou sa označuje proces vývinu neurálnej rúry. V prvom kroku notochorda indukuje nad ňou ležiace bunky embryonálnej ektodermy, aby sa množili a diferencovali na neuroektodermu, ktorú nazývame neurálna platnička. Vkleslina, vznikajúca pozdĺž stredovej osy neurálnej platničky, sa nazýva neurálna brázda. Okraje neurálnej platničky po bokoch brázdy sa nadvihujú do neurálnych valov, ktoré rastú k sebe až ich horné okraje spolu splynú. Vzniká tak neurálna rúra, ktorá predstavuje prvý základ pre centrálny nervový systém. Vývin neurálnej rúry je viackrokový proces prísne kontrolovaný génmi, ovplyvniteľný faktormi vonkajšieho prostredia (Pospíšilová et al., 2007; Varga et al., 2007). Bunky neurálnej lišty môžeme charakterizovať ako populáciu multiponentných prekurzorových buniek, ktoré sú pomenované podľa miesta ich pôvodu – neurálnej lišty. V embryonálnom období vývinu tvorí neurálna lišta hranicu medzi neurálnou platničkou (budúci centrálny nervový systém) a ne-neurálnou ektodermou (budúca pokožka, obr. 1). Obr. 1. Schematický nákres formovania sa neurálnej rúry aj neurálnej lišty (znázornené tmavo) a následnej migrácie buniek neurálnej lišty do rôznych častí tela embrya (Sakai et Wakamatsu, 2005). Neurálna lišta je rozdelená do dvoch veľkých oblastí, zvaných kraniálna a trupová neurálna lišta (cranial and trunk neural crest). Kraniálna neurálna lišta siaha od stredu diencephala kaudálne až po 5. somit, trupová neurálna lišta pokračuje od 5. somitu po kaudálny koniec embrya. Z oblasti neurálnej lišty medzi očnými plakódami až po 3. somit migrujú bunky do výtokovej časti srdca, preto sa táto oblasť označuje aj ako kardiogénna („srdcová“) neurálna lišta (cardiac neural crest). 136 Na začiatku sú neurálne lišty súčasťou ektodermy, preto majú charakter epitelových buniek. Následne bunky neurálnej lišty podstúpia komplexný proces, zvaný epitelovo-mezenchýmová premena (epithelial-mesenchymal transition). Premena zahŕňa génmi riadené zmeny ultraštruktúry buniek, architektoniky cytoskeletu aj v expresii proteínov. Premenené bunky sa oddelia od povrchového epitelu a migrujú do tela embrya, kde dajú základ bunkám s rôznym osudom a funkciou (Kang et Svoboda, 2005). Napríklad neuróny a podporné bunky periférneho nervového systému sú väčšinou pôvodom z neurálnej lišty, s výnimkou niektorých neurónou pochádzajúcich z neuroplakód. Bunky neurálnej lišty sa diferencujú aj na melanocyty v koži, chrupku a väzivo hlavy a krku, chromafinné bunky drene nadobličky a iné (Sakai et Wakamatsu, 2005). Utváranie žiabrových oblúkov, s výnimkou I. mandibulárneho oblúka, je regulované homeobox (HOX) génmi. Ich informáciu prinášajú bunky neurálnej lišty, migrujúce do pod nimi ležiacej mezodermy budúcich žiabrových oblúkov. Expresia HOX génov postupuje segmentovite, rostrokaudálnym smerom. Podmienkou pre uplatnenie morfogenetického pôsobenia príslušných HOX génov je interakcia budúceho žiabrového oblúku s neuroektodermovými bunkami prislúchajúcich rombomérov. Okrem základnej integrácie neuroektodermy s bunkami mezodermy sa uplatňujú pri vývoji žiabrových oblúkov a z nich pochádzajúcich derivátov aj ďalšie faktory udržujúce a regulujúce rast a morfologické utváranie (Vacek, 2001). Mezenchýmové bunky, pochádzajúce z neurálnej lišty indukujú normálny vývin viacerých orgánov: 1) thymus lymphaticus - podmieňujú atraktívnosť epitelového základu týmusu pre migrujúce prekurzorové T-bunky z hematopoetických orgánov a sú nevyhnutné pre normálnu histogenézu a funkciu týmusu, 2) glandulae parathyroideae - podmieňujú normálny vývoj, stavbu a funkciu prištítnych teliesok, 3) glandula thyroidea - vytvárajú spojivo štítnej žľazy, 4) tvár a krk - podieľajú sa na vývoji skeletu, chrupiek, spojivových a niektorých svalových štruktúr hlavy, tváre a krku, 5) srdce - podieľajú sa na septácii výtokovej časti srdca, oddelení veľkých ciev a komôr srdca. Vývin týmusu a neurálna lišta Výskum Bockmana a Kirbyho (1984) na kuracích embryách potvrdili, že experimentálna eliminácia častí kraniálnej neurálnej lišty (medzi somitmi 1 až 5) výrazne zredukuje veľkosť týmusu, prípadne spôsobuje až jeho absenciu. Podobne redukované boli aj prištítne telieska a štítna žľaza, v niektorých prípadoch dokonca telieska chýbali (na jednej strane alebo obojstranne) a objavili sa aj vývinové chyby srdca. Vývin týmusu teda závisí od priameho spojenia mezenchýmových derivátov neurálnej lišty s epitelom budúceho faryngu. Význam neurálnej lišty v normogenéze týmusu je znázornený na Obr. 2. Bunky neurálnej lišty po epitelovo-mezenchýmovej transformácii cestujú aj do oblasti faryngových vačkov. Tieto bunky ektomezenchýmu obklopia rozpínajúcu sa masu epitelových buniek – základ týmusu. Následne sa tento epitelový základ stáva atraktívny pre prekurzorové bunky lymfoidnej rady, ktoré sem migrujú z okolitých krvných ciev. Epitel vytvorí podpornú sieť pre lymfoidné bunky a interakcie medzi bunkami epitelu a budúcich lymfocytov dopomáhajú pri dozrievaní imunokompetentných T- buniek. Z buniek neurálnej lišty vznikajú spojivové puzdro a spojivové septá týmusu (Bockman, 1997). Vývin srdca a neurálna lišta Ľudské srdce, ako orgán sa začína vyvíjať v treťom týždni embryonálneho vývinu. V tom čase sa z pôvodne párového základu vytvorí jednotná, najprv priamo prebiehajúca srdcová rúra. Časť neurálnej lišty, ktorá sa označuje ako kardiogénna, sa nepodieľa jedine na vývine srdca, ale jej ablácia je asociovaná aj s nevyvinutím alebo nesprávnym vývinom týmusu, prištítnych teliesok a štítnej žľazy. Nakoľko vrodené chyby výtokovej časti srdca a hypoplázia týmusu sú súčasťou spektra pri viacerých klinických stavoch, rýchlo sa objavili dohady, že kardiogénna neurálna lišta je embryonálnym základom DiGeorgovho syndrómu (Hutson et Kirby, 2003). Bunky kardiogénnej neurálnej lišty zohrávajú viacero kľúčových úloh v normogenéze srdca - cestujú cez 3., 4., a 6. faryngový oblúk do vznikajúceho trunkokonálneho septa budúceho srdca a vytvárajú spojivo a hladké svalstvo septa ako aj parasympatické postganglionové neuróny (Larsen, 2001). Úloha kardiogénnej neurálnej lišty v normálnej a zmenenej septácii srdcových výtokových kanálov bola dokázaná pomocou ablácie neurálnej lišty v mnohých experimentoch. Ak sa odstráni kardiogénna neurálna lišta experimentálnym zvieratám skôr, než jej bunky začnú migrovať, 137 trunkokonálne septum sa vôbec nevyvinie a krv vyteká z komôr srdca cez truncus arteriosus perzistens. Ablácia časti alebo celej kardiogénnej neurálnej lišty môže zapríčiniť aj iné anomálie, napr. pootočenie aorty do prava, stenózu trojcípej chlopne, hypopláziu pravého štvrtého aortálneho oblúka, defekt komorového septa s hypopláziou alebo Fallotovu tetralógiu. Ďalší dôkaz o úlohe poruchy migrácie buniek neurálnej lišty je časté spojenie uvedených anomálií srdca s poruchou vývinu faryngových oblúkov a ich derivátov (napr. týmus), cez ktoré normálne bunky kardiogénnej neurálnej lišty migrujú. Náchylnosť na infekcie s hypopláziou týmusu a prištítnych teliesok aj anomáliami tváre u detí s vrodenými chybami srdca, známu ako DiGeorgov syndróm, spôsobuje delécia génov na chromozóme 22. Je to jedno z ochorení označovaných ako CATCH 22: Cardiac defects (srdcové chyby), Abnormal facial features (abnormálne črty tváre), Thymus hypoplasy (hypoplázia týmusu), Cleft palate (rázštep podnebia) a Hypocalcemia (hypokalcémia spôsobená nedostatočným vývinom glandulae parathyroideae) (Chaoui et al., 2002). Súčasne môžu byť prítomné aj ďalšie vrodené vývinové chyby u orgánov, ktorých normálny vývoj je tiež indukovaný prítomnosťou buniek neurálnej lišty. Okrem vrodených chýb srdca a týmusu môže byť súčasťou symptomatológie DiGeorgovho syndrómu aj gastroezofageálny reflux, oneskorený vývoj reči, laryngomalácia, rázštep pery a podnebia, agenéza obličiek, typické abnormality tváre, hluchota, malformácie očí, ochrnutie nervus facialis a hypotyroidizmus (Markert et al., 2004). Kraynack et al. (1999) dávajú do súvislosti s deléciou 22q11.2 aj agenézu corpus callosum, ktorú diagnostikovali u 4 ročného dievčaťa s DiGeorgovým syndrómom. Hemizygotná delécia chromozómu 22q11, ktorá je asociovaná s DiGeorgovým syndrómom sa vyskytuje u 1 zo 4000 detí. V 8 až 28% je táto choroba zdedená po rodičoch a prevalencia familiárneho výskytu sa zvyšuje so zlepšujúcou sa starostlivosťou o pacientov s DiGeorgovým syndrómom a ich prežívaním do reprodukčného veku (Stalmans et al., 2003). Pereira et al. (2003) porovnávali výskyt mikrodelécií 22q11.2 (metódou vysoko špecifickej PCR) u 149 jedincov z troch rôznych etnických skupín (europoidná a negroidná varieta a mulati). Autori nenašli signifikantný rozdiel týkajúci sa heterozygozity spomínanej mikrodelécie medzi jednotlivými subpopuláciami. Lézie kardiogénnej neurálnej lišty však majú malý morfologický dopad na vývin žíl srdca, ako napríklad cor triatriatum alebo anomálie venae pulmonales (Philips at al., 1989). Obr. 2. Schéma jednotlivých krokov vo vývine týmusu (Bockman, 1997). Závery Pri vrodených chybách srdca sa často nevenuje dostatočná pozornosť možnému narušenému vývinu týmusu. Mikušová et al. (2006) sledovali štruktúru týmusu odstráneného pri kardiochirurgických operáciách srdca detí. Zistili pozitívnu koreláciu medzi zmenou štruktúry týmusu a vybranými vrodenými chybami srdca (defekt komorového septa, transpozícia veľkých ciev srdca, perzistujúci truncus arteriosus, hypoplázia ľavej komory) u detí. Autori predpokladajú, že tieto zmeny sú podmienené génmi, ovplyvňujúcimi bunky neurálnej lišty v ich migrácii do základu srdca a týmusu. Týmusy detí s vrodenými chybami srdca vykazovali zmeny v štruktúre kôry a drene, aj v pozitivite na cytokeratín. Najväčšie rozdiely boli v počte, štruktúre a veľkosti Hassallových teliesok drene týmusu. 138 Navyše deťom s vrodenými chybami srdca sa počas kardiochirurgickej operácie bežne vykonáva totálna alebo parciálna tymektómia pre lepší prístup k operačnému polu. Zatiaľ existuje málo údajov o zmenách v bunkovej imunite následkom tymektómie u malých detí. Halnon et al. (2005) zistili narušenú produkciu a dlhotrvajúce zníženie počtu CD4 a CD8 lymfocytov u tymektizovaných detí. Môže však byť otázne, či tieto zmeny spôsobila samotná tymektómia pri kardiochirurgickej operácii alebo narušený prenatálny vývin týmusu. Poďakovanie Práca bola podporená Grantom Univerzity Komenského č. UK/349/2007 a grantom VEGA č. 1/4252/07. Použitá literatúra 1. Bockman, D.E.: Development of the thymus. Microsc Res Tech. 38: 209–215, 1997. 2. Bockman, D.E., Kirby M.L.: Dependence of thymus development on derivates of neural crest. Science. 223: 498–500, 1984. 3. Graham, A.: Development of the pharyngeal arches. Am J Med Genet. 119A(3): 251–256, 2003. 4. Halnon, N.J., Jamieson, B., Plunkett, M. et al.: Thymic function and impaired maintance of peripheral T cell populations in children with congenital heart disease and surgical thymectomy. Pediatr Res. 57(1): 42–48, 2005. 5. Hutson, M.R., Kirby, M.L.: Neural crest and cardiovascular development: a 20-year perspective. Birth Defects Res (part C). 69: 2–13, 2003. 6. Chaoui, R., Kalache, K.D., Heling, K.S. et al.: Absent or hypoplastic thymus on ultrasound: a marker for deletion 22q11.2 in fetal cardiac defects. Ultrasound Obstet Gynecol. 20: 546–552, 2002. 7. Kang, P., Svoboda, K.H.: Epithelial-mesenchymal transformation during craniofacial development. J Dent Res. 84(4): 678–690, 2005. 8. Kapeller, K., Pospíšilová, V.: Embryológia človeka. Martin: Vydavateľstvo Osveta 371p., 2001. 9. Kirby, M.L., Waldo, K.L.: Role of neural crest in congenital heart disease. Circulation. 82: 332–340, 1990. 10. Kraynack, N.C., Hostoffer, R.W., Robin, N.H.: Agenesis of the corpus callosum associated with DiGeorge – velocardiofacial syndrome: a case report and review of the literature. J Child Neurol. 14(11): 754–756. 1999. 11. Larsen, W.J.: Human Embryology. Third Edition. New York: Churchill Livingtone 548p., 2001. 12. Markert, M.L., Alexieff, M.J., Li, J. et al.: Complete DiGeorge syndrome: Development of rash, lymphadenopathy and oligoclonal T cells in 5 cases. J Allergy Clin Immunol. 113 (4): 734–741, 2004. 13. Mikušová, R., Pospíšilová, V., Varga, I. et al.: Retikuloepitelová stróma v normálnom a patologicky zmenenom týmuse. In: Polák, Š., Pospíšilová, V., Varga, I. (eds): Morfológia v súčasnosti. Bratislava: Univerzita Komenského, 239–245, 2006. 14. Pereira, A.N., Correa, R.F.R., Mota, G.F. et al.: High specificity PCR screening for 22q11.2 microdeletion in three different ethnic groups. Braz J Med Biol Res. 36(10): 1359–1365, 2003. 15. Philips, M.T., Waldo, K., Kirby, M.L.: Neural crest ablation does not alter pulmonary vein development in the chick embryo. Anat Rec. 223(3): 292–298, 1989. 16. Pospíšilová, V., Slípka, J.: Does the thymus develop in the third branchial pouch only? Funct Develop Morphol. 4: 247–248, 1994. 17. Pospíšilová, V., Mikušová, R., Polák, Š., Varga, I.: Embryológia človeka. Učebnica pre bakalárske a magisterské odbory. Bratislava: Univerzita Komenského 100p., 2007. 18. Sakai, D., Wakamatsu, Y.: Regulatory mechanisms for neural crest formation. Cell Tis Org. 179: 29–35, 2005. 19. Slípka, J., Pospíšilová, V.: „Thymus secundus“ beim Menschen. Ann Anat. 177: 386, 1995. 20. Stalmans, I., Lambrechts, D., De Smet, F. et al.: VEGF: A modifier of the del 22q11 (DiGeorge) syndrome? Nature Med. 9(2): 173–182, 2003. 21. Vacek, Z.: Embryologie. Učebnice pro studenty lékařství a oborů všeobecná sestra a porodní asistentka. Praha: Grada Publishing 255p., 2006. 22. Varga, I., Pospíšilová, V., Rajec, J. et al.: Etiológia, patogenéza a prevencia kongenitálnych defektov neurálnej rúry. In: XIV. kongres SGPS SLS s medzinárodnou účasťou venovaný pamiatke primára MUDr. Ladislava Topolského, CSc. Abstrakty. Bratislava: SLS, SGPS. 42–43, 2007. 139 Simultaneous detection of multiple genetic variants associated with hereditary pancreatitis (Molecular diagnostic assay development and validation) Patrik Vitazka, M. Lu, MA. Armstrong, Arti Pandya, Andrea Ferreira-Gonzalez Department of Pathology, Virginia Commonwealth University Medical Center, Richmond, VA Abstract Background: Susceptibility to pancreatitis, variability of clinical manifestation and likelihood of complications such as progression to neoplastic disease results likely from specific variations in the individual's genomic DNA. Role of genetic polymorphism in disease development is most evident in the case of hereditary pancreatisis (HP). HP presents as an autosomal dominant disorder with 80% disease penetrance and is associated with mutations in cationic trypsinogen gene (PRSS1). Recently another gene has been described the serine protease inhibitor Kazal type 1 (SPINK1) to be a contributing factor in adult alcoholic and chronic pancreasitis. Methods: We have developed a single tube DNA genotyping assay simultaneously detecting four different loci in two genes: PRSS1 and SPINK1 gene. PCR amplicones are used as templates for extension of unlabeled olifonucleotides with fluorescent dideoxynucleotides by the AmpliTaq DNA Polymerase. Resulting fluorescently labelled oligos are analyzed on the ABI 3100 capillary electrophoresis instrument and genotype is assigned using the GeneScan Software. Conclusion: We have developed an accurate method for simultaneous detection of the four most common genetic variants associated with pancreatitis. The design of the assay allows for flexible incorporation of additional genetic variants and will lead to a better understanding and management of patients with pancreatic inflammatory disease. Introduction Recurrent inflammatory attacks of pancreatic tissue result, in many occasions, into irreversible structural alteration and functional impairment of the pancreas with life threatening consequences. Exocrine pancreas produces a variety of proteolytic enzymes necessary for proper chymus digestion. These enzymes are secreted into pancreatic juice as inactive proenzymes and do not become activated until they enter the duodenum. Improper pancreatic juice composition, environmental stimuli, such as chronic exposure to ethanol, distorted local anatomy with altered drainage of bile and pancreatic juice into the duodenum, and increased sensitivity of the immune system, can all lead to premature activation of proteolytic enzymes in the pancreatic parenchyma and result in inflammation. Therefore, inflammation of the pancreatic parenchyma is usually a result of an autodigestive process rather than infection. Susceptibility to pancreatitis and variability of clinical manifestation, including progression to a neoplastic disease, results likely from specific variations in the DNA of an individual. The role of genetics in pancreatitis development was previously correlated with a particular mutation in the key proteolytic enzyme, the cationic trypsinogen gene [PRSS1 NM_002769.2: c. 365G>A (p. Arg122His)]. Dominant pattern of inheritance and the fact that more than 80% of the PRSS1_R122H mutation carriers develop disease during their lifetime made trypsinogen gene a suitable candidate for genetic testing. Further studies showed that additional disease contributing mutations can occur [PRSS1 NM_002769.2: c. 47C>T (p. Ala122Val), PRSS1 NM_002769.2: PRSS1_ c. 86A>T (p. Gln122Ile)]. Since mutations in PRSS1 gene can explain only a limited number (~2-3%) of familiar or idiopathic pancreatitis, genetic variations in other genes, hand-in-hand with environmental factors, are likely to be present. Among these genes, SPINK1 is the most recent candidate [SPINK1 NM_003122.2: c. 101 A>G (p. Gln122Ser)]. Additionally, there has been a clear association with certain mutations in the CFTR1 gene. Interestingly, the patient’s risk was increased approximately 40fold by having 2 CFTR mutations, 20-fold by having SPINK1 (N34S), and 900-fold by having both. Genetic testing offers a tool that allows identification of individuals with greater risk for pancreatitis development and can influence early disease management. It also decreases the number of invasive procedures what translates into decreased cost for health care providers and the same time benefit 140 patients. Here we describe development of a molecular diagnostic tool for targeted mutation detection in genes that have been previously correlated with either a high risk of pancreatitis development or with increased susceptibility to pancreatitis. The chosen assay platform was designed to be easily updated as additional loci and genes are discovered. As many as 35 single nucleotide variants or mutations in multiple genes can be simultaneously assessed in a single run. Materials and methods Assay platform: The assay was designed as a SNaPshot Multiplex Assay run on the ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) to simultaneously interrogate presence of four different nucleotides in two different genes in a single tube reaction. Primer and probe design: Pairwise DNA alignment shows that PRSS1 gene shares extensive homology with the PRSS2 and PRRSS3 genes and TRY5, TRY6, and TRY7 pseudogenes (Fig. 1). PRSS1 gene exon2 alignment (partial sequence): PRSS1 PRSS3 PRSS2 TRY7 TRY5 TRY6 TTGCTGCCCCCTTTGATGATGATGACAAGATCGTTGGGGGCTACAACTGTGAGGAGAATTCTGTCCCCTACCAGGTGTCCCTGAATTCTGGCTACCACTTCTGTGGTGGCTCCCTCATCAACGAACAGTGGGTGGTATCAGCAGGCCACTGCTACAAGTC TTGCTGTCCCCTTTGACGATGATGACAAGATTGTTGGGGGCTACACCTGTGAGGAGAATTCTCTCCCCTACCAGGTGTCCCTGAATTCTGGCTCCCACTTCTGCGGTGGCTCCCTCATCAGCGAACAGTGGGTGGTATCAGCAGCTCACTGCTACAAGAC TTGCTGCCCCCTTTGATGATGATGACAAGATCGTTGGGGGCTACATCTGTGAGGAGAATTCTGTCCCCTACCAGGTGTCCTTGAATTCTGGCTACCACTTCTGCGGTGGCTCCCTCATCAGCGAACAGTGGGTGGTGTCAGCAGGTCACTGCTACAAGTC TTGGTGTCTCCTTTGATGATGATGACAAGATTGTTGGGGGCTACAACTGTGAGGAGAATTCTGTCCCCTACCAGGTGTCCCTGAATTCTGGCTACCACTTCTGTGTTGGCTCCCTCAACAGGGAATAGTGGGTGGTGTCAGCAGCTCACTGCTACAAGTC TTGCTTCCCCTTTCGACGACGATGACAACATCATTTAGTGGTATACCTGTGAGGAGAATTCTGTCCCCTACCAGGTGTCCCTGAATTCTGGGTACCACTTCTGCAGTGGCTCCCTCCTCAGCGAACAGTGGGTGGTGTCAGCAGCTCACTGCTACAAGTA TTGCTGTCCCCTTTGATGATGATGACAAGATTGTTGGGGGCTACACCTGTGAGGAGAATTCTGTCCCCTACCAGGTGTCCTTGAATTCTGGCTCCCACTTCTGTGGTGGCTCCCTCATCAGCGAACAGTGGGTGGTGTCAGCAGGTCACTGCTACAAGCC *** * * * ** ** ** ******** ** ** * * ** * **************** ***************** ********** * ********* ********** ** *** ********** ******* ************ PRSS1 PRSS3 PRSS2 TRY7 TRY5 TRY6 NNNNNNNNCAAGATCATCCGCCACCCCCAATACGACAGGAAGACTCTGAACAATGACATCATGTTAATCAAGCTCTCCTCACGTGCAGTAATCAACGCCCGCGTGTCCACCATCTCTCTGCCCACCGCCCCTCCAGCCACTGGCACGAAGTGNNNNNNNN NNNNNNNNCAAGATCATCCGCCACCCTAAATACAACAGGGACACTCTGGACAATGACATCATGCTGATCAAACTCTCCTCACCTGCCGTCATCAATGCCCGCGTGTCCACCATCTCTCTGCCCACCACCCCTCCAGCTGCTGGCACTGAGTGNNNNNNNN NNNNNNNNCAAGATCATCCGCCACCCCAAATACAACAGCCGGACTCTGGACAATGACATCCTGCTGATCAAGCTCTCCTCACCTGCCGTCATCAATTCCCGCGTGTCCGCCATCTCTCTGCCCACTGCCCCTCCAGCTGCTGGCACCGAGTCNNNNNNNN NNNNNNNNCAAGATCATCCGCCACCCCAAATACAACAGCTGGACTCTGGACAATGACATCCTGCTGATCAAGCTCTCCACACCTGCCATCATCAATGCCCATGTGTCCACCATCTCTCTGCCCACCACCCCTCCAGCTGCTGGCACTGAGTGNNNNNNNN NNNNNNNNCAAGATCATCCGCCACCCCAAATACAACAGTTGGACTCTGGACAATGACATCCTGCTGATCAAGCTCTCCATGCCTGCTGTCATCAATGCCCACATGTCCACCATCTCTCTACCCACCGCCCCTCCAGCTGCTGGCACCAAGTTNNNNNNNN NNNNNNNNCAAGATCATCCGCCACCCCAAATACAACAGGATTACTCTGAACAATGACATCATGCTGATCAAGCTCTCCACACCTGCCGTCATCAATGCCCATGTGTCCACGATCTCTCTGCCCACTGCCCCTCCAGCTGCTGGCACCGAGTGNNNNNNNN ****************** ***** **** ****** *********** ** * ***** ****** * *** * ***** *** ***** * ******** ***** ********** ******* *** PRSS1 gene exon3 alignment (partial sequence): Fig. 1. Alignment of the trypsinogen gene family. Three pairs of primers were used in a multiplex PCR reaction to yield three products (Fig. 2): 423bp amplicon of the exon 2 of the PRSS1 gene, 138bp amplicon of the exon 3 of the PRSS1 gene, and 307bp amplicon of the exon 3 of the SPINK1 gene. PRSS1_exon2: forward primer: PRSS1_ex2_F(2), reverse primer: PRSS1_ex2_R, probe: PRSS1_ex2_47_F(pA) Forward strand AAAAACCCATCTCCACTCCAGTTGCTG 5’- CCCAGGAGAGCTCGGATCCTNNNNNCCCATCTCCACTCCAGTTGCTGCNNNNNCGACTGCAAAGCTCCCGGC -3’ PRSS1_exon2: forward primer: PRSS1_ex2_F(2), reverse primer: PRSS1_ex2_R, probe: PRSS1_ex2_86_R(pA) Forward strand 5’- CCCAGGAGAGCTCGGATCCTNNNNNACTGTGAGGAGAATTCTGTCCCCTNNNNNCGACTGCAAAGCTCCCGGC -3’ GACACTCCTCTTAAGACAGGGGAAAAAAAAAAA PRSS1_exon3: forward primer: PRSS1_ex3_F, reverse primer: PRSS1_ex3_R, probe: PRSS1_ex3_365_R Forward strand 5’- TCATGTTAATCAAGCTCTCCTCACGNNNNNGCGTGTCCACCATCTCTCTGCCCNNNNNGCGAGCTCTGGCGGTGAGT -3’ GCACAGGTGGTAGAGAGACGGG SPINK1_exon3: forward primer: SPINK1_ex3_F, reverse primer: SPINK1_ex3_R, probe: SPINK1_ex3_101_R Forward strand 5’- CAATCACAGTTATTCCCCAGAGNNNNNATGAACTTAATGGATGCACCAAGNNNNNTCTCACCCCGAGAAAAGCAAAC -3’ ACTTGAATTACCTACGTGGTTCAAAAAAAAAAAAAAA Fig. 2. Primers and probes for the hereditary pancreatitis SNaPshot multiplex essay. PCR assay was optimized with regard to: annealing temperature (55oC-65oC in 1oC increments), Mg2+ concentration (1.0mM-3.0mM in 0.5mM increments), and primer concentration (100nM-900nM in 200nM increments). PCR amplicones were used in a common oligo-probe based single dideoxynucleotide (ddNTP) extension reaction. Genotyping control preparation: PCR amplicon of the PRSS1 gene encompassing a region with all the variants of interest was cloned into the pCRBluntII-TOPO vector. Genotyping control for the SPINK1 gene was prepared similar way. Site directed mutagenesis was used to introduce specific base pair changes at the analyzed positions. Samples: Analyzed clinical samples were divided into three groups: Group 1: Individuals from a large family diagnosed with hereditary pancreatitis (studied by Pandya at al.), n=21. Group 2: Individuals with clinical manifestation of pancreatisis, n=142. Group 3: Healthy individuals without apparent clinical manifestation of pancreatitis - control group, n=157. SNaPshot protocol: Genomic DNA from whole peripheral human blood was extracted with the MagNa Pure LC Instrument (Roche Diagnostics) using the DNA I Blood Cells Fast Protocol and the MagNA Pure LC DNA Isolation kit. DNA was initially amplified in a multiplex PCR (3-plex) reaction using three pairs of primers. Amplified DNA was subsequently digested with SAP and ExoI enzymes to remove dNTPs and unincorporated primers and used as templates for four oligonucleotide probes in single dideoxynucleotide (ddNTP) extension 141 reaction. Mixture of four different ddNTPs each labeled with a different fluorophore was used in the extension reaction (SnapShot Multiplex Reaction Mix, Applied Biosystems). Fluorescently labeled probes were digested with SAP, mixed with HiDi formamide, heat denatured, and run on the capillary electrophoresis instrument ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer raw data files were analyzed using the GeneScan Software with the GS120 LIZ Size Standard analysis parameter file. Results and discussion Assay design: The assay was designed as a SNaPshot Multiplex Assay run on the ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) to simultaneously interrogate presence of four different nucleotides in two different genes in a single tube reaction. ANALYTICAL VALIDATION: Assay inter and intra run variability: After initial assay optimization with regard to primer annealing temperature, magnesium ion concentration, and primer concentration, nine clinical samples with genotype previously established by sequencing and positive plasmid controls generated by site directed mutagenesis were run on three different days in three replicates. For each case, we measured the coefficient of variation (%CV) and looked at the range of obtained values. Precision and reportable ranges: To determine assay variability and to establish reportable range criteria, results from 320 samples were analyzed and average peak size values and reportable ranges were calculated. Background threshold value for peak height was also defined. PRSS1_47 peak size peak height A16(47C) 30.15 +/- 0.25 >400 PRSS1_86 V16(47T) 31.58 +/- 0.25 >400 N29(86A) 35.71 +/- 0.25 >400 PRSS1_365 I29(86T) 35.45 +/- 0.25 >400 R122 (365G) 26.6 +/- 0.25 >400 R122 (365A) 28.3 +/- 0.25 >400 SPINK1_101 N34(101A) 38.47 +/- 0.25 >400 S34(101G) 37.08 +/- 0.25 >400 Assay specificity and sensitivity: To confirm specificity of the SNaPshot Multiplex Genotyping Assay forty eight clinical samples were subject to bidirectional sequencing or to RLFP analysis using the AflIII restriction endonuclease. We analyzed n=15 DNA samples from the group 1, n=20 DNA samples from the group 2, and n=13 samples from the group 3. Bidirectional sequencing analysis of the PRSS1 gene exon 2 at the position 47 and 86 identified presence of wild type nucleotides PRSS1_ (47C/C) and PRSS1_ (86A/A) in all 48 analyzed samples. No mutations were identified either by sequencing or by the SNaPshot Multiplex genotyping assay. Bidirectional sequencing analysis of the SPINK1 gene exon 3 at the position 101 identified presence of wild type nucleotides SPINK1_(101A/A) in 37 individuals, 11 individuals were identified as heterozygotes with one wild type nucleotide and one genetic variant nucleotide SPINK1_(101A/G). The overall sensitivity and specificity resulting from the comparison of bidirectional sequencing and the SNaPshot Multiplex genotyping assay was 100% (Specificity: [TN/(TN+FP)] = 100%, Sensitivity: [TN/(TN+FP)] = 100%). PCR-RLFP analysis with the AflIII restriction endonuclease of the PRSS1 gene exon 3 at the position 365 identified presence of wild type nucleotides PRSS1_ (365 G/G) in 37 individuals, 15 individuals were identified as heterozygotes with one mutated nucleotide and one wild type nucleotide PRSS1_ (365 G/A). The overall sensitivity and specificity resulting from the comparison of the RLFP analysis and the SnaPshot Multiplexgenotyping assay was 100% (Specificity: [TN/(TN+FP)] = 100%, Sensitivity: [TN/(TN+FP)] = 100%). GROUP PRSS1_47 PRSS1_86 PRSS1_365 SPINK1_101 C/C C/T T/T A/A A/T T/T G/G G/A A/A A/A A/G G/G GROUP 1 (n=21) 21 0 0 21 0 0 7 14 0 21 0 0 142 GROUP 2 (n=142) 142 0 0 142 0 0 141 1 0 135 7 0 GROUP 3 (n=157) 157 0 0 157 0 0 157 0 0 153 4 0 CLINICAL VALIDATION: SNaPshot Multiplex Genotyping Assay identified 14 individuals out of n=21 to have a mutation in the PRSS1 at the position 365 G>A (PRSS1_R122H) in the group 1. The assay also identified one individual to have a mutation in the PRSS1 at the position 365 G>A (PRSS1_R122H) and 7 individuals to have a single nucleotide variant in the SPINK1 gene at the position 101 A>G (SPINK1_N34S) out of n=142 in the group 2. There were 4 individuals with a single nucleotide variant in the SPINK1 gene at the position 101 A>G (SPINK1_N34S) out of n=157 in the group 3. Nobody in this group had a mutation in the PRSS1 gene. We did not identify anybody who would have mutation in both PRSS1 and the SPINK1 genes simultaneously. PRSS1_ c. 47C>T (p. Ala122Val) PRSS1_ c. 86A>T (p. Gln122Ile) 0 0 0 0 0 0 0 PRSS1 c. 365 G>A (p. Arg122His) A/T T/T A/A 0 A/A 48 0 0 A/T C/C 48 sequencing T/T 0 0 0 T/T C/T C/T sequencing SNaPshot Assay C/C T/T SNaPshot Assay 0 0 0 SPINK1 c. 101 A>G (p. Gln122Ser) 0 0 0 15 0 0 0 0 A/A A/G G/G A/A G/G 33 sequencing A/A 37 0 0 G/G A/G G/A G/A AflIII PCR-RLFP SNaPshot Assay G/G A/A SNaPshot Assay 0 11 0 0 0 0 Conclusions We have developed an accurate method for simultaneous detection of the four most common genetic variants associated with hereditary pancreatitis. The SNaPshot Multiplex Genotyping Assay platform was chosen for its user friendly format and flexible customization of number of analyzed single nucleotide variants or mutations in multiple genetic loci. Assessment of multiple genetic variants simultaneously will lead to a better understanding and management of patients with pancreatic inflammatory disease. Acknowledgements I would like to thank Dr. Vanda Repiska and Dr. Viera Geislerova for their invitation to participate on the conference “Vrsanskeho den biologov”. Likewise I would like to thank all the personals at the Molecular Diagnostics Lab at Virginia Commonwealth University for they dedication to the exciting work they do everyday. References 1. Ellis, I., Lerch, M.M., Whitcomb, D.C.: Genetic testing for hereditary pancreatitis: guidelines for indications, counselling, consent and privacy issues. Pancreatology. 1(5): 405–15, 2001. 2. Noone, P.G., Zhou, Z., Silverman, L.M., et al.: Cystic fibrosis gene mutations and pancreatitis risk: relation to epithelial ion transport and trypsin inhibitor gene mutations. Gastroenterology. 121: 1310–1319, 2001. 3. Sanchez, J.J.S., Børsting, C., Hallenberg, C., Buchard, A., Hernandez, A., Morling, N.: Multiplex PCR and minisequencing of SNPs - a model with 35 Y chromosome SNPs. Forensic Sci Int. 137: 74–84, 2003. 4. Teich, N., Rosendahl, J., Toth, M., Mossner, J., Sahin-Toth, M.: Mutations of human cationic trypsinogen (PRSS1) and chronic pancreatitis. Hum Mutat. 27: 721–730, 2006. 143 Hodnotenie farmakologickej liečby starších pacientov pomocou vybraných indikátorov Martin Wawruch1, Martina Žikavská1, Kamil Stratený1, Ladislava Wsólová2, Magdaléna Kuželová3, Jana Tisoňová1, Dalibor Hojsík4, Vladimír Šišovsky5, Štefan Laššán6, Viera Kristová 1 Farmakologický ústav, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava; 2Oddelenie vedeckých a technických informácií, Slovenská zdravotnícka univerzita, Bratislava; 3Katedra farmakológie a toxikológie, Farmaceutická fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava; 4Ústav súdneho lekárstva, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava; 5Ústav patologickej anatómie, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Bratislava; 6Katedra pneumológie a ftizeológie, Fakulta zdravotníckych špecializačných štúdií, Slovenská zdravotnícka univerzita, Bratislava, Slovenská republika, [email protected] Abstrakt V súčasnosti vystupuje do popredia čoraz viac problém hodnotenia kvality farmakoterapie v geriatrii. Preto cieľom našej štúdie bolo hodnotiť kvalitu farmakologickej liečby s použitím dvoch indikátorov kvality: a) používanie liečiv potenciálne nevhodných pre starších pacientov a b) nežiaduce účinky (NÚ) farmák, ktoré mali príčinný vzťah k prijatiu na hospitalizáciu. Do štúdie sme zaradili 600 pacientov vo veku ≥65 rokov hospitalizovaných v nemocnici v Považskej Bystrici od 1.12. 2003 do 31.3. 2005. Na identifikovanie potenciálne nevhodných liečiv sme použili Beersov zoznam z roku 2003. Ako NÚ vedúce k hospitalizácii sme hodnotili tie NÚ liečiv, ktoré boli uvedené ako hlavný dôvod alebo ako jedna z príčin prijatia do nemocnice. Pri prijatí do nemocnice sa potenciálne nevhodné liečivá vyskytli u 121 (20,2%) a pri prepustení u 120 (20,0%) pacientov. Najčastejšie sme zaznamenali digoxín v dávke >0,125 mg/deň (okrem liečby predsieňových arytmií) a tiklopidín. NÚ, ktoré patrili k príčinám hospitalizácie, boli dokumentované u 47 pacientov. Prevažovali NÚ A-typu (n=43), ktoré sú dávkovo závislé a preventabilné. Hlavným nástrojom prevencie NÚ je pravidelné prehodnocovanie farmakoterapie, rešpektovanie osobitostí individuálneho chorého a zohľadňovanie rizika liekov. Úvod Hoci starší ľudia tvoria približne iba pätinu obyvateľstva Slovenskej republiky, náklady na farmakologickú liečbu týchto pacientov predstavujú takmer tretinu všetkých financií vynaložených na lieky (Hegyi a Krajčík, 2002; Zdravotnícka ročenka, 2004). Starší ľudia predstavujú vysoko vulnerabilnú skupinu populácie z hľadiska rizika farmakologickej liečby. Nežiaduce účinky sú častou príčinou hospitalizácie. Podľa údajov štúdií orientovaných na populáciu starších pacientov 3,5-24,8% hospitalizácií sú spôsobené NÚ (Col a kol., 1990; Lindley a kol., 1992). Citlivosť staršieho človeka na farmakoterapiu súvisí so zmenami farmakokinetiky a farmakodynamiky liečiv, s častou polymorbiditou, so súčasným užívaním viacerých liečiv ako aj so zmenenou compliance k farmakoterapii (Bressler a Bahl, 2003). Podľa domácich zdrojov užívajú starší obyvatelia v domovoch dôchodcov priemerne 4,8 liekov. Iba 9,9% z týchto osôb neužívali žiaden liek (Bartošovič a kol., 2003). Wawruch a kol. (2007) zaznamenali užívanie ≥6 liečiv až u 62,3% hospitalizovaných pacientov pri prepustení z nemocnice. Z uvedených dôvodov vystupuje v súčasnosti čoraz viac do popredia problém hodnotenia kvality farmakoterapie v geriatrii. Zložitosť takejto analýzy vyplýva z nedostatku relevantných dôkazov, ktoré by umožnili jednoznačne definovať kvalitnú alebo nekvalitnú farmakologickú liečbu u starších pacientov. Pre objektivizáciu hodnotenia kvality farmakoterapie boli vytvorené indikátory kvality. Ide o merateľné parametre, pre ktoré existujú dôkazy alebo konsenzus, že môžu byť použité na hodnotenie kvality farmakologickej liečby a jej zmien (Lawrence a Olesen, 1997). Ich použitie umožňuje poukázať na problémy a trendy v preskripcii. V priestore Európskej Únie sa tvorbou indikátorov kvality zaoberá expertná skupina DURQUIM (Drug Utilisation Research Quality Indicators Meeting) (Hoven a kol., 2005). Indikátory kvality farmakoterapie sú pre oblasť geriatrie vytvárané zväčša metódami konsenzu odborníkov, ktorí zohľadnia aktuálny stav poznania na úrovni medicíny založenej na dôkazoch. 144 Na Slovensku je nedostatok prác zaoberajúcich sa kvalitou preskripcie liekov. Dosiaľ publikované práce sa sústredili zväčša na ekonomické aspekty farmakoterapie, čo súvisí so snahou regulačných orgánov o znižovanie nákladov vynaložených na lieky (Foltán a kol., 2003). Preto cieľom našej štúdie bolo hodnotiť kvalitu farmakologickej liečby s použitím dvoch indikátorov kvality: 1) používanie liečiv potenciálne nevhodných pre starších pacientov a 2) nežiaduce účinky liečiv, ktoré mali príčinný vzťah k prijatiu na hospitalizáciu. Pacienti a metódy Do predkladanej retrospektívnej štúdie sme zaradili 600 pacientov vo veku ≥65 rokov hospitalizovaných na Internom oddelení Nemocnice s poliklinikou v Považskej Bystrici v období od 1.12. 2003 do 31.3. 2005. Do súboru neboli zaradení pacienti, ktorí počas hospitalizácie zomreli. Taktiež boli z hodnotenia vyradení chorí, ktorých dokumentácia neposkytovala všetky údaje potrebné pre naše hodnotenie (napr. pacienti, ktorí boli po krátkej hospitalizácii preložení na iné oddelenie). U všetkých pacientov sme zaznamenali liečivá, s ktorými pacient prišiel do nemocnice a farmaká, ktoré mu boli odporučené pri prepustení z nemocnice. Do úvahy sme brali i dávkovanie jednotlivých liečiv. Nehodnotili sme farmaká, ktoré boli podávané iba prechodne počas hospitalizácie. Taktiež sme neanalyzovali prípravky určené na lokálnu terapiu (dermatologiká). Všetky údaje pre našu analýzu sme čerpali z chorobopisov pacientov. Pri zbere dát sme plne rešpektovali etické princípy s ohľadom na zabezpečenie ochrany osobných údajov. Na identifikovanie liečiv potenciálne nevhodných pre pacientov vo veku ≥65 rokov sme použili americký Beersov zoznam z roku 2003 (Fick a kol., 2003). Zoznam zahŕňa liečivá, ktorých podanie starším pacientom je spojené so zvýšeným rizikom manifestácie nežiaducich účinkov, ďalej farmaká s vysokým interakčným potenciálom a liečivá, ktoré nemajú dostatočne potvrdenú účinnosť z hľadiska medicíny založenej na dôkazoch. Ide o medzinárodne rešpektovaný zoznam, ktorý bol použitý v podobných štúdiách (Fialova a kol., 2005, Onder a kol., 2005). Užívanie potenciálne nevhodných liečiv pri prijatí a prepustení z nemocnice sme porovnali McNemarovým testom (hladina významnosti α=0,05; štatistický softvér SPSS for Windows 13. verzia). Ako nežiaduce účinky (NÚ) vedúce k hospitalizácii sme hodnotili tie NÚ liečiv, ktoré boli uvedené v dokumentácii pacienta ako hlavný dôvod alebo ako jedna z príčin prijatia do nemocnice. Zaznamenali sme liečivá, ktoré boli podľa dokumentácie v príčinnom vzťahu k jednotlivým NÚ. Kauzálny vzťah konkrétneho liečiva s nežiaducou udalosťou musel byť potvrdený „dechallenge“ testom alebo údajom o dávkovej závislosti. „Dechallenge“ testom rozumieme ústup NÚ po ukončení podávania liečiva. Dávková závislosť znamenala vymiznutie NÚ po redukcii dávky vyvolávajúceho farmaka. Diferencovali sme NÚ A- a B- typu. A-typ reprezentujú dávkovo závislé nežiaduce reakcie, ktoré sú výsledkom zosilnenia farmakodynamického účinku liečiva. B-typ NÚ sú nezávislé od dávky a nesúvisia s mechanizmom účinku farmaka. Za NÚ sme nepovažovali prípady úmyselného alebo náhodného predávkovania, chyby v aplikácii a terapeutické omyly (Rawlins a Thompson, 1985; van der Hooft a kol., 2006). Výsledky a diskusia V súbore 600 pacientov prevažovali ženy 351 (58,5%) nad mužmi 249 (41,5%). Priemerný vek ± smerodajná odchýlka (SD) všetkých pacientov súboru bol 76,6 ± 6,5 rokov. Ženy boli staršie (77,1 ± 6,1) ako muži (75,9 ± 7,0). V hodnotenom súbore sa pri prijatí do nemocnice vyskytli potenciálne nevhodné liečivá u 121 (20,2%) chorých a pri prepustení u 120 (20,0%) pacientov. Porovnateľné hodnoty boli zistené v Českej republike (25,2%), Taliansku (25,7%) a Fínsku (20,3%) (Fialová a kol., 2005). V hodnotenom súbore sme zaznamenali ako najčastejšie nevhodné farmaká digoxín v dávke >0,125 mg/deň (okrem liečby predsieňových arytmií) a tiklopidín. K najzriedkavejšie sa vyskytujúcim patrili pentazocín, tioridazín a amitriptylín (tabuľka 1). Digoxín je najstarším a zároveň aj jedným z najmenej finančne nákladných liečiv používaných v terapii chronického srdcového zlyhania. Jeho frekventovaný výskyt v našom súbore poukazuje na pretrvávajúci trend preskripcie tohto farmaka. Na častej preskripcii tiklopidínu v našom súbore sa podieľajú limitácie zdravotných poisťovní pre klopidogrel, ktorý predstavuje bezpečnejšiu alternatívu v porovnaní s tiklopidínom. Príčinou je vyššia cena klopidogrelu oproti tiklopidínu. 145 Liečivo digoxín* tiklopidín amiodaron chlórdiazepoxid karizoprodol diazepam fluoxetín metyldopa indometacín doxazosín prometazín pentazocín tioridazín amitriptylín výskyt pri prijatí 44 28 19 9 7 6 5 5 3 3 2 1 1 0 výskyt pri prepustení 43 28 18 9 7 7 4 5 2 3 3 1 1 1 Tab. 1. Výskyt potenciálne nevhodných liečiv pri prijatí a prepustení z nemocnice (n=600). Vysvetlivky: hodnoty vyjadrujú frekvenciu výskytu; *digoxín v dávke >0,125 mg/deň, okrem liečby predsieňových arytmií. Počas hospitalizácie nedošlo k významnej zmene celkového počtu potenciálne nevhodných liečiv pri porovnaní stavu pri prijatí a prepustení z nemocnice. Možno konštatovať, že vnímanie potenciálneho rizika hodnotených liečiv nemocničnými lekármi (internistami) je podobné ako u praktických lekárov, ktorí zodpovedali za liečbu pacientov mimo nemocnice (Wawruch a kol., 2006). Americký Beersov zoznam sme použili preto, lebo na Slovensku ani v iných krajinách strednej a východnej Európy nie sú k dispozícii podobné zoznamy, ktoré by zohľadňovali regionálne osobitosti preskripcie a dostupnosť registrovaných farmák v príslušnej krajine. Nežiaduce účinky (NÚ), ktoré patrili k príčinám hospitalizácie, boli dokumentované u 47 (7,8%) z 600 pacientov hodnoteného súboru (tabuľka 2). NÚ pád, hypotenzia počet 10 poruchy srdcového rytmu 9 hyperkaliémia 8 krvácanie alergia 7 4 GIT ťažkosti 4 hepatotoxicita extrapyramídový syndróm kašeľ rozkolísaný DM 2 1 lieková skupina / liek ACEI β-blokátory Ca-antagonisty digoxín β-blokátory Ca-antagonisty amiodaron ACEI ACEI + K-šetriace diuretikum (spironolaktón) K-šetriace diuretikum (amilorid) warfarín NSA ATB NSA prokinetiká opioidy statín atypické antipsychotikum 1 1 ACEI kortikosteroidy počet 5 3 2 3 3 2 1 5 2 1 7 2 2 2 1 1 2 1 1 1 Tab. 2. Nežiaduce účinky vedúce k hospitalizácii a liečivá, ktoré boli dané do kauzálneho vzťahu s NÚ. Vysvetlivky: hodnoty vyjadrujú frekvenciu výskytu; NÚ – nežiaduci účinok; ACEI – inhibítory angiotenzín-konvertujúceho enzýmu; K-šetriace diuretikum – kálium šetriace diuretikum; Caantagonisty – blokátory vápnikových kanálov; NSA – nesteroidové antiflogistiká; ATB – antibiotiká; GIT ťažkosti – gastrointestinálne NÚ (zhoršenie vredovej choroby žalúdka a dvanástnika, hnačka, zápcha); DM – diabetes mellitus. 146 Najčastejšie boli zaznamenané kardiovaskulárne komplikácie farmakoterapie: pád spôsobený poklesom krvného tlaku pri antihypertenznej liečbe a poruchy srdcového rytmu. Frekvenciu výskytu týchto NÚ možno vysvetliť vysokou prevalenciou kardiovaskulárnych ochorení u starších pacientov nášho súboru. Krvácanie ako NÚ vedúci k hospitalizácii bolo v našom súbore dané do kauzálnej súvislosti s warfarínovou terapiou u 7 pacientov. V niektorých podobných štúdiách predstavovalo krvácanie spôsobené antikoagulačnou liečbou najčastejší NÚ, ktorý bol príčinou hospitalizácie (Gurwitz a kol., 2000; van der Hooft a kol., 2006). Relatívne nižší výskyt takýchto NÚ v našej štúdii možno vysvetliť určitou opatrnosťou v preskripcii warfarínu u starších ľudí. Prevažná väčšina NÚ - 43 (91%) zo 47 pacientov boli A-typu, ktoré sú dávkovo závislé a preventabilné. Iba v 4 prípadoch alergických reakcií išlo o B-typ NÚ. Závery Z výsledkov práce vyplýva potreba väčšej pozornosti odbornej lekárskej verejnosti ku špecifikám farmakoterapie staršieho pacienta. Problematika potenciálne nevhodných liečiv u pacientov vo veku ≥65 rokov nie je zatiaľ na Slovensku dostatočne propagovaná. Pre hodnotenie kvality preskripcie v slovenských podmienkach by bolo užitočné vytvoriť zoznamy potenciálne nevhodných liečiv, ktoré by zohľadňovali osobitosti domácej preskripcie. Snahy regulačných orgánov o šetrenie nákladov na lieky by nemali viesť k poklesu kvality farmakologickej liečby a následne k zníženiu kvality života starších ľudí. Preferencia lacnejších terapeutických alternatív môže viesť k manifestácii NÚ, ktorých liečba zvyšuje náklady na zdravotnícku starostlivosť. Prevaha A-typu NÚ v hodnotenom súbore poukazuje na možnosť prevencie väčšiny NÚ u starších ľudí. Hlavným nástrojom prevencie NÚ je pravidelné prehodnocovanie farmakoterapie, rešpektovanie osobitostí individuálneho chorého a zohľadňovanie rizika liekov. Poďakovanie Ďakujeme riaditeľovi Nemocnice s poliklinikou v Považskej Bystrici MUDr. Petrovi Krutému za umožnenie štúdie. Práca bola podporená grantom VEGA 0314 a Európskym Sociálnym Fondom. Použitá literatúra 1. Bartošovič, I., Krajčík, Š., Hegyi, L.: Farmakoterapia v zariadeniach sociálnych služieb pre starých ľudí. Prakt Lek. 83(6): 340–343, 2003. 2. Bressler, R., Bahl, J.J.: Principles of drug therapy for the elderly patient. Mayo Clin Proc. 78(12): 1564–1577, 2003. 3. Col, N., Fanale, J.E., Kronholm, P.: The role of medication non-compliance and adverse drug reactions in hospitalizations of the elderly. Arch Intern Med. 150(4): 841–845, 1990. 4. Fialova, D., Topinkova, E., Gambassi, G. et al.: Potentially inappropriate medication use among elderly home care patients in Europe. JAMA. 293(11): 1348–1358, 2005. 5. Fick, D.M., Cooper, J.W., Wade, W.E. et al.: Updating the Beers criteria for potentially inappropriate medication use in older adults. Arch Intern Med. 163(27): 2716–2724, 2003. 6. Foltán, V., Tesař, T. (Eds).: Lieky. Lieková politika. Farmakoekonomika. Bratislava: Propact, 186, 2003. 7. Gurwitz, J.H., Field, T.S., Avorn, J. et al.: Incidence and preventability of adverse drug events in nursing homes. Am J Med. 109(2): 87–94, 2000. 8. Hegyi, L., Krajčík, Š.: Priority farmakoterapie vo vyššom veku. Geriatria. 8(3): 101–113, 2002. 9. Hoven, J.L., et al.: Indicators of prescribing quality in drug utilisation research: report of a European meeting (DURQUIM, 13-15 May 2004) Eur J Clin Pharmacol. 60(11): 831–834, 2005. 10. Lawrence, M., Olesen, F.: Indicators of quality of health care. Eur J Gen Pract. 3: 103–108, 1997. 11. Lindley, C.M., Tully, M.P., Paramsothy, V., Tallis, R.C.: Inappropriate medication is a major cause of adverse drug reactions in elderly patients. Age Ageing. 21 (4): 294–300, 1992. 12. Onder, G., Landi, F., Liperoti, R. et al.: Impact of inappropriate drug use among hospitalized older adults. Eur J Clin Pharmacol. 61(5): 453–459, 2005. 13. Rawlins, M.D., Thompson, J.W.: Mechanisms of adverse drug reactions. In Davies DM (Ed). Textbook of adverse drug reactions. 3rd ed. Oxford; Oxford University Press, 12–38, 1985. 14. van der Hooft, C.S., Sturkenboom, M.C.J, van Grootheest, K. et al.: Adverse drug reaction-related hospitalisations: A nationwide study in the Netherlands. Drug Saf. 29(2): 161–168, 2006. 15. Wawruch M, Zikavska M, Wsolova L, Kuzelova M, Tisonova J, Gajdosik J, Urbanek K, Kristova V. Polypharmacy in elderly hospitalised patients in Slovakia. Pharm World Sci. In press, 2007. 16. Wawruch, M., Zikavska, M., Wsolova, L. et al.: Perception of potentially inappropriate medication in elderly patients by Slovak physicians. Pharmacoepidemiol Drug Saf. 15(11): 829–834, 2006. 17. Zdravotnícka ročenka Slovenskej republiky 2004. Veková štruktúra obyvateľstva. 147 Posttranscriptional regulation of the Inhibitor of Apoptosis protein cIAP1 during cellular stress Tong T. Zhao, Stephen M. Lewis, Martin Holčík Apoptosis Research Centre, Children’s Hospital of Eastern Ontario, 401 Smyth Road, Ottawa, K1H 8L1 Canada Abstract Apoptosis is a physiological process characteristic of pluricellular organisms leading to self-destruction of the cell. One of the hallmarks of apoptosis is the activation of caspases that in turn cleave cellular substrates, leading to an orderly disassembly of the cell. A family of intrinsic cellular inhibitor of Apoptosis proteins mediates competitive inhibition of caspase activity. We report here that UV irradiation leads to downregulation of cIAP1 expression that is due to mRNA destabilization. Four AU-rich elements are located within the 3’untranslated region of cIAP1 mRNA and are sufficient to mediate cIAP1 mRNA instability during UV stress. Furthermore, we have identified hnRNPA1 as one of the cIAP1 3’UTR ARE binding proteins. HnRNP A1 is primarily nuclear protein but becomes relocalized into cytoplasm after exposure of cells to UVC. In addition, hnRNP A1 destabilizes cIAP1 mRNA under normal growth conditions and during UVC stress. Finally, siRNA-mediated knockdown of hnRNP A1 attenuates the UVC–induced apoptosis suggesting that hnRNP A1 is an essential posttranscriptional modulator of cIAP1 expression and cell death. Introduction Apoptosis plays an important role in the maintenance of cellular homeostasis and is typified by activation of a family of evolutionarily conserved intracellular cysteine proteases, known as caspases. Caspases are functionally connected to each other, with initiator caspases cleaving and activating effector caspases in a hierarchical manner (1). Controlling the caspase activity is critical for the survival of cells and one of the mechanisms that is used to neutralize caspase activity is facilitated by a family of proteins called the IAPs (Inhibitor of Apoptosis proteins) which are capable of directly binding distinct caspases and inhibiting their proteolytic activity (2). In addition, the function of the IAPs is not restricted to caspase inhibition, but also includes regulation of the cell cycle, signal transduction, and protein degradation (3). Given the critical role the IAPs play in the regulation of apoptosis, their expression is tightly controlled. This is achieved at different levels of gene expression. For example, cIAP2 is regulated transcriptionally via the NF-κB regulatory network (4). In contrast, the expression of XIAP is regulated translationally through an internal ribosome entry site (IRES) element (5). Similarly, expression of cIAP1 is also controlled at the level of translation. There is a short regulatory upstream open reading frame (uORF) located in the 5’UTR of cIAP1 that exerts an inhibitory effect on the translation of cIAP1 (6). Furthermore, cIAP1 also contains an inducible IRES element. During endoplasmic reticulum (ER) stress, cIAP1 is translationally upregulated to delay the onset of ER stress induced cell death (7). In this work we describe an additional control mechanism that regulates cIAP1 expression by modulating cIAP1 mRNA stability in response to UV irradiation. We find that there are four AU-rich elements (AREs) located within the 3’UTR of cIAP1 mRNA that are sufficient to mediate cIAP1 mRNA instability during UV irradiation. In addition, hnRNP A1 binds to the AREs in the 3’UTR of cIAP1 in a sequence specific manner. Importantly, following UV irradiation the hnRNP A1 relocalizes from nucleus to the cytoplasm where it destabilizes cIAP1 mRNA. Taken together, these results suggest that hnRNP A1 is an essential posttranscriptional modulator of cIAP1 expression. Materials and methods Human embryonic kidney cells (HEK293) were cultured in standard conditions as described (8). Transient transfections were performed using LipofectAMINE PLUS according to the protocol provided by the manufacturer (Invitrogen). Cells were collected for analysis 24 h after transfection. siRNA transfections were performed using Lipofectamine 2000 according to the protocol provided by the manufacturer (Invitrogen). Cells were collected for analysis 48 h after transfection. In the case of 148 co-transfection, 0.5µg/well of plasmid DNA was co-transfected at the same time as siRNA. UVC irradiation experiments were performed as described (9). For the cycloheximide (CHX) experiments, cells were treated with UVC (150mW/cm2) and 25µg/ml of CHX was added, cells were harvested at 0, 8, 24, 32, 48 hr point after addition of CHX. For the Actinomycin D experiments, cells were treated with UVC (150mW/cm2), 10µg/ml of Act D was added and cells harvested at 0, 1, 2, 4, 8 hr time points. For cells transfected with an siRNA, they were treated with UVC (150mW/cm2) 48 hours post siRNA transfection. Five hours later, cells were harvested as described above. Western blot analysis was performed using standard conditions and as described (8). Antibody complexes were detected by direct infrared fluorescence by Odyssey infrared imaging system (LiCOR). Isolation of RNA and quantitative RT-PCR analysis was performed using the QuantiTect SYBR Green PCR kit according to the protocol provided by the manufacturer (Qiagen). The PCR reactions were analyzed on an ABI Prism 7000 detection system using the ABI Prism 7000 SDS software. Quantitative PCR reactions were carried out to detect Ct values of NEO, CAT, cIAP1 and GAPDH genes. Data was analyzed using Microsoft Excel and is presented as 2-CT (cIAP1-GAPDH) and 2-CT (CAT-NEO). In the Actinomycin D experiment, 2-CT (cIAP1-GAPDH) normalized to 0hr CT values (2-∆∆CT) calculation was used. RNA-affinity chromatography, GST-fusion purification and UV-crosslinking of RNA-protein complexes was performed essentially as described (8). Cell viability was determined using the Vi-Cell cell viability analyzer (Beckman Coulter). All data are expressed as mean +/- SD values. Statistical significance was assessed by two tailed t test or one-way ANOVA (comparison of more than two groups). If not otherwise stated, all experiments reported here represent at least three independent replications performed in triplicate. Results and discussion We observed that UV irradiation (150mW/cm2) induced more than a four fold decrease in cIAP1 protein levels (A) without having any appreciable effect on the protein stability (not shown) suggesting that posttranscriptional regulation is involved. Indeed, we observed that following UV irradiation there was a marked difference in the steady-state levels of cIAP1 mRNA (B). To determine if the stability of cIAP1 mRNA is altered following UV irradiation we treated cells with transcription inhibitor Actinomycin D and determined the half-life of cIAP1 mRNA in treated and untreated cells. UV irradiation resulted in approximately 40 % decrease in the half life of cIAP1 mRNA (C). These findings suggest that the UV irradiation-induced down-regulation of cIAP1 is due at least in part to decreased mRNA stability. 3’ UTR is often involved in the regulation of mRNA stability. Analysis of the 3’UTR of cIAP1 revealed that it contains multiple putative AU-rich elements (AREs), including at least three AUUUA motifs, which might regulate mRNA stability. Thus, it was reasonable to propose that cIAP1 mRNA instability may be due to the presence of AREs in the 3’UTR. To test this hypothesis, the full length 3’UTR was cloned into the reporter plasmid downstream of the CAT coding region. In addition, a 100nt fragment containing the four AREs of the cIAP1 3’UTR was also inserted downstream of the CAT coding region, while the 3’ UTR of TNFα that is known to contain functional ARE was used as a positive control (D, top). The expression of the reporter gene was normalized to that of Neomycin that is expressed from the same plasmid but driven by an independent promoter. We observed that the presence of either the full length 3’ UTR or just the ARE-containing region significantly decreased steady state levels of CAT mRNA suggesting that the 3’UTR of cIAP1 can confer instability of a reporter mRNA and the four AREs within the 100bp fragment are sufficient to recapitulate this effect (D). Since specific trans-acting factors (AUBPs) often bind to AREs and thereby control its stability we sought to isolate these factors and identified hnRNP A1 as cIAP1 3’ UTR biding protein (E). Importantly, the binding of hnRNP A1 to cIAP1 3’ UTR is specific since other known RNA binding proteins TIAR, TIA-1, and hnRNP C1/2 were not detected (E). Furthermore, the binding of hnRNP A1 is sequence specific as mutation of the cIAP1 ARE abrogated both the binding of purified hnRNP A1 (F, top) as well as restored the stability of reporter mRNA (F, bottom). hnRNP A1 is primarily localized in the nucleus of mammalian cells. However, it has been reported that following UV irradiation hnRNP A1 relocalizes from nucleus into cytoplasm (10). Indeed, we confirmed that hnRNP A1 accumulates in the cytoplasm following UV irradiation of HEK293T cells (not shown). We further reasoned that targeted downregulation of hnRNP A1 should lead to stabilization of cIAP1 mRNA, increased levels of cIAP1 protein and subsequent increase in the sensitivity of cells to UV irradiation. Indeed, siRNA-mediated downregulation of hnRNP A1 markedly 149 elevated levels of cIAP1 protein (G) and steady-state levels of cIAP1 mRNA (H). More importantly, siRNA-mediated downregulation of hnRNP A1 resulted in enhanced survival of HEK293T cells in response to UV irradiation while the downregulation of cIAP1 resulted in increased sensitivity to UV irradiation (I). Conclusions UV light is a common type of environmental stress that causes DNA damage and induces apoptosis in mammalian cells through the mitochondrial branch of apoptotic pathway. UV irradiation results in the modulation of expression of multiple genes that encode proteins involved in the repair of DNA damage, regulation of cell cycle progression, and regulation of apoptosis. While the transcriptional regulation upon UV irradiation has been extensively studied it cannot account for the changes in the expression of all genes. We have identified a novel regulatory mechanism that controls the expression of cIAP1, a potent modulator of apoptosis. The results presented here provide evidence for hnRNP A1 being an important player in the post-transcriptional regulation of cIAP1 expression. cIAP1 has been linked with several common malignancies including lung, ovarian, esophageal, and liver carcinoma. This suggests that overall contribution of cIAP1 to human cancers may be substantial, and the regulation of the expression of this gene should be closely examined. Acknowledgements We thank members of the Apoptosis Research Centre for helpful discussions and critical comments. This work was supported by a grant from the National Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). 150 References 1. Richter, B.W., Duckett, C.S.: The IAP proteins: caspase inhibitors and beyond. Sci STKE. PE1, 2000. 2. Holcik, M., Gibson, H., Korneluk, R.G.: XIAP: Apoptotic brake and promising therapeutic target. Apoptosis. 6: 253–261, 2001. 3. Liston, P., Fong, W.G., Korneluk, R.G.: The inhibitors of apoptosis: there is more to life than Bcl2. Oncogene. 22: 8568–8580, 2003. 4. Chu, Z.L., McKinsey, T.A., Liu, L., Gentry, J.J., Malim, M.H., Ballard, D.W.: Suppression of tumor necrosis factor-induced cell death by inhibitor of apoptosis c-IAP2 is under NF-kappaB control. Proc Natl Acad Sci USA. 94: 10057–10062, 1997. 5. Holcik, M., Lefebvre, C.A., Yeh, C., Chow, T., Korneluk, R.G.: A new internal-ribosome-entry-site motif potentiates XIAP-mediated cytoprotection. Nature Cell Biol. 1: 190–192, 1999. 6. Warnakulasuriyarachchi, D., Ungureanu, N.H., Holcik, M.: The translation of an antiapoptotic protein HIAP2 is regulated by an upstream open reading frame. Cell Death Differ. 10: 899–904, 2003. 7. Warnakulasuriyarachchi, D., Cerquozzi, S., Cheung, H.H., Holcik, M.: Translational induction of the inhibitor of apoptosis protein HIAP2 during endoplasmic reticulum stress attenuates cell death and is mediated via an inducible internal ribosome entry site element. J Biol Chem. 279: 17148–17157, 2004. 8. Lewis, S.M., Veyrier, A., Hosszu Ungureanu, N., Bonnal, S., Vagner, S., Holcik, M.: Subcellular relocalization of a trans-acting factor regulates XIAP IRES-dependent. Translation Mol Biol Cell. 18: 1302– 1311, 2007. 9. Ungureanu, N.H., Cloutier, M., Lewis, S.M., de Silva, N., Blais, J.D., Bell, J.C., Holcik, M.: Internal ribosome entry site-mediated translation of Apaf-1, but not XIAP, is regulated during UV-induced cell death. J Biol Chem. 281: 15155–15163, 2006. 10. van der Houven van Oordt, W., Diaz-Meco, M.T., Lozano, J., Krainer, A.R., Moscat, J., Caceres, J.F.: The MKK(3/6)-p38-signaling cascade alters the subcellular distribution of hnRNP A1 and modulates alternative splicing regulation. J Cell Biol. 149: 307–316, 2000. 151
© Copyright 2024