1. No category

Diversidad del elemento transponible Galileo en especies de
Drosophila (Diptera, Drosophilidae) del grupo repleta
Trabajo de investigación del Master en Genética Avanzada
Curso 2009-2010
Andrea Acurio
Director: Dr. Alfredo Ruiz
Co-director: Dr. Deodoro C. S. G. Oliveira
Facultad de Biociencias
Departamento de Genética y Microbiología
________________
________________
Lic. Andrea Acurio
Dr. Alfredo Ruiz
__________________
Dr. Deodoro C.S.G. Oliveira
1
Resumen
Los elementos transponibles (TE) constituyen una porción importante del genoma de
practicamente todos los organismos vivientes, son poderosos facilitadores de evolución
genómica e influyen en la diversidad fenotípica. El elemento transponible Galileo,
descubierto en Drosophila buzzatii, es miembro de la superfamilia P de transposones de
DNA. Este TE ha demostrado tener un papel causal en la generación de inversiones en
poblaciones naturales de Drosophila y su presencia en 6 de las 12 especies secuenciadas de
Drosophila sugiere una contribución importante a la evolución de estos dípteros. Las copias
de Galileo encontradas en el genoma de D. mojavensis fueron clasificadas en cuatro grupos
o subfamilias denominadas C, D, E y F.
Drosophila buzzatii y D. mojavensis pertenecen al grupo de especies repleta, endémico de
regiones áridas y semiáridas del continente americano. Este grupo de especies representa
un excelente modelo biológico para los estudios de evolución debido a su alta diversidad,
cerca de 100 especies descritas. Para estudiar la distribución y diversidad del elemento
transponible Galileo en el grupo repleta se realizó un muestreo representativo de los
subrupos de especie hydei, mercatorum, mulleri y repleta. Se analizaron 98 muestras de 49
especies del grupo repleta, 4 del grupo nannoptera y 1 del grupo virilis. Mediante PCR se
amplificaron las secuencias de la transposasa de Galileo, que luego fueron clonadas y
secuenciadas. La amplificación fue positiva para 51 muestras de 16 especies de Drosophila
del grupo repleta. Con estos datos se construyó una filogenia que se comparó con la
filogenia de las especies. Los datos obtenidos extienden la distribución de Galileo dentro
del grupo repleta y sugieren una diversificación vertical dentro del linaje de repleta.
2
Página
I. INTRODUCCIÓN
1. Los elementos transponibles
4
2. El elemento transponible Galileo
5
3. El grupo de especies repleta
7
4. Objetivos
8
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de muestras
9
2. Diseño de cebadores
12
3. Extracción de DNA genómico
13
4. Reacción en cadena de la polimerasa
14
5. Visualización del fragmento obtenido
15
6. Clonación del producto de PCR
15
7. Análisis de las secuencias amplificadas
17
8. Construcción de la filogenia
18
III. RESULTADOS
1. Amplificación por PCR de las copias de Galileo
20
2. Identidad de las secuencias amplificadas
26
3. Relaciones filogenéticas
32
IV. DISCUSIÓN
1. Galileo en el grupo de especies repleta
34
2. Dinámica de Galileo en el grupo repleta
36
3. La transposasa de Galileo
37
4. Inserciones encontradas en Galileo
38
V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
39
VI. BIBLIOGRAFÍA
40
VII. AGRADECIMIENTOS
45
3
I. INTRODUCCIÓN
1. Los elementos transponibles
Los elementos transponibles (TE, transposable elements) representan un
componente importante en el genoma de casi todos los organismos. La proporción de
TE en el genoma varía desde un 4% en la levadura Saccharomyces cerevisiae a más del
70% en algunas plantas y anfibios. En el genoma humano la proporción de TE es del
45% (Venner et al. 2009). Se considera que por disfunción génica o pérdida de
regulación, los TE son responsables de alrededor del 1% de enfermedades humanas
(Kazazian 1998).
Los TE son capaces de movilizarse dentro del genoma del hospedador y pueden
insertarse en genes o elementos reguladores, alterar la función de un gen o inducir
reordenaciones cromosomicas (Venner et al. 2009). La mayoría de inserciones de TE
son detrimentales, otras son selectivamente neutrales y unas pocas pueden ser
beneficiosas debido a su capacidad mutagénica, pudiendo contribuir así a la diversidad
del genoma hospedador. En algunos casos los TE han sido "domesticados" actuando
como genes o elementos reguladores de genes por lo que constituyen un recurso de
innovación génica para el organismo (Medstrand et al. 2005, Brandt et al. 2005).
En base a su mecanismo de transposición, los TE pueden ser divididos en dos
clases: La clase I comprende retrotransposones que se mobilizan a través de
mecanismos mediados por RNA (Berg 1989) y los de clase II que se movilizan a través
de mecanismos mediados por DNA y se multiplican usando la maquinaria de
replicación de la célula hospedadora (McDonald 1993). Dependiendo de su habilidad
4
para dirigir su transposición, cada clase de TE puede contener dos tipos de copias:
autónomas y no autónomas.
Los elementos autónomos tienen marcos abiertos de lectura (ORF, open reading
frames) que codifican las proteínas requeridas para la transposición en el genoma del
hospedador. En contraste los elementos no autónomos no codifican proteínas de
tranposición pero pueden transponerse utilizando la maquinaria de las copias
autónomas. La integración de casi todos los TE da como resultado la duplicación de una
secuencia genómica corta del sitio diana (TSD, target site duplications) en el sitio de
inserción. Los tranposones de DNA usualmente tienen una estructura simple con
repeticiones terminales invertidas (TIR, terminal inverted repeats) que flanquean un
sólo gen que codifica la tranposasa.
La transposasa se acopla de manera específica a los extremos de su elemento
codificante (elemento autónomo) y a los extremos de los miembros de las familias no
autónomas (Wessler 2006). Una vez acoplado la transposasa inicia la reacción de corta
y pega en donde el elemento es escindindo del sitio donante (generando un espacio
vacío) y se inserta en un nuevo sitio del genoma.
Uno de los rasgos más sobresalientes de los TE es su capacidad de atravesar los
límites entre especies e insertarse en nuevos genomas. El proceso conocido como
Transferencia Horizontal (TH) se define por la transferencia de material genético entre
especies. La TH ha sido propuesta como un paso escencial en el ciclo de vida de los
transposones de DNA (Silva et al. 2004).
2. El elemento transponible Galileo
Galileo fue descubierto en Drosophila buzzatii, en donde se caracterizaron copias
no autónomas y se clasificó a este elemento como tipo foldback debido a sus largas TIR
5
(Cáceres et al. 2001, Casals et al. 2003). En un estudio posterior (Casals et al. 2005),
copias de Galileo fueron detectadas en varias especies del complejo buzzatii, aunque no
en especies más alejadas como D. mulleri o D. repleta. Más adelante Marzo et al.
(2008) caracterizaron copias completas o casi completas de Galileo en D. buzzatii y en
el genoma de otras 6 especies de Drosophila secuenciadas, D. ananassae, D. willistoni,
D. pseudoobscura, D. persimilis, D. virilis y D. mojavensis (Figura 1). Las copias de
Galileo obtenidas tenían una longitud de 4,4 a 6 kb y codificaban una transposasa de
889-938 aa. En base a la identidad aminoacídica de la transposasa con la de los
elementos P y 1360 de D. melanogaster, Galileo fue re-clasificado como miembro de la
superfamilia P de transposones de DNA que se transpone mediante un mecanismo de
tipo corta-y-pega. Según Marzo et al. (2008), Galileo está (o ha estado recientemente)
activo en el genoma de D. buzzatii y también en otras especies del género Drosophila,
su más reciente evento de transposición fue estimado en alrededor de 0.2 millones de
años.
Figura 1. Galileo en Drosophila. A. Copia de Galileo en el genoma de D.buzzatii.
B. Copias más largas encontradas en los genomas de 6 especies secuenciadas.
Tomado y modificado de Marzo et al. (2008).
6
Las copias de Galileo encontradas en el genoma de D. mojavensis fueron
clasificadas, en base a la identidad de las secuencias de los TIR, en cuatro grupos o
subfamilias, C, D, E y F. La divergencia promedio entre las copias dentro de los grupos
C-F fue estimada en 2,2%, 2,3%, 2,4% y 8,9%, respectivamente, indicando un tiempo
de diversificación de 1,4 a 5,5 millones de años para las subfamilias (Marzo et al.
2008).
Se conoce que Galileo está implicado en la generación de al menos tres inversiones
polimórficas en poblaciones de D. buzzatii mediante recombinación ectópica (Cáceres
et al. 2001, Casals et al. 2003, Delprat et al. 2009). Además Galileo ha sido encontrado
en el genoma de otras especies de Drosophila que son polimórficas para inversiones
cromosómicas, entre ellas están las más polimórficas de todo el género (D. willistoni y
D. persimilis). Esta observación abre la posibilidad de que Galileo esté implicado en la
generación de inversiones cromosómicas en otras especies del género Drosophila.
3. El grupo de especies repleta de Drosophila
El género Drosophila representa un importante organismo modelo no sólo para
entender la evolución genómica sino también para investigaciones experimentales
comparativas, debido a que tiene una filogenia bien establecida y extensa literatura en
Genética, Etología y Ecología. El grupo de especies repleta, endémico de regiones
áridas y semiáridas de Norte y Sudamérica, es uno de los grupos más extensos y
complejos dentro del género Drosophila, con más de 100 especies (Bächli 2010). Está
dividido en seis subgrupos, fasciola, inca, hydei, mercatorum, mulleri y repleta, en base
a inversiones cromosómicas y caracteres morfológicos (Wasserman 1960, 1982, 1992,
Vilela 1983, Rafael & Arcos 1989).
7
El grupo repleta utiliza una amplia variedad de nichos ecológicos que van desde
una alta especificidad, como ciertas especies del subgrupo mulleri que utilizan tejidos
de cactus necrotizados como único sitio de oviposición y cortejo, hasta especies más
generalistas de los subgrupos hydei, mercatorum y repleta (Markow & O’Grady 2006).
4. Objetivos
El objetivo principal de esta investigación es conocer la distribución y la dinámica
evolutiva del elemento transponible Galileo dentro de las especies de Drosophila
del grupo repleta.
Los objetivos específicos son:
1. Determinar en que especies de Drosophila del grupo repleta se encuentra
Galileo para conocer mejor su distribución.
2. Construir una filogenia con las copias de Galileo que pudiesen encontrarse en el
genoma de las especies del grupo repleta para inferir su historia evolutiva.
3. Comparar la filogenia obtenida con la filogenia de las especies del grupo repleta
con la finalidad de detectar posibles casos de transferencia horizontal.
8
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de muestras
Se trató de incluir el mayor número de especies posibles para obtener una muestra
representativa del grupo de especies repleta. Se analizaron 92 muestras de los
subgrupos mulleri, hydei, mercatorum y repleta. Además se incluyeron 5 muestras del
grupo nannoptera que comparte el nicho ecológico con especies cactófilas del grupo
repleta y 1 muestra del grupo virilis, el grupo filogenéticamente más cercano a repleta.
En total se analizaron 98 muestras de 49 especies (Tabla 1). La obtención de las
muestras se realizó mediante colectas, donaciones y algunas fueron cepas de stock
centers. Los especímenes de localidades ecuatorianas,
se colectaron con trampas
plásticas y cebo de Opuntia ficus-indica con levadura de cerveza Saccharomyces
cerevisiae. La identificación taxonómica de estas muestras se realizó mediante
caracteres morfológicos externos y el análisis de la genitalia de los machos (Figura 2).
Figura 2. Caracteres morfológicos utilizados para la identificación taxonómica: a.
último segmento abdominal, b. arco genital y edeago, c. ovipositor y espermatecas, d.
palpo labial, e. número de ramas de la arista, f. peine sexual, g. venación alar, h. patrón
de coloración del torax, i. patron de coloración del abdomen.
9
Tabla1. Datos de colección disponibles de las especies utilizadas en este estudio.
Código
GAL001
GAL002
GAL003
GAL005
GAL007
GAL008
GAL009
GAL010
GAL011
GAL012
GAL015
GAL016
GAL018
GAL019
GAL020
GAL021
GAL023
GAL024
GAL025
GAL026
GAL027
GAL028
GAL029
GAL030
GAL031
GAL032
GAL033
GAL034
GAL035
GAL036
GAL037
GAL038
GAL039
GAL040
GAL041
GAL042
GAL043
GAL044
Especie
D. aldrichi
D. arizonae
D. arizonae
D. koepferae
D. martensis
D. mercatorum
D. mojavensis
D. mulleri
D. mayaguana
D. buzzatii
D. stalkeri
D. starmeri
D. uniseta
D. virilis
D. venezolana
D. wheeleri
D. mojavensis
D. arizonae
D. wheeleri
D. arizonae
D. wheeleri
D. arizonae
D. arizonae
D. navojoa
D. mojavensis
D. aldrichi
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. aldrichi
D. mojavensis
D. mettleri
D. mercatorum
D. anceps
D. borborema
D. fulvimacula
D. longicornis
D. hydei
Localidad/Pais
Zuata/Venezuela
Tomatlan /Méjico
Punta Onah/Méjico
Cébila/Argentina
Guaca/Venezoela
Comarada/Bolivia
Punta Onah/Méjico
Panuco/Méjico
Port Henderson/Jamaica
España
St. Petersburg/U.S.A.
Rio Hacha/Colombia
Salamanca/Colombia
―
Los Roques/Venezuela
Ejido Uruapan/Méjico
Catalina I./U.S.A.
Punta Onah/Méjico
Punta Onah/Méjico
San Quintin/Méjico
Catalina Island/U.S.A.
Tomatlan/Méjico
Vaquerias/Méjico
Chamela/Méjico
Santiago/Méjico
Hatulco//Méjico
Punta Onah/Méjico
Punta Onah/Méjico
San Quintin/Méjico
Zapilote/Méjico
Providence M./U.S.A.
Sonora/Méjico
Tucson/U.S.A.
Michoacan /Méjico
Bahia/Brasil
Veracruz/Méjico
Tucson/U.S.A.
Sonora/Méjico
Colector/ Año
Fontdevila/1980
Heed/1981
Heed/1981
Fontdevila et al. /1981
Cerda/1984
Fontdevila et al./1982
Heed/1981
Richardson/1998
Thomas et al./ 1983
Bowling G. Stock C/1990
Ordoñez/1996
Ordoñez/1990
UMEA Stock C.
Cerda/1984
Heed et al. /1979
2002
Etges et al./ 2007
Etges et al./ 2007
Etges et al./ 2008
Counteman/2004
Heed/1982
Etges et al./ 1997
Etges et al./ 1997
Etges et al./ 1996
Etges et al./ 2002
Etges et al./ 2007
Armella et al./ 1996
Etges et al./ 2008
Etges et al./ 1998
Etges et al./ 1996
Dros. Stock Center/1996
Dros. Stock Center/2005
Dros. Stock Center/1998
Dros. Stock Center/1974
Dros. Stock Center/2002
Dros. Stock Center/2001
Dros. Stock Center/2006
10
GAL045
GAL046
GAL047
GAL052
GAL053
GAL054
GAL055
GAL056
GAL057
GAL058
GAL059
GAL082
GAL083
GAL084
GAL085
GAL086
GAL088
GAL089
GAL090
GAL091
GAL092
GAL093
GAL094
GAL095
GAL096
GAL097
GAL098
GAL099
GAL100
GAL101
GAL102
GAL103
GAL104
GAL105
GAL106
GAL107
GAL108
GAL109
GAL110
GAL111
GAL116
GAL117
GAL118
D. richardsoni
D. straubae
D. ritae
D. hamatofila
D. hexastigma
D. paranaensis
D. peninsularis
D. meridiana
D. neorepleta
D. mercatorum
D. mercatorum
D. pachea
D. pachea
D. nigrospiracula
D. eremophila
D. navojoa
D. huckinsi
D. spenceri
D. mojavensis
D. mojavensis
D. hydei
D. hydei
D. hydei
D. arizonae
D. arizonae
D. mojavensis
D. mojavensis
D. aldrichi
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. eremophila
D. pegasa
D. fulvimacula
TortolaIsland
Sigus Beach/Cuba
Puebla/Méjico
Superstition /U.S.A.
Puebla/Méjico
Chiapas/Méjico
Bath/Jamaica
Canal Zone/Panama
Jalisco/Méjico
Palmira /Colombia
Campo Grande/Brasil
Las Bocas/Méjico
Punta Onah/Méjico
Las Bocas/Méjico
Las Bocas/Méjico
Las Bocas/Méjico
Las Bocas/Méjico
Las Bocas/Méjico
Punta Onah/Méjico
El Choyudo/Méjico
Las Bocas/Méjico
Punta Onah/Méjico
El Choyudo/Méjico
Las Bocas/Méjico
El Choyudo/Méjico
Las Bocas/Méjico
Punta Onah/Méjico
Las Bocas/Méjico
Guaritas/Brasil
Trinkey/Australia
Mazán/Argentina
Wari/Peru
Quilmes/Argentina
Ticucho/Argentina
Otamendi/Argentina
Carboneras/España
Carboneras/España
Sardinia/Italia
Carboneras/España
Carboneras/España
Punta Tecolote/Méjico
Zapotitlan/Méjico
Los Tuxtlas/Méjico
Dros. Stock Center
Dros. Stock Center
Dros. Stock Center/1991
Dros. Stock Center/2005
Dros. Stock Center/1997
Dros. Stock Center/2002
Dros. Stock Center/1957
Dros. Stock Center/1958
Dros. Stock Center/2004
Dros. Stock Center
Dros. Stock Center
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 1995
Barker/1977
Ruiz et al. /1982
Fontdevila/1980
Ruiz et al. /1982
Hasson /1986
Ruiz et al. /1982
Fontdevila et al. /1981
Fontdevila et al. /1981
Gompel/ 2006
Fontdevila et al. /1981
Fontdevila et al. /1981
Etges/2000
Etges/2002
Etges/2001
11
GAL119
GAL120
GAL121
GAL122
GAL123
GAL124
GAL125
GAL126
GAL127
GAL128
GAL129
GAL130
GAL131
GAL135
GAL137
GAL138
GAL139
TOTAL
D. desertorum
D. spenceri
D. huichole
D. bifurca
D. leonis
D. mainlandi
D. hexastigma
D. nigricruria
D. mettleri
D. acanthoptera
D. wassermani
D. nannoptera
D. racemova
D. aldrichi
D. nigrohydei
D. guayllabambae
D. longicornis
49 especies
Big Bend NP/U.S.A.
Infiernillo/Méjico
Zapotitlan/Méjico
Punta/Méjico
Ixtlan del Rio/Méjico
Catalina Island/U.S.A.
Zapotitlan/Méjico
Las Bocas/Méjico
El Choyudo/Méjico
Huatulco/Méjico
Infiernillo/Méjico
Joluxtla/Méjico
El Tecolo/Méjico
Punta Onah/Méjico
Nayón/Ecuador
Nayón /Ecuador
Guayllabamba/Ecuador
98 muestras
Etges/2005
Etges/1998
Etges/2002
Etges/2000
Etges/2000
Counteman/2004
Etges/2000
Ruiz et al./ 2009
Ruiz et al./ 2009
Etges/2002
Etges/1998
Etges/2000
Etges/2000
Ruiz et al./ 2009
Acurio et al. 2009
Acurio et al. 2009
Acurio et al. 2009
2. Diseño de cebadores
Los cebadores, que se denominaron G5 y G6
fueron diseñados a partir del
alineamiento de las secuencias más conservadas de la transposasa en las subfamilias C
y D de Galileo en D. mojavensis. Para esto, se utilizaron las copias casi completas de
Galileo en el genoma de D. mojavensis reportadas por Marzo et al. (2008): la secuencia
BK006357 localizada en el contig 10758.1 (Grupo C) y la secuencia BK006358
localizada en el contig 9930 (Grupo D). Se esperaba que estos cebadores amplifiquen
un fragmento de alrededor de 450bp del ORF que codifica la transposasa (Figura 3,
Tabla 2).
12
Figura 3. Esquema que denota la estructura de Galileo y el fragmento de interés. En
rojo se muestran los cebadores utilizados.
Tabla 2. Cebadores utilizados en este estudio.
Primers
G5
G6
Secuencia (5'-3')
TGCACCGCATCTWGTWAAATCC
Longitud (bp)
22
AAATAATCACGCATTTCCWGAAG
23
3. Extracción del DNA genómico
La extracción del DNA genómico se realizó a partir de un solo individuo
conservado en etanol. Se utilizó la técnica de extracción con Bromuro de
Hexadeciltrimetilamonio (CTAB). El espécimen fue homogenizado con una varilla
estéril de polipropileno, a este homogenato se agregó 700 µl de buffer CTAB a 60°C y
se incubó durante 1 hora a la misma temperatura. Se agregó 600 µl de
cloroformo/isoamílico y se mezcló por 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó
a 13.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 5 minutos y se recogió el sobrenadante
al que se le agregó igual volumen de isopropanol frío y se mezcló por inmersión para
la precipitación del DNA. Se recuperó el pellet centrifugando a 13.000 rpm durante 5
minutos y se descartó el líquido. El pellet obtenido se lavó con 300 µl de etanol al 70%
y se centrifugó nuevamente a 13.000 rpm durante 5 minutos, se descartó el etanol y se
13
secó cuidadosamente el pellet al vacío. Finalmente se disolvió el pellet en 50 µl de agua
MQ estéril. Para determinar la cantidad y la calidad del DNA extraído se realizaron dos
reacciones de PCR con los cebadores correspondientes a los genes Cox I y Gapdh. Los
productos de la amplificación se corrieron en un gel de agarosa al 0.7% y tinción de
bromuro de etidio.
4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La preparación de la mezcla para la reacción de PCR fue realizada con las
cantidades detalladas en la Tabla 3. Se utilizó la Taq Polimerasa de Roche Applied
Science. Las condiciones utilizadas en el termociclador MJ Mini BIO-Rad® de BioRad Laboratories, Inc. fueron optimizadas para la secuencia de interés (Tabla 4).
Tabla 3. Cantidades utilizadas en cada reacción de PCR.
H2O
Buffer 10X
dNTPs 2mM
Primer 5 10 mM
Primer 6 10 mM
Taq Pol. 5u/µl
DNA
Total
Cantidades/reacción
22,2 µl
3 µl
0,6 µl
1 µl
1 µl
0,2 µl
2 µl
30 µl
Tabla 4. Programa utilizado en el termiclador para la PCR.
35
ciclos
Fase
Denaturación inicial
Temperatura
95 °C
Tiempo
4 minutos
Denaturación
95°C
30 segundos
Anillamiento
53°C
30 segundos
Extension
72°C
30 segundos
Extensión final
72°C
7 minutos
14
5. Visualización del fragmento obtenido
Se cargaron 10 µl del producto de PCR más 2µl de marcador de peso molecular
(Ladder 1 Kb plus de INVITROGEN®) en un gel de agarosa con una concentración de
0,7%. Para la migración electroforética se utilizó Tampón TAE 1X (Tris Acético 40
mM y EDTA 1mM), el voltaje utilizado varió de 70-90 voltios de acuerdo a la
extensión del gel. Para la tinción, los geles fueron sometidos a una solución de Bromuro
de Etidio a una concentración 0,5 µg/ml y radiación ultravioleta. Fotografías de los
geles fueron captadas utilizando el programa Alpha Digidoc RT©.
El producto de PCR fue purificado con el kit NucleoSpin® Extract II de Clontech
Laboratories, Inc. con tecnogía de columnas con membranas de silice.
6. Clonación del producto de PCR
Para la clonación del fragmento de interés se siguieron los protocolos de:
1. El vector sintético pGEM Easy® de Promega
2.
Kit Strataclone® de Stratagene
1. Para la reacción de ligación con el vector pGEM Easy ® se utilizó 5µl de T4 DNA
ligasa, 1µl de pGEM vector (50 ng), 3 µl de producto de PCR y 1 µl T4 DNA
ligasa. Para lograr un mayor número de transformaciones, la reacción fue incubada
durante toda la noche. Las cantidades utilizadas para la preparación de placas LBAmpicilina-Xgal-IPTG y medio SOC se encuentran resumidas en la Tabla 5.
Para preparar las células competentes se siguió el protocolo de Sambrook & Russel
(2001). Se colocaron en agitación 50 µl de cultivo de E. coli DHSα F' y 50 µl de medio
15
LB (Tabla 5) durante 4 horas a 37°C de temperatura, luego 10 µl de este cultivo fue
colocado en hielo durante 20 minutos, se centrifugó durante 10 minutos a 4000 RPM a
4°C de temperatura, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 2 µl de
0,1 M CaCl2 a 4°C, se volvió a centrifugar durante 10 minutos a 4000 RPM a 4°C,
volvió a eliminar el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 0.4µl de 0,1 M CaCl 2.
Las células competentes se mantuvieron a 4°C hasta su transformación.
Para la transformación usando el vector pGEM se colocaban 50µl de la reacción de
ligación en las células competentes y luego se sometían a un choque térmico (90
segundos a 42º C) para incorporar el vector con el inserto, se agregaba 950 µl de medio
SOC y se incubaba una hora y media a 37°C, luego se colocaban 150 µl del cultivo
transformado en placas de LB –Ampicilina-IPTG- Xgal se incubaba a 37°C durante
toda la noche.
Tabla 5. Cantidades y componentes usados en la preparación de placas de
incubación y medio SOC.
Placa de incubación (unidad)
Agar LB
Ampicilina 50µg/ml
X-Gal 20 µg/ml
IPTG
25 µl
25 µl
25 µl
12,5 µl
Medio SOC 1000 µl
SOC
970 µl
2+
Mg
10 µl
Glucosa 10 µl
H2O
10 µl
Debido a que este kit permite una diferenciación por color de las células transformadas
se seleccionaron 4-6 colonias blancas de cada placa y se realizó una reamplificación
del fragmento con los primer SP6 y T7. Las condiciones del termociclador se
encuentran detalladas en la Tabla 4.
16
2. Para la ligación con el kit Strataclone de Stratagene® se utilizaron 3µl de Cloning
Buffer, 2µl de producto de PCR, 1 µl de vector Ampicilina/Kanamicina, este kit
viene con células competentes incluidas. Para su transformación las células
competentes eran sometidas a un choque térmico. Se utilizó 1 µl de la reacción de
ligación y se incubaba con medio LB a 37°C durante 1 hora. 100µl de la reacción
de transformación se colocaban en placas de LB-Ampicilina-Xgal y eran incubadas
durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente se seleccionaban 4 a 6 colonias
blancas y se realizaba una PCR para reamplificar el fragmento con los cebadores T6
y T7. En el termociclador se utilizaron las condiciones de la Tabla 4.
Para visualizar el fragmento clonado se cargaron 10 µl del producto de PCR
resultado de la clonación más 2 µl de tampón de carga en un gel de agarosa al 0,7%, la
tinción se realizó con bromuro de etidio. Los clones obtenidos de cada muestra tenían el
mismo tamaño por lo que un solo clon fue seleccionado por cada muestra. Luego de ser
limpiado el producto de PCR resultado de la clonación fue enviado al servicio de
secuenciación de Macrogen en Corea del Sur (www.macrogen.com).
7. Análisis de las secuencias amplificadas
Los cromatogramas de las secuencias Galileo fueron editados con el programa
Geneious© V 5.0 (Drummond et al. 2010). Las secuencias de los cebadores y el vector
de clonación fueron eliminadas de las muestras. Para comprobar la identidad de las
secuencias amplificadas se realizó un Megablast (Zhang et al. 2000), que muestra sólo
resultados que alcancen un alto grado de similaridad, contra la colección de nucleótidos
no redundantes (nr) de la base de datos del NCBI. Para la identidad de las secuencias se
17
estableció un umbral de e-30 para el valor E con un porcentaje de identidad nucleotídica
superior al 70%. Las copias incompletas de Galileo C, D y F (BK006358 Contig 10369)
reportadas en el genoma de D. mojavensis (Marzo et al. 2008) fueron utilizadas en la
construcción de la filogenia.
Las secuencias fueron alineadas con el programa MUSCLE 3.5 (Edgar 2004). Este
programa consiguio un alineamiento óptimo y permitio el uso de la información
generada por los gaps originados por la naturaleza de las secuencias. Las inserciones
encontradas en las muestras GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri, GAL135/aldrichi y
GAL033/mojavensis fueron eliminadas antes de ser alineadas para la construcción de la
filogenia.
La secuencia casi-completa de Galileo reportada en D. virilis (Figura 1) por Marzo
et al. (2008) fue utilizada como grupo externo (outgroup) en la filogenia. Esta
secuencia tiene el número de acceso BK006359 en GenBank y está localizada en el
conting 16409.
8. Construcción de la filogenia
Para la construcción de la filogenia se utilizó el método de Inferencia Bayesiana.
Este método nos permitió evaluar la sensibilidad de la topología del árbol filogenético a
los métodos de análisis utilizando el algoritmo Markov-Monte Carlo (MCMC) con el
programa MrBayes 3.0 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). Cuatro búsquedas de cadenas
que incluían 1 cadena cold y 3 cadenas hot fueron programadas en el computador, cada
cadena permitía correr 2.000.000 generaciones. Los árboles generados se conservaban
cada 200 generaciones y las primeras 300.000 generaciones eran descartadas para
18
asegurar que se había alcanzado un valor estable de la verosimilitud. Un consenso
estricto de árboles remanentes en este proceso fue computado y la probabilidad a
posteriori para cada nodo fue estimada para tener robustez en cada selección. Los
clados obtenidos fueron considerados robustos cuando alcanzaban un valor de la
probabilidad Bayesiana posterior > 95%.
También se utilizó el método de Maximum Likelihood para elaborar árboles
filogenéticos realizados con PhyML (Guindon et al. 2005) implementado en Geneious
5.0. Las distancias moleculares fueron estimadas por el modelo de sustitución K80 de
Kimura para utilizar la información generada por deleciones/inserciones en las
secuencias. Para conocer el soporte estadístico de cada nodo en el árbol se calcularon
los valores bootstrap basados en 100 replicas con un umbral bootstrap >70%.
19
III. RESULTADOS
1. Amplificación por PCR de las copias de Galileo
Las secuencias de Galileo fueron amplificadas en 51 muestras de 16 especies del
grupo repleta (Tabla 6, Figura 7). No se detectó Galileo en 47 muestras de 35 especies
(Tabla 7). Para la comparación de los datos obtenidos se utilizó la clasificación
taxonómica de las especies del grupo repleta basada en los trabajos de Durando et al.
2000, Moran & Fontdevila 2005, O'Grady et al. 2002, Oliveira et al. 2003, Oliveira et
al. 2005, Ruiz et al. 1990, Spicer & Pitnick 1996, Vilela 1983 y Wasserman 1992.
Dentro del grupo repleta se pudo amplificar Galileo en dos de los cuatro subgrupos
muestreados (mulleri y repleta). En el subgrupo mulleri se obtuvieron resultados
positivos en los 5 complejos de especies, en el complejo buzzatii amplificaron 6
especies (D. borborema, D. buzzatii, D. koepferae, D. richardsoni, D. stalkeri y D.
martensis), en el complejo longicornis 4 especies (D. desertorum, D. longicornis, D.
mainlandi y D. hamatofila), en el complejo mojavensis 2 especies (D. arizonae y D.
mojavensis) y en el complejo mulleri 3 especies (D. aldrichi, D. mulleri y D. wheeleri).
Sólo amplificó una especie del subgrupo repleta, D. fulvimacula, perteneciente al
complejo fulvimacula.
En contraste los subgrupos mercatorum y hydei no dieron resultados positivos en la
amplificación. Tampoco se obtuvo amplificación en las 4 especies del grupo
nannoptera ni en la muestra del grupo virilis. La divergencia de Galileo en D. virilis
pudo haber sido la causa por la que los cebadores no amplificaron esta secuencia por
PCR.
20
En general se puede observar un patrón claramente distinguible de la amplificación de
la transposasa de Galileo dentro de las especies del subgrupo mulleri. En concordancia
con la historia evolutiva de la filogenia de las especies (Figura 7), la invasión de Galileo
en este linaje pudo haber sucedido como un evento único en la especie ancestral del
subgrupo mulleri. La amplificación de dos muestras de D. fulvimacula que pertenece al
subgrupo repleta extienden la distribución de Galileo a este subgrupo, sin embargo
esta secuencia comparte sólo el 77,7% de identidad nucleotídica con las demás
secuencias lo que podría sugerir que se trata de un tipo diferente de Galileo.
Tabla 6. Especies que dieron un resultado positivo para la amplificación de Galileo. El
tamaño de los fragmentos incluye los cebadores G5 y G6. El asterisco indica que el
fragmento tiene un ORF de longitud completa.
Especie
Código
D. borborema
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. buzzatii
D. koepferae
D. martensis
D. richardsoni
D. stalkeri
GAL041
GAL012
GAL100
GAL101
GAL102
GAL103
GAL104
GAL105
GAL106
GAL107
GAL108
GAL109
GAL110
GAL111
GAL005
GAL007
GAL045
GAL015
378
343
344
340
426*
426*
426*
340
307
426*
426*
426
426*
339
369
429
426*
420
Complejo longicornis
Cluster ritae
D. desertorum
Cluster longicornis D. longicornis
GAL119
GAL043
426
757
Grupo repleta
Subgrupo mulleri
Complejo buzzatii
Cluster buzzatii
Cluster martensis
Cluster stalkeri
Tamaño (bp)
21
Complejo mulleri
Cluster mojavensis
Cluster mulleri
Subgrupo repleta
Complejo fulvimacula
TOTAL
D. mainlandi
D. hamatofila
GAL124
GAL052
423
426*
D. arizonae
D. arizonae
D. arizonae
D. arizonae
D. arizonae
D. arizonae
D. arizonae
D. arizonae
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. mojavensis
D. aldrichi
D. aldrichi
D. aldrichi
D. aldrichi
D. aldrichi
D. mulleri
D. wheeleri
D. wheeleri
GAL002
GAL003
GAL024
GAL026
GAL028
GAL029
GAL095
GAL096
GAL009
GAL023
GAL031
GAL033
GAL034
GAL035
GAL037
GAL090
GAL091
GAL097
GAL098
GAL001
GAL032
GAL036
GAL099
GAL135
GAL010
GAL025
GAL027
427
425
426*
426*
425
426*
426*
427
426*
426*
428
578
426*
426*
434
426*
434
426*
426*
722
401
401
401
426
741
437
426
D. fulvimacula
D. fulvimacula
16 especies
GAL042
426
GAL118
426
51 muestras
Tabla 7. Especies que no amplificaron Galileo con los cebadores G5 y G6.
Especie
Código
Grupo repleta
Subgrupo hydei
Complejo bifurca
Complejo hydei
D. bifurca
D. nigrohydei
D. guayllabambae
D. hydei
GAL122
GAL137
GAL138
GAL044
22
D. hydei
D. hydei
D. hydei
GAL092
GAL093
GAL094
D. mercatorum
D. mercatorum
D. mercatorum
D. mercatorum
D. paranaensis
D. peninsularis
GAL008
GAL039
GAL058
GAL059
GAL054
GAL055
D. anceps
D. leonis
D. nigrospiracula
GAL040
GAL123
GAL084
D. starmeri
D. uniseta
D. venezolana
GAL016
GAL018
GAL020
D. eremophila
D. eremophila
GAL085
GAL116
D. longicornis
D. ritae
D. huckinsi
D. huichole
D. hexastigma
D. hexastigma
D. spenceri
D. spenceri
D. meridiana
D. pegasa
GAL139
GAL047
GAL088
GAL121
GAL053
GAL125
GAL089
GAL120
GAL056
GAL117
D. navojoa
D. navojoa
GAL030
GAL086
D. leonis
D. nigrospiracula
GAL123
GAL084
Subgrupo mercatorum
Subgrupo mulleri
Complejo anceps
Cluster anceps
Complejo buzzatii
Cluster martensis
Complejo eremophila
Cluster eremophila
Complejo longicornis
Cluster longicornis
Cluster ritae
Cluster huckinsi
Sin cluster
Complejo meridiana
Complejo mojavensis
Cluster mojavensis
Complejo anceps
Sin cluster
Complejo mulleri
23
Subcluster mayaguana
Complejo eremophila
Sin complejo
Subgrupo repleta
Complejo repleta
Grupo nannoptera
D. mayaguana
D. straubae
D. mettleri
D. mettleri
D. nigricruria
D. racemova
GAL011
GAL046
GAL038
GAL127
GAL126
GAL131
D. repleta
D. neorepleta
D. pachea
D. pachea
D. nannoptera
D. acanthoptera
D. wassermani
GAL022
GAL057
GAL082
GAL083
GAL130
GAL128
GAL129
D. virilis
35 especies
GAL019
47 muestras
Grupo virilis
Complejo virilis
Total
24
Figura 7. Filogenia de las especies de Drosophila del grupo repleta (Oliveira, en
preparación). Las figuras cuadradas indican las especies utilizadas en este estudio, azules
para amplificación positiva y rojas para amplificación negativa. La estrella muestra el
posible punto de invasión de Galileo en el linaje del grupo repleta.
25
2. Identidad de las secuencias amplificadas
Como resultado del Megablast realizado con cada una de las secuencias
amplificadas contra la base de datos del NCBI se obtuvieron valores altamente
significativos de similaridad con las secuencias BK006357 (5989 bp) y BK006358
(6576 bp) correspondientes a copias de Galileo halladas en el genoma de D.
mojavensis (Marzo et al.2008) (Tabla 8). El alineamiento de las secuencias (Figura
4) permitió la localización de fragmentos insertados y evidenció la degradación de
algunas copias que mostraban deleciones y pequeñas duplicaciones.
Encontramos que 20 secuencias tienen un ORF que se puede traducir
completamente a proteína, sin codones stop ni alteraciones del cambio en la pauta
de lectura de la región amplificada de la transposasa de Galileo (Figura 5)
sugiriendo que podrían ser copias autónomas. En cambio 31 secuencias
amplificadas son copias defectivas.
Mediante un alineamiento de las 20 secuencias protéicas y las copias de
Galileo C, D y F reportadas por Marzo et al. (2008) en el genoma de D. mojavensis,
se pudo comprobar que la transposasas amplificadas tiene segmentos altamente
conservados y que los fragmentos de las transposasas amplificadas en este estudio
contienen el aminoácido D677 (Figura 5), que forma parte de la firma molecular de
diferentes tipos de transposasas.
26
Tabla 8. Resultados del mejor alineamiento posible (best hit) encontrado en la base
de datos del NCBI realizado con cada una de las secuencias obtenidas en especies
del grupo repleta de Drosophila.
Muestra
E- Value
GAL001/D. aldrichi
GAL002/D. arizonae
GAL003/D. arizonae
GAL005/D. koepferae
GAL007/D. martensis
GAL009/D. mojavensis
GAL010/D. mulleri
GAL012/D. buzzatii
GAL015/D. stalkeri
GAL023/D. mojavensis
GAL024/D. arizonae
GAL025/D. wheeleri
GAL026/D. arizonae
GAL027/D. wheeleri
GAL028/D. arizonae
GAL029/D. arizonae
GAL031/D. mojavensis
GAL032/D. aldrichi
GAL033/D. mojavensis
GAL034/D. mojavensis
GAL035/D. mojavensis
GAL036/D. aldrichi
GAL037/D. mojavensis
GAL041/D. borborema
GAL042/D. fulvimacula
GAL043/D. longicornis
GAL045/D. richardsoni
GAL052/D. hamatofila
GAL090/D. mojavensis
GAL091/D. mojavensis
GAL095/D. arizonae
GAL096/D. arizonae
GAL097/D. mojavensis
GAL098/D. mojavensis
GAL099/D. aldrichi
GAL100/D. buzzatii
GAL101/D. buzzatii
GAL102/D. buzzatii
GAL103/D. buzzatii
GAL104/D. buzzatii
GAL105/D. buzzatii
GAL106/D. buzzatii
1.32e-105
3.06e-164
5.12e-157
8.23e-60
2.07e-81
8.36e-175
6.84e-136
1.18e-63
1.63e-88
0
6.51e-171
2.89e-112
8.30e-180
4.24e-133
1.10e-158
3.86e-178
1.10e-168
2.42e-95
3.17e-31
0
8.30e-180
2.42e-95
1.10e-178
4.00e-48
4.32e-98
3.16e-139
3.51e-64
1.47e-137
8.91e-130
2.36e-180
8.30e-180
1.81e-171
0
8.30e-180
2.42e-95
2.15e-60
1.10e-57
9.43e-90
4.32e-98
9.36e-95
1.10e-57
4.97e-36
D. mojavensis TE Galileo
Nombre
Identidad
BK006357
89.0%
BK006357
95.4%
BK006357
93.4%
BK006357
86.0%
BK006357
82.8%
BK006358
97.0%
BK006357
90.6%
BK006357
79.2%
BK006358
79.4%
BK006357
100.0%
BK006357
96.5%
BK006357
90.3%
BK006358
97.8%
BK006357
88.8%
BK006357
93.7%
BK006358
97.6%
BK006358
95.1%
BK006357
84.7%
BK006357
93.8%
BK006358
98.1%
BK006358
97.8%
BK006357
84.7%
BK006358
96.4%
BK006357
78.7%
BK006357
84.7%
BK006357
90.6%
BK006358
79.9%
BK006357
90.3%
BK006358
89.4%
BK006358
96.7%
BK006359
97.8%
BK006358
96.5%
BK006358
99.2%
BK006358
97.8%
BK006357
84.7%
BK006357
78.2%
BK006357
77.5%
BK006358
83.2%
BK006358
84.6%
BK006358
83.9%
BK006357
77.5%
BK006357
71.6%
27
GAL107/D. buzzatii
GAL108/D. buzzatii
GAL109/D. buzzatii
GAL110/D. buzzatii
GAL111/D. buzzatii
GAL118/D. fulvimacula
GAL119/D. desertorum
GAL124/D. mainlandi
GAL135/D. aldrichi
9.43e-90
2.00e-101
4.32e-98
2.01e-96
6.90e-54
4.32e-98
3.27e-114
1.94e-116
2.29e-114
BK006358
BK006358
BK006358
BK006358
BK006357
BK006357
BK006357
BK006358
BK006358
TOTAL
83.2%
85.0%
84.5%
84.3%
76.8%
84.7%
86.8%
87.2%
90.2%
51 muestras
28
Figura 4. Parte del alineamiento de las 52 secuencias utilizadas en este estudio. Cambios a nivel nucleotídico e inserciones se
muestran con diferentes colores, las líneas entrecortadas muestran deleciones.
29
Figura 5. Alineamiento proteico de las 20 secuencias amplificadas de la transposasa de Galileo y las secuencias C, D y F. En la
parte superior, se encuentra la secuencia consenso. Los segmentos más conservados están enmarcados en un recuadro de color
negro, la estrella de color rojo indica la localización del aminoácido en el dominio catalítico D677.
30
Cuatro
muestras
contenían
inserciones
de
tamaño
considerable,
GAL001/aldrichi contenía una inserción de 308 nucleótidos, GAL025/wheeleri y
GAL135/aldrichi contenían una inserción de 327 nucleótidos y GAL033/mojavensis
contenía una inserción de 227 nucleótidos (Figura 6). Se utizaron varias
herramientas bioinformáticas como Megablast y Repeat Masker pero no se
obtuvieron resultados significativos que permitan conocer la identidad de estas
secuencias. Sin embargo, los insertos se categorizaron como tipo I en las secuencias
GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri y GAL135/aldrichi por compartir entre ellas
una identidad nucleotídica del 96% y encontrarse en la misma posición dentro de las
secuencias. La inserción en la secuencia GAL033/mojavensis comparte sólo el 47%
de identidad nucleotídica con las otras tres inserciones encontradas por lo que
clasificó como tipo II.
Figura 6. Diagrama que muestra la posición y longitud de las inserciones. En
celeste, las secuencias de Galileo. En verde inserción de tipo I y en violeta la
inserción tipo II.
31
3. Relaciones filogenéticas
Los árboles obtenidos mediante Inferencia Bayesiana y Maximum
Likelihood tienen escencialmente la misma topología.
La Figura 8 muestra el árbol
construido con 51 secuencias de Galileo en el grupo repleta, la secuencia de D. virilis
como outgroup y las secuencias C, D y F de D. mojavensis
En general la filogenia concuerda con el árbol filogenético de las especies
del grupo repleta (Figura 7). Por ejemplo se observan grupos monofiléticos a nivel de
complejos de especie como el que forman las muestras de las especies D. buzzatii, D.
borborema, D. stalkeri y D. richarsoni (complejo buzzatii), el grupo monofilético formado
por D. longicornis, D. mainlandi y D. hamatofila (complejo longicornis) y el grupo
monofilético formado por las dos muestras de D. fulvimacula, que pertenece a un subgrupo
diferente de las demás muestras (subgrupo repleta). Algunas discordancias se dan a nivel
de especies como las muestras de Galileo en D. arizonae y D. mojavensis (complejo
mojavensis) que se entremezclan en la filogenia. La especie D. desertorum se situa distante
de su complejo de especies, esto podría ser explicado por discordancias que existen en
torno a su clasificación dentro del complejo longicornis (Oliveira et al. 2005).
En la Figura 7 se puede apreciar también las diferencias intraespecíficas en relación al tipo
de Galileo que se amplificó en el genoma de cada especie, copias de Galileo tipo C y D
fueron encontradas en el genoma de D. mojavensis, otro caso es el de D. fulvimacula que
tiene copias de Galileo más similares a la de D. mojavensis de tipo F. Por la formación de
grupos monofiléticos se pueden distinguir tipos diferentes de Galileo en el genoma de la
misma especie como en D. mojavensis y 3 grupos diferentes en D. buzzatii. Las muestras
que fueron editadas por contener las inserciones de tipo I y II aparecen separadas de los
32
clusters de especie a los que pertenecen y se grupan de acuerdo al tipo de inserción, de tipo
I Gal001/aldrichi, Gal135/aldrichi y Gal025/wheeleri y de tipo II Gal033/mojavensis.
Figura 8. Árbol obtenido mediante Inferencia Bayesiana de las transposasas de Galileo en
el grupo repleta de Drosophila. Los números indican el valor bootstrap de Maximun
likelihood y la probabilidad posterior de un clado asociado. Los colores denotan diferentes
subgrupos de especies.
33
V. DISCUSIÓN
1. Galileo en el grupo de especies repleta
Previamente se había determinado que cuatro subfamilias del elemento
transponible Galileo se encontraban en el genoma de D. mojavensis (C, D, E y F) (Marzo
et al. 2008) y tres subfamilias en el genoma de D. buzzatii (Galileo, Kepler y Newton)
(Casals et al. 2005, Delprat et al. 2009). Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que
Galileo es una familia de elementos transponibles con subfamilias o grupos diferenciados.
Al igual que en la filogenia de las especies del grupo repleta (Durando et al., 2000) y
conclusiones de análisis citológicos (Ruiz & Wasserman, 1993), en la filogenia obtenida
con la transposasa de Galileo, se observa que las 6 especies del complejo buzzatii forman
un grupo monofilético. Las copias amplificadas de Galileo en Drosophila buzzatii forman
grupos monofiléticos diferenciados que muestran una relación filogenética similar a la
encontrada entre Galileo, Kepler y Newton por Casals et al. (2005) con las secuencias de
los TIR. Los elementos Kepler y Newton comparten una identidad nucleotídica del 90%,
sus transposasas no se conocen. Sin embargo la información obtenida en este estudio podría
servir para el diseño de cebadores que ayuden a aclarar la organización estructural de estos
elementos.
El patrón entremezclado observado en las especies D. mojavensis y D. arizonae del
complejo mojavensis es similar al encontrado en filogenias realizadas utilizando genes
mitocondriales y puede deberse a que son especies gemelas de separación reciente que
comparten un polimorfismo ancestral (Reed & Markow 2004, Oliveira et al. 2003). El
tiempo de divergencia estimado entre estas dos especies es de 1,91 a 2,97 millones de años
(Reed et al. 2007). La especie D. desertorum clasificada dentro del cluster ritae del
34
complejo longicornis por similaridades encontradas en caracteres cromosómicos
(Waserman 1992) aparece fuera del complejo en la filogenia obtenida con la transposasa de
Galileo. Este resultado es similar al que muestra la filogenia obtenida por Durando et al.
(2000) en donde esta especie es clasificada fuera del complejo longicornis argumentando
que este no es un complejo monofilético.
La obtención de las secuencias de Galileo en 16 de las 51 especies muestreadas
refleja un patrón observable en la filogenia de las especies, sugiriendo que la adquisición de
Galileo en el genoma de la especie ancestral del subgrupo mulleri fue un evento único.
Posteriormente las secuencias de Galileo han divergido dentro de cada una de las especies,
lo que podría explicar la abundancia de copias que se puede encontrar dentro del genoma
de una especie como fue el caso en D. mojavensis y D. buzzatii. El tiempo mínimo
estimado para la invasión de Galileo en el subgrupo mulleri se puede establecer con el
tiempo de divergencia del subgrupo mulleri, estimado en alrededor de 11 millones de años
(Ruso et al. 1995). La inserción de Galileo en el subgrupo repleta sin embargo no pudo ser
establecida de manera precisa con los datos obtenidos en este estudio. Una hipótesis que se
podría plantear es que la colonización en este subgrupo se llevó a cabo de manera
independiente a la del subgrupo mulleri, lo cual podría explicar las diferencias encontradas
en las secuencias amplificadas de D. fulvimacula.
No se obtuvo amplificación de Galileo en los subgrupos más basales de la filogenia
del grupo repleta como los subgrupos hydei y mercatorum. Dos explicaciones podrían ser
propuestas para estos resultados. En el primer caso la ausencia podría deberse a que la
adquisición de Galileo fue posterior a la divergencia de estos dos subgrupos hace
aproximadamente 22 millones de años (Spicer & Pitnick 1996). En el segundo caso, la
35
ausencia de Galileo podría explicarse por una pérdida estocástica de las copias (Lohe et al.
1995), lo que sería factible si en un período largo de tiempo la tasa de pérdida de
elementos por deriva génica excede la tasa de ganancia de elementos por transposición,
eventualmente no quedarían elementos remanentes en el genoma. La divergencia gradual
en las secuencias ocasionada aleatoriamente por mutaciones podría hacer que los elementos
no puedan ser identificados por PCR o hibridización de ADN. Así, la presencia de Galileo
dentro de las especies del grupo repleta detectada en este estudio podría ser un estimado
conservador tomando en cuenta que un sólo cambio nucleotídico pudo evitar que la
secuencia sea reconocida por los cebadores.
2. Dinámica de Galileo en el grupo repleta
Las relaciones filogenéticas encontradas con la transposasa de Galileo coinciden en
términos amplios con las relaciones filogenéticas obtenidas con las especies del grupo
repleta, lo que nos permite inferir que Galileo tiene una dinámica de diversificación
vertical dentro del linaje del grupo repleta. Esta hipótesis ha sido propuesta para explicar la
la persistencia y emergencia de nuevas especies de elementos L1 en mamíferos (Khan et al.
2006) y la diversificación gradual de elementos Mariner en gramíneas (Feschotte &
Wessler 2002) originados por procesos estocásticos y fundamentados en la teoría neural de
la biodiversidad (Tilman 2004, Venner et al. 2009). Aunque eventos de transferencia
horizontal han sido propuestos como un componente integral del ciclo de vida en los
transposones de clase II como Mariner y Elementos P (Kidwell 1994, Pinsker et al. 2001),
en este estudio no se encontraron evidencias de que Galileo utilice la transferencia
horizontal para su transmisión en el genoma del hospedador.
36
3. La transposasa de Galileo
El alineamiento de las secuencias traducidas mostró la presencia de inserciones,
deleciones y sustituciones que introducen codones de stop o causan cambios en el marco
de lectura. Un 39% de las transposasas amplificadas tenían un ORF de longitud completa.
Así, es probable que en el genoma de las especies del grupo repleta una gran porción de
copias de Galileo contengan transposasas inactivas. Esto ha sido observado también en
transposasas de elementos de clase II como Mariner (Feschotte & Wessler 2002). El
modelo más simple para explicar la abundancia de copias no autónomas se basa en que
podría existir una presión de selección positiva de los elementos inactivos. Esto podría ser
factible gracias a que dichos elementos pueden participar en la regulación del mecanismo
de transposición en al menos dos maneras. Primero, sirviendo como sustrato para la
transposición debido a su necesidad de una transposasa funcional, su multiplicación no
incrementa la cantidad total de transposasa producida (Lohe et al. 1997). Segundo, los
elementos inactivos tienen interferencia directa con la transposasa funcional a través de
competencia por sitios de inserción o por degradación de la transposasa con subunidades
inactivas (Lohe et al. 1996).
Las transposasas de Galileo amplificadas incluyen el primer aminoácido de la firma
molecular DD/E, que se encuentra en diversos tipos de transposasas e intregrasas. Esta
firma consiste en dos residuos de ácido aspártico, típicamente separados por más de 90
aminoácidos, seguida por un residuo de ácido glutámico (Hartl et al. 1997). La firma
molecular DD/E al parecer juega un rol importante en el mecanismo de reacción, que es
parte del sitio activo de la enzima y que sirve como dominio de acoplamiento para el cation
divalente (Mg2 o Mn2) necesario para la catálisis (Richardson et al. 2009). La característica
37
que comparten todas las proteínas que contienen esta firma es su habilidad para realizar
cortes de cadena simple en una molécula duplex de DNA y exponer un extremo 3' hidroxil
que es unido con nucleótidos dispuestos en posición opuesta a las secuencia target que será
reparada por enzimas de la célula hospedadora, creando una duplicación directa,
característica de la inserción de un elemento transponible (Craig 1995).
4. Inserciones encontradas en Galileo
No se pudo determinar con certeza la identidad de las inserciones encontradas en las
secuencias de D. mojavensis, D. aldrichi y D. wheeleri. Sin embargo previamente
elementos ISBu han sido reportados en secuencias de Galileo en D. buzzatii (Casals et al.
2005) y D. mojavensis (Marzo et al. 2008). Los ISBu son Helitrones, un tipo de
transposones de DNA que se replican por un mecanismo de círculo rodante (Kapitonov &
Jurka 2001) y se encuentran ampliamente distribuidos dentro del género Drosophila (Yang
& Barbash 2008). Los helitrones son los únicos transposones conocidos en eucariotas que
se integran en el genoma sin la introducción de TSD. Usualmente la integración de los
helitrones ocurre específicamente entre nucleótidos A y T en la secuencia del hospedador.
Los helitrones no tienen TIR, presentes en otros transposones de DNA, en su lugar han
conservado secuencias TC 5' y CTRR en el extremo 3' (Jurka et al. 2007).
La posición en la filogenia de las muestras GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri,
GAL135/aldrichi y GAL033/mojavensis que contenían insertos podría obedecer a que parte
de la secuencia de Galileo fue delecionada durante el proceso de inserción de una secuencia
exógena.
38
V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
I.
Los resultados obtenidos en este estudio extienden la distribución del elemento
transponible Galileo dentro del grupo de especies repleta de Drosophila. Galileo
está presente en al menos 16 especies de los subgrupos mulleri y repleta.
II.
Las relaciones filogenéticas encontradas con la transposasa de Galileo coinciden con
las relaciones filogenéticas obtenidas con las especies del grupo repleta lo que nos
permite inferir que Galileo tiene una dinámica de diversificación vertical dentro del
linaje del grupo repleta.
III.
No se obtuvieron evidencias de que Galileo haya utilizado el mecanismo de
Transferencia Horizontal en su distribución dentro del grupo repleta.
El hecho de que Galileo genere inversiones polimórficas por recombinación ectópica
sugiere que este elemento transponible tuvo una contribución importante en la
evolución del género Drosophila. La búsqueda de Galileo en otros grupos de especie
como los grupos willistoni y saltans que tienen un nicho ecológico diferente al grupo
repleta y entre los cuales se encuentran las especies más polimórficas del género
Drosophila es crítica para entender la dinámica y distribución de este elemento
transponible.
39
VI. BIBLIOGRAFÍA
Bächli G (2010) TaxoDros: The Database on Taxonomy of Drosophilidae, version 2010-1, last
accessed 5 January 2010. http://taxodros.unizh.ch/
Berg D & Howe M (1989) Mobile DNA Washington, DC: American Society of Microbiology.
Biémont C & Vieira CN (2006) Genetics: Junk DNA as an evolutionary force. Nature 443: 521 524.
Brandt J, Schrauth S, Veith AM, Froschauer A & Haneke T (2005) Transposable elements as a
source of genetic innovation: expression and evolution of a family of retrotransposonderived neogenes in mammals. Gene 345: 101–111.
Brookfield JF (2005) The ecology of the genome - mobile DNA elements and their hosts. Nature
reviews. Genetics 6(2):128-36.
Cáceres M, Puig M & Ruiz A (2001) Molecular characterization of two natural hotspots in the
Drosophila buzzatii genome induced by transposon insertions. Genome Research
11(8):1353-64.
Casals F, Cáceres M & Ruiz A (2003) The foldback-like transposon Galileo is involved in the
generation of two different natural chromosomal inversions of Drosophila buzzatii.
Molecular Biology and Evolution 20(5):674-85.
Casals F, Cáceres M, Manfrin MH, González J & Ruiz A (2005) Molecular characterization and
chromosomal distribution of Galileo, Kepler and Newton, three foldback transposable
elements of the Drosophila buzzatii species complex. Genetics 169(4):2047-59.
Craig NL (1995) Unity in transposition reactions. Science 270:253–54.
Delprat A, Negre B, Puig M & Ruiz A (2009) The transposon Galileo generates natural
chromosomal inversions in Drosophila by ectopic recombination. PloS One 4(11):e7883.
doi:10.1371/journal.pone.0007883
Drummond AJ, Ashton B, Buxton S, Cheung M, Heled J, Kearse M, Moir R, Stones-Havas S,
Sturrock S, Thierer T & Wilson A (2010) Geneious v5.0.
Durando CM, Baker RH, Etges WJ, Heed WB, Wasserman M & DeSalle R (2000) Phylogenetic
analysis of the repleta species group of the genus Drosophila using multiple sources of
characters. Mol Phyl and Evol 16(2):296-307.
40
Edgar RC (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high
throughput. Nucleic Acids Research 32(5): 1792-97.
Eickbush TH & Furano AV (2002) Fruit flies and humans respond differently to
retrotransposons. Curr Opin Genet Dev 12: 669–674.
Feschotte C & Wessler SR (2002) Mariner-like transposases are widespread and diverse in
flowering plants. Proc Natl Acad Sci USA 99: 280–285.
Feschotte C et al. (2003) Genome-wide analysis of mariner-like transposable elements in rice
reveals complex relationships with stowaway miniature inverted repeat transposable
elements (MITEs). Genetics 163: 747–758
Guindon S, Lethiec F, Duroux P & Gascuel O (2005) Phyml online-a web server for fast
maximum likelihood-based phylogenetic inference. Nucl Acids Res 33:557-559.
Hartl DL, Lohe AR, Lozovskaya ER (1997) Modern thoughts on an ancyent Marinere: function,
evolution, regulation. Annu Rev Genet 31:337-358.
Jurka J, Kapitonov VV, Kohany O & Jurka MV (2007) Repetitive sequences in complex
genomes: structure and evolution. Annu Rev Genomics Hum Genet 8:241-259.
Kapitonov VV & Jurka J (2001) Rolling-circle transposons in eukaryotes. Proc Natl Acad Sci
USA 98:8714–19.
Kapitonov VV & Jurka J (2003) Molecular paleontology of transposable elements in the
Drosophila melanogaster genome. Proc Natl Acad Sci USA 100:6569-6574.
Kazazian H (1998) Mobile elements and disease. Curr Opin Genet Dev 8:343-350.
Khan H et al. (2006) Molecular evolution and tempo of amplification of human LINE-1
retrotransposons since the origin of primates. Genome Res 16: 78–87.
Kidwell MG (1994) The evolutionary history of the P family of transposable elements. J Hered
85: 339-346.
Langley CH, Montgomery E, Hudson R, Kaplan, N. & Charlesworth, B. (1988) On the role of
unequal exchange in the containment of transposable element copy number. Genet Res
52: 223–235.
Lohe AR, De Aguiar D & Hartl DL (1997). Mutations in the mariner transposase: The
“D,D(35)E” consensus sequence is nonfunctional. Proc Natl Acad Sci USA 94:1293–97.
41
Lohe AR, Moriyama EN, Lidholm DA & Hartl DL (1995) Horizontal transmision, vertical
inactivation, and stochastic loss of mariner-like transposable elements. Mol Biol Evol
12:62–72.
Lohe AR, Sullivan DT, Hartl DL (1996) Genetic evidence for subunit interactions in the
transposase of the transposable element mariner. Genetics 144:1087–95.
Markow T & O’Grady PM (2006) Drosophila: A Guide to Species Identification and Use.
Academic Press, London.
Marzo M, Puig M & Ruiz A (2008) The Foldback-like element Galileo belongs to the P
superfamily of DNA transposons and is widespread within the Drosophila genus. Proc
Natl Acad Sci USA 105(8): 2957-62.
McDonald JF (1993) Transposable Elements and Evolution. Dodrect, The Netherlands: Kluver.
Medstrand P, van de Lagemaat LN, Dunn CA, Landry JR, Svenback D, & Mager DL (2005)
Impact of transposable elements on the evolution of mammalian gene regulation.
Cytogenet Genome Res 110 (1-4): 342-52.
Morán T & Fontdevila A (2005) Phylogeny and molecular evolution of the Drosophila hydei
subgroup (Drosophila repleta group) inferred from the Xanthine dehydrogenase gene.
Mol Phyl Evol: 36(3):695-705.
O'Grady PM, Durando CM, Heed WB, Wasserman M, Etges W &DeSalle R (2002) Genetic
divergence within the Drosophila mayaguana subcluster, a closely related triad of
Caribbean species in therepleta species group. Hereditas 136:240-245.
Oliveira DC, Wintermute EH, Etges WJ, Heed WB, O'Grady PM & Desalle R. (2003)
Hierarchical structure in the Drosophila mojavensis cluster (Diptera: Drosophilidae).
Hereditas 139(3):223-227.
Oliveira DC, Grady PM, Etges WJ, Heed WB & Desalle RO (2005) Molecular systematics and
geographical distribution of the Drosophila longicornis species complex (Diptera:
Drosophilidae). Zootaxa: 321 -332.
Pinsker W, Haring E, Hagemann S & Miller WJ (2001) The evolutionary life history of P
transposons: from horizontal invaders to domesticated neogenes. Chromosoma 110: 148158.
42
Puig M, Cáceres M & Ruiz A (2004) Silencing of a gene adjacent to the breakpoint of a
widespread Drosophila inversion by a transposon-induced antisense RNA. Proc Natl
Acad Sci USA 101(24):9013-9018.
Rafael V & Arcos G (1989) Subgrupo inca, un nuevo subgrupo del grupo repleta, con
descripción de Drosophila huancavilcae N.SP. (Diptera, Drosophilidae). Evol Biol 3:233243.
Reed LK & Markow TA (2004) Early events in speciation: polymorphism for hybrid male
sterility in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA 101:9009-9012.
Reed LK, Nyboer M & Markow T (2007) Evolutionary relationships of Drosophila mojavensis
geographic host races and their sister species Drosophila arizonae. Mol Ecol 16(5):10071022.
Richardson JM, Colloms SD, Finnegan DJ & Walkinshaw MD (2009) Molecular architecture of
the Mos1 paired-end complex: the structural basis of DNA transposition in a eukaryote.
Cell 138(6):1096-10108.
Ruiz A, Wasserman M & Heed WB (1990) Evolution of the mojavensis cluster of cactophilic
Drosophila with descriptions of two new species. Heredity 81: 30–42.
Ruiz A & Wasserman M (1993) Evolutionary cytogenetics of the Drosophila buzzatii species
complex. Heredity 70:582-96.
Russo C, Takezaki N & Nei M (1995) Molecular phylogeny and divergence times of drosophilid
species. Molecular biology and evolution 12(3):391-404.
Sambrook J & Russell DW (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual. 3rd ed, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York.
Silva JC, Loreto EL & Clark JB (2004) Factors that affect the horizontal transfer of transposable
elements. Current issues in molecular biology 6(1):57-71.
Singh ND & Petrov DA (2004) Rapid sequence turnover at an intergenic locus in Drosophila.
Mol Biol Evol 21:670-680.
Spicer GS & Pitnick S (1996) Molecular systematics of the Drosophila hydei subgroup as
inferred from mitochondrial DNA sequence. J Mol Evol 43(3):281-286.
Tilman D (2004) Niche tradeoffs, neutrality, and community structure: a stochastic theory of
resource competition, invasion, and community assembly. Proc Natl Acad Sci USA 101:
10855–10861.
43
Venner S, Feschotte C & Biémont C (2009) Dynamics of transposable elements: towards a
community ecology of the genome. Trends in Genetics 25(7):317-323.
Vilela CR (1983) A revision of the Drosophila repleta species group (Diptera, Drosophilidae).
Rev Bras Entomol 27:1- 114.
Wasseman M (1960) Cytological and phylogenetic relationships in the repleta group of the genus
Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA 46:842-859.
Wasserman M (1982) Evolution of the repleta group. In: Ashburner M, Carson HL and
Thompson JN (eds) The Genetics and Biology of Drosophila. v. 3b. Academic Press,
London, pp. 61–139.
Wasserman M (1992) Cytological evolution of the Drosophila repleta species group. In: Krimbas
CB and Powell JR (eds) Drosophila Inversion Polymorphism. CRC Press, Boca Raton,
pp. 455-555.
Wessler S (2006) Eukaryotic transposable elements: teaching old genomes new tricks. In: L.
Caporale, Editor, The Implicit Genome, Oxford University Press, Oxford, pp. 138–165.
Yang H & Barbash D (2008) Abundant and species-specific DINE-1 transposable elements in 12
Drosophila genomes. Genome Biology 9(2):39-45.
44
VII. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no se habría podido realizar sin la colaboración de varias personas que
me han brindado su ayuda, sus conocimientos y su apoyo.
Quiero agradecer en primer lugar a mi familia porque a pesar de la distancia, el
ánimo, apoyo y alegría que me brindan me dan la fortaleza necesaria para seguir adelante.
Quedo especialmente agradecida con mis dos directores de tesis. El Dr. Alfredo
Ruiz que me acogió en su grupo de trabajo y corrigió minuciosamente esta tesina, le
agradezco sinceramente su confianza y todo el apoyo que me ha brindado. Al Dr.
Deodoro Oliveira le agradezco por su paciencia, disponibilidad y generosidad para
compartir sus conocimientos. Sin su ayuda y consejos yo no habría podido realizar este
trabajo.
Mis sinceros agradecimientos para la Dra. Violeta Rafael, la Dra. Laura Arcos
Terán y la Dra. Mar Marzo. Gracias a mis compañeras Nuria Rius y Yolanda Guillen con
quienes compartí gratos momentos durante el trabajo y para la Dra. Alejandra Delprat por
su guía al inicio de este estudio.
Finalmente, quiero agradecer las instituciones que me han apoyado para la
realización de este Máster. A la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología del Ecuador
SENACYT por haberme concedido la Beca de Fortalecimiento Humano 2009, a la
Universidad Católica del Ecuador y a la Universidad Autónoma de Barcelona.
45