Diversidad del elemento transponible Galileo en especies de Drosophila (Diptera, Drosophilidae) del grupo repleta Trabajo de investigación del Master en Genética Avanzada Curso 2009-2010 Andrea Acurio Director: Dr. Alfredo Ruiz Co-director: Dr. Deodoro C. S. G. Oliveira Facultad de Biociencias Departamento de Genética y Microbiología ________________ ________________ Lic. Andrea Acurio Dr. Alfredo Ruiz __________________ Dr. Deodoro C.S.G. Oliveira 1 Resumen Los elementos transponibles (TE) constituyen una porción importante del genoma de practicamente todos los organismos vivientes, son poderosos facilitadores de evolución genómica e influyen en la diversidad fenotípica. El elemento transponible Galileo, descubierto en Drosophila buzzatii, es miembro de la superfamilia P de transposones de DNA. Este TE ha demostrado tener un papel causal en la generación de inversiones en poblaciones naturales de Drosophila y su presencia en 6 de las 12 especies secuenciadas de Drosophila sugiere una contribución importante a la evolución de estos dípteros. Las copias de Galileo encontradas en el genoma de D. mojavensis fueron clasificadas en cuatro grupos o subfamilias denominadas C, D, E y F. Drosophila buzzatii y D. mojavensis pertenecen al grupo de especies repleta, endémico de regiones áridas y semiáridas del continente americano. Este grupo de especies representa un excelente modelo biológico para los estudios de evolución debido a su alta diversidad, cerca de 100 especies descritas. Para estudiar la distribución y diversidad del elemento transponible Galileo en el grupo repleta se realizó un muestreo representativo de los subrupos de especie hydei, mercatorum, mulleri y repleta. Se analizaron 98 muestras de 49 especies del grupo repleta, 4 del grupo nannoptera y 1 del grupo virilis. Mediante PCR se amplificaron las secuencias de la transposasa de Galileo, que luego fueron clonadas y secuenciadas. La amplificación fue positiva para 51 muestras de 16 especies de Drosophila del grupo repleta. Con estos datos se construyó una filogenia que se comparó con la filogenia de las especies. Los datos obtenidos extienden la distribución de Galileo dentro del grupo repleta y sugieren una diversificación vertical dentro del linaje de repleta. 2 Página I. INTRODUCCIÓN 1. Los elementos transponibles 4 2. El elemento transponible Galileo 5 3. El grupo de especies repleta 7 4. Objetivos 8 II. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Obtención de muestras 9 2. Diseño de cebadores 12 3. Extracción de DNA genómico 13 4. Reacción en cadena de la polimerasa 14 5. Visualización del fragmento obtenido 15 6. Clonación del producto de PCR 15 7. Análisis de las secuencias amplificadas 17 8. Construcción de la filogenia 18 III. RESULTADOS 1. Amplificación por PCR de las copias de Galileo 20 2. Identidad de las secuencias amplificadas 26 3. Relaciones filogenéticas 32 IV. DISCUSIÓN 1. Galileo en el grupo de especies repleta 34 2. Dinámica de Galileo en el grupo repleta 36 3. La transposasa de Galileo 37 4. Inserciones encontradas en Galileo 38 V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 39 VI. BIBLIOGRAFÍA 40 VII. AGRADECIMIENTOS 45 3 I. INTRODUCCIÓN 1. Los elementos transponibles Los elementos transponibles (TE, transposable elements) representan un componente importante en el genoma de casi todos los organismos. La proporción de TE en el genoma varía desde un 4% en la levadura Saccharomyces cerevisiae a más del 70% en algunas plantas y anfibios. En el genoma humano la proporción de TE es del 45% (Venner et al. 2009). Se considera que por disfunción génica o pérdida de regulación, los TE son responsables de alrededor del 1% de enfermedades humanas (Kazazian 1998). Los TE son capaces de movilizarse dentro del genoma del hospedador y pueden insertarse en genes o elementos reguladores, alterar la función de un gen o inducir reordenaciones cromosomicas (Venner et al. 2009). La mayoría de inserciones de TE son detrimentales, otras son selectivamente neutrales y unas pocas pueden ser beneficiosas debido a su capacidad mutagénica, pudiendo contribuir así a la diversidad del genoma hospedador. En algunos casos los TE han sido "domesticados" actuando como genes o elementos reguladores de genes por lo que constituyen un recurso de innovación génica para el organismo (Medstrand et al. 2005, Brandt et al. 2005). En base a su mecanismo de transposición, los TE pueden ser divididos en dos clases: La clase I comprende retrotransposones que se mobilizan a través de mecanismos mediados por RNA (Berg 1989) y los de clase II que se movilizan a través de mecanismos mediados por DNA y se multiplican usando la maquinaria de replicación de la célula hospedadora (McDonald 1993). Dependiendo de su habilidad 4 para dirigir su transposición, cada clase de TE puede contener dos tipos de copias: autónomas y no autónomas. Los elementos autónomos tienen marcos abiertos de lectura (ORF, open reading frames) que codifican las proteínas requeridas para la transposición en el genoma del hospedador. En contraste los elementos no autónomos no codifican proteínas de tranposición pero pueden transponerse utilizando la maquinaria de las copias autónomas. La integración de casi todos los TE da como resultado la duplicación de una secuencia genómica corta del sitio diana (TSD, target site duplications) en el sitio de inserción. Los tranposones de DNA usualmente tienen una estructura simple con repeticiones terminales invertidas (TIR, terminal inverted repeats) que flanquean un sólo gen que codifica la tranposasa. La transposasa se acopla de manera específica a los extremos de su elemento codificante (elemento autónomo) y a los extremos de los miembros de las familias no autónomas (Wessler 2006). Una vez acoplado la transposasa inicia la reacción de corta y pega en donde el elemento es escindindo del sitio donante (generando un espacio vacío) y se inserta en un nuevo sitio del genoma. Uno de los rasgos más sobresalientes de los TE es su capacidad de atravesar los límites entre especies e insertarse en nuevos genomas. El proceso conocido como Transferencia Horizontal (TH) se define por la transferencia de material genético entre especies. La TH ha sido propuesta como un paso escencial en el ciclo de vida de los transposones de DNA (Silva et al. 2004). 2. El elemento transponible Galileo Galileo fue descubierto en Drosophila buzzatii, en donde se caracterizaron copias no autónomas y se clasificó a este elemento como tipo foldback debido a sus largas TIR 5 (Cáceres et al. 2001, Casals et al. 2003). En un estudio posterior (Casals et al. 2005), copias de Galileo fueron detectadas en varias especies del complejo buzzatii, aunque no en especies más alejadas como D. mulleri o D. repleta. Más adelante Marzo et al. (2008) caracterizaron copias completas o casi completas de Galileo en D. buzzatii y en el genoma de otras 6 especies de Drosophila secuenciadas, D. ananassae, D. willistoni, D. pseudoobscura, D. persimilis, D. virilis y D. mojavensis (Figura 1). Las copias de Galileo obtenidas tenían una longitud de 4,4 a 6 kb y codificaban una transposasa de 889-938 aa. En base a la identidad aminoacídica de la transposasa con la de los elementos P y 1360 de D. melanogaster, Galileo fue re-clasificado como miembro de la superfamilia P de transposones de DNA que se transpone mediante un mecanismo de tipo corta-y-pega. Según Marzo et al. (2008), Galileo está (o ha estado recientemente) activo en el genoma de D. buzzatii y también en otras especies del género Drosophila, su más reciente evento de transposición fue estimado en alrededor de 0.2 millones de años. Figura 1. Galileo en Drosophila. A. Copia de Galileo en el genoma de D.buzzatii. B. Copias más largas encontradas en los genomas de 6 especies secuenciadas. Tomado y modificado de Marzo et al. (2008). 6 Las copias de Galileo encontradas en el genoma de D. mojavensis fueron clasificadas, en base a la identidad de las secuencias de los TIR, en cuatro grupos o subfamilias, C, D, E y F. La divergencia promedio entre las copias dentro de los grupos C-F fue estimada en 2,2%, 2,3%, 2,4% y 8,9%, respectivamente, indicando un tiempo de diversificación de 1,4 a 5,5 millones de años para las subfamilias (Marzo et al. 2008). Se conoce que Galileo está implicado en la generación de al menos tres inversiones polimórficas en poblaciones de D. buzzatii mediante recombinación ectópica (Cáceres et al. 2001, Casals et al. 2003, Delprat et al. 2009). Además Galileo ha sido encontrado en el genoma de otras especies de Drosophila que son polimórficas para inversiones cromosómicas, entre ellas están las más polimórficas de todo el género (D. willistoni y D. persimilis). Esta observación abre la posibilidad de que Galileo esté implicado en la generación de inversiones cromosómicas en otras especies del género Drosophila. 3. El grupo de especies repleta de Drosophila El género Drosophila representa un importante organismo modelo no sólo para entender la evolución genómica sino también para investigaciones experimentales comparativas, debido a que tiene una filogenia bien establecida y extensa literatura en Genética, Etología y Ecología. El grupo de especies repleta, endémico de regiones áridas y semiáridas de Norte y Sudamérica, es uno de los grupos más extensos y complejos dentro del género Drosophila, con más de 100 especies (Bächli 2010). Está dividido en seis subgrupos, fasciola, inca, hydei, mercatorum, mulleri y repleta, en base a inversiones cromosómicas y caracteres morfológicos (Wasserman 1960, 1982, 1992, Vilela 1983, Rafael & Arcos 1989). 7 El grupo repleta utiliza una amplia variedad de nichos ecológicos que van desde una alta especificidad, como ciertas especies del subgrupo mulleri que utilizan tejidos de cactus necrotizados como único sitio de oviposición y cortejo, hasta especies más generalistas de los subgrupos hydei, mercatorum y repleta (Markow & O’Grady 2006). 4. Objetivos El objetivo principal de esta investigación es conocer la distribución y la dinámica evolutiva del elemento transponible Galileo dentro de las especies de Drosophila del grupo repleta. Los objetivos específicos son: 1. Determinar en que especies de Drosophila del grupo repleta se encuentra Galileo para conocer mejor su distribución. 2. Construir una filogenia con las copias de Galileo que pudiesen encontrarse en el genoma de las especies del grupo repleta para inferir su historia evolutiva. 3. Comparar la filogenia obtenida con la filogenia de las especies del grupo repleta con la finalidad de detectar posibles casos de transferencia horizontal. 8 II. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Obtención de muestras Se trató de incluir el mayor número de especies posibles para obtener una muestra representativa del grupo de especies repleta. Se analizaron 92 muestras de los subgrupos mulleri, hydei, mercatorum y repleta. Además se incluyeron 5 muestras del grupo nannoptera que comparte el nicho ecológico con especies cactófilas del grupo repleta y 1 muestra del grupo virilis, el grupo filogenéticamente más cercano a repleta. En total se analizaron 98 muestras de 49 especies (Tabla 1). La obtención de las muestras se realizó mediante colectas, donaciones y algunas fueron cepas de stock centers. Los especímenes de localidades ecuatorianas, se colectaron con trampas plásticas y cebo de Opuntia ficus-indica con levadura de cerveza Saccharomyces cerevisiae. La identificación taxonómica de estas muestras se realizó mediante caracteres morfológicos externos y el análisis de la genitalia de los machos (Figura 2). Figura 2. Caracteres morfológicos utilizados para la identificación taxonómica: a. último segmento abdominal, b. arco genital y edeago, c. ovipositor y espermatecas, d. palpo labial, e. número de ramas de la arista, f. peine sexual, g. venación alar, h. patrón de coloración del torax, i. patron de coloración del abdomen. 9 Tabla1. Datos de colección disponibles de las especies utilizadas en este estudio. Código GAL001 GAL002 GAL003 GAL005 GAL007 GAL008 GAL009 GAL010 GAL011 GAL012 GAL015 GAL016 GAL018 GAL019 GAL020 GAL021 GAL023 GAL024 GAL025 GAL026 GAL027 GAL028 GAL029 GAL030 GAL031 GAL032 GAL033 GAL034 GAL035 GAL036 GAL037 GAL038 GAL039 GAL040 GAL041 GAL042 GAL043 GAL044 Especie D. aldrichi D. arizonae D. arizonae D. koepferae D. martensis D. mercatorum D. mojavensis D. mulleri D. mayaguana D. buzzatii D. stalkeri D. starmeri D. uniseta D. virilis D. venezolana D. wheeleri D. mojavensis D. arizonae D. wheeleri D. arizonae D. wheeleri D. arizonae D. arizonae D. navojoa D. mojavensis D. aldrichi D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. aldrichi D. mojavensis D. mettleri D. mercatorum D. anceps D. borborema D. fulvimacula D. longicornis D. hydei Localidad/Pais Zuata/Venezuela Tomatlan /Méjico Punta Onah/Méjico Cébila/Argentina Guaca/Venezoela Comarada/Bolivia Punta Onah/Méjico Panuco/Méjico Port Henderson/Jamaica España St. Petersburg/U.S.A. Rio Hacha/Colombia Salamanca/Colombia ― Los Roques/Venezuela Ejido Uruapan/Méjico Catalina I./U.S.A. Punta Onah/Méjico Punta Onah/Méjico San Quintin/Méjico Catalina Island/U.S.A. Tomatlan/Méjico Vaquerias/Méjico Chamela/Méjico Santiago/Méjico Hatulco//Méjico Punta Onah/Méjico Punta Onah/Méjico San Quintin/Méjico Zapilote/Méjico Providence M./U.S.A. Sonora/Méjico Tucson/U.S.A. Michoacan /Méjico Bahia/Brasil Veracruz/Méjico Tucson/U.S.A. Sonora/Méjico Colector/ Año Fontdevila/1980 Heed/1981 Heed/1981 Fontdevila et al. /1981 Cerda/1984 Fontdevila et al./1982 Heed/1981 Richardson/1998 Thomas et al./ 1983 Bowling G. Stock C/1990 Ordoñez/1996 Ordoñez/1990 UMEA Stock C. Cerda/1984 Heed et al. /1979 2002 Etges et al./ 2007 Etges et al./ 2007 Etges et al./ 2008 Counteman/2004 Heed/1982 Etges et al./ 1997 Etges et al./ 1997 Etges et al./ 1996 Etges et al./ 2002 Etges et al./ 2007 Armella et al./ 1996 Etges et al./ 2008 Etges et al./ 1998 Etges et al./ 1996 Dros. Stock Center/1996 Dros. Stock Center/2005 Dros. Stock Center/1998 Dros. Stock Center/1974 Dros. Stock Center/2002 Dros. Stock Center/2001 Dros. Stock Center/2006 10 GAL045 GAL046 GAL047 GAL052 GAL053 GAL054 GAL055 GAL056 GAL057 GAL058 GAL059 GAL082 GAL083 GAL084 GAL085 GAL086 GAL088 GAL089 GAL090 GAL091 GAL092 GAL093 GAL094 GAL095 GAL096 GAL097 GAL098 GAL099 GAL100 GAL101 GAL102 GAL103 GAL104 GAL105 GAL106 GAL107 GAL108 GAL109 GAL110 GAL111 GAL116 GAL117 GAL118 D. richardsoni D. straubae D. ritae D. hamatofila D. hexastigma D. paranaensis D. peninsularis D. meridiana D. neorepleta D. mercatorum D. mercatorum D. pachea D. pachea D. nigrospiracula D. eremophila D. navojoa D. huckinsi D. spenceri D. mojavensis D. mojavensis D. hydei D. hydei D. hydei D. arizonae D. arizonae D. mojavensis D. mojavensis D. aldrichi D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. eremophila D. pegasa D. fulvimacula TortolaIsland Sigus Beach/Cuba Puebla/Méjico Superstition /U.S.A. Puebla/Méjico Chiapas/Méjico Bath/Jamaica Canal Zone/Panama Jalisco/Méjico Palmira /Colombia Campo Grande/Brasil Las Bocas/Méjico Punta Onah/Méjico Las Bocas/Méjico Las Bocas/Méjico Las Bocas/Méjico Las Bocas/Méjico Las Bocas/Méjico Punta Onah/Méjico El Choyudo/Méjico Las Bocas/Méjico Punta Onah/Méjico El Choyudo/Méjico Las Bocas/Méjico El Choyudo/Méjico Las Bocas/Méjico Punta Onah/Méjico Las Bocas/Méjico Guaritas/Brasil Trinkey/Australia Mazán/Argentina Wari/Peru Quilmes/Argentina Ticucho/Argentina Otamendi/Argentina Carboneras/España Carboneras/España Sardinia/Italia Carboneras/España Carboneras/España Punta Tecolote/Méjico Zapotitlan/Méjico Los Tuxtlas/Méjico Dros. Stock Center Dros. Stock Center Dros. Stock Center/1991 Dros. Stock Center/2005 Dros. Stock Center/1997 Dros. Stock Center/2002 Dros. Stock Center/1957 Dros. Stock Center/1958 Dros. Stock Center/2004 Dros. Stock Center Dros. Stock Center Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 1995 Barker/1977 Ruiz et al. /1982 Fontdevila/1980 Ruiz et al. /1982 Hasson /1986 Ruiz et al. /1982 Fontdevila et al. /1981 Fontdevila et al. /1981 Gompel/ 2006 Fontdevila et al. /1981 Fontdevila et al. /1981 Etges/2000 Etges/2002 Etges/2001 11 GAL119 GAL120 GAL121 GAL122 GAL123 GAL124 GAL125 GAL126 GAL127 GAL128 GAL129 GAL130 GAL131 GAL135 GAL137 GAL138 GAL139 TOTAL D. desertorum D. spenceri D. huichole D. bifurca D. leonis D. mainlandi D. hexastigma D. nigricruria D. mettleri D. acanthoptera D. wassermani D. nannoptera D. racemova D. aldrichi D. nigrohydei D. guayllabambae D. longicornis 49 especies Big Bend NP/U.S.A. Infiernillo/Méjico Zapotitlan/Méjico Punta/Méjico Ixtlan del Rio/Méjico Catalina Island/U.S.A. Zapotitlan/Méjico Las Bocas/Méjico El Choyudo/Méjico Huatulco/Méjico Infiernillo/Méjico Joluxtla/Méjico El Tecolo/Méjico Punta Onah/Méjico Nayón/Ecuador Nayón /Ecuador Guayllabamba/Ecuador 98 muestras Etges/2005 Etges/1998 Etges/2002 Etges/2000 Etges/2000 Counteman/2004 Etges/2000 Ruiz et al./ 2009 Ruiz et al./ 2009 Etges/2002 Etges/1998 Etges/2000 Etges/2000 Ruiz et al./ 2009 Acurio et al. 2009 Acurio et al. 2009 Acurio et al. 2009 2. Diseño de cebadores Los cebadores, que se denominaron G5 y G6 fueron diseñados a partir del alineamiento de las secuencias más conservadas de la transposasa en las subfamilias C y D de Galileo en D. mojavensis. Para esto, se utilizaron las copias casi completas de Galileo en el genoma de D. mojavensis reportadas por Marzo et al. (2008): la secuencia BK006357 localizada en el contig 10758.1 (Grupo C) y la secuencia BK006358 localizada en el contig 9930 (Grupo D). Se esperaba que estos cebadores amplifiquen un fragmento de alrededor de 450bp del ORF que codifica la transposasa (Figura 3, Tabla 2). 12 Figura 3. Esquema que denota la estructura de Galileo y el fragmento de interés. En rojo se muestran los cebadores utilizados. Tabla 2. Cebadores utilizados en este estudio. Primers G5 G6 Secuencia (5'-3') TGCACCGCATCTWGTWAAATCC Longitud (bp) 22 AAATAATCACGCATTTCCWGAAG 23 3. Extracción del DNA genómico La extracción del DNA genómico se realizó a partir de un solo individuo conservado en etanol. Se utilizó la técnica de extracción con Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio (CTAB). El espécimen fue homogenizado con una varilla estéril de polipropileno, a este homogenato se agregó 700 µl de buffer CTAB a 60°C y se incubó durante 1 hora a la misma temperatura. Se agregó 600 µl de cloroformo/isoamílico y se mezcló por 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó a 13.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 5 minutos y se recogió el sobrenadante al que se le agregó igual volumen de isopropanol frío y se mezcló por inmersión para la precipitación del DNA. Se recuperó el pellet centrifugando a 13.000 rpm durante 5 minutos y se descartó el líquido. El pellet obtenido se lavó con 300 µl de etanol al 70% y se centrifugó nuevamente a 13.000 rpm durante 5 minutos, se descartó el etanol y se 13 secó cuidadosamente el pellet al vacío. Finalmente se disolvió el pellet en 50 µl de agua MQ estéril. Para determinar la cantidad y la calidad del DNA extraído se realizaron dos reacciones de PCR con los cebadores correspondientes a los genes Cox I y Gapdh. Los productos de la amplificación se corrieron en un gel de agarosa al 0.7% y tinción de bromuro de etidio. 4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La preparación de la mezcla para la reacción de PCR fue realizada con las cantidades detalladas en la Tabla 3. Se utilizó la Taq Polimerasa de Roche Applied Science. Las condiciones utilizadas en el termociclador MJ Mini BIO-Rad® de BioRad Laboratories, Inc. fueron optimizadas para la secuencia de interés (Tabla 4). Tabla 3. Cantidades utilizadas en cada reacción de PCR. H2O Buffer 10X dNTPs 2mM Primer 5 10 mM Primer 6 10 mM Taq Pol. 5u/µl DNA Total Cantidades/reacción 22,2 µl 3 µl 0,6 µl 1 µl 1 µl 0,2 µl 2 µl 30 µl Tabla 4. Programa utilizado en el termiclador para la PCR. 35 ciclos Fase Denaturación inicial Temperatura 95 °C Tiempo 4 minutos Denaturación 95°C 30 segundos Anillamiento 53°C 30 segundos Extension 72°C 30 segundos Extensión final 72°C 7 minutos 14 5. Visualización del fragmento obtenido Se cargaron 10 µl del producto de PCR más 2µl de marcador de peso molecular (Ladder 1 Kb plus de INVITROGEN®) en un gel de agarosa con una concentración de 0,7%. Para la migración electroforética se utilizó Tampón TAE 1X (Tris Acético 40 mM y EDTA 1mM), el voltaje utilizado varió de 70-90 voltios de acuerdo a la extensión del gel. Para la tinción, los geles fueron sometidos a una solución de Bromuro de Etidio a una concentración 0,5 µg/ml y radiación ultravioleta. Fotografías de los geles fueron captadas utilizando el programa Alpha Digidoc RT©. El producto de PCR fue purificado con el kit NucleoSpin® Extract II de Clontech Laboratories, Inc. con tecnogía de columnas con membranas de silice. 6. Clonación del producto de PCR Para la clonación del fragmento de interés se siguieron los protocolos de: 1. El vector sintético pGEM Easy® de Promega 2. Kit Strataclone® de Stratagene 1. Para la reacción de ligación con el vector pGEM Easy ® se utilizó 5µl de T4 DNA ligasa, 1µl de pGEM vector (50 ng), 3 µl de producto de PCR y 1 µl T4 DNA ligasa. Para lograr un mayor número de transformaciones, la reacción fue incubada durante toda la noche. Las cantidades utilizadas para la preparación de placas LBAmpicilina-Xgal-IPTG y medio SOC se encuentran resumidas en la Tabla 5. Para preparar las células competentes se siguió el protocolo de Sambrook & Russel (2001). Se colocaron en agitación 50 µl de cultivo de E. coli DHSα F' y 50 µl de medio 15 LB (Tabla 5) durante 4 horas a 37°C de temperatura, luego 10 µl de este cultivo fue colocado en hielo durante 20 minutos, se centrifugó durante 10 minutos a 4000 RPM a 4°C de temperatura, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 2 µl de 0,1 M CaCl2 a 4°C, se volvió a centrifugar durante 10 minutos a 4000 RPM a 4°C, volvió a eliminar el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 0.4µl de 0,1 M CaCl 2. Las células competentes se mantuvieron a 4°C hasta su transformación. Para la transformación usando el vector pGEM se colocaban 50µl de la reacción de ligación en las células competentes y luego se sometían a un choque térmico (90 segundos a 42º C) para incorporar el vector con el inserto, se agregaba 950 µl de medio SOC y se incubaba una hora y media a 37°C, luego se colocaban 150 µl del cultivo transformado en placas de LB –Ampicilina-IPTG- Xgal se incubaba a 37°C durante toda la noche. Tabla 5. Cantidades y componentes usados en la preparación de placas de incubación y medio SOC. Placa de incubación (unidad) Agar LB Ampicilina 50µg/ml X-Gal 20 µg/ml IPTG 25 µl 25 µl 25 µl 12,5 µl Medio SOC 1000 µl SOC 970 µl 2+ Mg 10 µl Glucosa 10 µl H2O 10 µl Debido a que este kit permite una diferenciación por color de las células transformadas se seleccionaron 4-6 colonias blancas de cada placa y se realizó una reamplificación del fragmento con los primer SP6 y T7. Las condiciones del termociclador se encuentran detalladas en la Tabla 4. 16 2. Para la ligación con el kit Strataclone de Stratagene® se utilizaron 3µl de Cloning Buffer, 2µl de producto de PCR, 1 µl de vector Ampicilina/Kanamicina, este kit viene con células competentes incluidas. Para su transformación las células competentes eran sometidas a un choque térmico. Se utilizó 1 µl de la reacción de ligación y se incubaba con medio LB a 37°C durante 1 hora. 100µl de la reacción de transformación se colocaban en placas de LB-Ampicilina-Xgal y eran incubadas durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente se seleccionaban 4 a 6 colonias blancas y se realizaba una PCR para reamplificar el fragmento con los cebadores T6 y T7. En el termociclador se utilizaron las condiciones de la Tabla 4. Para visualizar el fragmento clonado se cargaron 10 µl del producto de PCR resultado de la clonación más 2 µl de tampón de carga en un gel de agarosa al 0,7%, la tinción se realizó con bromuro de etidio. Los clones obtenidos de cada muestra tenían el mismo tamaño por lo que un solo clon fue seleccionado por cada muestra. Luego de ser limpiado el producto de PCR resultado de la clonación fue enviado al servicio de secuenciación de Macrogen en Corea del Sur (www.macrogen.com). 7. Análisis de las secuencias amplificadas Los cromatogramas de las secuencias Galileo fueron editados con el programa Geneious© V 5.0 (Drummond et al. 2010). Las secuencias de los cebadores y el vector de clonación fueron eliminadas de las muestras. Para comprobar la identidad de las secuencias amplificadas se realizó un Megablast (Zhang et al. 2000), que muestra sólo resultados que alcancen un alto grado de similaridad, contra la colección de nucleótidos no redundantes (nr) de la base de datos del NCBI. Para la identidad de las secuencias se 17 estableció un umbral de e-30 para el valor E con un porcentaje de identidad nucleotídica superior al 70%. Las copias incompletas de Galileo C, D y F (BK006358 Contig 10369) reportadas en el genoma de D. mojavensis (Marzo et al. 2008) fueron utilizadas en la construcción de la filogenia. Las secuencias fueron alineadas con el programa MUSCLE 3.5 (Edgar 2004). Este programa consiguio un alineamiento óptimo y permitio el uso de la información generada por los gaps originados por la naturaleza de las secuencias. Las inserciones encontradas en las muestras GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri, GAL135/aldrichi y GAL033/mojavensis fueron eliminadas antes de ser alineadas para la construcción de la filogenia. La secuencia casi-completa de Galileo reportada en D. virilis (Figura 1) por Marzo et al. (2008) fue utilizada como grupo externo (outgroup) en la filogenia. Esta secuencia tiene el número de acceso BK006359 en GenBank y está localizada en el conting 16409. 8. Construcción de la filogenia Para la construcción de la filogenia se utilizó el método de Inferencia Bayesiana. Este método nos permitió evaluar la sensibilidad de la topología del árbol filogenético a los métodos de análisis utilizando el algoritmo Markov-Monte Carlo (MCMC) con el programa MrBayes 3.0 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). Cuatro búsquedas de cadenas que incluían 1 cadena cold y 3 cadenas hot fueron programadas en el computador, cada cadena permitía correr 2.000.000 generaciones. Los árboles generados se conservaban cada 200 generaciones y las primeras 300.000 generaciones eran descartadas para 18 asegurar que se había alcanzado un valor estable de la verosimilitud. Un consenso estricto de árboles remanentes en este proceso fue computado y la probabilidad a posteriori para cada nodo fue estimada para tener robustez en cada selección. Los clados obtenidos fueron considerados robustos cuando alcanzaban un valor de la probabilidad Bayesiana posterior > 95%. También se utilizó el método de Maximum Likelihood para elaborar árboles filogenéticos realizados con PhyML (Guindon et al. 2005) implementado en Geneious 5.0. Las distancias moleculares fueron estimadas por el modelo de sustitución K80 de Kimura para utilizar la información generada por deleciones/inserciones en las secuencias. Para conocer el soporte estadístico de cada nodo en el árbol se calcularon los valores bootstrap basados en 100 replicas con un umbral bootstrap >70%. 19 III. RESULTADOS 1. Amplificación por PCR de las copias de Galileo Las secuencias de Galileo fueron amplificadas en 51 muestras de 16 especies del grupo repleta (Tabla 6, Figura 7). No se detectó Galileo en 47 muestras de 35 especies (Tabla 7). Para la comparación de los datos obtenidos se utilizó la clasificación taxonómica de las especies del grupo repleta basada en los trabajos de Durando et al. 2000, Moran & Fontdevila 2005, O'Grady et al. 2002, Oliveira et al. 2003, Oliveira et al. 2005, Ruiz et al. 1990, Spicer & Pitnick 1996, Vilela 1983 y Wasserman 1992. Dentro del grupo repleta se pudo amplificar Galileo en dos de los cuatro subgrupos muestreados (mulleri y repleta). En el subgrupo mulleri se obtuvieron resultados positivos en los 5 complejos de especies, en el complejo buzzatii amplificaron 6 especies (D. borborema, D. buzzatii, D. koepferae, D. richardsoni, D. stalkeri y D. martensis), en el complejo longicornis 4 especies (D. desertorum, D. longicornis, D. mainlandi y D. hamatofila), en el complejo mojavensis 2 especies (D. arizonae y D. mojavensis) y en el complejo mulleri 3 especies (D. aldrichi, D. mulleri y D. wheeleri). Sólo amplificó una especie del subgrupo repleta, D. fulvimacula, perteneciente al complejo fulvimacula. En contraste los subgrupos mercatorum y hydei no dieron resultados positivos en la amplificación. Tampoco se obtuvo amplificación en las 4 especies del grupo nannoptera ni en la muestra del grupo virilis. La divergencia de Galileo en D. virilis pudo haber sido la causa por la que los cebadores no amplificaron esta secuencia por PCR. 20 En general se puede observar un patrón claramente distinguible de la amplificación de la transposasa de Galileo dentro de las especies del subgrupo mulleri. En concordancia con la historia evolutiva de la filogenia de las especies (Figura 7), la invasión de Galileo en este linaje pudo haber sucedido como un evento único en la especie ancestral del subgrupo mulleri. La amplificación de dos muestras de D. fulvimacula que pertenece al subgrupo repleta extienden la distribución de Galileo a este subgrupo, sin embargo esta secuencia comparte sólo el 77,7% de identidad nucleotídica con las demás secuencias lo que podría sugerir que se trata de un tipo diferente de Galileo. Tabla 6. Especies que dieron un resultado positivo para la amplificación de Galileo. El tamaño de los fragmentos incluye los cebadores G5 y G6. El asterisco indica que el fragmento tiene un ORF de longitud completa. Especie Código D. borborema D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. buzzatii D. koepferae D. martensis D. richardsoni D. stalkeri GAL041 GAL012 GAL100 GAL101 GAL102 GAL103 GAL104 GAL105 GAL106 GAL107 GAL108 GAL109 GAL110 GAL111 GAL005 GAL007 GAL045 GAL015 378 343 344 340 426* 426* 426* 340 307 426* 426* 426 426* 339 369 429 426* 420 Complejo longicornis Cluster ritae D. desertorum Cluster longicornis D. longicornis GAL119 GAL043 426 757 Grupo repleta Subgrupo mulleri Complejo buzzatii Cluster buzzatii Cluster martensis Cluster stalkeri Tamaño (bp) 21 Complejo mulleri Cluster mojavensis Cluster mulleri Subgrupo repleta Complejo fulvimacula TOTAL D. mainlandi D. hamatofila GAL124 GAL052 423 426* D. arizonae D. arizonae D. arizonae D. arizonae D. arizonae D. arizonae D. arizonae D. arizonae D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. mojavensis D. aldrichi D. aldrichi D. aldrichi D. aldrichi D. aldrichi D. mulleri D. wheeleri D. wheeleri GAL002 GAL003 GAL024 GAL026 GAL028 GAL029 GAL095 GAL096 GAL009 GAL023 GAL031 GAL033 GAL034 GAL035 GAL037 GAL090 GAL091 GAL097 GAL098 GAL001 GAL032 GAL036 GAL099 GAL135 GAL010 GAL025 GAL027 427 425 426* 426* 425 426* 426* 427 426* 426* 428 578 426* 426* 434 426* 434 426* 426* 722 401 401 401 426 741 437 426 D. fulvimacula D. fulvimacula 16 especies GAL042 426 GAL118 426 51 muestras Tabla 7. Especies que no amplificaron Galileo con los cebadores G5 y G6. Especie Código Grupo repleta Subgrupo hydei Complejo bifurca Complejo hydei D. bifurca D. nigrohydei D. guayllabambae D. hydei GAL122 GAL137 GAL138 GAL044 22 D. hydei D. hydei D. hydei GAL092 GAL093 GAL094 D. mercatorum D. mercatorum D. mercatorum D. mercatorum D. paranaensis D. peninsularis GAL008 GAL039 GAL058 GAL059 GAL054 GAL055 D. anceps D. leonis D. nigrospiracula GAL040 GAL123 GAL084 D. starmeri D. uniseta D. venezolana GAL016 GAL018 GAL020 D. eremophila D. eremophila GAL085 GAL116 D. longicornis D. ritae D. huckinsi D. huichole D. hexastigma D. hexastigma D. spenceri D. spenceri D. meridiana D. pegasa GAL139 GAL047 GAL088 GAL121 GAL053 GAL125 GAL089 GAL120 GAL056 GAL117 D. navojoa D. navojoa GAL030 GAL086 D. leonis D. nigrospiracula GAL123 GAL084 Subgrupo mercatorum Subgrupo mulleri Complejo anceps Cluster anceps Complejo buzzatii Cluster martensis Complejo eremophila Cluster eremophila Complejo longicornis Cluster longicornis Cluster ritae Cluster huckinsi Sin cluster Complejo meridiana Complejo mojavensis Cluster mojavensis Complejo anceps Sin cluster Complejo mulleri 23 Subcluster mayaguana Complejo eremophila Sin complejo Subgrupo repleta Complejo repleta Grupo nannoptera D. mayaguana D. straubae D. mettleri D. mettleri D. nigricruria D. racemova GAL011 GAL046 GAL038 GAL127 GAL126 GAL131 D. repleta D. neorepleta D. pachea D. pachea D. nannoptera D. acanthoptera D. wassermani GAL022 GAL057 GAL082 GAL083 GAL130 GAL128 GAL129 D. virilis 35 especies GAL019 47 muestras Grupo virilis Complejo virilis Total 24 Figura 7. Filogenia de las especies de Drosophila del grupo repleta (Oliveira, en preparación). Las figuras cuadradas indican las especies utilizadas en este estudio, azules para amplificación positiva y rojas para amplificación negativa. La estrella muestra el posible punto de invasión de Galileo en el linaje del grupo repleta. 25 2. Identidad de las secuencias amplificadas Como resultado del Megablast realizado con cada una de las secuencias amplificadas contra la base de datos del NCBI se obtuvieron valores altamente significativos de similaridad con las secuencias BK006357 (5989 bp) y BK006358 (6576 bp) correspondientes a copias de Galileo halladas en el genoma de D. mojavensis (Marzo et al.2008) (Tabla 8). El alineamiento de las secuencias (Figura 4) permitió la localización de fragmentos insertados y evidenció la degradación de algunas copias que mostraban deleciones y pequeñas duplicaciones. Encontramos que 20 secuencias tienen un ORF que se puede traducir completamente a proteína, sin codones stop ni alteraciones del cambio en la pauta de lectura de la región amplificada de la transposasa de Galileo (Figura 5) sugiriendo que podrían ser copias autónomas. En cambio 31 secuencias amplificadas son copias defectivas. Mediante un alineamiento de las 20 secuencias protéicas y las copias de Galileo C, D y F reportadas por Marzo et al. (2008) en el genoma de D. mojavensis, se pudo comprobar que la transposasas amplificadas tiene segmentos altamente conservados y que los fragmentos de las transposasas amplificadas en este estudio contienen el aminoácido D677 (Figura 5), que forma parte de la firma molecular de diferentes tipos de transposasas. 26 Tabla 8. Resultados del mejor alineamiento posible (best hit) encontrado en la base de datos del NCBI realizado con cada una de las secuencias obtenidas en especies del grupo repleta de Drosophila. Muestra E- Value GAL001/D. aldrichi GAL002/D. arizonae GAL003/D. arizonae GAL005/D. koepferae GAL007/D. martensis GAL009/D. mojavensis GAL010/D. mulleri GAL012/D. buzzatii GAL015/D. stalkeri GAL023/D. mojavensis GAL024/D. arizonae GAL025/D. wheeleri GAL026/D. arizonae GAL027/D. wheeleri GAL028/D. arizonae GAL029/D. arizonae GAL031/D. mojavensis GAL032/D. aldrichi GAL033/D. mojavensis GAL034/D. mojavensis GAL035/D. mojavensis GAL036/D. aldrichi GAL037/D. mojavensis GAL041/D. borborema GAL042/D. fulvimacula GAL043/D. longicornis GAL045/D. richardsoni GAL052/D. hamatofila GAL090/D. mojavensis GAL091/D. mojavensis GAL095/D. arizonae GAL096/D. arizonae GAL097/D. mojavensis GAL098/D. mojavensis GAL099/D. aldrichi GAL100/D. buzzatii GAL101/D. buzzatii GAL102/D. buzzatii GAL103/D. buzzatii GAL104/D. buzzatii GAL105/D. buzzatii GAL106/D. buzzatii 1.32e-105 3.06e-164 5.12e-157 8.23e-60 2.07e-81 8.36e-175 6.84e-136 1.18e-63 1.63e-88 0 6.51e-171 2.89e-112 8.30e-180 4.24e-133 1.10e-158 3.86e-178 1.10e-168 2.42e-95 3.17e-31 0 8.30e-180 2.42e-95 1.10e-178 4.00e-48 4.32e-98 3.16e-139 3.51e-64 1.47e-137 8.91e-130 2.36e-180 8.30e-180 1.81e-171 0 8.30e-180 2.42e-95 2.15e-60 1.10e-57 9.43e-90 4.32e-98 9.36e-95 1.10e-57 4.97e-36 D. mojavensis TE Galileo Nombre Identidad BK006357 89.0% BK006357 95.4% BK006357 93.4% BK006357 86.0% BK006357 82.8% BK006358 97.0% BK006357 90.6% BK006357 79.2% BK006358 79.4% BK006357 100.0% BK006357 96.5% BK006357 90.3% BK006358 97.8% BK006357 88.8% BK006357 93.7% BK006358 97.6% BK006358 95.1% BK006357 84.7% BK006357 93.8% BK006358 98.1% BK006358 97.8% BK006357 84.7% BK006358 96.4% BK006357 78.7% BK006357 84.7% BK006357 90.6% BK006358 79.9% BK006357 90.3% BK006358 89.4% BK006358 96.7% BK006359 97.8% BK006358 96.5% BK006358 99.2% BK006358 97.8% BK006357 84.7% BK006357 78.2% BK006357 77.5% BK006358 83.2% BK006358 84.6% BK006358 83.9% BK006357 77.5% BK006357 71.6% 27 GAL107/D. buzzatii GAL108/D. buzzatii GAL109/D. buzzatii GAL110/D. buzzatii GAL111/D. buzzatii GAL118/D. fulvimacula GAL119/D. desertorum GAL124/D. mainlandi GAL135/D. aldrichi 9.43e-90 2.00e-101 4.32e-98 2.01e-96 6.90e-54 4.32e-98 3.27e-114 1.94e-116 2.29e-114 BK006358 BK006358 BK006358 BK006358 BK006357 BK006357 BK006357 BK006358 BK006358 TOTAL 83.2% 85.0% 84.5% 84.3% 76.8% 84.7% 86.8% 87.2% 90.2% 51 muestras 28 Figura 4. Parte del alineamiento de las 52 secuencias utilizadas en este estudio. Cambios a nivel nucleotídico e inserciones se muestran con diferentes colores, las líneas entrecortadas muestran deleciones. 29 Figura 5. Alineamiento proteico de las 20 secuencias amplificadas de la transposasa de Galileo y las secuencias C, D y F. En la parte superior, se encuentra la secuencia consenso. Los segmentos más conservados están enmarcados en un recuadro de color negro, la estrella de color rojo indica la localización del aminoácido en el dominio catalítico D677. 30 Cuatro muestras contenían inserciones de tamaño considerable, GAL001/aldrichi contenía una inserción de 308 nucleótidos, GAL025/wheeleri y GAL135/aldrichi contenían una inserción de 327 nucleótidos y GAL033/mojavensis contenía una inserción de 227 nucleótidos (Figura 6). Se utizaron varias herramientas bioinformáticas como Megablast y Repeat Masker pero no se obtuvieron resultados significativos que permitan conocer la identidad de estas secuencias. Sin embargo, los insertos se categorizaron como tipo I en las secuencias GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri y GAL135/aldrichi por compartir entre ellas una identidad nucleotídica del 96% y encontrarse en la misma posición dentro de las secuencias. La inserción en la secuencia GAL033/mojavensis comparte sólo el 47% de identidad nucleotídica con las otras tres inserciones encontradas por lo que clasificó como tipo II. Figura 6. Diagrama que muestra la posición y longitud de las inserciones. En celeste, las secuencias de Galileo. En verde inserción de tipo I y en violeta la inserción tipo II. 31 3. Relaciones filogenéticas Los árboles obtenidos mediante Inferencia Bayesiana y Maximum Likelihood tienen escencialmente la misma topología. La Figura 8 muestra el árbol construido con 51 secuencias de Galileo en el grupo repleta, la secuencia de D. virilis como outgroup y las secuencias C, D y F de D. mojavensis En general la filogenia concuerda con el árbol filogenético de las especies del grupo repleta (Figura 7). Por ejemplo se observan grupos monofiléticos a nivel de complejos de especie como el que forman las muestras de las especies D. buzzatii, D. borborema, D. stalkeri y D. richarsoni (complejo buzzatii), el grupo monofilético formado por D. longicornis, D. mainlandi y D. hamatofila (complejo longicornis) y el grupo monofilético formado por las dos muestras de D. fulvimacula, que pertenece a un subgrupo diferente de las demás muestras (subgrupo repleta). Algunas discordancias se dan a nivel de especies como las muestras de Galileo en D. arizonae y D. mojavensis (complejo mojavensis) que se entremezclan en la filogenia. La especie D. desertorum se situa distante de su complejo de especies, esto podría ser explicado por discordancias que existen en torno a su clasificación dentro del complejo longicornis (Oliveira et al. 2005). En la Figura 7 se puede apreciar también las diferencias intraespecíficas en relación al tipo de Galileo que se amplificó en el genoma de cada especie, copias de Galileo tipo C y D fueron encontradas en el genoma de D. mojavensis, otro caso es el de D. fulvimacula que tiene copias de Galileo más similares a la de D. mojavensis de tipo F. Por la formación de grupos monofiléticos se pueden distinguir tipos diferentes de Galileo en el genoma de la misma especie como en D. mojavensis y 3 grupos diferentes en D. buzzatii. Las muestras que fueron editadas por contener las inserciones de tipo I y II aparecen separadas de los 32 clusters de especie a los que pertenecen y se grupan de acuerdo al tipo de inserción, de tipo I Gal001/aldrichi, Gal135/aldrichi y Gal025/wheeleri y de tipo II Gal033/mojavensis. Figura 8. Árbol obtenido mediante Inferencia Bayesiana de las transposasas de Galileo en el grupo repleta de Drosophila. Los números indican el valor bootstrap de Maximun likelihood y la probabilidad posterior de un clado asociado. Los colores denotan diferentes subgrupos de especies. 33 V. DISCUSIÓN 1. Galileo en el grupo de especies repleta Previamente se había determinado que cuatro subfamilias del elemento transponible Galileo se encontraban en el genoma de D. mojavensis (C, D, E y F) (Marzo et al. 2008) y tres subfamilias en el genoma de D. buzzatii (Galileo, Kepler y Newton) (Casals et al. 2005, Delprat et al. 2009). Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que Galileo es una familia de elementos transponibles con subfamilias o grupos diferenciados. Al igual que en la filogenia de las especies del grupo repleta (Durando et al., 2000) y conclusiones de análisis citológicos (Ruiz & Wasserman, 1993), en la filogenia obtenida con la transposasa de Galileo, se observa que las 6 especies del complejo buzzatii forman un grupo monofilético. Las copias amplificadas de Galileo en Drosophila buzzatii forman grupos monofiléticos diferenciados que muestran una relación filogenética similar a la encontrada entre Galileo, Kepler y Newton por Casals et al. (2005) con las secuencias de los TIR. Los elementos Kepler y Newton comparten una identidad nucleotídica del 90%, sus transposasas no se conocen. Sin embargo la información obtenida en este estudio podría servir para el diseño de cebadores que ayuden a aclarar la organización estructural de estos elementos. El patrón entremezclado observado en las especies D. mojavensis y D. arizonae del complejo mojavensis es similar al encontrado en filogenias realizadas utilizando genes mitocondriales y puede deberse a que son especies gemelas de separación reciente que comparten un polimorfismo ancestral (Reed & Markow 2004, Oliveira et al. 2003). El tiempo de divergencia estimado entre estas dos especies es de 1,91 a 2,97 millones de años (Reed et al. 2007). La especie D. desertorum clasificada dentro del cluster ritae del 34 complejo longicornis por similaridades encontradas en caracteres cromosómicos (Waserman 1992) aparece fuera del complejo en la filogenia obtenida con la transposasa de Galileo. Este resultado es similar al que muestra la filogenia obtenida por Durando et al. (2000) en donde esta especie es clasificada fuera del complejo longicornis argumentando que este no es un complejo monofilético. La obtención de las secuencias de Galileo en 16 de las 51 especies muestreadas refleja un patrón observable en la filogenia de las especies, sugiriendo que la adquisición de Galileo en el genoma de la especie ancestral del subgrupo mulleri fue un evento único. Posteriormente las secuencias de Galileo han divergido dentro de cada una de las especies, lo que podría explicar la abundancia de copias que se puede encontrar dentro del genoma de una especie como fue el caso en D. mojavensis y D. buzzatii. El tiempo mínimo estimado para la invasión de Galileo en el subgrupo mulleri se puede establecer con el tiempo de divergencia del subgrupo mulleri, estimado en alrededor de 11 millones de años (Ruso et al. 1995). La inserción de Galileo en el subgrupo repleta sin embargo no pudo ser establecida de manera precisa con los datos obtenidos en este estudio. Una hipótesis que se podría plantear es que la colonización en este subgrupo se llevó a cabo de manera independiente a la del subgrupo mulleri, lo cual podría explicar las diferencias encontradas en las secuencias amplificadas de D. fulvimacula. No se obtuvo amplificación de Galileo en los subgrupos más basales de la filogenia del grupo repleta como los subgrupos hydei y mercatorum. Dos explicaciones podrían ser propuestas para estos resultados. En el primer caso la ausencia podría deberse a que la adquisición de Galileo fue posterior a la divergencia de estos dos subgrupos hace aproximadamente 22 millones de años (Spicer & Pitnick 1996). En el segundo caso, la 35 ausencia de Galileo podría explicarse por una pérdida estocástica de las copias (Lohe et al. 1995), lo que sería factible si en un período largo de tiempo la tasa de pérdida de elementos por deriva génica excede la tasa de ganancia de elementos por transposición, eventualmente no quedarían elementos remanentes en el genoma. La divergencia gradual en las secuencias ocasionada aleatoriamente por mutaciones podría hacer que los elementos no puedan ser identificados por PCR o hibridización de ADN. Así, la presencia de Galileo dentro de las especies del grupo repleta detectada en este estudio podría ser un estimado conservador tomando en cuenta que un sólo cambio nucleotídico pudo evitar que la secuencia sea reconocida por los cebadores. 2. Dinámica de Galileo en el grupo repleta Las relaciones filogenéticas encontradas con la transposasa de Galileo coinciden en términos amplios con las relaciones filogenéticas obtenidas con las especies del grupo repleta, lo que nos permite inferir que Galileo tiene una dinámica de diversificación vertical dentro del linaje del grupo repleta. Esta hipótesis ha sido propuesta para explicar la la persistencia y emergencia de nuevas especies de elementos L1 en mamíferos (Khan et al. 2006) y la diversificación gradual de elementos Mariner en gramíneas (Feschotte & Wessler 2002) originados por procesos estocásticos y fundamentados en la teoría neural de la biodiversidad (Tilman 2004, Venner et al. 2009). Aunque eventos de transferencia horizontal han sido propuestos como un componente integral del ciclo de vida en los transposones de clase II como Mariner y Elementos P (Kidwell 1994, Pinsker et al. 2001), en este estudio no se encontraron evidencias de que Galileo utilice la transferencia horizontal para su transmisión en el genoma del hospedador. 36 3. La transposasa de Galileo El alineamiento de las secuencias traducidas mostró la presencia de inserciones, deleciones y sustituciones que introducen codones de stop o causan cambios en el marco de lectura. Un 39% de las transposasas amplificadas tenían un ORF de longitud completa. Así, es probable que en el genoma de las especies del grupo repleta una gran porción de copias de Galileo contengan transposasas inactivas. Esto ha sido observado también en transposasas de elementos de clase II como Mariner (Feschotte & Wessler 2002). El modelo más simple para explicar la abundancia de copias no autónomas se basa en que podría existir una presión de selección positiva de los elementos inactivos. Esto podría ser factible gracias a que dichos elementos pueden participar en la regulación del mecanismo de transposición en al menos dos maneras. Primero, sirviendo como sustrato para la transposición debido a su necesidad de una transposasa funcional, su multiplicación no incrementa la cantidad total de transposasa producida (Lohe et al. 1997). Segundo, los elementos inactivos tienen interferencia directa con la transposasa funcional a través de competencia por sitios de inserción o por degradación de la transposasa con subunidades inactivas (Lohe et al. 1996). Las transposasas de Galileo amplificadas incluyen el primer aminoácido de la firma molecular DD/E, que se encuentra en diversos tipos de transposasas e intregrasas. Esta firma consiste en dos residuos de ácido aspártico, típicamente separados por más de 90 aminoácidos, seguida por un residuo de ácido glutámico (Hartl et al. 1997). La firma molecular DD/E al parecer juega un rol importante en el mecanismo de reacción, que es parte del sitio activo de la enzima y que sirve como dominio de acoplamiento para el cation divalente (Mg2 o Mn2) necesario para la catálisis (Richardson et al. 2009). La característica 37 que comparten todas las proteínas que contienen esta firma es su habilidad para realizar cortes de cadena simple en una molécula duplex de DNA y exponer un extremo 3' hidroxil que es unido con nucleótidos dispuestos en posición opuesta a las secuencia target que será reparada por enzimas de la célula hospedadora, creando una duplicación directa, característica de la inserción de un elemento transponible (Craig 1995). 4. Inserciones encontradas en Galileo No se pudo determinar con certeza la identidad de las inserciones encontradas en las secuencias de D. mojavensis, D. aldrichi y D. wheeleri. Sin embargo previamente elementos ISBu han sido reportados en secuencias de Galileo en D. buzzatii (Casals et al. 2005) y D. mojavensis (Marzo et al. 2008). Los ISBu son Helitrones, un tipo de transposones de DNA que se replican por un mecanismo de círculo rodante (Kapitonov & Jurka 2001) y se encuentran ampliamente distribuidos dentro del género Drosophila (Yang & Barbash 2008). Los helitrones son los únicos transposones conocidos en eucariotas que se integran en el genoma sin la introducción de TSD. Usualmente la integración de los helitrones ocurre específicamente entre nucleótidos A y T en la secuencia del hospedador. Los helitrones no tienen TIR, presentes en otros transposones de DNA, en su lugar han conservado secuencias TC 5' y CTRR en el extremo 3' (Jurka et al. 2007). La posición en la filogenia de las muestras GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri, GAL135/aldrichi y GAL033/mojavensis que contenían insertos podría obedecer a que parte de la secuencia de Galileo fue delecionada durante el proceso de inserción de una secuencia exógena. 38 V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS I. Los resultados obtenidos en este estudio extienden la distribución del elemento transponible Galileo dentro del grupo de especies repleta de Drosophila. Galileo está presente en al menos 16 especies de los subgrupos mulleri y repleta. II. Las relaciones filogenéticas encontradas con la transposasa de Galileo coinciden con las relaciones filogenéticas obtenidas con las especies del grupo repleta lo que nos permite inferir que Galileo tiene una dinámica de diversificación vertical dentro del linaje del grupo repleta. III. No se obtuvieron evidencias de que Galileo haya utilizado el mecanismo de Transferencia Horizontal en su distribución dentro del grupo repleta. El hecho de que Galileo genere inversiones polimórficas por recombinación ectópica sugiere que este elemento transponible tuvo una contribución importante en la evolución del género Drosophila. La búsqueda de Galileo en otros grupos de especie como los grupos willistoni y saltans que tienen un nicho ecológico diferente al grupo repleta y entre los cuales se encuentran las especies más polimórficas del género Drosophila es crítica para entender la dinámica y distribución de este elemento transponible. 39 VI. BIBLIOGRAFÍA Bächli G (2010) TaxoDros: The Database on Taxonomy of Drosophilidae, version 2010-1, last accessed 5 January 2010. http://taxodros.unizh.ch/ Berg D & Howe M (1989) Mobile DNA Washington, DC: American Society of Microbiology. Biémont C & Vieira CN (2006) Genetics: Junk DNA as an evolutionary force. Nature 443: 521 524. Brandt J, Schrauth S, Veith AM, Froschauer A & Haneke T (2005) Transposable elements as a source of genetic innovation: expression and evolution of a family of retrotransposonderived neogenes in mammals. Gene 345: 101–111. Brookfield JF (2005) The ecology of the genome - mobile DNA elements and their hosts. Nature reviews. Genetics 6(2):128-36. 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Mis sinceros agradecimientos para la Dra. Violeta Rafael, la Dra. Laura Arcos Terán y la Dra. Mar Marzo. Gracias a mis compañeras Nuria Rius y Yolanda Guillen con quienes compartí gratos momentos durante el trabajo y para la Dra. Alejandra Delprat por su guía al inicio de este estudio. Finalmente, quiero agradecer las instituciones que me han apoyado para la realización de este Máster. A la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología del Ecuador SENACYT por haberme concedido la Beca de Fortalecimiento Humano 2009, a la Universidad Católica del Ecuador y a la Universidad Autónoma de Barcelona. 45
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