Download Report

Nr. 158 - okt. 2013
BIONYT VERDEN
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
1
VIDENSKABENS
Fremtidens
diagnosemiddel
Spyt
DNA-sekvens af 700.000 år gammel hest
4 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
Af Ole Terney
Supplerende
tekst og video:
www.bionyt.dk/spyt
Nye ultrafølsomme metoder kan
afsløre alvorlige
sygdomme i en
simpel spytprøve
T
ænk, hvis man kunne undgå
blodprøver og blot behøvede spyt
til testning for sygdom og helbredstilstand. Spyt er let at indsamle, lagre
og transportere; mere sikkert for hospitalspersonale at håndtere end blod
(ingen risiko for stik-skader, og der
er mindre virus-koncentration i spyt
end i blod); uden risiko for overførsel af infektion på grund af genbrug
af usteriliserede nåle (et problem i
u-lande); mindre problemer med
bortskaﬀelse af aﬀald (endnu et problem i u-lande uden autoklavering);
kan indsamles af personen selv eller
af utrænede personer (en økonomisk
fordel); spytprøvetagning er stress-fri;
spyt kan let indsamles i vanskelige situationer og fra børn, ældre, folk med
nåleskræk, folk med sammenklappede vener, overvægtige personer og
patienter, der af religiøse grunde ikke
må give blod.
Spyttest ville kunne gentages igen og
igen. Hele befolkningsgrupper ville
kunne afgive spytprøver til test for en
sygdoms samlede forekomst i befolkningen med henblik på større initiativer på sundhedsområdet (ref.10708).
Man ville nå ﬂere mennesker, og
sygdomme ville kunne opdages tidligere (jo tidligere en sygdom opdages,
jo større er chancen for succesfuld
behandling). Altså ville samfundet
kunne spare penge til omfattende behandlinger, og patienter ville kunne
undgå bivirkninger og senskader på
grund af for sen diagnose.
Tandlægen
Skal tandlægerne inddrages
i spytdiagnostik?
Folk kommer hyppigere til tandlægen
end til deres læge, og spyt ville kunne
indsamles under et almindeligt tandeftersyn. Men der er ingen tradition
for, at tandlægen direkte inddrages i
screening for sygdomme.
På Tandlægeforeningens årskursus
i Bella Centeret 2013 blev det diskuteret, om tandlægerne skal inddrages
i spytdiagnostik (ref.10700). Ikke overraskende var der nogen uenighed. Hvis
debatten havde foregået blandt læger,
ville der nok have været enighed om,
at spytdiagnostik skal forbeholdes
lægerne. Men inddragelse af tandlæger
kan foregå på mange niveauer.
Det ville være nemt at inkludere
udtagning af en spytprøve som en
rutinesag ved kontrol af tænderne.
Som det er nu, er det imidlertid op
til patienterne selv at gå videre med
tandlægens iagttagelser. Der er nok
ingen, der forestiller sig, at tandlægen
skal stille en diagnose. En fremtidig
model, hvor tandlægen videregiver
sine observationer og eventuelle indledende målinger til patienten og pa-
tientens læge, er nok mere sandsynlig
at få gennemført.
Der foregår forskning om
påvisning af sygdomme i
spyt ved de odontologiske
universitetsafdelinger
Selv om der ikke er tradition for, at
tandlægen stiller medicinske diagnoser, så forskes der ved nogle universiteters odontologiske afdelinger i spyttest til diagnoser.
Björn Klinge fra det odontologiske
fakultet ved Malmö Högskola forsker i
spyttest til sygdomme, der involverer
inﬂammation (ref.10725). I et studie blev
500 personer i Skåne bedt om at udfylde et spørgeskema om sygdom og
afgive en spytprøve. Dette studie viste,
at man kunne påvise inﬂammationsfaktorer i patienter med diabetes,
hjerte-kar-sygdomme og visse kræfttyper (ref.10706).
I Californien har UCLA School of
Dentistry i Los Angeles fået 5 millioner dollar til at forske i sammenhænge mellem sygdomme og spyttets
indhold af RNA uden for cellerne,
(extracellulært RNA) (ref.10707).
RNA udskilles i mellemrummene
mellem celler, hvorved det fungerer
som et signal uden for spytkirtlerne
(exokrint signal). Dette signalsystem
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
5
Biologiske prøver kan tages fra blod og andre kropsvæsker, men
allerlettest fra spyt. Nye teknologier muliggør de vanskeligere spytanalyser til diagnose-formål. - Det kan blive starten på en ny spytindustri med store fordele for patienterne.
ﬁndes i bl.a. maven og hjertet, men
også i ﬁngre og tæer samt altså i munden (ref.10707).
Den førende spyttest-forsker er David T. Wong. Han var den første, der
(i 2004) påviste det extracellulære
RNA i spyt (ref.10707). Han er redaktør
på bogen Salivary Diagnostics, som
blev udgivet i 2008 (ref.10724, bogen ﬁndes:
UB2/KUB-NS-Nord)
.
Spyttest i stedet for blodprøve?
Standardproceduren til at teste kroppens sundhedstilstand har længe været
at bruge blodprøver. Det har i mange
år været overset, at mundhulen og
spyttet også afspejler kroppens sundhedstilstand, men de seneste 10 år er
der kommet meget mere fokus på
spyt(ref.10699)(ref.10700).
Spyttest
- en ny industri
Langsom udvikling
des at indeholde biomarkører fra alle
organerne.
Spyttet afspejler i højere grad end
blodet kroppens umiddelbare tilstand
(men denne døgnvariation i spyttets
biokemi er en svær ting at håndtere;
og der er stor individuel variation og
desuden varierer spytdannelsen med
stimuleringen). Eftersom sammensætningen af biomolekyler i spyttet
varierer i løbet af døgnet, er sammensætningen af biomolekyler i spyttet på
et givent tidspunkt ikke en afspejling
af den tilsvarende sammensætning i
blodet, fordi der i blodet ikke er de
samme døgnvariationer. Døgnvariationen i spyt kan derfor vanskeliggøre
tolkningen af resultaterne. (Desuden
Spyt-diagnosticering vil
i fremtiden
kunne få stor
betydning,
fordi spyttest
er nemme at
tage, og fordi
der er udviklet
ultrafølsomme
metoder, der
ikke kræver
specialuddannet
personale eller
avanceret temperaturstyring
Spyttest vil utvivlsomt blive en
helt ny industri, men hvorfor
går det så langsomt? En del af
forklaringen på den langsomme
udvikling af spytbaseret diagnosticering er, at der har manglet
følsomme målemetoder. Men
der har også manglet viden om
spyttets biologi - bl.a. viden om
transporten af biomolekyler fra
blodet til spyttet (ref.10699).
Det er vanskeligt at ﬁnde pålidelige sammenhænge mellem
biomolekylerne i blodet og i spyttet.
Der er stor viden om sammenhængen
mellem blodets indhold af biomolekyler og forskellige sygdomme, - men
hvis man ikke kan relatere spyttets
indhold af biomolekyler til et tilsvarende mønster i blodet, vil denne
viden om sammenhængene mellem
biomolekyler i blod og bestemte
sygdomme ikke kunne udnyttes ved
spyttest.
Blodet har den diagnostiske fordel, at det gennemløber alle organer
i kroppen. Blodet må derfor formo-
mangler man undertiden forklaringer: Et studie har f.eks. kuriøst påvist,
at amylase-dannelse i spytkirtlerne
kan være en markør for søvnmangel
(ref.10724 s.98)
).
En anden ulempe ved spytdiagnoser er, at spyttets sammensætning kan
være påvirket af måden, som spytprøven tages på. En stimulering
af spytafgivelsen under prøvetagningen kan både være en
fordel og en ulempe (ref.10699).
Det forventes derfor, at det
bliver nødvendigt at måle
ﬂere parametre i spyt for at
kunne opnå en pålidelig diagnose, end det i dag kræves for
blodanalyser (ref.10699).
Standardisering af
spyt-opsamling
For at ﬁnde sammenhænge
mellem spyttets indhold af
biomolekyler med det tilsvarende indhold af biomolekyler i blod er det nødvendigt
at bruge mere standardiserede
metoder til opsamling af spyt
(ref.10699)(ref.10701)
. Det har ført til
Fortsættes på side 7
Salivette-kit. Personen skal tygge i 45 sek. - 1 minut med bomulds-rullen i tandkødsranden.
Oracol-kit gnubbes mod gummerne 1 minut
6 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
Spyttets kulturhistorie
Ivan Pavlov blev kendt for et forsøg, ber et barn spytter han tre gange
hvor hunde begyndte at savle, når på jorden for at repræsentere den
de hørte en klokke, som angav, at hellige treenighed og afvise djævede snart ville få mad. Spytproduk- len. Under græske bryllupper spyttion er tæt forbundet med tanken ter gæsterne på bruden for at ønske
om mad. Ikke desto mindre har held og lykke. Det er også alminforskellige folkeslag yderst forskellig deligt, at grækere spytter på tøj og
holdning til spyt, fra meget negativ hinanden under hilsen for at undgå
til meget positiv.
det onde øje.
Opdagelsen af, at spyt og nys kan
I Somali anvendes spyt som et
bære smitte var med til at give spyt primitivt helsemiddel mod åbne
negative associationer. Midt i 1800- bylder. Mod smertefulde slangebid
tallet, før disse opdagelser, var spyt- bruger somalierne i Afrika en blanning almindelig, f.eks. hos folk, der ding af smør og spyt. Hos Azandetyggede skråtobak. Da den tyske folket i Sudan og Masai-folket i
læge Robert Koch opdagede, at spyt Østafrika bruges spyt som førstekunne indeholde tuberkulosebakte- hjælp mod mindre sår, evt. blandet
med urter. Hos Bena-folket i Tanrier, ﬁk spyt en negativ klang.
Selv om vi danner ca. 1½ liter spyt zania bruges spyt til at behandle
om dagen, er spytning kun socialt forbrændinger og Masia-stammen
tilladt for sportsstjerner inden for bruger spyt mod insektbid og opf.eks. baseball, for at signalere ma- svulmning.
skulinitet, og i andre sportsgrene
Wolof-stammen i Afrika tror spyt
spyttes for at bede om held (spytte i medbringer en spirituel velsignelse
hænderne, f.eks.). At spytte på no- fra spyttets ophavsmand, og en nygen er en yderst hånlig handling.
født smøres ind i spyt fra de, der vil
I Peru, Bolivia, Venezuela og barnet det godt. Hos Ashanti-folket
lande langs Andes-bjergkæden
fremstilles stadig alkoholiske
"chicha"-drikke
af maniok-rod,
majs og frugter
ved at bruge spyt
som den fordøjende og fermenterende
kilde.
(Ordet stammer
fra spansk - for
spyt eller at spytte).
Grækerne spytter for at forhindre ulykker, selv
under ceremonier i den græskkatolske kirke.
Når præsten døSpytteskål fra ca. 1740
i Ghana skal bedstefaderen direkte
spytte ind i den nyfødtes mund for
at barnet kan blive spirituelt oplyst.
Siden for 4000 år siden er "betelnød" (en blanding af areca-nød,
betel-blade og lime) blevet tygget
i Thailand, Indien, Phillipinerne,
Taiwan og Indonesien. Planten frigiver alkaloider, som let absorberes
igennem mundslimhinden og medfører ekstrem stor produktion af
rødbrunt spyt. Den medfølgende
spytten opfattes som en del af det
at have en god personlig hygiejne.
Efter udbruddet af SARS-epidemien i 2003 i Kina, Hong Kong og
Taiwan er der blevet indført bøder
for at forhindre oﬀentlig spytten.
I Singapore kan bøden være op til
25.000 kr.
Spyt indgår naturligt i et kys mellem kærester, hvorimod folk er ret
så tilbageholdende med at udveksle
spyt med fremmede. Nogle hundeejere er villige til at acceptere et slik
fra deres hund, men ofte ikke fra en
hund, der ikke er deres egen.
Det er ofte tabu at dele en ske,
tandbørste eller sugerør, fordi det
har rørt ved den anden persons
spyt.
Der kan være psykologiske faktorer
som gør, at folk
har svært ved at
acceptere, at spyt
indeholder diagnostisk information
om den persons
krop, som spyttet
kom fra. Der synes
således at være en
psykologisk skelnen mellem spyt,
der stadig er i en
persons
mund,
og spyt, som ikke
mere er i personen
- som om spyttet
dermed er blevet
fremmed og ikkeselv(ref.10724 s.104-109).
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
7
Der sker i øjeblikket en rivende udvikling af
spytdiagnosticering til brug i ulandene,
dvs. med simple opsamlingsmetoder (ref.10705).
Fortsat fra side 5
udvikling af kommercielle spytopsamlings-kit. De mest udbredte udstyr til
spytopsamling er (ref.10699) (ref.10701):
OraSure www.orasure.com (hvor man med
en nylonpind med specialbehandlet
bomuldsvat på enden påviser spyttets
eventuelle IgG-antistoﬀer mod HIVog hepatitis-virus (smittepåvisning)).
Omni-SAL (hvor et stykke vat placeres under tungen til opsamling af
IgG-antistof. Når en tilstrækkelig
mængde spyt er absorberet i vattet
skifter en indikator farve).
Salivette (hvor patienten skal tygge i
et minut med en vatrulle af bomuld,
placeret ved tandkødsranden) (ref.10734 s.9).
Oracol (hvor en pind med et stykke
absorberende skumstof på enden er
beregnet til at kunne optage 1 ml væske, når der gnides 30 gange på hver
af gummerne, som med en tandbørste, i 1 minut). Oracol anvendes i bl.a.
England til påvisning af antistoﬀer
mod mæslinger, HIV, hepatitis A og
B, fåresyge og røde hunde (ref.10735 s.8).
Både kortvarig spytopsamling på under
1 minut, og langvarig på over 15 minutter, giver upræcise tal for spytproduktion
(ref.10724 s.38). Interessant nok afgiver venstre
øre-spytkirtel mere spyt end den højre.
Dette udligner sig efter 10 min. (ref.10724
s.38)
. Til brug for diagnose anbefales
spytopsamling i 10 minutter(ref.10724 s.38).
(Ofte bruges dog 5 minutter til test for
caries-risiko, men 15 minutter hvis man
skal vurdere, hvor patientens manglende
spytdannelse ligger i forhold til økonomisk tilskud til tandbehandlinger, fordi
nedsat spytdannelse giver større risiko
for tandsygdomme).
Personen bør ikke spise eller drikke
i 1½ time før prøvetagningen. Patienten skal starte med at synke alt sit
spyt, og må derefter ikke synke under
spytopsamlingen, men savle ned i en
kop, hvis vægt er kendt på forhånd.
Personen skal under opsamlingen forholde sig så roligt som muligt og må
ikke bevæge mund eller tunge (ved
ustimuleret spytopsamling; samme
procedure bruges ved stimuleret spytopsamling, men her tygger personen
på f.eks. en smagløs paraﬃnklump).
Når tiden er gået, afsluttes der med,
at patienten spytter i koppen. Den
enkelte patient bør altid opsamle spyt spyt og fuldspyt (helspyt). Opsamling
på samme tidspunkt af døgnet, for at af kirtelspeciﬁkt spyt - altså opsamnedsætte virkningen af døgnvariation. ling fra de enkelte kirtler - kan være
Spytdannelsen er højere om vinteren vanskelig og anvendes mest til underend om sommeren, og spytdannelsen søgelse af kirtelspeciﬁkke sygdomme.
er nedsat ved højere omgivelsestem- Oftest anvendes fuldspyt, der er en
blanding af spyt fra hele mundhulen,
peratur (ref.10724 s.38).
Under spytopsamling skal personen og altså fra forskellige spytkirtler.
Biomolekylerne i spyttet er i høj grad
sidde komfortabelt, have åbne øjne,
let fremoverbøjet hoved og have hvi- dannet af spytkirtlerne selv. Men biolet i 5 minutter (ref.10724 s.39).
molekylerne kan også være kommet
Opsamling i 10 min. bør give 3- fra blodet(ref.10699). Omkring 27% af
7 ml spyt (ref.10751). Da bakterierne i proteinerne i blodet ﬁndes også i spyt
(ref.10734 s.10)
spyttet hurtigt
.
kan nedbryde
Afhængig af støreventuelle biorelsen og ladningen
af biomolekylerne
markører, skal
kan denne transprøven straks
nedkøles på is
port ske ved passiv diﬀusion (det
(evt. ﬂydende
gælder f.eks. for
nitrogen) for at
elektrisk-neutrale
nedsætte den
steroider), og ved
enzymatiske aksåkaldt ultraﬁltretivitet, og bakterierne i spyttet
ring (ved indsivskal fjernes ved
ning via spalterne
ﬁltrering eller
mellem cellerne)
1. Øre-spytkirtlen
centrifugering
eller aktiv transport,
(ref.10724 s.71)
2. Underkæbe-spytkirtlen
f.eks. via receptor. Lag3. Undertunge-spytkirtlen.
binding, idet proring bør ske ved
under
-20○C
teinerne fra blodet
(ref.10724s.73)
kan komme over i
. Optøning bør ske hurtigt ved at komme spyttet ved at være bundet til et reprøven i varmt vand i kort tid, fordi ceptor-protein (såkaldt ligand-binlangsom optøning ødelægger sårbare ding). Bindingen medfører ændring
biomarkør-proteinmolekyler mere og af receptor-molekylets rumlige form,
medfører udfældning af mucinpro- hvorved proteinet kan transporteres
aktivt over membranen (ref.10699).
tein-komplekser (ref.10724 s.72).
Spyt er et blandingsprodukt
For at kunne bruge spyt til diagnose
vil det være en fordel, at man kan
besvare spørgsmål såsom: Hvad danner kirtelcellerne selv? Hvad kommer
udefra? Hvordan transporteres stofferne over i spyttet? (Da forskellige
stoﬀer ofte transporteres på forskellig
måde, har transportmåden betydning
for stoﬀernes koncentration i spyttet).
Øget spytdannelse fortynder stofkoncentrationerne, men hæver også pH
(så spyttet bliver mindre surt, hvorved
nogle stoﬀer diﬀunderer tilbage over
cellemembranerne og ud af spyttet).
Man skelner mellem kirtelspeciﬁkt
Spytproduktion og
afsondring af spyt
Sunde, raske personer afgiver fra 0,5
liter til 1,5 liter spyt pr. dag med en
hastighed på 0,5 ml/min (ref.10699).
Mængden af spyt afhænger af fysiologiske og patologiske tilstande samt af
lugt- og smagsindtryk (ref.10699). Nedsat
spytproduktion kan være tegn på sygdom.
Spytkirtlerne
Hos mennesket ﬁndes ca. 600 mindre
spytkirtler, der er spredt rundt i munden under slimhinden, og tilsammen
producerer ca. 10% af spyttet, samt
8 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
tre par store spytkirtler, der producerer ca. 90% af spyttet:
 Øre-spytkirtlen (glandula parotis (gl. parotidea)
parotis-kirten, under huden over ramus mandibula)
.
 Underkæbe-spytkirtlen (glandula subman-
dibularis, den submandibulære, ved basis mandibula)
.
 Undertunge-spytkirtlen (glandula sublin-
gualis, den sublinguale kirtel, under tungen)
.
(Dertil kommer små bidrag fra
bl.a. tandkødet, madrester mellem
tænderne, bakterier i eventuelle huller i tænderne, udsivende væske ved
inﬂammation i tandkødet) (ref.10734 s.4).
Fra kirtlerne udsondres en blanding
af elektrolytter, proteiner, genetisk
materiale, polysaccharider og mange
andre molekyler. De ﬂeste af disse
stoﬀer kommer ind i spytkirtelsystemet fra de omgivende blodkar-kapillærer, men der dannes også stoﬀer i
selve spytkirtlerne.
Det primære spyt dannes i de såkaldt sekretoriske endestykker, der består af acinære celler.
Spyt indeholder proteiner, som
spytcellerne har dannet (bl.a. mucin,
statherin og prolin-rige proteiner).
Desuden indeholder spyt immunoglobulin-A (IgA), der dannes af immunceller. IgA er en dimer, altså bestående af to enheder, og disse holdes
sammen som et dimerkompleks ved
hjælp af et protein (kaldet J-kæden).
Spytkirtelcellerne har receptorer, som
binder dette IgA-kompleks, indtager
det ved endocytose, og transporterer
det tværs over cellen indpakket i en
vesikel, og til sidst sendes dette immunoglobulin-A ud i spytkanalen (sammen med en del af receptoren, kaldet
den sekretoriske komponent) (ref.10734 s.6).
Ud over dette IgA er der i spyt også
små mængder af antistoftyperne IgG
og IgM.
Der er sket en kolossal udvikling i
følsomme målemetoder, hvormed
man faktisk nu kan måle helt ned til
enkeltmolekyler. Ofte forekommer de
interessante biologiske stoﬀer i meget
små mængder i spyt, så interessen for
at måle på spyt er først rigtig blevet
stimuleret nu, hvor disse teknikker er
opfundet.
e i spytkanalen
Sener
Biomolekyler, som �ndes i spyt,
og deres funktion i mundhulen
Spyttet skal beskytte den øverste del
af slimhinden i spiserøret, hvilket er
vigtigt for, at maden lader sig synke,
og for taleevnen (ref.10699). Munden er
fuld af bakterier, måske 500 forskellige arter, og spyt indeholder ca. 10
mill. bakterier pr. milliliter(ref.10724
s.71)
. En forudsætning for at kunne
opretholde en god mundhygiejne er
at have en tilstrækkelig spytproduktion, da spyttet indeholder mange
beskyttende stoﬀer.
Mundhulen oversvømmes hele tiden med spyt, som fjerner madrester
og mikroorganismer, og spyt indeholder direkte bakterie-inaktiverende
stoﬀer, bl.a. lysozym mod Gram-posi-
tive bakterier. Et andet spytprotein er
histatin, som modvirker bakterierne
ved at neutralisere giftige lipopolysaccharider, som Gram-negative bakterier har i deres cellemembran. Desuden
hæmmer histatin bakterieenzymer,
som skader tænderne (ref.10724 s.160).
Lactoferrin er et jernbindende glycoprotein, som produceres af spytkirtlerne, og som hæmmer bakteriers
vækst ved at gøre det sværere for bakterierne at få det jern, som de behøver
til deres enzymer (ref.10724 s.160).
Spytmangel medfører galopperende-hurtig karies (huller i tænderne).
De såkaldte muciner i spyttet binder
sig til bakterier og forhindrer, at bakterierne klæber til tand-emaljen. Spyt
indeholder i øvrigt calcium og phos-
Blodkar
Reabsorption
phat, som er hoved-byggesten for
tandemaljens calcium-hydroxyapatit
(ref.10724 s.32)
. Hvis spyt kun var vand,
ville vores tænder være opløst og væk i
20-årsalderen, har Frank Oppenheim
fra Boston Universitets oral-biologiske afdeling sagt (ref.10724 s.109).
Desuden indeholder spyt bikarbonat og andre ioner med buﬀer-evne,
som neutraliserer syrer (bl.a. den
9
Spytkanal
In
ds
ku Spytrør
ds
sty
kk
e
Spytrørcelle
Spytdannelsen stimuleres
Spytbåde af det
dannelse
sympatiske nervesignalsystem
[transmitter-stof:
noradrenalin]
og af det parasympatiske nervesignalsystem
[transmitter-stof:
acetylcholin].
En stimulus
fører til, at
cellens endoplasmatiske
reticulum friSpytgiver frit Ca++.
dannelse
Den pludselige frigivelse
af calcium medfører, at porte for kalium-ioner (K+) åbnes, så kalium-ionerne farer ud af cellen (cellen har indre
overskud af K+ på grund af natrium/kalium-pumpens
ATP-energikrævende pumpeaktivitet).
Cellens tab af de positive kalium-ioner (K+) ud af cellens "bagdør" medfører et tilsvarende tab af de negative
chlor-ioner (Cl-) ind til spytkanalen (lumen). Derved
opstår en elektrisk-negativ ubalance i spytkanalen, som
medfører, at (de positive) natrium-ioner (Na+) siver ud
i spytkanal-lumen - via mellemrummene mellem cellerne [paracellulært]). Da der nu er mange natrium-ioner og
chlor-ioner i spytkanalen er der dermed blevet skabt et
osmotisk overtryk her, som får vand (H2O) til at diﬀundere ud i spytkanalen - dels ud af cellerne[transcellulært] og
dels via mellemrum mellem cellerne. Derved er der dannet primær spyt (med visse ligheder til blodvæske). [Senere i spytkanalens forgrenede gange reabsorberes 98%
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
Udførselsrør
Spytkanal
Spytdannelse
Acinære
celler
(Sekretoriske spytkirtel-endeceller)
af natrium-ionerne og 76% af chlor-ionerne, dog kun
henholdsvis ca. 69% og 60% under tygge-stimulering)].
Den sekretoriske spytkirtel-endecelle vender i øvrigt
tilbage til udgangspunktet ved at igangsætte transportsystemer, som reetablerer de oprindelige ion-gradienter
fra før cellen blev stimuleret til at lave spyt.
De reetablerende transportsystemer er:
Den ATP-krævende pumpe:
1: Den energikrævende, ATP-drevne 3Na+/2K+-pumpe.
De ikke-ATP-krævende svingdørs-transportsystemer:
2: Co-transporteren Na+/K+/2Cl- .
3: (Na+)ind i cellen/(H+)ud i spytkanal-lumen.
4: (Cl-)ind i cellen/(HCO3-)ud i lumen (dette Cl-/HCO3- system
kræver carbon-anhydrase-enzymets omdannelse af CO2
og H2O til HCO3- og H+).
mælkesyre, der dannes af mundbakterier), og spyt beskytter derved tandemaljen mod demineralisering.
Ustimuleret spyt har et pH på ca.
6,8. Spyt fremkaldt ved stimulering
har et let basisk pH-tal på ca. 7,4 (fordi bikarbonat-koncentrationen øges
ved stimuleringen) (ref.10724 s.32). Hvis
spyttets pH f.eks. er 6,2 (surt) har
personen risiko for at få huller i tæn-
derne. I dette tilfælde vil tyggegummi
være fordelagtigt, fordi spytstimuleringen altså øger pH-tallet.
Når et stof transporteres fra det forholdsvis pH-neutrale blod til det ofte
mere sure spyt, vil der ske en ionisering af stoﬀet i spyttilstanden, og da
disse ladede stoﬀer har sværere ved at
transporteres over cellemembraner,
kan de ikke komme tilbage igen. De
10 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
ophobes derfor i spyttet. Ved øget
sekretionshastighed får spyttet dog
som nævnt højere pH (dvs. det bliver
mindre surt). Koncentrationen af stofferne bliver også mindre, når der er
høj sekretionshastighed.
Spytmangel
Nogle mennesker føler, at de har
mundtørhed, selv om deres spytdannelse er normal. Omvendt har nogle
mennesker objektiv-målbart nedsat spytdannelse uden, at de oplever
mundtørhed(ref.10724 s.30). Spytmanglen
kan dog medføre revner i tungen.
Spytmangel er oftest en bivirkning
af medicin (beta-blokkere, beroligende midler og antipsykotisk medicin),
som har den bivirkning, at de nedsætter nervesignalerne til spytkirtlerne
(ref.10724 s.30)
.
Sjögrens syndrom
En meget mindre gruppe patienter
med spytmangel er mennesker med
autoimmun reaktion mod spytkirtlerne. Det kaldes Sjögren's syndrom og
ﬁndes hos 0,6% af befolkningen, og
er 9 gange hyppigere hos kvinder end
hos mænd. Det skønnes, at 2-4 millioner mennesker i USA har Sjögren's
syndrom, der giver mundtørhed i en
grad, så tør mad ikke kan spises og tale
i længere tid bliver vanskelig (ref.10724
s.189-197)
. Lindring kan opnås ved øget
luftfugtighed under søvn, nedsat forbrug af alkohol, kaﬀe og krydderier,
samt hyppig mundskylning.
Radioaktiv terapi mod hoved- og
halsregionen (som behandling af
kræftsygdom) kan medføre nedsat
spytdannelse, i hvert fald ved de behandlingsprocedurer, der anvendtes
tidligere.
Omkring 6-10% af en hel befolkning lider af mundtørhed, men for
aldersgruppen over 50 år er andelen
25%, og for aldersgruppen over 80 år
har 40% mundtørhed, men det skyldes som nævnt bivirkninger af medicin (ref.10724 s.31).
Årsagen er, at disse lægemidler ikke
er helt speciﬁkke, så midler mod f.eks.
højt blodtryk vil bl.a. også virke på
spytkirtlernes nervecelle-receptorer.
Som tommelﬁngerregel gælder, at
hvis der indtages mere end 4 lægemidler dagligt, vil mundtørhed være
en sandsynlig bivirkning (ref.10724 s.30).
Over 1000 lægemidler har mundtørhed som en mulig bivirkning (ref.10724
s.64)
. Det gælder f.eks. alle lægemidler,
som binder acetylcholin.
Diagnoser
Ni grupper af proteiner udgør omkring 98% af proteinerne i spyttet.
Resten (omkring 2%) består af over
1200 forskellige proteiner (ref.10699).
Man har i spyt påvist biomarkører
for bl.a. inﬂammationssygdom (Creaktiv protein, CRP), hjerte-kar-sygdomme (hjerte-troponin), brystkræftmarkører (HER2-proteinet mv.), oral
cancer (interleukiner, tumor-nekrosefaktor-alfa og andre immunproteiner)
(ref.10701)
.
Foruden Sjögrens syndrom (autoimmun kirtelgigt) er også andre
sygdomme associeret med unormal
spytfunktion: Bl.a. Prader-Willi syndrom (fejl på kromosom-15) samt
stressrelaterede sygdomme (ref.10699).
HIV-smitte
Den amerikanske sundhedsstyrelse
FDA har godkendt spyttest til påvisning af HIV. I en rapport fra EU
omtales, at spyttest for HIV har høj
sensitivitet (96,2% - 100% i forskellige studier) og endnu højere speciﬁcitet (99,6% - 100%) (ref.10735 s.4).
I testen påvises HIV-speciﬁkt IgGantistof i spyttet.
Infektionen skyldes HIV-virus (human-immundefekt-virus), som angriber de såkaldte CD4-celler, som har
en central rolle i immunforsvaret.
HIV-infektion vil uden behandling
udvikle sig til AIDS (som kendetegnes ved en række følgesygdomme,
som skyldes nedbrud af immunforsvaret).
I de første 3 måneder efter HIVsmitte er viruskoncentrationen i
kroppen (og dermed smittefaren)
størst. I de første 1-4 uger kan HIV-
antistof ikke måles i blodet, men det
vil være muligt at måle HIV-antigen
(dvs. HIV-virusprotein) i en blodprøve. Ved hjælp af en PCR-test
kan man også påvise RNA (og kopiDNA) fra HIV. Derfor kan man nu
teste personer, når de henvender sig,
og de skal ikke mere vente i f.eks. 3
måneder. Et sikkert negativt svar kan
gives efter 4 uger (ref.10734 s.10).
Det er lettere at få folk til at acceptere en spyttest for HIV end en
blodtest. Brugen af spyttest for HIV
muliggør hjemmetest (hvilket dog
kan være etisk problematisk).
87% af antistoﬀerne i spyt er af
typen IgA (ref.10734 s.10). Niveauet af
HIV-speciﬁk IgA i spyt falder i takt
med, at den smittede person udvikler symptomer, og IgA-tallet i spyt
kan derfor bruges til at følge personens sygdom (ref.10734 kilde 11). IgA fra
spyt kan også påvise HIV-infektion i
spædbørn (ref.10734 s.11).
Desuden kan HIV-test fra helspyt
bruges til at overvåge antistof-responset hos HIV-smittede personer
ved at måle på tilstedeværelse af IgGantistof, der er HIV-speciﬁkt (påvist
med ELISA-test og efterfølgende bekræftet med Western-blot test).
Kræft-påvisning i spyt
Kræft skal helst påvises tidligt. Man
vil typisk påvise kræft ved en biopsi
(udtagning af en vævsprøve), men
denne metode kan ikke bruges til
screening af en befolkning. En spyttest ville derimod være velegnet.
Bugspytkirtel-kræft
Pankreas-kræft (dvs. bugspytkirtelkræft) blev i 2010 påvist med 90%
(høj) følsomhed og 95% (høj) speciﬁcitet ved at screene spyt for ﬁre
mRNA-biomarkører, der er speciﬁkke for denne kræftform (ref.10701).
Brystkræft
Kvinder med brystkræft har forhøjet niveau af en brystkræft-markør HER2/neu i både spyt og blod
(ref.10701)
. Desuden er brystkræft-markøren CA15-3 forøget, og tumor-re-
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
Glandula parotidea accessoria
Øre-spytkirtlen
Øre-spytkirtlens
udførselsgang
Oral cancer har en dårlig prognose, idet 5060% dør inden 5 år.
Ved cancer er dannelsen af proteinet p53
ofte nedsat. p53 er et
tumor-hæmmende protein, som syntetiseres
af celler, der udsættes
for DNA-skadelig stress
(f.eks. stress på grund
af solpåvirkning). Hvis
mutationerne inaktiverer
p53-produktionen, øges
risikoen for kræft. Dannelse af det inaktive p53protein kan medføre, at
kroppen laver antistoﬀer
mod dette protein.
Sådanne p53-antistoffer ﬁndes i blodet hos
patienter med forskellige
kræftformer. p53-påvisning i spyt kan f.eks.
bruges til diagnose af
oral kræft (ref.10734kilde 11).
Hvis spyt indeholder meget af det forsvarspeptid, der kaldes
defensin-1, er dette også
en indikator for oral
cancer (ref.10734kilde 11).
Hormon-måling
Underkæbe-spytkirtlen
pressor-protein-p53 er nedsat i spyt
hos kvinder med brystkræft (ref.10701).
Studier tyder på, at brystkræft hos
kvinder kan ﬁndes ved at påvise et
højt niveau af to kræft-biomarkører
(dels den omtalte CA15-3 og dels
"erb"), men speciﬁciteten kan være
så lav som 70%(ref.10734kilde 12). Dog kan
spyttest for tumor-markører være
med i en pulje af test, som tilsammen kan udgøre en diagnostisk test,
og evt. skal man lade et computerprogram om at give diagnosen ud fra
delresultaterne.
Oral cancer
Kræft i mundhulen ledsages af ændringer i biomarkører i spyt (øget
transferrin, øget cyclin-D1, nedsat
mængde maspin) foruden af speciﬁkke mRNA’er (hvor spyt-måling faktisk
er bedre end blod-måling)(ref.10701).
11
Påvisning af hormoner
i spyt kan bruges til
diagnoser for kirtelsygdomme, psykologiske
diagnoser,
fertilitetsundersøgelser, doping/
sportsmedicin og adfærdsstudier. Man kan
i spyt måle testosteron,
progesteron og estriol
- samt cortisol, der dog diﬀunderer
langsomt over cellemembranerne;
cortisol-hormonet øger dannelsen
af glucose under stress, men udviser
stor døgnvariation. En bedre måling
af stress opnås ved spyt-måling af
hormonet chromogranin-A, som er
et peptid, der udskilles samtidig med
katekolaminer, som er akutte stressparametre(ref.10734 s.15).
En sygdom, der medfører overpro-
12 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
duktion af cortisol (Cushing syndrom), højpolært molekyle, og derfor vand- ﬁndes i spyttet allerede 2-5 minutter
kan påvises med spyttest, der dog opløselige, dvs. mindre fedtopløse- efter, at man har været udsat for passiv
skal bekræftes ved en urintest(ref.10734 lige.
rygning. Man måler dog på nedbryds.15)
Insulin kan (modsat andre hormo- ningsproduktet cotinin, fordi det har
. Tilstanden kan bl.a. skyldes hypothalamus-tumor, der medfører ner) transporteres aktivt over spytkir- en halveringstid på 20 timer (hvorioverproduktion af CRH
tel-cellemembranerne mod nikotin-koncentrationen halve(ref.10734 s.13, kilde12)
res på 3-6 timer). Hvis det er tand(corticotropin), der på sin En spyttest for HIV
.
side fører til øget udskil- er godkendt i USA.
lægens opgave at få folk til at stoppe
Tobak og
med at ryge kan en spyttest altså aflelse af ACTH (adreno- En EU-rapport roser
narkotika
corticotropisk hormon), denne test for stor
sløre, om de rent faktisk er stoppet.
som i sidste ende fører følsomhed og speci- Når man indtager Desuden kan testen påvise passiv rygtil øget udskillelse af cor- ficitet, dog ikke altid
medicin eller ryger en ning. (Passiv rygning i hjemmet har
cigaret vil dette efter størst skadelig virkning (ref.10734 s.19)).
tisol fra binyrebarken.
100%
ganske kort tid kunne
Ved medfødt manspores i spyttet. Udgel på cortisol (adrenal
hyperplasi) mangler et enzym til at sættelse for passiv rygning, samt brug Nye analysemetoder muliggør
omdanne steroidhormonet 17alfa- og misbrug, kan altså derved afsløres. udbredelse af spytdiagnostik
hydroxyprogesteron til cortisol. DiagDe ﬂeste medikamenter er enten Antallet af videnskabelige publikanosen kan stilles ved en spyttest, der svagt basiske eller svagt sure. De basi- tioner om afprøvning af forskellige
påviser ophobning af 17alfa-hydroxy- ske stoﬀer har tendens til at ophobes metoder baseret på spytmålinger,
i spyttet, fordi de ioniseres i det lidt er steget voldsomt (ref.10699) (ref.10700)
progesteron (ref.10734 s.15).
Diagnose af fertilitetsproblemer sure spyt, og derfor ikke kan diﬀun- (ref.10701). Følsomme analysemetoder
kan tænkes at være mulig ved spyt- dere tilbage i cellerne igen.
er meget afgørende, fordi koncentratest for kønshormoner. Hormonerne
Kokain på fri base-form kan påvises tionen af de biomolekyler, man ønfor den kvindelige cyklus kan nemlig i spyt, og ved også at måle nedbryd- sker at måle i spyt, er 100 gange, ja
måles i spyt (progesteron og estradiol). ningsproduktet BZE kan tidspunktet endog undertiden 1000-3000 gange,
Ligeledes kan testosteron måles i spyt for kokain-indtagelsen afsløres. Ned- lavere end koncentrationen af disse
hos mænd. Hvis der måles under 0,2 brydningsproduktet BZE kan påvises biomolekyler i blod (ref.10699).
nanomol testosteron pr. liter i spyt er i op til 10 dage med en grænseværdi
En spytprøve fra munden kan tages
det tegn på hypogonadisme (ref.10734 på 1 ng/ml (ref.10734 s.17).
med en vatpind, og vatpinden kan sens.15)
. Spyttest kan i øvrigt dokumenteNikotin er et basisk alkaloid, som des til lægen. Viser prøven tegn på sygre doping med testostedom, kan lægen indkalde
patienten til en mere deron (nemlig påvisning
Sy�lis-spyttest
af unormalt højt testotaljeret udredning.
steron-tal i forhold til
Det kan i nogle lande være vanskeligt at få kontakt til befolkOpgaven bliver i fremtikroppens epitestosteron)
ningsgrupper, der har risiko for at blive smittet med syﬁlis.
den at kunne bruge spyt(ref.10734 s.15)
Her kan spyttest være praktisk. Den spyttest for syﬁlis, som
test til nærmere indkreds.
man har til rådighed, kan bruges til epidemiologiske studier,
ning af sygdommens art.
Det er vanskeligt
men har ikke følsomMed spyttest vil man kunat lave spytmåling for
kortison, hypofyse-horhed nok til at være
ne nå ﬂere mennesker, og
brugbar til diagnose
opnå tidligere diagnose og
moner, proteinhormoeller screening, og kan
derfor bedre udsigt til helner og DHEA (dehydroikke skelne mellem
epiandrosteron).
bredelse og i tillæg opnå
Det
aktiv infektion og tidsamfundsbesparelser.
skyldes, at medens de
I over 30 år har læger udovenfor-nævnte hormoligere/behandlet infekner er fedtopløselige og
tion (ref.10735 s.7).
nyttet test af spyt for fornemme at transportere
Testen påviser antiskellige sygdomme, men
over spytkirtelcellerne,
disse test var ikke særlig
stoﬀer mod syﬁlisfordi de er ukonjugerede
følsomme, og blev pribakterien (TRFIA-test = Time
Resolved Fluorescence Immuno Assay for
stoﬀer, er de sidstnævnmært anvendt til at påvise
IgG-antistoﬀer mod Treponema)
steroidhormoner og antite (kortison, hypo.
fyse-hormoner, proteinstoﬀer i spyttet. I fremtiden kan spyt derimod
hormoner og DHEA)
Elektronmikroskopisk
komme til at spille en helt
konjugerede stoﬀer, dvs.
foto af syﬁlis-bakterien
ny, stor rolle.
bundet covalent til et
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
ELISA-test
Supplerende tekst og video: www.bionyt.dk/ELISA
Test af spyt har traditionelt
været udført med ELISAmetoden (enzymkoblet immuno-sorbent-analyse). ELISAteknik bruges ved mange
diagnostiske tests, bl.a. graviditets-test.
En ELISA-test bygger på
reaktionen mellem et relevant målprotein og et speciﬁkt antistof, der er mærket
på en sådan måde, at målprotein/antistof-komplekset
kan påvises.
Dette dannede målprotein/
antistof-kompleks indfanges
af et andet speciﬁkt antistof,
som er fasthæftet til et bæremateriale (immobiliseret til
en plastoverﬂade eller til
magnetiske kugler), hvorved
det bliver lettere at bortvaske
de ikke-bundne stoﬀer.
Antistoﬀet kan være mærket med et enzym (f.eks.
peroxidase). Mængden af
enzymaktivitet (f.eks. altså
peroxidase-aktiviteten) vil
så svare til mængden af målproteinmolekyler.
Derefter tilsættes en væske,
der skifter farve eller bliver
fluorescerende, hvis det
aktive enzym er til stede.
Farvereaktionen kan ske
ved, at enzymet omdanner
det ikke-farvede eller ikkeﬂuorescerende substrat til
et farvet eller ﬂuorescerende produkt, som kan
måles.
Jo mere farve, der dannes, jo mere er der af det
pågældende målprotein i
prøven.
Farveintensiteten måles i
et fotometer.
ELISA-testen udføres på
små plastikplader med 96
“brønde” (små fordybninger i pladen) til de enkelte
prøver. En sådan analyseplade muliggør automatisering af analysen.
ELISA-testene har givet
en sensitivitet på 96% [det
vil sige at 96% af de-rentfaktisk-positive som forventet var positive i testen]
og en speciﬁcitet på 99,9%
[dvs. at 99,9% af de-rentfaktisk-negative som forventet var negative ifølge
testen] (ref.10734 s.8).
Man har videreudviklet
en ELISA-test til spyt. Den
kaldes GAC-ELISA (IgGantibody-capture-ELISA).
I visse studier er opnået
sensitiviteter på 98-100%
og speciﬁciteter på 97,7100% (ref.10734 s.9).
Trin 4:
Substrat
tilsættes og
giver signal
via enzym.
Substrat afgiver signal
Substrat
for enzymet
Trin 3:
Antistof
(kemisk
bundet til
enzym)
tilsættes.
Kemisk
Bindes via
antistofbinding
delen til
målstoffet.
Trin 2:
Prøve (med
målstof)
tilsættes,
og fanges
af antistof
på pladen.
Trin 1:
Antistof
bundet til
en plade.
13
ENZYM
Kemisk
binding
ANTISTOF
nr.2
Speciﬁk
binding
Målstof
ANTISTOF
på plade
Fig.:
Sandwich-princippet i ELISA-testen (Bemærk at ﬁguren skal
læses nedefra; fra trin 1 til trin 4).
Antistoffer binder målstoffet (trin 1-2).
Et enzym fremkalder et signal, som registreres (trin 3-4).
I denne version af en ELISA-test er et antistof bundet til en
testbrønd-væg. (Vist nederst på tegningen).
En prøve tilsættes, og hvis målstoffet ﬁndes i prøven, bindes
målstoffet til antistoffet (alt andet vaskes væk). Målstoffet
bindes derefter til et antistof/enzym-kompleks, som ved substrat-tilsætning fremkalder et ﬂuorescens-signal).
Af Ole Terney
Supplerende tekst og video:
www.bionyt.dk/PCR
14 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
PCR
metoden
PCR-teknologien
I 1980’erne blev der opfundet en
PCR-teknologi (polymerase chain
reaction), som var meget mere følsom end ELISA. Det grundlæggende
princip ved PCR er beskrevet udførligt i BioNyt nr. 72(ref.10702).
PCR-teknikken bygger på opformering af det bestemte område af
det genetiske materiale, DNA, som
man ønsker at påvise i en biologisk
prøve. (DNA-området kan f.eks. indeholde en basesekvens, der kendetegner en genetisk sygdom, eller som
stammer fra et virus eller en parasit).
Kopieringen af dette DNA går lynhurtigt ved hjælp af PCR-metoden:
På få timer kan man få rigeligt med
DNA til nærmere undersøgelser.
Ved PCR-metoden kræves meget
lidt DNA som udgangspunkt, fordi
opformeringen af det valgte DNAstykke er så præcis. Dette er basis
for metodens anvendelighed. For at
undgå forurening med andre DNAsekvenser, er det imidlertid nødvendigt, at processen forløber afskærmet
fra omgivende forureningskilder.
te deoxyribonukleotider på enden af
PCR-primeren. Derfor starter kopieringen kun ved målsekvensen).
Ved at gentage processen 20-40
gange, dannes ﬂere og ﬂere målsekvenser, som efterfølgende kan bestemmes.
DNA-polymeraseenzymet, der bruges ved PCR-metoden, har to vigtige
begrænsninger: Enzymet kan ikke selv
starte DNA-syntesen (men skal have
en primer-ende; 3’OH), og enzymet
kræver en skabelon i form af den anden DNA-streng. Disse to krav sikrer,
at man kan opformere målsekvensen
på en speciﬁk måde (ref.10702).
PCR-metoden stiller særlige krav
til analyseudstyr og uddannelse af
personalet. Metoden er omstændelig
at udføre på grund af de gentagne
temperaturskift, og der er risiko for
opformering af ikke-relevant nukleinsyre. PCR-metoden er af disse
grunde ikke blevet udbredt uden for
specialiserede laboratorier.
Gammel PCR-maskine
Traditionel PCR-maskine
PCR i korte træk:
Trin 1: Kraftig opvarmning til ca.
95˚C i 1-2 minutter. (Det dobbeltstrengede DNA adskilles derved).
Trin 2: Temperaturen sænkes langsomt
til 55˚C i 2 minutter. (Der tilføres to
PCR-primere, som er fremstillet til
speciﬁkt at binde til det stykke DNA,
der skal kopieres, ”målsekvensen”).
Der er to primere, fordi de bindes til
hver af de to strenge i DNA, se ﬁguren overfor.
Trin 3: Temperaturen hæves til 72˚C.
(DNA-syntesen sættes i gang med
enzymet DNA-polymerase, der kan
tåle denne høje temperatur. DNApolymerase-enzymet kan kun påsæt-
Moderne PCR-maskine (G-STORM GS4 thermal cycler)
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
15
Målområde
(Det interessante
område)
95oC. Den høje temperatur medfører at DNAstrengene går fra hinanden (denaturering)
Denatureringstrinnet
55oC. Den lave temperatur medfører, at DNAprimerne danner basepar med den komplementære DNA-skabelon (annealing)
DNAstrenge
fungerer
som skabelon
for nydannelse
af DNA-strenge
Nydannelse
af
DNA-strenge
Princippet i
PCR-metoden
Annealingstrinnet
72oC. Ved denne temperatur forlænger polymerase-enzym primerne under dannelse af
nye DNA-strenge i begge retninger
Syntesetrinnet
Resultat:
Voldsom opformering
af DNA-området
Af Ole Terney
Supplerende tekst og video: www.bionyt.dk/RCA
RCA
Rolling Circle Ampli�cation
PCR-teknologiens
a�øser: RCA-metoden
RCA-primeren
DNA-polymeraseenzymet kræver
en RCA-primer (et oligonukleotid af deoxyribonukleotider)
, som enzymet kan starte på.
Polymeraseenzymet kan nemlig ikke
starte sin DNA-syntese på enkeltstrenget DNA.
PCR-metoden kræver som nævnt,
at temperaturen styres, og hele tiden
veksler mellem 95˚C / 55˚C / 72˚C.
Det kan ganske vist automatiseres,
men kræver laboratorieudstyr.
RCA-metodens opdagelse
RCA-metoden blev opfundet i begyndelsen af 1990’erne. I første omgang var det en ny metode til opformering af DNA og forstærkning af
signalet til bl.a. diagnoser (ref.10703).
Metoden opformerer DNA'et ved at
lade et DNA-polymerase-enzym aflæse cirkulært DNA igen og igen under nydannelse af DNA undervejs.
En ringformet hjælpeprobe er
ofte nødvendig i RCA-metoden
Der anvendes typisk en hjælpeprobe,
der kan danne en DNA-ring. Hjælpeproben har i enderne DNA-områder, som er komplementære med
mål-DNA'et.
Enzymets funktion i RCA
Fordele ved RCA-metoden
RCA-metoden har et helt afgørende
træk: Den kan foregå ved omgivelsestemperatur (isotermisk). Dette
muliggør analyse uden opvarmning - og kan dermed udføres uden
elektricitet(ref.10703). Det giver RCAmetoden et stort potentiale på steder
i verden uden elektricitet (ref.10705).
RCA-metoden er (sammenlignet
med PCR) desuden mere enkel at
udføre, meget følsom og speciﬁk og
kan påvise ikke blot DNA og RNA
(som PCR-metoden er begrænset
til), men kan også påvise proteiner
og andre biomarkører (ref.10708). I princippet kan der ved hjælp af RCAmetoden hurtigt og simpelt stilles en
diagnose på mange livstruende sygdomme - blot med en lille blodprøve
eller en lille spytprøve.
Mål-DNA
RCA-metoden til opformering af
DNA bygger altså på, at man på forhånd kender basesekvensen for det
stykke DNA ("mål-DNA'et", targetDNA), som man vil påvise og opformere til et signal-niveau, hvis det
eventuelt ﬁndes i prøven.
Hybridisering mellem den
ringformede hjælpe probe
og mål-DNA'et ( target-DNA)
DNA-polymerase-enzymet starter
i enden på primeren, og nydanner
derefter DNA, som er komplementært med den ringformede DNAstreng. DNA-polymerase-enzymet
aﬂæser altså det ringformede DNA
i omgang efter omgang, cirkel efter
cirkel, rundt og rundt.
(Hvis der kun er én type primer tilstede danner enzymet en lang tandem
af forbundne kopier af det cirkulære
DNA. Dvs. gentagne DNA-sekvensstykker, som perler på en snor). Aﬂæs-
Da hjælpeprobens ender er komplementære med mål-DNA'et, hybridiserer de til mål-DNA'et. Det
sker, når hjælpeproben opdager målDNA'et. Derefter er det opgaven at
gøre dette til et synligt signal.
ningen af DNA-cirklen kommer til at ligne
situationen, hvor man ruller en ledning af en
tromle - blot med den forskel, at ”ledningen”
dannes undervejs.
DNA-polymerasen
Dannelsen af RCA-produktet
RC A - m e t o den medfører
nydannelse af
DNA, som er
en kopi af mål-DNA'et. Til nydannelse af DNA kræves et DNA-polymerase-enzym (som navnet siger
laver enzymet en polymer af DNAmolekyleenheder).
Under tilstedeværelse af de 4 deoxyribonukleotider, som er byggesten
for DNA, ruller den ene kopi efter
den anden af det cirkulære DNA,
medens det allerede dannede DNA
undervejs løsnes fra dobbelt-DNAstrengen. Produktet ruller af det
cirkulære DNA, deraf navnet RCA,
”rolling circle ampliﬁcation”, eller i
korthed RCA-metoden.
Ampliﬁkation betyder (signal)forstærkning.
Signalet forstærkes, fordi der sker en opformering af DNA'et. En dansk oversættelse kunne
være
”rullecirkel-forstærkning”,
”rullecirkel-opforme-
ring”, ”rullecirkel-ampliﬁkation”, ”rotationscirkel-ampliﬁkation” eller lignende).
PCRmeto
a�øse dens
r
RCA-princippet
Mikrochip
Indfangning
(hybridisering)
Hul lukkes
( ligering )
Ligering (sammenføjning)
Opformering af DNA
Hvis DNA-polymerasen katalyserer syntese af det cirkelformede
DNA f.eks. 1000 omgange, bliver
der dannet 1000 delprodukter.
Disse delprodukter har alle information om mål-DNA-sekvensen
og signalsekvensen.
Kobling til en fast overflade
Man lader ofte RCA-primeren være
koblet til en fast overﬂade. Derved
hænger hele tandem-sekvensen fast
til denne overﬂade (immobilisering).
På denne måde kan man synliggøre
et enkelt mål-DNA i en vævsprøve,
fordi det lange stykke af nydannet
DNA hænger fast på den faste overﬂade, og her afgiver et signal.
Signalet
Hjælpeproben kan indeholde en
signalsekvens, der senere kan bruges
Ny DNA
dannes og
mål-DNA'et
skubbes af
Fluorescerende
signalsekvens
til at synliggøre slutproduktet. På
DNA-polymerasens vej bliver denne
hjælpeprobes signalsekvens aﬂæst.
Hver runde giver et delprodukt,
som dels indeholder information
om mål-DNA-sekvensen, dels signal-sekvensen.
Synliggørelse af den afrullede
streng af kopi-DNA kan ske ved,
at en af de fire deoxyribonukleotider var mærket med et fluorescerende molekyle.
Signal fra det
opformerede
DNA
Synliggørelsen kan også ske efter
at overskydende reagens er vasket
væk - nemlig ved at tilsætte fluorescensmærkede oligonukleotider,
som hybridiserer med det nye
DNA (dvs. binder sig specifikt
hertil) (ref.10713).
Fremgang for RCA-analysen
Vadim V. Demidov opsummerede
i 2005, hvordan ti-året 1995-2005
var gået med hensyn til analyser inden for DNA-diagnostik
(ref.10708)
.
I 2005 var PCR stadig den
Den oprindelige
dominerende analysemetode
mål-DNA streng
ved DNA-diagnostik. Men
skubbes bort.
PCR var ved at blive indhenDNA-polymerase- tet af de metoder, som ikke
enzym (forlænger kræver opvarmning i løbet
DNA-strengen)
af analyseprocessen - og især
RCA-metoden var blevet
mere og mere populær. I 2005 arbejdede flere biotek-firmaer på at
udvikle en kommerciel diagnoseanalyse baseret på RCA-princippet (ref.10708) (bl.a. Quiagen og Hamilton Thorne Biosciences fra USA,
Amersham Biosciences fra UK, Olink
Bioscience fra Sverige og Biokit fra
Spanien) . RCA-metoden er senere
blevet modificeret på utallige måder (ref.10703). (ref.10705).
18 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
Minikugler
Minikugle-metode kombineret med RCA-metoden:
I 2009 beskrev T. Konry og
kollegaer en kombination af
dels minikugle-analyser til at
indfange de stoﬀer, der skal
analyseres, og dels et RCA-baseret system til at opnå stærkt
øget følsomhed af analysen
(ref.10714)
.
Minikugler kan på overﬂaden bære monoklonale antistoﬀer til at indfange proteiner
som f.eks. interleukin-8 (IL8). Man bringer minikuglerne
sammen med det protein, der
skal bestemmes (i eksemplet
her er proteinet altså interleukin-8). Med endnu et antistof
får man interleukin-8 til at
sidde i sandwich mellem de to
antistoﬀer. Derefter udføres RCAanalyse til opformering af signalet.
Trin A: En minikugle belagt med
antistoﬀer mod f.eks. signalstoﬀet interleukin-8 indfanger dette stof.
Trin B: Der sker en avidin/biotinhjulpet binding til en indfangningsprobe, der ved hybridbinding er
koblet til en hjælpeprobe. Det store
molekyle avidin og det lille molekyle biotin bindes meget stærkt til
hinanden. Til biokemiske analyser
bruges denne avidin/biotin-binding
RCA-patenter
Udviklingen af RCA blev hæmmet
af patentsituationen (ref.10708). Patenter kan både fremme og hæmme
udviklingen. Det første patent inden for et nyt felt er ofte formuleret
meget bredt for at sætte sig på hele
feltet. Al efterfølgende udvikling
kommer i voldsom afhængighed af
det første patent, og der betales licenser for kommerciel udnyttelse.
Dette skete med RCA-metoden.
Den første patentansøgning havde
J. I. Auerbach som opﬁnder og
Minikugle bundet
til monoklonalt
antistof (mAB)
Interleukin-8
Biotin-bundet mAB
Avidin
Biotin-bundet indfangnings-probe
Hjælpe-probe
Mål-genet
Signal-probe
meget ofte. Avidin kan binde sig til
ﬂere biotin-molekyler.
Trin C: Hjælpeproben (også kaldet
padlock probe, "låse-DNA-stykke")
indfanger mål-DNA'et, fordi hjælpeproben har en sekvens, så hver ende
hybridiserer til kendte områder i det
DNA-målområde, der skal påvises.
Trin D: Hjælpeproben bringer derved
DNA-enderne sammen, så de kan
lukkes med et enzym for at opnå en
cirkeldannelse. Hullet lukkes af dette
enzym, en DNA-ligase.
Trin E: Der er nu tilvejebragt et
titlen ”Methods for the isothermal
ampliﬁcation of nucleic acid molecules”. Den blev i 1994 til US-patent
nr. 5.354.668 (ref.10708). I 1990’erne
kom mange andre patentansøgninger. Situationen blev kompleks
med gensidig afhængighed mellem
de forskellige patenter (ref.10708). En
sådan situation kan føre til store
stridigheder om rettighederne.
Et patent giver kun en geograﬁsk
afgrænset ret. Et US-patent gælder
således kun i USA. (Danmark kan
være dækket af et nationalt patent
grundlag for en RCA-ampliﬁkation
med det ringformede DNA som udgangspunkt (ref.10714).
Trin F: Signalprober genkender og
hybridiserer til dele af den dannede
DNA-streng. Tilstedeværelsen af
DNA-stykket er dermed bekræftet ud
fra signalet fra signalproberne. F.eks.
ved at hybridisere med ﬂuorescensmærkede signalprober.
Med denne type analyse kunne
man måle helt ned til 1 pM målDNA og 10 fM interleukin-8 i samme analyse (ref.10714).
eller af et europæisk "EP-patent").
Det kræver et stort arbejde at afklare, i hvilke lande der ﬁndes et
gyldigt patent på en teknologi.
Videreudvikling af RCA-test
RCA-teknologien kan bruges sammen med mange forskellige målemetoder. Den omfattende udvikling
af RCA-teknologien siden starten i
1990’erne opsummeres af danske
forskere i en artikel med ikke mindre end 206 referencer (ref.10718).
RCA-metoden er blevet kombine-
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
ret med meget avancerede målemetoder, men det mest spændende er
nok, at RCA kan tilpasses til brug
under meget lav-teknologiske forhold, og derfor kan ﬁnde anvendelse uden for de specialiserede
laboratorier, - altså f.eks. hos den
praktiserende læge eller endog af
den enkelte patient (ref.10718).
Når man kan måle markører på
en enkelt celle, bliver det muligt
at måle på materiale, hvor ikke alle
celler er ens. Dette er tilfældet ved
kræft, hvor der på samme tid ﬁndes
mange forskellige celletyper, nemlig dels de såkaldte kræft-stamceller og dels de mere eller mindre differentierede kræftceller. Det vides
ikke, hvordan disse forskellige celler påvirker udviklingen af kræft og
behandlingen af kræft.
Med de nye teknikker til påvisning af enkelt-molekyler i enkeltceller åbnes der altså op for nye
forskningsområder (ref.10718).
Minidråbe
RCA kombineret med en
teknologi kaldet microfluidic nano-liter platform
åbner en helt ny verden
Ved mange af de tidligere anvendelser af RCA-teknologien foregik reaktionen på en fast overﬂade, hvor
produktet fra RCA forblev bundet
til den faste fase og altså blev påvist
her.
Denne opsætning med en fast
overﬂade er imidlertid ikke anvendelig i alle tilfælde, så forskere er
gået på jagt efter en metode, hvor
et markørprotein kan måles på en
enkelt celle - uden at cellen er bundet til en fast fase.
Der er tidligere blevet udviklet såkaldte microﬂuidic-metoder.
Nu er det lykkedes forskere at få
RCA-reaktionen til at foregå inde
i en dråbe af nanostørrelse (ref.10717).
Kombinationen af de to teknikker
muligør ultrafølsom analyse på enkeltceller.
Grundprincippet i microfluidicteknologien er at indeslutte en
enkelt celle i en meget lille dråbe
(af nanoliter-størrelse) med RCAreagenser.
De meget små dråber dannes i
mikrokanaler. Dråben omsluttes
af olie. Når der skal opnås dråber
med kun en enkelt celle, vil der
også være mange dråber uden celler til stede (eller med mere end én
celle), men det kompenseres der
for ved at fremstille et meget stort
antal dråber i det automatiserede
apparatur (ref.10717).
Metoden er blevet anvendt til at
måle en specifik tumor-markør
EpCAM (epithelial cell adhesion
molecule). Den lave forekomst af
denne markør har hidtil gjort det
vanskeligt at måle den.
Hvis RCA i minidråber kombineres med cellesorteringsmetoder,
vil det være muligt at isolere celler, der er positive for EpCAM, og
dermed opnå en større mængde
EpCAM-aktive celler til yderligere
studier (ref.10717).
Enzymtest
Der stilles store forventninger
til RCA i multiplekse analyser
RCA er indtil nu især blevet udviklet til at påvise nukleinsyrer (dvs.
DNA og RNA), proteiner eller
enzymaktiviteter. Men i fremtiden
forventes det at blive muligt at videreudvikle RCA-teknologien til at
måle forskellige molekyltyper og
enzymaktiviteter i samme analyse
(multiplekse analyser) (ref.10718).
Herved vil man kunne følge ﬂere
molekylære aktiviteter inde i en
celle - selvom cellen beﬁnder sig i et
væv med andre celletyper (ref.10718).
Der kendes ikke andre analysemetoder, hvormed der kan udføres
så komplekse analyser (ref.10718). Analyse af enkeltceller i heterogent væv
kan bruges inden for kræftforskningen.
19
Følsom metode til påvisning
af enzym-aktivitet
Når man ønsker at måle små mængder af et genprodukt, har det været
almindeligt at bruge en kvantitativ
PCR-reaktion, fordi PCR-teknologien kan måle små mængder. Men
PCR-teknologien er som tidligere
nævnt en kompleks teknologi, og
den måler kun oligonukleotider
(f.eks. mRNA) og ikke enzymaktiviteter.
Ved hjælp af PCR-metoden
kan man f.eks. måle den mængde
mRNA, der koder for et enzym,
men man er ikke i stand til at måle,
om enzymet er i en aktiv, dvs. katalyserende, form.
I mange tilfælde er man netop
mest interesseret i at måle selve
enzymaktiviteten.
På dette område har forskere ved
Århus Universitet udført frontforskning (ref.10715). De har arbejdet
med en metode til at måle aktiviteten af human topoisomerase I.
Måling af dette enzym er interessant i forhold til visse kræftbehandlinger. Kemoterapi med
stoffer fra camptothecin-familien
rammer dette enzym, så ved at
måle aktiviteten af topoisomerase-I
kan man finde ud af, hvor godt
behandlingen med camptothecin
virker.
Enzymet topoisomerase I klipper
hul i den ene streng af dobbeltstrenget, ringformet DNA, således at for
høj spænding i den dobbeltstrengede DNA-ring afhjælpes. Dette
hul skal efterfølgende lukkes ved
sammenføjning (ligering). Denne
klip-og-sy-reaktion er meget vigtig
for en celles liv, men omstændighederne varierer fra organisme til
organisme.
Ved at anvende speciﬁkke sekvenser i de hjælpe-prober, der anvendes
under analysen, kan man påvise,
om en celle har modtaget et fremmed enzym med en anden speciﬁcitet, f.eks. på grund af en infektion.
Se den efterfølgende artikel om
malaria, hvor man anvender denne
teknologi.
20 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
Af Ole Terney
Supplerende tekst og video: www.bionyt.dk/malaria
Malaria påvist ved
en simpel spytprøve
Cirkel-DNA metoden (RCA)
er anvendt til test for malaria
En dansk forskergruppe ved Århus
Universitet har udviklet en RCAbaseret test til påvisning af malariaparasitter i blod. Med RCA-metoden
kunne de måle en bestemt enzymaktivitet, som afslører malariaparasittens tilstedeværelse (ref.10705).
Forskerne ved Århus Universitet er
de første forskere, der har videreudviklet RCA-metoden til måling af en
enzymaktivitet. (Denne videreudvikling kaldes REEAD; eng: rolling circle enhanced enzyme activity detection)
(ref.10715)(ref.10705)
.
RCA-test for malaria-version
af enzymet topo-isomerase I
De danske forskere målte speciﬁkt på
aktiviteten af et for malariaparasitten
livsnødvendigt DNA-klippe-og-limeenzym, topoisomerase-I, i en blodprøve.
Enzymet topoisomerase I, som påvises i
testen, er et enzym, der ﬁndes hos alle
levende organismer, idet det er helt
essentielt for organismens overlevelse.
Topoisomerase I (ofte kaldet TopI)
fremmer (ved katalytisk enzymaktivitet), at der sker brud på den ene
streng i dobbeltstrenget DNA, hvorved der dannes et covalent enzym/
DNA-mellemprodukt, som muliggør, at de afbrudte DNA-strenge igen
sættes sammen - af det samme enzyms
ligase-aktivitet (sammenlimning).
Enzymet kan altså både klippe og sy
sammen. Denne aktivitet er livsnødvendig for at kunne fjerne skadelige
spændinger, som kan opstå i dobbeltstrenget DNA.
De indledende forsøg på måling af
enzymaktiviteten fra malariaparasitten i en lille spyt-prøve ser lovende ud
(ref.10705)
.
Forskerne ved Institut for Molekylærbiologi og Genetik og Interdisciplinært
Nanoscience Center ved Århus Universitet har videreudviklet RCA-teknologien til at ske i nano-dråber. Dermed
har de frembragt den første diagnostiske test, som bygger på måling af
en enzymaktivitet i den indtrængende organisme, her malariaparasitter
(ref.10705)
.
Det regnes for mere sikkert at bygge
en test på selve tilstedeværelsen af malariaparasitten end at forsøge at teste
patientens immunreaktion eller eventuelle sygdomssymptomer.
Topoisomerase I stiller meget speciﬁkke krav til den DNA-sekvens,
den bindes til og spalter ved. Det er
denne egenskab, der med stort held
udnyttes i den nyudviklede metode
(ref.10705)
. Enzymet varierer nemlig lidt
fra organisme til organisme, og DNAsubstratet tilsvarende. Denne forskellighed udnyttes i den nye testmetode.
Enzymet topoisomerase I er så vigtig for Plasmodium-arters overlevelse,
at det ikke er gået tabt under evolutionen af Plasmodium-arterne. Der er
således særdeles gode muligheder for
at udvikle en speciﬁk pan-malariatest,
hvormed alle Plasmodium-arter kan
påvises ved samme test.
Det er tidligere vist, at man kan måle
human-TopI ved hjælp af RCA-metoden. De danske forskere ﬁk så den
idé, at de måske kunne måle TopIaktiviteten fra Plasmodium i prøver fra
en malaria-inﬁceret person og relatere
dette til tilstedeværelsen af parasitten
(ref.10705)
.
Dette krævede, at man kunne skelne
mellem topoisomerase I fra mennesket
(hTopI), og topoisomerase I fra malaria-Plasmodiumparasitten (pTopI).
For at måle parasittens topoisomerase
I blev der anvendt et reaktionskammer af ekstrem lille størrelse. Metoden
kaldes på engelsk ”droplet microﬂuidics
platform”.
Kombinationen af RCA og ”droplet
microﬂuidics platform” viste sig at give
en meget følsom og speciﬁk påvisning
af tilstedeværelsen af malariaparasitter
(ref.10705)
.
Principperne i analysen er følgende:
Hvis der er pTopI (fra parasitten) tilstede i en blodprøve, der er taget af et
menneske, der mistænkes for at være
smittet med malaria, vil dette pTopI-
enzym klippe hul i et nøje udformet
testsubstrat (DNA) - og vil efterfølgende lukke hullet igen.
Det pågældende testsubstrat indeholder to DNA-sekvenser, som har
betydning for påvisningen af klip/syaktiviteten.
Det er vigtigt at forstå, at speciﬁciteten i analysen ligger i, at man lige
netop tilbyder et stykke substratDNA, som er speciﬁk for DNA-klip/
sy-enzymet fra den organisme, som
man ønsker at afsløre tilstedeværelsen
af. (Hvis man vil påvise hTopI-enzymet, er det således et andet DNAsubstrat, der skal anvendes, end hvis
man vil påvise pTopI-enzymet). Man
skal kunne skelne mellem dem, da der
altid vil være hTopI tilstede, når man
tester for pTopI.
Man tilfører et DNA-stykke, som
kan fungere som primer for en DNApolymerase. (Desuden tilfører man de
til DNA-syntesen nødvendige ﬁre typer af deoxyribonukleotider).
DNA-polymerasen kopierer nu det
cirkulære DNA gang på gang – f.eks.
1000 gange. Den ene kopi efter den
anden kommer derved til at ligge
sammenkoblede som perler på en
snor.
Den RCA-baserede test for malariainfektion er så følsom, at den giver et
positivt udslag ned til at der i gennemsnit kun er 0,06 parasit pr. mikroliter
(ref.10705)
. (Dette kan sammenlignes
med, at de mest optimale protokoller for PCR kan måle ned til 0,01-1
parasit pr. mikroliter (ref.10705)).
Metoden forventes at kunne anvendes til at teste for malaria i en lille
spytprøve (ref.10705).
Ny viden om malaria
Danske forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns
Universitet har været førende i opdagelsen af, hvordan malariaparasitter undviger kroppens immunforsvar
- og får lov til at hobe sig op i hjernen,
hvilket ofte fører til dødbringende
sygdom.
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
21
Der er store perspektiver ved spyttest-teknologi
- som f.eks. hvis man ved simple spyttest i
fattige udviklingslande kan teste for malaria.
Den nye viden bringer en vaccine
mod malaria inden for rækkevidde og
styrker hele forskningsområdet.
Tidligere var det i Danmark svært at
få økonomisk støtte til malariaforskning, fordi der i mange år har været
fokus på kræftforskning. Desuden er
langt de ﬂeste personer, der får malaria, at ﬁnde blandt verdens fattigste,
hvilket ikke har gjort det attraktivt
at udvikle medicin og vaccine mod
malaria. Trods dette er dansk malariaforskning epokegørende.
Malaria er udbredt i tropiske og
subtropiske områder, specielt i Afrika.
Der importeres 150-200 tilfælde af
malaria til Danmark om året (ref.107019).
Malaria er altså ikke en almindelig
sygdom i Danmark, men danske forskere har i mange år været fremtrædende inden for malariaforskning på
et internationalt højt plan.
Malaria er et stort problem
på verdensplan
Malaria er en infektionssygdom, som
skyldes en gruppe af malariaparasitter
af slægten Plasmodium, hvoraf Plasmodium falciparum er den farligste
for mennesker.
Plasmodium-parasitterne er encellede organismer, som kan leve som
Giemsa-farvning af ringformer og gametocytter
af malaria-parasitten, Plasmodium falciparum
parasitter i bl.a. mennesket og i en
bestemt stikmyg ved navn Anopheles
(ref.107019)
.
Man regner med, at der i år 2010
opstod omkring 216 millioner nye
malariatilfælde i verden, hvoraf omkring 655.000 havde dødelig udgang
(ref.107019)
.
De ﬂeste, der dør af malaria, er børn
under 5 år. Børn er særligt sårbare,
fordi de endnu ikke har en færdigudviklet, naturlig immunitet (ref.107019).
Malaria-parasitten skjuler sig
for menneskets immunsystem i
de røde blodlegemer
En infektion med malaria-parasitter kan udvikle sig livstruende, fordi
parasitterne har en evne til at undgå
kroppens naturlige immunforsvar.
Parasitterne opformerer sig i de røde
blodlegemer, og får de røde blodlegemer til at udtrykke et parasit-aﬂedt
vedhæftningsprotein på overﬂaden af
de røde blodlegemer (ref.10720). Dette
parasitprotein bindes til celler i blodkarvæggen, og der kan ske roset-dannelse med binding af ikke-inﬁcerede
røde blodlegemer. Der sker også en
blodplade-hjulpet sammenklumpning af inﬁcerede røde blodlegemer.
Disse forhold kan føre til blodprop.
Det har vist sig, at malariaparasitten
er utrolig dygtig til at variere vedhæftningsproteinet, som kaldes PfEMP1proteinet (P.falciparum-erythrocytemembrane-protein-1). Der foregår et
sandt kapløb om liv eller død. Der er
således fundet omkring 60 varianter
af proteinet (ref.10722).
Genet, der koder for PfEMP1-proteinet, blev klonet i 1995. Derved
blev det muligt at studere vedhæftningen på molekylplan. Men der er
rigtig mange parametre at undersøge.
Malariaparasitten bærer gener, der
koder for mange varianter af vedhæftningsproteinet, og endothel-cellerne
har rigtig mange klæbe-molekyler på
celleoverﬂaden, dvs. molekyler, hvortil parasit-aﬂedte proteiner kan binde
sig (ref.10720). Kombinationerne er mange, og der skal derfor komplekse metoder til for at undersøge disse mange
kombinationer.
22 BioNyt - Videnskabens Verden nr.158 www.bionyt.dk
MALARIA
Kønnet stadie:
Hanlige og hunlige
gametocytter
dannes
Tidlige
stadier
i myggen
Gametocytter
Gameter
Stadie i
blodlegemer
hos menneske
Ukønnet
cyklus
Anfald når
mange parasitter
frigøres samtidig
Merozoitter
Rødt blodlegeme
(hos menneske)
med haploide
merozoitter
Myggen optager parasittens kønsstadie (hanlige
og hunlige gametocytter)
medens den suger blod
En stikkende hunlig Anopheles-myg indsprøjter parasittens sporozoitter i blodet,
og de vandrer til leveren
Leveren
Stadie i
leveren hos
et menneske
Nogle af parasitterne
kan være hvilende, i
uger eller måneder
Den mulige malaria-vaccine
Antistoﬀer mod de forskellige malaria-antigener, der dannes undervejs
i malariaparasittens livsstadier i blodet, kan være vigtige for opnåelse af
beskyttende immunitet og er derfor
mulige vaccinekandidater (ref.10721).
I 2011 var forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns
Universitet med til at undersøge,
hvordan individer, der ikke tidligere
har været i kontakt med malariasmitte, ville reagere på malaria-smitte.
Der blev testet 104 PfEMP1-domæner (fremstillet ved genteknologi). De
blev testet i hollandske forsøgspersoner for at se, hvornår der kom et antistof-svar i forsøgspersonen. Hvis et
PfEMP1-domæne fremkaldte et hurtigt antistofsvar, var det en potentiel
kandidat til en vaccine (ref.10721).
Infektionen blev påført via myggestik fra Anopheles stephensi myg, der
var inﬁceret med ét af de rekombinante PfEMP1-domæner.
Det var således et meget realistisk
Sporozoitter
En levercelle
kan danne ti-tusinder
af merozoitter
Fusion og
dannelse
af diploid
zygote
Zygote
Ookinet med aktiv bevægelse
inﬁcerer
myggens
tarm
Oocyst
Sene stadier
i myggen: Fra
oocysten frigives tusinder
af haploide
sporozoitter
Sporozoitter
overføres til menneskets blod
scenarie med en ”naturlig” infektionsmetode. Forsøget blev stoppet, efter at
malariaparasitten havde delt sig aseksuelt et par gange (for ikke at påføre
forsøgspersonen for stor risiko for at
få en ukontrollerbar malaria).
På trods af det meget korte infektionsforløb, blev der observeret
PfEMP1-antistoﬀer i omkring 60%
af forsøgspersonerne.
Dette resultat tegnede godt, men der
kunne ikke etableres en sammenhæng
mellem omfanget af infektionen og
bredden af antistof-svaret. En af deltagerne udviklede kun antistoﬀer
mod ét domæne, medens en anden
udviklede antistoﬀer mod 38 domæner af de i alt 104 domæner.
Malariaparasitten
helgarderer
Stadier
i myggen
Malariaparasitten helgarderer sig ved
at udtrykke de ﬂeste domæner, når
parasitten går ind i blodstadiet. Den
kender jo ikke antistof-reaktionen
hos den nye vært, så den vælger at
være på den sikre side og sørge for, at
stort set alle domæner bliver udtrykt
samtidigt. Denne strategi giver malaria-parasitten gode muligheder for
at overleve og fremkalde en kronisk
infektion.
Epidemiologiske data tyder på, at
alvorlig malaria er knyttet til visse
velbevarede domæner af PfEMP1.
Metodemæssigt er dette dog svært at
undersøge. Forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns
Universitet kombinerede to metoder,
som hver især ikke var helt gode, men
som tilsammen gav et tydeligt resultat.
De fandt, at uanset hvilke symptomer et meget malaria-sygt barn havde, kunne de påvise, at transskription
(DNA-aﬂæsning) af domæne cassette
nummer 8 (DC8) var meget forhøjet.
Der var også forhøjet transskription
fra DC13-domænet. Deres forskning
pegede således på to gode vaccinekandidater (ref.10722).
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158, www.bionyt.dk
Malariaparasit-bindingsstedet
De danske forskere fulgte imidlertid også en anden angrebsstrategi.
Hvis man kunne ﬁnde det sted i
blodårerne, hvor malariaparasittens
protein sætter sig fast, så kunne
man arbejde på at forhindre, at
røde blodlegemer med malariaprotein på ydersiden kunne sætte sig
fast.
Hvis parasitholdige røde blodlegemer ikke kan hægte sig fast, vil de
blive ført til milten (blodets rensningsanlæg) til tilintetgørelse, og
parasitten vil gå til grunde(ref.10723).
Forskernes mål var således at ﬁnde
ud af, hvilke af menneskets tusinder af receptorer i blodkarrene, som
parasitterne bindes til. Det krævede
screening af over 2500 proteiner.
Det første skridt var at genskabe
hele PfEMP1-proteiner ved genteknologi i laboratoriet. Dernæst
blev delstykker af hele PfEMP1-
molekylet analyseret for binding til
proteiner i cellevæggen af menneskets blodkar.
De danske forskere samarbejdede
med det engelske ﬁrma Retrogenix,
som har specialiseret sig i at få celler
til at producere forskellige proteiner på cellemembran-overﬂaden.
Ved at teste det ene protein efter
det andet fandt man ud af, hvilke af
karvæggenes ﬂere tusinde proteiner,
som en oprenset version af malariaparasittens PfEMP1-protein bindes
stærkest til. Dette pegede éntydigt
på menneskets overﬂadeprotein
EPCR (eng: endothelial protein C
receptor).
EPCR-overﬂadeproteinet er en
utrolig vigtig receptor i kroppen.
Den sidder centralt i den signalvej,
der kontrollerer både kroppens immunforsvar, cellevæggenes integritet og blodkoagulering. Hvis der
sker en øget blodkoagulering i hjer-
23
nen, er der stor risiko for dannelse
af blodprop i hjernen. Blodpropper
er en af hovedårsagerne til, at folk
dør af hjernemalaria (ref.10723).
Mulige mål for vacciner er altså
blokering af parasittens DC8 og
DC13 hæfteproteiner, og bindingen til menneskets EPCR-receptor.
Blodprøve til mikroskopisk undersøgelse for malaria (den tykke blodprøve er vanskeligere at undersøge,
men den større mængde blod øger
chancen for at ﬁnde parasitten)
MALARIA
Merozoitter
Merozoitinvasion
Rødt blodlegeme
Sporozoitter
Infektion
Parasitten
inﬁcerer de
røde blodlegemer
Lever
Inﬁceret
rødt blodlegeme
Tilhæftning
i moderkagen
Moderkagen
Merozoitter
Ukønnet
cyklus
Overførsel
til malariamyg
Inﬁceret
rødt blodlegeme
Tilhæftning
i endotheliet
Endothel
Gametocytter