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EFECTO DE LA INFECCIÓN CON Leishmania panamensis, L. mexicana Y L.
donovani SOBRE LA APOPTOSIS DE MACRÓFAGOS U937.
ANDREA CISNEY ARÉVALO CORTÉS
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
IBAGUÉ
2011
EFECTO DE LA INFECCIÓN CON Leishmania panamensis, L. mexicana Y L.
donovani SOBRE LA APOPTOSIS DE MACRÓFAGOS U937.
ANDREA CISNEY ARÉVALO CORTÉS
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al Título de
Magíster en Ciencias Biológicas
Directora: LILIANA VALDERRAMA M.Sc.
Codirector: GUSTAVO ADOLFO VALLEJO M.Sc., Ph.D.
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
IBAGUÉ
2011
2
NOTA DE ACEPTACIÓN
3
A mi madre, quien me ha enseñado
con su ejemplo, el talento infinito
de la fortaleza y la perseverancia.
4
AGRADECIMIENTOS
A Dios y a la Santísima Vírgen María.
A mis padres Aurora y Alfonso, y mis hermanos Diana, César y Manuel por su
amor, apoyo, comprensión y colaboración, en los momentos de dificultad. No
tengo palabras para expresar lo valiosas que fueron todas sus manifestaciones de
cariño y apoyo cuando el viento arrecio en mi contra. ¡Este trinfo es para ustedes!
A Dani, por su amor sincero, ternura, cariño, comprensión y ayuda infinita e
incondicional. Gracias por sus consejos, por animarme y ser mi soporte en estos
últimos años de mi formación de postgrado. ¡Te amo!
A Liliana Valderrama por su apoyo, ayuda y comprensión. Aprendí mucho de su
trabajo. Gracias por sus palabras de aliento cuando sentía desfallecer y porque
con su grado de exigencia, día a día crecí y logré dar lo mejor de mí.
A la Dra. Nancy Saravia por su conocimiento científico, experiencia y apoyo.
A Adriana Cruz, por sus recomendaciones científicas, sugerencias y ayuda.
Muchas gracias.
A Mabel Valderrama por su disposición para colaborarme en lo que fuera con
microscopía. ¡Mil y mil gracias por tu ayuda y trabajo!
A Alejita, no solo por la colaboración en el laboratorio, sino porque me brindó la
mano cuando más lo necesité. Gracias por sus palabras, por hacerme reir…por su
positivismo. Para ella y para toda su familia gracias infinitas y sinceras por
hacerme un miembro más de su hogar.
Al Dr. Gustavo Vallejo, gracias por todos sus conocimientos científicos. Por ser un
excelente Maestro durante todo mi proceso académico y científico en pregrado y
maestría. Gracias por sus sabios consejos.
Al Laboratorio de Materiales del CIDEIM, su ayuda fue siempre la mejor.
A la Sra Beatríz Herrera, por su valiosa colaboración en la búsqueda bibliográfica.
Al Banco de Cepas del CIDEIM.
A las entidades: CIDEIM, COLCIENCIAS-Programa Joven Investigador, National
Institutes of Health U.S.A. y FOGARTY U.S.A. por el apoyo financiero y científico.
5
CONTENIDO
pág.
INTRODUCCIÓN
16
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
17
2. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES
18
2.1 GENERALIDADES SOBRE LEISHMANIASIS
18
2.1.1 Formas clínicas
18
2.1.2 Epidemiología
18
2.1.3 Transmisión y persistencia
19
2.1.4 Mecanismos de persistencia de Leishmania en el macrófago
20
2.2 GENERALIDADES SOBRE APOPTOSIS
21
2.2.1 Vías de inducción de apoptosis
22
2.2.1.1 Vía intrínseca o mitocondrial
22
2.2.1.2 Vía extrínseca o de los receptores de muerte
23
2.2.2 Drogas que se emplean para la inducción de apoptosis
24
2.3 APOPTOSIS E INFECCIÓN
25
2.3.1 Efecto de la apoptosis del parásito Leishmania sobre el curso de la
infección
26
2.3.2 Efecto de la infección con microorganismos intracelulares sobre la
apoptosis de la célula hospedera
28
3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
38
6
pág.
3.1 OBJETIVO GENERAL
38
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
38
3.3 HIPÓTESIS
38
4. DISEÑO METODOLÓGICO
39
4.1 PARÁSITOS
39
4.2 DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL 50 (DL50) A LA NEOMICINA
39
4.3 TRANSFECCIÓN DE L. panamensis, L. mexicana Y L. donovani
39
4.4 CULTIVO DE PROMASTIGOTES DE L. panamensis, L. mexicana Y L.
donovani
43
4.5 CULTIVO DE LA LÍNEA CELULAR U-937
44
4.6 DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS U-937
44
4.7 INFECCIÓN DE MACRÓFAGOS U-937
45
4.8 INDUCCIÓN DE APOPTOSIS
45
4.9 TINCIÓN CON Annexin V-PE Y 7AAD PARA MEDIR LOS NIVELES
DE EXTERIORIZACIÓN DE LA FOSFATIDILSERINA EN MACRÓFAGOS
U-937
46
4.10 TINCIÓN DE TUNEL PARA MEDIR LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN
EN MACRÓFAGOS U-937
47
4.11 TINCIÓN CON Syto 16 Y Annexin V-Alexa 568 PARA MEDIR LA
VIABILIDAD DE Leishmania DENTRO DEL MACRÓFAGO APOPTÓTICO
49
4.11.1 Evaluación de las láminas por microscopía de fluorescencia
50
5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
52
7
pág.
6. RESULTADOS
53
6.1 LA INFECCIÓN CON ESPECIES DE Leishmania TIENE EFECTO
SOBRE LA APOPTOSIS Y NO SOBRE LA NECROSIS DEL
MACRÓFAGO
53
6.2 EFECTO DIFERENCIAL DE LA INFECCIÓN CON ESPECIES DE
Leishmania EN LA APOPTOSIS DEL MACRÓFAGO DETERMINADA
POR EXTERIORIZACIÓN DE FOSFATIDILSERINA
55
6.3 EFECTO DIFERENCIAL DE ESPECIES DE Leishmania EN LA
APOPTOSIS DEL MACRÓFAGO, DETERMINADA POR
FRAGMENTACIÓN DEL ADN
58
6.4 LOS AMASTIGOTES DE L. panamensis, L. mexicana Y L. donovani
SOBREVIVIERON A LA APOPTOSIS DEL MACRÓFAGO
61
6.5 EMISIÓN DE FLUORESCENCIA DE LAS CEPAS L. panamensis, L.
mexicana Y L. donovani TRANSFECTADAS CON GFP
69
6.6 LOS PORCENTAJES DE INFECTIVIDAD MEDIDOS POR GFP Y
GIEMSA NO CAMBIARON EN EL TIEMPO PARA L. panamensis,
MIENTRAS QUE PARA L. mexicana Y L. donovani PRESENTARON
DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS EN ALGUNOS PUNTOS EN EL
TIEMPO
70
6.7 L. panamensis Y L. mexicana SON MAS INFECTIVAS QUE L.
donovani
72
6.8 LA CARGA PARASITARIA DE LAS TRES ESPECIES DE Leishmania
EVALUADAS NO AFECTÓ LA APOPTOSIS DEL MACRÓFAGO
74
6.9 LA EMISIÓN DE GFP SE AFECTÓ POR ACCIÓN DE LA ESPECIE
DE Leishmania Y DEL TRATAMIENTO DE APOPTOSIS
77
7. DISCUSIÓN
79
8
pág.
8. CONCLUSIONES
85
9. PERSPECTIVAS
86
REFERENCIAS
87
9
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Vías de señalización de la apoptosis: intrínseca y extrínseca
24
Figura 2. Infección del neutrófilo granulocito polimorfonuclear (PMN) y el
macrófago con L. major
27
Figura 3. Estrategias de Leishmania para invadir e inactivar la célula
hospedera
30
Figura 4. Vector pSP72αNEOαGFP
40
Figura 5. Metodología de transfección de GFP en cepas de L.
panamensis, L. mexicana y L. donovani utilizando el vector
pSP72αNEOαGFP
41
Figura 6. Estrategia experimental para medir los niveles de fosfatidilserina
de macrófagos U937 infectados con L. panamensis, L. mexicana y L.
donovani usando la tinción de Annexin V-PE y 7AAD
47
Figura 7. Estrategia experimental para medir el nivel de fragmentación de
ADN en macrófagos humanos de la línea U937 infectados con L.
panamensis, L. mexicana y L. donovani usando el ensayo de TUNEL
48
Figura 8. Estrategia experimental para medir la viabilidad de amastigotes
de L. panamensis, L. mexicana y L. donovani en macrófagos humanos
apoptóticos mediante tinción con Syto16 y Annexin V-Alexa 568 por
microscopía de fluorescencia
50
Figura 9. Efecto de la infección con L. panamensis, L. mexicana y L.
donovani en la muerte celular de macrófagos humanos de la línea U937 a
las 8, 24, 48 y 72 horas post-tratamiento
54
Figura 10. Porcentaje de macrófagos humanos de la línea celular U937
Annexin V+ a las 8, 24, 48 y 72 horas post-tratamiento con los inductores:
Estaurosporina, Camptothecina y D-PBS
55
10
pág.
Figura 11. Efecto de la infección con L. panamensis, L. mexicana y L.
donovani en la exteriorización de fosfatidilserina de macrófagos humanos
de la línea celular U937 a las 8, 24, 48 y 72 horas post-tratamiento, en
ausencia o presencia de inductor
57
Figura 12. Porcentaje de macrófagos humanos de la línea celular U937
BrdU-Red+ a las 24 y 72 horas post-tratamiento con los inductores:
Estaurosporina, Camptothecina y D-PBS
58
Figura 13. Efecto de la infección con L. panamensis, L. mexicana y L.
donovani en la fragmentación del ADN de macrófagos humanos de la línea
celular U937 a las 24 y 72 horas post-tratamiento, en ausencia o presencia
de inductor
60
Figura 14. Microscopia de fluorescencia de macrófagos humanos de la
línea celular U937 marcados con Syto16 y Annexin V-Alexa 568
62
Figura 15. Macrófagos apoptóticos humanos de la línea celular U937
evaluados en sobrenadante y laminilla a las 24 y 72 horas post-tratamiento
en ausencia o presencia de inductor
63
Figura 16. Microscopia de fluorescencia de macrófagos apoptóticos
conteniendo amastigotes de Leishmania vivos (Syto16+b)
65
Figura 17. Microscopia de fluorescencia de macrófagos apoptóticos
conteniendo amastigotes de Leishmania vivos en prolongaciones (blebs) y
en cuerpos apoptóticos
66
Figura 18. Macrófagos apoptóticos humanos de la línea celular U937 con
parásitos intracelulares Syto16+ brillantes (Syto16+b) ó vivos de L.
panamensis, L. mexicana ó L. donovani a las 24 y 72 horas posttratamiento en ausencia o presencia de inductor
68
Figura 19. Porcentaje de emisión de fluorescencia de GFP determinada
por citometría de flujo
69
Figura 20. Microscopía de fluorescencia de las cepas L. panamensis, L.
mexicana y L. donovani transfectadas con GFP
70
Figura 21. Porcentaje de infección en macrófagos humanos de la línea
celular U-937 infectados con L. panamensis GFP, L. mexicana GFP y L.
donovani GFP determinados por GIEMSA y porcentaje de GFP+
71
11
pág.
Figura 22. Porcentaje de infección en macrófagos humanos de la línea
celular U-937 con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani evaluados
por GIEMSA, porcentaje de GFP+ y carga parasitaria
73
Figura 23. Análisis de correlación entre la externalización de fosfatilserina
y la carga parasitaria en macrófagos U937 infectados con L. panamensis,
L. mexicana y L. donovani
75
Figura 24. Análisis de correlación entre la fragmentación del ADN y la
carga parasitaria en macrófagos U937 infectados con L. panamensis, L.
mexicana y L. donovani
76
Figura 25. Porcentajes de macrófagos humanos de la línea celular U-937
GFP+ con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani determinados por
citometría de flujo
78
12
LISTA DE CUADROS
pág.
Cuadro 1. Efecto de microorganismos intracelulares sobre la apoptosis de
la célula hospedera
32
Cuadro 2. Protocolos de electroporación usados para L. panamensis, L.
mexicana y L. donovani
42
Cuadro 3. Condiciones de cultivo de las líneas L. panamensis GFP012, L.
mexicana GFP013 y L. donovani GFP019
44
13
RESUMEN
Algunos organismos intracelulares inhiben la apoptosis de su célula hospedera, lo
que les permite sobrevivir, replicarse y protegerse del ataque directo del sistema
inmunitario. Otros en cambio, pueden inducirla para garantizar la fagocitosis por
parte de otra célula hospedera y perpetuar la infección.
Con el fin de establecer si diferentes subgéneros de especies de Leishmania usan
la apoptosis para promover la persistencia de la infección, se evaluó el efecto de la
infección con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani en la apoptosis de
macrófagos humanos de la línea U937. En el presente trabajo, L. donovani se
utilizó como control, ya que esta especie inhibe la apoptosis de la célula
hospedera.
Hasta el momento no se conoce si las especies de Leishmania del subgénero
Viannia inducen o inhiben la apoptosis de las células hospederas, razón que
fundamenta el trabajo que se ha planteado en el presente estudio.
Para este trabajo se infectaron macrófagos humanos U937 con L. panamensis, L.
mexicana y L. donovani. Los macrófagos infectados y no infectados se trataron
con inductores de apoptosis: estaurosporina, camptothecina y D-PBS, durante 8,
24, 48 y 72 horas. Mediante citometría de flujo, se evaluó la exteriorización de
fosfatidilserina con Annexin V-PE y 7AAD y la fragmentación de ADN con el
ensayo de TUNEL. Además, se determinó la viabilidad de amastigotes en células
apoptóticas mediante tinción con Syto 16 (viabilidad) y Annexin V-Alexa 568
(apoptosis), mediante microscopía de fluorescencia.
En este trabajo se observó que la infección con L panamensis indujo
exteriorización de fosfatidilserina en el macrófago. Ésta no modificó los niveles de
dicho fosfolípido del macrófago frente a un estímulo de apoptosis como
estaurosporina, camptothecina y D-PBS. Además, esta especie no inhibió, ni
indujo la fragmentación del ADN de la célula hospedera. L. mexicana, por su parte,
no produjo efecto en la externalización de la fosfatidilserina del macrófago, pero
inhibió de forma significativa la fragmentación del ADN en el mismo. La infección
con L. donovani inhibió la externalización de la fosfatidilserina y la fragmentación
del ADN de la célula fagocítica. Aunque L. panamensis y L. mexicana fueron más
infectivas que L. donovani no fue posible correlacionar la infectividad con el efecto
que causan las especies sobre la apoptosis del macrófago.
Estos resultados serán importantes para considerar que el fenómeno de
persistencia en la leishmaniasis puede estar relacionado a un evento de inducción
de la externalización de fosfatidilserina, ya que es una señal de “silenciamiento”
del mecanismo efector del macrófago. Además, en el presente trabajo se
comprobó que en las células apoptóticas sobrevivieron los amastigotes de las tres
14
especies de Leishmania evaluadas y se observaron parásitos vivos dentro de
cuerpos apoptóticos que pueden ser la forma para pasar desapercibidos por el
sistema inmune y lograr perpetuar la infección en su hospedero definitivo, el
macrófago.
Palabras claves: Apoptosis, Leishmania, macrófago, inhibición, inducción,
persistencia.
15
INTRODUCCIÓN
Las razones primordiales para administrar terapia sistémica en la leishmaniasis
cutánea causada por especies de Leishmania del subgénero Viannia son la
persistencia de infección y el riesgo de su reactivación, especialmente en tejidos
mucosos de la nasofaringe. Lesiones nuevas en personas previamente infectadas
son frecuentes en focos endémicos, donde una alta proporción de la población ha
sido expuesta. La persistencia de la infección tiene entonces implicaciones en la
prevención y en el manejo clínico de la leishmaniasis causada por especies de
este subgénero, el cual predomina en el territorio colombiano y al que se le
atribuye el mayor número de casos de leishmaniasis cutánea y mucosa.
Trabajos realizados por otros investigadores han planteado que la fagocitosis
silente de neutrófilos apoptóticos infectados con Leishmania por parte de
macrófagos está relacionada con persistencia de la infección. Así mismo, la
apoptosis puede estar implicada en el silenciamiento de la repuesta inmune a
causa de inóculos infectivos de Leishmania junto con células apoptóticas. Ambas
situaciones favorecerían el establecimiento de infecciones productivas.
El efecto de la infección por parásitos de Leishmania sobre la apoptosis de la
célula hospedera se ha investigado únicamente en las especies del subgénero
Leishmania, principalmente en las especies del viejo Mundo como L. major, L.
donovani, L. tropica, L. aethiopica y L. infantum y sólo en dos del nuevo Mundo
como L. amazonensis y L. pifanoi. Debido al desconocimiento de este tópico en
las especies del subgénero Viannia y en la mayoría de las del nuevo Mundo para
el subgénero Leishmania, resulta necesario investigar en este tema especialmente
en las especies que circulan en Colombia.
En este trabajo se evaluó el efecto de la infección con L. panamensis o L.
mexicana en la apoptosis de macrófagos humanos de la línea U937. La primera es
la principal especie del subgénero Viannia que causa el 75% de los casos de
leishmaniasis cutánea americana en Colombia. La segunda es la especie más
importante del subgénero Leishmania en ocasionar los casos en el país. En el
presente trabajo, se utilizó L. donovani como control, esta especie no ocasiona
casos en el nuevo Mundo, pero se usó como referencia ya que inhibe la apoptosis
de la célula hospedera.
Las estrategias experimentales in vitro realizadas en este trabajo permitieron
dilucidar la relación entre el efecto que ocasiona la infección por Leishmania en la
apoptosis del macrófago y si este evento puede permitir la supervivencia del
parásito dentro de la célula hospedera. Lo anterior, contribuirá al conocimiento de
la inmunopatogénesis de la leishmaniasis cutánea americana en Colombia.
16
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la leishmaniasis tegumentaria causada por especies de Leishmania del
subgénero Viannia es común observar casos de cronicidad y reactivación de las
lesiones, indicando persistencia del parásito. Los mecanismos involucrados son
aún desconocidos.
Aunque se ha considerado que la apoptosis de la célula hospedera resulta en la
eliminación de los patógenos intracelulares, se ha demostrado que la fagocitosis
de neutrófilos apoptóticos infectados con L. major permite la infección silente de
macrófagos.
Además especies como L. donovani, L. major, L. pifanoi, L. amazonensis y L.
infantum inhiben la apoptosis de la célula hospedera con el fin de protegerse del
ataque directo del sistema inmune, para sobrevivir y multiplicarse dentro de ésta.
En el presente trabajo se plantea que la modulación de la apoptosis del macrófago
por parte de Leishmania podría ser un mecanismo del parásito para favorecer la
persistencia de la infección. Por tanto, se determinará el efecto de la infección con
L. panamensis, L. mexicana y L. donovani en la apoptosis de macrófagos
humanos U937 y se establecerá si estos parásitos sobreviven a la apoptosis del
macrófago.
La especie L. donovani será usada como control en este estudio. Sin embargo, el
efecto de la infección con esta especie en la apoptosis espontánea de macrófagos
humanos U937 e inducida con tres estímulos diferentes: estaurosporina,
camptothecina o D-PBS es una propuesta novedosa.
17
2. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES
2.1 GENERALIDADES SOBRE LEISHMANIASIS
La leishmaniasis es una enfermedad causada por parásitos protozoos
pertenecientes al género Leishmania, los que son transmitidos al hombre por
insectos hembras hematófagos Phlebotominae del género Lutzomyia en el nuevo
Mundo y Phlebotomus en el viejo Mundo. La leishmaniasis es considerada por la
Organización Mundial de la Salud (OMS, 2009) como una enfermedad tropical
desatendida que prevalece en la población pobre y marginada que vive en zona
rural. Puede causar deformidades de por vida, discapacidad o incluso la muerte.
2.1.1 Formas clínicas. Las formas clínicas de la enfermedad en los humanos son:
cutánea, mucocutánea, cutánea difusa, cutánea diseminada, visceral o kala azar y
dérmica post-kala azar. Dependiendo de la respuesta inmune del hospedero
humano y de la especie de Leishmania, la infección con el parásito puede
desarrollarse de forma asintomática, producir lesiones moderadas en la piel o por
el contrario lesiones difundidas ó destructivas como las de la mucosa orofaríngea.
En la forma visceral la infección puede infiltrarse en el bazo y la médula ósea
produciendo una enfermedad sistémica que conduce a la muerte del paciente
(Ashford, 2000; David & Craft, 2009; Desjeux, 2004; Herwaldt, 1999; Travi &
Montoya – Lerma, 1994; World Health Organization [WHO], 2010).
La forma visceral se produce por infección con especies del subgénero
Leishmania, L. donovani o L. infantum en el viejo Mundo y por L. chagasi u
ocasionalmente L. amazonensis en las américas. Las leishmaniasis
tegumentarias, es decir que involucran la piel y las mucosas, pueden ser
producidas por especies del subgénero Leishmania como L. tropica, L. major y L.
aethiopica en el viejo Mundo y en el nuevo Mundo por L. mexicana, L.
amazonensis, L. venezuelensis, L. pifanoi y L. garnhami o por especies del
subgénero Viannia: L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis, L. peruviana, L.
lainsoni, L. colombiensis, L. shawi, L. naïffi y L. lindenbergi (Ashford, 2000; David
& Craft, 2009; El-On, 2009; Herwaldt, 1999; Travi & Montoya – Lerma,1994; WHO,
2010). Las especies de Leishmania del subgénero Viannia, se destacan por
ocasionar infecciones cutáneas crónicas y recurrentes con compromiso mucoso o
cutáneo (de Oliveira Guerra et al., 2011; Figueroa et al., 2009; Mendoça et al.,
2004; Schubach et al., 1998a).
2.1.2 Epidemiología. Anualmente, se registran de 1.5 a 2 millones de casos
nuevos para la leishmaniasis cutánea y 500.000 casos para la forma visceral a
nivel mundial (David & Craft, 2009; Desjeux, 2004; Herwaldt, 1999; WHO, 2010).
En Colombia, el reporte de casos de leishmaniasis se ha incrementado en los
18
últimos años. Para el año 2007 se notificaron 6014 casos, 9512 para el año 2008,
15477 para el 2009 y 14722 casos para el 2010. La leishmaniasis es una patología
endémica en todo el territorio colombiano, excepto en San Andrés Islas, Atlántico y
Bogotá. Se presentan tres formas clínicas de la enfermedad: la cutánea con un
98.6%, la mucocutánea con un 0.96% y la visceral con un 0.5% (Instituto Nacional
de Salud [INS], 2010; Sivigila, semana epidemiológica 52 de 2010).
Las especies del subgénero Viannia son las más ampliamente distribuidas en
Colombia y responsables del mayor número de casos de leishmaniasis cutánea y
mucosa. En este subgénero predomina L. panamensis con un 75% de los casos,
mientras que L. braziliensis es responsable de un 15% y L guyanensis de un 3%.
Del subgénero Leishmania se reportan casos ocasionados por L. mexicana con un
5% y L. amazonensis con un 2% (Ovalle, Porras, Rey, Rios, & Camargo, 2006;
Rodríguez-Barraquer et al., 2008; Saravia et al., 1998; Saravia et al., 2002).
2.1.3 Transmisión y persistencia. La transmisión de la leishmaniasis puede darse
en ciclos zoonótico o antroponótico. En el ciclo zoonótico, los vectores se
alimentan de reservorios mamíferos silvestres y domésticos (Ashford, 2000; David
& Craft, 2009; Desjeux, 2004; Herwaldt, 1999; Travi & Montoya – Lerma,1994;
WHO, 2010). En el ciclo antroponótico, el reservorio es el humano. Se acepta que
las especies del subgénero Viannia se transmiten principalmente por un ciclo
zoonótico. Sin embargo, aún no se han identificado con precisión los reservorios, y
el papel de la transmisión antroponótica y los individuos con infección asintomática
como reservorios aún no son claros (Ashford 2000, WHO, 2010).
En pacientes con leishmaniasis cutánea americana activa ocasionada por
especies de este subgénero se ha reportado diseminación de parásitos vivos de
Leishmania a tejidos no afectados como piel, mucosa nasal, amígdalas, conjuntiva
y monocitos de sangre, en una alta proporción (Figueroa et al., 2009; Romero et
al., 2010; Vergel et al., 2006). Adicionalmente, la cura clínica de la leishmaniasis
cutánea americana raramente se asocia con una cura estéril; es decir, que los
parásitos nunca desaparecen aún después de tratamiento y cura clínica. La
persistencia de Leishmania se ha comprobado en sangre periférica, en cicatrices,
en piel no afectada y en monocitos de pacientes tratados y curados (Coutinho,
Pirmez & Da-Cruz, 2002; Guevara et al., 1993; Haddad et al., 1996; Mendoça et
al., 2004; Oliveira-Neto, Mattos, Souza, Fernandes & Pirmez, 1998; Schubach et
al., 1998a; Schubach et al., 1998b; Vergel et al., 2006).
De acuerdo con lo anterior, los parásitos de Leishmania circulan a través del
cuerpo durante la enfermedad activa y después de la resolución clínica de las
lesiones (Coutinho et al., 2002; Figueroa et al., 2009; Guevara et al., 1993;
Haddad et al., 1996; Mendoça et al., 2004; Oliveira-Neto et al., 1998; Romero et
al., 2010; Schubach et al., 1998a; Schubach et al., 1998b; Vergel et al., 2006).
Esta persistencia de la infección en la leishmaniasis cutánea americana favorece
19
la reactivación posterior a la presentación del primer episodio de la enfermedad y
promueve el desarrollo de una resistencia al tratamiento con antimonio, lo que
puede originar una enfermedad recurrente (Mendoça et al., 2004; Rojas et al.,
2006; Schubach et al., 1998a; Vergel et al., 2006).
2.1.4 Mecanismos de persistencia de Leishmania en el macrófago. El parásito es
inoculado por la picadura del vector en forma de promastigote flagelado. Los
promastigotes ingresan a la célula blanco, el macrófago, y se transforman en
amastigotes. Para sobrevivir dentro de las vacuolas parasitóforas, los parásitos
deben interferir con la activación del macrófago, la cual se produce por acción de
la respuesta inmune tipo Th1 y culmina con la producción de moléculas
leishmanicidas, principalmente radicales libres del oxígeno y óxido nítrico (ON)
(Bhardwaj, Srivastava, Sudan & Saha, 2010; Kima, 2007; Kumar Basu & Ray,
2005).
La entrada de Leishmania a la célula hospedera es mediada por receptores que
reconocen moléculas que están sobre la superficie del parásito, tales como el
lipofosfoglicano (LPG). Los macrófagos presentan sobre su superficie, receptores
que reconocen al parásito y permiten la fagocitosis de una manera “silente”, es
decir, sin activar la función bactericida del macrófago. Los principales receptores
que se han descrito para la entrada “silente” de Leishmania son: el receptor 3 del
complemento (CR3), los receptores Fc (FcR), el receptor de la fosfatidilserina y el
receptor de manosa (MR) (Bhardwaj et al., 2010; Carter, Whitcomb, Campbell,
Mukbel & McDowell, 2009; Chu, Thomas, Patel & Buxbaum, 2010; Kima, 2007;
Kumar Basu & Ray, 2005; Miles, Conrad, Alves, Jeronimo & Mosser, 2005;
Thomas & Buxbaum, 2008; Von Stebut, 2007).
Una vez dentro del macrófago, los amastigotes de Leishmania pueden modular
múltiples vías de señalización que alteran la respuesta de activación del
macrófago, evitando su eliminación. En la célula hospedera, las señales son
traducidas en cascadas de quinasas y fosfatasas a través de los ciclos de
fosforilación y desfosforilación, en los que interfiere Leishmania para garantizar su
supervivencia (Bhardwaj et al., 2010; Kima, 2007).
La respuesta Th1 que controla la infección, se inicia cuando se enlaza el marcador
CD40 del macrófago con su ligando CD40-L. Este enlace, estimula la fosforilación
de p38MAPK que induce la producción de interleucina (IL)-12. El desarrollo de la
respuesta Th1 depende de la presencia de IL-12. Sin embargo, en infecciones con
Leishmania, la unión del ligando con CD-40 decrece la fosforilación de p38MAPK y
por consiguiente decrece la expresión de IL-12. Mientras que, induce la
fosforilación de ERK1/2 que incrementa la producción de IL-10, un potente
inhibidor de la activación del macrófago, polarizando la respuesta hacia Th2,
favoreciendo la susceptibilidad al patógeno (Bhardwaj et al., 2010; Kima, 2007).
20
Los receptores CR3 y FcR también se han asociado a la alteración de la respuesta
de las citocinas IL-12 e IL-10. La fagocitosis de Leishmania mediada por el
receptor CR3 se ha asociado con la inhibición en la producción de IL-12 (Carter et
al., 2009; Marth & Kelsall, 1997; Von Stebut, 2007). Por su parte, el receptor
FcγRIII del macrófago, cuando se enlaza a la IgG1 que opsoniza a Leishmania,
también induce la producción de IL-10, la cual suprime la producción de IL-12
(Chu et al., 2010; Miles et al., 2005; Thomas & Buxbaum, 2008).
El interferón gamma (IFN-γ) producido por los linfocitos Th1 juega un papel crítico
en el control de la infección de Leishmania, al inducir la producción de óxido nítrico
(ON) en el macrófago. Sin embargo, la IL-10, producida durante la infección con
Leishmania, inhibe el IFN-γ, suprimiendo la producción de ON y favoreciendo la
persistencia de la infección (Balestieri et al., 2002; Bhardwaj et al., 2010; Kima,
2007; Kumar Basu & Ray, 2005).
Así mismo, la proteína quinasa C (PKC) del macrófago, es la responsable de la
fosforilación de las subunidades p47 y p67, componentes de la NADPH oxidasa, la
cual es responsable de la generación del anión superóxido, indispensable para
eliminar microorganismos intracelulares. No obstante, el LPG, molécula de
superficie de Leishmania, inhibe la activación de la PKC y subsecuentemente todo
el proceso descrito, para favorecer su supervivencia (Bhardwaj et al., 2010; Kima,
2007; Kumar Basu & Ray, 2005).
Otro proceso del cual se vale Leishmania para sobrevivir dentro del macrófago es
la apoptosis, tanto la propia como la alteración de la apoptosis de la célula
hospedera. Por tratarse del tema central de este trabajo, se resumen las
generalidades de apoptosis antes de detallar el papel de este proceso en la
persistencia del parásito dentro del macrófago.
2.2 GENERALIDADES SOBRE APOPTOSIS
La apoptosis es una forma de muerte celular en la que una secuencia programada
de eventos conduce a la eliminación de la célula sin liberar sustancias dañinas
hacia el exterior. Es un tipo de muerte celular programada (MCP), término que
también abarca a la necrosis y la autofagia. La MCP es un proceso esencial para
el desarrollo embrionario y el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos de
los adultos. Por medio de ésta se eliminan las células dañadas, infectadas o
transformadas (Elmore, 2007; Kroemer et al., 2009).
21
La apoptosis se caracteriza por activación de caspasas, degradación del
citoesqueleto, reducción del volumen de la célula ocasionado por la deshidratación
celular, lo que conlleva a la condensación del citoplasma y cambios en la forma y
el tamaño celular. Plegamiento de la membrana plasmática, llamada zeiosis, que
termina en un desprendimiento de partes de la célula, conocidos como cuerpos
apoptóticos (Elmore, 2007; Hengartner, 2000; Heussler, Küenzi & Rottenberg,
2001; Kroemer et al., 2009).
Otros cambios incluyen la expresión de ligandos para los receptores de las células
fagocíticas profesionales (macrófagos y células dendríticas), como la exposición
del fosfolípido fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática.
Condensación de la cromatina nuclear, fragmentación del núcleo (cariorrexis) y del
ADN. Adicionalmente, las células fagocíticas secretan citocinas que inhiben la
inflamación (Elmore, 2007; Hengartner, 2000; Heussler et al., 2001; Kroemer et al.,
2009).
Las señales de muerte que conducen a la apoptosis son muy diversas entre ellas
están los elevados niveles de oxidantes en el interior de la célula, lesión del ADN
por oxidantes, luz ultravioleta, fármacos quimioterapéuticos, infección por
patógenos, células inmunológicamente auto reactivas (Elmore, 2007; Faherty &
Maurelli, 2008; Hengartner, 2000; Heussler et al., 2001, Kroemer et al., 2009).
2.2.1 Vías de inducción de apoptosis. Existen dos tipos generales de vías de
señalización que permiten el inicio de la activación de caspasas iniciadoras de la
muerte celular programada. Una es mediada por ligandos que se unen a
receptores en la superficie celular y la otra es mediada por estrés celular o por
lesión en el ADN, estímulos que producen señales que actúan dentro de la célula
e inician eventos mitocondriales. Estas dos vías, también denominadas extrínseca
e intrínseca, respectivamente, pueden solaparse, aunque la transducción de
señales es diferente (Cascales, 2003; Elmore, 2007; Hengartner, 2000; Heussler
et al., 2001, Kroemer et al., 2009).
2.2.1.1 Vía intrínseca o mitocondrial. Estímulos por estrés ambiental o por la
ausencia de factores de crecimiento, entre otros, activan las proteínas proapoptóticas de la familia de Bcl-2 (Bax, Bak, Bid, Bad, Bim y Bik) produciendo la
permeabilización de la membrana externa de las mitocondrias, lo que permite la
liberación de citocromo C y Smac/DIABLO. El citocromo C se une al factor 1
activador de la proteasa apoptótica (Apaf-1) e induce la activación de la caspasa9, formando el apoptosoma. Una vez que la caspasa-9 está activada, ésta activa a
las caspasas efectoras como la caspasa-3 y con esto desencadena las últimas
fases de la apoptosis que se desarrollan en el núcleo (Figura 1). Smac/DIABLO se
une y antagoniza el inhibidor de las proteínas apoptóticas (IAP) (Cascales, 2003;
22
Elmore, 2007; Faherty & Maurelli, 2008; Hengartner, 2000; Heussler et al., 2001,
Kroemer et al., 2009).
Un segundo grupo de proteínas pro-apoptóticas son liberadas de la mitocondria el
factor inductor de la apoptosis (AIF), la endonucleasa G y el complejo CAD/ICAD.
La caspasa 3 cliva el complejo para liberar el CAD y activarla. Luego, las tres
proteínas se dirigen al núcleo y ocasionan la condensación y fragmentación del
ADN (Cascales, 2003; Elmore, 2007; Faherty & Maurelli, 2008; Hengartner, 2000;
Heussler et al., 2001, Kroemer et al., 2009).
2.2.1.2 Vía extrínseca o de los receptores de muerte. La vía extrínseca se inicia
por unión de un ligando con su receptor transmembranal (FasL/FasR, TNFα/TNFR, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4, Apo2L/DR5) produciendo el reclutamiento de
factores citosólicos para la formación del complejo de señalización inductor de
muerte (DISC) y posterior activación de la caspasa iniciadora 8. La caspasa-8
activada es liberada del DISC al citoplasma para clivar varias caspasas efectoras
como la procaspasa-3. Esta última una vez activa, cliva la DNasa y finaliza la
apoptosis. Esta vía puede ser regulada por el IAP que afecta a las caspasas
inciadoras y efectoras (Figura 1) (Cascales, 2003; Elmore, 2007; Faherty &
Maurelli, 2008; Hengartner, 2000; Heussler et al., 2001, Kroemer et al., 2009).
Las vías de los receptores de muerte y mitocondrial convergen a nivel de la
caspasa-3. El solapamiento e integración de ambas se debe a Bid, un miembro
pro-apoptótico de la familia de Bcl-2. La caspasa-8 media la ruptura de Bid,
incrementando su actividad pro-apoptótica que resulta en su translocación a la
mitocondria donde promueve la liberación del citocromo C (Figura 1) (Cascales,
2003; Elmore, 2007; Faherty & Maurelli, 2008; Hengartner, 2000; Heussler et al.,
2001, Kroemer et al., 2009).
23
Figura 1. Vías de señalización de la apoptosis: intrínseca y extrínseca.
VÍA INTRÍNSECA
Mitocondria
VÍA EXTRÍNSECA
Membrana celular
Apoptosoma
Fuente: Faherty & Maurelli, 2008.
2.2.2 Drogas que se emplean para la inducción de apoptosis. La inducción de
apoptosis en líneas celulares se ha logrado mediante el uso de drogas
antineoplásicas como la estaurosporina o la camptothecina, o simplemente por la
supresión de nutrientes en el cultivo celular usando D-PBS.
La estaurosporina es un inductor de apoptosis que inhibe un amplio número de
proteínas quinasas tales como: las quinasas serina/treonina, la proteína quinasa
C, la proteína quinasa dependiente de AMPc, la proteína quinasa dependiente de
CMPC y la proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina. Una proteína
quinasa, es una enzima que modifica a otras proteínas mediante fosforilación,
activándolas o desactivándolas (Cho, Katz & Chain, 2003; Hardie, 1999; Matthews
& Gerritsen, 2010).
24
Este inductor presenta una afinidad alta a los sitios de unión del ATP de las
proteínas quinasas, lo que resulta en su inactivación (Hardie, 1999; Matthews &
Gerritsen, 2010).
Esta droga puede inducir apoptosis por las vías extrínseca o intrínseca
(Belmokhtar, Hillion & Ségal-Bendirdjian, 2001; Nakamura, Sarmiento, Moran &
Gómez, 2009; Scarlett et al., 2000; Zhang, Gillespie & Hersey, 2004).
En la vía intrínseca este inductor inhibe la proteína quinasa B/Akt disminuyendo la
fosforilación de Bad y permitiendo que se una a las proteínas antiapoptóticas BclXL y Bcl-2, que preservan la integridad de la membrana mitocondrial. Dicha unión
forma heterodímeros que ocasionan cambios en la permeabilidad de la
mitocondria e inician la apoptosis (Zhang et al., 2004).
La estaurosporina también activa el Bax, un miembro proapoptótico implicado en
la permeabilidad de la membrana mitocondrial. Los cambios en la permeabilidad
ocasionan disminución del potencial de membrana, propiciando la liberación de
citocromo C y Smac/DIABLO (Scarlett et al., 2000; Zhang et al., 2004).
La camptothecina, otra droga citotóxica, induce apoptosis cuando se enlaza de
forma específica al complejo topoisomerasa I – ADN, pero no a la enzima o al
ADN solo. La topoisomerasa I es la diana de la camptothecina. Esta enzima
permite que el ADN superenrollado se relaje mediante un corte hecho a una
hebra, permitiendo que la molécula rote alrededor del enlace fosfodiéster. Su
función proporciona los procesos de transcripción y replicación (Hsiang, Hertzberg,
Hecht & Liu, 1985; Pommier, 2004; Pommier, 2006).
La unión de la camptothecina a este complejo, previene la religación de la hebra
cortada y la liberación de la topoisomerasa I. Al perturbar el equilibrio del ADN
ocasiona la fragmentación de este (Hsiang et al., 1985; Pommier, 2004; Pommier,
2006).
2.3 APOPTOSIS E INFECCIÓN
Una de las principales funciones de la apoptosis es servir como mecanismo de
defensa contra la infección de patógenos intracelulares. Idealmente, cuando una
célula hospedera está infectada por un microorganismo, entra en apoptosis para
eliminar la infección. La célula apoptótica es reconocida y fagocitada por
macrófagos y el microorganismo es potencialmente eliminado junto con la célula
infectada. Sin embargo, se ha visto que los microorganimos presentan
mecanismos que modulan la apoptosis a su favor, inhibiéndola o induciéndola. Por
consiguiente, la apoptosis deja de ser beneficiosa para convertirse en una
condición desfavorable para el hospedero y propicia para el patógeno intracelular
(Akarid et al., 2004; Heussler et al., 2001; Laskay, van Zandbergen & Solbach,
25
2008; Lüder, Gross & Lopes, 2001; Ritter, Frischknecht & van Zandbergen, 2009;
van Zandbergen, Solbach & Laskay, 2007).
Muchos microorganismos intracelulares como virus, bacterias, hongos y
protozoos, bajo una gran presión selectiva por evadir el sistema inmune, han
desarrollado vías de señalización que específicamente modulan la apoptosis a su
favor, garantizando su invasión en las células hospederas en el orden de
explotarlas, para poder reproducirse y persistir de una forma “silente” (DosReis,
Ribeiro-Gomes, Guillermo & Lopes, 2007; Faherty & Maurelli, 2008; Heussler et
al., 2001; Laskay et al., 2008; Lüder et al., 2001; Ritter et al., 2009; van
Zandbergen et al., 2007).
También se ha visto que los parásitos pueden modular la apoptosis propia, para
garantizar su entrada a la célula hospedera, sin activar los mecanismos efectores
de ésta (Laskay et al., 2008; Ritter et al., 2009; van Zandbergen et al., 2007). A
continuación se explicarán las dos formas.
2.3.1 Efecto de la apoptosis del parásito Leishmania sobre el curso de la infección.
Para los trypanosomátidos como Leishmania se ha propuesto que la apoptosis
propia tiene un rol biológico definido como un camino para maximizar su eficacia
biológica (fitness). Ésta sirve como mecanismo de adaptación y de defensa del
parásito contra la célula hospedera. El reconocimiento de la fosfatidilserina
expuesta sobre la superficie del parásito, por parte de la célula hospedera, es una
condición importante del proceso de infección y progresión de la enfermedad. En
el caso de los promastigotes de Leishmania, una sub-población muere por
apoptosis. Sin embargo, en el caso de los amastigotes toda la población expone
fosfatidilserina pero no necesariamente muestra muerte por apoptosis, fenómeno
que ha sido llamado “mimetismo”. Ambas condiciones coexisten durante el
proceso infectivo e inhiben la capacidad leishmanicida del macrófago (Nguewa,
Fuertes, Valladares, Alonso & Pérez, 2004; Shaha, 2006; Wanderley & Barcinski,
2010).
En el inóculo infectivo de promastigotes de Leishmania existen dos poblaciones:
apoptóticos (Annexin V+ y TUNEL+) y vivos (Annexin V- y TUNEL-), ambos son
fundamentales para proporcionar la entrada “silente” y la supervivencia del
parásito en la célula hospedera (Figura 2A y B). Los promastigotes apoptóticos del
inóculo son un factor determinante de virulencia. La depleción de parásitos
apoptóticos, disminuye la infectividad. Bajo este contexto, la fosfatidilserina
exteriorizada por los promastigotes induce la producción de Factor de Crecimiento
Transformante-β (TGF-β) e inhibe el ON (Laskay et al., 2008; Ritter et al., 2009;
van Zandbergen et al., 2006; van Zandbergen et al., 2007; Wanderley et al., 2009;
Wanderley & Barcinski, 2010).
26
Asimismo, los amastigotes de Leishmania exteriorizan fosfatidilserina pero son
considerados viables por ser negativos para yoduro de propidio (YP), un colorante
que mide mortalidad. La cantidad de fosfatidilserina expuesta es modulada por la
respuesta inmune tipo Th2 que genera susceptibilidad y desactivación del
macrófago. Esta característica en los amastigotes facilita su proliferación
(Wanderley, Moreira, Benjamin, Bonomo & Barcinski, 2006; Wanderley &
Barcinski, 2010).
Figura 2. Infección del neutrófilo granulocito polimorfonuclear (PMN) y el
macrófago con L. major. (A) Inóculo infectivo de Leishmania conteniendo parásitos
apoptóticos y vivos. (B) Entrada “silente” de Leishmania al PMN y supervivencia
de los parásitos vivos dentro del fagocito. Inhibición de apoptosis del PMN por
efecto de la infección con Leishmania. (C) El PMN con parásitos viables entra en
apoptosis y aparecen en el sitio de infección los macrófagos (célula azul). (D)
Fagocitosis del PMN apoptótico conteniendo parásitos vivos por el macrófago. (E)
La fagocitosis del PMN apoptótico “silencia” el mecanismo efector del macrófago y
los parásitos de Leishmania se replican dentro de la célula hospedera definitiva.
“entrada silente”
infección de las células
hospederas finales
Leishmania
viable/
infectiva
Leishmania
apoptótica
C
B
A
“entrada silente”
del parásito al
neutrófilo
neutrófilo
apoptótico
infectado
Tiempo después
de la infección (h)
Fuente: Laskay et al., 2008.
27
E
D
fagocitosis del neutrófilo
apoptótico infectado
2.3.2 Efecto de la infección con microorganismos intracelulares sobre la apoptosis
de la célula hospedera. Muchos organismos intracelulares son capaces de
prevenir ó inducir la apoptosis de las células hospederas. Para los patógenos es
crucial inhibir la apoptosis de la célula hospedera, en el orden de mantener un
nicho intracelular para su supervivencia, multiplicación y protección frente a un
ataque directo por parte del sistema inmune. Por otro lado, los microorganismos
intracelulares también pueden inducir la apoptosis en la célula hospedera, con el
fin de propagar la infección de forma “silente” a otras células. La entrada del
patógeno por medio de una célula apoptótica infectada, hace que el nuevo
hospedero no active su mecanismo efector antimicrobial, garantizando que el
microorganismo intracelular sobreviva, se multiplique y persista pasando
desapercibido para el sistema inmune (Akarid et al., 2004; DosReis et al., 2007;
Faherty & Maurelli, 2008; Heussler et al., 2001; Laskay et al., 2008; Moore &
Matlashewski, 1994; Ritter et al., 2009; van Zandbergen et al., 2007).
La modulación de la apoptosis de la célula hospedera por efecto de la infección
con patógenos intracelulares, ha sido un tema de estudio en la patogénesis
ocasionada por Leishmania, ya que puede explicar el evento de persistencia del
parásito en el hospedero (Akarid et al., 2004; Heussler et al., 2001; van
Zandbergen et al., 2004b).
Con L. major se ha descrito un panorama completo sobre la forma como
Leishmania se vale de la inhibición o inducción de la apoptosis en la célula
hospedera, para evadir el sistema inmune. La infección con L. major en el
neutrófilo granulocito polimorfonuclear (PMN) ocasiona el decrecimiento de la
actividad de la caspasa 3 prolongando de dos a tres días la supervivencia del
fagocito. Los parásitos vivos de Leishmania son albergados temporalmente dentro
del PMN y permanecen sin replicarse, ni transformarse en amastigotes. Lo
anterior, indica que el neutrófilo es un hospedero temporal, que sirve para
garantizar la supervivencia del parásito hasta que logra invadir la célula hospedera
definitiva, el macrófago (Figura 2B) (Aga et al., 2002; Laskay, van Zandbergen &
Solbach, 2003; Laskay et al., 2008; van Zandbergen et al., 2004b; van Zandbergen
et al., 2007).
Después de 48 horas, el neutrófilo entra en apoptosis a causa de la infección con
Leishmania. Los neutrófilos apoptóticos infectados secretan altos niveles de la
quimiocina MIP-1β, cuya función es atraer macrófagos. Dadas estas condiciones,
el PMN apoptótico infectado con parásitos vivos, es fagocitado de forma “silente”
por el macrófago, garantizando la supervivencia y replicación de Leishmania en el
hospedero definitivo (Figura 2 C-E). En este caso, ocurren dos eventos
importantes que garantizan la supervivencia del parásito. Primero, los parásitos
vivos dentro del PMN no tienen un contacto directo con los receptores de
superficie del macrófago, por lo que este fagocito no reconoce el intruso
intracelular, y consecuentemente no se activa. Segundo, la fagocitosis de la célula
apoptótica “silencia” el macrófago, es decir que los mecanismos efectores no son
28
activados contra Leishmania (Aga et al., 2002; Laskay et al., 2003; Laskay et al.,
2008; Ritter et al., 2009; van Zandbergen et al., 2004b; van Zandbergen et al.,
2007).
Lo anterior indica que la inducción de la apoptosis en la célula hospedera por
efecto de la infección con Leishmania, es importante para cuatro aspectos
fundamentales en un proceso infectivo: reclutamiento de nuevas células
hospederas, promoción de la fagocitosis, inactivación de los mecanismos
efectores del fagocito (es decir, entrada “silente”) y persistencia de la infección. El
proceso en el que un parásito vivo se encuentra dentro de una célula apoptótica,
la cual es fagocitada de forma “silente” y por medio de ésta, transfiere la infección
a otra célula hospedera sin ocasionar en ella la activación de su mecanismo
efector, facilitando la supervivencia y replicación del parásito se conoce como
“caballo de Troya” (Figura 3) (Laskay et al., 2003; Laskay et al., 2008; Ritter et al.,
2009; van Zandbergen et al., 2004b; van Zandbergen et al., 2007).
29
Figura 3. Estrategias de Leishmania para invadir e inactivar la célula hospedera.
Entrada “silente” de Leishmania al macrófago a través de células apoptóticas
usando dos estrategias llamadas: “caballo de Troya” ó “conejo de Troya”.
“Caballo de Troya”
Neutrófilo apoptótico
infectado
Macrófago infectado
“Conejo de Troya”
Neutrófilo apoptótico
+ parásito extracelular
Macrófago infectado
Fuente: Ritter et al., 2009.
Según Getti, Cheke & Humber (2008), la infección con L. aethiopica, L. tropica o L.
major en macrófagos de dos líneas celulares, U-937 y THP-1, y macrófagos
derivados de monocitos de sangre periférica humana, ocasiona la inducción de
apoptosis temprana en dichas células hospederas, caracterizada por
exteriorización de fosfatidilserina, permeabilización de la membrana mitocondrial y
activación de las caspasas, sin producir fragmentación del ADN.
30
Asimismo, en la infección con Leishmania se ha descrito otro mecanismo, en el
que la fagocitosis de una célula hospedera apoptótica no infectada, al no activar el
macrófago, permite la entrada “silente” de parásitos extracelulares, proceso
llamado por los autores como “conejo de Troya” (Figura 3). Este mecanismo se
diferencia del anteriormente descrito, porque el parásito no va dentro de la célula
apoptótica, lo común para ambos casos, es que a través de la señal de la
fosfatidilserina de la célula apoptótica, se logra una entrada “silente” al macrófago
(Laskay et al., 2003; Laskay et al., 2008; Ritter et al., 2009; van Zandbergen et al.,
2004b; van Zandbergen et al., 2007).
Por ejemplo, se ha demostrado que cuando L. major es inoculado junto con
células fagocíticas apoptóticas, se exacerba la replicación del parásito dentro de
los macrófagos, evento que se caracteriza por la producción de TGF-β y la
prostaglandina 2 (PGE2) (Laskay et al., 2008; Ribeiro-Gomes et al., 2004).
El reconocimiento de la fosfatidilserina exteriorizada sobre la membrana de la
célula apoptótica, suprime las funciones microbicidas del macrófago y se producen
citocinas como el TGF-β y la IL-10, que regulan negativamente los niveles de
Factor de Necrosis Tumoral-α (TNF-α), IFN-γ y ON (DosReis et al., 2007; Laskay
et al., 2008; Lopes, Freire-de-Lima & DosReis, 2000; Ribeiro-Gomes et al., 2004;
van Zandbergen et al., 2004b; Zhang, Kim, Yamamoto, Kang & Ma, 2010).
Por otro lado, los microorganismos pueden inducir la apoptosis de células que
promueven la respuesta inmune adaptativa como los linfocitos B y T, para
favorecer la persistencia de la infección. Esto se ha observado en parásitos como
Leishmania (Banerjee et al., 2011), T. cruzi (de Meis et al., 2006; DosReis &
Lopes, 2009) y T. brucei (Bockstal et al., 2011). La infección por T. brucei por
ejemplo, previene la maduración de los linfocitos B transicionales, al inducir la
apoptosis en estas células, lo que resulta, en una pérdida de la producción de
anticuerpos que contrarresten la infección, favoreciendo la replicación y
supervivencia del parásito (Bockstal et al., 2011).
Opuesto a lo anterior, las infecciones con L. donovani, L. major, L. pifanoi, L.
amazonensis y L. infantum ocasionan inhibición en los niveles de apoptosis de la
célula hospedera frente a diversos estímulos apoptóticos (Aga et al. 2002; Akarid
et al., 2004; Donovan, Maciuba, Mahan & McDowell, 2009; Lisi et al. 2005; Moore
& Matlashewski, 1994; Ruhland, Leal & Kima, 2007).
Finalmente, la inducción o la inhibición de este proceso fisiológico durante la
infección por microorganismos intracelulares es un camino importante de
diseminación que le garantiza al parásito la supervivencia. Varios aspectos de la
interacción entre hospedero y parásito pueden estar influidos por la apoptosis
como la evasión del parásito, la supresión inmune, la distribución no balanceada
de sub-poblaciones de linfocitos T y aún el daño tisular no linfoide. Este tipo de
31
muerte en la célula hospedera, puede conducir a importantes modificaciones en
las interacciones hospedero-parásito durante las infecciones crónicas (Chuenkova
& PereiraPerrin, 2010; DosReis & Lopes, 2009; Laskay et al., 2008; Ritter et al.,
2009; van Zandbergen et al., 2007).
A continuación se presenta una recopilación del efecto que causa la infección de
algunos microorganismos sobre la apoptosis de su célula hospedera (Cuadro 1).
Cuadro 1. Efecto de microorganismos intracelulares sobre la apoptosis de la
célula hospedera.
Efecto
sobre
apoptosis
Células
Mecanismo
Referencia
↓
Macrófago
(Derivado de
médula ósea de
ratón)
Bloqueo de liberación de
citocromo C mitocondrial.
Akarid et al. (2004)
↓/↑
Neutrófilo
Reducción de la actividad
de caspasa-3 hasta las 42
horas.
Aumento de la actividad de
caspasa-3 después de las
42 horas.
Aga et al. (2002)
↓
Macrófago
(Línea RAW
264.7 murina)
↓
Macrófago
(Líneas RAW
264.7 y B10R
murinas)
Activación de la vía
PI3K/Akt.
Ruhland et al. (2007)
Leishmania major,
L. tropica,
L. aethiopica
↑
Macrófago
(Líneas U937 y
THP-1 humanas)
Exteriorización de
fosfatidilserina,
permeabilización de la
membrana mitocondrial,
activación de caspasas.
Getti et al. (2008)
Leishmania
infantum
↓
Monocito
(U937)
Inhibición de PKC y
reducción de la actividad de
caspasa-3.
Lisi et al. (2005)
Microorganismo
Leishmania major
Leishmania major,
L. donovani
Leishmania major,
L. pifanoi,
L. amazonensis
Aumento en la expresión de
la proteína antiapoptótica Donovan et al. (2009)
Bcl-XL.
32
Microorganismo
Leishmania
donovani
Efecto
sobre
apoptosis
Mecanismo
Referencia
↓
Inhibición mediada por
Macrófago
(Derivado de factor soluble producido por
médula ósea de el macrófago (TNF-α y GMratón)
CSF).
↓
Células
cardíacas
(Cardiomiocitos)
Activación de NF-κB y
reducción de actividad de
caspasa-3.
Petersen, Krumholz,
Carmen, Sinai &
Burleigh (2006)
↓
Células
cardíacas
Cruzipaína induce
activación de PI3K/Akt y
MEK1/ERK1/2 y la
expresión de Bcl-2.
Aoki et al. (2004);
Aoki et al. (2006)
↓
Células de
Fibrosarcoma
y cardíacas
↑
Trypanosoma cruzi
Células
↓
↓
↑
↑
Moore y
Matlashewski
(1994)
Aumento de la expresión de
Hashimoto,
c-FLIP, un inhibidor de la Nakajima-Shimada &
vía extrínseca.
Aoki (2005)
Exteriorización de
Células cardíacas fosfatidilserina, activación
de caspasa 3,
HL-1
fragmentación del ADN.
Macrófagos
(Ratones
resistentes
C57BL/6)
Levy et al. (2011)
Inhibición de apoptosis
mediada por HSP65.
Sakai et al. (1999)
Neuronas,
células gliales
Activación PI3K/Akt y
MAPK/Erk1/2. Reduce
actividad de caspasas.
Chuenkova, Furnari,
Cavenee & Pereira
(2001); Chuenkova &
Pereira (2003);
Chuenkova &
PereiraPerrin (2010)
Cardiomiocitos,
Macrófagos
Permeabilidad de la
membrana mitocondrial,
fragmentación del ADN.
de Souza et al.
(2003); Tostes,
Rocha-Rodrigues, de
Araujo Pereira,
Rodrigues (2005)
Células
mononucleares Expresión de Fas/Fas-L y
de sangre
TNF-α.
periférica (PBMC)
33
Rodrigues et al.
(2008)
Microorganismo
Efecto
sobre
apoptosis
Células
↓
Células de la
retina
↓
↓
↓
Toxoplasma gondii
↓
↓
↓
↑
↓
↓
Theileria parva
↓
↓
↓
Mecanismo
Referencia
Reduce la fragmentación
del ADN. Previene factores
Choi et al. (2011)
pro-apoptóticos (Bad y Bax)
y activación caspasa 3.
Bloqueo de la liberación del
Yamada, Tomita,
citocromo C. Inhibición de la
Célula hospedera
Weiss & Orlofsky
granzima B del linfocito T
(2011).
CD8(+).
Inhibición de activación de
Keller et al. (2006)
caspasas 3 y 7 por
citocromo C.
Linfocitos T
Inhibición de activación de
JNK y liberación de
Células de cérvix
Carmen, Hardi &
citocromo C, disminución de
(HeLa)
Sinai (2006)
Bax y Bad, inhibición de
caspasas 3 y 9.
Monocitos
Aumento de expresión de
(U937) y
Mcl-1, disminución de
Goebel, Gross, &
precursores de
poli(ADP-ribosa) polimerasa
Lüder (2001)
neutrófilos (HLy liberación de citocromo C.
60)
Molestina, Payne,
Activación de NF-κB,
Coppens & Sinai
aumento de expresión de
Fibroblastos
(2003); Payne,
Bcl-xL, Bfl-1, c-IAP1/2 y
reducción de actividad de Molestina & Sinai
(2003)
caspasas.
Kim & Denkers
Macrófagos
Activación de PI3K.
(2006)
El TgPDCD5 induce
Bannai et al.
apoptosis en presencia de
Macrófagos
(2008);
Bannai et al. (2009)
INF-γ.
Proteína derivada del
Hayashida et al.
esquizonte TpSCOP activa
Linfocitos
(2010)
el NF-κB.
Guergnon,
Reducción en la activación
Dessauge,
Linfocitos T y B
de caspasas 9 y 3.
Langsley & Garcia
(2003)
Küenzi, Schneider,
Aumento de proteínas antiLinfocitos T
& Dobbelaere
apoptóticas c-FLIP y c-IAP.
(2003)
Activación de c-Myc y
aumento en la expresión de Dessauge et al.
Linfocitos B
la proteína anti-apoptótica
(2005)
Mcl-1.
Lizundia et al.
Linfocitos B
Activación de JNK y c-Jun.
(2006)
34
Microorganismo
Efecto
sobre
apoptosis
Células
Mecanismo
Referencia
Theileria annulata
↓
Linfocitos B
Activación de la vía antiapoptótica PKA.
Guergnon et al.
(2006)
↓
Células hepáticas
Reduce la activación de
caspasas. Inhibe la
fragmentación del ADN.
van de Sand et al.
(2005)
↓
Células hepáticas
Activación de PI3K/Akt.
Leirião et al. (2005)
↑
Células
mononucleares
de sangre
periférica
Extracto de esquizontes
induce apoptosis.
Toure-Balde et al.
(1996)
↑
Células
endoteliales
Plasmodium
berghei
Plasmodium
falciparum
↑
Cryptosporidium
parvum
Mycobacterium
tuberculosis
La citoadherencia de
Pino et al., 2003;
eritrocitos infectados activan
Touré et al. (2008)
caspasas 8 y 9.
Células del
Factores solubles de
endotelio
eritrocitos infectados
Wilson et al. (2008)
vascular cerebral. inducen fragmentación del
Células gliales
ADN
↑/↓
Células
intestinales
Esporozoitos activan
caspasa 3, trofozoitos
inhiben apoptosis.
↓/↑
Células
intestinales
Inhibición de las caspasas
hasta las 48h. Después
activación de caspasas
↓
Células del
epitelio biliar
Activación de NF-κB.
Chen et al. (2001)
↑
Células
intestinales
Inhibición de NF-κB en
infección temprana.
McCole, Eckmann,
Laurent & Kagnoff
(2000)
↑
Macrófagos
(THP-1)
↑
Macrófagos
alveolares
↑
Macrófagos
alveolares
murinos
↓
Macrófagos
humanos y
murinos
Mele, Gomez
Morales, Tosini, &
Pozio (2004)
Liu, Enomoto,
Lancto,
Abrahamsen &
Rutherford (2008)
Proteína secretada ESAT-6
Derrick & Morris
induce activación de
(2007)
caspasas.
Inducción de fragmentación
Keane et al. (1997)
del ADN por TNF-α.
Elevados niveles de
metilglioxal, un producto de Rachman et al.
vías metabólicas, induce
(2006)
apoptosis.
El gen nuoG de M.
tuberculosis inhibe la
fragmentación del ADN.
35
Velmurugan et al.
(2007)
Microorganismo
Chlamydia
trachomatis
Efecto
sobre
apoptosis
Células
Mecanismo
Referencia
↓
Inhibición de liberación de Fan et al. (1998);
citocromo C y activación de
Greene, Xiao,
Células de cérvix
caspasas.
Huang, McClarty &
(HeLa)
La vía anti-apoptótica
Zhong (2004); Xiao
et al. (2005)
NF-κB no es activada.
↓
PMN humano
Detiene la apoptosis,
reduciendo la actividad de
la caspasa 3. No hay
van Zandbergen et
exteriorización de
al. (2004a)
fosfatidilserina, ni
fragmentación del ADN.
↓
Células de
neuroblastoma
Chlamydia
pneumoniae
Inhibe la activación de la
caspasa 3 y 7.
Appelt et al. (2008)
↑
Macrófago (Línea
Activación de caspasa 3 sin
U937 humana y
fragmentación del ADN (4línea J774 A.1
12 horas).
murinas)
Abu-Zant et al.
(2005)
↑/↓
Macrófago (Línea
U937 humana y Activación de caspasa 3 y
activación de la vía del
línea J774 A.1
Factor de transcripción
murinas)
(Macrófagos
nuclear κ-B (NF-κB)
humanos
asociada con supervivencia
derivados de
celular.
monocitos)
Abu-Zant et al.
(2007)
Legionella
pneumophila
↑
En presencia de IFN-γ
Nonaka, Kuwabara,
activación de caspasas 3 y
Mimuro, Kuwae &
7. Exteriorización de
Imajoh-Ohmi (2003)
fosfatidilserina.
Macrófagos
(U937)
↓
Sp15 secretado por
Clark & Maurelli
Shigella previene
Células epiteliles
(2007); Faherty &
HeLa
la activación de la caspasa
Maurelli (2009)
3.
↓
Inducción de la expresión
de JUN y genes de
proteínas anti-apoptóticas.
Activación del NF-κB.
Inhibe la activación de
caspasa 3.
Shigella flexneri
Células
epiteliales
36
Faherty et al.
(2010)
Microorganismo
Efecto
sobre
apoptosis
Células
Mecanismo
Referencia
Wu et al. (2010)
Zheng et al. (2011)
Salmonella typhi
↑
Macrófagos
El plásmido quimérico
pR(ST98) produce pérdida
del potencial de membrana
mitocondrial.
Activa caspasas 9 y 3.
Yersinia pestis
↑
Macrófagos
Activación caspasa 1.
37
3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Establecer el efecto de la infección con Leishmania de los subgéneros Viannia (V.)
y Leishmania (L.), L. (V.) panamensis, L. (L.) mexicana y L. (L.) donovani, sobre la
apoptosis de la célula hospedera y la persistencia de la infección.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar el efecto de la infección por diferentes especies de Leishmania
sobre los niveles de exteriorización de la fosfatidilserina en macrófagos
U937.
• Determinar el efecto de la infección por diferentes especies de Leishmania
sobre la fragmentación del ADN en macrófagos U937.
• Establecer si L. (V.) panamensis, L. (L.) mexicana y L. (L.) donovani
sobreviven a la apoptosis de macrófagos U937.
3.3 HIPÓTESIS
Ho: La modulación de la apoptosis del macrófago por efecto de la infección
con especies de Leishmania del nuevo mundo no es una estrategia del parásito
para persistir en el hospedero.
Ha: La modulación de la apoptosis del macrófago por efecto de la infección
con especies de Leishmania del nuevo mundo podría ser una estrategia del
parásito para persistir en el hospedero.
38
4. DISEÑO METODOLÓGICO
4.1 PARÁSITOS
Fueron
empleados
promastigotes
de
L.
panamensis
Lbp1989
(MHOM/CO/95/1989), L. mexicana LM16 (MNYC/BZ/62/M379) y L. donovani
DD8 (MHOM/IN/80/DD8). Los parásitos cedidos por el Banco de Cepas de
CIDEIM, tenían pase por hámster para asegurar su infectividad. Además, el
número de repiques por cepa en los experimentos no superó un número de cinco
evitando así perder dicha infectividad. Para infectar los macrófagos se usaron
parásitos de Leishmania en fase estacionaria, es decir después de 6 días de
cultivo.
4.2 DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL 50 (DL50) A LA NEOMICINA
Previo a la transfección, para cada una de las especies de Leishmania se
estableció la Dosis Letal 50 (DL50) a la Neomicina Geneticin (G-418) (Gibco BRL).
Se cultivaron los parásitos de L. panamensis, L. mexicana y L. donovani a 1x107
parásitos/ml en medio Schneider’s (Sigma) con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB)
(Gibco BRL), bajo diferentes concentraciones de G-418 (0µg/ml, 40µg/ml, 80µg/ml,
160µg/ml y 320µg/ml). Las curvas de DL50 permitieron establecer la
concentración bajo la cual se realizaría la selección de las líneas de Leishmania
transfectadas con el vector que les conferiría resistencia a la Neomicina.
4.3 TRANSFECCIÓN DE L. panamensis, L. mexicana Y L. donovani
Con el propósito de evaluar infección mediante citometría de flujo, se transfectaron
las cepas de Leishmania arriba mencionadas con un plásmido que contiene el gen
para la proteína verde fluorescente (GFP). Para ello, se realizó la transfección de
las cepas con el vector pSP72αNEOαGFP proporcionado por el Dr. Marc Ouellette
de la Universidad de Laval de Canadá. El fragmento de GFP clonado en el vector
tiene un tamaño molecular de 760pb y fue insertado en el sitio de restricción Hind
dIII 2658 (Ouellette M. datos no publicados) (Figura 4).
39
Figura 4. Vector pSP72αNEOαGFP. Donado por el Dr. Marc Ouellette (Centre de
Recherche en Infectiologie du CHUL and the Département de Biologie Médicale,
Division de Microbiologie, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec,
Canadá) (Ouellette M. datos no publicados).
Fuente: Ouellette, datos no publicados.
Para obtener una buena cantidad de ADN plasmídico y poder llevar a cabo la
transfección, se requirió primero realizar una transformación de células
químicamente competentes de Escherichia coli TOP10 One Shot® (Invitrogen) con
el vector pSP72αNEOαGFP. Para esto se usó el Kit TOPO TA Cloning®
(Invitrogen).siguiendo los pasos del manual de Invitrogen (2006).
Se picaron de 1-4 colonias transformadas las cuales fueron cultivadas en 5ml de
medio LB-Antibiótico (ampicilina 100µg/ml) (LB-A) a 37 ºC con agitación de 250
rpm por 8 horas. Luego se masificó el cultivo a 100 ml de LB-A, sembrando 150µl
del cultivo previamente crecido e incubándose por 12-16 horas a 37°C con
agitación 250 rpm. La extracción del ADN plasmídico se realizó por lisis alcalina
(Figura 5).
40
Figura 5. Metodología de transfección de GFP en cepas de L. panamensis, L.
mexicana y L. donovani utilizando el vector pSP72αNEOαGFP.
Transformación de células competentes
(E. coli) con el vector pSP72αNEOαGFP
Cultivo de parásitos (L. panamensis,
L. mexicana, L. donovani) en Medio
Schneider’s
Curva de parásitos Dosis
Letal (DL) 50 de G-418
Extracción ADN plasmídico (lisis alcalina)
Transfección de parásitos L. panamensis,
L. mexicana, L. donovani
Selección de Parásitos transfectados usando
G-418
En medio axénico (Schneider’s líquido)
En platos (Schneider’s sólido)
Dilución limitante en placa de 96 pozos
(Usando 2X-3X DL50 G-418)
(Usando 2X-3X DL50 G-418)
(Usando 2X-3X DL50 G-418)
Mantenimiento de parásitos transfectados en
medio Schneider’s con G-418
Análisis de los parásitos transfectados por
microscopía de fluorescencia y citometría de flujo
Los parásitos fueron transfectados y seleccionados de acuerdo a la metodología
planteada en la figura 5. Cada cepa en fase logarítmica fue ajustada a una
concentración de 1x108 parásitos en el buffer de electroporación. Se trabajó con
cubetas de electroporación estériles de 0.4cm (BIO-RAD) y el ajuste fue hecho a
800µl (700µl de parásitos, 100µg de ADN plasmídico (pSP72αNEOαGFP) y agua
hasta completar volumen total de 800µl).
Las electroporaciones se realizaron siguiendo los protocolos presentados en el
cuadro 2.
41
Cuadro 2. Protocolos de electroporación usados para L. panamensis, L. mexicana y L. donovani.
Cepa
Voltaje
kV
Capacitancia
µF
Nº de
pulsos
Duración
del pulso
(mseg)
Tiempo
entre cada
pulso
(seg)
Buffer de
electroporación
Electroporador
Gene Pulser XcellTM
(BIO-RAD)
L. panamensis
1.5
25
2
0.4
10
Cytomix
(8.66mM K2HPO4,
1.34mM KH2PO4, 0.15mM
CaCl2, 120mM KCL,
25mM HEPES, 5mM
MgCl2.6H2O, 2mM EDTA)
pH7.6
L. mexicana
1.5
25
2
0.4
10
Cytomix
Gene Pulser XcellTM
(BIO-RAD)
-
(21mM HEPES, 137mM
NaCl2, 5mM KCl2, 0.7mM
Na2HPO4, 6mM glucosa)
pH 7.5
Gene Pulser XcellTM
(BIO-RAD)
L. donovani
2.25
500
1
0.4
42
Los parásitos transfectados se cultivaron en 10 ml de Schneider’s con 10% SFB a
25°C por 24 horas sin adicionar antibiótico de selección hasta que fueron
estabilizados. Posteriormente, se adicionó G-418 a una concentración de 2-3
veces la DL50 de la cepa (Figura 5).
Los parásitos transfectados fueron seleccionados en platos con Schneider’s sólido
por agotamiento y en placas de 96 pozos por dilución limitante (1:10; 1:100; 1:200;
1:400; 1:800; 1:1600; 1:3200; 1:6400) con medio Schneider’s en presencia de 2-3
veces la DL50 de G-418 (Figura 5). Los cultivos se incubaron a 25°C por una
semana; se verificó el crecimiento de los mismos en el microscopio invertido,
hasta que se observaron colonias en los platos y parásitos en la dilución 1:6400
para luego ser pasados a medio líquido Schneider’s con 10% de SFB y continuar
el crecimiento bajo la selección con G-418.
La fluorescencia de las líneas de Leishmania transfectadas se evaluó por
citometría de flujo (citómetro FACS CaliburTM BD) y microscopía de fluorescencia
(microscopio de fluorescencia Eclipse 800 Nikon) (Figura 5). Las líneas de
parásitos transfectados con un porcentaje de GFP positivo superior al 90% por
citometría de flujo fueron utilizadas para los ensayos. Para este procedimiento los
parásitos fueron lavados con FACS buffer, ajustados a 2x106 parásitos/ml y
adquiridos en el citómetro en el canal FL1. Los análisis se efectuaron usando el
programa FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc.) realizando histogramas de FL1-H: GFP. Se
hallaron los porcentajes y la intensidad media de fluorescencia de GFP.
4.4 CULTIVO DE PROMASTIGOTES DE L. panamensis, L. mexicana Y L.
donovani
Para la evaluación de la fosfatidilserina y la fragmentación de ADN por citometría
de flujo, se utilizaron cepas de L. panamensis, L. mexicana y L. donovani
transfectadas con GFP.
Se cultivaron L. panamensis GFP012, L. mexicana GFP013 y L. donovani GFP019
a 25°C en medio Schneider’s de selección bajo condiciones de preparación y
concentración de G-418 específicas para cada cepa (Cuadro 3). Las líneas de
parásitos transfectados fueron cultivadas durante 8 días para obtener
promastigotes en fase estacionaria que fueron usados para la infección de
macrófagos U-937 en los ensayos previamente mencionados.
43
Cuadro 3. Condiciones de cultivo de las líneas L. panamensis GFP012, L.
mexicana GFP013 y L. donovani GFP019.
Preparación de Medio Schneider’s
Código de la línea de
Leishmania GFP (Banco
de Cepas CIDEIM)
Concentración
de selección
con G-418
(µg/ml)
Volumen
final por
botella
(ml)
% Suero Fetal
Bovino
% L-Glutamina
(200 mM)/
% Penicilina
Estreptomicina
(10.000U/ml)
% Orina
humana*
L. panamensis GFP012
20
1/1
2
3200
6
L. mexicana GFP013
15
1/1
2
1300
5
L. donovani GFP019
15
1/1
2
450
3
*Para la preparación de orina humana como suplemento del cultivo de Leishmania se
siguió la metodología propuesta por Armstrong & Patterson (1994) y Howard, Pharoah,
Ashall & Miles (1991).
Las cepas de L. panamensis, L. mexicana y L. donovani no transfectadas fueron
cultivadas en medio Senejkie por 6 días a 25°C para obtener parásitos en fase
estacionaria.
4.5 CULTIVO DE LA LÍNEA CELULAR U-937
Se utilizó la línea celular humana de monocitos U-937 (ATCC CRL 1593). En los
ensayos se utilizaron células con un número máximo de 5 pases. La línea se
cultivó en medio RPMI (Sigma) con L-glutamina suplementado con 10% SFB. Los
cultivos fueron mantenidos bajo una temperatura de 37 °C y 5% de CO2.
4.6 DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS U-937
Los monocitos U-937 fueron diferenciados a macrófagos con Phorbol Myristate
Acetate (PMA) (100ng/ml) en medio RPMI con L-glutamina suplementado con
10% SFB por 4 días. El PMA induce la diferenciación y adherencia de las células a
los pozos de las placas donde fueron cultivadas. En los experimentos se usaron
placas de 6 pozos (BD) para las muestras de citometría y placas de 24 pozos (BD)
con laminillas redondas de 12mm (Fisher Scientific) para microscopía de
fluorescencia y óptica. La concentración de células por pozo en las placas de 6 fue
44
de 6x105 células en 3ml y para las placas de 24 pozos fue de 1.2x105 células en
1ml.
4.7 INFECCIÓN DE MACRÓFAGOS U-937
Previo a la infección, los parásitos se opsonizaron durante una hora con suero
humano AB inactivado. Se infectaron los macrófagos U-937 con una dosis de 40:1
(parásitos:célula) durante 2 horas a 34 °C, 5% CO2. Los cultivos se lavaron con
solución buferada de fosfatos Dulbecco´s (D-PBS) (Gibco-Invitrogen) por 3 veces
para eliminar los parásitos extracelulares. Luego, las células se incubaron por 24
horas a 34°C, 5% CO2 para permitir que los parásitos se transformaran en
amastigotes.
Se evaluó el porcentaje de infección y la carga parasitaria por microscopia en
laminillas coloreadas con GIEMSA al 3% en buffer de fosfato. Para evitar sesgo
por parte del evaluador, las láminas se rotularon con un código numérico que no
permitía identificar la cepa. Además, con las líneas transfectadas con GFP se
analizó por citometría de flujo el porcentaje de células GFP positivo.
4.8 INDUCCIÓN DE APOPTOSIS
Se indujo la apoptosis en macrófagos infectados con Leishmania y no infectados
usando tres inductores: estaurosporina (Sigma), camptothecina (Sigma) y D-PBS.
Se trabajó con estaurosporina 6µM, la cual fue preparada a partir de un stock
1000µM y disuelta con DMSO estéril. La camptothecina se preparó a partir de un
stock 25µg/ml con DMSO estéril para obtener la concentración de trabajo que fue
6µM. La concentración final de cada droga fue disuelta en medio RPMI 10% de
SFB. Para la apoptosis inducida por deprivación de nutrientes, el medio de cultivo
se reemplazó con D-PBS estéril.
Los inductores se adicionaron a los pozos una vez que se retiró el medio en el que
se encontraban las células. Para las placas de 6 pozos se adicionó 1.5ml y para
las placas de 24 pozos se adicionó 600 µl. Una vez agregados los inductores, las
células se evaluaron a las 8, 24, 48 y 72 horas post-tratamiento.
Cabe aclarar que para los experimentos se incluyeron como controles células
infectadas con Leishmania y no infectadas que no se trataron con los inductores
de apoptosis. Dichas células fueron evaluadas en los tiempos previamente
mencionados.
45
4.9 TINCIÓN CON Annexin V-PE Y 7AAD PARA MEDIR LOS NIVELES DE
EXTERIORIZACIÓN DE LA FOSFATIDILSERINA EN MACRÓFAGOS U-937
Para determinar si L. panamensis, L. mexicana y L. donovani incrementan o
reducen los niveles de exteriorización de la fosfatidilserina en macrófagos U937,
se caracterizó la cinética de dicho marcador de apoptosis usando la tinción de
Annexin V-PE (BD) y 7AAD (BD) por citometría de flujo (Figura 6).
El Annexin V es una proteína altamente afín a la fosfatidilserina y cuyo enlace es
dependiente de calcio. Annexin V puede estar marcada con una molécula
fluorescente que permite la identificación de células apoptóticas mediante
citometría de flujo.
Así mismo, la pérdida de la integridad de la membrana ocurre en los procesos de
muerte celular por apoptosis y necrosis, razón por la cual la tinción de Annexin VPE suele estar combinada con 7AAD, un colorante vital. Las células con
membranas intactas no se teñirán con 7AAD, mientras que las que se encuentran
en un estado de apoptosis tardía y de necrosis dejarán pasar el 7AAD.
Para estos ensayos se infectaron macrófagos U937 con L. panamensis GFP012,
L. mexicana GFP013 y L. donovani GFP019 a la dosis de 40:1 (promastigotes por
célula). Las células fueron tratadas con los inductores apoptóticos como se
describió previamente. Los macrófagos fueron desprendidos con Tripsina-EDTA
(Sigma) y teñidos con Annexin V-PE y 7AAD para su posterior evaluación en el
citómetro de flujo FACS CaliburTM BD (Figura 6).
Paralelo a este experimento de citometría, se montó un ensayo en placas de 24
pozos con laminillas utilizando las mismas condiciones expuestas anteriormente
con el fin de evaluar por microscopía el porcentaje de infección de cada cepa por
tinción con GIEMSA. Con el propósito de evaluar infección mediante citometria de
flujo, se utilizaron cepas de Leishmania transfectadas con GFP.
Los datos adquiridos en el citómetro de flujo se analizaron usando el programa
FlowJo 7.6. Primero se realizó un dotplot pseudocolor graficando las células por
tamaño y complejidad celular, es decir Forward Scatter (FSC) Vs Side Scatter (SSC),
respectivamente. Luego, se realizó una región de macrófagos (excluyendo la
esquina del plot que corresponde a detritos celulares y parásitos extracelulares).
Posteriormente, se elaboró un plot de los macrófagos en el que se pudo establecer
los eventos positivos y negativos para Annexin V-PE y 7AAD. Finalmente, se realizó
una estadística descriptiva arrojada por el programa para obtener los porcentajes de
cada una de las subpoblaciones celulares y los índices de intensidad de
fluorescencia media.
46
Figura 6. Estrategia experimental para medir los niveles de fosfatidilserina de
macrófagos U937 infectados con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani
usando la tinción de Annexin V-PE y 7AAD.
Cepas en medio Schneider’s
L. panamensis GFP012
L. mexicana GFP013
L. donovani GFP019
Monocitos U937
Opsonización de parásitos
Adherencia y diferenciación a macrófagos
Infección
Dosis infectiva
40 parásitos:1 célula
No Infección
Con inductor:
Estaurosporina (6µM)
Camptothecina (6µM)
D-PBS
Sin inductor
Con inductor:
Estaurosporina (6µM)
Camptothecina (6µM)
D-PBS
Sin inductor
8hr, 24hr, 48hr, 72hr
Desprendimiento de células con Tripsina EDTA
CITOMETRÍA
Annexin V-PE
7-AAD
Porcentaje de células
apoptóticas y no apoptóticas
CITOMETRÍA
GFP
Porcentaje de
células infectadas
Tinción de GIEMSA
Porcentaje de células
infectadas
4.10 TINCIÓN DE TUNEL PARA MEDIR LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN EN
MACRÓFAGOS U-937
Para determinar si L. panamensis, L. mexicana ó L. donovani alteraron los niveles
de fragmentación de ADN en macrófagos U937, se utilizó el ensayo de TUNEL
(terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling) (Kit Apo-BrdURedTM - Biovision) por citometría de flujo.
En esta prueba la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) incorpora el
BrdUTP (nucleótido desoxiuridina trifosfato bromolado) a los extremos 3'-hidroxilo
(OH) de las cadenas de ADN rotas en células apoptóticas. Un aumento en la
incorporación del BrdUTP dará lugar a una señal positiva para fragmentación de
47
ADN la cual se identificará en el citómetro por el fluorocromo rojo presente en el
BrdUTP-Red.
Para este objetivo se empleó la misma estrategia experimental anterior, solo que
ésta vez se midieron dos tiempos: uno temprano 24 horas post tratamiento y otro
tardío a las 72 horas (Figura 7).
Los datos adquiridos en el citómetro de flujo se analizaron en el programa FlowJo
7.6. Se realizó un dotplot FSC Vs SSC para establecer la región de macrófagos.
Posteriormente, se elaboró un histograma para evaluar el porcentaje de células
BrdUTP-Red positivas y se hallaron los índices de intensidad de fluorescencia
media.
Figura 7. Estrategia experimental para medir el nivel de fragmentación de ADN en
macrófagos humanos de la línea U937 infectados con L. panamensis, L. mexicana
y L. donovani usando el ensayo de TUNEL.
Cepas en medio Schneider’s
L. panamensis GFP012
L. mexicana GFP013
L. donovani GFP019
Monocitos U937
Opsonización de parásitos
Adherencia y diferenciación a macrófagos
No Infección
Con inductor:
Estaurosporina (6µM)
Camptothecina (6µM)
D-PBS
Infección
Dosis infectiva
40 parásitos:1 célula
Sin inductor
Con inductor:
Estaurosporina (6µM)
Camptothecina (6µM)
D-PBS
Sin inductor
24hr, 72hr
Desprendimiento de células con Tripsina EDTA
CITOMETRÍA
TUNEL
Fragmentación del ADN
CITOMETRÍA
GFP
Porcentaje de
células infectadas
48
Tinción de GIEMSA
Porcentaje de células
infectadas
4.11 TINCIÓN CON Syto 16 Y Annexin V-Alexa 568 PARA MEDIR LA
VIABILIDAD DE Leishmania DENTRO DEL MACRÓFAGO APOPTÓTICO
La viabilidad de amastigotes en células apoptóticas se evaluó mediante tinción con
Syto16 (Invitrogen) y Annexin V-Alexa 568 (Invitrogen) por microscopía de
fluorescencia.
El Syto 16 mide viabilidad y es permeable permitiendo teñir macrófago y parásito
intracelular. Syto 16 se enlaza a los ácidos nucleicos y los tiñe de color verde
brillante en células viables y color verde disminuido para aquellas que presentan
apoptosis temprana.
La disminución de la fluorescencia del Syto 16 puede deberse a alteraciones
cromosomales ocurridas durante la apoptosis. Se han planteado varias hipótesis
que explicarían la disminución en el brillo del Syto 16. Una está relacionada con la
cantidad de colorante que puede enlazarse en el núcleo, la que se reduce en
células apoptóticas debido a la condensación de la cromatina y/o la degradación
del ARN. La otra tiene que ver con la disminución del potencial de membrana
mitocondrial durante la apoptosis, la cual impide que el Syto 16 penetre en este
organelo y por consiguiente se evita su enlace con el ADN mitocondrial.
El Annexin V-Alexa 568 es altamente afín a la fosfatidilserina permitiendo medir la
apoptosis. Éste no penetra el macrófago, así que solo se detectará la
fosfatidilserina de la célula hospedera, la cual se teñirá de rojo.
Para este objetivo se empleó la misma estrategia experimental anterior, salvo que
para este caso no se utilizaron cepas transfectadas con GFP ya que su
fluorescencia es capturada en el mismo canal que la del Syto 16 (Figura 8).
Se procesaron los sobrenadantes y las laminillas adheridas. En los sobrenadantes
se encontraron las células que entraron en apoptosis y perdieron adherencia. En
las laminillas adheridas quedaron las células que en su mayor proporción son
viables. Las células provenientes de sobrenadantes fueron colectadas en tubos y
lavadas dos veces con Buffer Hepes 20mM con 2mM CaCl2 a 1900 r.p.m. por 5
min a 4 ºC. Luego las células fueron resuspendidas en 100µl de Buffer Hepes y
teñidas con 5µl de Annexin V-Alexa 568 y 0.25µl de Syto16 por 15 minutos a 4 ºC.
Después se lavaron dos veces y fueron resuspendidas en 100µl Buffer Hepes con
una gota de SlowFade® Gold Antifade Reagent (Invitrogen), el cual es un agente
que evita la pérdida de fluorescencia de los fluorocromos. Veinte µl de la
suspensión celular fueron montados en láminas tratadas con Poly-L-lysine 0.01%.
Las laminillas adheridas se dejaron secar y se fijaron con metanol. Cada laminilla
se tiñó con 20 µl del cóctel de tinción (por cada 100µl de Buffer Hepes 20mM 5µl
Annexin V-Alexa 568 y 0.25µl de Syto 16) en cámara húmeda a 4ºC por 15
49
minutos. Fueron lavadas dos veces con Buffer Hepes 20mM y montadas con una
gota de SlowFade® Gold Antifade Reagent.
Figura 8. Estrategia experimental para medir la viabilidad de amastigotes de L.
panamensis, L. mexicana y L. donovani en macrófagos humanos apoptóticos
mediante tinción con Syto16 y Annexin V-Alexa 568 por microscopía de
fluorescencia.
L. panamensis 1989
L. mexicana LM16
L. donovani DD8
Monocitos U937
Opsonización de parásitos
Adherencia y diferenciación a macrófagos
No Infección
Con inductor:
Estaurosporina (6µM)
Camptothecina (6µM)
D-PBS
Infección
Dosis infectiva
40 parásitos:1 célula
Sin inductor
Con inductor:
Estaurosporina (6µM)
Camptothecina (6µM)
D-PBS
Sin inductor
24hr, 72hr
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
Syto16
Annexin V-Alexa 568
Tinción de GIEMSA
Porcentaje de células
infectadas
4.11.1 Evaluación de las láminas por microscopía de fluorescencia. Las láminas
se evaluaron usando el microscopio de fluorescencia Eclipse E800. Para evaluar
Syto 16 se utilizó el filtro FITC (ADN: Ex/Em 488/518) (ARN: Ex/Em 494/525).
Para evaluar Annexin V-Alexa 568 se usó el filtro TRITC (Ex/Em 578/603). Se
evaluaron 100 células por laminilla rotuladas con código numérico (código ciego).
El evaluador utilizó el siguiente criterio de evaluación:
• Macrófagos vivos: Syto 16 brillante y Annexin V-Alexa 568 negativo.
50
• Macrófagos en apoptosis temprana:
Syto 16 brillante y Annexin V-Alexa 568 positivo.
Syto 16 disminuido y Annexin V-Alexa 568 positivo.
Syto 16 disminuido y Annexin V-Alexa 568 negativo.
•
Macrófagos en apoptosis tardía: Syto 16 negativo y Annexin V-Alexa 568
positivo.
• Parásitos vivos: Syto 16 brillante.
51
5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se realizó la prueba de Shapiro-Wilk con el fin de establecer la normalidad de los
datos. Las variables respuesta (% de células muertas, % macrófagos Annexin V+,
% de macrófagos infectados, etc) no cumplieron los supuestos de normalidad, así
que se realizaron análisis estadísticos no paramétricos.
Para cada variable respuesta en cada tiempo de evaluación se hicieron
comparaciones entre las especies evaluadas en cada tratamiento. Se aplicó la
prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (K-W) y el procedimiento de Dunn’s para
comparaciones múltiples. Para establecer la correlación entre variables se
realizaron análisis de correlación de Spearman. Asimismo, para comparar dos
poblaciones independientes se aplicó la prueba de Mann-Whitney U.
Los análisis se efectuaron usando los programas SPSS® versión 19 y Prism 5
(GraphPad, Inc.). Valores p<0.01 y p<0.05 se consideraron estadísticamente
significativos.
52
6. RESULTADOS
6.1 LA INFECCIÓN CON ESPECIES DE Leishmania TIENE EFECTO SOBRE LA
APOPTOSIS Y NO SOBRE LA NECROSIS DEL MACRÓFAGO
Las infecciones con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani ocasionaron un
efecto directo sobre la apoptosis y no sobre la necrosis del macrófago U937. En
general, los porcentajes de necrosis de los macrófagos infectados con cualquiera
de las especies de Leishmania no superaron el 10% en los tratamientos
evaluados. Así mismo, ninguno de los inductores usados indujo necrosis. En
presencia del inductor estaurosporina se observó aumento de apoptosis en
relación con el tiempo, tanto en ausencia de infección como con cada una de las
tres especies evaluadas (Figura 9A y B). Con camptothecina y D-PBS se
obtuvieron resultados similares a los observados con estaurosporina (datos no
publicados).
53
Figura 9. Efecto de la infección con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani en
la muerte celular de macrófagos humanos de la línea U937 a las 8, 24, 48 y 72
horas post-tratamiento. La apoptosis se determinó por la exteriorización de
fosfatidilserina con Annexin V-PE y la necrosis por tinción con 7AAD mediante
citometría de flujo. Apoptosis (○) y necrosis (■). A) Sin inductor, B) Estaurosporina.
Se graficaron los promedios ± el error estándar de la media. Los análisis
corresponden a 4 experimentos independientes.
40
20
8
24
80
60
40
20
0
8
24
48
Horas
APOPTOSIS
60
40
20
8
24
48
72
100
72
80
60
40
20
0
8
24
48
80
60
60
40
40
20
20
8
24
48
Horas
72
NECROSIS
Fuente: Autor
54
0
80
60
40
20
0
72
100
80
0
100
100
80
0
72
% M uerte celular
% M uerte celular
100
48
Horas
L. donovani
% M u e r te c e lu la r
60
L. mexicana
% M u e r te c e lu la r
80
0
B
100
% M u e rte c e lu la r
% M u e r te c e lu la r
100
L. panamensis
8
24
48
72
8
24
48
Horas
72
100
% M uerte celular
Sin infección
A
8
24
48
Horas
72
80
60
40
20
0
6.2 EFECTO DIFERENCIAL DE LA INFECCIÓN CON ESPECIES DE Leishmania
EN
LA
APOPTOSIS
DEL
MACRÓFAGO
DETERMINADA
POR
EXTERIORIZACIÓN DE FOSFATIDILSERINA
En los macrófagos U937 se indujo exteriorización de fosfatidilserina con los
inductores estaurosporina y camptothecina de forma significativa (*:p<0.05 ó **:
p<0.01) con respecto al control sin inductor post-tratamiento, en todos los tiempos
evaluados. El D-PBS indujo la exteriorización a partir de las 48 horas (Figura 10).
Figura 10. Porcentaje de macrófagos humanos de la línea celular U937 Annexin
V+ a las 8, 24, 48 y 72 horas post-tratamiento con los inductores: Estaurosporina,
Camptothecina y D-PBS. La apoptosis se determinó a través de la exteriorización
de fosfatidilserina de los macrófagos con Annexin V-PE por citometría de flujo. Se
graficaron las medianas con el rango intercuartil. Las diferencias significativas
entre los grupos se establecieron aplicando la prueba de Kruskall-Wallis (K-W) y el
procedimiento de Dunn’s (*: p<0.05, **: p<0.01). Los análisis corresponden a 4
experimentos independientes.
K-W p= 0.03
K-W p= 0.02
% Macrófagos Annexin V+
100
K-W p= 0.01
**
80
60
40
**
*
*
**
**
*
*
*
CONTROLES
Sin inductor, sin infección
Estaurosporina, sin infección
Camptothecina, sin infección
D-PBS, sin infección
20
0
8
24
48
Tiempo (horas)
72
Fuente: Autor
La infección por L. panamensis indujo la exteriorización de fosfatidilserina del
macrófago en ausencia del inductor en todos los tiempos evaluados. En relación al
control, sin inductor y sin infección, L. panamensis incrementó los niveles de
exteriorización de fosfatidilserina de los macrófagos U937 en 6%, 9%, 10% y 23%
para las 8, 24, 48 y 72 horas, respectivamente, presentando diferencias
significativas a las 72 horas (p<0.05) (Figura 11A).
55
Por el contrario, las infecciones con L. mexicana y L. donovani produjeron niveles
de exteriorización de fosfatidilserina del macrófago por debajo del control, sin
inductor y sin infección. Sin embargo, en ninguna de las dos especies se
observaron diferencias significativas con respecto al control para cada uno de los
tiempos evaluados (Figura 11A).
Al realizar comparaciones entre especies en el tratamiento sin inductor, se
encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre L. panamensis y L. mexicana
a las 72 horas, con un 57% y 30% respectivamente, de fosfatidilserina
exteriorizada por el macrófago y entre L. panamensis y L. donovani en el mismo
tiempo, con un 57% y 29% respectivamente (Figura 11A). No existieron
diferencias significativas en ninguno de los tiempos evaluados cuando se comparó
L. donovani con L. mexicana (Figura 11A).
En presencia de estaurosporina, la infección con L. panamensis o L. mexicana no
cambió significativamente el nivel de exteriorización de fosfatidilserina en los
macrófagos U937 en relación al control (Figura 11B).
La infección con L. donovani en presencia de estaurosporina, redujo la
exteriorización de fosfatidilserina del macrófago en relación al control, en un 6%,
17%, 22% y 25% para las 8, 24, 48 y 72 horas respectivamente, presentando
diferencias significativas a las 24 y 72 horas (p<0.05) (Figura 11B).
En el tratamiento con estaurosporina, se encontraron diferencias significativas
(p<0.05) en los niveles de exteriorización de fosfatidilserina del macrófago, entre
las especies L. panamensis y L. donovani a las 24, 48 y 72 horas, con un 51% y
28%, 77% y 55%, 85% y 56%, respectivamente (Figura 11B). Además, a las 72
horas, las especies L. mexicana y L. donovani presentaron diferencias
significativas en la exteriorización de fosfatidilserina del macrófago con un 82% y
56%, respectivamente. No existieron diferencias significativas en ninguno de los
tiempos evaluados cuando se comparó L. panamensis con L. mexicana (Figura
11B).
En presencia del inductor camptothecina, no se detectaron diferencias
significativas con relación al control en los niveles de exteriorización de
fosfatidilserina del macrófago luego de la infección con ninguna de las especies
evaluadas. Sin embargo, con L. donovani se observó una reducción en la
exteriorización de la fosfatidilserina del macrófago en un 7%, 8%, 7% y 13% para
las 8, 24, 48 y 72 horas, respectivamente (Figura 11C).
Con camptothecina, se encontraron diferencias significativas (p<0.05) en los
niveles de exteriorización de fosfatidilserina entre las especies L. mexicana y L.
donovani y esta última y L. panamensis a las 72 horas, con un 93% y 74% de
apoptosis y 74% y 90%, respectivamente (Figura 11C).
56
En presencia de D-PBS, L. donovani redujo la exteriorización de fosfatidilserina del
macrófago con respecto al control en 20% y 31% para las 48 y 72 horas
respectivamente, aunque estas diferencias no fueron significativas. Luego de la
infección con L. panamensis o L. mexicana no se observó diferencias significativas
con respecto al control, en niveles de fosfastidilserina exteriorizada por el
macrófago. Así mismo, se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre las
especies L. mexicana y L. donovani con 89% y 50% de fosfatidilserina
exteriorizada por el macrófago a las 72 horas (Figura 11D).
Figura 11. Efecto de la infección con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani en
la exteriorización de fosfatidilserina de macrófagos humanos de la línea celular
U937 a las 8, 24, 48 y 72 horas post-tratamiento, en ausencia o presencia de
inductor: A) Sin inductor, B) Estaurosporina, C) Camptothecina, D) D-PBS. La
apoptosis se determinó a través de la exteriorización de fosfatidilserina de los
macrófagos con Annexin V-PE por citometría de flujo. Se graficaron las medianas
con el rango intercuartil. Las diferencias significativas entre los grupos se
determinaron aplicando la prueba de Kruskall-Wallis (K-W) y el procedimiento de
Dunn’s (*: p<0.05). Los análisis corresponden a 4 experimentos independientes.
Sin inductor
A
% Macrófagos Annexin V+
100
80
*
60
*
100
80
*
40
20
8
24
48
Tiempo (horas)
Camptothecina
100
72
*
*
0
60
60
40
40
20
20
24
48
Tiempo (horas)
72
24
48
Tiempo (horas)
72
0
8
Fuente: Autor
57
Sin infección
L. panamensis
L. mexicana
D-PBS
L. donovani
*
100
80
8
8
D
80
0
*
*
*
*
*
60
20
C
% Macrófagos Annexin V+
*
*
40
0
B
K-W p= 0.05
Estaurosporina
24
48
Tiempo (horas)
72
6.3 EFECTO DIFERENCIAL DE ESPECIES DE Leishmania EN LA APOPTOSIS
DEL MACRÓFAGO, DETERMINADA POR FRAGMENTACIÓN DEL ADN
En los macrófagos U937, ambos inductores de apoptosis, camptothecina y
estaurosporina, indujeron fragmentación del ADN de forma significativa (p<0.05 ó
p<0.01) con respecto al control sin inductor a las 72 horas. Con D-PBS, no se
observaron diferencias significativas en este parámetro en ningún tiempo
evaluado, con respecto al control sin inductor (Figura 12).
Figura 12. Porcentaje de macrófagos humanos de la línea celular U937 BrdURed+ a las 24 y 72 horas post-tratamiento con los inductores: Estaurosporina,
Camptothecina y D-PBS. La apoptosis se determinó a través de la fragmentación
del ADN de los macrófagos con TUNEL por citometría de flujo. Se graficaron las
medianas con el rango intercuartil. Las diferencias significativas entre los grupos
se determinaron aplicando la prueba de Kruskall-Wallis (K-W) y el procedimiento
de Dunn’s (*: p<0.05, **: p<0.01). Los análisis corresponden a 4 experimentos
independientes.
K-W p=0.05
% Macrófagos BrdU-Red+
100
80
**
K-W p=0.01
**
60
*
CONTROLES
40
Sin inductor, sin infección
Estaurosporina, sin infección
Camptothecina, sin infección
D-PBS, sin infección
20
0
24
Tiempo (horas)
72
Fuente: Autor
La infección con L. panamensis no produjo diferencias significativas a nivel de
fragmentación del ADN del macrófago en relación al control, ni en ausencia del
inductor, ni en presencia de estaurosporina o camptothecina. Con D-PBS a las 72
horas se observó diferencias significativas (p<0.05) entre el control y esta especie,
en la fragmentación del ADN (Figura 13 A-D).
58
Por su parte, L. mexicana redujo significativamente la fragmentación del ADN del
macrófago a las 24 horas, en relación al control, tanto en ausencia de inductor,
como en presencia de estaurosporina o D-PBS (7% de reducción sin inductor,
p<0.05; 17% de reducción con estaurosporina, p<0.05 y 5% de reducción con DPBS, p<0.05) (Figura 13 A, B y D). En presencia de estaurosporina, aunque no
hubo diferencia significativa a las 72 horas, L. mexicana redujo en un 29% con
respecto al control, la fragmentación del ADN del macrófago (Figura 13B).
Al igual que con L. mexicana, la infección con L. donovani redujo
significativamente la fragmentación del ADN del macrófago en relación al control
en un 35%, a las 72 horas de evaluación, cuando la apoptosis fue inducida con
estaurosporina (p<0.05, Figura 13B). En ausencia de inductor y en presencia de
camptothecina o D-PBS, no se observaron diferencias significativas con respecto
al control, en los niveles de fragmentación del ADN del macrófago, por efecto de la
infección con esta especie, en ninguno de los tiempos evaluados (Figura 13A, C y
D).
Evidentemente, en presencia de camptothecina, con ninguna de las tres especies
de Leishmania evaluadas, hubo efecto sobre la fragmentación del ADN del
macrófago (Figura 13C).
Al realizar comparaciones entre especies, en ausencia del inductor o en presencia
de camptothecina, no se encontraron diferencias significativas en los niveles de
fragmentación del ADN del macrófago entre las especies evaluadas (Figura 13A).
En contraste, en presencia de estaurosporina, L. panamensis indujo niveles de
fragmentación del ADN del macrófago a las 72 horas significativamente más altos
(62% macrófagos BrdU-Red+) que L. mexicana (21% macrófagos BrdU-Red+,
p<0.05) y L. donovani (14% de macrófagos BrdU-Red+, p<0.01) (Figura 13B).
En presencia de D-PBS, aunque se encontraron diferencias significativas en los
niveles de fragmentación del ADN del macrófago a las 24 horas, entre L.
panamensis y L. mexicana (6% vs. 1% de macrófagos BrdU-Red+,
respectivamente; p<0.05), y entre L. mexicana y L. donovani (1% vs. 9% de
macrófagos BrdU-Red+, respectivamente; p<0.01) (Figura 13D), estos niveles
fueron más bajos que con estaurosporina.
59
Figura 13. Efecto de la infección con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani en
la fragmentación del ADN de macrófagos humanos de la línea celular U937 a las
24 y 72 horas post-tratamiento, en ausencia o presencia de inductor: A) Sin
inductor, B) Estaurosporina, C) Camptothecina, D) D-PBS. La apoptosis se
determinó a través de la fragmentación del ADN de los macrófagos con TUNEL
por citometría de flujo. Se graficaron las medianas con el rango intercuartil. Las
diferencias significativas entre los grupos se determinaron aplicando la prueba de
Kruskall-Wallis (K-W) y el procedimiento de Dunn’s (*: p<0.05, **: p<0.01). Los
análisis corresponden a 4 experimentos independientes.
Sin inductor
A
B
% Macrófagos BrdU-Red+
40
*
**
*
80
60
*
20
*
40
10
20
0
24
C
Tiempo (horas)
72
0
Camptothecina
100
80
80
60
60
40
40
20
20
24
Tiempo (horas)
72
24
Tiempo (horas)
72
Sin infección
L. panamensis
D-PBS
D
100
% Macrófagos BrdU-Red+
K-W p= 0.01
100
30
0
Estaurosporina
L. mexicana
L. donovani
K-W p= 0.03
*
*
* **
0
24
Fuente: Autor
60
Tiempo (horas)
72
6.4 LOS AMASTIGOTES DE L. panamensis, L. mexicana Y L. donovani
SOBREVIVIERON A LA APOPTOSIS DEL MACRÓFAGO
Con el propósito de evaluar si Leishmania sobrevive a la apoptosis del macrófago,
se observó simultáneamente la apoptosis de la célula hospedera y la viabilidad de
los amastigotes intracelulares mediante microscopía de fluorescencia.
En la microscopía de fluorescencia, el parámetro de medida para determinar la
viabilidad fue Syto16+ brillante (Syto16+b) (Figura 14A). La apoptosis fue
determinada por exteriorización de fosfatidilserina (Annexin V-Alexa 568+) (Figura
14 B-E). Se observaron diferentes fases de la apoptosis del macrófago, desde
cuando la célula apoptótica no ha perdido la integridad del núcleo (Figura 14B),
pasando por la condensación de la cromatina nuclear y pérdida del volumen
celular (Figura 14C), hasta el desprendimiento de cuerpos apoptóticos (Figura
14E).
61
Figura 14. Microscopia de fluorescencia de macrófagos humanos de la línea
celular U937 marcados con Syto16 y Annexin V-Alexa 568. La tinción verde
brillante indica viabilidad (Syto16+b), la verde opaca o disminuida (Syto16+d)
indica perdida de viabilidad y la roja indica apoptosis (Annexin V-Alexa 568+). A)
Macrófagos vivos (Syto16+b, Annexin V-Alexa 568-). Fases de la apoptosis
observadas: B) Macrófago apoptótico sin cromatina nuclear condensada (Annexin
V-Alexa 568+, Syto16+b), C) Macrófago apoptótico con núcleo condensado
(Annexin V-Alexa 568+, Syto16+d), D) Macrófago en apoptosis tardía (Annexin VAlexa 568+, Syto16-) y E) Macrófago con cuerpo apoptótico desprendido (Annexin
V-Alexa 568+, Syto16-).
A
AnnV Alexa568-
B
AnnV Alexa568+
C
AnnV Alexa568+
D
AnnV Alexa568+
E
AnnV Alexa568+
Syto16+ brillante Syto16+ brillante
Syto16+ disminuido Syto16-
Syto16-
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Fuente: Autor
62
Sobreposición
Para la microscopía de fluorescencia se evaluaron las células en sobrenadantes y
en laminillas. En los sobrenadantes se encontraron las células que entraron en
apoptosis y perdieron adherencia, mientras que en las laminillas quedaron las
células adheridas, que en una alta proporción fueron viables. Con camptothecina a
las 72 horas de evaluación, se observó en laminilla, macrófagos apoptóticos
infectados con L. panamensis o L. mexicana (Figura 15). Sin embargo, en todos
los tratamientos evaluados los macrófagos apoptóticos con parásitos Syto16+b
(viables) se encontraron en el sobrenadante.
Figura 15. Macrófagos apoptóticos humanos de la línea celular U937 evaluados
en sobrenadante y laminilla a las 24 y 72 horas post-tratamiento en ausencia o
presencia de inductor: A) Sin inductor, B) Estaurosporina, C) Camptothecina, D) DPBS. La apoptosis se determinó a través de la exteriorización de fosfatidilserina de
los macrófagos con Annexin V-Alexa 568, por microscopía de fluorescencia. Se
graficaron los promedios ± el error estándar de la media. Los análisis
corresponden a 4 experimentos independientes.
Sin inductor
% Macrófagos apoptóticos
A
Sobrenadante
Laminilla
Estaurosporina
B
Sobrenadante
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
24
72
Horas
24
Camptothecina
% Macrófagos apoptóticos
C
Sobrenadante
0
72
Laminilla
80
80
60
60
40
40
20
20
72
Horas
24
72
Horas
Sobrenadante
100
24
72
24
72
D-PBS
D
100
0
24
Laminilla
0
Fuente: Autor
63
24
72
Laminilla
Horas
24
72
Sin infección
L. panamensis
L. mexicana
L. donovani
Los amastigotes intracelulares de L. panamensis, L. mexicana y L. donovani
sobrevivieron a la apoptosis del macrófago (Figura 16 B, D y F). Incluso, se
observaron amastigotes Syto16+b de Leishmania en las prolongaciones de las
células apoptóticas (blebs) (Figura 17A, B y D) y en los cuerpos apoptóticos
(Figura 17C)
64
Figura 16. Microscopia de fluorescencia de macrófagos apoptóticos conteniendo amastigotes de Leishmania vivos
(Syto16+b). La tinción roja indica apoptosis (Annexin V-Alexa 568+), verde brillante viabilidad (Syto16+b). A, C y E)
Macrófagos vivos con amastigotes de Leishmania vivos. B, D y F) Macrófagos apoptóticos con amastigotes de
Leishmania vivos. Las flechas señalan amastigotes vivos.
L. panamensis
A
B
L. mexicana
C
D
L. donovani
E
F
AnnV Alexa568-
AnnV Alexa568+
AnnV Alexa568-
AnnV Alexa568+
AnnV Alexa568-
AnnV Alexa568+
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Fuente: Autor
65
Figura 17. Microscopia de fluorescencia de macrófagos apoptóticos conteniendo amastigotes de Leishmania vivos en
prolongaciones (blebs) (A, B y D) y en cuerpos apoptóticos (C). La tinción roja indica apoptosis (Annexin V Alexa 568+), verde
viabilidad (Syto16+b). Las flechas señalan amastigotes vivos. A-C: L. panamensis; D: L. donovani
A
B
C
D
AnnV Alexa568+
AnnV Alexa568+
AnnV Alexa568+
AnnV Alexa568+
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Syto16+ brillante
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Sobreposición
Fuente: Autor
66
Los macrófagos apoptóticos infectados con L. panamensis, L. mexicana y L.
donovani, en ausencia de inductor, presentaron amastigotes viables (Syto16+b) a
las 24 y 72 horas de evaluación. La especie que indujo mayor cantidad de
macrófagos apoptóticos con amastigotes viables fue L. panamensis con 25% y
15%, a las 24 y 72 horas, respectivamente; seguida por L. mexicana con 15% y
8% y L. donovani con 6% y 5%, a las 24 y 72 horas, respectivamente. Se
observaron diferencias significativas en viabilidad a las 24 y 72 horas entre L.
panamensis y L. donovani (p<0.05 y p<0.01 respectivamente) (Figura 18A).
En presencia de estaurosporina, a las 24 horas post-tratamiento el porcentaje de
células apoptóticas con amastigotes viables fue significativamente mayor para
células infectadas con L. panamensis (29%) que para macrófagos infectados L.
donovani (3%) (p<0.01). Contrariamente, a las 72 horas, la viabilidad intracelular
de amastigotes en macrófagos apoptóticos fue mayor para L. donovani (17%) en
comparación con las otras dos especies, siendo significativa la diferencia con
respecto a L. mexicana (4%, p<0.01) (Figura 18B). Esta mayor supervivencia de
amastigotes de L. donovani en macrófagos apoptóticos (20%) en comparación con
L. mexicana (0%) (p<0.01), se reprodujo cuando se tuvo D-PBS como inductor a
las 72 horas de evaluación (Figura 18D).
67
Figura 18. Macrófagos apoptóticos humanos de la línea celular U937 con
parásitos intracelulares Syto16+ brillantes (Syto16+b) ó vivos de L. panamensis, L.
mexicana ó L. donovani a las 24 y 72 horas post-tratamiento en ausencia o
presencia de inductor: A) Sin inductor, B) Estaurosporina, C) Camptothecina, D) DPBS. La apoptosis del macrófago se determinó a través de la exteriorización de
fosfatidilserina con Annexin V-Alexa 568 y la viabilidad del amastigote con Syto16
por microscopía de fluorescencia. Se graficaron las medianas con el rango
intercuartil. Las diferencias significativas entre los grupos se determinaron
aplicando la prueba de Kruskall-Wallis (K-W) y el procedimiento de Dunn’s (*:
p<0.05, **: p<0.01). Los análisis corresponden a 4 experimentos independientes.
Sin inductor
% Macrófagos apoptóticos
con parásitos Syto16+b
A
60
K-W p= 0.01
*
40
60
40
K-W p= 0.01
**
K-W p= 0.01
**
20
0
24
C
% Macrófagos apoptóticos
con parásitos Syto16+b
**
20
Tiempo (horas)
K-W p= 0.03
L. panamensis
L. mexicana
L. donovani
D-PBS
K-W p= 0.04
K-W p= 0.02
**
40
*
*
24
72
Tiempo (horas)
*
20
0
24
D
60
*
40
0
72
Camptothecina
60
Estaurosporina
B
Tiempo (horas)
72
*
20
0
Fuente: Autor
68
24
Tiempo (horas)
72
6.5 EMISIÓN DE FLUORESCENCIA DE LAS CEPAS L. panamensis, L. mexicana
Y L. donovani TRANSFECTADAS CON GFP
Todas las especies de Leishmania transfectadas presentaron porcentajes de
emisión de GFP+ superiores al 90% después de la selección en presencia de
Neomicina. Los índices de fluorescencia media determinados mediante citometría
de flujo fueron de 1019, 713 y 551, para L. panamensis, L. mexicana y L.
donovani, respectivamente (Figura 19). La emisión de GFP de las especies de
Leishmania transfectadas fue comprobada por microscopía de fluorescencia
(Figura 20).
Figura 19. Porcentaje de emisión de fluorescencia de GFP determinada por
citometría de flujo. A) Control sin transfectar (L. panamensis), B) L. panamensis
GFP, C) L. mexicana GFP y D) L. donovani GFP.
L. panamensis GFP012
# CÉLULAS
Leishmania sin GFP
GFP
Fuente: Autor
69
L. mexicana GFP013
L. donovani GFP019
Figura 20. Microscopía de fluorescencia de las cepas L. panamensis, L. mexicana
y L. donovani transfectadas con GFP.
L. panamensis
L. mexicana
L. donovani
Fuente: Autor
6.6 LOS PORCENTAJES DE INFECTIVIDAD MEDIDOS POR GFP Y GIEMSA
NO CAMBIARON EN EL TIEMPO PARA L. panamensis, MIENTRAS QUE PARA
L. mexicana Y L. donovani PRESENTARON DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS EN
ALGUNOS PUNTOS EN EL TIEMPO
Los porcentajes de infección del macrófago con las especies de Leishmania
evaluadas fueron determinados por citometría mediante fluorescencia de GFP y
microscopía por coloración con GIEMSA. Con L. panamensis los porcentajes de
infección obtenidos mediante las dos técnicas no fueron diferentes en el tiempo.
Sin embargo, para L. mexicana y L. donovani hubo diferencias significativas en
cuanto al porcentaje de infección del macrófago, entre los dos métodos de
medición evaluados para algunos puntos del tiempo (Figura 21). L. mexicana
presentó diferencias significativas a las 24 horas (macrófagos GFP+=72% y
GIEMSA=85% p=0.03) y 48 horas (macrófagos GFP+=69% y GIEMSA=85%
p=0.03). L. donovani presentó diferencias significativas a las 24 horas (macrófagos
GFP+=52% y GIEMSA=71% p=0.03) y 72 horas (macrófagos GFP+=29% y
GIEMSA=67% p=0.03) (Figura 21B y C).
70
No se encontró correlación entre los porcentajes de infección determinados por
citometria de flujo y microscopia, cuando se aplicó la prueba de Correlación de
Spearman (datos no publicados).
Figura 21. Porcentaje de infección en macrófagos humanos de la línea celular U937 infectados con (A) L. panamensis GFP, (B) L. mexicana GFP y (C) L.
donovani GFP determinados por dos métodos: microscopía usando la coloración
de GIEMSA y citometría de flujo por el porcentaje de GFP+. Se graficaron las
medianas con el rango intercuartil. Las diferencias significativas entre los métodos
(GIEMSA vs GFP+) para cada uno de los tiempos evaluados se determinaron
aplicando la prueba de Mann-Whitney U *p<0.05. Los análisis corresponden a 4
experimentos independientes.
L. panamensis
% Macrófagos infectados
B
100
80
60
40
20
0
8
24
48
72
Horas
C
% Macrófagos infectados
% Macrófagos infectados
A
100
80
*
*
24
48
60
40
20
0
8
Horas
L. donovani
100
80
*
*
60
GFP +
GIEMSA
40
20
0
L. mexicana
8
24
48
Horas
Fuente: Autor
71
72
72
6.7 L. panamensis Y L. mexicana SON MAS INFECTIVAS QUE L. donovani
Aunque la dosis infectiva 50 para las tres especies fue la misma (1:40;
macrófago:parásitos), se observó que los porcentajes de infección de L. donovani
fueron significativamente menores con respecto a L. panamensis y L. mexicana,
tanto por microscopia como por citometría de flujo (Figura 22 A y B). Las cepas L.
panamensis y L. mexicana presentaron porcentajes de infección en el tiempo entre
el 70% y 90% y no hubo diferencias significativas entre estas dos especies con las
dos técnicas evaluadas (Figuras 22 A y B).
Además, la carga parasitaria (número parásitos/célula) causada por las tres
especies reprodujo los resultados de porcentaje de infección, confirmando que L.
donovani es significativamente menos infectiva que L. panamensis (p<0.05) o L.
mexicana (p<0.05 o p<0.01), (Figura 22C).
72
Figura 22. Porcentaje de infección en macrófagos humanos de la línea celular U937 con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani evaluados por: A) Microscopía
empleando la coloración de GIEMSA. B) Citometría de flujo por el porcentaje de
GFP+. C) Carga parasitaria determinada por microscopía (GIEMSA). Se graficaron
las medianas con el rango intercuartil. Las diferencias significativas entre los
grupos se determinaron aplicando la prueba de Kruskall-Wallis (K-W) y el
procedimiento de Dunn’s (*: p<0.05, **: p<0.01). Los análisis corresponden a 4
experimentos independientes.
K-W p= 0.02
100
*
*
K-W p= 0.03
*
*
B
K-W p= 0.05
100
*
*
% M acrófagos GFP+
% M acrófagos infectados
(GIEM SA)
A
80
60
40
20
0
8
24
48
K-W p= 0.01
K-W p= 0.01
**
**
Nº parásitos/célula
15
*
48
72
20
0
8
24
Tiempo (horas)
K-W p= 0.02
*
K-W p= 0.02
*
*
K-W p= 0.02
*
*
*
K-W p= 0.02
*
**
5
8
24
48
Tiempo (horas)
Fuente: Autor
73
*
40
10
0
**
60
72
25
20
K-W p= 0.04
80
Tiempo (horas)
C
K-W p= 0.01
72
L. panamensis
L. mexicana
L. donovani
6.8 LA CARGA PARASITARIA DE LAS TRES ESPECIES DE Leishmania
EVALUADAS NO AFECTÓ LA APOPTOSIS DEL MACRÓFAGO
Ni las altas cargas parasitarias ocasionadas por la infección con L. panamensis o
L. mexicana, ni la baja carga parasitaria por L. donovani en el macrófago, se
correlacionaron con la exteriorización de la fosfatidilserina (Figura 23) o la
fragmentación del ADN de la célula hospedera (Figura 24).
74
Figura 23. Análisis de correlación entre la externalización de fosfatilserina y la carga parasitaria en macrófagos
U937 infectados con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani. Correlación de Spearman, r = coeficiente de
correlación.
L. panamensis
Nº parásitos/célula
L. mexicana
Nº parásitos/célula
L. donovani
Nº parásitos/célula
SIN INDUCTOR
r = 0.3
p = 0.2
20
ESTAUROSPORINA
r = 0.3
p = 0.2
20
CAMPTOTHECINA
r = 0.3
p = 0.3
20
D-PBS
15
15
15
15
10
10
10
10
5
5
5
5
0
0
0
0
20 40 60 80 100
r = -0.06
p = 0.8
20
0
20
40
60
80 100
r = 0.2
p = 0.5
20
0
20
40
60
80 100
r = 0.1
p = 0.7
20
0
15
15
15
10
10
10
10
5
5
5
5
0
20 40 60 80 100
r = 0.09
p = 0.7
20
0
0
20
40
60
80 100
r = -0.1
p = 0.7
20
0
0
20
40
60
80 100
r = 0.1
p = 0.7
20
0
15
15
15
10
10
10
10
5
5
5
5
0
20 40 60 80 100
% Annexin V+
0
0
20
40
60
80 100
0
0
20
40
60
80 100
% Annexin V+
% Annexin V+
Fuente: Autor
75
20
40
60
0
80 100
r = 0.04
p = 0.9
0
20
40
60
80 100
r = 0.2
p = 0.5
20
15
0
0
20
15
0
r = 0.3
p = 0.2
20
0
20
40
60
80 100
% Annexin V+
Figura 24. Análisis de correlación entre la fragmentación del ADN y la carga parasitaria en macrófagos U937
infectados con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani. Correlación de Spearman, r = coeficiente de correlación.
L. panamensis
Nº parásitos/célula
L. mexicana
Nº parásitos/célula
L. donovani
N º parásitos/célula
SIN INDUCTOR
r = -0.2
p = 0.6
20
ESTAUROSPORINA
r = 0.1
p = 0.8
20
CAMPTOTHECINA
r = -0.4
p = 0.3
20
D-PBS
15
15
15
10
10
10
10
5
5
5
5
15
0
0
10 20 30 40 50
r = -0.05
p = 0.9
20
15
0
0
20
40
60
80 100
r = -0.1
p = 0.7
20
15
0
0
20
40
60
20
80 100
r = -0.3
p = 0.4
15
r = 0.2
p = 0.6
20
0
0
10
10
5
5
5
5
10
20
20
30
40
r = 0.2
p = 0.6
15
0
0
20
40
60
20
80 100
r = 0.05
p = 0.9
15
0
0
20
40
60
80 100
r=0
p=1
20
15
0
10
10
5
5
5
5
0
10
20
30
% BrdU-Red +
40
0
0
20
40
60
80 100
0
0
20
40
60
80 100
% BrdU-Red +
% BrdU-Red +
Fuente: Autor
76
0
20
40
60
0
80 100
r=0
p=1
15
10
80 100
r = 0.07
p = 0.9
20
10
0
60
15
10
0
40
20
10
0
20
0
20
40
60
80 100
% BrdU-Red +
6.9 LA EMISIÓN DE GFP SE AFECTÓ POR ACCIÓN DE LA ESPECIE DE
Leishmania Y DEL TRATAMIENTO DE APOPTOSIS
Se observó una disminución significativa a través del tiempo en los porcentajes de
emisión de GFP de los macrófagos infectados con L. panamensis y L. mexicana,
en presencia de camptothecina (Figura 25A y B). L. mexicana presentó además,
diferencias significativas (p<0.05 o p<0.01) con estaurosporina con respecto al
control sin inductor (Figura 25B). Para estas dos especies la presencia de D-PBS
no afectó la emisión de GFP.
La presencia de estaurosporina no afectó a través del tiempo los porcentajes de
emisión de GFP de los macrófagos infectados con L. donovani; mientras que
camptothecina y D-PBS los disminuyeron significativamente (p<0.05 o p<0.01)
(Figura 25C).
77
Figura 25. Porcentajes de macrófagos humanos de la línea celular U-937 GFP+
con L. panamensis, L. mexicana y L. donovani determinados por citometría de
flujo. A) L. panamensis, B) L. mexicana y C) L. donovani. Se graficaron las
medianas con el rango intercuartil. Las diferencias significativas entre los grupos
se determinaron aplicando la prueba de Kruskall-Wallis (K-W) y el procedimiento
de Dunn’s (*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001). Los análisis corresponden a 4
experimentos independientes.
B
L. panamensis
% Macrófagos GFP +
K-W p= 0.02 K-W p= 0.01
100
K-W p= 0.02
80
60
40
**
20
0
*
**
8
24
48
72
Horas
% Macrófagos GFP +
% Macrófagos GFP +
A
C
100
K-W p= 0.05
80
60
*
40
K-W p= 0.01
*
***
20
0
K-W p= 0.003
8
24
48
**
**
72
Horas
L. donovani
K-W p= 0.01
80
60
K-W p=0.01
K-W p=0.01
40
20
0
L. mexicana
*
8
*
24
**
**
48
Horas
Fuente: Autor
78
**
72
Sin inductor
Estaurosporina
Camptothecina
D-PBS
7. DISCUSIÓN
La apoptosis es un mecanismo del sistema inmune que sirve para eliminar una
infección ocasionada por un patógeno intracelular. Sin embargo, también puede
convertirse en una medida a favor del patógeno cuando éste se vale de factores
propios o vías de señalización de su célula hospedera para inhibir ó inducir la
apoptosis de los fagocitos, con el fin de perpetuar la infección y pasar
desapercibido por el sistema inmune (DosReis et al., 2007; Faherty & Maurelli,
2008; Heussler et al., 2001; Laskay et al., 2008; Lüder et al., 2001; Ritter et al.,
2009; Ruhland et al. 2007; van Zandbergen et al., 2007).
En el presente trabajo se demuestra que la infección por L. panamensis en
macrófagos humanos de la línea histiocítica U937 induce una respuesta de
apoptosis temprana caracterizada por la externalización de fosfatidilserina a las 72
horas, sin afectar la integridad del ADN. Esta misma respuesta fue reportada en
infecciones con L. aethiopica, L. tropica ó L. major a las 48 y 72 horas en dos
líneas de macrófagos, U937 y THP-1, y en macrófagos derivados de monocitos de
sangre periférica humana (Getti et al., 2008). Además, se ha observado que los
neutrófilos infectados con L. major después de las 48 horas, exteriorizan
fosfatidilserina para promover una fagocitosis “silente” por parte del macrófago
(Aga et al., 2002; Laskay et al., 2003; Laskay et al., 2008; Ritter et al., 2009; van
Zandbergen et al., 2004b; van Zandbergen et al., 2007).
De forma similar, la bacteria intracelular Legionella pneumophila induce apoptosis
incompleta en los macrófagos durante la fase temprana de infección, al activar la
caspasa 3, sin fragmentar el ADN (Abu-Zant et al., 2005). La activación de la
caspasa 3 previene la fusión del endosoma con el lisosoma, evitando la
eliminación de la bacteria (Abu Khweek & Amer, 2010; Molmeret et al., 2004). Al
mismo tiempo, también es activada la vía anti-apoptótica NF-κB, para demorar la
apoptosis y permitir que el patógeno se aproveche de su célula hospedera (AbuZant et al., 2007). El balance de las dos respuestas facilita la replicación
bacteriana (Amer, 2010).
Otro caso similar ocurre con el parásito intracelular Toxoplasma gondii. La
infección con la cepa letal de T. gondii, RH, induce altos niveles de apoptosis en
las células del bazo, disminuyendo la producción de ON y proporcionando la
diseminación de la parasitemia (Gavrilescu & Denkers, 2001).
La señal de fosfatidilserina promueve una fagocitosis “silente”, es decir, que no se
activan los mecanismos efectores de la célula fagocítica profesional. En
infecciones por parásitos, se han descrito estrategias como las del caballo de
Troya ó el conejo de Troya, que se valen de dicha señal, para invadir de forma
“silente” y perpetuar la infección en la célula hospedera (Akarid et al., 2004;
79
DosReis et al., 2007; Heussler et al., 2001; Laskay et al., 2008; Ritter et al., 2009;
van Zandbergen et al., 2007).
Lo anterior indica que el curso de la infección puede favorecerse por el
reconocimiento de la fosfatidilserina por parte de la célula fagocítica. Esto fue
comprobado en macrófagos murinos infectados con parásitos de L. major y células
Jurkat apoptóticas con fosfatidilserina exteriorizada, que inactiva el mecanismo
efector de la célula hospedera, generando exacerbación de la infección (Laskay et
al., 2008; Ribeiro-Gomes et al., 2004). Así mismo, macrófagos infectados con L.
amazonensis al fagocitar neutrófilos apoptóticos, incrementaron la carga
parasitaria, lo que dependió de la producción de TGF-β1 y PGE2 (Afonso et al.,
2008).
Otro parásito como T. cruzi que induce apoptosis en los linfocitos T (de Meis et al.,
2006; DosReis & Lopes, 2009) durante el proceso infectivo, promueve la
interacción de macrófagos infectados con dichas células apoptóticas, estimulando
la secreción de citocinas como el TGF-β y la IL-10, que inhiben la producción de
ON y promueven la replicación del parásito intracelular al estimular la síntesis de
la poliamina putrescina y la PGE2 (DosReis, 2011; Freire-de-Lima et al., 2000; van
Zanbergen et al., 2007). Esto indica que las células apoptóticas regulan la
respuesta inmune a favor de la infección (DosReis & Lopes, 2009).
Lo expuesto previamente puede ser explicado con base a los fenotipos de
diferenciación del macrófago en respuesta a una diversidad de estímulos y
ambientes, los cuales se han denominado M1 ó M2. El macrófago M1 está
relacionado con la eliminación de microorganismos intracelulares a través de
especies reactivas del oxígeno (ROS) y del ON. El M2 está asociado a
inmunoregulación y remodelación de tejidos. La fagocitosis de células apoptóticas
puede generar macrófagos reguladores M2, que se caracterizan por secretar IL-10
y TGF-β, importantes para suprimir la producción de ROS y ON, incrementar la
actividad fagocítica del macrófago y regular negativamente la expresión del
complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHCII), lo cual atenúa la
presentación antigénica de los macrófagos (Duque & Rojas, 2007; Mosser &
Edwards, 2008).
La diferenciación a macrófagos reguladores M2, puede entonces favorecer la
supervivencia y replicación de los patógenos intracelulares (Mosser & Edwards,
2008). En el modelo murino C57BL/6 resistente a la infección por Leishmania y
caracterizado por una respuesta Th1, se ha reportado que al tratar los macrófagos
con neutrófilos apoptóticos, se induce un fenotipo regulador M2 caracterizado por
inducir IL-10 alto e IL-12 bajo, proporcionando la permisividad a la replicación de
L. major (Filardy et al., 2010).
80
Por otro lado, en este trabajo se demuestra que L. mexicana inhibe la
fragmentación del ADN del macrófago U937 a las 24 horas. Previamente, otro
estudio había comprobado que esta especie inhibe la apoptosis de las células
dendríticas hasta las 18 horas post-tratamiento con camptothecina (Valdés-Reyes
et al., 2009).
En el presente trabajo también se comprobó que L. donovani inhibe la apoptosis
de la célula hospedera inducida por un estímulo apoptótico, estaurosporina. Esta
observación ha sido demostrada por otros investigadores usando otros inductores
apoptóticos como la privación del factor estimulante de colonias del macrófago (MCSF) (Moore y Matlashewski, 1994) ó la adición de cicloheximida (Donovan et al.,
2009).
Esta inhibición frente a diversos estímulos apoptóticos, también ha sido observada
con otras especies de Leishmania como: L. major (Aga et al., 2002; Akarid et al.,
2004; Donovan et al., 2009; Ruhland et al., 2007), L. pifanoi (Ruhland et al., 2007),
L. amazonensis (Ruhland et al., 2007) y L. infantum (Lisi et al., 2005).
Todavía no es clara la vía mediante la cual los parásitos de Leishmania inhiben la
apoptosis en los macrófagos. Sin embargo, en infecciones con L. major, se ha
comprobado que el mecanismo de inhibición de la apoptosis ocurre a nivel
mitocondrial, evitando la liberación del citocromo C y por ende la activación de la
caspasa 3, cuando macrófagos murinos infectados derivados de médula ósea, son
tratados con el inductor estaurosporina y privación del M-CSF (Akarid et al., 2004).
De otro lado, la estaurosporina es un inductor de apoptosis que inhibe un amplio
número de proteínas quinasas relacionadas con la superviviencia celular (Cho et
al., 2003; Hardie, 1999; Matthews & Gerritsen, 2010). Se ha comprobado que la
activación de estas quinasas no es la única vía usada por Leishmania para evitar
la apoptosis del macrófago, aunque puedan ser activadas durante la infección. En
infecciones con L. amazonensis, L. major o L. pifanoi se ha demostrado que
aunque se activen quinasas como la p38MAPK o la PI3K/Akt, sólo esta última está
implicada en la inhibición de la apoptosis del macrófago antes de las 24 horas de
infección, y pierde importancia después de este tiempo (Ruhland et al., 2007).
En concordancia con estos antecedentes, la inhibición de la apoptosis del
macrófago causada por la infección con L. donovani o L. mexicana observada en
este estudio, podría no depender de la vía de las quinasas, ya que se produjo en
presencia de estaurosporina. Sin embargo, esto sería algo para comprobar en
futuras investigaciones.
El hecho de inhibir la apoptosis de la célula hospedera, le garantiza al
microorganismo intracelular la posibilidad de replicarse, sobrevivir y evitar el
ataque directo por parte del sistema inmune (Akarid et al., 2004; DosReis et al.,
81
2007; Faherty & Maurelli, 2008; Heussler et al., 2001; Laskay et al., 2008; Ritter et
al., 2009; van Zandbergen et al., 2007).
Inverso a lo observado con estaurosporina, en presencia de camptothecina, con
ninguna de las tres especies de Leishmania evaluadas hubo efecto sobre la
apoptosis de macrófagos humanos U937. La camptothecina actúa a nivel del
ADN, induciendo apoptosis cuando se enlaza de forma específica al complejo
topoisomerasa I – ADN (Hsiang et al., 1985; Pommier, 2004; Pommier, 2006).
Contradictorio a lo observado en el presente modelo experimental in vitro, en un
modelo murino la infección con otras especies de Leishmania, L. major, L. pifanoi
o L. amazonensis, inhibieron la apoptosis del macrófago en presencia de
camptothecina (Ruhland et al., 2007). Sin embargo, las especies usadas en el
presente trabajo son distintas a las empleadas por Ruhland et al. (2007); sumado
a ésto, se ha visto que el efecto sobre la apoptosis depende de la especie o de la
cepa del parásito (Donovan et al., 2009).
La regulación de la apoptosis de la célula hospedera, es un factor crítico
determinante de las interacciones entre el patógeno y el hospedero. La respuesta
varía de acuerdo al tipo de célula hospedera, a la especie del microorganismo o
incluso al tipo de cepa (Carmen & Sinai, 2007; Chuenkova & PereiraPerrin, 2010;
de Souza et al., 2003; Donovan et al., 2009; DosReis et al., 2007).
De acuerdo con los reportes encontrados, en una misma especie de Leishmania
puede observarse un efecto inhibidor o inductor de la apoptosis del fagocito. Tal es
el caso de L. major, la cual inhibe la apoptosis de la célula hospedera (Aga et al.,
2002; Akarid et al., 2004; Donovan et al., 2009; Ruhland et al., 2007), pero
también la induce (Getti et al., 2008). El efecto diferencial de una misma especie
de Leishmania sobre la apoptosis del macrófago, depende de las características
propias de la cepa (Donovan et al., 2009).
En infecciones con T. cruzi, el efecto de la infección sobre la apoptosis de la célula
hospedera es dependiente de la cepa; por ejemplo, los niveles de apoptosis en los
cardiomiocitos son más altos cuando están infectados con la cepa Dm28c que con
la cepa Y (de Souza et al., 2003). Asimismo, el grado de habilidad antiapoptótica
de la bacteria intracelular Chlamydia trachomatis en la célula hospedera varía
entre los diferentes tipos de serovariantes (Greene et al., 2004).
Por otro lado, al reemplazar el medio de cultivo por D-PBS, la privación de
nutrientes puede llevar a una muerte por apoptosis (Hwang & Lee, 2008), aunque
también puede desencadenar un proceso de muerte por autofagia (Hwang & Lee,
2008; Sakagami et al., 2009; Thet et al., 2009). Bajo este tratamiento, se observó
que L. donovani inhibe la externalización de fosfatidilserina comparado con el nivel
de L. mexicana. Esta última inhibió la fragmentación del ADN del macrófago a las
24h, resultados que son similares a los obtenidos con estaurosporina.
82
En términos generales, al igual que Leishmania, otros microorganismos pueden
inhibir o inducir la apoptosis de la célula hospedera como: Trypanosoma cruzi (de
Souza et al., 2003; DosReis & Lopes, 2009; Levy et al., 2011; Manque et al., 2011;
Petersen et al., 2006; Rodrigues et al., 2008; Tostes et al., 2005), Toxoplasma
gondii (Bannai et al., 2008; Bannai et al., 2009; Choi et al., 2011; Kim & Denkers,
2006; Yamada et al., 2011), Cryptosporidium parvum (Chen et al., 2001; Liu et al.,
2008; McCole et al., 2000; Mele et al., 2004), Mycobacterium tuberculosis (Derrick
& Morris, 2007; Rachman et al., 2006; Velmurugan et al., 2007), Legionella
pneumophila (Abu-Zant et al., 2005; Abu-Zant et al., 2007) y Shigella flexneri
(Clark & Maurelli, 2007; Faherty et al., 2010; Faherty & Maurelli, 2009; Nonaka et
al., 2003).
En el presente trabajo se evidencia por primera vez que los amastigotes de L.
panamensis, L. mexicana y L. donovani sobreviven a la apoptosis del macrófago.
Este hallazgo fue previamente reportado con otra especie, L. major, en neutrófilos
apoptóticos que contenían parásitos viables (van Zandbergen et al., 2004b).
En la infección con Salmonella thypi se ha visto que su plásmido pRST98 asociado
a la virulencia de este serovariante, induce apoptosis en los macrófagos y
aumenta la superviviencia de la bacteria dentro de la célula apoptótica (Wu et al.,
2010).
También se encontraron amastigotes de L. panamensis y L. donovani vivos en
prolongaciones de las células apoptóticas y en cuerpos apoptóticos. Esto mismo
se ha observado en macrófagos THP-1 infectados con L. aethiopica (Getti et al.,
2008). Otro microorganismo intracelular como Chlamydia puede ser transferido a
otras células hospederas ocultándose dentro de un cuerpo apoptótico (Byrne &
Ojcius, 2004). Así mismo, se ha documentado que cuerpos apoptóticos
conteniendo Mycobacterium tuberculosis fueron fagocitados por células
dendríticas (Schaible et al., 2003).
Aunque en el presente trabajo no se comprobó la transferencia de la infección a
otras células hospederas por medio de las células apoptóticas que contienen
parásitos vivos, ya se ha demostrado que la fagocitosis por macrófagos de células
apoptóticas con parásitos vivos de L. major puede ser una forma para amplificar y
persitir la infección (van Zandbergen et al., 2004b; van Zandbergen et al., 2007).
L. panamensis y L. mexicana presentaron porcentajes de infectividad y cargas
parasitarias mayores que L. donovani. Sin embargo, ni la carga parasitaria, ni el
porcentaje de infectividad explicó el fenómeno de apoptosis en las especies de
Leishmania evaluadas. Contrario a lo que se pudiera pensar, que los niveles de
infectividad altos son nocivos para la célula hospedera, en infecciones con L.
major bajo una dosis infectiva de 40 parásitos por macrófago se observó un efecto
de inhibición de apoptosis mayor que la que se presentó bajo una dosis de 10
parásitos por célula (Akarid et al., 2004).
83
Adicionalmente, se ha comprobado que el efecto de la infección con Leishmania
sobre la apoptosis del macrófago es específica de la cepa en una misma especie
e independiente de su infectividad, ya que usando la misma dosis infectiva con
diferentes cepas de L. major ó L. donovani, no hubo diferencias en cuanto al
porcentaje de infección pero sí en el nivel de inhibición de la apoptosis (Donovan
et al., 2009).
Por lo demás, aunque en el presente estudio no se comprobó que la inducción de
la apoptosis ocurriera como consecuencia del proceso de fagocitosis por sí mismo;
Getti et al. (2008) usando la misma línea celular del presente estudio, demostró
que la fagocitocis de partículas de zymosan no causó apoptosis en macrófagos
U937 al ser comparados con el control no tratado.
En el presente trabajo se observó que el tratamiento con estaurosporina no
modifica la infectividad de L. donovani. Caso contrario fue observado para las
especies L. panamensis y L. mexicana, en las que la infectividad disminuyó. Es
posible que esta diferencia se deba a que las vías de señalización inhibidas por
estaurosporina son importantes durante la infección con L. panamensis y L.
mexicana, pero no participan en la infección por L. donovani. Sin embargo, debido
a que se desconocen las vías activadas por estas especies, se requieren más
estudios para determinar el mecanismo por el cual estaurosporina afecta la
infectividad de L. panamensis y L. mexicana.
Finalmente, la inducción o la inhibición de la apoptosis de la célula hospedera
puede ser un mecanismo que le permite a Leishmania perpetuar la infección. En la
leishmaniasis cutánea americana se ha reportado la persistencia de la infección en
pacientes con cura clínica (Coutinho et al., 2002; Guevara et al., 1993; Haddad et
al., 1996; Mendoça et al., 2004; Oliveira-Neto et al., 1998; Schubach et al., 1998a;
Schubach et al., 1998b; Vergel et al., 2006). Además, se ha comprobado que en la
leishmaniasis activa, los parásitos vivos de Leishmania se diseminan a tejidos no
afectados (Romero et al., 2010), indicando que puede existir un proceso de
infección de forma “silente” que no activa la respuesta inmune en estos tejidos
sanos, y que podría estar relacionado con eventos de externalización de
fosfatidilserina en la célula hospedera ocasionados por la infección, lo cual será un
objetivo para futuras investigaciones.
84
8. CONCLUSIONES
•
L. panamensis induce la exteriorización de fosfatidilserina del macrófago U937,
una señal de fagocitosis “silente”.
•
L. mexicana y L. donovani inhibieron la apoptosis del macrófago U937.
•
El efecto de inhibición o inducción de la apoptosis del macrófago depende de la
especie de Leishmania y del inductor de apoptosis.
•
L. panamensis, L. mexicana y L. donovani pueden sobrevivir a la apoptosis del
macrófago, lo cual es importante para perpetuar la infección en el hospedero.
•
Los amastigotes de Leishmania pueden sobrevivir dentro de cuerpos
apoptóticos, fragmentos celulares que pueden servir como vehículo de
persistencia al ser fagocitados por otro macrófago.
•
La carga parasitaria y la infectividad de las tres especies de Leishmania
evaluadas no están relacionadas con los efectos que causan éstas en el
fenómeno de apoptosis del macrófago U937.
85
9. PERSPECTIVAS
Futuras investigaciones se encaminarán a resolver cómo L. panamensis, L.
mexicana y L. donovani modulan la apoptosis en el macrófago. Para analizar
cómo se lleva a cabo dicha respuesta durante el proceso infectivo por cada
especie, se debe verificar qué caspasas se activan ó inactivan, determinar si
ocurre pérdida del potencial de membrana mitocondrial y si hay liberación de
citocromo C. Igualmente, para saber de qué forma ocurre una apoptosis
incompleta en L. panamensis, se tendrá que verificar si se activan vías de
señalización de supervivencia durante la infección con esta especie. También se
debe verificar qué vías de supervivencia son activadas durante la infección con L.
mexicana y L. donovani.
Otro aspecto importante a determinar es sí el macrófago apoptótico con parásitos
viables es un vehículo para la persistencia del parásito en el hospedero. Esto
podría lograrse cultivando macrófagos con dichas células y verificando qué sucede
con la replicación del parásito. Finalmente, se debe evaluar si durante la
fagocitosis de macrófagos apoptóticos infectados se induce la diferenciación hacia
un fenotipo M2 capaz de secretar citocinas anti-inflamatorias como TGF-β e IL-10,
contribuyendo a la persistencia de la infección.
86
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