Predstavljamo vam novo razvito serijo testov za poročevalske gene, temelječe na luciferazi. Za
proučevanje kompleksnih celičnih sporočevalnih poti so luciferazni testi zaradi širokega dinamičnega
razpona in izvrstne občutljivosti močno orodje. Sedaj omogočajo še boljšo občutljivost, daljši signal in
možnost multipleksnih testov.
Bioluminiscenčni testi se čedalje pogosteje pojavljajo v
biomedicinskih laboratorijih kot dodatek ali alternativa
fluorescenčnem in kemiluminescenčnem načinu detekcije.
Luciferaza in luciferin sta splošna izraza za aktivne snovi v
bioluminiscentnih organzimih - substrat in pripadajoči encim, ki
katalizira reakcijo luminiscence. Luminiscenca se v
biomedicinskih aplikacijah uporablja za teste celične viabilnosti
in kinazne teste, proteazne, siRNA oz. miRNA teste ter teste
poročevalskih genov.
svetloba
Z napredkom in optimizacijo testov je sedaj na voljo še več opcij, že samo nekateri organizmi posedujejo
različne vrste luciferaz, ki lahko proizvajajo svetlobo različnih spektrov iz enakega luciferina. Da
zadovoljimo naš način zaznavanja in merjenja luminiscence pa so substrati modificirani glede na jakost
ali trajanje signala.
Več o bioluminiscenci – klikni za povezavo
Thermo Scientific Pierce luciferazni poročevalski geni so
optimizirani človeški kodoni v plazmidnem vektorju, ki je
optimiziran za izražanje v sesalskih celicah. Luciferazni proteini
Gaussia, Gaussia-Dura in Cypridina se izločajo v medij za celične
kulture, kar omogoča spremljanje dejavnosti poročevalskih genov
v živih celičnih kulturah. Izloča se več kot 85% luciferaznih
proteinov Gaussia, Gaussia-Dura in Cypridina, preostali del pa
lahko grobo zaznamo tudi v lizatu celic, kar omogoča kombiniranje
z drugimi intraclularnimi luciferazami.
Gaussia-Dura je mutanta luciferanznega gena Gaussia, ki proizvaja
bolje stabilen bioluminiscentni signal kot ga daje naravna
luciferaza. Nesekretorni luciferazi sta Green Renilla in Red Firefly.
Profil spektralne emisije luciferaznih
reporterjev. Osenčen razpon predstavlja
filtre, ki so bili uporabljeni pri poskusih
med razvojem izdelkov: 480±20nm band
pass (BP) in 640nm long pass (LP).
Luciferaza Green Renilla je intracelularni protein z večjo stabilnostjo v serumu in močnejšim
oddajanjem svetlobe kot ju imajo nativni luciferazi Renilla in Firefly. Poročevalski testi Green Renilla so
tako bolj občutljivi kot tisti, ki uporabljajo naravno renilo.
Luciferaza Red Firefly je tudi intracelularni protein, katerega vrh emisije je premaknjen iz zelenega
(nativnega) v rdeči spekter, zato jo lahko kombiniramo z drugimi luciferazami v t.i. dvojnih testih.
Tabela: Možni plazmidi in lastnosti poročevalskih genov
plazmid
pMCS-Cypridina Luc
pCMV-Cypridina Luc
pTK-Cypridina Luc
pMCS-Gaussia Luc
pCMV- Gaussia Luc
pTK- Gaussia Luc
pMCS- Gaussia-Dura Luc
pCMV- Gaussia-Dura Luc
pTK- Gaussia-Dura Luc
pMCS-Green Renilla Luc
pCMV- Green Renilla Luc
pTK- Green Renilla Luc
pMCS-Red Firefly Luc
pCMV- Red Firefly Luc
pTK- Red Firefly Luc
promotor
luciferazni
za izražanje poročevalski
gen
Cypridina
CMV
(6kDa)
TK
Gaussia (22
CMV
kDa)
TK
Gaussia- Dura
CMV
(22 kDa)
TK
Green Renilla
CMV
(36 kDa)
TK
Red Firely (62
CMV
kDa)
TK
se poročevalski
protein izloča v
medij
potreben
substrat
da
vargulin
da
coelentrazin
da
coelentrazin
ne
coelentrazin
ne
luciferin
Poenostavljen postopek testa:
Transfecirajte
celice s plazmidi.
Dodajte
aktivatorje ali
inhibitorje
Zberite lizat (intracelularne) ali
zberite medij
(sekretorne luciferaze)
Dodajte testne
reagente
Odčitajte oddano
svetlobo na
luminometru
Kompleti za enostavni poročevalski test
Thermo Scientific Pierce Luciferase Reporter Assay Kits so na voljo v dveh oblikah: »flash« in »glow«.
Testi tipa flash dajejo močan svetlobni signal – kratkotrajen, a z maksimalno občutljivostjo.
2
Pri reagentih tipa flash je za pridobitev najmočnejšega signala in preprečitev variabilnosti najbolje
uporabiti luminometer in avtomatske injektorje. Po drugi strani testi tipa glow sproščajo manj
intenziven, a dolgo trajajoč signal, zato ga lahko uporabljate pri večji količini vzorcev in ne potrebujete
injektorjev.
Reagenti z luciferazo Thermo Scientific Pierce Flash Assay dajejo
najsvetlejši svetlobni signal. Grafikoni A-C: reagenti so bili dodani
v jamice z medijem oz. lizatom celic HEK293 (24h po transfekciji).
Grafikon D: reagenti so bili dodani v jamice z lizatom HeLa celic
(72h po transfekciji). Skupni izhod svetlobe (v RLU - Relative Light
Units) je odčitan na luminometru Thermo Scientific Varioskan
Flash (čas integracije = 1 sec/odčitek).
Reagenti z luciferazo Thermo Scientific Pierce Glow Assay
imajo močnejši svetlobni signal z izvrstno stabilnostjo.
Reagenti »glow« so bili dodani v jamice z medijem oz.
lizatom celic HEK293 (24h po transfekciji). Skupni izhod
svetlobe (v RLU - Relative Light Units) je odčitan na
luminometru Thermo Scientific Varioskan Flash (čas
integracije = 1 sec/odčitek). Grafikon A: Pierce Cypridina
Glow Assay, grafikon B: Pierce Gaussia-Dura Glow Assay,
grafikon C: Pierce Green Renilla Glow Assay v primerjavi s
Promega Renila Luciferase Assay System, grafikon D: Pierce
Red Firefly Glow Assay v primerjavi s Promega Steady-Glo
Luciferase Assay System.
,
Kompleti za dvojni poročevalski test
Thermo Scientific Dual Luciferase Reporter Assay Kits so visoko občutljivi testi tipa flash, ki zaznajo
najprej primarni eksperimentalni reporter in nato sekundarni luciferazni reporter za normalizacijo. Prvi
luciuferazni signal poda informacijo o specifičnih eksperimentalnih pogojih, drugi signal odraža
učinkovitost transfekcije in celično viabilnost.
Dvojni sporočevalski testi omogočajo enostaven postopek testiranja signalov dveh različnih luciferaz. Ko
dodamo dva različna substrata enemu testnemu reagentu, lahko sočasno merimo oba luciferazna
3
signala in ju ločimo z uporabo filtrov. Dve luciferazi lahko merimo torej v istem vzorcu brez potrebe po
koraku dušenju signala (quenching).
Dvojni luciferazni poročevalski testi so idealni za analizo več kot ene tarče na presejanje, minimiziranje
neciljnih efektov, določitev medsebojnega vpliva dveh ali več signalnih poti in za normalizacijo podatkov
z namenom odstraniti artifakte eksperimenta.
Izbirate lahko med tremi kombinacijami dvojnih kompletov: luciferazo Red Firefly kombiniramo z
Gaussio, Cypridino ali Green Renillo. Dosežemo pa lahko še nadaljnje kombinacije s sočasno
transfekcijo več luciferaz z različnimi potrebami po substratu v iste celice. Na primer, reporterski
plazmidni konstrukt, ki vsebuje Gaussio (ali Green Renilla) lahko ko-transfeciramo s plazmidi s Cypridino
in Red Firefly. V tem primeru posamezne lufciferazne signale zaznamo z ustreznimi enojnimi testi,
vzorec pa razdelimo v ločene jamice.
Potek dela pri dvojnem poročevalskem testu:
Pri dvojnem testu tako ni vmesnih stopenj. Luciferazi spektralno ločimo z menjavo filtrov.
liza celic  dodamo pufer  merimo dve luciferazi sočasno
npr. Green Renilla – Red Firefly (eksperimentalna in normalizacija)
Nastavitev filtrov za dvojne teste (npr. Varioskan Flash Luminometer)
• Cypridina - Red Firefly: 470 +/- 20 nm Bandpass in 640 nm long pass
• Gaussia - Red Firefly: 470 +/- 20 nm BP in 640 nm LP
• Green Renilla - Red Firefly: 525 +/- 15 nm BP in 640 nm LP
Pregled kompatibilnosti luminometrov najdete na povezavi.
4
Izberite luciferazni vektor
Vsak luciferazni poročevalski gen je na voljo v vektorjih pMCS, pCV in pTK.
pMCS-luc vektorji nosijo luciferazni gen, ki je idealen za izražanje v sesalskih celicah in tako povzroči
izrazito boljšo produkcijo svetlobe. Vektorji imajo območje z več mesti za kloniranje(MCS), kamor se
umesti transkripcijski regulatorni element. Thermo Scientific nudi tudi servis za kloniranje po meri
uporabnika.
Za normalizacijo oz. kontrolo v transfekcijskih poskusih uporabimo plazmide pCMV-luc in pTK-luc.
pCMV vektorji imajo luciferazni gen pod CMV promotorjem (citomegalovirus), zato imajo konsistentno
visoko ekspresijo v sesalskih celicah. pTK vektorji so pod promotorjem timidin kinaze (TK) virusa
herpesa simpleksa (HSV) in se izražajo na konsistentno nizki ravni.
Za zmanjšanje signala ozadja se uporabijo mesta za končanje prepisovanja (Ter), operator lac (Lac 01) in
mesto za prekinitev prepisovanja (TPS). Kot selekcijska označevalca sta uporabljena puromicin za
sesalske in ampicilin za bakterijske celice.
Oglejte si animaciji o dvojnih testih in časovnih testih s skeretornimi luciferazami :
Transfecirajte celice
Za vse naštete luciferazne vektorje je validiran transfekcijski postopek s transfekcijskim reagentom
Thermo Scientific TurboFect. TurboFect je sterilna raztopina kationskega polimera, transfekcija se lahko
opravi s serumom ali brez in je idealen za zelo različne celice - tudi primarne in tiste, ki se težko
transfecirajo. V primerjavi z drugimi lipidnimi ali polimernimi reagenti ima zelo dobre transfekcijske
lastnosti in minimalno toksičnost.
Uspešna transfekcija različnih celičnih linij s
TurboFect reagentom in plazmidno DNK, ki
kodira eGFP. Transfekcije (n=2 ali 3) so
analizirali s pretočno citometrijo
5
Boljši rezultati transfekcije z reagentom
TransFect. Primerjava učinkovitosti
transfekcije (leva y os) in izražanja proteinov
(desna y os) v celicah HepG2, transfeciranih s
pDNA za eGFP in transfecijskim reagentom
TurboFect ali reagenti drugih proizvajalcev.
Transfekcije (n=2 ali 3) so bile opravljene po
navodilih proizvajalca in analizirane s
pretočno citometrijo.
Pomožni reagenti za delo z luciferaznimi testi
Thermo Scientific Pierce Luciferase Cell Lysis Buffer: pufer za hitro in učinkovito lizo pritrjenih celic
ali peletov celic v suspenziji za analizo izražanja promotorja v luciferaznih testih. Pufer je kompatibilen z
vsemi Piercovimi kiti za luciferazne teste, je validiran za delo s celicami COS-7, NIH3T3 in Jurkat.
Kompatibilen s proteinskimi testi BCA in Coomassie (Bradford).
Pierce Firefly Signal Enhancer: do petkrat poveča intenzivnost signala pri testih tipa flash in do dvakrat
jakost in trajanje signala pri testih tipa glow, ojača tudi stabilnost bioluminiscenčnega signala za
luciferazni protein Firefly.
Thermo Scientific Pierce D-Luciferin: visoka čistoča za nizko ceno. Smo edini proizvajalec, ki s HPLC
metodo zagotovimo ustrezno kiralnost in učinkovitost luciferina. V obliki mononatrijeve ali monokalijeve
soli.
Primer metode za trojni poročevalski test – spremljanje ARE in NFκB in v nevroblastomskih celicah
ARE repeats minP
kotransfecirajte
tri plazmide v
celice
Gaussia Luciferase
plazmid za ARE odvisno ekspresijo luciferaze Gaussia
NF-kB repeatsminP
Cypridina Luciferase
plazmid za NF-kB odvisno ekspresijo luciferaze Cypridina
CMV
Red Firefly Luciferase
kontrolni plazmid, ekspresija luciferase
Firefly iz CMV promotorja
dodajte aktivatorje
celice razdelite na plošče in jih transfecirajte
izražanje Cypridine in Firefly
v lizatu izmerimo z dvojnim
testom
izražanje Gaussie zaznamo
z merjenjem flash signala v
mediju
6
Za primarne in matične celice, celice v suspenziji in druge celične linije, ki jih težko transfeciramo –
lentivirusni vektorji in pakirni sistemi LentiLuc
Najpogostejša metoda za transfekcijo celic je lipidna transfekcija. Za celične linije, kjer pa ni uspešna, je
najvarnejši sistem virusna transdukcija celic. Na voljo je več virusnih sistemov (adeno, retro in
lentivirusi), ki ima vsak svoje prednosti in slabosti. Lentivirusni delci so na splošno najbolj zaželeni, saj
imajo zelo visoko učinkovitost transdukcije. Lentivirusni vektorji stabilno vgradijo transgene v aktiven
kromatin celic (delečih ali nedelečih), imajo nizko toksičnost, zagotavljajo dolgotrajno izražanje
transgena in imajo širok tropizem. Z letom 2013 Thermo Scientific nudi 25 različnih lentivirusnih
vektorjev. Lentivirusni sistem omogoča oblikovanje stabilnih celičnih linij z luciferazo, s katerimi lahko
delamo presejalne teste za majhne molekule, analize sekretornih poti in celo slikanje procesov v živih
živalih (in-vivo imaging).
Izbirate lahko med Cypridina Lentivirus, Gaussia Lentivirus, Gaussia Dura Lentivirus, Green Renilla
Lentivirus, Red Firefly Lentivirus.
Na primer: Thermo Scientific Pierce Gaussia LentiLuc Packaging Kit vsebuje prenosni vektor pLentiMCS-Gaussia Luc, ki ima kloniran gen iz ceponožca Gaussia princeps. Gen kodira naravno sekretorno
obliko bioluminiscenčne luciferaze Gaussia (pribl. 20kDa), s katero je omogočena meritev aktivnosti
poročevalskega gena v mediju (za teste real-time) ali lizatu celic (za teste end-point). Prenosni vektor je
brez promotorja, vanj se klonira želeni promotor za nadzor ekspresije luciferaze.
trans-lentivirusna
pakirna mešanica
formiranje virusnih
delcev in brstenje
virus nesposoben
replikacije
virusni proteini
zberite virus v
supernatantu
penosni vektor
pLentiMCV-Luc
pakirna celica
transdukcija celic
Oblikovanje lenivirusa, ki izraža luciferazo s »pakirnim kompletom« Thermo Scientific Pierce Gaussia
LentiLuc Packaging Kit
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Klonirajte želeni poročevalni gen v vektor pLenti-MCS-Gaussia Luc.
Naredi kotransfekcijo vektorja in Trans-Lentiviral Packaging Mix v pakirne celice HEK293T.
Naslednji dan celicam zamenjajte medij - uporabite medij z manj seruma.
64 ur po transfekciji pridobite virus.
Če je potrebno, virus koncentrirajte in/ali očistite.
Če je potrebno, določite titer virusa.
Na želenih velicah naredite transdukcijo z virusom.
Za selekcijo stabilnih izraževalcev dodajte puromicin.
Opravite test za izražanje luciferaze Gaussia.
7
Elementi Thermo Scientific Pierce LentiLuc Transfer Vector: promotor, ki nas zanima, kloniramo v
mesto MCS (multiple cloning site) z označenimi restrikcijski encimi. Elementi plazmida, ki so zapakirani v
virusni sistem, so označeni zeleno.
Za izolacijo stabilnih klonov s puromicinsko rezistenco prenosni vektor kodira puromicin-N-acetiltransferazo (Pac), ki jo sproži promotor fosfoglicerat kinaze (PGK). Vključen je še lentivirusni vektor
Precision LentiORF RFP Control za konstitutivno izražanje RFP, ki se ga lahko uporabi paralelno z gausio
za pozitivno kontrolo virusne konstrukcije in uspešnosti transgeneze.
Pakrini sistemi Thermo Scientific LentiLuc Packaging
System imajo izboljšan varnostni profil v primerjavi z
drugimi lentivirusnimi sistemi na tržišču. Geni
virusa, ki so potrebni za pakiranje (Gag, Pol, Pro,
Rev, Tat, Env), so razdeljeni med pet plazmidov, zato
je le malo možnosti, da bi se virus vrnil v stanje
sposobnosti replikacije. Za dodano varnost je
izražanje Gag-Pro in Tat-Rev pod nadzorom
pogojnega tetraciklinskega odzivnega promotorja
(TRE), zato se te virusne komponente izrazijo le v
celicah, ki izražajo tetraciklinski transaktivator (preko
plazmida pTLA1-TOFF).
Thermo Scientific Pierce CMV- in TK- LentiLuc delci so že narejeni virioni, ki imajo stabilno izražanje
luciferaze pod kontrolo citomegalovirusa (CMV) oz. promotorja timidin kinase (TK) virusa herpes
simplex (HSV). Ker se promotorji razlikujejo v aktivnosti, so ti prednarejeni virusi namenjeni za (CMV) ali
nizko (TK) izražanje luciferaze. Te delce lahko uporabimo v kombinaciji z drugimi lentivirusnimi delci z
drugimi luciferazami kot pozitivno kontrolo za infekcijo in transgeni prenos ali za normalizacijo
eksperimentalnih pogojev. Če jih uporabimo samostojno, lahko oblikujemo celične linije s stabilnim
izražanjem določenega nivoja želene luciferaze
Za dodatne informacije in cenik pišite
dr. Malan Štrbenc
[email protected] mob: 040 626 041
8