1. No category

How to modify a gene in the
genome of a mouse or a rat?
How to modify a gene in the genome of a
mouse or a rat?
•
What kind of modification is desired?
–
–
–
•
The modification can be:
–
–
–
•
Constitutional (inactivation of the gene in all tissues, at all developmental times)
Conditional (binary transgenesis)
Inducible (inducible Cre systems)
Randomly
–
–
•
Knock-out
Knock-in
Introduction of small modifications (intoduction of point mutations, hypomorphic
alleles)
Chemically induced mutations (ENU)
Insertional mutagenesis: gene trapping, transposon mediated insertional mutagenesis
Non randomly
–
–
Zinc finger nuclease genome editing
Homologous recombination in ES cells
Genome modification by
Gene Trapping in ES cells
• Use of ES cells
• Random gene targeting
Gene Trapping
•
Gene trapping is a method of randomly generating embryonic stem cells with wellcharacterized insertional mutations.
•
The mutation is generated by inserting a gene trap vector construct into an intronic or
coding region of genomic DNA.
•
The gene trap vector constructs contain selectable reporter tags used to identify cell lines
where the vector has successfully interrupted a gene. These reporter tags can also be
useful for further experimentation in cells and mice.
•
Gene trap sequences are derived from cDNA or genomic DNA from the trapped locus using
primer sequences from vector ends, and the sequences are used to identify and annotate
the trapped gene.
•
Gene trap cell lines reliably contribute to the germ line, producing very useful mutant
mouse strains for the functional characterization of genes. Although the insertion of the
vector construct in a genic region typically results in complete inactivation of the “trapped”
gene (a null allele), this is not guaranteed. In some cases vector insertion can fail to
inactivate a gene, lead to hypomorphic gene function, or result in a dominant negative
phenotype. Generally, vector insertion close to the 5' end of a gene, but downstream of the
untranslated region before the first exon, is more likely to create a null allele than insertion
near the 3'
Advantages and Limitions of Gene Trapping
Avantages:
•
Rapid, cost effective
•
Produces a large variety of insertional mutations throughout the genome
•
Allows the insertion and expression of reporter genes (β-galactosidase or xGFP)
Limitations:
•
Gene trapping requires the trapped gene to be expressed in ES cells (otherwise it will not be
possible to select cells)
•
Gene trapping does not always generate null alleles (depending on where the gene-trap
insertion occurs (in the first intron or the last one for exemple)
•
Trapping is not entirely random but shows preference for large transcription units and
genes more higly expressed in ES cells. Not all genes can be targeted (50 to 60%)
•
incorporation of exogenous DNA (selection marker)
Transposon-mediated
insertional mutagenesis
(Transposon-mediated KO = TKO)
• Use of transgenic animals (mutator
and helper transgenic lines: mouse
and rat)
• Random targeting of genes
•
Only a few transposon
insertions are created
per G1 animals, which
can be easily identified,
tracked and segregated,
using PCR methods and
breeding
Advantages and limitions of transposonmediated insertional mutagenesis
Avantages:
•
Produces a large variety of insertional mutations directly in the living animal
•
The gene does not need to be expressed in the germ line (as for gene-trapping in the ES
cells)
•
Allows the insertion and expression of various reporter genes (β-galactosidase or xGFP) to
track mutant animals
•
Only a few transposon insertions are created per G1 animals, which can be easily
identified, tracked and segregated, using PCR methods and breeding (in contrast to ENU
mutations where thousands of mutations are created in each G1 animals)
•
Placing the transposase under a tissue specific inducible promoter can be used to
generate somatic mutations in a tissue of interest.
Limitations:
•
Gene trapping does not always generate null alleles (depending on where the gene-trap
insertion occurs in the first intron or the last one for exemple)
•
Trapping is not entirely random
Genome editing with engineered
zinc finger nucleases
• Targeting of specific genes
• Random or designed modifications
• Use of one cell embryo or ES cells
Genome editing with engineered zinc finger
nucleases
•
Genome editing allows efficient genetic modification via:
– the induction of a double strand break (DSB) in a specific genome target
sequence
– followed by the generation of desired modifications during subsequent
DNA break repair according to two distinct pathways
– Non homologous end joining (NHEJ)
– Homology directed repair (HDR)
•
Genome editing is performed through the use of zinc finger nucleases
•
Zinc finger nucleases can be introduced (as mRNAs or plasmids encoding zinc
finger nucleases):
– in vitro in ES cells
– in vivo directly in fertilized embryos (one cell stage) via standard
microinjection techniques
Structure and design of zinc finger nucleases
•
Zinc finger nucleases (ZFNs)
associate a DNA binding domain
specified by the zinc finger proteins to
the nuclease domain of the FokI
restriction enzyme.
•
ZFNs act as dimers only
•
The DNA binding domain is specified
by the modular assembly of the
various zinc finger proteins, each of
them recognizing 3 bp of DNA.
•
ZFN monomers are composed of 3 to
6 individual zinc finger proteins which
recognize 9 to 18 bp of DNA. ZFN
dimers will target 18 to 36 bp of DNA.
Urnov et al. Nature Reviews Genetics, september 2010, vol. 11
Types of genome editing made possible by
using zinc finger nucleases
Knock-in of a few bp to several KB
of DNA in drosophila, ES cells and
iPSCs
Urnov et al. Nature Reviews Genetics, september 2010, vol. 11
Advantages and limitations of genome editing
with zinc finger nucleases
Advantages:
• very rapid (from 6 to 12 months) from design to mouse
• works in all strains tested to date
• does not result in incorporation of exogenous DNA (selection marker)
• Efficient
•
Major advantage of genome editing with zinc finger nucleases:
–
will allow knocking in genes in rat ES cells or rat iPSCs (when using the HDR pathway)
Limitations:
–
–
Requirement of unique sequences (closely related families of genes can be difficult to
target )
Off-target effect (ZFNs can induce DSBs and subsequent mutations at other loci)
Genome editing with zinc finger nucleases in
the one cell embryo
Jacobs HJ et al. Trends in Genetics, december 2010, vol. 26, N°12
Genome targeting by
homologous recombination in
ES cells
• Targeting of specific genes
• Designed modifications
• Use of ES cells
The life history of the mouse in genetics
•
•
75-125 million years ago:
6 million years ago:
•
•
1900:
1909:
•
1921:
•
1929:
•
•
•
•
•
1972:
1982:
1987-1989:
1998:
1999:
•
•
•
•
•
2001:
2001:
2002 May :
2002 Aug :
2002 Dec :
A common ancestor of mice and humans
Genus Mus emergence (mus musculus, the house mouse
around 8000 BC)
Fancy mice become laboratory mice
Birth of the lab mouse (Clarence Little creates the first inbred
strain DBA)
C57BL (will become one of the most widely used and important
mice to geneticists: its genome will be sequenced in 2002)
The Jackson laboratory (world’s most imprtant research centers
for mouse geneticists)
First computer database for mouse genetics
First transgenic mouse (growth hormone rat transgene)
The first knock-out mouse
Mouse clones (after Dolly: Cumulina and her clones)
The Mouse Genome Sequencing Consortium (26 institutes in six
countries; 1990 for human)
The human genome
The private shotgun mouse genome
Mouse chromosome 16
Physical map of the mouse genome
The mouse genome
An exemple: Disruption of the rat p53 gene
Schematic diagram showing the strategy to disrupt
the rat p53 gene via homologous recombination.
C Tong et al. Nature 000, 1-3 (2010) doi:10.1038/nature09368
C Tong et al. Nature 000, 1-3 (2010) doi:10.1038/nature09368
An exemple: Disruption of the rat p53 gene
Confirmation of p53 gene targeting in rat ES cells.
C Tong et al. Nature 000, 1-3 (2010) doi:10.1038/nature09368
Une lignée de cellule ES idéale?
•
Choix du fonds génétique crucial
•
129 strain
– Fonds génétique non idéal pour certaines analyses (immunologie et
neurologie). On doit donc faire des back-cross successifs sur la lignée
consanguine C57BL/6 pour obtenir une lignée congénique
•
C57BL/6 strain
– Cellules ES ayant une fréquence de passage dans la lignée germinale plus
faible que les cellules ES 129
•
129 X C57BL/6 F1 strains
The different types of targeting constructs
1.
2.
3.
Isogenic is better
Bigger is better
Promoterless selection (if possible) is better
•The more these parameters can be incorporated in a targeting construct,
the greater the chance of success
•Targeting remains unpredictably variable, however, for reasons which are
not understood.
The targeting constructs: Bigger is better
•
Conventional (small constructs):
–
–
–
–
•
Absolute requirement for isogenic homology arms (a few kb of sequences)
Assembly of the targeting construct by conventionel cloning
Screening by PCR or Southern blot generally easy to design
Allow the use of promoterless targeting constructs (the gene mediating the positive
selection does not have a promoter driving its expression)
BAC-based targeting constructs:
–
–
–
–
–
–
Isogenic or non isogenic
Can be « easily » modified by recombineering (homologous recombination in the
bacteria E. coli: Red/ET or RecA-mediated recombineering)
Higher recombination efficiencies than smaller targeting vectors
Screening more difficult than for conventional vectors
Targeting construct are too large to permit an thorough characterization of the
tageting event and the molecular details of the recombination events remain difficult
to assess .
Preclude the use of promoterless targeting constructs (selection less effective)
Promoter-driven and promorterless targeting
constructs
Promoter-Driven cassette: gène de sélection positive (neo) sous le contrôle d’un
promoteur
Promoterless cassette: gène de sélection positive (neo) ne possédant pas de promoteur
propre
Le gène neo ne sera transcrit que si le vecteur de recombinaison s’est bien intégré au site voulu. Son
expression est contrôlée par le promoteur du gène ciblé.
NorCOMM Targeted mES Cell Lines
Comment créer une souris chimère ?
•Par agrégation d’un embryon au stade
morula 8 cellules avec des cellules ES
Wagner et al. BMC Cancer 2008 8:370
•Par injection des cellules ES dans un embryon au stade
blastocyste
Qu’est-ce qu’une complémentation
tétraploïde ?
2N
2N
•
Un embryon au stade 2 cellules est
soumis à une électrofusion permettant la
formation d’un embryon 4N qui est
ensuite cultivé juqu’au stade blastocyste.
Des cellules ES (2N) sont injectées dans
ce blastocyste.
•
Toutes les annexes embryonnaires
seront 4N et l’embryon 2N.
•
L’embryon dérivera exclusivement des
cellules ES introduites dans le
blastocyste 4N.
•
Si les cellules ES sont bien totipotentes,
elles participeront à la lignée germinale
et permettront une transmission
germinale de la mutation introduite dans
les cellules ES de 100%.
The international Knockout mouse consortium
The international Knockout mouse consortium
Targeted mutations MGI (Jackson laboratory)
Targeted mutations MGI (Jackson
laboratory)
International Mouse Strain Resource (IMSR)
(hosted by the Jackson Laboratory)
The Knock Out Rat Consortium
Conditional mutagenesis and site-specific
recombination
Les situations, dans lesquelles les souris mutantes portent la mutation
dans toutes leurs cellules (knock-out constitutionnels), ont leurs
limites pour deux types de raisons :
•
(1) dans le cas où la mutation entraîne à l’état homozygote une
létalité embryonnaire, il devient impossible d’étudier la fonction
éventuelle du gène, au-delà du moment où les embryons meurent et
donc pendant toute la vie adulte.
•
(2) un gène peut avoir un profil d’expression très large et son
invalidation entraîner un phénotype complexe qui affecte de
multiples tissus. Il est alors utile, pour simplifier l’analyse, de créer
des souris porteuses de la mutation seulement dans l’un ou l’autre
de ces tissus.
Complete gene inactivation can lead to early lethality and
prevent analysis of protein functions in specific tissues
LoxP-sites and Cre mediated recombination
•
•
•
•
•
CRE recombinase:
Site specific recombinase
from phagePI (38kDa)
Recognizes and binds to a
34-bp long sequence called
loxP
Can excise sequences
placed between two loxPsites if the loxP sites are in
the some orientation
If loxP sites are in opposite
orientation recombination will
give rise to an inversion
FRT sites and FLP mediated recombination
•
Derived from Yeast
•
FLP binds FRTs
•
Functions at 30*C
•
Less efficient that CRE
recombinase
•
Generally used to remove
selection markers in vivo
Inactivation d'un gène par le système Cre-loxP.
L'enzyme Cre va exciser une séquence d'ADN
flanquée de deux sites loxP, en laissant en place un
seul site loxP. A : gène endogène ; B : vecteur de
recombinaison homologue, les séquences en rouge
représentent les séquences homologues entre le gène
endogène et le vecteur. Pgk-néo : gène de sélection
sous le contrôle du promoteur pgk qui confère aux
cellules la résistance à la néomycine ; HSV-tk :
promoteur et séquence codante de la thymidine kinase
du virus de l'herpès qui rend les cellules sensibles au
ganciclovir. La séquence à exciser est flanquée de
deux sites loxP ; le gène néo est dans une séquence
non codante, entre les sites loxP ; le gène tk est en
dehors des séquences homologues ; C : Configuration
du gène après l'événement de recombinaison
homologue dans les cellules ES. Le gène néo et les
sites loxP s'intègrent, le gène tk est éliminé. La cellule
est résistante à la néomycine et au ganciclovir. La
séquence codante du gène est conservée, il reste
fonctionnel. 1 - Inactivation du gène in vitro et
élimination de néo : les cellules ES sont traitées par
Cre par lipofection de l'enzyme ou par transfection
transitoire d'un vecteur d'expression de Cre.
L'élimination du gène cible et de néo est vérifiée par
PCR sur les clones de cellules ES. Les souris knock
out correspondantes exprimeront la mutation dans tous
les tissus où le gène s'exprime normalement. 2 Inactivation du gène spécifique de tissu in vivo : a)
Fabrication d'une souris transgénique pour les cellules
ES recombinées : le gène reste fonctionnel in vivo. b)
Fabrication d'une souris transgénique qui exprime Cre
sous la dépendance d'un promoteur spécifique du tissu
hématopoïétique ou d'une lignée (zone rosée). c) Le
croisement des deux lignées de souris donne
naissance à des animaux dans lesquels l'inactivation
du gène cible a lieu spécifiquement dans les tissus qui
expriment Cre (zone rosée).
Le système Cre/loxP et ses applications
Le système Cre/loxP et ses applications
LoxP sites are indicated by red arrows and Cre recombinase in green. If the loxP site is
located in the 5′ untranslated region (A), an inverted orientation is advisable as it prevents the
introduction of ATG codons in front of the expressed ORF. In E, instead of loxP sites also
FRT sites could be used. The star indicates as an example an introduced point mutation. The
Cre-loxP system can also be used to resolve transgene silencing due to concatemerization of
transgene copies (F). In G, the mutation of the loxP site in the Cre binding site is represented
by a dot. In H, the mutation in the loxP spacer is indicated by a black arrow.
Tronche et al. FEBS Letters Volume 529, Issue 1 , 2 October 2002, Pages 116-121
CRE-mediated Deletion in ES Cells
CRE Mediated Deletion in vivo
CRE-expressing transgenic mice
•
How to generate transgenic mice expressing CRE in a tissue specific
manner? (inertional transgenesis or knock-in)
•
http://www.mshri.on.ca/develop/Nagy/Cre.htm
Problèmes liés au système Cre/LoxP
•
Problèmes de toxicité de la Cre recombinase et problèmes liés au
site d’insertion de la Cre ou à son activité sur certains site
cryptiques existant dans le génome
•
La sensibilité des sites LoxP à la recombinaison varie en fonction
du locus, du stade de développement embryonnaire ou adulte, du
type cellulaire : en fonction de la méthylation et de l’état de la
chromatine.
Strategy for linking the conditional gene inactivation to reporter gene activation
Kin-Ming Kwan, genesis, Volume 32, Issue 2, Date: February 2002, Pages: 49-62
Cell-lineage tracing experiments
• Utilisation de systèmes binaires consistant à croiser
deux souches de souris transgéniques
DRIVER LINE
Transgène CRE sous le contrôle
d’un promoteur neuronal spécifique
Nkx2.1-CRE
X
REPORTER LINE
Marqueur fluorescent inactif
ROSA26-eGFP
La lignée REPORTER
•
REPORTER
LINE
La lignée REPORTER comporte un transgène codant pour une molécule
fluorescente qui ne sera produite qu’après un évènement de recombinaison
enlevant une séquence STOP empêchant la transcription de l’ARN codant pour
cette molécule fluorescente (lignée obtenue par recombinaison homologue).
LOXP
LOXP
STOP
eGFP
eGFP
Locus Rosa26: transcription
ubiquitaire pendant toute
l’embryogenèse
Le locus ROSA26R
LOXP
LOXP
SA
STOP
eGFP
LOCUS ROSA26
P
Exon 1
Exon 2
LOXP
P
Exon 1
LOCUS ROSA26
LOXP
STOP
eGFP
Avant recombinaison
SA LOXP
P
STOP
Exon 1
LOCUS ROSA26
LOXP
eGFP
Exon 2
Après recombinaison
LOCUS ROSA26
SA LOXP
P
Exon 1
eGFP
Exon 2
eGFP
Les lignées ROSA 26
•
•
•
•
•
Rosa26-LacZ (1999)
Rosa26-Z / AP (lacZ ->alkaline phosphatase; double reporter strain)
Rosa26-eGFP
Rosa26-eYFP (2001)
Rosa26-eCFP (2001)
D’autres lignées….
•
IRG mouse DsRed/eGFP (2008) avec promoteur pCAGS (double
reporter strain)
La lignée DRIVER
DRIVER LINE
La lignée DRIVER est générée par transgenèse additive et comporte un
transgène (de type BAC modifié le plus souvent ) codant pour la CRE
recombinase sous le contrôle des éléments promoteur/enhancer du gène dont
on veut mimer l’expression
Nkx2.1
Eléments enhanceurs
P
CRE
La lignée DRIVER peut également avoir été générée par recombinaison
homologue (KI) et, dans ce cas, les séquences codant pour la CRE viennent
remplacer celles codant pour le gène dont on veut mimer l’expression sur un
des deux allèles (lignée KI hétérozygote).
Souris Cre-LBD
Inducible conditional knock-out
DRIVER LINE
On peut également ajouter aux séquences codant pour la CRE des séquences
codant pour un récepteur stéroidien et qui vont séquestrer la CRE dans le
cytoplasme (ligand binding domain -LBD- d’un récepteur hormonal)
CRE LBD
Si addition de Tamoxifen (hormone de synthèse se liant aux séquences LBD)
dans l’eau de boisson de la femelle gestante, translocation de la CRE dans le
noyau et recombinaison
TAMOXIFEN
Other inducible systems
Souris Cre-ER-T2
DRIVER LINE
Il existe d’autres systèmes inductibles pour la CRE:
-Activation transcriptionnelle du gène Cre par le Tamoxifen (séquences
ERT ajoutées au promoteur en amont de la CRE): lorsque l’on donne du
Tamoxifen à la femelle gestante, cette hormone se lie à un récepteur
stéroidien endogène localisé dans le cytoplasme. Celui-ci va être
transloqué dans le noyau et se fixer sur les séquences ERT ajoutées au
promoteur de la CRE, entrainant ainsi la transcription de ce locus.
- Un système inductible par le métaux lourds (le zinc par exemple): La CRE
est placée sous le contrôle du promoteur de la méthallothionéine inductible
au zinc (très toxique plus phénomène de leakage fréquent)
Other inducible systems: an example
ChR2 = Channelrhodopsin-2 = genetically encoded molecular sensitizer that enables activation of
neurons in response to pulses of blue light
Other inducible systems: an example
Optogenetics
Recombineering =
BAC modification
Tetracycline-controlled transcriptional activator (tTA)
system: "Tet Off"
Zhu et al. Seminars in Cell and Developmental Biology
Volume 13, Issue 2 , April 2002, Pages 121-128
Tissue- or cell type-specific promoter (P ) directs the expression of tTA, a fusion protein of tetracycline
repressor of E. coli (TetR) and the transcription activation domain of viral protein 16 of herpes simplex
virus (VP16). In the absence of regulating agent doxycycline (Dox), tTA binds the responsive elements
tetracycline-resistance operon of E. coli transposon Tn10 (tetO) and activates minimum promoter from
human cytomegalovirus (P ) leading to transcription and expression of downstream target gene. In the
presence of Dox, tTA dissociates from tetO and terminates transcription of the target gene.
Reverse tetracycline-controlled transcriptional
activator (rtTA) system: "Tet-On"
Zhu et al. Seminars in Cell and Developmental Biology
Volume 13, Issue 2 , April 2002, Pages 121-128
A specific promoter directs the expression of rtTA in the tissue or cell type of interest. In the absence of
Dox, rtTA does not bind to tetO so there is no transcription activation of the target gene. In contrast, in the
presence of Dox, rtTA binds to tetO and initiates the transcription of the target gene.
Combined use of tetracycline-controlled transcriptional
silencer (tTS) and rtTA system
Zhu et al. Seminars in Cell and Developmental Biology
Volume 13, Issue 2 , April 2002, Pages 121-128
A modified form of tTA, tTS is a fusion protein of TetR and KRAB-AB silencing domain of Kid-1 protein
(Kid). A ubiquitous promoter (P ) or a tissue-specific promoter can be used to drive the expression of tTS.
Meanwhile, a specific promoter controls the expression of rtTA. In the absence of Dox, tTS binds tetO
with high affinity. However, unlike tTA, tTS actively suppresses transcription of the target gene,
preventing leaky expression of the transgene. In the presence of Dox, tTS dissociates from tetO whereas
rtTA binds tetO with high affinity and activates transcription and expression of the target gene.