1. No category

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, FKKT
Tesni in
presledkovni stiki
med celicami
Seminarska naloga pri predmetu Biološke membrane
Avtorici: Veronika Jarc in Tjaša Goričan;mentor: prof. dr. Igor Križaj
1/2/2015
UVOD ....................................................................................................................................................... 2
TESNI STIKI ............................................................................................................................................... 3
ZGRADBA TESNIH STIKOV .................................................................................................................... 3
KLAUDIN .............................................................................................................................................. 3
OKLUDIN .............................................................................................................................................. 4
TRICELULIN .......................................................................................................................................... 5
JAM ...................................................................................................................................................... 5
ZO-1, ZO-2 in ZO-3 ............................................................................................................................... 5
BOLEZNI TESNIH STIKOV...................................................................................................................... 6
PRESLEDKOVNI STIKI ............................................................................................................................... 6
KANALI PRESLEDKOVNIH STIKOV ........................................................................................................ 6
KONEKSINI (Cx) .................................................................................................................................... 7
STRUKTURA IZOOBLIKE KONEKSINA Cx26 ........................................................................................... 8
OHRANJENE IN NEOHRANJENE REGIJE V DRUŽINI KONEKSINOV ....................................................... 8
STRUKTURA PORE KANALA PRESLEDKOVNEGA STIKA IN INTERAKCIJE MED KONEKSONOMA IZ
KONEKSINOV Cx26 .............................................................................................................................. 9
MEHANIZEM ODPIRANJA IN ZAPIRANJA KANALOV PRESLEDKOVNEGA STIKA IZ IZOOBLIKE
KONEKSINOV Cx26 ............................................................................................................................ 10
POMEN PRESLEDKOVNIH STIKOV...................................................................................................... 11
BOLEZNI, POVEZANE S PRESLEDKOVNIMI STIKI ................................................................................ 11
ZAKLJUČEK ............................................................................................................................................. 12
VIRI ........................................................................................................................................................ 12
1
UVOD
Tesni stiki so stiki, ki povezujejo lateralne celične membrane v epitelijskih celicah, kjer postane
medcelični prostor neprehoden za medcelično tekočino. Vsebujejo paracelularne kanalčke, ki
nadzirajo pretok skozi intracelularni prostor epitelijskih celic (slika 1).
Slika 1: Prikaz tesnih stikov med celicama (Steed et. al 2009).
Z elektronsko mikroskopijo lahko tesne stike vidimo kot območje, kjer so plazemske membrane zelo
skupaj in obdajajo celico kot pas skupaj z adhezijskimi stiki. Tesne stike so podrobneje analizirali z
freeze-fracture elektronsko mikroskopijo, ki je pokazala morfologijo centralnega hidrofobnega
predela samega tesnega stika. Zaradi teh analiz so tesne stike klasificirali kot semi-permeabilne
pregrade, ki so zmožne pretoka ionov, raztopin, in celic skozi paracelularni prostor. Torej sodelujejo
pri vzdrževanju in vzpostavitvi apiko-bazalne polarnosti. Tesni stiki so prikazani v glutaraldehidno
fiksiranih epiteljiskih celicah kot linearne fibrile na citoplazmeski strani (P-stran) in brazde na
eksoplazemski (E-stran) strani celice (slika 2).
Slika 2: Tesni stik pod elektronskim mikroskopom (puščica predstavlja P-stran, konica puščice pa E-stran) (Furuse 2010).
Poznamo dva modela, ki razlagata, zakaj imajo tesni stiki tako strukturo. Najbolj verjeten model je
proteinski model, ki predlaga, da proteinsko pritrjevalni elementi (adhezijske molekule) držijo
plazemske membrane skupaj. Drug model je lipidni model, kjer so tesni stiki cilindrično obrnjene
lipidne micele, narejene z združitvijo plazemske membrane, kar se vidi v neprekinjenosti zunanjih
predelov plazemskih membran med sosednjimi celicami.
2
Presledkovni stiki so stiki med dvema sosednjima celicama, katerih membrani sta oddaljeni za 2-4
nm, in so prisotni v veliko različnih tipih tkiv. Sestavljeni so iz 10-1000 kanalov, ki potekajo čez 2
plazemski membrani in tako povezujejo citoplazmi 2 sosednjih celic (slika 3).
Slika 3: Presledkovni stiki (levo) in kanal presledkovnega stika (desno) http://kalvi.gateforit.com/wpcontent/uploads/2012/12/gap-junctions.jpg (citirano 31.12.2014).
TESNI STIKI
ZGRADBA TESNIH STIKOV
Tesni stiki so multiproteinski kompleksi, sestavljeni iz integralnih in perifernih membranskih
proteinov. Sem spadajo klaudin, okludin, tricelulin, stična adhezijska molekula (JAM) in Coxsackie ter
adenovirus asociiran receptor (CAR).
KLAUDIN
Klaudini so multigenska družina sestavljena iz 27 predstavnikov pri človeku in miših. So 21-28 kDa
veliki proteini, sestavljeni iz štirih transmembranskih domen (dveh ekstracelularnih zank,
citoplazemskega N- in C-konca ter kratkega citoplazemskega obrata) (slika 4). Večina klaudinov ima
ohranjen motiv GLWxxC(8-10 aa)C v prvi ekstracelularni zanki in PDZ domensko- vezavni motiv na Ckoncu, ki se veže na PDZ domeno, ki jo vsebujejo proteini ZO-1, ZO-2 in ZO-3. Klaudini spadajo med
najbolj pomembne komponente tesnih stikov, ki so pomembne za njihovo strukturo in funkcijo.
Slika 4: Shematski prikaz klaudina (Furuse 2010).
Najbolj pomembna funkcija klaudinov je nastanek pramenov tesnih stikov, ki so strukturno in
funkcijsko jedro tesnih stikov v plazemski membrani. Če pride do prevelikega ali premalega izražanja
pramenov tesnih stikov se to lahko vidi v nepravilnem delovanju celice. V določenih primerih lahko
3
pride do tega, da tesni stiki izgubijo funkcijo pregrade v celici. Poznana je še vloga ZO-1 ali ZO-2
proteinov pri sodelovanju z klaudini. Ti so namreč potrebni za nastanek tesno stičnih pramenov.
Večina celic koekspresira različne klaudinske podtipe v kombinacijah in razmerjih, ki se razlikujejo
med različnimi vrstami celic. Poznamo različne kombinacije izraženih klaudinov, ki tvorijo različne
vrste tesno stičnih pramenov. Kombinacija klaudin-1/-3 in klaudin-2/-3 v L-celicah tvori heterotipične
tesne pramene. Ob koekspresiji klauidna-3 in -4 v HeLa celicah se ne moreta sestaviti heterotipično
med celicami, ampak se lahko le heteromerno. Iz tega lahko sklepamo, da so tesno stični prameni
običajno sestavljeni iz različnega mozaika klaudinov, ki tvorijo homotipične ali heterotipične
interakcije med celicami.
Kot praktično vsi proteini so tudi klaudini deležni posttranslacijskih modifikacij. Klaudini so
najpogosteje posttranslacijsko modificirani z palmitoilacijo in fosforilacijo. Blizu konca druge in četrte
transmembranske domene imajo vsi klaudini membranske proksimalne CxxC motive in ti motivi so
palmitoilirani. Z usmerjeno mutagenezo so dokazali, da je modifikacija klaudina-14 potrebna za
njegovo učinkovito lokalizacijo v tesnih stikih. Fosforilirani pa so Ser in Thr ostanki na C-koncih
citoplazemske regije različnih klaudinov, vključno s kaludini-3, -4, -5 in -16. S fosforilacijo reguliramo
lokalizacijo klaudinov in pregradno sposobnost tesnih stikov.
OKLUDIN
Je prvi transmembranski protein, odkrit v tesnih stikih z metodo z monoklonskimi protitelesi proti
plazmi membrane, ki je bila obogatena z adherinskimi in tesnimi stiki, izolirana iz piščančjih jeter.
Okludin je protein, velik 65 kDa, sestavljen iz štirih transmembranskih domen, dveh ekstracelularnih
zank, intercelularnega obrata, C- in N-konca (slika 5). Čeprav ima podobno strukturo klaudinu, med
njima ni nobene sekvenčne podobnosti. Prva ekstracelularna zanka ima karakteristično
aminokislinsko sestavo: 60% aminokislin, ki sestavlja to zanko je glicinskih in tirozinskih ostankov.
Njihova vloga pa še ni točno določena. Citoplazemski C-konec okludina se veže na ZO-1, ZO-2 in ZO-3,
ki spadajo med družino MAGUK proteinov, ki se nahajajo v tesnih stikih. V tej regiji je veliko serinskih
in treoninskih ostankov, ki so fosfolirilani in skoncentrirani na območju tesnih stikov.
4
Slika 5: Shematski prikaz okludina.
Tudi okludini sodelujejo pri nastanku in celični adheziji pri celičnih stikih, vendar ne v tako veliki meri
kot klaudini. Nastanejo lahko namreč kratki tesno stični prameni, ki vsebujejo okludin in so podobni
pramenom, ki nastanejo pri klaudinih.
TRICELULIN
Je protein, ki se nahaja v področju tromej med celicami. Vsebuje štiri transmembranske domene, ki
so po sekvenci podobne 130 aminokislinam, ki se nahajajo na citopazemskem C-koncu okludinov.
Preko te regije se tricelulin veže na protein ZO-1. Njegova pomembna naloga je, da prevzame
barierno funkcijo.
JAM
Celične adhezijske molekule ali JAM so predstavniki imunoglobulinske poddružine, ki se izražajo v
levkocitih, trombocitih, ter epitelijskih in endotelijskih celicah, kjer se nahajajo v celičnih kontaktih
med celicami, še posebej v tesnih stikih. Sem spadajo JAM-A, JAM-B in JAM-C, ki so homofilne in
heterofilne adhezijske molekule. Celične adhezijske molekule imajo večjo vlogo v določanju
polarizacije celic in manjšo vlogo pri vlogi pregrade med celicami. Prav tako njihova citoplazemska
domena interagira z proteinom ZO-1.
ZO-1, ZO-2 in ZO-3
Da pride do povezovanja okludina, klavidna, tricelulina in JAM proteinov v področju tesnega stika so
pomembni citoplazmesko-submembransko nameščeni proteini ogrodni oz ZO proteini. Poznamo ZO1, ZO-2 in ZO-3, ki so proteini iz družine membransko vezanih gvanilatno kinaznih homologov
(MAGUK). Vsebujejo tri PDZ domene, SH3 domeno in gvanilat kinazno domeno (GUK) (slika 6). Poleg
zgoraj naštetih pa imata ZO-1 in ZO-2 še kislinsko domeno zraven GUK domene. ZO proteini se preko
PDZ domene povezujejo z okludinom, klavdinom, tricelulinom in JAM proteini. ZO-1 in ZO-2 proteina
5
sta nujno potrebna za pravilno sestavljanje tesnih stikov, saj bi ob deleciji gena za en ali drug protein
prišlo do nepravilnostih v nastanku tesnih stikov.
Slika 6: Shematski prikaz ZO proteinov (Furuse 2010).
BOLEZNI TESNIH STIKOV
Kot pri drugih stikih so tudi pri tesnih stikih prisotne bolezni. Te ponavadi nastanejo zaradi mutacij v
genih za proteine, ki so udeleženi pri nastanku tesnih stikov. Mutacija klavdina-16 lahko privede do
dedne hipomagneziemije, medtem, ko mutacija klavdina-14 in/ali tricelulina do gluhosti. Mutacije
klavdina-1 v genu na 3. kromosomu (3q28-q29) se dedujejo avtosomno recesivno. Bolezen se izrazi z
luskavico, pojavom levkocitinih vakuol ter kroničnim jetrnim obolenjem. Prav tako tudi mnogi virusi
in bakterije zlorabijo spremembe tesnih stikov za vstop v celico.
PRESLEDKOVNI STIKI
KANALI PRESLEDKOVNIH STIKOV
Kanali presledkovnih stikov vsebujejo velike količine α- heliksov (~60%), pri čemer je posamezen
kanal sestavljen iz 2 proteinskih kompleksov: koneksonov, ki se posamezno nahajata v plazemski
membrani sosednje celice in se stikata (slika 8).
6
Slika 7: Struktura človeškega kanala presledkovnega stika (iz izooblik koneksinov Cx26). Vsaka podenota je pobarvana z
drugo barvo (Maeda S. et al, 2011).
Stik med dvema koneksonoma povzroči nastanek ozkega prehoda, ki omogoča prehajanje
anorganskim ionom in majhnim, v vodi topnim molekulam, ki imajo molekulsko maso do ~1 kDa, kot
so npr. cAMP, Ca2+ in IP3. Pri vretenčarjih so koneksoni heksameri, saj so sestavljeni iz 6 podenot:
koneksinov (Cx), ki obdajajo poro kanala (slika 9).
Slika 8: Konekson kot heksamer iz 6 koneksinov (ureditev transmembranskih heliksov in N-končnega heliksa) (Maeda S. et
al, 2011).
KONEKSINI (Cx)
Koneksini so integralni membranski proteini, ki so v človeškem proteomu prisotni v 21 izooblikah, ki
imajo različne lastnosti, npr. preference do kationov ali anionov in različne velikosti. V primeru, da se
več izooblik izraža v 1 celičnem tipu, nastanejo heteromerni koneksoni, za katere je značilno, da so
sestavljeni iz vsaj 2 različnih izooblik koneksinov, ali heterotipični kanali, ki vsebujejo različna
koneksona (slika 10). Če je konekson sestavljen iz koneksinov 1 izooblike gre za homomerni konekson
in če 2 koneksona iz enakih izooblik koneksinov interagirata, nastane homotipični kanal. Kanali
presledkovnega stika, zgrajeni iz določenih izooblik koneksinov, imajo določene lastnosti, kot so
upornost, permeabilnost in selektivnost, ter funkcije. Na permeabilnost ionov in molekul, ki prehajajo
kanal, namreč vplivajo širina pore (do ~1kDa), električno polje v njej in naboji na njeni površini.
7
Slika 9: Homomerni konekson, heteromerni konekson, homotipični kanal in heterotipični kanal (spodaj od leve proti desni)
(Abrams C. K. et al, 2012).
STRUKTURA IZOOBLIKE KONEKSINA Cx26
Izooblika koneksina Cx26 je sestavljena iz 4 transmembranskih heliksov (TM1-TM4), 2 zunajceličnih
zank (E1 in E2), N-končne regije (NT), citoplazemske zanke (CL) in C-končnega repa (CT) (slika 11).
Transmembranska heliksa TM1 in TM2 se nahajata zraven lumna pore, medtem ko sta TM3 in TM4
zraven lipidnega okolja plazemske membrane. Transmembranski heliks TM3 vsebuje nabite
aminokisline, zakopane v notranjost koneksina, kar prepreči njihov stik z lipidnim okoljem, in
omogoča intramolekularne interakcije. V vsaki zunajcelični zanki E1 in E2 so 3 ohranjeni Cys, ki tvorijo
3 intramolekularne disulfidne vezi (S-S) med E1 in E2, kar omogoča njuno povezavo in pravilno zvitje
ter posledično normalno delovanje kanala presledkovnega stika. V N-končni regiji se v pori kanala
nahaja N-končni heliks (NTH), ki prekriva transmembranska heliksa TM1 in TM2, tako da nista
izpostavljena lumnu pore.
Slika 10: Izooblika koneksina Cx26. Vsaka regija je pobarvana z drugo barvo, s puščicama sta prikazani stran pore in lipidna
stran in s paličicami so prikazane 3 S-S v zunajcelični regiji (Maeda S. et al, 2011).
OHRANJENE IN NEOHRANJENE REGIJE V DRUŽINI KONEKSINOV
Na splošno so med člani družine koneksinov sekvence aminokislin zelo ohranjene, vendar obstajajo
regije, ki niso, npr. del NTH, ki se nahaja zraven lumna pore, in del TM2 v citoplazemski regiji (slika
12). Še bolj neohranjene regije predstavljajo deli TM3 in TM4, ki so izpostavljeni lipidnemu okolju.
Člani družine koneksinov se med seboj najbolj razlikujejo po regijah v citoplazemski zanki in C-koncu.
8
Slika 11: Izooblika koneksina Cx26, pobarvana glede na ohranjenost ak ostankov med člani družine koneksinov. Bolj vijolična
barva pomeni manjšo ohranjenost (Maeda S. et al, 2011).
STRUKTURA PORE KANALA PRESLEDKOVNEGA STIKA IN INTERAKCIJE MED
KONEKSONOMA IZ KONEKSINOV Cx26
Pora kanala iz koneksinov Cx26 je sestavljena iz znotrajceličnega dela, ki oblikuje vhod v poro, dela
pore v obliki lijaka, negativno nabitega dela in zunajceličnega dela (slika 13). Šest NTH tvorijo del pore
v obliki lijaka. Ta del ima zožano dno, kjer aminokisline na površini pore zelo vplivajo na velikost
molekul, ki bodo prehajale, in na permeabilnost kanala. Negativno nabiti del se nahaja med TM1 in
E1 in predstavlja zožano regijo pore, zato aminokisline na površini tudi tega dela prispevajo k temu,
kakšne lastnosti bo imel kanal. Poleg tega pa je ta regija vključena v zaznavanje razlike v napetosti
med dvema notranjostima celice.
Slika 12: Struktura pore kanala presledkovnega stika iz Cx26 (Maeda S. et al, 2011).
Zunajcelični del preko interakcij med E1 in E2, ki povezujejo 2 koneksona, omogoča, da nastane
neprekinjen kanal, izoliran pred zunanjim okoljem. V E1 aminokislina Asn54 tvori vodikovo vez z
Leu56, ki je na nasprotnem koneksonu, Gln57 pa tvori vodikovo vez z enakim aminokislinskim
ostankom na nasprotnem koneksonu (slika 14). V E2 aminokisline Lys168, Asp179, Thr177 in Asn176
tvorijo vodikove vezi in solne mostičke z enakimi aminokislinskimi ostanki na nasprotnem koneksonu.
9
Slika 13: Interakcije med koneksonoma (Maeda S. et al, 2011).
MEHANIZEM ODPIRANJA IN ZAPIRANJA KANALOV PRESLEDKOVNEGA STIKA IZ
IZOOBLIKE KONEKSINOV Cx26
Presledkovni stiki so dinamične strukture, saj se njihovi kanali lahko kot odziv na zunajcelični signal
preko reverzibilne konformacijske spremembe odpirajo ali zapirajo. Za kanale presledkovnega stika je
značilno, da se odpirajo in zapirajo po mehanimu, odvisnemu od razlike v napetosti med
notranjostima dveh celic. Del kanala v obliki lijaka je stabiliziran preko vodikovih vezi, ki se na dnu
tega dela pojavijo med Asp2 in glavno verigo sosednjega koneksina, ter hidrofobnimi interakcijami, ki
nastanejo med Trp3 in Met34, ki je na sosednjem koneksinu, kar omogoča, da se kanal odpre (slika
15).
Slika 14: Struktura dela pore v obliki lijaka, ki je stabiliziran preko vodikovih vezi (rdeče prekinjene črte) in hidrofobnih
interakcij (oranžne prekinjene črte). Interakcije se tvorijo med sosednjimi koneksini (Maeda S. et al, 2011).
Asp2 je v pori izpostavljen in lahko zaznava spremembe v električnem polju vzdolž pore. Ko nastane
razlika v napetosti med sosednjima celicama, pozitivno električno polje povzroči, da se Asp2 prestavi
in s tem prekine hidrofobne interakcije med Trp3 in Met34, posledično se NTH sprosti s TM1 in nato
nastane interakcija med dvema NTH, kar povzroči, da se kanal zapre (slika 16).
10
Slika 15: Mehanizem odpiranja in zapiranja kanalov presledkovnega stika iz Cx26, odvisnega od razlike v napetosti med
citoplazmama 2 celic. V primeru, ko ni razlike v napetosti med citoplazmama 2 celic, je kanal odprt (A) in v primeru, ko je, je
kanal zaprt (B) (Maeda S. et al, 2011).
POMEN PRESLEDKOVNIH STIKOV
Presledkovni stiki se nahajajo v zelo različnih tkivih, zato imajo pomembne vloge v različnih bioloških
procesih. Omogočajo direktno komunikacijo med sosednjimi celicami in regulirajo prehod ionov in
molekul, zaradi česar so zelo pomembni pri razvoju, diferenciaciji celic, aktivnosti nevronov in
imunskemu odzivu.
Presledkovni stiki v razvijajočih možganih omogočajo regulacijo proliferacije nevronov, in med
mišičnimi celicami srca omogočajo, da se električni valovi razširijo po tkivu, pri čemer sprožijo
kontrakcijo celic in posledično srčni utrip. Poleg tega so presledkovni stiki v očesni leči pomembni za
razvoj, zorenje in ohranjanje celic očesne leče, saj so le-te brez jedra in organelov, s čimer omogočijo
prozornost tkiva, in morajo biti zato preko presledkovnih stikov povezane z okolišlimi epitelijskimi
celicami. Pomembni pa so tudi v mrežnici med nevroni, kjer dopamin kot odziv na povečano
intenziteto svetlobe, povzroči zmanjšanje njihove permeabilnosti, kar omogoči, da mrežnica zamenja
uporabo paličic s čepki.
BOLEZNI, POVEZANE S PRESLEDKOVNIMI STIKI
Mutacije v vsaj 10 genih za koneksine so povezane z večimi različnimi dednimi boleznimi, npr.
gluhostjo, boleznimi kože, perifernimi in centralnimi nevropatijami, nevrodegenerativnimi boleznimi,
abnormalnostmi telesnega razvoja, kataraktami in kardiovaskularnimi boleznimi. Med temi
mutacijami so mutacije v genih za 3 izooblike koneksinov povezane z boleznimi centralnega živčnega
sistema, npr. z obliko bolezni Charot-Marie-Tooth (CMT1X), dedno spastično paraperezo in
Hallermann-Streiffovim sindromom (HSS). Poleg tega je s presledkovnimi stiki povezan tudi razvoj
raka.
11
ZAKLJUČEK
Ob pravilnem delovanju klavdina, okludina, tricelulina, JAM in ZO proteinov imajo tesni stiki funkcijo
pregrade in povezovanja celice ter preprečujejo prehod medcelične tekočine. Čeprav je malo znano o
samem mehanizmu vezave proteinov tesnega stika pride med seboj ob kakršni koli mutaciji do
sprememb v stabilnosti tesnih stikov. Za točno razumevanje mutacij ter prehodnosti tesnih stikov bi
bile potrebne še nadaljnje študije.
Presledkovne stike najdemo v številnih različnih tkivih v človeškem telesu in so povezani s številnimi
boleznimi, kar kaže na to, da je komunikacija preko presledkovnih stikov nujna za različne fiziološke
procese. So dinamične in kompleksno zgajene membranske strukture, zato bodo za boljše
razumevanje njihove funkcije potrebne dodatne strukturne študije.
VIRI
Furuse, M. Molecular Basis of the Core Structure of Tight Junctions. Cold Spring Harb Perspect BIol,
2010, 2:a002907, 1-14.
Suzuki, H., Tani, K., Tamura, A., Tsukita, S., Fujiyoshi, Y. Model for the Architecture of Claudin-Based
Paracellular Ion Channels through Tight Junctions. J. Mol. Biol, 2014, in press.
Steed, E., Balda, M.S., Matter, K. Dynamics and functions of tight junctions. Trends in Cell Biology,
2009, 20, 3, 142-149.
Maeda, S. in Tsukihara T. Structure of the gap junction channel and its implications for its biological
functions. Cell. Mol. Life Sci, 2011, 68, 1115-1129.
Zoidl, G. in Dermietzel, R. Gap junctions in inherited human disease. Eur. J. Physiol, 2010, 460, 451466.
Abrams, C. K. in Scherer, S.S. Gap junctions in inherited human disorders of the central nervous
system. Biochimica et Biophysica Acta, 2012, 1818, 2030-2047.
Alberts, B. et al. Essential Cell Biology. New York in London: Garland Science, 2010.
12