1. No category

Opbygning og funktion af en HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Kromatografi udføres under højt tryk gennem en søjle. Derved adskilles stoffer efter polaritet eller chiralitet.
●
●
●
●
●
Det valgte solvent pumpes løbende gennem søjlen med den valgte
flow rate.
Ved injektionsventilen sprøjtes prøven ind i et kort prøve loop. Dette
loop har et volumen på 2-1000 mikroliter.
Når injektionshåndtaget drejes føres solvent-flowet gennem
prøveloopet og prøven føres på søjlen.
På søjlen adskilles prøvens forskellige komponenter.
Disse komponenter detekteres for enden af søjlen - ofte vha. en UVeller MS-detektor.
Solventer:
● De skal være meget rene!
○ De skal være triple destilleret.
○ Intet ilt i solventet - eller gas generelt.
○ Køres først igennem en guard-column med det samme
søjlemateriale som søjlen. Denne kan skiftes oftere end selve søjlen.
● Solventer af forskellig polaritet benyttes til at ændre elueringen af forskellige analytter.
● Der kan køres isokratisk, gradient eller med en kombination af forskellige solventer:
○ Isokratisk: Samme koncentration af ét solvent under hele analysen
○ Gradient: En langsomt skiftende solventsammensætning. f.eks. lav eluntstyrke ⇒
høj eluentstyrke.
○ Kombination af solventer: Ved at køre en fast kombination af solventer opnår en
meget specifik eluentstyrke, som benyttes til hele analysen.
Pumpen:
● Pumpen sørger for et uniformt tryk og flow.
○ Normalt arbejdes der med et tryk på 70-400 bar, men det kan nå op på 1000 bar
i nogle apparater.
○ Den normale flow rate er på 0,5-5 mL/min.
Injektion:
● Ved injektionsventilen sprøjtes prøven ind i et kort prøve loop. Dette loop har et volumen
på 2-1000 mikroliter.
● Når håndtaget drejes føres flowet gennem prøveloopet og prøven indføres på søjlen.
● Ved injektion er det yderst vigtigt at prøven er ren og filtreret på en lille søjle.
● Der må ikke være luft i injektionen. Dette medfører at søjlen kan udtørre.
Søjlen:
●
●
●
HPLC-søjler er 5-30 cm lange og 1-5 mm i diameter.
Søjlerne er pakket med en stationær fase.
○ Enten polær (normal fase)
○ eller apolær (omvendt fase)
I nogle apparater er søjlen i en ovn, som varmer søjlen til 10 grader over
stuetemperatur. Dette øger reproducibiliteten af analyserne.
○ Hvis der benyttes en ovn, skal solvent forvarmes før det går ind på søjlen.
Søjlemateriale:
Almindelige polære faser
Almindelige apolære faser
Amino
Cyano
Diol
Octadecyl (alkan) C18
Octyl (alkan)
Phenyl
F5-phenyl
Søjlen er loaded med partikler som består af silica. Jo mindre partikler jo bedre opløsning
(mindre pladehøjde!)
Silica er ikke brugbart ved pH > 8. I stedet kan polymer-materialer benyttes.
Det mest basale søjlemateriale består af Si-OH-enheder og benyttes ofte i
adsorbtionskromatografi.
Ofte er disse enheder dog blevet påsat en R-gruppe (se ovenfor).
Disse R-grupper har forskellig polaritet, hvilket giver mulighed for mere specifik separation.
Oftest anvendes C18-kæder (omvendt fase).
Omvendt fase:
● Upolært søjlemateriale
● Upolære analytter har længere retentionstider end polære ⇒ større affinitet for søjlen.
● Upolære solventer har større eluentstyrke end polære.
○ Methanol har lavest eluentstyrke
○ pentane har højest eluentstyrke
● Omvendt fase kromatografi har mindre tendens til tailing, fordi der ikke er så stærk
adsorbtion i det upolære søjlemateriale.
Normal fase
● Polært søjlemateriale
● polære analytter har længere retentionstider
● polære solventer har højere eluentstyrke end uploære
○ Pentane har lavest eluentstyrke
○ Methanol har højest eluentstyrke
● Polære søjlematerialer er meget følsomme overfor vand!
Detektor:
●
●
●
●
●
UV-detektor (ofte en ”Flow cell” - fig. 24-19 s. 612)
○ Meget sensitiv til lave koncentrationer.
○ Påvirkes ikke af temperatur og solventsammensætning.
■ Dog skal bølgelængde vælges så solventer ikke absorberer.
○ God til gradient eluering .
○ Detektionsgrænse: ca. 0.1-1 ng
Flourosens detektor
○ Analyt derivatiseres - enten før eller efter søjlen.
○ Efter “derivatisering” måles flourosensen
○ God til gradient eluering.
○ Detektionsgrænse: ca. 0.1-1 ng
Evaporative light-scattering detektor
○ Analyt fordampes og fast stof bliver tilbage.
○ Spredningen af lys fra det faste stof måles.
○ Stor spredning af lys betyder meget stof.
○ God til gradient eluering.
○ Detektionsgrænse: ca. 0.1-1 ng
APCI og ES
APCI (ladning induceres af corona) og ES (ladning induceres af spænding på nebulizer)
Talepapir
Generel opbygning: Solvent, pumpe, injektionsventil, søjle (evt. i ovn) og detektor.
Solventer:
● Rene/filtrerede
● Polaritet
● Isokratisk vs. gradient
Pumpe:
● Tryk (70 - 400 bar)
● Flow rate (0,5 - 5 mL/min)
Injektion:
● Meget rene prøver
● Prøveloop (2 - 1000 mikroliter)
Søjle:
● HPLC-søjler er 5-30 cm lange og 1-5 mm i diameter.
● Søjler kan holdes stabile i temperatur i en ovn (10 grader over stuetemp!)
● Søjlemateriale er små silica-partikler coated med forskellige R-grupper
○ Omvendt fase
■ Upolært søjle materiale (ofte C18)
■ Polære solventer
○ Normal fase
■ Polært søjlemateriale (ofte Si-OH)
■ Upolære solventer
Detektor:
● UV
● MS
● Flourosens detektor
● Evaporative light-scattering detektor