1. No category

Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Univerzitetni študijski program Kemija
Izbirni sklop analizna in anorganska kemija
Avtomatizirana analiza
Seminar 2011
Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar
Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza
(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in
inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu
napake ali druge nepravilnosti.
Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
INTEGRIRANI MIKROFLUIDNI SISTEM ZA HITRO
FORENZIČNO DNA ANALIZO
povzeto po članku: Hopwood A.J., Hurth C., et al.: Integrated Microfluidic System for Rapid
Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal. Chem., 82 (2010) 6991-6999.
Mentor: prof.dr. Boris Pihlar
Barbara Remškar,
UNI KEMIJA
1. UVODNI DEL
1.1. Povzetek članka
Avtorji članka so izdelali v celoti integriran instrument za analizo kratkih tandemskih ponovitev DNA
molekule, ki so jo pridobili z odvzemom celic ustne sluznice. Instrument bo pomagal policiji pri
preiskovanju zločinov, saj se DNA procesna naprava enostavno napolni z vzorcem, ki ga nato
usmerjajo preko večih komor, da očistijo in pomnožijo DNA s PCR metodo, pomnožen produkt pa
nato preide v kapilarni elektroforezni (CE) čip. Fluorescentno označen produkt je v nadaljevanju ločen
z uporabo mikrokapilarne elekroforeze z resolucijo 1,2 bp, saj tako lahko detektirajo fragmente
kratkih tandemskih ponovitev in pridejo tudi do DNA profila v formatu, ki je kompatibilen z britansko
podatkovno bazo (ang. UK Database). Celotni proces od odvzetja vzorca do pridobitve DNA profila je
izvedljiv v štirih urah [1].
1.2. Na kratko o forenziki
Forenzika je veda, ki združuje znanost in zakone - gre za skupno ime, ki obsega znanje večih strok.
Področje forenzike zajema tudi forenzično kemijo, ki spada seveda v področje analizne kemije. Gre za
ločeno disciplino v kateri so cenjene predvsem spretnosti, umetnost in znanost primerjanja. Analizna
kemija uporablja kvalitativno in kvantitativno analizo, forenzična kemija temu prišteva še primerjalno
analizo [2].
Rimljani so bili prvi, ki so formulirali potrebne elemente forenzične kemije. V takratnem času je bilo
neverjetno težko ugotoviti kako se je določena oseba zastrupila in ali je za to dejanje kdo odgovoren.
Zaradi množičnega dogajanja so prvi zakon na področju zastrupitev sprejeli že leta 82 pr.n.št.
Približno 250 let pred tem pa so Rimljani obsodili kar veliko število žensk, ki naj bi zastrupile ali moža
ali očeta morebiti druge sorodnike. Kazen, ki so jo dobile zaradi storjenega zločina, pa je bilo popitje
strupa – vodilo v takratnem času se je glasilo: »Those who live by the poison shall die from the
poison« (ang. tisti, ki živijo strupom, naj umrejo s strupom) [2].
Analizna kemija se na področju forenzike deli na dva dela: forenzično kemijo in forenzično
toksikologijo. Pri slednji delajo z biološkimi dokazi, sledijo drogam in strupom ter so povezani s
preizkovanjem smrtnih primerov. Za »očeta« forenzične toksikologije označujejo gospoda z imenom
Mateu Josep Bonaventura Orfila, francoskega kemika in toksikologa, ki se je ukvarjal z zastrupitvami.
Dobro je znan po primeru Marie LaFarge, vdovi, ki se je pri 24 letih vnovič poročila s Charles LaFarge–
om, ki pa je leta 1839 skrivnostno umrl po zaužitju torte, ki mu jo je pripravila žena. Vse je kazalo na
zastrupitev z arzenom, saj so ga našli v torti, vendar ga po obdukciji trupla v telesu pokojnega ni bilo
moč zaznati, zato so Orfilo prosili za pomoč. Ta je ugotovil, da test katerega so naredili za določitev
arzena v tkivu ni bil izveden pravilno, nato pa ga ponovil, določil arzen in dokazal krivdo Marie
LaFarge [2].
Danes se na področje forenzike vse bolj uporablja tehnika prstnega odtisa (DNA profiling). O tej
tehniki, ki ji pravijo tudi forenzična DNA analiza, so prvič pisali leta 1984, zato je to zelo mlado
področje, ki pa se je že močno uveljavilo. Začetnik je Sir Alec Jeffreys iz Univerze Leicester v Angliji, ki
1
je leta 1987 omogočil, s pomočjo kemijskega podjetja Imeperial Chemical Industries (ICI), tudi
komercialno dostopne krvne teste [3].
2. SPLOŠNO O FORENZIČNIH ANALIZAH
DNA ali deoksiribonukleinska kislina je kompleksna molekula, ki jo najdemo v sleherni celici našega
telesa kot tudi v celicah vseh živih bitij. Ta unikatna molekula nosi genetske informacije, ki so
uporabne za delovanje celice kot tudi celotnega telesa in se prenašajo iz generacije v generacijo. Ker
ima vsak človek svojo unikatno »kodo« molekule DNA, je to zelo priročno za detektiranje
povzročiteljev in osumljencev raznih zločinov in kaznivih dejanj [4]. V forenzičnih raziskavah se DNA
analiza izvaja z ekstrakcijo DNA iz vzorca, ki ga vzamejo s pomočjo sterilnih palčk iz ustne sluznice.
Tak forenzični proces dovoljuje rutinsko analizo vzorca, ki pa jo morajo narediti v 24 – 72 h po
odvzemu vzorca. Osumljencu, ki je v policijskem pridržanju, odvzamejo vzorec in ga nato shranijo ter
jih skupaj z drugimi vzorci zbrane odnesejo v laboratorij na analizo, kjer jim lahko proces analize
vzame od nekaj ur do celo nekaj tednov. Celo pri vzorcih, ki so takoj prinešeni v laboratorij, je velika
verjetnost, da bo analiza potekala tako dolgo, da bodo osumljenca že izpustili iz pridržanja [1]. V
laboratoriju tako molekulo DNA primerjajo z biološkim vzorcem, ki so ga našli na kraju zločina – s
krvjo, slino, lasmi ali pa s kožnimi celicami, ki jih najdejo skupaj s prstnimi odtisi. Na molekuli DNA so
znana določena področja, ki se zelo razlikujejo med posamezniki. V Veliki Britaniji primerjajo deset
takih področij na molekuli s SGM Plus sistemom, vendar ta ne odkrije vseh podrobnosti posameznika,
le tiste, ki so močno razlikujejo [4]. Tak vzorec ima le 2,3% možnosti ujemanja z vzorcem, ki so ga vzeli
s kraja zločina in ga shranili v Nacionalni DNA podatkovni bazi (NDNAD – National DNA Database).
Ker večkrat pride do incidentov s strani osumljencev, ki podajo varščino za svojo osvoboditev, bi bilo
bolje, da bi take osebke pridržali do končne analize in primerjave z vzorcem v podatkovni bazi. To je
prineslo zahtevo po hitri DNA analizi in dostopu do podatkov v nacionalni bazi [1].
Forenzičnim laboratorijem trenutni proces omogoča, da lahko vzorce v nujnih primerih analizirajo
tudi ročno v manj kot 8 urah. Vendar taka analiza terja veliko trdega dela in denarja. Rešitev bi bila
implementacija hitrejšega sistema, kjer bi osumljencu odvzeli vzorec, ga analizirali in primerjali z
vzorcem v podatkovni bazi DNA profilov. To bi potekalo v času, ko je osumljenec še v pridržanju, brez
potrebe po ponovnem prijetju v primeru, da pride do ujemanja vzorcev [1].
V Veliki Britaniji je kar 75% aretiranih posameznikov izpuščenih po 6 urah pridržanja in okrog 95% po
24 urah. Prav zaradi tega je mnogim raziskovalcem cilj skrajšati DNA analizo, da bi skupaj s primerjavo
vzorcev z DNA profilom v bazi (prstni odtis DNA) in morebitno duplikacijo to trajalo približno 6 ur,
dokler je osumljenec še v pridržanju [1].
Do sedaj je bilo že veliko raziskav kako pohitriti DNA analizo in optimizirati celotni proces. Razvoj
integriranega mikrofluidnega sistema t.i. tudi mikro totalni analizni sistem (ang. microTAS – micro
total analysis system) je bil obravnavan že dlje časa in nekateri so že uspešno razvili module za DNA
ekstrakcijo, PCR pomnoževanje in kapilarno elektroforezo [1]. Tak sistem za analizo potrebuje zelo
majhne količine vzorca, za CE je dovolj že 106 -107 molekul vzorca. Prednosti microTAS so v hitrosti,
majhni porabi reagentov, veliki prepustnosti in v majhnosti instrumenta. Mikrofluidna avtomatizacija
prav tako eliminira možnost kontaminacije vzorca [5].
DNA analiza zajema ekstrakcijo DNA iz vzorca, kvantifikacijo in normalizacijo DNA, hkrati pa obsega še
encimsko pomnoževanje DNA (PCR - polymerase chain reaction) s katero pomnožimo kratko
2
specifično zaporedje DNA (STR - short tandem repeats) in separacijo oz. detekcijo PCR produktov,
kjer se običajno uporablja kapilarna elektroforeza (CE) [1]. Slednja je separacijska metoda, kjer se
komponente vzorca ločijo zaradi različne hitrosti potovanja v električnem polju v kapilari. Fragmenti
DNA so označeni s fluorescenčnimi barvili in se zaradi različne afinitete do negativnega potenciala
ločijo med seboj. Na koncu fragmente presvetlijo z laserjem, ki povzroči, da DNA fluorescira [6].
PCR ali verižna reakcija s polimerazo je hitra, poceni in enostavna metoda pomnoževanja zaželenega
specifičnega DNA fragmenta, kjer je potrebna le majhna količina DNA. PCR metoda ojača kratko
sekvenco DNA, manjšo od 25 kb, včasih celo manjšo od 1 kb [7]. Proces izvedejo tako, da v prvi
stopnji denaturirajo DNA pri višji temperaturi (okrog 90°C), da dobimo dve vijačnici. Sledi znižanje
temperature (okrog 55°C) in encim polimeraza DNA ob stari (matrični) verigi dodaja komplementarne
nukleotide (sintetično izdelani fragmenti DNA). Pri povišani temperaturi (okrog 70°C) ta encim zgradi
dve popolnoma identični kopiji DNA [8]. Proces segrevanja in ohlajanja traja približno 90 s in je
ponovljen 25-45 – krat [7].
STR ali kratke tandemske ponovitve so kratka zaporedja baznih parov (med 2 in 5) na več mestih v
genomu, ki se večkrat ponovijo, število ponovitev pa se lahko razlikuje od posameznika do
posameznika. Z metodo želijo določevati zaporedja na točno določenih mestih (lokusih – gre za
mesto gena na kromosomu), kjer se ponavljajo večinoma 4 bazni pari, saj je tako verjetnost, da bosta
dva posameznika imela enako kombinacijo STR, zelo majhna [9].
Fluidni sistem je osnovan na principu zaprte arhitekture, kar zmanjša možnost kontaminacije vzorca,
saj je to temeljna zahteva uporabe v forenziki. Omogoča tudi DNA ekstrakcijo, pomnoževanje DNA,
resolucijo STR alelov s kapilarno elektroforezo in njihovo detekcijo z uporabo lasersko inducirane
fluorescence (LIF). Polikarbonatna naprava za DNA ekstrakcijo in PCR vsebuje zahtevane reagente – ti
so pripeti na adapter, na njem pa se nahaja tudi stekleni mikrokapilarni elektroforenzni čip, ki se
uporablja za detekcijo barvno označenih pomnoženih STR alelov. Ekstrakcijski – PCR del je v stiku z
elektronskim vezjem, ki zagotavlja kontrolo in omogoča uporabo tudi neizkušenemu tehniku. Fluidni
premiki so avtomatski in kontrolirani z uporabo elektrokemijskih črpalk in termično aktiviranih
ventilov. Da se izognejo neprestanemu opremljanju in popravljanju sistema ter pri tem možnosti
kontaminacije, raje uporabijo ventile za enkratno uporabo kot pa kompleksnejše ventile, ki bi jih sicer
lahko uporabili večkrat. Ob zahtevi se aktivira tudi samo – kontrolni magnet, ki se uporablja za
zbiranje magnetnih delcev za DNA čiščenje. V sistem vstavljeni toplotno odporni grelci so uporabni za
aktivacijo ventilov in Peltierjeve naprave, ki imajo nalogo vzdrževanja kroženja toplote za pospešitev
procesa [1]. Peltierjeve naprave omogočajo prenos toplote z ene strani naprave na drugo stran ne
glede na temperaturni gradient dveh različnih tipov materialov (z mrzlega na toplo) s porabo
električne energije [10]. Miniaturni visokonapetostni del je integriran v "hardware" (strojno opremo)
in omogoča separacijo STR pomnožkov (ang. amplicons) v matriksu polivinilpirolidona (PVP) in
hidroksietilceluloze (HEC). Podatki pridobljeni s pomočjo µCE so obdelani ročno z uporabo
komercialno dostopne programske opreme in DNA profil nato posnamejo v formatu, ki je združljiv s
podatki iz Nacionalne DNA podatkovne baze [1].
3
3. EKSPERIMENTALNI DEL
Na posameznih osumljencih poberejo vzorec DNA iz ustne sluznice s sterilno palčko, vzorce zberejo in
jih nemudoma pošljejo v laboratorij na analizo [1].
3.1. Načrtovanje in izdelava naprave (ang. cartridge)
Napravo za DNA ekstrakcijo, ojačanje in PCR pomnoževanje so naredili s 3 mm polikarbonatne plošče
(tiskano vezje), ki je računalniško krmiljena (CNC) in obsega veliko število komor za shranjevanje
reagentov in pomnoževanje vzorca. Fluidni sistem je izdelan tako, da so izhodi iz ene komore na dnu
posamezne komore in vodijo v drugo, saj so tako izkoristili gravitacijo in se znebili morebiti nastalih
mehurčkov v toku tekočine znotraj sistema. Na kanalih, ki povezujejo komore, so s parafinskim
voskom izdelani odprti (O) in zaprti (V) ventili katerega temperatura tališča je 65°C. Izjema je le ventil
V15, ki vertikalno povezuje dve komori – ti sta napolnjeni z različnima parafinskima voskoma –
spodnja komora, bližje Peltierjevi napravi, vsebuje H1 Sasol vosek (Ttal = 105°C) in druga standardni
vosek. Razlika v temperaturi tališča teh dveh vrst voskov je pomembna zato, ker H1 vosek preprečuje
ventilu V15, da bi se predčasno odprl zaradi Peltierjevih naprav, ki generirajo višje temperature.
Slika 1: Predstavitev naprave za DNA
ekstrakcijo, pomnoževanje in po PCR
denaturacijo, ki kaže P1 -P4 =
elektrokemijske črpalke; C1 = komora za
vnos vzorca; C2 = komora s kroglicami; C3 =
mešalna/inkubacijska komora; C4 = spiralna
in elucijska komora; R = PCR komora; A =
shranjevalna
komora
DNA;
D
=
denaturacijska komora; M = shranjevalna
komora kroglic; B = komora s čistilnim
pufrom; W = shranjevalna komora s čistilnim
pufrom; E = shranjevalna komora elucijskega
pufra; F = shranjevalna komora formamida;
X = izhod na CE. Zaprti ventil je prikazan z ;
odprti ventil z
in zračniki z .
Slika povzeta po [1].
Tabela 1: Reagenti in pripadajoči volumni
potrebni za delovanje naprave. Tabela
povzeta po [1].
4
V črpalne komore so namestili aluminijaste elektrode, jih prilepili z ustreznim lepilom in posušili. V
komoro R so dodali PCR mešenico reagentov v obliki kroglic (ang. beads) preden so pripojili 0,5 mm
polikarbonatno podlago z obojestranskim lepilnim trakom in jo zadržali pri dveh različnih tlakih za 40
sekund. Reagenti so tako stabilni vsaj 16 tednov, če so shranjeni na 4°C, prav tako ta del naprave
shranjujejo pri tej temperaturi vse dokler ga ne uporabijo. Ostale reagente dodajo, v za njih
namenjena mesta, ravno pred uporabo. »Kartušo za enkratno uporabo« (ang. the single – use
cartridge) nato vstavijo vertikalno v nosilec, horizontalno pa namestijo 140 mm stekleni microCE čip
(slika 2A). Komponenti sta skupaj povezani s 100 mm dolgo teflonsko cevko notranjega premera 200
µm, kjer ročno povežejo izhod X na napravi z zbirnikom vzorca na adapterju, ki je pritrjen na
elektroforezni čip. Teflonsko cevko ob vsakokratni uporabi zamenjajo [1].
Slika 2: Polikarbonatna naprava in borosilikatni microCE čip. (A) PC naprava v vertikalni in CE čip v horizonatalni legi. (B)
Zgoraj je viden adapter z zbirniki za elektrode, vidna je tudi PEEK cevka za vnos, ki vstopa v podolgovat zbirnik vzorca
(sample well no. 1), na dnu slike je viden pokrov adapterja s tremi z zlato plastjo obdanimi elektrodami. (C) Pokrov adapterja
v poziciji z Au elektrodami. (D) Predstavitev adapterjev na CE čipu in postavitev CE kanala v relaciji z zbirniki (ang. wells).
Slika povzeta po [1].
3.2. Elektronsko krmiljenje
Tiskano vezje kontrolira in omogoča različne funkcije, hkrati drži ploščico z vezjem na katero je
nameščena naprava (ang. cartridge), ki povezuje elektrode na elektrokemijskih črpalkah [1].
Vzorcu celic, ki ga pridobijo iz ustne sluznice, z dodatkom pufra povzročijo, da se celice v
hipotoničnem okolju razpočijo, dodajo raztopino encima proteinaze K, ki jo uporabijo za zaščito
dednega materiala, saj ta deaktivira nukleaze, ki bi v nasprotnem primeru razgradile DNA. Vse skupaj
postavijo v mikrocentrifugirno cevko in inkubirajo pri 60°C 15 minut. 150 µL vzorca s pipeto
prenesejo v komoro C1. Zaženejo črpalko P1, da zadrži tlak v sistemu in odpre se ventil O1, ki usmeri
5
vzorec v komoro B s čistilnim pufrom, potem pa gre preko komore M z magnetnimi kroglicami v
komoro C2, kjer pride do mešanja vzorca. Vzorec potuje naprej preko dveh ekspanzijskih komor v
komoro C3. Tu se izvrši mešanje s pomočjo mehurčkov pare, ki jih producira pomožna črpalka.
Vzorec se v C3 zadrži za 3 minute, da olajša DNA vezavo. Nato potuje naprej v komoro C4, kjer
magnetno polje (450±100 gauss), ki ga povzroči samo – aktivirani magnet, zajame magnetne kroglice.
V odpadno komoro steče supernatant z neveznimi DNA in tudi drugi neuporabnimi produkti. Kroglice
z vezanimi DNA se sperejo s čistilnim pufrom iz komore W z aktivacijo črpalke P2. S kroglic se je nato
sprostila DNA s 3 minutno inkubacijo pri 60°C po odstranitvi magnetnega polja. V naslednji fazi je v
komoro C4 pritekel elucijski pufer iz komore E. Magnetno polje je zopet »polovilo« kroglice in
aktivacija črpalke P3 je povzročila, da je eluirana raztopina DNA je stekla proti komori A preko PCR
komore R. V PCR komori se je izvršilo pomnoževanje DNA (16 - ih lokusov) v večih stopnjah pri
ustreznih temperaturah. Raztopina je nato stekla preko parafinske komore in ventila O12, ventil V15
pa je zaprl PCR komoro. PCR raztopini je bil dodan formamid in majhna količina internega standarda
iz formamidnega rezervoarja F, ki ga je prečrpala črpalka P4. V denaturacijski komori se je zbral
formamidni vzorec, sledila je tri minutna inkubacija pri 95°C pred črpanjem v CE čip [1].
CE mikročip je izdelan iz borosilikatnega stekla, nanj pa je z UV lepilom nameščen polikarbonatni
adapter, da omogoči zbirnikom pufra maksimalni možni volumen (35 µL) in PEEK (polieter eter keton)
povezavo teflonske cevke do naprave za DNA ekstrakcijo in pomnoževanje. Polikarbonatni plošči –
ena s tremi zlatimi količki in druga le z enim (slika 2B) – sta bili izdelani kot pokrov za zaščito fluidnega
sistema na adapterju (slika 2C) in sta povezani s kontrolnim sistemom. CE čip so izdelali iz polimera, ki
so ga izmenično sprali z vodo in s HCl. Tveganje za kakršnokoli kontaminacijo vzorca s PCR produkti, ki
bi jo morebiti lahko povzročil CE čip, je bila minimalna, saj so reagente pripravili prej preden so vse
skupaj povezali s CE čipom. V vsako vdolbinico oz. zbirnik na elektroforeznem čipu so dali majhno
količino pufra (25 µL) nato pa omogočili povezavo. Vzorec je stekel v zanj namenjeno komoro na
adapterju in se injiciral v separacijski kanal. Označene fragmente so detektirali 110 mm od mesta
injekcije [1].
3.3. Detekcija z lasersko – inducirano fluorescenco (LIF)
Lasersko – inducirana fluorescenca se veliko uporablja predvsem v kapilarnih separacijah zaradi svoje
visoke občutljivosti, hitrosti in selektivnosti. Gre za spektroskopsko metodo, ki je uporabljena za
študij strukture molekul, detekcije točno določenih specij in vizualizacije ter meritve toka. Tudi tu so
za detekcijo uporabili konfokalno lasersko – inducirano fluorescenco – sistem za odkrivanje. Kot vir
so uporabili laser (diode-pumped solid-state - DPSS), ki so ga omejili s pomočjo 480 – 520 nm filtra in
žarek usmerili na visoko reflektivno ogledalo s centrom na Ramanskem laserskem reflektorju. Laser
proizvede 21 mW moči pri 491 nm na CE mikročipu, kjer svetlobo zberejo s pomočjo objektiva.
Emisije valovnih dolžin fluorescentno zabeleženih DNA fragmentov se po emisijskem filtru zberejo na
kameri (charge – coupled device camera – CCD), ki ima mesto na spektrometru. Ta odstrani tiste
valovne dolžine emisijskega spektra, ki so različne od dolžine CCD, vendar pa zagotavlja kvantitativno
merjenje različnih barv vzorca. Podatki so dali informacijo o vrhovih vsake izmed petih barv, ki so bile
uporabljene s pomočjo multipleksne analize in prav tako pa tudi informacijo o genotipu [1].
6
4. REZULTATI IN RAZPRAVA
Cilj celotne raziskave je bil izdelati DNA profil s 16 lokusi v elektoferogramu – k temu je pripomogla
zbirka vzorcev, DNA ekstrakcija, metoda PCR in CE detekcijska instrumentacija. Največje odstopanje
lahko dobimo z vnosom vzorca, saj imajo različni posamezniki različno količino celic, te pa različno
količino DNA. Koncentracijo DNA je tako potrebno minimizirati. Ugotovili so, da je pri sveže pobranih
vzorcih koncentracija DNA v območju 0,47 - 1,92 ng/µL trudoma dosežena. Količina DNA, ki so jo
dobili po PCR pomnoževanju je varirala glede na količino DNA v reakciji, volumen PCR in število PCR
ciklov. Dodana količina DNA ekstrakta je bila odvisna od velikosti PCR komore in kroglic (ang. beads).
PCR komoro so napolnili z DNA raztopino, ki je potovala od komore C4 do komore A, polnili pa so jo
toliko časa dokler ni dosegla restrikcijskega kanala [1].
Slika 3: Izdelava fluidnega sistema v PCR komori. DNA raztopina vstopi v komoro z desne in jo napolni. Ko nivo tekočine
doseže zožitveni kanal na zgornji levi strani komore, se tlak, ki je odgovoren za prečkanje raztopine skozi zožitveni kanal
močno poveča napram tlaku, če bi raztopina potovala skozi »bypass« kanal. Raztopina DNA zato prečka most (bypass) in
pusti za seboj natančen volumen DNA v PCR komori (komora je prikazana z rdečo raztopino). Reakcijski volumen je
obnovljen z zaprtjem mostu na Y z uporabo ventila V15, formamid pa spere komoro in zbere PCR produkte.
Slika povzeta po [1].
Ko je ventil V15 zaprt, celoten PCR vzorec iz PCR komore v formamidu preide na zbirnik na
elektroforeznem čipu. Površinski efekti lahko enostavno pripomorejo k premiku večine vzorca iz
komore – v njej ostane le kakšen mikroliter ali dva. V kanalu se pred formamidom nahaja zrak, ki iz
PCR komore odstrani večino PCR reakcije med zožanjem (ang. constriction). Formamid nato napolni
komoro in odnese preostanek PCR raztopine. Volumen vzorca, ki pride v komoro D se nekoliko
spreminja v območju med 15-35 μL. Sprememba v volumnu nastane zaradi treh razlogov: (1) Ko teče
raztopina mimo se vosek na V13 in V14 stopi, posledično pride do nekolikšnega mešanja z voskom.
Tekočina se zato ujame, ko se vosek ponovno strdi. (2) Tekočina se lahko tudi izgubi v strukturi
ventilov V13 in V14. (3) Kanali imajo grobo površino, ki obdrži 1-2 μL tekočine /inch kanala. Tako je
volumen vzorca, ki pride iz PCR, se denaturira v komori D in nato doseže μCE, spremenljiv kar pa
lahko znatno vpliva na končne rezultate. Zaradi zgoraj navedenih razlogov se volumen PCR produkta
7
in formamida sorazmerno zmanjša z volumskim razmerjem. Vzorec običajno segrejejo na 95°C za 3
minute, da pride do denaturacije in ga nato v trenutku ohladijo na ledu. Lahko pa ga počasi
segrevajo, brez končnega ohlajanja in ga nato pripravijo za CE. Vrednotenje takega profila je
zadovoljivo, saj so ugotovili, da sta profila z in brez ohlajanja primerljiva. Elektroferogram internega
standarda, ki so ga s formamidom redčili v razmerju 9:1 in nato segreli do 95°C za 5 minut, da je
prišlo do denaturacije, je bil uporaben za oceno ločitvene učinkovitosti µCE modula. Resolucijo so
izračunali tako, da so pomerili retenzijske čase in širine vrhov Gaussove krivulje in jo izračunali po
sledeči formuli:
Posledično Rbp = Δbp/R nakazuje resolucijo baznih parov – minimum ločitve dveh vrhov baznih parov,
ki se bosta znova pojavila ločeno na bazni liniji elektroferograma. Slika 4A kaže na elektroferogram,
kjer so predstavljeni podatki – elektroferogram predstavlja celoto zbranih signalov s CCD. Slika 4B
kaže potek resolucije na CE sistemu kot funkcija znane velikosti vrha v primerjavi z
elektroferogramom, ki so ga dobili s kapilarnim analizatorjem, kjer so uporabili enak polimerni
matriks pri 65°C s katodnim potencialom 10,3kV. Dobljena resolucija na μCE modulu je dokaj blizu
komercialnemu CE aparatu [1].
Slika 4: (A) tipični elektroferogram pridobljen z GeneScan 500 LIZ zagonom na CE podsistemu z uporabo 140 mm mikročipa
pri 50°C. (B) Primerjava resolucije (v baznih parih) Rbp na CE sistemu (rdeča krivulja) in na 310 aparatu (Applied Biosystems)
pri 65°C v 36 cm kapilari (modra krivulja). Slika povzeta po [1].
Resolucijske vrednosti so varirale v območju med 1,02 in 1,24 bp za vrhove v mejah 140-160 bp.
Slednjo lahko izboljšamo z uporabo potisnega injiciranja in kompozicije HEC/PVP mešanice za
uporabo na mikročipu [1].
Serijo alelnih lestvic so posneli na CE podsistemu z uporabo standarda, ki je pripomogel k stabilnosti
sistema. Zaporedni nizi so bili pridobljeni na treh različnih mikročipih, da bi lahko določili kakšna so
variranja med mikročipi [1]. Spodnja slika nakazuje kromosom s specifičnimi deli, kjer vedo kakšne so
8
lastnosti, zato jih imenujejo markerji. Genetski markerji so značilni kratki deli DNA in mestu v
molekuli DNA, kjer ta marker leži, pravimo lokus. Z opazovanjem specifičnih genetskih markerjev
lahko znane vzorce DNA primerjajo z neznanimi in potem določujejo ali so vzorci kako povezani ali
celo identični [11]. Če bi si lahko molekulo DNA predstavljali kot zelo dolgo vrvico, bi bil lokus
specifičen del vrvice (npr. med 7-8 cm), ki pa je lahko obarvan s tremi različnimi barvami (npr.
rumeno, zeleno, rdečo). Na lokusu imamo torej tri možnosti – tri alele. Prav te razlike v alelih nam
dajo uporabne informacije [12].
Slika 5: (A) Poweplex ESI16 alelna lestvica z uporabo CC5 ILS500 standarda in GeneMarkerja HID 1,76. (B) [7-9] alelno
področje (304-310 bp) na D22S1045 markerju. (C) [10 – 11] področje (146-150 bp) na D18S51 markerju. (D) [9-11] področje
na TH01 markerju. (E) [21,2-26] področje na FGA markerju. Slika povzeta po [1].
Slike od 5B do 5E kažejo na alelna področja, ki so jih dobili s pomočjo markerjev. Opazili so premike v
velikosti baznih parov za pet različnih alelnih lestvic. Tako se je maksimalna sprememba v poziciji
alela napram tabelarični vrednosti pokazala pri vseh markerjih v območju med 0,2 – 0,7 bp.
Sprememba narašča z velikostjo fragmenta, kot je tudi pričakovano s kromatografsko resolucijo CE
podsistema. Podatki pridobljeni iz niza petih alelnih lestvic z znanimi oznakami so bili zatem
uporabljeni za vnaprejšnjo določitev pričakovanih velikosti neznanih alelov v ojačanih DNA vzorcih
[1].
9
5. ZAKLJUČEK
Avtorji članka so uspeli pokazati microTAS pristop za učinkovito in hitro DNA tehnologijo primeren za
področje forenzike. DNA profile so pridobili preko odvzetih celic katerim so ustvarili hipotonično
okolje, da so pridobili molekule DNA. Avtomatski proces je enostaven in DNA profili so skladni s
pričakovanimi profili donorja. Cilj celotne raziskave je bil doseči učinkovit DNA profil od vzorca do
profila v manj kot dveh urah. Avtorji se zavedajo, da bi lahko proces pohitrili na določenih stopnjah in
bi tako prišli do profila v manj kot 4 urah. Veliko časa (približno 1,5 ure) bi lahko prihranili tako, da bi
zreducirali PCR parametre. Optimizacija procesa na napravi dovoljuje paralelni proces tako odpiranja
ventilov kot kontrole črpalk kar pa lahko znatno zmanjša porabljen čas in zato so avtorji optimistični,
saj verjamejo, da lahko dosežejo zastavljen cilj – analizo v manj kot dveh urah. Za posamezni vzorec
porabijo 10 minut, da napolnijo raztopine v plastično napravo in nekje 75 minut za pripravo na CE čip.
To bi lahko izvedli že medtem, ko se izvaja analiza prejšnjega vzorca, saj bi tako skrajšali čas za nekaj
več kot 5 minut. Resolucija na opazovanem μCE modulu je zelo blizu komercialnemu CE aparatu in
reproduciranost fragmentne migracije je bila zelo dobra. Migracija DNA profila človeških vzorcev
zahteva nekaj izboljšav, če bi bil sistem uporaben za dokazne vzorce [1].
Največja spremenljivka v procesu ostaja količina (volumen) DNA vnosa v PCR reakcijo in dokler
zadeva višino vrhov v elektroferogramu, to ne bo imelo vpliva na natančnost določanja genotipa
vzorca [1].
Avtorji so prepričani, da se bo vsak z osnovnim znanjem stroke lahko spoprijel z instrumentom,
čeprav pa je res, da je potrebno pridobiti izkušnje. V nadaljevanju imajo cilj izdelati napravo, ki bo
sklopljena z avtomatskim kanalom, z njo pa bi skrajšali čas in naredili posamezniku prijaznejši sistem
[1].
Članek z naslovom Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection
to DNA Profile je delo večih avtorjev, ki se zavzemajo za napredek pri DNA analizah v forenzičnih
raziskavah. Izbrala sem si ga za izdelavo seminarske naloge pri predmetu Avtomatizirana analiza, saj
me je pritegnil že povzetek in tudi celoten članek je vsekakor zanimiv in naučila sem se mnogih novih
stvari tako s področja forenzike kot tudi s področja molekularne genetike. Moram priznati, da kot
kemiku, ki nima veliko znanja o molekularni biologiji in genetiki, je članek vsakič znova odpiral nova
vprašanja predvsem z vprašalnico »Zakaj?«. Z vztrajnim iskanjem odgovorov in dodatne literature,
sem se nekako le uspela prebiti skozi članek in si ustvarila sliko celotnega procesa analize DNA, ki jo
uporabljajo v forenziki. Naprava, ki so jo izdelali, bo vsekakor pomagala tako policiji kot forenzikom in
verjamem, da bodo z njeno pomočjo lahko na enostavnejši način prijeli zločince, brez nepotrebnega
ponovnega prijetja, če bi slučajno prišlo do ujemanja vzorcev, saj bodo ti ljudje še v pridržanju, ko
bodo že znani rezultati DNA analize.
10
LITERATURA:
[1] Hopwood A.J., Hurth C., et al.: Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis:
Sample Collection to DNA Profile. Anal. Chem., 82 (2010) 6991-6999.
[2] Bell S.: Forensic Chemistry. Pearson Prentice Hall, USA (2006) p. 1-10
[3] http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_fingerprinting (8.4.2011)
[4] http://www.npia.police.uk/en/docs/NDNAD07-09-LR.pdf (9.4.2011)
[5] Liu, P.; Mathies, R. A.: Integrated microfluidic systems for high-performance genetic analysis.
Trends Biotechnol, 27 (2009) 572–581.
[6] http://sl.wikipedia.org/wiki/Kapilarna_elektroforeza (10.4.2011)
[7] Ringo J.: Fundamental Genetics. Cambridge University Press, UK (2004) p. 261
[8] http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html (14.4.2011)
[9] Erlich, H.A. 1989. PCR technology: principles and applications for DNA amplifications.Stockton
Press, NY.
[10] http://en.wikipedia.org/wiki/Thermoelectric_cooling (15.4.2011)
[11] http://www.wisegeek.com/what-are-genetic-markers.htm (16.4.2011)
[12]http://www.medvedi.si/index.php?option=com_content&view=article&id=46%3Amarkerji&catid
=19%3Agenetikasplono&Itemid=66&lang= (17.4.2011)
11