1. No category

Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana
Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani
7. JESENOVČEVI DNEVI
Raziskovalni dnevi
laboratorijske biomedicine v okviru "Tedna
laboratorijske medicine – LABMEDFEST" bodo
posvečeni spominu prof. dr. Nika Jesenovca
30. september 2015 ~ Klinični inštitut za klinično kemijo in
biokemijo, Univerzitetni Klinični Center, Zaloška 2, Ljubljana.
ZBORNIK PREDAVANJ
7. JESENOVČEVI DNEVI – RAZISKOVALNI DNEVI
LABORATORIJSKE BIOMEDICINE
30. september 2015 ~ Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo,
Univerzitetni Klinični Center, Zaloška 2, Ljubljana.
Organizator srečanja: Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo (Univerzitetni
klinični center Ljubljana) in Katedra za klinično biokemijo (Fakulteta za farmacijo,
Univerza v Ljubljani)
Znanstveni in organizacijski odbor: Aleš Jerin , Janja Marc, Darko Černe, Alenka FranceŠtiglic, Nataša Karas Kuželički, Milan Skitek
Recenzenti: Janja Marc, Alenka France Štiglic, Nataša Karas Kuželički
Urednika: Milan Skitek in Darko Černe
Oblikovanje in prelom: Monika Skitek
Izdal: Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo (Univerzitetni klinični center Ljubljana)
in Katedra za klinično biokemijo (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)
Založnik: Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo (Univerzitetni klinični center Ljubljana)
Naklada: 100 izvodov
Tisk: Birografika Bori d.o.o., Ljubljana
CIP - Kataložni zapis o publikaciji
Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana
616-074(082)
616.61-074(082)
JESENOVČEVI dnevi (7 ; 2015 ; Ljubljana)
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine : zbornik predavanj / 7. Jesenovčevi dnevi, 30. september
2015, Ljubljana ; [organizator srečanja Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni
klinični center Ljubljana in Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani
; urednika Milan Skitek in Darko Černe]. - Ljubljana : Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo,
Univerzitetni klinični center, 2015
ISBN 978-961-6442-67-1
1. Gl. stv. nasl. 2. Skitek, Milan 3. Univerzitetni klinični center (Ljubljana). Klinični inštitut za klinično
kemijo in biokemijo 4. Fakulteta za farmacijo (Ljubljana). Katedra za klinično biokemijo
281334528
Donator raziskovalnega srečanja:
Hermes Analitica
PROGRAM SREČANJA
08:00
Registracija
09:00
Uvodni nagovor
Programme of meeting
Milan Skitek (Univerzitetni klinični center Ljubljana)
Darko Černe (Univerza v Ljubljani)
Farmakogenetika v laboratorijski medicini
Koordinatorica: Nataša Karas Kuželički
09:20
Pharmacogenomics, a new partner of TDM in clinical
practice
Marja-Liisa Dahl (Division of Clinical Pharmacology, Department of Laboratory
Medicine, Karolinska institutet, Švedska)
09:45
Farmakogenomika v personalizirani laboratorijski
medicini
Novejša dognanja pri odkrivanju in zdravljenju okvare ledvic
Koordinatorica: Alenka France-Štiglic
12:00
Milan Skitek, Aleš Jerin (Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni
klinični center Ljubljana)
12:20
Pomen farmakogenetke in TDM pri zdravljenju z
zaviralci TNF-alfa pri kronični vnetni črevesni bolezni
David Drobne, Gregor Novak, asist. Dr. Alojz Šmid (Klinični oddelek za gastroenterologijo
in hepatologijo, Interne klinike, Univerzitetni klinični center Ljubljana)
10:35
12:40
Kronična ledvična bolezen – kje smo in kako naprej
13:00
Uporaba vitamina D pri zdravljenju pacientov z IgA
nefropatijo
10:50
11:05
13:20
Proteolizni encim katepsin K in njegov vpliv na rakave
in matične celice možganskega tumorja gliobalstoma
Urška Verbovšek (Oddelek za genetsko toksikologijo in biologija raka, Nacionalni
inštitut za biologijo):
Vrednost urinskih kvantitativnih rezultatov v
medicinskem laboratoriju
Mladen Krsnik (Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni
klinični center Ljubljana)
13:40
Genetske preiskave pri spremljanju uspeha zdravljenja
bolnikov s kronično levkemijo
Tadej Pajič (Klinični oddelek za hematologijo, Interne klinike, Univerzitetni klinični
center Ljubljana)
Jelka Lindič (Klinični oddelek za nefrologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični
center Ljubljana)
Joško Osredkar, Tina Humar, Damjan Kovač (Klinični inštitut za klinično kemijo in
biokemijo, Klinični oddelek za nefrologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični
center Ljubljana)
Novi pristopi pri genotipizaciji polimorfizmov v genu
za CYP2D6
Irena Prodan Žitnik (Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v
Ljubljana)
Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na
srcu z novejšimi biooznačevalci
Jurij Matija Kališnik (Klinični oddelek za kirurgijo srca in ožilja, Kirurška klinika,
Univerzitetni klinični center Ljubljana)
Janja Marc (Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljana)
10:10
Okvara ledvic - vrednotenje in izziv za laboratorijsko
medicino
14:00
Mikroskopski pregled sedimenta seča
Mateja Šter (Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični
center Ljubljana)
Zaključna razprava
Koordinatorici: Nataša Karas Kuželički in Alenka France-Štiglic
KAZALO
9
BESEDA ORGANIZATORJA
15
FARMAKOGENETIKA V LABORATORIJSKI MEDICINI
16
Pharmacogenomics, a new partner of TDM in clinical practice
22
Farmakogenomika v personalizirani laboratorijski medicini
30
omen farmakogenetke in TDM pri zdravljenju z zaviralci TNF-alfa pri
P
kronični vnetni črevesni bolezni
42
Novi pristopi pri genotipizaciji polimorfizmov v genu za CYP2D6
50
Genetske preiskave pri spremljanju uspeha zdravljenja bolnikov s kronično
levkemijo
62
roteolizni encim katepsin K in njegov vpliv na rakave in matične celice
P
možganskega tumorja gliobalstoma
73NOVEJŠA DOGNANJA PRI ODKRIVANJU IN ZDRAVLJENJU
OKVARE LEDVIC
74
Okvara ledvic - vrednotenje in izziv za laboratorijsko medicino
84
Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na srcu z novejšimi
biooznačevalci
98
Kronična ledvična bolezen – kje smo in kako naprej
110
Uporaba vitamina D pri zdravljenju pacientov z IgA nefropatijo Kronična
130
Mikroskopski pregled sedimenta seča
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Beseda organizatorja
Ali stroka potrebuje znanost?
Prof.dr. Darko Černe
Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija
Prizadevamo si, da bi Jesenovčevi dnevi postali tradicionalni dogodek slovenske
medicinske biokemije. Zato se dobivamo zadnji dan septembra vsako leto. Toda
s kakšnim namenom? O tem lani nismo spregovorili. Namen Jesenovčevih
dnevov je poudariti in približati pomembnejše znanstvene dosežke stroki
medicinske biokemije. Številni raziskovalci (od fizikov do molekularnih biologov)
se danes deklarativno ukvarjajo z iskanjem novih bioloških označevalcev, ki
naj bi pripomogli k učinkovitejši diagnostiki in/ali terapiji, kar kaže na veliko
aktualnost naše discipline. Vendar Katedra za klinično biokemijo pri Fakulteti
za farmacijo in stroka medicinske biokemije, organizirana v mrežo zdravstvenih
laboratorijev institucijaliziranih na treh nivojih zdravstvene dejavnosti, ima s
tem že desetletne izkušnje. Zato je prav, da to našo družbeno odgovornost na
področju medicinske biokemije poudarimo in okrepimo.
Znanost ustvarja novo znanje, ki se lahko uporabi pri nadaljnjem razmišljanju ali
vsakdanjem življenju. Razvoj, napredovanje neke discipline je zagotovo odvisen
od temeljitega, izčrpnega in natančnega raziskovanja, brez predsodkov in
etično utemeljenega (1) in raziskovanje je pomembna za izboljšanje zdravstvene
oskrbe (2). Toda, ali stroka potrebuje znanost? Pri pripravi tega nagovora se mi
je seveda porodilo tudi obratno vprašanje: ali znanost potrebuje stroko? Odgovor
na slednje vprašanje je jasen: znanost nujno potrebuje stroko. Odnos znanosti
do stroke pa je, zanimivo, dualen. Znanost (pri tem mislim na medicinsko
biokemijo), ki ne dela za stroko, je je samó sáma sebi namen – izgubi smisel. Po
drugi strani pa znanost preneha biti znanost, ko se uporabi (aplicira) v stroki.
Medicinska biokemija in laboratorijska biomedicina sodi med tako imenovane
operativne discipline, tako kot farmacija in medicina, pa tudi gradbeništvo,
strojništvo, živilstvo itd (3). Pri operativnih disciplinah je delo institucionalizirano
v dve samostojni vertikali, medsebojno povezani in soodvisni: univerzitetna
vertikala in strokovna vertikala. Novo znanje, ustvarjeno v teh disciplinah preko
9
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
znanosti na univerzi, se uporablja v vsakdanjem življenju. Medicinske fakultete,
v slovenskem visokošolskem prostoru pa tudi Katedra za klinično biokemijo
Fakultete za farmacijo, sodelujejo z zdravstveno operativo, farmacevtske
fakultete s farmacevtsko industrijo, fakultete za gradbeništvo z gradbeno
operativo, itd. Fakultete te vrste imajo zunaj univerze od nje neodvisno
„infrastrukturo“, kamor se prenaša ter preskuša novo znanje. Pri teh disciplinah
je razmeroma lahko razločevati med znanostjo in stroko. Če se na univerzi z
znanstvenimi pristopi ustvarja novo znanje, poteka v stroki prenos rezultatov
znanosti in novega znanja v prakso.
V primeru medicinske biokemije in laboratorijske biomedicine sta obe vertikali
zelo dobro strukturirani. Na Katedri za klinično biokemijo in Fakulteti za farmacijo
poteka znanstveno, pedagoško in strokovno delo na treh bolonjskih stopnjah.
V prvi, dodiplomski stopnji je pouk usmerjen v pridobivanje temeljnih znanj in
kompetenc discipline, v drugi je večji poudarek tudi na pridobivanju osnovnih
raziskovalnih kompetenc, v tretji stopnji pa je pouk individualiziran ter usmerjen
v vzgojo znanstvenikov izbrane discipline. Strokovna vertikala so zdravstveni
laboratoriji organizirani na primarnem, sekundarnem in terciarnem nivoju
zdravstvene dejavnosti. Strokovna vertikala skrbi za razvoj stroke. V laboratorijih
univerzitetnih bolnic se goji vrhunska stroka. Iz nje izvirajo vedno nova vprašanja
in če je vrhunski strokovnjak tudi znanstvenik, išče in najde odgovore, jih
preskuša ter oceni kakovost svojega dela tudi z objavo v znanstvenem časopisju.
Če se v univerzitetni vertikali goji v glavnem temeljna znanost, se v njeni
komplementarni strokovni vertikali goji v glavnem uporabna znanost.
Med obema vertikalama so velike razlike, celo tako velike, da so za to potrebni
dve različni ministrstvi (Ministrstvo za izobraževanje, znanost in šport ter
Ministrstvo za zdravje). Toda za obstoj discipline in njen razvoj so nujna
povezovanja. Visokošolski učitelj, kot vrhunski znanstvenik, mora v sebi gojiti
tudi strokovnjaka in vrhunski strokovnjak mora v sebi gojiti tudi znanstvenika.
Visoko šolstvo, ki ne dela za stroko, je samó sáma sebi namen in stroka brez
znanosti zelo hitro postane samó še obrt. Tako kot sta si komplementarni barvi
v največji možni meri različni, pa se postavljeni enakovredno ena poleg druge
druga drugo krepita in skupaj ustvarjata izjemno močne slikovne učinke. Zato
moramo, v dobro sedanjosti in prihodnosti naše discipline in seveda pacienta
oz. bolnika krepiti medsebojno sodelovanje obeh vertikal. Sodelovanje med
Katedro za klinično biokemijo in nekaterimi terciarnimi zdravstvenimi laboratoriji
je že institucionalizirano, vendar ga je nujno še naprej krepiti in sodelovanje
razširiti še na ostale strukturne nivoje.
10
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
In kaj daje znanost stroki danes? Bliskovit napredek translacijske medicine
(pri tem mislim na razvoj omik) danes "kar bruha" potencialne nove biološke
označevalce. Pri mnogih novih bioloških označevalcih pravzaprav sploh še
ne poznamo njihove prave vlogo v etiologiji in patofiziologiji bolezni. Njihovo
potencialno uporabnost v vsakdanji klinični praksi je potrebno še preveriti, kar za
stroko pomeni zelo veliko dela. Ker živimo v času samooklicane z dokazi podprte
medicine, je sposobnost kritičnega razmišljanja ter proučevanja in vrednotenja
znanstvene literature nujna kompetenca vsakega zdravstvenega delavca.
Znanstveno delo omogoča pridobivanje kompetenc povezanih z kritičnim
razmišljanjem, pregledovanjem in interpretacijo literature, načrtovanjem študij,
tolmačenjem in objavljanjem podatkov ter novih dognanj, pomembno krepi
zavedanje o nujnosti multidisciplinarnih skupin znanstvenikov in strokovnjakov
iz prakse za doseganje novega znanja in komunikacije med njimi, pomembno
pa krepi tudi zavedanje po nujnosti vseživljenjskega učenja in usposabljanja (4).
Ob tem neizpodbitnem pomenu znanosti za stroko se seveda poraja vprašanje,
kako v neki disciplini ovrednotiti obseg znanosti in njeno kakovost. Znanost je
v načelu dostopna vsem ljudem, je mednarodna, nima meja. Njena kvantiteta
in kvaliteta se zato lahko vrednosti skozi objave in priznanje v mednarodnem
prostoru. Omenjen pristop ni idealen in zato pogosto kritiziran, vendar še
vedno najboljši možni.
Za današnje srečanje in sporočilo sem analiziral obseg in kvaliteto objav
slovenskih specialistov medicinske biokemije v obdobju zadnjih dvajsetih let. V
41,8 % vseh objav slovenskih specialistov medicinske biokemije naši specialisti
nastopajo v vlogi prvega ali vodilnega avtorja (Slika 1). To je dober podatek, saj
pomeni, da imajo specialisti medicinske biokemije v omenjenih raziskovanjih
pogosto odločilno vlogo. Bolj zaskrbljujoče pa je, da če odštejemo tri specialiste
medicinske biokemije, se število objav zmanjša za dobro polovico (na 47,6
%), če odštejemo 4 specialiste pa skoraj za 60 % (na 41,3 %). To pomeni, da
je raziskovanje osredotočeno na zelo majhno število specialistov medicinske
biokemije in da moramo v bodoče močno popularizirati raziskovanje tudi med
ostalimi specialisti medicinske biokemije, če želimo zagotoviti čim boljši razvoj
stroke. Dobro pa je, da pri tem ostaja delež objav s prvim ali vodilnim avtorstvom
vsaj približno enak: v vseh primerih okoli ali le malo pod 40 %.
11
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Slika 1. Analiza obsega mednarodnih objav specialistov medicinske biokemije. Raziskovanje je žal
osredotočeno na zelo majhno število specialistov medicinske biokemije.
Kaj pa odmevnost naših objav v mednarodnem prostoru? Z našimi objavami
dosegamo v povprečju 15,26 čistih citatov na eno mednarodno objavo
in 7,38 normiranih citatov. Če odštejemo štiri najbolje citirane specialiste
medicinske biokemije ostaja število doseženih čistih in normiranih citatov na
eno mednarodno objavo približno enako (15,76 in 7,9), kar je zelo razveseljujoč
podatek. To kaže, da se naši članki berejo in rezultati naših raziskav uporabljajo
oz. navajajo, nakazujejo torej vpliv naših raziskav v svetovni znanstveni sredini.
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Rad bi zaključil s sporočilom, da je za prihodnji obstoj in nadaljnji razvoj
slovenske medicinske biokemije nujna popularizacija in širitev znanosti na širši
krog specialistov medicinske biokemije. K realizaciji tega cilja želijo prispevati
tudi Jesenovčevi dnevi, katerih namen je izboljšati slišnost in prepoznavnost
raziskovanja na področji medicinske biokemije. Prvi del letošnjih Jesenovčevih
dnevov je posvečen farmakogenetiki v medicinski biokemiji. Želimo okrepiti
zavedanje, da je farmakogenetika v svetu in tudi pri nas povsem običajna
dejavnost medicinske biokemije. Farmakogenetika že dolgo omogoča
personalizirano medicino na področju hematologije in onkologije ter postaja
nujna spremljevalka TDM-a. Drugi del Jesenovčevih dnevov je posvečen novejšim
dognanjem pri odkrivanju in zdravljenju okvare ledvic. S slabšim delovanjem
ledvic se danes sooča okrog deset odstotkov odrasle populacije, zato to področje
predstavlja neizčrpen znanstveni izziv.
Literatura
1.
Mileder LP. Medical students and research: Is there a current discrepancy between education and demands? GMS Z Med Ausbild 2014; 31(2):Doc15.
2.Currat LJ, de Francisco A, Al-Tuwaijri S, Ghaffar A, Jupp S. The 10/90 Report on health
research 2003-2004. Geneve: Global forum for Health research, 2004. Spletna stran: http://
www.isn.ethz.ch/Digital-Library/Publications/Detail/?id=17141; dostopno 25.7. 2015.
3.
Kordaš M. Kaj je univerza in kaj medicina? ISIS 1998; 7(7): 22-6).
4.Griffin MF, Hindocha S. Publication practices of medical students at British medical
schools: experience, attitudes and barriers to publish. Med Teach 2011; 33(1):e1-8.
Slika 2. Analiza odmevnosti objav specialistov medicinske biokemije.
12
13
Farmakogenetika v
laboratorijski medicini
Pharmacogenomics, a new partner of TDM in clinical practice
Marja-Liisa Dahl
Farmakogenomika v personalizirani laboratorijski medicini
Janja Marc
Pomen farmakogenetke in TDM pri zdravljenju z zaviralci
TNF-alfa pri kronični vnetni
David Drobne
Gregor Novak
Alojz Šmid
Novi pristopi pri genotipizaciji polimorfizmov v genu za CYP2D6
Irena Prodan Žitnik
Genetske preiskave pri spremljanju uspeha zdravljenja bolnikov
s kronično levkemijo
Tadej Pajič
Proteolizni encim katepsin K in njegov vpliv na rakave in
matične celice možganskega tumorja gliobalstoma
Urška Verbovšek
14
15
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Pharmacogenomics, a new partner of TDM
in clinical practice
Marja-Liisa Dahl
Dept of Laboratory Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Karolinska Institutet, Karolinska
University Hospital, Stockholm, Sweden
Therapeutic drug monitoring (TDM) is one of the key clinical activities within
the discipline of clinical pharmacology. Already decades ago, it became clear
that for many pharmaceutical drugs, the administered dose itself was not
predictive of the individual drug exposure and corresponding clinical effects
and that drug dosage needed to be individualized in order to achieve best
therapeutic effect with a minimum of adverse effects. This stimulated the
development of analytical methods to actually measure systemic drug
concentrations during treatment as an aid to individualization of drug dosage.
This applied especially for drugs with a large inter-individual variation in
pharmacokinetics (PK), narrow therapeutic window, or critical thresholds for
pharmacological action. Important indications for TDM include, apart from
the abovementioned inter-individual PK variability, identification of intraindividual differences in PK due to for example drug interactions, variable
clearance over time in critically ill patients (e.g. in intensive care units),
variable compliance to prescribed dosage or conditions where treatment
failure and/or concentration-related adverse effects are unacceptable.
Tricyclic antidepressants, aminoglycosides, digoxin, theophylline, and
antiepileptic drugs were early examples of the application of TDM. Today,
TDM is routine also for immunosuppressants, lithium, many anti-infective
drugs and antipsychotics.
Today, in an era of Personalised Medicine, with the increasing understanding
of the molecular mechanisms behind inter- and intraindividual variability
in drug exposure and drug effects, great expectations have been posed
on pharmacogenetics/pharmacogenomics as a tool for individualized
pharmacotherapy. The early developments in this field dealt with drug
metabolising enzymes, especially the cytochromes P450 (CYP). In particular,
16
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 were early shown to be under genetic
regulation, allowing individuals to be classified, based on genotyping of
functional allele variants (causing lack of, decreased or increased enzyme
activity), as poor metabolisers (PM), intermediate and “normal” extensive
metabolisers (IM, EM), and in some cases as ultrarapid metabolisers (UM).
These three enzymes play a major role in the metabolism of a large number
of clinically important drugs of various therapeutic classes. Examples are
CYP2D6 and many antidepressants and antipsychotics as well as tamoxifen,
CYP2C19 and certain antidepressants and clopidogrel, and CYP2C9 and
coumarin anticoagulants and antidiabetic drugs. Consequently, there was
early enthusiasm on the possibility of prospectively predicting an individual´s
optimal dose requirement by genotyping, with the prospect of avoiding
time consuming dose adjustments, adverse effects and therapeutic failures.
There is by now a large body of evidence for the impact of specific CYP
genotypes on the PK of relevant drug substrates and also in some cases on
therapeutic outcomes. For certain drugs, guidelines have been developed for
genotype-based dosing (e.g. www.pharmgkb.org) and data on biomarkers
are increasingly included in drug labeling (www.fda.gov) (1). PK-related
biomarkers in drug labeling include apart from CYPs e.g. TPMT, phase II
enzymes and drug transporters. Other genomic biomarkers are related to
drug safety (e.g. HLA-B*5701 for Abacavir-induced skin reactions) or efficacy
(e.g. somatic tumor biomarkers).
It is important to remember that the metabolism of most drugs is not
catalyzed by one enzyme only but by several CYPs or other enzymes such
as UDT-glucuronosyltransferaras (UGTs). Relevant examples are CYP1A2
and CYP3A4/5 that are involved in the metabolism of many drugs in parallel
with the polymorphic CYPs and show not only large inter-individual but
also intra-individual differences in activity. This is due to induction and
inhibition by many drugs and other substances present in the environment,
such as polycyclic hydrocarbons in tobacco smoke inducing CYP1A2 and
many fruit juices inhibiting CYP3A. Polypharmacy is rather a rule than an
exception in many patients and drug-drug interactions are thus a major
cause of PK variability. The role of active drug transporters in the PK of drugs
is increasingly acknowledged. Gender, age, ethnicity and other diseases
may also influence enzyme activity and drug PK. We are only starting to
understand the possible impact of epigenetics. The clinical relevance of a
specific genetic polymorphism thus depends on the quantitative importance
of that specific protein for the total clearance of the drug, as well as whether
17
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
the parent compound, its metabolite(s) or both are pharmacologically
active. Moreover, even with the same drug exposure, individuals respond
variably. The pharmacodynamics of most drugs is complex and, similar to
PK, influenced by genetic, constitutional and environmental factors. Still,
the last few decades´ achievements in understanding the role of specific
enzymes in drug metabolism, and their molecular genetic and environmental
regulation have greatly improved our possibilities to individualise treatment
strategies.
TDM and pharmacogenetic testing have their pros and cons. The concept
of TDM includes not only the analysis as such using a quality-assured
methodology, but also preanalytical issues such as adequate sampling
time in relation to duration of drug treatment (usually steady state) and
drug intake (peak or trough levels), pre-analytical sample handling, as well
as post-analytical pharmacological interpretation of concentration data
taking these previously mentioned issues and clinical patient data into
account. Genotyping can, on the other hand, be performed in a sample taken
at any time, even prior to drug treatment. TDM is, however, in most cases
a more precise tool for determining the actual systemic drug exposure in
an individual and for predicting drug levels at target, than what is currently
possible from genotyping of drug metabolizing enzymes or transporters
which classifies individuals into only a few groups. The clinical relevance of
genotyping depends on how well the test covers the functional variants of
importance. Ethnic differences in allele distributions need to be taken into
account. It is to be stressed that when it comes to e.g. CYP genotyping, there
is also a large variation in enzyme activity even within a given genotype,
and an overlap between genotype groups, limiting the predictive value
of genotyping for drug PK in an individual patient. With TDM, changes
in exposure over time can be identified, due to e.g. varying compliance,
drug interactions, and influence of other environmental factors, age, or
concomitant disease. Prediction of individual drug dosage based on preemptive genotyping usually does not take other concomitant drugs or
other clinically relevant parameters into account. An exception is warfarin
for which algorithms including non-genetic information apart from CYP2C9
and VKORC1 genotypes have been developed (2,3).
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
performed, covering more than 100 different pharmaceutical entities. The
main groups are immunosuppressants (41%), antiepileptics (24%), antibiotics
(13%), followed by antipsychotic drugs (7%), antivirals (2-3%), antidepressants
(2%) and others including antifungals, opioids, digoxin etc. Analysis of
immunosuppressive drugs in blood has become an important clinical routine
for essentially all patients in the post-transplantation period. In contrast, TDM
of many anti-infective agents or psychotropic drugs is mainly performed
in selected cases of therapeutic failure, pronounced adverse effects, or
extreme variability in drug disposition. In the same year, the laboratory
carried out genotyping of about 2000 patient samples, about half of them
for TPMT, followed by HLA-B*5701 and CYP-genotyping. It is to be noticed
that other HLA genotyping as well as tumor genotyping are performed by
other laboratories than clinical pharmacology. TPMT genotyping is in most
cases performed in parallel with TPMT activity measurement. The high
frequency of TPMT and HLA genotyping can be explained by them being
included in local guidelines while CYP genotyping is mostly performed in
individual patients with either lack of effect, pronounced adverse effects
or as a follow-up of either extremely high or low concentrations in relation
to dose, as identified by TDM. Most CYP-genotyping samples come from
psychiatry. Examples of our experience with genotyping as a complement
to TDM will be discussed in more detail in the presentation.
Dept of Clinical Pharmacology at Karolinska University Hospital has performed
TDM as a clinical routine for about 40 years and introduced genotyping
services in the early 1990’s (4). In 2014, around 70 000 TDM analyses were
Although drug concentrations measured in a TDM laboratory are primarily
used to guide dosing during ongoing therapy, the information can also be
of great value for future patients. Drug concentration data and associated
clinical information accumulates into a database with potential for both
clinical pharmacological research and for improved communication of TDM
results to clinicians. Accumulated routine TDM data has successfully been
utilized to describe variability in concentration-to-dose ratios in a naturalistic
clinical setting, and to assess the impact of factors such as age, gender,
concomitant drugs and smoking (5,6). In addition, outliers with exceptionally
high or low drug exposure in relation to dosage can be identified for further
pharmacogenetic studies. Examples are early case reports describing patients
with extremely high and low concentrations of tricyclic antidepressants
due to slow and rapid CYP2D6 activity, respectively (7-8). In the case of
rapid metabolism, the patient could later be shown to have duplication
of a functional CYP2D6 gene, classifying her as an ultrarapid metaboliser
of CYP2D6 (9). Biobanking of DNA in parallel with routine TDM of large
patient groups also provides a valuable research material to be utilized for
18
19
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
later pharmacogenetic studies with new scientific questions (4,10). Thus,
pharmacogenetic testing and TDM are in many cases complementary
rather than exclusive (11-13). Genotyping may in certain cases prove to be of
particular relevance for drug and starting dose selection, but even wider for
understanding the reasons behind exceptionally high or low concentrationto-dose ratios, side-effects or lack of efficacy despite normally adequate
doses in individual patients.
References
1.Ehmann F, Caneva L, Prasad K, et al. Pharmacogenomic information in drug labels:
European Medicines Agency perspective. The Pharmacogenomics J 2015;15:201-210.
2.Wadelius M, Chen LY, Lindh JD, et al. The largest prospective warfarin-treated cohort
supports genetic forecasting. Blood 2009;113:784-92.
3.Lazo-Langner A, Kovacs MJ. Predicting warfarin dose. Curr Opin Pulm Med 2010;16:426-431.
4.Eliasson E, Lindh JD, Malmström RE, Beck O, Dahl M-L. Therapeutic drug monitoring
for tomorrow. Eur J Clin Pharmacol 2013;69:25-32.
5.Skogh E, Reis M, Dahl M-L, Lundmark J, Bengtsson F. Therapeutic drug monitoring
data on olanzapine and its N-demethyl metabolite in the naturalistic clinical setting.
Ther Drug Monit 2002;24:518-526.
6.Lind A-B, Reis M, Bengtsson F, et al. Steady state concentrations of mirtazapine,
N-desmethylmirtazapine, 8-hydroxymirtazapine and their enantiomers in relation to
cytochrome P450 2D6 genotype, age and smoking behavior. Clin Pharmacokinetics
2009;48:63-70.
7.Alván G, Bertilsson L, Dahl M-L, Ingelman-Sundberg M, Sjöqvist F. Moving toward
genetic profiling in patient care: the scope and rationale of pharmacogenetic/ecogenetic
investigation. Drug Metab Dispos 2001;29:580-585.
8.Bertilsson L, Åberg-Wistedt A, Gustafsson LL, Nordin C. Extremely rapid hydroxylation
of debrisoquine: a case report with implications for treatment with nortriptyline and
other tricyclic antidepressants. Ther Drug Monit 1985;7:478-480.
9.Bertilsson L, Dahl M-L, Sjöqvist F, et al. Molecular basis for rational megaprescribing
in ultrarapid hydroxylators of debrisoquine. The Lancet 1993;341:363.
10.Söderberg MM, Haslemo T, Molden E, Dahl M-L. Influence of FMO1 and 3
polymorphisms on serum olanzapine and its N-oxide metabolite in psychiatric patients.
Pharmacogenomics J 2013;13:544-550.
11.Dahl M-L, Sjöqvist F. Pharmacogenetic methods as a complement to therapeutic
monitoring of antidepressants and neuroleptics. Ther Drug Monit 2000;22:114-116.
12.Dahl M-L. Cytochrome P450 phenotyping/genotyping in patients receiving
antipsychotics: useful aid to prescribing? Clin Pharmacokinet 2002;41:453-470.
13.Sjöqvist F, Eliasson E. The convergence of conventional therapeutic drug monitoring
and pharmacogenetic testing in personalized medicine: focus on antidepressants.
Clin Pharmacol Ther 2007;81:899-902.
20
21
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Farmakogenomika in bolniku prilagojena
laboratorijska medicina
/ Pharmacogenomics and personalised laboratory medicine /
Janja Marc *
Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana
* On behaf of EFLM/ESPT working group for Personalised Laboratory medicine: Pazzagli M
(chair), Chresta C, Brandslund I, Vermish P, van Shaik R, Schwab M and Marc J
Povzetek
Končne definicije personalizirane medicine (bolniku prilagojene medicine) še
nimamo. Ena od njih pravi, da je bolniku prilagojena medicina medicinski model,
ki sloni na molekulskem profiliranju posameznika in omogoča izbor bolniku
prilagojene (prave) terapije ob pravem času oziroma ugotavlja nagnjenost
k bolezni ter uvaja preventivne, posamezniku prilagojene ukrepe ciljano in
pravočasno. V pogenomskem obdobju je razvoj novih instrumentalnih tehnik
in biostatističnih programov omogočil razvoj naprednih tehnologij »omic«. Te
tehnologije omogočajo analizo celotne skupine kemijsko podobnih molekul
kot je npr. genom, transkriptom, proteom, metabolom, epigenom, mikrobiom,
itd. v nekem biološkem sistemu (tkivo, celica). Posebnost bolniku prilagojene
(personalizirane) laboratorijske medicine je v tem, da se ne upira na spremembe
v koncentraciji ene same molekule (diagnostičnega kazalca) temveč na
spremembe profila molekul. Več kot je molekul, ki sestavljajo takšen profil bolj
natančen je opis in več posebnosti stanja pri posameznika odraža – bolj je torej
»oseben«. Od takšnega pristopa (medicinskega modela) si obetamo hitrejšo
in učinkovitejšo diagnostiko ter boljše in varnejše zdravljenje s tem pa tudi
hitrejše okrevanje in povrnitev zdravja. Bolniku prilagojena medicina v pravem
pomenu predstavlja nov pristop k diagnostiki in terapiji, ki temelji na rezultatih
naprednejših tehnologij »omik«. Stroka laboratorijske medicine se zaveda svoje
vloge v bolniku prilagojeni medicini, vendar bo potrebno uvesti določene ukrepe
in morda spremeniti organiziranost stroke ter predvsem povečati sodelovanje
med posameznimi disciplinami znotraj laboratorijske medicine.
22
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Ključne besede: napredne tehnologije omik, genom, proteom, transkriptom,
metabolom, diagnostični kazalec, biooznačevalec
Abstract
Final Definitions of personalized medicine is still lacking. One of them says that
personalized medicine refers to a medical model use the molecular profiling for
tailoring the right therapeutic strategy to the righ patients at right time and/or to
determine the predispossition to disease for deliver timely and targeted prevention.
In postgenome period, the development of new instrumental techniques and
biostatistics enable the development of “omic” advanced technologies. These
technologies allow to analyze the whole group of chemically similar molecules like.
genome, transcriptome, proteome, methabolome, epigenom, microbiom. etc. in a
biological system (tissue, cell).The specialty of personalized laboratory medicine
is that it is not based on only one (or few) measured concentration (diagnostic
marker), but on the profile of molecules. The more the molecules is included in
profiling more accurate is description of patients characteristics and therefore
description is more "personal". Such an approach (the medical model) shall offer
faster in more effective diagnosis with more effective and safer treatment and
hence faster recovery of health. Personalized medicine represents new medical
approach to the diagnosis and therapy based on the results of “omic” advanced
technologies. Profession of laboratory medicine is aware of its role in personalized
medicine, but it will be necessary to introduce specific measures and perhaps
change the organization of the profession, in particular to enhance cooperation
between the various disciplines within the laboratory medicine.
Key words: omic advance technology, genome, proteome, transcriptome,
metabolome, diagnostic marker, biomarker
1. Uvod
Tako farmakogenomiko kot bolniku prilagojeno (personalizirano) laboratorijsko
medicino bi figurativno lahko opisali »otroka moderne dobe«. Danes vstopata na
področje diagnostike in terapije skozi velika vrata in sta rezultat več desetletnega
23
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
razvoja visoko zmogljivih »omskih" tehnologij.Pričakuje se, da bosta pripomogli
k bolj točni diagnostiki ter učinkovitejši in varnejši ciljani terapiji in s tem bi
prispevali k hitrejšemu okrevanju po bolezni, višji kakovosti življenja pacientov
in hkrati k nižjim stroškom v zdravstveni blagajni. Zavedati pa se je potrebno ,
da bosta morala ta otroka skozi vsa razvojna obdobja predno bosta našla svoj
prostor v stroki, a ta pot bo lažja in hitrejša, če bomo mi, ki delujemo v stroki
razumeli pomen in sprevideli prednosti teh novih pristopov v zdravstvu.
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
v številu na ta način odkritih molekul, biooznačevalcev. Ko z proteomsko
analizo pregledujemo profil nekaj tisoč proteinov je seveda zelo verjetno,
da bomo odkrili nekaj deset ali sto proteinov, ki bi jih lahko opredelili kot
biološke označevalce. Lahko bi rekli, da omike predstavljajo prvi korak
nekakšno presejalno analizo, ki služi zgolj za identifikacijo potencialnih
biooznačevalcev, ki jih bomo morali v nadaljevanju s potrditveno metodo bolj
natančno kvalitativno ali kvantitativno oceniti. Po klinični evalvaciji in izračunu
diagnostične občutljivosti in specifičnosti, pa bi lahko nov biooznačevalec
uvedli v laboratorijsko diagnostiko kot diagnostični kazalec (slika 1).
2. Pogenomsko obdobje in napredne tehnologije omik
Po letu 2002, ko je bilo objavljeno zaporedje nukleotidov v humani DNA, torej
v pogenomskem obdobju, so se začele razvijati analizne metode, katerih
namen ni bil več analizirati nek posamezni analit (t.i. biokemijski kazalec),
temveč pridobiti celotno sliko – profil vseh kemijsko ali po funkciji podobnih
molekul v nekem biološkem sistemu. Nekaj podobnega sicer klinični kemiki že
poznamo, npr. elektroforeza serumskih proteinov, vendar so bili znanstveniki
pri razvoju teh tehnologij mnogo bolj ambiciozni. Želeli so razviti orodja, ki
bi omogočila pridobiti profil tisočih ali nekaj deset tisočih molekul, npr. kot
je profil proteinov v vzorcu urina za katerega danes vemo, da vključuje preko
2000 različnih proteinov in peptidov. Sočasen razvoj novih instrumentalnih
tehnik in biostatističnih programov je omogočil razvoj naprednih tehnologij
»omic«. Izraz »omike« je skrajšan izraz, ki zaobjema vsa področja celične
biologije, s končnico –omika, in sicer: genomiko, transkriptomiko, proteomiko,
lipidomiko, metabolomiko, epigenomiko, mikrobiomiko, idr. (1,2). Posamezno
področje omike pa proučuje določeno skupino molekul. Tako se npr. na
področju genomike analizira celoten genom in ne samo posamezne mutacije s
tehnologijo sekvenciranja nove generacije (new generation sequencing, NGS).
Podobno velja za analizo transkriptoma, kjer se analizira celoten set mRNA
pa tudi tRNA in rRNA v neki celici običajno z NGS ali biočip tehnologijama
. Analiza proteoma celice ali tkiva pomeni pregledati celotno proteinsko
sliko npr. v nekem biološkem vzorcu. Za analizo proteoma največ uporablja
masna spektroskopija podobno kot tudi za analizo metaboloma, torej profila
metabolitov v posameznih bioloških sistemih ali tkivih.
Ta »omski« pristop pa je zanimiv tudi za raziskovalce. Pomaga pri odkrivanju
in identifikaciji posamezne ali skupine molekul, ki se v patološkem vzorcu
izražajo drugače. Tudi ta pristop je kliničnim kemikom blizu, a ključna je razlika
24
Slika 1. Napredne tehnologije omik pri odkrivanju novih diagnostikov.
Bistvena prednost omskih tehnologij je v tem, da lahko »vidimo tudi tisto česar
ne gledamo«. Pri klasičnih analizah merimo samo tiste molekule (parametre),
za katere imamo reagente in za katere smo se vnaprej odločili, da jih želimo
izmeriti (»gledati«). Dobro se zavedamo, da je npr. ob nespremenjeni izmerjeni
količini albuminov v urinu, količina drugih proteinov lahko spremenjena, vendar
tega ne moremo potrditi, saj jih nismo »pogledali« - torej izmerili, analizirali.
Pri proteomski analizi urina pa pridobimo profil preko 2000 različnih proteinov
sočasno , torej so vključeni tudi tisti, ki jih sicer verjetno ne bi analizirali.
Zato predstavlja ta način najbolj inovativen pristop k odkrivanju in uporabi
biooznačevalcev. V znanosti stroki se je zanj uveljavil izraz »pristop brez hipoteze«
(»hypothesis less approach«). Glede na to kakšno skupino molekul analiziramo,
ločimo različne omske tehnologije npr. genomske tehnologije, transkriptomske
tehnologije, proteomske tehnologije in metabolomske tehnologije.
25
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
3.Napredne tehnologije omik in bolniku prilagojena laboratorijska
medicina
Posebnost bolniku prilagojene (personalizirane) laboratorijske medicine je
torej v tem, da se ne upira na spremembe v koncentraciji ene same molekule
(diagnostičnega kazalca) temveč na spremebe profila molekul. Več kot je
molekul, ki sestavljajo takšen profil bolj natančen bo opis in več posebnosti
stanja pri posameznika bo odražal – bolj bo torej »oseben«. Lahko bi rekli,
da s temi naprednimi tehnologijami s tem ko pregledamo celoten nabor
genov, proteinov, mRNA in metabolitov v izbranem vzorcu pridobivamo
pasameznikov genomski, proteinski, metabolomski ODTIS. Podobno kot
prstni odtis, je tudi npr. genomski odtis lasten posamezniku, torej unikaten.
Del genomskih odtisov služi danes za identifikacijo posameznikov v sodni
medicini.. Če že ne s posameznimi omskimi analizami, pa s kombinacijo leteh zagotovo zelo »poosebimo« nabor podatkov, ki so osnova nekakšnemu
»molekulskemu« prepoznavanju posameznika (3) (Slika 2). Čeprav prave
definicije personalizirane medicine še nimamo, je evropska komisija (2013)
predlagala naslednjo definicijo: »Personalized medicine refers to a medical
model use the molecular profiling for tailoring the right therapeutiv strategy
to the righ patients at right time and/or to determine the predispossition to
disease for deliver timely and targeted prevention.« (4)
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Ne glede na definicijo, cilj visoko zmogljivih naprednih tehnologije omik je
oblikovati profila skupine molekul, kot je npr. proteinski profil patološkega
urina ali metabolni profil izbranega punktata. Po primerjavi profila
bolnikovega vzorca s profili kontrolnega (zdravega) vzorca lahko hitro
prepoznamo odklone v preiskovanem vzorcu. Na osnovi profilov oz. odtisov
različnih molekul, lahko prepoznamo molekulske/biokemične posebnosti
posameznika ter jih pozneje uporabimo v njemu prilagojeni (potrditveni)
diagnostiki in (ciljani) terapiji. Nedvomno si od takšnega pristopa obetamo
hitrejšo in učinkovitejšo diagnostiko ter boljše in varnejše zdravljenje. s
tem pa tudi hitrejše okrevanje in povrnitev zdravja. Zaključili bi lahko, da
bolniku prilagojena medicina v pravem pomenu predstavlja torej nov pristop
k diagnostiki in terapiji, ki temelji na rezultatih naprednejših tehnologij.
Vendar se je že zgodaj pokazalo, da upravljanje s tako veliko količino
podatkov, kot so jih dajale genomske, proteomske, transkriptomske itd.
analize ni enostavno. Slednje je izpostavilo nov dodaten izziv povezan z
naprednimi tehnologijami omik. Razviti je bilo potrebno tudi visoko zmogljiva
bioinformacijska orodja in programe za odbiranje, sejanje, razvrščanje, in
povezovanje tisočih podatkov pred končno interpretacijo in končna vrednost
naprednih tehnologij omik za medicino bo tako v veliki meri odvisna od
umetne inteligence, ki doživlja intenziven razvoj.
4. Pacientu prilagojena laboratorijska medicina in farmakogenomika
Slika 2. Profili različnih bioloških molekul so potrebni za molekulsko prepoznavanje
posameznika (3).
26
Eno prvih področij na katerem se je bolniku prilagojena medicina začela
uporabljati v klinični praksi je farmakogenomika, področje, ki proučuje tiste
genetske spremembe, ki oblikujejo posameznika in njegov odziv na neko
zdravljenje. Vzrok za to so bile težave pri zdravljenju z nekaterimi zdravili.
Pokazalo se je, da teorija »One fits all« pri določenih terapijah ne vzdrži.
Po aplikaciji enakega odmerka iste učinkovine različnim posameznikom je
odziv na nekatera zdravila lahko zelo različen. Odziv je lahko premočan in
povezan neželenimi učinki (NŽU) ali pa je odziv preslab in so farmakološki
učinki zdravila prešibki. Obojemu lahko sledijo dodatni klinični zapleti, kar
slabša stanje bolnika in zvišuje stroške zdravljenja. Ocenjujejo, da v ZDA
vsako leto umre več kot 100.000 bolnikov zaradi NŽU, in pri skupno 2,2
miljona bolnikih se letno pojavljajo resni NŽU (5). Različen odziv na zdravilno
27
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
učinkovino je posledica številnih dejavnikov, pri čemer eni izhajajo iz stanja
organizma, drugi pa iz lastnosti zdravila. Številne od teh poznamo in vemo, da
npr. telesna teža, kajenje, jetrna funkcija, delovanje ledvic, fizična aktivnost
ali prehrana tukaj nekaj manjka, po drugi strani pa npr. fizikalno-kemične
lastnosti učinkovine in interakcije z drugimi učinkovinami določajo učinke
apliciranega zdravila. Genetske dejavnike, ki spreminjajo odziv posameznika
na zdravilen učinkovine, bi lahko uvrstili v prvo skupino. Teh dveh stavkov
ne razumem najbolje.
Geni naj bili odgovorni za 30-95% variabilnosti v odzivu na ZU . Večinoma gre
za gene tistih proteinov, ki so vključeni v sistem ADME. Mutacije (nivo DNA)
ali spremembe v izražanju teh genov (nivo RNA) lahko namreč spremenijo
učinkovitost npr. presnovnih encimov, transportnih proteinov ali receptorjev
s katerimi ineragira zdravilna učinkovina po aplikaciji. S tem lahko vplivajo
mutacije tako na farmakokinetične lastnosti (npr. hitrost presnove in
izločanja) kot tudi farmakodinamičnelastnosti zdravilne učinkovine (npr.
vezava ućinkovine na tarčni protein). Na primer, zelo pomembna je uvedba
farmakogenomike pred zdravljenjem z različnimi novimi tarčnimi zdravilnimi
učinkovinami. Tukaj se na osnovi farmakogenetičnega testiranja, ki vključuje
mutacijsko analizo tarčnega receptorja npr. HER2 in merjenje njegovega
izražanja odločajo, ali je biološko zdravilo (trastuzumab) sploh smiselno
aplicirati.
V nasprotju z drugimi dejavniki, kot sta npr. ledvična ali jetrna funkcija, se
značilnosti DNA tekom življenja ne spreminjajo in jih lahko odkrijemo že
v mladosti. S pomočjo farmakogenomskega testiranja pred uvedbo nove
terapije, lahko torej napovemo odziv posameznika (in NŽU) na aplicirano
zdravilo. S tem, ko to genetsko informacijo vključimo v nadaljnje ukrepanje
pa že vstopimo v individualizirano terapijo oz. »posamezniku prilagojeno
zdravljenje«, ki je del personalizirane oz. »bolniku prilagojene« medicine«(6).
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
»zlorabe« teh podatkov. Masa podatkov, ki je na voljo ob teh analizah zelo
natančno karakterizira posameznika, zato je potrebno poskrbeti za varnost
teh podatkov in dosledno slediti etičnim načelom, ki veljajo v laboratorijski
medicini. Rezultati ankete, ki jo je izvedla delovna skupina za personalizirano
laboratorisjo medicno pri EFLM (Eur. Federation of Lab Med in ESPT (Eur.
Soc. for Pharmacogenomics and Personal Therapy) je pokazala, da se stroka
laboratorijske medicine zaveda svoje vloge v personalizirani medicini kot
novem zdravstvenem modelu. Opozorila pa je na ukrepe, ki jih bo potrebno
uvesti in predvsem spremeniti organiziranost stroke. Potrebno bi bilo uvesti
naprednejše tehnologije in omogočiti izpopolnjevanje strokovnjakov LM
za pridobivanje kompetenc iz interpretacije in svetovanja ter predvsem
povečati sodelovanje med posameznimi disciplinami znotraj laboratorijkse
medicine (7).
Literatura
1.Noorbakhsh F, Atefeh A, Power C. Application of “Omics” Technologies for Diagnosis
and Pathogenesis of Neurological Infections. Curr Neurol Neurosci Rep 2015; 9:580.
2.Checa A, Bedia C, Jaumont J. Lipodomic data analysis: Tutorials, practical guidelines
and applications. Anal Chim Acta 2015; 885:1-16.
3.Topol E. Individualized Medicine from Prewomb to Tomb; Cell 2014; 157: 241-253.
4.Use »-omic« advanced technologies in the development of personalised medicine«
Commission staf working document, European Commission, Brussel 2013.
5.Chyka PV.How many deaths occur annually from adverse drug reactions in the united
states? Am J Med 2000;109:122–130.
6.MARC, Janja. Farmakogenomika - nova možnost za varnejše in učinkovitejše zdravljenje.
Farmacevtski vestnik 2011; l62: 51-56.
7.Malentacchi F, Mancini I, Brandslund I, et al. Is laboratory medicine ready for the era
of personalised medicine? Clin Chem Lab Med 2015; 53(2): i-iv.
5. Zaključek
Bolniku prilagojena laboratorijska medicina predstavlja nov pristop k
obravnavi bolnikov, ki sloni na molekulskem prepoznavanju posameznikovega
stanja. Masovni podatki, pridobleni z naprednimi tehnologijami omik,
bodo v polni meri izrabljeni šele z razvojem visoko zmogljivih inteligenčnih
sistemov. Ob veliki zmogljivosti teh tehnologij se je povečala tudi možnost
28
29
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Pomen farmakogenetike in določanja
koncentracij bioloških zdravil pri
zdravljenju z zaviralci TNF- α pri kronični
vnetni črevesni bolezni
/ TNF- α inhibitors in inflammatory bowel disease: the role of
pharmacogenetics and therapeutic drug monitoring /
Gregor Novak1, Lojze Šmid1, David Drobne1
1
niverzitetni klinični center Ljubljana, Klinični oddelek za gastroenterologijo in hepatologijo,
U
Japljeva 2, 1000 Ljubljana, Slovenija
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Abstract
Inflammatory bowel disease is a systemic disease of uncontrolled inflammation
in the gastrointestinal tract, which greatly reduces quality of life and can be
life-threatening. TNF-α inhibitors are highly effective drugs, however 10-40 % of
patients still do not respond (primary non-response). An even bigger issue is loss
of response after initial response, which occurs in every second patient or in 10 %
of patients per year (secondary failure). Primary non-response can be explained
with genetic differences between individual patients (genetic polymorphisms,
different pre-treatment expression of inflammatory genes in intestinal
mucosa). For secondary failure more important mechanisms are believed to
be pharmacokinetics and immunogenicity of TNF-α inhibitors; consequently,
with therapeutic drug monitoring it is possible to prevent secondary failure.
The article presents recent findings in the field of pharmacogenetics and
pharmacokinetics/immunogenicity of TNF-α inhibitors.
Keywords: therapeutic drug monitoring, pharmacogenetics, TNF-α
inhibitors, inflammatory bowel disease
Povzetek
Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je sistemska bolezen z nekontroliranim
vnetjem v prebavni cevi, ki močno zniža kvaliteto življenja bolnikov, včasih
pa bolnika tudi življensko ogroža. Zaviralci TNF-α so učinkovita zdravila za
zdravljenje te bolezni, vendar 10-40 % bolnikov ne odgovori na zdravljenje
(primarna rezistenca). Še večji problem je izguba učinka po začetnem odzivu,
kar se zgodi pri vsakem drugem bolniku oz. pri 10 % bolnikov letno (sekundarna
odpoved). Za primarno rezistenco naj bi bile odgovorne predvsem genetske
razlike med bolniki (genetski polimorfizmi, različna ekspresija genov v črevesni
sluznici pred uvedbo terapije), za sekundarno odpoved pa so pomembnejši
farmakokinetski mehanizmi in imunogenost zaviralcev TNF-α; posledično se
je izkazalo, da je možno z določanjem koncentracij zdravila (TDM) pri večini
bolnikov preprečiti sekunadno odpoved. V članku tako predstavljamo novosti
iz področja farmakogenetike in farmakokinetike zaviralcev TNF-α.
Ključne besede: določanje koncentracije zdravil, farmakogenetika, zaviralci
TNF-α, kronična vnetna črevesna bolezen
30
1. Uvod
Pri kronični vnetni črevesni bolezni (KVČB) gre za nekontrolirano vnetje v
prebavni cevi, ki poteka z zagoni in izboljšanji. Ločimo dva podtipa, in sicer
ulcerozni kolitis (UK) in Crohnovo bolezen (CB). Bolezen se kaže s krvavavimi
driskami, bolečinami v trebuhu, vročino, povišanjem vnetnih kazalcev,
utrujenostjo, slabokrvnostjo. Ne gre zgolj za bolezen prebavne cevi, ampak
za sistemsko bolezen, ki lahko poleg črevesa prizadene še številne druge
organske sisteme (koža, pljuča, oči, jetra, sklepi...) in močno zniža kakovost
življenja bolnikov. Zaradi nekontroliranega vnetja lahko bolniki tudi umrejo
zaradi sepse, kirurških ali trombemboličnih zapletov.
Cilj zdravljenja KVČB je torej popolna kontrola vnetne aktivnosti bolezni
v vseh prizadetih organih, v črevesju je cilj popolna zacelitev sluznice. S
konvencionalno terapijo (aminosalicilati, antibiotiki, imunomodulatorji,
enteralna prehrana, kortikosteroidi) smo pri zdravljenju uspešni zgolj pri
blagih do zmernih oblikah KVČB. Z uvedbo bioloških zdravil iz skupine
zaviralcev TNF-α v zdravljenje KVČB v začetku novega tisočletja se je na
31
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
tem področju zgodila prava revolucija, saj je s temi zdravili mogoče zdraviti
tudi težje oblike bolezni.
Tumor nekrotizirajoči faktor-α (TNF-α) je citokin s pomembno vlogo v
patogenezi KVČB. Zaviralci TNF-α so monoklonska protitelesa, ki vežejo
topni in membransko vezani TNF-α in s tem povzročijo nevtralizacijo prostega
TNF-α (t.j. vezavo topnega TNF-α) in indukcijo apoptoze mononuklearnih
vnetnih celic (z vezavo na membranski TNF-α receptor izražen na teh celicah)
– to vodi v kontrolo vnetja in s tem v remisijo bolezni.
Na slovenskem trgu imamo 3 različne zaviralce TNF-α, ki so registrirani
za bolnike s KVČB in sicer infliksimab, adalimumab in golimumab. Med
sabo se razlikujejo po načinu apliciranja in doziranju. Infliksimab se aplicira
intravenozno v zdravstveni ustanovi, medtem ko se ostala dva aplicirata
subkutano s strani bolnika v domačem okolju. Navadno pričnemo z
indukcijskim zdravljenjem (pri infliksimabu 5 mg/kg TT ob tednu 0-2-6), ki
mu sledi vzdrževalno zdravljenje (5 mg/kg TT/ 8 tednov).
Glavni problem zaviralcev TNF-α je primarna rezistenca in sekundarna
odpoved.
• O primarni rezistenci govorimo, kadar bolnik sploh ne odgovori na
uvedbo zaviralca TNF-α – takih bolnikov je od 10-40 %.
•Sekundrna odpoved pomeni, da bolnik najprej odgovori na zaviralec
TNF-α, nato pa postoma izgubi odgovor na zdravilo. To se zgodi pri
vsakem drugem bolniku oz. pri približno 10 %/ leto in v končni fazi
povzroči odpoved izbranega zaviralca TNF-α pri vsakem četrtem
bolniku.
Mehanizma primarne rezistence in sekundarne odpovedi sta različna. Pri
prvem domnevajo, da gre za farmakodinamski fenomen, in sicer za »ne-TNF-α
mehanizem«, kjer TNF-α ne igra odločilne vloge v vnetnem procesu. Slednje
pomeni, da so tudi ostala zdravila iz skupine zaviralcev TNF-α neučinkovita
in posledično slabo prognozo s pogosto potrebo po operativni terapiji.
Pri sekundarni odpovedi zdravila pa gre bolj za faramakokinetski fenomen,
predvsem zaradi imunogenosti zaviralcev TNF-α, saj pride med zdravljenjem
do tvorbe protiteles usmerjenih proti zdravilu in posledično do hitrejšega
klirensa zdravil.
Raziskave zadnjih let kažejo, da bi s pomočjo farmakogenetike in določanja
koncentracij zaviralcev TNF-α (TDM) lahko bistveno izboljšali učinkovitost
in dolgoročno uspešnost zdravljenja z zaviralci TNF-α. Spodaj prikazujemo
rezultate nekaterih raziskav in možnosti bolniku prilagojenega zdravljenja.
32
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
2. Pomen farmakogenetike pri zdravljenju z zaviralci TNF-α
2.1 Ugotavljanje/predvidevanje primarne rezistence
Mehanizem primarne rezistence ni znan; mnogi verjamejo, da bo genetika
pojasnila vzrok. Študije polimorfozmov v genih, značilnih za KVČB, so
identificirale nekatere alelne variante, ki so povezane z večjo ali manjšo
možnostjo, da bo bolnik odgovoril na zaviralec TNF-α. Žal doslej še ni bil
identificiran noben pomembnejši polimorfizem, na osnovi katerega bi lahko
jasno predvideli, kateri bolniki bodo odgovorili na zdravljenje z zaviralci
TNF-α. Odziv na zdravljenje z infliksimabom pri Crohnovi bolezni je bil sicer
povezovan s polimorfizmi v številnih genih (genih za ligand Fas, kaspazo 9,
FCGR3A itd.) (1). Slovenska raziskovalna skupina je pokazala, da je dober odziv
na zdravljenje z adalimumabom pri CB povezan s polimorfizmom v genu za
ATG16L1, ki je vpleten v avtofagijo. Pri 85 % bolnikov z genotipom CT ali TT
so opažali odziv na zdravljenje in le pri 37,5 % bolnikov z genotipom CC (2).
Ekspresijske študije so pokazale, da so določeni geni v biopsijah sluznice
črevesa pri bolnikih, ki odgovorijo na zaviralce TNF-α, močneje izraženi kot
pri tistih, ki ne odgovorijo na terapijo. Tako je na primer Arijs s sodelavci
ugotovila, da lahko na podlagi različne ekspresije že petih genov (TNFAIP6,
S100A8, IL-11, G0S2 in S100A9) v sluznici kolona pred uvedbo infliksimaba
pri bolnikih s Crohnovim kolitisom napovemo, kateri bolniki bodo odgovorili
na zdravljenje in kateri ne, z 100% točnostjo (3). Podobne so bile ugotovitve
pri UK, kjer lahko napovemo, kateri bolniki bodo odgovorili na zaviralce
TNF-α na podlagi ekspresije genov (TNFRSF11B, STC1, PTGS2, IL-13R alfa2,
IL-11; vsi vpleteni v pridobljeni imunski odziv), z 95% občutljivostjo in 85%
specifičnostjo (4).
2.2 P
redvidevanje/preprečevanje sekundarne odpovedi zaviralcev
TNF-α
Pred kratkim so pokazali (zaenkrat objavljeno le v obliki abstrakta), da
je prisotnost alela HLA-DRB1*03 neodvisni napovedni dejavnik razvoja
protiteles. Pri bolnikih s protitelesi je bil prisoten v 13 %, pri bolnikih brez
protiteles pa v 4 % (OR 3,6). Prisotno arginina na poziciji 74 in odsotnost
33
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
glutamata na poziciji 71 v β1- verigi proteina HLA-DR je povezana z razvojem
protiteles proti infliksimabu; to sekvenčno zaporedje je prisotno pri 95 %
bolnikov z alelom HLA-DRB1*03, kar je dodaten dokaz za vlogo alela v
razvoju protiteles. Prisotnost alela HLA-DRB1*03 pri bolniku, ki potrebuje
zdravljenje z infliksimabom, tako vpliva na obravnavo bolnika: potrebni
so preventivni ukrepi za zmanjšanje imunogenosti (indukcijska doza
infliksimaba, kombinirana terapija z imunomodulatorjem, pogosto merjenje
koncentracij zdravila) (5).
3.Določanje koncentracije zdravila in protiteles proti zdravilu v
serumu (TDM)
Med faktorji, ki privedejo do izgube učinka zaviralcev TNF-α, se v literaturi
omenjajo nizke serumske koncentracije zdravila in prisotnost protiteles
proti zaviralcem TNF-α, ki so posledica imunogenosti. Protitelesa se vežejo
na zdravilo (t.j. protitelo proti TNF-α) in zmanjšajo njegovo učinkovitost.
Z vezavo na Fab podenoto zdravila protitelo onemogoči vezavo liganda
(t.j.TNF-α), z vezavo na ostale dele zdravila pa vpliva na farmakokinetiko,
saj pospeši imunsko pogojeno odstranjevanje zdravila preko retikuloendotelijskega sistema. Meritev se izvede tik pred naslednjo aplikacijo
zdravila, ko je koncentracija zdravila v serumu najnižja (TL; angl. trough
level) (6). Večina študij je bila opravljena z infliksimabom, zato se bomo v
prispevku osredotočili nanj. Prikazali bomo, kje v zdravljenju z infliksimabom
je TDM pomembna in vpliva na odločitev o zdravljenju.
3.1 TDM med indukcijskim zdravljenjem
Nizke koncentracije zaviralca TNF-α in protiteles proti zdravilu v času
indukcije kažejo na poddoziranje zdravila. Z optimizacijo odmerka (dvig doze,
skrajšanje intervala med aplikacijami) zagotovimo zadostno koncentracijo
zdravila v krvi in induciramo remisijo bolezni. Primer je akutni hudo-potekajoč
ulcerozni kolitis, kjer gre za hudo sistemsko vnetje z visokimi koncentracijami
TNF-α, ki porabljajo velike količine zdravila. Poleg tega gre za pospešen
metabolizem infliksimaba ter izgubo zdravila preko vnete črevesne stene
v lumen črevesa, zato pričakujemo nizke koncentracije zdravila v krvi.
34
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Dokazali so, da s pospešeno indukcijo (3 aplikacije infliksimaba povprečno
v 24 dneh) v primerjavi s standardnim režimom (3 aplikacije infliksimaba ob
tednu 0-2-6) zmanjšamo potrebo po zgodnji totalni kolektomiji (odstranitvi
celotnega debelega črevesja) iz 40 % na 6,7 % (7).
Nizke koncentracije zdravila so lahko tudi med indukcijo posledica
imunogenosti. Nedavno je bilo ugotovljeno, da se protitelesa proti
infliksimabu pojavijo zelo zgodaj, lahko že po prvi infuziji infliksimaba (8).
Če so torej koncentracije zaviralca TNF-α nizke ob hkratnih visokih vrednostih
protiteles, gre za zgodnjo sekundarno odpoved. Z zamenjavo zdravila za
drug zaviralec TNF-α lahko induciramo remisijo bolezni.
TDM med indukcijo lahko torej prepreči napačen zaključek, da gre za primarno
rezistenco zaviralcev TNF-α. Pomaga pri odločitvi za optimizacijo zdravljenja
z infliksimabom pri poddoziranju ali zamenjavo za drug zaviralec TNF-α
pri zgodnji sekundarni odpovedi. S tem prepreči nepotrebne operacije in
zamenjave za omejen spekter zdravil drugih skupin, ki so navadno manj
učinkovita (9).
3.2 TDM po indukciji
Bolniki s CB z dolgotrajnim odzivom na zaviralce TNF-α so imeli po indukciji
(14. teden) višje vrednosti TL od bolnikov, pri katerih je prišlo do izgube
odziva na zdravljenje. Vrednosti TL nad 3,5 µg/mL (in upad CRP) po indukciji
napovedujejo dolgotrajen odziv na vzdrževalno zdravljenje pri bolnikih s
povišanim CRP pred uvedbo infliksimaba. Pri bolnikih z TL pod 3,5 µg/mL pa
bi bilo smiselno dvigniti TL z optimizacijo odmerka (ali pa pogosto spremljati
TL) in s tem preprečiti padec koncentracije infliksimaba pod mejo zaznave
in s tem razvoj protiteles, ki se pojavijo ob epizodičnih aplikacijah (10).
Podobna so spoznanja pri ulceroznem kolitisu, kjer koncentracije TL 14. teden
po začetku indukcije nad 2,5 µg/mL napovedujejo manj akutnih zagonov
bolezni in manjšo stopnjo kolektomij kot koncentracije pod to vrednostjo (11).
Zgodnja določitev TL po indukciji lahko napove dolgoročni klinični odgovor
za zdravljenje z zaviralci TNF-α.
3.3 TDM v remisiji bolezni
Znana je povezava med TL in klinično remisijo pri KVČB; višje vrednoti TL
pomenijo boljši nadzor nad boleznijo. Tako je povprečna vrednost TL pri
35
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
bolnikih s KVČB v klinični remisiji 2,6 µg/mL, pri bolnikih v klinični remisiji
z nizkim CRP-jem (klinična in biokemična remisija) 3,5 µg/mL, pri bolnikih v
klinični remisiji s kalprotektinom pod 250 (marker vnetne aktivnosti v črevesni
steni, ki korelira z endoskopsko remisijo) pa 4,9 µg/mL (12).
Študija TAXIT je dokazala, da je v klinični remisiji imelo kar 9 % bolnikov
vrednosti TL pod mejo zaznave in od teh 77 % prisotna protitelesa proti
infliksimabu (13). Ti bolniki lahko imajo aktivno bolezen, ki je klinično tiha,
ali pa bo kmalu prišlo do zagona bolezni.
Vaughn s sodelavci je primerjal proaktiven TDM s titracijo zdravila do ciljnih
TL s standardnim režimom apliciranja infliksimaba. Ciljno vrednost zdravila so
postavili med 5 in 10 µg/mL: pri bolnikih z nižjimi TL so povišali dozo zdravila
in skrajšali interval, obratno so storili pri previsokih TL. Pri vrednostih TL nad
5 µg/mL je verjetnost, da so ostali na vzdrževalni terapiji z infliksimabom,
več kot 90 % (HR 0,1 (95% CI:0,02-0,4)). Noben od bolnikov z vrednostmi v
zaželjenem intervalu ni prenehal z zdravilom zaradi poslabšanja osnovne
bolezni ali infuzijske reakcije, kar pa se je zgodilo v skupini bolnikov s
standardnim režimom, kjer je najverjetneje prišlo do razvoja protiteles (14).
Visoke vrednosti TL imajo malo verjetno korist, zato je umestno (čeprav ne
dokazano) bolnikom z visokimi TL znižati odmerke zaviralca TNF-α, saj gre
za zelo draga zdravila. Tako so v študiji TAXIT pri vrednostih TL nad 7 znižali
odmerek zdravila ali podaljšali interval doziranja do vrednosti TL med 3 in
7. Pri tem niso opažali izgube učinka zdravila ali poslabšanja bolezni do
skupnega opazovanega časa 1 leto, so se pa znižali stroški zdravljenja zaradi
nižjih doz zdravil (13). Zaenkrat sicer zgornja koncentracija infliksimaba, ki je
še koristna za bolnika, ni znana, vendar se verjetno giblje med 7 in 10 (12-14).
Glavni pomen TDM med remisijo je identifikacija bolnikov z nizkimi ali
nezaznavnimi vrednostmi TL in optimizacija zdravljenja, ki lahko prepreči
zagon bolezni in razvoj protiteles s sekundarno odpovedjo.
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Pri koncentraciji protiteles proti infliksimabu nad 9 µg/mL-eq optimiziranje
odmerka ni bilo uspešno v 90 %, v tem primeru se je za boljšo izbiro pokazala
zamenjava za drug zaviralec TNF-α. Pri bolnikih z nizkimi ali nezaznavnimi
vrednostmi tako TL kot protiteles pa je bilo najuspešnejše optimiziranje
odmerka infliksimaba. Meritve TL pred in po optimiziranju odmerka so
pokazale pomen protiteles. Ob prisotnih visokih titrih protiteles pred
optimizacijo (>9 µg/mL-eq) se nivo TL po optimizaciji terapije ni spremenil
(nevtralizacija zdravila s prisotnimi protitelesi), pri nezaznavnih ali nizkih
titrih protiteles (<9 µg/mL-eq) pa je prišlo do pomembnega porasta TL po
povišanju odmerka (15).
TDM je torej pomemben pri izgubi odziva ob vzdrževalni terapiji z zaviralci
TNF-α za odločitev glede ustrezne intervencije, kar pogosto predstavlja
klinično dilemo. TDM pomaga pri odločitvi v več kot dveh tretjinah bolnikov,
poleg tega je takšen način obravnave bolnikov tudi stroškovno ugodnješi.
Slednje je dokazala danska študija, ki je primerjala optimizacijo odmerka
infliksimaba pri izgubi odziva na podlagi TDM in glede na običajno klinično
prakso. Pri zdravljenju po algoritmu s TDM so bili stroški zdravljenja bistveno
nižji (34 %) ob podobni uspešnosti zdravljenja in kvaliteti življenja bolnikov
(16).
3.5 TDM ob prehodu iz kombinirane terapije na monoterapijo
Izraelska raziskava je analizirala uspešnost različnih intervencije pri izgubi
odziva na zdravljenje z zaviralci TNF-α glede na nivoje TL ter protiteles.
Ugotovili so, da pri vrednostih TL za infliksimab nad 3,8 µg/mL optimiziranje
odmerka istega ali zamenjava za drug zaviralec TNF-α ni uspešna v 90 %.
Nivoji nad to vrednostjo predstavljajo zadostne količine zdravila, zato so se
za uspešnejše izkazale zamenjave za zdravila izven skupine zaviralcev TNF-α.
Kombirana terapija infliksimaba in imunomodulatorja (azatioprin,
6-merkaptopurin, metotreksat) je pri bolnikih, ki predhodno niso jemali teh
zdravil, uspešnejša kot monoterapija (17), zato se terapija z infliksimabom
načeloma vedno začne kot kombinirana terapija. Pomen kombinirane terapije
je predvsem v prvih mesecih zdravljenja, saj imajo ti bolniki višje vrednosti TL
kot bolniki na monoterapiji z infliksimabom (1,44-krat) in redkeje razvijejo
protitelesa. Zaradi stranskih učinkov kombinirane terapije (malignomi,
okužbe) pa je potrebno čimprej po doseženi remisiji bolezni ukiniti eno od
imunosupresivnih zdravil, bodisi imunomodulator bodisi infliksimab.
V primeru, da se zdravnik odloči za ukinitev infliksimaba in prehod na
monoterapijo z azatioprinom, imajo TL nad 2 µg/mL negativno napovedno
vrednost za remisijo bolezni po prehodu na monoterapijo z azatioprinom
(HR 0,4 (95% CI: 0,19-0,91)) (18). Če imaš torej pred ukinitvijo visok nivo TL,
to pomeni, da je zdravilo prisotno v krvi in verjetno sodeluje v doseganju
remisije bolezni. Po ukinitvi infliksimaba, zato tvegaš zagon.
36
37
3.4 TDM ob zagonu bolezni
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
V primeru, da se zdravnik odloči za ukinitev azatioprina in prehod na
monoterapijo z infliksimabom, imajo visoki nivoji TL ob prehodu iz
kombinirane na monoterapijo pozitivno napovedno vrednost za dolgotrajno
remisijo; bolniki TL nad 5 µg/mL nimajo ponovnega zagona bolezni, tisti z
nezaznavnimi TL pa imajo že v nekaj mesecih spet zagon bolezni (19).
4. Sklep
3.6 TDM pri ponovni uvedbi infliksimaba po prekinitvi
Pri izbiri zaviralca TNF-α so nam lahko v pomoč molekularne tehnike:
Ponovna uvedba infliksimaba po več kot 6 mesečni prekinitvi terapije (angl.
drug holiday) je povezana z povečano možnostjo infuzijskih reakcij in z
neučinkovitostjo, saj so bolniki, ki so bili že predhodno izpostavljeni zdravilu,
lahko razvili protitelesa proti zdravilu. Posledično je do pred kratkim veljalo,
da se bolnikom, ki so bili v preteklosti že izpostavljeni infliksimabu, ponovno
ne uvaja zdravila.
Nedavna raziskava pa je pokazala, da je ponovna uvedba zdravila varna
(infuzijske reakcije v 20 % bolnikov) in učinkovita (odziv na zdravljenje pri
84,5 % bolnikov pri 14 tednih in 70 % po enem letu). Pomembno je le, da se
zdravila ne uvede bolnikom, ki so imeli v preteklosti infuzijske reakcije ali
dokazano sekundarno odpoved zaradi tvorbe protiteles proti infliksimabu.
Podobni so bili izsledki, do katerih je prišel Louis s sodelavci, kjer je bila
ponovna uvedba infliksimaba varna in uspeša (remisija) pri 88 % bolnikov (18).
S pomočjo TDM se da napovedati, kateri bolniki lahko varno in učinkovito
ponovno začnejo terapijo že po prvi oz. drugi ponovni infuziji infliksimaba.
Bolniki, ki so imeli v serumu po ponovni infuziji protitelesa in nizke nivoje
TL, niso imeli koristi od zdravljenja in so imeli pogoste infuzijske reakcije. Na
drugi strani vrednosti TL nad 2 µg/mL oz. odsotnost protiteles po ponovni
izpostavitvi infliksimabu napovedujejo dolgoročno uspešnost zdravljenja.
Odsotnost protiteles se je izkazala za edini napovedni dejavnik za varno
ponovno uvedbo infliksimaba (20).
3.7 TDM pri subkutanih zaviralcih TNF-α
Določanje TL in protiteles pri subkutanih zaviralcih TNF-α (adalimumab,
golimumab) lahko pomaga odkriti nekompliantne bolnike (zdravilo si
aplicirajo sami v domačem okolju), saj imajo ti bolniki ves čas nezaznavne
nivoje.
38
Koncept personalizirane medicine prodira v obravnavo bolnikov s KVČB, saj
lahko pomaga pri problemu primarne rezistence in sekundarne odpovedi
zaviralcev TNF-α. Pri problemu primarne rezsitence ima vlogo predvsem
farmakogenetika, pri problemu sekundarne odpovedu pa TDM.
•ekspresija genov v biopsijah črevesne sluznice z visoko natančnostjo
identificira bolnike s primarno rezistenco;
•genetski polimorfizmi (ligand Fas, ATG16L1, itd.) dobro korelirajo s
primarno rezistenco, vendar so zaenkrat neuporabni v klinični praksi
zaradi nizke absolutne napovedne vrednosti; in
•bolniki z HLA-DRB1*03 so bolj podvrženi tvorbi protiteles proti
infliksimabu.
Ko je terapija s zaviralcem TNF-α enkrat uvedena, nam TDM omogoča bolj
optimalno obravnavo:
•TDM ob indukciji: prepreči napačno odločitev, da gre za primarno
rezistenco in s tem omogoči optimizacijo odmerka (poddoziranje) ali
zamenjavo za drug zaviralec TNF-α (zgodnja sekundarna odpoved
zaradi imunogenosti);
•
TDM po indukciji: napove dolgoročni učinek zdravljenja;
•TDM v remisiji: omogoča optimizacijo odmerka zdravila, s čimer
preprečimo zagon bolezni ali razvoj protiteles;
•TDM ob zagonu bolezni: loči farmakokinetični od farmakodinamičnega
razloga poslabšanja bolezni in vodi v ustrezno terapevtsko odločitev;
•TDM pred prehodom iz kombinirane terapije na monoterapijo: omogoča
predvideti dolgoročni učinek zdravljenja in varno ukinitev kombinirane
terapije;
•TDM tik po ponovni uvedbi zdravila po daljši prekinitvi: omogoča
predvideti varnost in dolgoročni učinek zdravljenja; in
•
TDM pri subkutanih zaviralcih TNF-α: omogoča nadzor kompliantnosti.
39
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
V Sloveniji smo pričeli s personalizirano medicino na področju KVČB med
prvimi v Evropi, srečujemo pa se z logističnimi (zamudno in drago pošiljanje
biološkega materiala v tujino) in finančnimi težavami, saj se zaenkrat nivoji
bioloških zdravil določajo le v tujini.
Literatura
1.Pierik M, Rutgeerts P, Vlietinck R, et al. Pharmacogenetics in inflammatory bowel
disease. World J Gastroenterol 2006;12:3657–3667.
2.Koder S, Repnik K, Ferkolj I, et al. Genetic polymorphism in ATG16L1 gene influences the
response to adalimumab in Crohn’s disease patients. Pharmacogenomics 2015;16:191204.
3.Arijs I, Quintens R, Van Lommel L, et al. The predictive value of epithelial gene
expression profiles for response to infliximab in Crohn’s disease. Inflamm Bowel Dis
2010;16:2090-2098.
4.Arijs I, Li K, Toedter G, et al. Mucosal gene signatures to predict response to infliximab
in patients with ulcerative colitis. Gut 2009;58:1612-1619.
5.Billiet T, Vande Casteele N, Van Stappen T, et al. Immunogenicity to infliximab is
associated with HLA-DRB1. Abstract. Gut 2015;64:1344–1345.
6. Chaparro M, Guerra I, Muñoz-Linares P, et al. Systematic review: antibodies and antiTNF-α levels in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 2012;35:971-986.
7.Gibson DJ, Heetun ZS, Redmond CE, et al. An Accelerated Infliximab Induction Regimen
Reduces the Need for Early Colectomy in Patients with Acute Severe Ulcerative Colitis.
Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:330-335.
8.Ungar B, Chowers Y, Yavzori M, et al. The temporal evolution of antidrug antibodies in
patients with inflammatory bowel disease treated with infliximab. Gut 2014;63:125864.
9.Papamichael K, Gils A, Rutgeerts P, et al. Role for therapeutic drug monitoring
during induction therapy with TNF antagonists in IBD: evolution in the definition and
management of primary nonresponse. Inflamm Bowel Dis 2015;21:182-197.
10.Cornillie F, Hanauer SB, Diamond RH, et al. Postinduction serum infliximab trough
level and decrease of C-reactive protein level are associated with durable sustained
response to infliximab: a retrospective analysis of the ACCENT I trial. Gut 2014;63:17211727.
11.Arias MT, Vande Casteele N, Vermeire S, et al. A panel to predict long-term outcome
of infliximab therapy for patients with ulcerative colitis. Clin Gastroenterol Hepatol
2015;13:531-538.
12.Roblin X, Rinaudo M, Jarlot C, et al. OPOO5 Infliximab trough level thresholds vary
depending on the efficacy criterion chosen for IBD patients. Oral presentation, ECCO
congress, Barcelona 2015.
13.Niels Vande Casteele, Marc Ferrante, Gert Van Assche, et al. Trough Concentrations
of Infliximab Guide Dosing for Patients With Inflammatory Bowel Disease.
Gastroenterology 2015;148:1320–1329.
40
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
14.Vaughn BP, Martinez-Vazquez M, Patwardhan VR, et al. Proactive therapeutic
concentration monitoring of infliximab may improve outcomes for patients
withinflammatory bowel disease: results from a pilot observational study. Inflamm
Bowel Dis 2014;20:1996-2003.
15.Yanai H, Lichtenstein L, Assa A, et al. Levels of drug and antidrug antibodies are
associated with outcome of interventions after loss of response to infliximab or
adalimumab. Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:522-530.
16.Steenholdt C, Brynskov J, Thomsen O, et al. Individualised therapy is more costeffective than dose intensification in patients with Crohn’s disease who lose response
to anti-TNF treatment: a randomised, controlled trial. Gut 2014;63:919-927.
17.Colombel JF, Sandborn WJ, Reinisch W, et al. Infliximab, azathioprine, or combination
therapy for Crohn’s disease. N Engl J Med 2010;362:1383–1395.
18.Louis E, Mary JY, Vernier-Massouille G, et al. Maintenance of remission among patients
with Crohn's disease on antimetabolite therapy after infliximab therapy is stopped.
Gastroenterology 2012;142:63-70.
19. Drobne D, Bossuyt P, Breynaert C, et al. Withdrawal of Immunomodulators After
Co-treatment Does Not Reduce Trough Level of Infliximab in Patients With Crohn’s
Disease. Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:514-521.
20. Baert F, Drobne D, Gils A, et al. Early Trough Levels and Antibodies to Infliximab Predict
Safety and Success of Reinitiation of Infliximab Therapy. Clin Gastroenterol Hepatol
2014;12:1474-1481.
41
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Novi pristopi pri genotipizaciji
polimorfizmov v genu za CYP2D6
/ Novel approaches to CYP2D6 genotyping /
Irena Prodan Žitnik1, Vid Mlakar1, Janja Marc1
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za klinično biokemijo, Aškerčeva 7,
1000 Ljubljana
1
Povzetek
Ocenjujejo, da citokrom P450 2D6 (CYP2D6) sodeluje pri metabolizmu 20-25
% zdravilnih učinkovin, ki se uporabljajo v klinični praksi, kot so npr. nekateri
antidepresivi, antipsihotiki, antiaritmiki, antagonisti beta adrenergičnih
receptorjev, opioidni analgetiki in protitumorske učinkovine. Zaradi številnih
polimorfizmov v genu za CYP2D6, se aktivnost encima in s tem presnova
teh zdravil med posamezniki zelo razlikuje. Aktivnost encima lahko sega od
nezaznavne pri slabih presnovnikih do visoke pri ultrahitrih presnovnikih. S
pomočjo genotipizacije polimorfizmov lahko predvidimo aktivnost encima in
presnovo zdravil pred začetkom zdravljenja in, da bi se izognili neželenim učinkom
oziroma zmanjšani učinkovitosti zdravila, odmerke ustrezno prilagodimo,
kar predstavlja korak k individualizaciji zdravljenja. Običajne metode so pri
genotipizaciji velikega števila polimorfizmov zamudne in drage, zato smo želeli
vpeljati metodo, ki bi omogočila hkratno analizo več polimorfizmov. Z metodo
podaljševanja začetnih oligonukleotidov smo uspešno genotipizirali 11 klinično
najpomembnejših polimorfizmov v eni reakciji in s tem bistveno skrajšali čas
analize ter zmanjšali stroške.
Ključne besede: polimorfizmi CYP2D6, individualizirano zdravljenje,
podaljševanje začetnih oligonukleotidov
42
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Abstract
It is estimated, that cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) enzyme plays an important
role in the metabolism of 20-25 % of all clinically used drugs, for example certain
antidepressants, antipsychotics, antiarrhythmics, beta-blockers, opioid analgesics
and anticancer agents. Due to the highly polymorphic status of the CYP2D6 gene,
the enzyme is very variable in activity, ranging from zero in poor metabolizers to
high in ultra rapid metabolizers. Preemptive genotyping for the CYP2D6 allele
variants enables identification of patients with impaired or increased metabolic
phenotypes and can help with individualization of therapy. Conventional methods
for analysis of that many allele variants are time consuming and expensive and
fast and reliable multiplex method is needed for simultaneous analysis of multiple
polymorphisms. With the use of Multiplex Single Base Primer Extension Method
we successfully genotyped 11 clinically most important CYP2D6 polymorphisms
and substantially reduced the time and cost of the analysis.
Keywords: CYP2D6 polymorphisms, individualized therapy, multiplex
single base primer extension method
1. Uvod
Citokrom P450 2D6 (CYP2D6) sodeluje pri metabolizmu 20-25 % klinično
pomembnih zdravilnih učinkovin (1). Tipični CYP2D6 substrati so lipofilni
in vključujejo učinkovine iz številnih terapevtskih skupin, kot so na primer
nekateri antidepresivi (amitriptilin, citalopram, imipramin, nortriptilin,…),
antipsihotiki (klorpromazin, klozapin, haloperidol, risperidon, …), antiaritmiki
(propafenon, …), antagonisti beta adrenergičnih receptorjev (metoprolol,
timolol,…), opioidni analgetiki (kodein, morfin, tramadol), protitumorske
učinkovine (tamoksifen, debrizokin, gefitinib,…) in drugi (2).
Gen za CYP2D6 je zelo polimorfen (do danes je znanih več kot 100 alelnih
različic (3)) in zaradi številnih polimorfizmov obstajajo velike interindividualne
razlike v aktivnosti encima. Preiskovance lahko na podlagi CYP2D6 genotipa
razdelimo v 4 skupine: normalne, počasne, vmesne in ultrahitre presnovnike. Pri
počasnih presnovnikih je encimska aktivnost CYP2D6 nezaznavna, presnova
zdravilnih učinkovin, ki se presnavljajo s CYP2D6, pa upočasnjena. Plazemske
koncentracije teh zdravilnih učinkovin so pri običajnem odmerjanju pri počasnih
43
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
presnovnikih zvišane, delovanje učinkovin je podaljšano, tveganje za pojav
neželenih učinkov pa povečano. Zato počasni, v primerjavi z normalnimi
presnovniki, pogosto potrebujejo nižje odmerke zdravil. Možna je tudi
zmanjšana učinkovitost predzdravil, katerih pretvorbo v aktivni metabolit
katalizira CYP2D6. V nasprotju s počasnimi presnovniki, je pri ultrahitrih
presnovnikih, ki imajo zaradi duplikacije ali multiplikacije gena za CYP2D6 več
kot dva funkcionalna alela, učinkovitost zdravil v običajnih odmerkih lahko
zmanjšana in potrebujejo za ustrezno delovanje višje odmerke, pri uporabi
predzdravil pa se pri njih pogosteje pojavijo neželeni stranski učinki (4, 5).
Genotipizacija bolnikov pred začetkom zdravljenja omogoča identifikacijo
bolnikov z različnimi CYP2D6 fenotipi in pomaga pri individualizaciji zdravljenja.
2. Analiza polimorfizmov CYP2D6
Za genotipizacijo polimorfizmov CYP2D6 se običajno uporablja metoda
alelne diskriminacije s hidrolizirajočimi sondami, ki je pri analizi večjega števila
polimorfizmov zamudna in draga, saj je potrebno izvesti več ločenih in zaporednih
analiz (genotipizacij). Zato smo želeli vpeljati metodo, ki bi omogočila hkratno
določitev 11-ih klinično najpomembnejših polimorfizmov CYP2D6 v čim krajšem
času. Za analizo smo izbrali metodo podaljševanja začetnih oligonukleotidov
(angl. Multiplex Single Base Primer Extension Method), ki temelji na podaljševanju
neoznačenih začetnih oligonukleoidov, ki se komplementarno vežejo na dele
gena tik pred posameznimi polimorfizmi, za en nukleotid (Slika 1).
polimorfno mesto
ACGCTGGGCTGCACGCTAC
NNNNTGCGACCCGACGTGCGATGGNNNNNNN
Legenda:
ddGTP – dideoksi gvanozin trifosfat;
ddATP – dideoksi adenozin trifosfat;
ddTTP – dideoksi timidin trifosfat;
ddCTP – dideoksi citidin trifosfat.
ddTGP
ddATP
ddTTP
ddCTP
ACGCTGGGCTGCACGCTACC
NNNNTGCGACCCGACGTGCGATGGNNNNNNN
kapilarna elektroforeza, detekcija
barva = genotip
Legend:
ddGTP – dideoxy guanosine triphosphate;
ddATP – dideoxy adenosine triphosphate;
ddTTP – dideoxy thymidine triphosphate;
ddCTP – dideoxy cytidine triphosphate.
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Podaljšanje za točno en nukleotid dosežemo z uporabo dideoksinukleozid
trifosfatov (ddNTP), s katerimi DNA polimeraza podaljša začetne
oligonukleotide na polimorfnih mestih. Metoda je primerna za analizo
polimorfizmov posameznih nukleotidov ter nekaterih krajših insercij ali
delecij. Podobna metoda je že opisana (7), vendar smo jo za uporabo v
našem laboratoriju morali ustrezno optimizirati.
Z metodo podaljševanja začetnih oligonukleotidov smo določili genotipe 11-ih
klinično najpomembnejših polimorfizmov v genu za CYP2D6 in sicer: 100C>T,
2850C>T, 1023C>T, 1661G>C, 1707delT, 1846G>A, 2549delA, 2613-15delAAG,
2988G>A, 3183G>A in 4180G>C. Najprej smo z metodo verižne reakcije s
polimerazo pomnožili celoten gen CYP2D6 in produkt dolžine 5,1 kb uporabili
v reakciji podaljševanja začetnih oligonukleotidov. Za analizo polimorfizmov
smo oblikovali 11 specifičnih začetnih oligonukleotidov, ki se prilegajo delu
gena CYP2D6 tik pred posameznimi polimorfizmi in se med seboj v dolžini
razlikujejo za 4-5 nukleotidov (Tabela 1). Razlika v dolžini omogoča kasnejšo
ločbo podaljšanih začetnih oligonukleotidov s kapilarno elektroforezo.
Tabela 1: Sekvence in dolžine uporabljenih začetnih oligonukleotidov
Table 1: Sequence and length of interrogation primers
Polimorfizem
Sekvenca začetnega oligonukleotida
100 C>T
ACGCTGGGCTGCACGCTAC
19
2850 C>T
TTAGCTTCAATGATGAGAACCTG
23
1023 C>T
(T)7ACCGCCCGCCTGTGCCCATCA
28
1661 G>C
(T)12CGAGCAGAGGCGCTTCTCCGT
33
1707 delT
(T)18GCAAGAAGTCGCTGGAGCAG
38
1846 G>A
(T)25CCGCATCTCCCACCCCCA
43
2549 delA
(T)27GATGAGCTGCTAACTGAGCAC
48
2613-15 delAGA
(T)32GCCTTCCTGGCAGAGATGGAG
53
4180 G>C
(T)37GTGTCTTTGCTTTCCTGGTGA
58
2988 G>A
(T)44AGTGCAGGGGCCGAGGGAG
63
3183 G>A
(T)46TGTCCAACAGGAGATCGACGAC
68
Slika 1. Princip metode podaljševanja začetnih oligonukleotidov (povzeto po (6)).
Figure 1. Principle of the Single Base Primer Extension Method (adapted from (6)).
44
45
Dolžina
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Po reakciji podaljševanja začetnih oligonukleotidov s fluorescentno
označenimi ddNTP, smo produkte ločili s kapilarno elektroforezo, ki ji je
sledila detekcija fluorescence. Rezultati so prikazani na Sliki 2.
Slika 3. Rezultati sekvenčne analize za polimorfizma 3183 G>A (A) in 2988 G>A (B).
Modro sta označena začetna oligonukleotida, ki jima sledi polimorfno mesto. A: GG
homozigot za polimorfizem 3183 G>A; B: GA heterozigot za polimorfizem 2988 G>A.
Figure 3. Sequencing results for 3183 G>A (A) in 2988 G>A (B) polymorphisms.
Interrogation primers are represented in blue and next to them on the right is the polymorphic
site. A: GG homozygous individual for 3183 G>A polymorphism. B: GA heterozygous
individual for 2988 G>A polymorphism
Slika 2. Rezultati genotipizacije 11-ih CYP2D6 polimorfizmov z metodo podaljševanja
začetnih oligonukleotidov.
Prvi in zadnji vrh (13 in 88 nt) predstavljata velikostna standarda, vmes so podaljšani
začetni oligonukleotidi. Barva vrhov označuje za kateri polimorfizem gre.
Figure 2. Results of primer extension method for CYP2D6 genotyping.
First and last peak represent the size standard and in between are the extended interrogation
primers. Color of the peaks denotes the type of polymorphism.
3. Sklep
Rezultate smo potrdili s sekvenčno analizo. Primera rezultatov sekvenčne
analize za polimorfizma 2988 G>A in 3183 G>A sta prikazana na Sliki 3.
Metoda podaljševanja začetnih oligonukleotidov je učinkovita, hitra in
cenovno ugodna metoda za hkratno genotipizacijo več polimorfizmov
posameznih nukleotidov ter krajših insercij ali delecij, s katero smo uspešno
genotipizirali 11 polimorfizmov v genu za CYP2D6 v eni reakciji. Z vključitvijo
specifičnih začetnih oligonukleotidov za dodatne polimorfizme v reakcijsko
zmes je možno nabor preiskovanih polimorfizmov tudi razširiti, z nadaljnjo
optimizacijo pa načrtujemo z opisano metodo analizirati tudi prisotnost
delecij ali duplikacij gena za CYP2D6.
46
47
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Literatura
1.Ingelman-Sundberg M. Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2D6
(CYP2D6): clinical consequences, evolutionary aspects and functional diversity. The
pharmacogenomics journal 2005; 5: 6-13.
2.PharmGKB. https://www.pharmgkb.org/gene/PA128#tabview=tab3&subtab=33,
dostopno: 26.7. 2015.
3.Ulrich MZ. Genetic variability of CYP2D6: basic and clinical aspects. In CYP2D6:
Genetics, Pharmacology and Clinical Relevance. Future Medicine Ltd, 2014: 28-41.
4.Teh LK,Bertilsson L. Pharmacogenomics of CYP2D6: molecular genetics, interethnic
differences and clinical importance. Drug metabolism and pharmacokinetics. 2012;
27: 55-67.
5.Marc J. Farmakogenomika – nova možnost za varnejše in učinkovitejše zdravljenje.
Farmacevtski vestnik 2011; 62: 51-56.
6.Life technologies. SNaPshot® Multiplex System for SNP genotyping. Product bulletin.
https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/cms_101014.pdf, dostopno:
26.7. 2015.
7.Sistonen J, Fuselli S, Levo A, Sajantila A. CYP2D6 genotyping by a multiplex primer
extension reaction. Clinical chemistry 2005; 51: 1291-1295.
48
49
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Genetske preiskave pri spremljanju uspeha
zdravljenja bolnikov s kronično mieloično
levkemijo
/ Molecular genetic tests and monitoring of the therapy in chronic
myeloid leukemia patients /
Tadej Pajič1, Irena Preložnik Zupan1, Mateja Grat2, Peter Černelč1
Univerzitetni klinični center Ljubljana, Interna klinika, Klinični oddelek za hematologijo,
Zaloška cesta 7, Ljubljana
2
Splošna bolnišnica Celje, Oblakova ulica 5, Celje
1
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Abstract
Chronic myeloid leukemia (CML) is caused by the formation of BCR-ABL1
fusion gene, which is also a molecular marker for the disease. Development of
targeted drugs, BCR-ABL1 tyrosine kinase inhibitors, has changed the strategy
for treatment of CML and improved the quality of life and survival rates of
the patients. Majority of patients develop stable and durable deep molecular
response. However, some of them are resistant to TKI. Point mutations in
the ABL1 kinase domain of BCR-ABL1 protein are a frequent mechanism of
resistance to TKI therapy. Therefore, molecular genetics tests have become
very important in monitoring of treatment of CML patients with TKI. Here, we
describe our experiences of the molecular genetics methods used for diagnosis
and monitoring the therapy of CML patients.
Key words: Chronic myeloid leukemia, BCR-ABL1, inhibitor of tyrosine
kinase, molecular genetic tests
Povzetek
Kronično mieloično levkemijo (KML) označuje zliti gen BCR-ABL1. Z razvojem
tarčnih zdravil, zaviralcev tirozin-kinaze (TKI) BCR-ABL1, se je strategija
zdravljenja KML povsem spremenila, kakovost življenja izboljšala, preživetje
bolnikov pa podaljšalo. Večina bolnikov doseže stabilne in trajne globoke
molekularne odzive. Manjši del bolnikov s KML je neodzivnih na zdravljenje s
TKI ali pa bolezen napreduje kljub zdravljenju. Pojav točkovnih mutacij v ABL1
kinazni domeni beljakovine BCR-ABL1 je eden pogostih dejavnikov, ki vpliva
na neodzivnost za zdravljenje s TKI. Zato so molekularno genetske metode
postale zelo pomembne pri oceni uspeha zdravljenja bolnikov s KML. Opisujemo
naše izkušnje z molekularno genetskimi metodami za ugotavljanje bolezni in
spremljanje uspešnosti zdravljenja bolnikov s KML.
Ključne besede: Kronična mieloična levkemija, BCR-ABL1, zaviralec tirozinkinaze, molekularno genetske preiskave
1. Uvod
Kronična mieloična levkemija (KML), je maligna bolezen krvotvorne matične
celice, ki jo uvrščamo med mieloproliferativne novotvorbe (1, 2). Zanjo je
značilen zliti gen BCR-ABL1, ki nastane kot posledica dvojne zamenjave
(recipročna translokacija) kromosomskih delov med kromosomoma 9
(9q34.1), na katerem se nahaja gen ABL1, in 22 (22q11.2), na katerem se
nahaja gen BCR. Nastaneta dolg kromosom 9 (9+) in skrajšan kromosom
22, imenovan kromosom Philadelphia (Ph; (t(9;22)(9q34.1; 22q11.2)) (3, 4).
Na kromosomu Ph nastali zliti gen BCR-ABL1 kodira zapis za tirozin-kinazo
BCR-ABL1. Protein BCR-ABL1 vpliva na stalno aktivacijo signalnih poti v
celici, poveča se proliferacija in prepreči apoptoza (celična smrt) celic (5).
Zliti gen BCR-ABL1 ugotovimo tudi pri 20 - 40 % odraslih bolnikov z akutno
limfoblastno levkemijo celic B (B-ALL) in v 2 - 5 % B-ALL pri otrocih. Zelo
redko ga odkrijemo pri bolnikih z akutno mieloično levkemijo (< 1%) (1, 6).
Beljakovina BCR-ABL1 je tarča za ciljano zdravljenje z zaviralci tirozin-kinaze
(TKI). Prva učinkovina iz skupine TKI, ki so jo uporabili za zdravljenje, je
bila imatinib mesilat (imatinib). Ta je povsem spremenil kakovost življenja
50
51
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
in preživetje bolnikov s KML v primerjavi s prejšnjimi zdravljenji. Molekula
imatiniba se veže v aktivno mesto encima, ga blokira in omogoči proces
apoptoze celic (1). Danes za zdravljenje KML uporabljamo tudi drugo
generacijo TKI, nilotinib in dasatinib, ki sta še močnejša zaviralca BCR-ABL1
tirozin-kinaze. Omogočata hitrejše in globlje odzive na zdravljenje. Način
zdravljenja je odvisen tudi od obdobja bolezni KML: kronično, pospešeno ali
blastna preobrazba. Pospešeno obdobje in blastno preobrazbo lahko skupaj
opredelimo tudi kot napredovalo obdobje. Natančnejši načini zdravljenja
so opisani drugje (4, 7).
Genetska nestabilnost spremenjenega klona celic lahko vodi do neodzivnosti
(rezistenco) na zdravljenje in do napredovanja bolezni, nastanka sekundarne
akutne levkemije (8). V primeru neodzivnosti na zdravljenje ali ko bolezen
napreduje kljub zdravljenju s TKI, se odločimo za druga zdravila ali presaditev
krvotvornih matičnih celic (PKMC)(7).
Uspešnost zdravljenja spremljamo s celotno krvno sliko, standardizirano
kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (kvantitativni
PCR) in/ali s citogenetsko preiskavo ter preiskavo FISH. V primeru rezistence
na zdravljenje s TKI, poslabšanja (nepojasnena anemija, levkopenija in
trombocitopenija) oz. napredovanja bolezni opravimo še dodatne preiskave,
kot so citogenetska preiskava vzorca kostnega mozga za oceno drugih
kromosomskih sprememb v celicah s kromosomom Ph (Ph+) ali brez
kromosoma Ph (Ph-) , ugotavljamo pridobljene mutacije v genu BCR-ABL1,
ki lahko vplivajo na učinek zdravljenja s TKI, in citološki ter histološki pregled
kostnega mozga (7).
V nadaljevanju opisujemo molekularno genetske preiskave, ki so pomembne
za postavitev diagnoze KML ter spremljanja učinka zdravljenja s TKI.
2.Ugotavljanje specifičnih BCR-ABL1 mRNA prepisov z obratnim
prepisovanjem in verižno reakcijo s polimerazo
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
naključnih ali specifičnih oligonukleotidov in encimov reverznih transkriptaz.
Komplementarna DNA je osnova za verižno reakcijo s polimerazo (Reverse
Transcriptase and Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) (6).
Pri nastanku Ph kromosoma lahko nastane eden izmed več vrst fuzijskih
genov BCR-ABL1 in tako tudi več vrst prepisov BCR-ABL1. To je odvisno
od tega, kje se je zgodil prelom znotraj gena BCR (ima 23 eksonov) in gena
ABL1 (ima 11 eksonov). Medtem, ko so prelomi na kromosomu 9 večinoma
v 5' koncu gena ABL1 v intronu 1, se prelomi na kromosomu 22 v genu BCR
lahko zgodijo na štirih mestih in sicer:
•v tki. večjem prelomnem področju (major breakpoint cluster region M-bcr), ki obsega eksone 12 do 16 (prvotno so bili ti eksoni označeni
od b1-b5),
•
anjšem prelomnem področju (minor breakpoint cluster region m
m-bcr), kjer se prelom zgodi znotraj širokega področja v intronu 1,
•
ikro prelomnem področju (mikro breakpoint cluster region - μ-brc),
m
ki obsega eksone 19 do 21 in
•nano prelomnem področju (nano breakpoint cluster region - ν-brc),
ki obsega eksona 6 in 7.
Pri KML se najpogosteje pojavita prepisa vrste e13a2 ali e14a2, ki nastaneta
iz fuzijskega gena BCR-ABL1, kjer se prelom v genu BCR zgodi v področju
M-bcr in v intronu 1 gena ABL1. Prepisa vrste e13a2 ali e14a2, zelo redko
oba, ugotovimo pri kar 98 % bolnikov s KML. Prepisa kodirata protein BCRABL1 molekularne mase 210000 (p210). Zelo redko lahko pri KML ugotovimo
prepis vrste e1a2, ki se prepiše iz fuzijskega gena BCR-ABL1, ki je nastal
zaradi prelomov v manjšem prelomnem področju (minor breakpoint cluster
region ali m-bcr) gena BCR in intronu 1 gena ABL. Prepis kodira protein
BCR-ABL1 molekularne mase 190000 (p190). Druge vrste prepisov zelo
redko ugotovimo pri KML.
Regije, v katerem se izvrši prelom v genu, so lahko široke tudi nekaj 10 kilobaznih
parov (kbp), tako da za zaznavo strukturnih kromosomskih nepravilnosti
kot npr. translokacij, ni mogoče uporabiti PCR na osnovi genomske DNA.
Zato pri večini levkemij uporabimo himerično, specifično informacijsko RNA
(messenger RNA, mRNA), ki jo izoliramo iz levkocitov kostnega mozga ali
periferne krvi. To prepišemo v komplementarno DNA (cDNA) z uporabo
Prepisa vrste e13a2 ali e14a2 ugotovimo tudi pri 25 % bolnikov z BCR-ABL1
pozitivno B-ALL. V 70 % bolnikov z BCR-ABL1 pozitivno B-ALL pa ugotovimo
prepis vrste e1a2. Drugi prepisi pri B-ALL so prav tako redki.
52
53
Kot presejalna preiskava za ugotavljanje BCR-ABL1 mRNA prepisov je zelo
uporabna metoda hkraten PCR (multiplex PCR). Ta omogoča, da lahko v
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
eni reakciji s pomočjo več parov oligonukleotidov ugotavljajmo več iskanih
BCR-ABL1 cDNA segmentov značilnih za različne fuzijske prepise BCRABL1. V našem laboratoriju smo za ugotavljanje BCR-ABL1 prepisov uvedli
metodo hkratnega PCR po referenci (9). Postopek smo modificirali tako, da
smo za reakcijo PCR izbrali takšno Taq DNA- polimerazo, ki omogoča hitro
in specifično pomnoževanje ciljnega odseka cDNA in tako hitro pridobitev
rezultata. Sam PCR je končan v eni uri. V primeru pozitivnega rezultata
v multipleks PCR-ju opravimo še potrditveni PCR, s katerim natančneje
opredelimo vrsto prepisa BCR-ABL1 (9).
V obdobju od 30.06.2011 do 30.06.2015 smo pri 85 bolnikih s sumom na
KML ugotovili značilen BCR-ABL1 mRNA prepis v našem laboratoriju.
Mediana starosti bolnikov je bila 61 let, razpon od 11 do 90 let. Od tega je
bilo 44 moških in 41 žensk. Izmed njih sta bila dva bolnika stara 11 in 15 let.
Pri 83/85 (98 %) bolnikom smo ugotovili bodisi e13a2 ali e14a2 BCR-ABL1
prepis. Prepis e13a2 smo ugotovili pri 35/85 (41 %), prepis e14a2 pa pri 48/85
(57 %) bolnikov. Pri 2/85 (2 %) smo ugotovili prepis e1a2. Naši rezultati so
skladni s podatki iz literature.
Preiskava ugotavljanja specifičnega BCR-ABL1 prepisa je del algoritma
opredelitve mieloproliferativnih novotvorb (MPN) po klasifikaciji Svetovne
zdravstvene organizacije (SZO) in je ena izmed najpogostejših preiskav v
našem laboratoriju. Določitev vrste prepisa je nujno potrebna tudi zato, ker
imamo v našem laboratoriju (tudi večina drugih laboratorijev) za tri najbolj
pogoste BCR-ABL1 prepise, e13a2, e14a2 in e1a2, razvite kvantitativne PCR.
Ta preiskava je najpomembnejša preiskava za spremljanje učinkovitosti
zdravljena bolnikov s KML.
3.Določitev ravni izražanja gena BCR-ABL1 z obratnim
prepisovanjem in kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo
v realnem času (RT-qPCR)
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Že pred časom so ugotovili, da je raven izražanja gena BCR-ABL1 v levkocitih
periferne krvi in kostnega mozga skladna. Skladna je tudi s številom
levkemičnih celic v telesu. Metoda je zelo občutljiva, ker z njo lahko ugotovimo
eno levkemično celico med 100.000 ali več normalnih celic (10). Zato lahko
to metodo uporabimo za določitev minimalne preostale bolezni in tako
določitve molekularnega odziva. Molekularni odziv (MolO) opredelimo kot
zmanjšanje ravni izražanja gena BCR-ABL1, to je zmanjšanje ravni BCRABL1 mRNA prepisa (prepis) določenega z RT-qPCR. MolO je del ocene
uspešnosti zdravljenja in ga merimo po treh, šestih in dvanajstih mesecih
od začetka zdravljenja s TKI , nato vsake tri mesece prva tri leta, nato na 3
do 6 mesecev (4, 7).
Raven izražanja gena BCR-ABL1 predstavlja razmerje med številom kopij
prepisa BCR-ABL1 in številom kopij prepisa referenčnega gena, običajno gena
ABL1 (tudi BCR, β-glukoronidaza (GUSB)), določenih z RT-qPCR. Razmerje
lahko izrazimo kot delež, odstotek (%) na mednarodnem desetiškem
logaritemskem merilu (mednarodno merilo, International Scale, IS), kjer
10 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,0032 % in 0,001 % ustreza zmanjšanju za 1, 2,
3, 4, 4.5 in 5 logaritmov pod začetno standardno vrednostjo 100 %, ki so jo
določili v raziskavi IRIS (11, 12). Mednarodno merilo so predlagali izbrani
strokovnjaki Nacionalnega inštituta za zdravje leta 2006 (12). Osnova za
mednarodno desetiško logaritemsko merilo (12) sta vrednosti 100 % in
0,1 %. Obe vrednosti so določili v raziskavi IRIS, kjer je bila vrednost 100
% določena kot mediana razmerij števila kopij BCR-ABL1 in številom kopij
referenčnega gena BCR 30 nezdravljenih bolnikov v kroničnem obdobju
bolezni. Vrednost 0,1 %, ki so jo imenovali kot glavni MolO (MolO; Major
Molecular Response, MMR), je za tri desetiške logaritme zmanjšanje ravni
BCR-ABL1 mRNA prepisa od začetne standardne vrednosti 100 %. V tej
raziskavi so ugotovili, da je velika večina bolnikov s KML, zdravljenih z
imatinibom, dosegla popolni citogenetski odgovor in da imajo bolniki, ki
dosežejo glavni MolO po 18 mesecih zdravljenja z imatinibom, zelo veliko
verjetnost, da bolezen v 5 letih ne bo napredovala (13, 14). Glavni MolO
je zaradi te in drugih raziskav(7), ki so potrdile njegov pomen, postal po
priporočilih evropske mreže za levkemijo želen odziv in glavni cilj zdravljenja
KML bolnikov s TKI (7).
Najobčutljivejša in najpomembnejša preiskava za spremljanje uspešnosti
zdravljenja KML s TKI je standardizirana metoda - kvantitativni PCR (qPCR), s
katerim določimo raven izražanja gena BCR-ABL1 v levkocitih periferne krvi.
Iz teh izoliramo RNA, ki jo v reakciji obratnega prepisovanja (RT) prepišemo
v cDNA, ki je osnova za qPCR (RT-qPCR).
Postavitev mednarodnega merila je omogočila harmonizacijo metod RTqPCR za določitev ravni izražanje gena BCR-ABL1 pri bolnikih z KML, ki
imajo najpogostejša prepisa e13a2 in/ali e14a2. Rezultati RT-qPCR so se pred
harmonizacijo metod med laboratoriji znatno razlikovali. Zato je bil v okviru
54
55
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
evropske mreže za levkemijo ustanovljen program EUTOS (The EUropean
Treatment Outcome Study), kjer smo s pomočjo izmenjave vzorcev in
primerjave rezultatov RT-qPCR našega laboratorija z rezultati referenčnega
laboratorija, ki je sodeloval v raziskavi IRIS, pridobili konverzijski faktor. Z
njim pomnožimo naš rezultat BCR-ABL1 RT-qPCR in ga predstavimo na
mednarodnem merilu. Na osnovi tega sodelovanja smo postali referenčni
center za izvedbo te metode v Sloveniji (15). Nadaljnja standardizacija
metode je še v teku (16).
Veliko raziskav je potrdilo prognostični pomen zgodnje ocene uspešnosti
zdravljenja bolnikov s KML po treh mesecih od začetka zdravljenja s TKI. Tako
imajo želen MolO tisti bolniki, ki po treh mesecih dosežejo raven izražanja
gena BCR-ABL1, ki je enaka ali manjša kot 10 % IS. Odziv na zdravljenje pri
bolnikih, ki niso dosegli želenega odziva po treh mesecih, ni optimalen.
Zato zahteva pogostejše kontrole in menjavo zdravila v primeru prehoda v
skupino neuspešnega zdravljenja (7).
Tudi mi smo želeli preveriti kakšen je delež naših bolnikov z ustreznim
odzivom na zdravljenje po treh mesecih in ali obstajajo razlike zaradi vrste
uporabljenega TKI. V raziskavo smo vključili 171 bolnikov s KML v kronični fazi
bolezni, ki so se zdravili v Sloveniji v obdobju od 01.08.2004 do 31.08.2014.
Od tega je bilo 80 (47 %) žensk in 91 moških (53 %). Mediana starosti je bila
58 let, razpon od 11 do 88 let.
Za štiri bolnike, tri ženske in enega moškega, nismo imeli podatka o
molekularnem odzivu po treh mesecih od začetka zdravljenja, zato smo
jih izključili iz analize. Trije izmed njih so se zdravili z imatinibom, eden z
nilotinibom.
Z imatinibom se je zdravilo 133, nilotinibom 33 in dasatinibom 1 izmed 167
bolnikov. Izmed 133 bolnikov, ki so se zdravili z imatinibom, je ustrezen
MolO na zdravljenje po treh mesecih doseglo 98 (74 %) bolnikov. Izmed 33
bolnikov, ki so se zdravili z nilotinibom, je ustrezen MolO na zdravljenje po
treh mesecih doseglo 30 (91 %) bolnikov. Bolnik, ki se je zdravil z dasatinibom
je tudi dosegel ustrezen MolO po treh mesecih od začetka zdravljenja.
Z Fisherjevim statističnim testom smo ugotovili, da obstaja statistično
značilna razlika v doseganju ustreznega molekularnega odziva po treh
mesecih od začetka zdravljenje v odvisnosti od vrste uporabljenega TKI.
Podrobnih vzrokov za neustreznost molekularnega odziva pri bolnikih
nismo raziskali. V analizo smo vključili bolnike, ki so se zdravili z imatinibom
ali nilotinibom in ugotovili,da je med bolniki, ki so prejemali nilotinib,
56
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
bilo več takšnih, ki so dosegli ustrezen MolO po treh mesecih od začeta
zdravljenja kot pri bolnikih, ki so prejemali imatinib (Fisherjev test; P=0,0379).
Naše ugotovitve na proučevani populaciji bolnikov s KML so v skladu z
ugotovitvami, ki so jih opravili v kliničnih raziskavah (7), to je, da je pri
novejših zdravilih, kot sta nilotinib in dasatinib, delež bolnikov, ki doseže
ustrezne odzive v krajšem času, večji (7).
Manjši del bolnikov s KML je neodzivnih na zdravljenje s TKI ali pa bolezen
napreduje kljub zdravljenju s TKI. Porast produkta BCR-ABL1 sicer ne pomeni
nujno neuspeha zdravljenja, ampak je razlog potrebno raziskati. Možni vzroki
so prekinitev ali opustitev jemanja zdravila ali odpornost proti zdravljenju.
Čeprav je vzrokov za pojav odpornosti proti zdravljenju s TKI več, sta klonska
evolucija in pojav točkovnih mutacij v kinazni domeni ABL1 beljakovine
BCR-ABL1 najpomembnejša dejavnika, ki sta medsebojno povezana (7, 17).
Drugi vzroki so vpliv na farmakokinetiko zdravila in aktivacija alternativnih
signalnih poti, ki vodijo do rasti celic neodvisno od BCR-ABL1 (17).
4.Ugotavljanje mutacij v genu BCR-ABL1 pri kronični mieloični
levkemiji
Klinično pomembne mutacije določimo s (klasičnim) sekvenciranjem po
Sangerju, določitvijo nukleotidnega zaporedja odseka cDNA ali DNA v BCRABL1, ki kodira kinazno domeno beljakovine BCR-ABL1 (7, 18). Priporočajo,
da opravimo mutacijsko analizo BCR-ABL1 v primerih ko bolniki niso dosegli
želenega odziva ali so le-tega izgubili (8). Določitev mutacije lahko vpliva
na odločitev o nadaljnji izbiri zdravljenja. Med njimi so nekatere, ki močno
vplivajo na odzivnost na zdravljenje s TKI. Takšna mutacija je zamenjava
treonina za izolevcin na mestu 315 (T315I) aminokislinskega zaporedja
beljakovine BCR-ABL1, ki povzroči pojav klona, ki je odporen proti imatinibu,
nilotinibu in dasatinibu. Za nilotinib in dasatinib je manj odpornih mutacij kot
za imatinib in se med seboj ne pokrivajo, razen mutacije T315I (7, 18, 19). V
naši raziskavi, ki smo jo opravili pred nekaj leti (19), smo v skupini bolnikov
s KML, ki so jih zdravili s TKI in ki niso dosegli glavnega MolO v najmanj 18
mesecih ali so le-tega izgubili napravili mutacijsko analizo BCR-ABL1. Pri
enem izmed devetih bolnikov smo ugotovili mutacijo T315I (slika 1), pri
drugem tiho mutacijo (SNP, rs2227985). Mutacije so najverjetneje redke
57
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
pri skupini bolnikov s KML pri katerih bolezen še ni napredovala, vendar je
preiskavo ugotavljanja mutacij pri teh bolnikih vseeno smiselno opraviti in
tudi ponavljati. To je tudi v skladu z priporočili (7, 18). Vpliv polimorfizmov
na odpornost na zdravljenje s TKI še danes ni povsem pojasnjen.
Slika 1. Elektroferograma nukleotidnega zaporedja, dobljenih iz aparata ABI 310
(Applied Biosystems) za odsek PCR segmenta BCR-ABL1 bolnika s kronično mieloično
levkemijo, ki vsebuje mutacijo p.T315I (c.947 C>T ref zap NM_005157.5; p.Thr315Ile,
p.T315I ref zap NP_005148.2).
Figure 1. Electropherograms of nucleotides sequences, obtained from the ABI 310
sequencer (Applied Biosystems) for the BCR-ABL1 PCR fragment in chronic myeloid
lekaemia patient having mutation p.Thr315Ile (c.947 C>T ref seq NM_005157.5;
p.Thr315Ile, p.T315I, ref seq NP_005148.2).
5. Sklep
Genetske preiskave so zelo pomembne za ugotavljanje in spremljanje
uspešnosti zdravljenja KML. Odziv na zdravljenje s TKI nastopi hitro in
v večini primerov tudi traja. Stabilne molekularne odzive, ki jih razvijejo
bolniki s KML med zdravljenjem s TKI, spremljamo z zelo občutljivo
metodo, standardiziranim kvantitativnim PCR. Manjši del bolnikov s KML
je neodzivnih na zdravljenje s TKI ali pa bolezen napreduje kljub zdravljenju
s TKI. Pojav točkovnih mutacij v kinazni domeni beljakovine BCR-ABL1 je
eden najpomembnejših dejavnikov za razvoj odpornosti na zdravljenje s TKI.
S sekvenciranjem po Sangerju ugotovimo klinično pomembne mutacije, ki
vplivajo na odločitev o izbiri nadaljnjega zdravljenja (20).
58
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Literatura
1.Vardiman JW, Melo JV, Baccarani M and Thiele J. Chronic myelogenous leukemia
BCR-ABL1 positive. In: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL et al. WHO classification
of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 2008: 32-37.
2.Modic M. Mieloproliferativne novotvorbe. In: Košnik M, Mrevlje F, Štajer D, Černelč
P, Koželj M. Interna medicina. Littera Picta, d.o.o., Slovensko medicinsko društvo,
2011: 1312-1315.
3.Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia
identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 1973; 243: 290-293.
4.Pajič T, Marc J, Preložnik-Zupan I. Kronična mieloična levkemija. Farm Vestnik 2013;
64: 343-353.
5.Quintas-Cardama A, Cortes J. Molecular biology of bcr-abl1-positive chronic myeloid
leukemia. Blood 2009; 113: 1619-1630.
6.van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion
gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of
minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation
of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: 1901-1928.
7.Baccarani M, Deininger MW, Rosti G et al. European LeukemiaNet recommendations
for the management of chronic myeloid leukemia: 2013. Blood 2013; 122: 872-884.
8.Radich J. Chronic Myeloid Leukemia 2010: Where Are We Now and Where Can We
Go? Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010; 2010:122-8. doi: 10.1182/
asheducation-2010.1.122.
9.Burmeister T and Reinhardt R. A multiplex PCR for improved detection of typical and
atypical BCR-ABL fusion transcripts. Leuk Res 2008; 32: 579-585.
10.Gabert J, Beillard E, van der Velden VH.et al. Standardization and quality control
studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of
fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against
Cancer program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357.
11.Drucker BJ, Guilhot F, O’Brien SG et al. Five-year follow-up of imatinib therapy for
newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic-phase shows sustained responses
and high overall survival. N Eng J Med 2006; 355: 2404-2417.
12.Hughes T, Deininger M, Hochhaus A et al. Monitoring CML patients responding to
treatment with tyrosine kinase inhibitors - recommendations for ‘harmonizing’ current
methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and
for expressing results. Blood 2006; 108: 28-37.
13.Iacobucci I, Saglio G, Rosti G et al. Achieving a major molecular response at the time of
a complete cytogenetic response (CCgR) predicts a better duration of CCgR in imatinibtreated chronic myeloid leukemia patients. Clin Cancer Res 2006; 12: 3037-3042.
14.Press RD, Love Z, Tronnes AA et al. BCR-ABL mRNA levels at and after the time
of a complete cytogenetic response (CCR) predict the duration of CCR in imatinib
mesylate-treated patients with CML. Blood 2006; 107: 4250-4256.
15.Muller MC, Cross NC, Erben P et al. Harmonization of molecular monitoring of CML
therapy in Europe. Leukemia 2009; 23: 1957-1963.
16.White H, Deprez L, Corbisier P et al. A certified plasmid reference material for the
standardisation of BCR-ABL1 mRNA quantification by real-time quantitative PCR.
Leukemia 2015; 29: 369-376.
59
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
17.Apperley JF Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukaemia.
Lancet Oncol 2007; 8: 1018-1029.
18.Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, Gruber F et al. BCR-ABL kinase domain mutation
analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors:
recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet. Blood
2011; 118: 1208-1215.
19.Pajič T, Lamovšek N, Fink, M et al. Analiza mutacij v kinazni domeni proteina BCRABL1 pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo in z nezadostnim odgovorom na
zdravljenje z zaviralcem tirozinske kinaze. Zdrav Vestn 2012; 81 supl 2: II-174-179.
20.Preložnik Zupan I, Pajič T, Glaser M et al. Uspešnost zdravljenja KML v Sloveniji v
obdobju inhibitorjev tirozinske kinaze. Zdrav Vestn 2012; 81: 56-64.
60
61
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Proteolizni encim katepsin K in njegov
vpliv na rakave in matične celice
možganskega tumorja glioblastoma
/ Proteolytic enzyme cathepsin K and his impact on cancer and
stem cells of brain tumour glioblastoma /
Urška Verbovšek1, Daniela Cesselli2, Tamara T. Lah1,3
Oddelek za genetsko toksikologijo in biologijo raka, Nacionalni inštitut za biologijo, Večna
pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenija
2
Department of Medical and Biological Sciences, University of Udine, Udine, Italija
3
Katedra za biokemijo, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Ljubljani,
Večna pot 113, 1000 Ljubljana, Slovenija
1
Povzetek
Proteolizni encimi oziroma proteaze so vključeni v raznolike procese v raku, od
njegovega nastanka do invazije in metastaziranja. Proteaze v celičnih prebavnih
organelih, lizosomih, so katepsini, ki pomembno prispevajo k natančno organizirani
mreži proteaz tekom napredovanja raka. V prispevku je predstavljen katepsin
K, cisteinska proteaza, prvotno opisana v osteoklastih kot pomemben dejavnik
fiziološke presnove hrustanca in kosti, s katero so povezane tudi dedne bolezni
pomanjkanja tega encima in kronična vnetja. Vse več je objav o možnem vplivu
katepsina K na razvoj različnih vrst rakavih obolenj. Kot prvi smo opisali povišano
izražanje katepsina K v najbolj agresivni obliki možganskega tumorja glioma, v
glioblastomu multiforme. Naše nadaljnje raziskave kažejo, da je njegova vloga
v tem tumorju povezana z regulacijo mobilizacije matičnim celicam podobnih
gliomskih celic, medtem ko so v drugih tipih raka ugotavljali predvsem vpliv
na rast, angiogenezo in metastaziranje tumorjev, še posebno v kosti. Z analizo
preživetja bolnikov z gliomom nizke in visoke stopnje smo pokazali, da izražanje
katepsina K v tumorju statistično značilno poslabša preživetje bolnikov. Katepsin
K je nedvomno pomemben encim v patobiologiji glioma.
Ključne besede: glioblastoma multiforme, katepsin K, matični celici podobna
rakava celica, niša matičnih celic, proteoliza, tumor.
62
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Abstract
Proteolytic enzymes or proteases are involved in various processes in cancer from
its initiation to invasion and metastatic spread. Proteases in cellular digestive
organelles, lysosomes, are called cathepsins that significantly contribute
to the precisely orchestrated protease network during cancer progression.
Here, cathepsin K is presented, a cysteine protease originally characterised
in osteoclasts as an important player in cartilage and bone metabolism also
linked to genetic diseases, caused by cathepsin K deregulation, and to chronic
inflammation. A vast body of literature is recently dedicated to possible
involvement of cathepsin K in various types of cancers. We were the first to
describe its overexpression in most malignant form of glioma, i.e. glioblastoma
multiforme. Our further research, is pointing out on its involvement in regulation
of glioma stem-like cells mobilisation, whereas in other types of cancer cathepsin
K was reportedly involved in tumour growth, angiogenesis and metastasis, in
particular to the bone. Survival analysis of patients with low and high grade
glioma showed that cathepsin K expression by the tumour significantly lowers
patient survival rate. Cathepsin K is certainly a new prominent enzyme in
pathobiology of glioma.
Keywords: cathepsin K, glioblastoma multiforme, glioma stem-like cell,
stem cell niche, proteolysis, tumour.
1. Uvod
Glioblastoma multiforme (GBM) je najbolj maligna oblika možganskega
tumorja vrste glioma, za katerega je značilna srednja vrednost preživetja
bolnikov samo 15 mesecev po diagnozi. Eden izmed glavnih razlogov za slabo
preživetje je difuzna infiltracija visoko invazivnih posameznih rakavih celic
v sosednje zdravo možgansko tkivo (parenhim), kar onemogoča popolno
kirurško odstranitev tumorja. Z invazivno rastjo tumorjev, vključno z
GBM, so povezani proteolizni encimi oziroma proteaze. Invazija gliomskih
celic v parenhim se razlikuje od invazije v ostala tkiva, saj se možganski
zunajcelični matriks (ZCM) razlikuje od večine ZCM drugih organov. Zaradi
kompaktne organizacije celic v možganih je ta zgoščen na približno 20%
tkivnega volumna. Prvenstveno je sestavljen iz glikozaminoglikanov (GAG) in
63
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
proteoglikanov, laminina, tenascina in nekaterih drugih firbilarnih proteinov,
a je v njem večinoma zelo malo kolagena. Ta je prisoten predvsem v dveh
območjih, in sicer okrog krvnih žil in na površini pie (glia limitans), kjer je
prisotna bazalna lamina.
Proteaze so, poleg razgradnje ZCM in omogočanja invazije tumorja,
lahko vpletene tudi v ostale procese, povezane z napredovanjem tumorja
(1), vplivajo na primer na celično proliferacijo, preživetje, angiogenezo,
senescenco, apoptozo in avtofagijo, vpletene pa so tudi v medcelične
interakcije v imunskem odzivu na novotvorbe. V vseh teh procesih bolj ali
manj cepijo peptidne vezi ključnih onkoproteinov in regulirajo npr. aktivnosti
kinaz (2), rastnih in kemotaktičnih faktorjev, kar imenujemo proteolizno
signaliziranje (3).
Aktivnost proteaz je strogo uravnavana na vseh nivojih izražanja, vključno s
post-translacijskim, ki ga nadzorujejo endogeni aktivatorji prekurzorskih oblik
proteaz, njihovi inhibitorji in možne interakcije z drugimi makromolekulami.
Ravnovesje med proteazami in inhibitorji torej ključno vpliva na razgradnjo
fizioloških substratov v raku, kar skupaj tvori molekulsko mrežo, imenovano
degradom raka. Številne proteaze in njihovi inhibitorji so tako povezani z
nastankom in napredovanjem raka, bodisi v smislu pospeševanja bodisi
zaviranja omenjenih procesov. Zato so proteaze uporabne v kliniki tudi kot
biološki označevalci – kot diagnostični in napovedni kazalci preživetja ali
celo odziva na zdravljenje pri različnih vrstah raka, tudi pri GBM (4).
inhibitorjev v GBM, vendar samo povišano izraženih genov, saj so ti bolj
uporabni v kliniki.
Primerjava med tkivi in celicami je pokazala na izrazito povišanje določenih
genov proteaz oz. proteinov s proteaznimi motivi v primerjavi z nemalignimi
kontrolnimi vzorci. Ti geni so TFRC (transferinski receptor), ERAP2
(aminopeptidaza 2 endoplazemskega retikuluma), GPR56 (z G proteinom
sklopljen receptor 56), GFPT2 (glutamin-fruktoza-6-fosfat transaminaza
2), CTSK (katepsin K), CSTB (stefin B), PI3 (peptidazni inhibitor 3, imenovan
tudi elafin) in CD74 (integralni protein CD74; molekulski spremljevalec
poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa II). V nadaljnjih raziskavah
smo se predvsem osredotočili na lizosomalno cisteinsko proteazo katepsin
K (CatK), ki jo kodira gen CTSK, katerega do zdaj še niso prepoznali za
biološkega označevalca v tej vrsti raka.
Naša raziskovalna skupina (5–7), in tudi drugi (strnjeno v (8)), je že v preteklosti
obširno raziskovala cisteinske katepsine v napredovanju glioma. Za katepsine
B (CatB), L (CatL) in S (CatS) je znano, da so povezani z napredovanjem glioma
in so v GBM povišano izraženi na nivoju mRNA, proteinov in aktivnosti.
CatB in CatS sta bila povezana z invazijo tumorja in preživetjem bolnikov
(7,9), medtem ko je CatL najverjetneje vključen v aktivacijo transkripcijskih
faktorjev v procesu apoptoze in celične proliferacije (10). Vendar pa navkljub
raziskavam o pomembni vlogi CatK v delovanju možganov pri glodalcih (11),
do sedaj še ni literaturnih podatkov o CatK v gliomih, razen naših študij (12,13).
2.Določanje dereguliranih genov za proteaze in njihove inhibitorje
v glioblastomu
3. Katepsin K
Glede na podatkovno zbirko MEROPS (podatki z dne 10.7.2015) poznamo 990
proteaz in 1605 proteaznih inhibitorjev, v času naše analize (na dan 18.4.2011)
pa je bilo v zbirko vnešenih 669 proteaz in 242 proteaznih inhibitorjev. Izmed
teh smo želeli določiti tiste proteaze in inhibitorje, ki so deregulirani v GBM
in se pri tem poslužili bioinformatskih pristopov oziroma orodij. Pri tem
smo uporabili naše rezultate transkriptomskih analiz in jih dopolnili s prosto
dostopnimi v podatkovnih zbirkah. Transkriptom GBM tkiv in celičnih linij
smo primerjali s podatki ne-malignega možganskega tkiva in celičnih linij
normalnih človeških astrocitov. Zatem smo izvedli molekularna in biološka
preverjanja, to je validacije prepoznanih dereguliranih proteaz in njihovih
Gen, ki ga kodira (CTSK), je brez dvoma eden najzanimivejših genov za
preučevanje v GBM. Do sedaj ni bil povezan s to boleznijo, saj je njegova
poznana aktivnost predvsem usmerjena v proteinske makromolekulske
substrate, kot so fibrilarni proteini, kolageni in proteoglikani, ki niso običajne
sestavine ZCM možganov. CatK sodeluje pri razgradnji kolagena v procesu
preoblikovanja kostnega in hrustančnega matriksa in je zato močno izražen
v osteoklastih (Slika 1) oz. hondrocitih (14). V teh tkivih je nujno potreben za
rast in razvoj, saj genetske okvare CatK povzročajo hude dedne bolezni, kot
je piknodisostoza. To je posebna oblika osteopetroze, za katero je značilna
povečana kostna gostota in posledično zelo krhke kosti. Nepravilna regulacija
CatK, pogojena s hormonskimi in drugimi vzroki, pa povzroča osteoporozo,
64
65
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
pri kateri je resorpcija kostnega matriksa večja od njegovega nastanka. Poleg
bolezni kosti ima CatK pomembno vlogo tudi v drugih patologijah, kot je
revmatoidni artritis in njegovih sekundarnih zapletih, kjer je spet udeležen
v razgradnji proteinov ZCM (14).
V zadnjem času se pojavlja vedno več objav o vlogi CatK v invazivnih vrstah
raka, še posebej je dobro preučena razgraja kostnega matriksa v metastazah
karcinomov (15). Za zdravljenje osteoporoze in kostnih metastaz je bila zato
razvita že cela vrsta inhibitorjev CatK (16), med katerimi se kot najbolj uspešen
za zdravljenje izkazal odanacatib (Merck) (17,18). Odanacatib je selektivni
nizkomolekulski organski inhibitor CatK. Akumulira se v resorpcijskih lakunah
in preprečuje vezavo CatK na substrat.
Vendar pa odkrivamo tudi druge nizkomolekulske proteinske in peptidne
substrate CatK, ki imajo poseben pomen v prenašanju fizioloških signalov.
Miši z onesposobljenim genom za CatK, za razliko od živali z onesposobljenimi
geni za druge katepsine (CatB ali CatL), imajo znatno prizadet živčni sistema
(11). Na primarnih kulturah možganskega tkiva, bogatih s celicami astroglije,
iz miši z onesposobljenim genom za CatK, je bilo ugotovljeno, da ima CatK
določeno, a še nepoznano, vlogo v zorenju oligodendrocitov (19). Poleg
osteoklastov in celic glije, CatK izražajo tudi druge celice, kot so kožni (20)
in pljučni fibroblasti (21), adipociti (22) in epitelne celice žleze ščitnice (23).
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
človeških osteoklastov, pridobljenih z diferenciacijo makrofagov, izoliranih iz periferne
krvi, (B) zamrznjene rezine človeškega GBM in (D) človeške GBM celične linije U87MG. Za to smo uporabili protitelo Abcam anti-CatK (ab19027). Jedra so obarvana s
hematoksilinom. Vsi omenjeni vzorci so pozitivni za CatK. V mišji čeljusti (A) sta se
pozitivno obarvala kostni mozeg (KM) in osteoklasti (O) ob kosti (K), medtem ko je
tkivo GBM močno pozitivno okrog krvnih žil. Osteoklasti (C) in celice U87-MG (D) kažejo
močno in difuzno znotrajcelično barvanje za CatK.
Figure 1. CatK expression in different tissues and cells. CatK expression was revealed
by immunohistochemical staining in (A) a paraffin section of mouse jaw (containing
bone), (C) human osteoclasts obtained by differentiation of macrophages isolated
from peripheral blood, (B) cryostat section of human glioblastoma multiforme (GBM)
and (D) human GBM U87-MG cells in culture. Abcam anti-CatK antibody ab19027 was
used. Nuclei are counterstained with haematoxylin. All samples show positive staining
for CatK. Mouse jaw (A) shows strong positivity in bone marrow (KM) and osteoclasts
(O) adjacent to bone (K) while GBM tissue (B) shows strong staining around blood
vessels. Osteoclasts (C) and U87-MG cells (D) show strong and diffuse intracellular
labelling of CatK.
Povišanega izražanja CatK v tkivih in celicah GBM nismo odkrili le na nivoju
prepisovanja gena, pač pa se prekomerno izraža tudi njegov protein, kot
je razvidno v celicah in tkivu na Sliki 1 (12). V celičnih linijah GBM se CatK
nahaja v granularnih strukturah ob jedru, v lizosomih, na tkivnem nivoju
pa smo ga v GBM identificirali v okolici krvnih žil. Tako v celicah kot v tkivih
je v večini prisotna le neaktivna pro-oblika encima z molekulsko maso 39
kDa. Aktivne oblike CatK v celicah nismo zaznali, prav tako ne njegovega
izločanja iz celic, kakor smo to opazili pri drugih katepsinih, na primer pri
CatB v istih vrstah celic.
4.Pomen katepsina K v uravnavanju tkivne lokalizacije
glioblastomskih matičnih celic
Slika 1. Izražanje CatK v različnih tkivih in celicah. Izražanje CatK smo določili z
imunohistokemijskim barvanjem (A) parafinske rezine mišje čeljusti, ki vsebuje kost, (C)
Imunohistokemijske slike glioblastomskih tkiv so pokazale na čisto določeno
lokalizacijo CatK v tumorju, in sicer obkroža krvne žile (natančneje arteriole),
kjer smo lahko locirali tudi matičnim celicam podobne gliomske celice (MCGC).
Te smo določili tako, da smo na zaporednih tkivnih rezinah zamrznjenega
vzorca tkiva GBM imunsko označili CatK in CD133, ki je označevalce MCGC,
zatem še CD31, ki je označevalec endotelijskih celic. Slednje so del celične
niše, ki v tkivih (tudi v tumorjih) veže matične celice. Ko-lokalizacija obeh
označevalcev s CatK je potrdila njegovo prisotnost v teh nišah in s tem
66
67
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
nakazala na njegovo možno vlogo v sidranju tumorskih matičnih celic.
Podobno vlogo ima CatK tudi v niši krvotvornih matičnih celic.
Tumorske matične celice predstavljajo populacijo celic z neomejenim
samoobnovitvenim potencialom, ki so se sposobne diferencirati v razne
vrste malignih celic in so manj občutljive na večino protirakavih učinkovin.
Nosijo neke vrste zapis za specifičen razvoj tumorja, zato predstavljajo
glavni vir za njegov razvoj in rast, zaradi svoje odpornosti na kemoterapijo
pa so vir ponovljene bolezni.
Sidranje tumorskih matičnih celic v niši poteka preko osi CXCL12-CXCR4, kot
je prikazano na Sliki 2. CXCL12 (oz. SDF-1; angl. stromal cell derived factor 1) je
kemokin, ki se veže na receptor CXCR4, izražen na tumorskih matičnih celicah.
Ugotovili smo, da se SDF-1 in CXCR4 izražata v vseh nišah MCGC v GBM (13).
Med CatK in SDF-1 smo opazili obratno sorazmerje – kjer je bilo izražanje
CatK visoko, je bilo izražanje SDF-1 nizko in obratno. Predpostavljamo, da
je SDF-1 odgovoren, da ohranja zalogo MCGC v GBM tkivni niši v okolici
tumorske arteriole (13) in da ga CatK s proteolizno cepitvijo inaktivira,
kar omogoči izplavljanje MCGC iz niše in njihovo nadaljnjo aktivacijo ter
diferenciacijo v invazivne tumorske celice GBM.
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
zaporednih rezinah GBM kaže del niše MCGC pri visoki povečavi, ki vključuje 1, lumen
tumorske arteriole; 2, plast endotelijskih celic; 3, tunico medio stene arteriole, ki jo
sestavljajo gladke mišične celice; 4, plast stromalnih celic in ZCM; 5, plast MCGC; in 6,
gliomske celice. Vsi trije proteini so izraženi v nekaterih endotelijskih celicah, najmočneje
pa v plasti MCGC in v nekaterih gliomskih celicah izven niše. (B) Shematski prikaz MCGC
niše in aktivnosti CatK v procesu migracije MCGC iz niše. Številke 1-6 pripadajo enakim
plastem tkiva kot pri (A). V odzivu na signale endotelijske in gliomske celice izločajo
različne proteaze, vključno s CatK. CatK cepi SDF-1α v ZCM stene arteriole, kar oslabi
pritrjanje MCGC ter spremeni signale v niši. MCGC izražajo receptor za SDF-1α, CXCR4.
Cepitev SDF-1α omogoči migracijo MCGC iz niše.
Figure 2. Characterisation and schematic representation of the glioma stem-like cell
(GSLC) niche in GBM with respect to the role of CatK in migration of GSLCs out of
the niche. (A) Immunohistochemical localisation of CatK, SDF-1α and CXCR4 in serial
cryostat sections of GBM, showing part of a GSLC niche at high magnification with 1,
lumen of tumour arteriole; 2, endothelial cell layer; 3, tunica media of arteriolar wall
consisting of smooth muscle cells; 4, layer of stromal cells and extracellular matrix
(ECM); 5, layer of GSLCs; and 6, glioma cells. All three proteins are expressed in some
endothelial cells, most strongly in the layer of GSLCs and in some cancer cells outside
the niche. (B) Schematic representation of the GSCL niche and CatK activity in migration
of GSLCs away from the niche. Numbers 1-6 correspond to the same tissue layers as
in (A). In response to signals, endothelial and cancer cells secrete various proteases,
including CatK. CatK cleaves SDF-1α in the ECM of arteriolar walls which weakens GSLC
anchorage and alters signals provided by the niche. GSLCs express receptor for SDF-1α,
CXCR4. Cleavage of SDF-1α enables migration of GSLCs out of the niche.
5. Klinični pomen izražanja katepsina K v GBM
Povišano izražanje CatK smo klinično ovrednotili v gliomih nizke (LGG)
in visoke stopnje (HGG). Na parafinskih rezinah 24 vzorcev HGG in 24
vzorcih LGG smo imunsko označili CatK. Kaplan-Meier analiza preživetja
bolnikov z LGG oziroma HGG je pokazala statistično značilno daljše preživetje
pri tistih, ki CatK v tumorju ne izražajo, kot pri tistih, ki ga (Slika 3). To
nakazuje prognostično vrednost CatK v gliomu in še dodatno potrjuje njegov
patofiziološki in klinični pomen.
Slika 2. Karakterizacija in shematski prikaz niše MCGC v GBM z ozirom na vlogo CatK v
migraciji MCGC iz niše. (A) Imunohistokemijska lokalizacija CatK, SDF-1α in CXCR4 na
68
69
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Slika 3. Klinično ovrednotenje izražanja CatK v LGG in HGG. Analiza preživetja (analiza
Kaplan-Meier) je pokazala statistično značilno daljše preživetje pacientov z gliomom
(A – LGG, B – HGG), pri katerih CatK ni izražen, v primerjavi s pacienti, pri katerih je
CatK izražen, predvsem v primeru LGG (A).
Figure 3. Clinical evaluation of CatK expression in LGG and HGG. Survival analysis
(Kaplan-Meier analysis) showed statistically significant longer survival of patients with
glioma (A – LGG, B – HGG) who do not express CatK in comparison with those who
express CatK, especially in LGG (A).
6. Zaključki
CatK ima pomembno vlogo v patobiologiji glioma in je najverjetneje povezan
z modulacijo kemokinske aktivnosti in migracijo MCGC, kar je podobno
dogajanju v niši krvotvornih matičnih celic v kostnem mozgu. Proteolizna
aktivnost CatK inaktivira kemokinsko aktivnost SDF-1, kar omogoči
mobilizacijo CXCR4+ MCGC iz niše. Te se nato diferencirajo v invazivne
tumorske celice in tako vzdržujejo tumor. Ti procesi pomembno vplivajo
na preživetje bolnikov z gliomom. Inhibitorji CatK, kot je odanacatib, tako
predstavljajo potencialno dopolnilno zdravljenje tega agresivnega tumorja,
saj bi z njimi lahko preprečili mobilizacijo in diferenciacijo MCGC ter jih tako
zadržali v niši, kjer bi jih lažje ciljali z drugimi terapevtskimi sredstvi. Za
uspešno zdravljenje glioma in njegove najbolj maligne oblike GBM bi bilo
namreč potrebno odstraniti prav vse MCGC.
Literatura
1.Hanahan D, Weinberg R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646–674.
2.López-Otín C, Hunter T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in
cancer. Nat Rev Cancer 2010;10:278–292.
70
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
3.
Turk B, Turk D, Turk V. Protease signalling: the cutting edge. EMBO J 2012;31:1630–1643.
4.Lah TT, Obermajer N, Duran Alonso MB, Kos J. Cysteine cathepsins and cystatins as
cancer biomarkers. In: Edwards D, Hoyer-Hansen G, Blasi F, Sloane BF. The Cancer
Degradome. Springer Science Business Media, 2008:575–613.
5.Colin C, Voutsinos-Porche B, Nanni I et al. High expression of cathepsin B and
plasminogen activator inhibitor type-1 are strong predictors of survival in glioblastomas.
Acta Neuropathol 2009;118:745–754.
6.Gole B, Huszthy PC, Popović M et al. The regulation of cysteine cathepsins and cystatins
in human gliomas. Int J Cancer 2012;131:1779–1789.
7.Strojnik T, Kavalar R, Trinkaus M, Lah TT. Cathepsin L in glioma progression: comparison
with cathepsin B. Cancer Detect Prev 2005;29:448–55.
8.Mentlein R, Hattermann K, Held-Feindt J. Lost in disruption: role of proteases in
glioma invasion and progression. Biochim Biophys Acta 2012;1825:178–185.
9.Flannery T, McQuaid S, McGoohan C et al. Cathepsin S expression: an independent
prognostic factor in glioblastoma tumours - a pilot study. Int J Cancer 2006;119:854–860.
10.Kenig S, Frangež R, Pucer A, Lah TT. Inhibition of cathepsin L lowers the apoptotic
threshold of glioblastoma cells by up-regulating p53 and transcription of caspases 3
and 7. Apoptosis 2011;16:671–682.
11.Dauth S, Sîrbulescu RF, Jordans S et al. Cathepsin K deficiency in mice induces structural
and metabolic changes in the central nervous system that are associated with learning
and memory deficits. BMC Neurosci 2011;12:74.
12.Verbovšek U, Motaln H, Rotter A et al. Expression analysis of all protease genes reveals
cathepsin K to be overexpressed in glioblastoma. PLoS One 2014;9:e111819.
13.Hira VVV, Ploegmakers KJ, Verbovšek U et al. CD133+ and nestin+ glioma stem-like
cells reside around CD31+ arterioles in niches that express SDF-1α, CXCR4, osteopontin
and cathepsin K. J Histochem Cytochem 2015;63:481–493.
14.Novinec M, Lenarčič B. Cathepsin K: a unique collagenolytic cysteine peptidase. Biol
Chem 2013;394:1163–1179.
15.Deng X, He G, Liu J et al. Recent advances in bone-targeted therapies of metastatic
prostate cancer. Cancer Treat Rev 2014;40:730–738.
16.Brömme D, Lecaille F. Cathepsin K inhibitors for osteoporosis and potential off-target
effects. Expert Opin Investig Drugs 2011;18:585–600.
17.Chapurlat RD. Odanacatib: a review of its potential in the management of osteoporosis
in postmenopausal women. Ther Adv Musculoskelet Dis 2015;7:103–109.
18.Jensen AB, Wynne C, Ramirez G et al. The cathepsin K inhibitor odanacatib suppresses
bone resorption in women with breast cancer and established bone metastases: results of
a 4-week, double-blind, randomized, controlled trial. Clin Breast Cancer 2010;10:452–458.
19.Dauth S, Schmidt MM, Rehders M et al. Characterisation and metabolism of astrogliarich primary cultures from cathepsin K-deficient mice. Biol Chem 2012;393:959–970.
20.Quintanilla-Dieck MJ, Codriansky K, Keady M et al. Expression and regulation of
cathepsin K in skin fibroblasts. Exp Dermatol 2009;18:596–602.
21.Bühling F, Röcken C, Brasch F et al. Pivotal role of cathepsin K in lung fibrosis. Am J
Pathol 2004;164:2203–2216.
22.Chiellini C, Costa M, Novelli SE et al. Identification of cathepsin K as a novel marker
of adiposity in white adipose tissue. J Cell Physiol 2003;195:309–321.
23.Dauth S, Arampatzidou M, Rehders M et al. Thyroid cathepsin K: roles in physiology
and thyroid disease. Clin Rev Bone Miner Metab 2011;9:94–106.
71
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Novejša dognanja pri odkrivanju in
zdravljenju okvare ledvic
Okvara ledvic - vrednotenje in izziv za laboratorijsko medicino
Milan Skitek
Aleš Jerin
Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na srcu z
novejšimi biooznačevalci
Jurij Matija Kališnik
Kronična ledvična bolezen – kje smo in kako naprej
Jelka Lindič
Uporaba vitamina D pri zdravljenju pacientov z IgA nefropatijo
Joško Osredkar, Tina Humar, Damjan Kovač
Mikroskopski pregled sedimenta seča
Mateja Šter
72
73
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Nizki, subterapevtski odmerki statina in
sartana v kombinaciji – nov preventivni
pristop za zaščito arterijske stene
/ Acute kidney injury – assessment and the role of laboratory medicine
in monitoring injury and function of kidney /
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
cell injury with immunological mechanisms are involved in AKI initiation and
extension, that lead to an intense, proinflammatory state.
The new classification of AKI staging will be discussed in the light of the new
and conventional biomarkers of kidney function and injury. The challenge for
laboratory medicine is to find more sensitive renal biomarkers for more precise
and earlier prediction of AKI
Key words: Acute kidney injury, biomarkers
Milan Skitek, Aleš Jerin
Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 2,
Ljubljana
Povzetek
Akutno okvaro ledvic (AOL) razvije okoli 20% bolnikov v bolnišničnih urgentnih
in intenzivnih oddelkih. Stopnja okvare in disfunkcije ledvic je povezana z
višjo umrljivostjo in je neodvisen vzrok za smrt bolnika. Najpogostejša oblika
intrinzične-renalne AOL je ishemija, povezana z hemodinamskimi motnjami,
poškodbami parenhima in imunološkimi mehanizmi, ki so vključeni v začetek
procesa in poslabšanje AOL z intenzivnim proinflamatornim stanjem.
Obravnavana bo nova klasifikacija stopenjske AOL v luči konvencionalnih in
novejših biooznačevalcev ledvične (dis)funkcije in okvare. Izziv za laboratorijsko
medicino predstavljajo novejši biooznačevalci, bolj občutljivi in specifični za
bolj točno, zanesljivo in zgodnejšo napoved AOL.
Ključne besede: Akutna okvara ledvic (AOL), biooznačevalci
1. Uvod
Akutno okvaro ledvic (AOL) razvije okoli 20% bolnikov v bolnišničnih urgentnih
in intenzivnih oddelkih, umrljivost pa znaša okoli 25-40%. Stopnja okvare in
disfunkcije ledvic je povezana z višjo umrljivostjo in je neodvisen vzrok za
smrt bolnika. Običajni vzroki smrti so poleg uremije krvavitve in sepsa (1).
Z AOL je povezan tudi ekonomski vpliv na stroške zdravljenja, saj bolniki
običajno potrebujejo dolgotrajne dialize in intenzivno terapijo in nego (2).
Prav zato je zgodnje prepoznavanje rizičnih bolnikov s pomočjo zanesljivih
kriterijev in klasifikacije diagnoze toliko pomembnejše.
1.1 Klasifikacija AOL
V preteklosti smo pogrešali harmonizacijo pri klasifikaciji in stopenjski
diagnostiki AOL. Zadnja klasifikacija KDIGO (3) temelji na koncentraciji
serumskega kreatinina (sKr) in količini izločanega seča. Klasifikacija loči tri
stopnje AOL glede na težavnost stanja (Tabela 1).
Abstract
SAcute kidney injury (AKI) is affecting about one in five patients in hospital
emergency departments. It occurs frequently after cardiac surgery. The degree
of kidney injury and disfunction is associated with higher mortality and is
independent factor for death. The most common cause and etiology of intrinsic
AKI is ischaemia. The haemodynamic disturbances, endothelial an epithelial
74
75
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Tabela 1. K-DIGO klasifikacija AOL
AOL je definirana pri izpolnjevanju enega od naslednjih kriterijev:
•
Zvišanje sKr za ≥ 26.5µmol/L znotraj 48 ur; ali
•
Zvišanje sKr za ≥ 1.5 krat od osnovne vrednosti, ki je znana ali se predvideva
iz rezultatov prejšnjih 7 dni
•
Volumen urina < 0.5ml/kg/h v 6 urah
SKr = koncentracija serumskega kreatinina
Stopnja AOL*
sKr
Izločeni seč
1
1.5 – 1.9 krat osnovni ali
zvišanje ≥ 26.5µmol/L
< 0.5ml/kg/h v 6 - 12 urah
2
2.0 – 2.9 krat osnovni
< 0.5ml/kg/h v ≥ 12 urah
3
3.0 krat osnovni ali
zvišanje ≥ 354 µmol/L ali
začetek terapije nadomestitve
ledvic (dialize) ali
pri bolnikih ≤ 18 let, znižanje
oGF na <35ml/min/1.73 m2
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
AOL poteka v več fazah: začetna (začetna okvara, hitro znižanje GF),
razširitvena (širitev okvare, poslabšanje funkcije, ishemična reperfuzijska
poškodba), vzdrževalna faza in faza povrnitve stanja pred začetno fazo
oz. ozdravitve (recovery). Celoten proces od začetne faze do prvih znakov
ozdravitve lahko znaša več tednov. Patofiziološki dejavniki v prvih 2
fazah zajemajo hemodinamske faktorje, poškodbe endotelija in epitelija
ter imunološke faktorje. Vsi ti različni procesi so med seboj povezani in
pospešujejo ledvično okvaro. Pomemben vzrok strukturne, biokemijske
in funkcionalne spremembe proksimalnih tubulnih celic med ALO je
depolimerizacija aktina. Apikalne membrane celic so zelo občutljive na
ishemijo in se hitro strukturno spremenijo zaradi depolimerizacije aktina, ki
je sestavina mikrovilov. V procesu sodeluje aktin-depolimerizacijski faktor,
ki je odvisen od pH. Ishemija povzroči padec pH vrednosti, kar povzroči
defosforilacijo proteina, posledično pa depolarizacijo aktina (4-6).
< 0.3ml/kg/h v ≥ 24 urah ali
Anuria ≥ 12 ur
*upošteva se strožji kriterij, npr. dvakratnik SKr osnovne koncentracije ob normalnem izločenem urinu = stopnja
AOL 2.
oGF – ocena glomerularne filtracije.
sKr – serumska koncentracija kreatinina.
AOL delimo v tri glavne kategorije: prerenalno, intrinzično-renalno in
postrenalno (obstruktivna). Intrinzična se lahko nadalje deli na podkategorije:
glomerularno (npr. hitro napredovalni glomerulonefritis), žilno (npr. renalna
skleroza) in tubulo-intersticijske bolezni. Vzroki za večino AOL je ishemija.
Ishemična AOL je lahko tudi posledica prerenalne AOL kot odgovor na
hipoperfuzijo in intenzivno retenzijo natrija in vode ter posledično visoko
stopnjo poškodbe ledvičnih celic. Sem prištevamo tudi pooperativno
AOL kot pogost in resen zaplet po srčni operaciji z zunajtelesnim krvnim
obtokom (ZTO) ter glavnim vzrokom obolevnosti in smrtnosti po operaciji.
V glavnem so vzroki ishemične AOL v znižanju intravaskularnega volumna
(npr. krvavitve, dehidracije), znižanju efektivnega volumna cirkulacije (npr.
peritonitis, kardiogeni šok), jetrno renalni sindrom, zdravila (npr. vpliv na
renin-angiotenzin-aldosteron sistem), kontrastna sredstva, ledvično žilne
bolezni (okluzije/stenoze arterij) in sepsa.
76
7. Jesenovčevi dnevi
2. Biooznačevalci AOL
Na razpolago imamo biooznačevalce poškodbe in funkcije ledvic. Vse
klasifikacije temeljijo na meritvah koncentracije serumskega kreatinina kot
funkcijskega biooznačevalca, ki je slabo občutljiv za zgodnejše odkrivanje
AOL. Bolj občutljiv funkcijski biooznačevalec je cistatin C kot neglikozilirana
beljakovina, sestavljena iz enojne polipeptidne verige, z majhno molekulsko
maso (13-kDa). Spada v družino zaviralcev proteinaze. Nastaja s stalno
hitrostjo v vseh jedrnih celicah, od koder se s stalno hitrostjo sprošča v krvni
obtok. Cistatin C se zaradi majhne molekulske mase in pozitivnega naboja
pri fiziološkem pH običajno skoraj v celoti prosto filtrira skozi glomerulno
membrano. Nato pa se v proksimalnih tubulnih celicah skoraj v celoti
reabsorbira in razgradi. Normalno se najmanj 99 % cistatina C razgradi v
tubulnih celicah. Zaradi tega se njegovega očistka ne more izmeriti, njegova
koncentracija v serumu pa je dober pokazatelj GFR (7-9).
Za odkrivanje in razlikovanje vzrokov zgodnejših faz AOL poznamo več
urinskih osnovnih preiskav: urinski sediment, proteinurija, osmolalnost urina
oz. relativna gostota urina in koncentracija natrija ter sečnine. Osnovna
urinska analiza je tradicionalna neinvazivna metoda uporabna za odkrivanje,
opredelitev in napoved poteka številnih ledvičnih bolezni. Biooznačevalci
epitelijske poškodbe so predvsem epitelijske celice in tubularni cilindri v
77
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
urinu. Pri opredeljevanju intrinzične ledvične bolezni smo predvsem pozorni
na hematurijo in proteinurijo. Mikroskopsko potrjena prisotnost krvnih celic
in nekaterih formiranih elementov (ledvičnih tubulnih celic, cilindrov) je
lahko pomemben znak bolezni (2). Študije so pokazale na visoko specifičnost
in nizko občutljivost sedimenta seča za odkrivanje in razlikovanje AOL v
primerjavi z lipokalinom povezanim z nevtrofilno gelatinazo (10-13).
Lipokalin povezan z nevtrofilno gelatinazo (angl. neutrophil gelatinaseassociated lipocalin, NGAL) je majhen 25-kDa velik sekretorni glikoprotein
nevtrofilnih granulocitov. V nizkih koncentracijah se sintetizira tudi v drugih
tkivih, vključno z ledvičnimi proksimalnimi tubuli. V nevtrofilcih in v urinu
obstaja v obliki monomera, v majhnem odstotku v obliki dimera in trimera
in v kompleksu z gelatinazo B, vrsto kolagenaze humanih nevtrofilcev.
Izkazalo se je, da je občutljiv, neinvaziven in visoko napovedljiv zgodnji
biooznačevalec AOL, ki hitro poraste v krvi in urinu po ishemični, septični
in nefrotoksični poškodbi ledvic. Rezultati objavljenih študij kažejo, da
koncentracija NGAL v urinu naraste nekajkrat po ishemičnih poškodbah,
ki sledijo operacijam srca in poškodbam ledvic povzročenimi z radiološkimi
kontrastnimi sredstvi ter prehitevajo povečanje koncentracije serumskega
kreatinina za 12 do 24 ur (14).
2.1 Encimi v urinu ledvičnega izvora
Encimi, ki se sprostijo v urin iz poškodovanih tubulnih celic, se nahajajo na
različnih lokacijah v celici, kot je citoplazma, lizosomi ali celična membrana.
Zato njihovo določanje zagotovi podrobnejšo informacijo o nastanku
in obširnosti poškodb tubulnih celic. Primer takih encimov so: encimi
resaste površine proksimalnega nefrona (alkalna fosfataza, γ-glutamil
transpeptidaza in alanin aminopeptidaza), citoplazemski encimi (izoencim
α glutation S-transferaze (GST-α) nastaja v epitelijskih celicah proksimalnih
tubulov, izoencim π pa v distalnih tubulih) in lizosomski encim N-acetil
glukozaminidaza (NAG). NAG je hidrolitičen encim, ki ga najdemo v mnogih
tkivih v telesu. Ima visoko molekulsko maso (130-140 kDa), zaradi česar se
v glomerulih ne filtrira. Visoko aktiven je v ledvičnih proksimalnih tubulnih
celicah, kot posledico poškodb/okvar pa zaznamo povečano aktivnost v
urinu (nekroza proksimalnih tubulnih celic).
78
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
2.2 Beljakovine z majhno molekulsko maso
Beljakovine z majhno molekulsko maso (<40 kDa) se prosto filtrirajo v
primarni urin in se nato reabsorbirajo in razgradijo v proksimalnih tubulnih
celicah. Povečane koncentracije teh beljakovin v urinu pomenijo resorbcijsko
okvaro proksimalnih tubulov. V ta namen se najpogosteje določajo α1- in β2mikroglobulin, retinol vezoči protein in cistatin C (5). Novejši biooznačevalec
je jetrna oblika maščobne kisline vezočega proteina (angl. liver type-fatty
acid binding protein, L-FABP), ki je 14-kDa velik citoplazemski protein,
ki se sintetizira predvsem v jetrih in proksimalnih tubulih ledvic, kjer ima
pomembno zaščitno vlogo. Veže proste maščobne kisline, ki spremljajo
ledvične bolezni in proteinurijo, ki se nato razgradijo. Zadnje raziskave so
potrdile, da je primeren označevalec napredovanja kronične ledvične bolezni
in tubulne ishemije (15, 16).
2.3 Biooznačevalci sintetizirani v ledvicah
S pomočjo raziskav celičnih kultur človeških proksimalnih tubulnih celic so
bili odkriti geni in genski produkti, ki so potencialni biooznačevalci ALO:
protein bogat s cisteinom 61 (angl. cystein rich protein 61, CYR61), NGAL,
molekula za odkrivanje ledvičnih okvar-1 (angl. kidney injury molecule-1,
KIM-1) in Klotho (fosfatonin).
CYR61 je protein iz družine zunajceličnih rastnih faktorjev z mnogimi
funkcijami, predvsem zaščitnimi. Po ishemičnih poškodbah ledvic se začne
izražati v proksimalnih tubulnih celicah in izločati z urinom. Urinske in
serumske koncentracije CYR61 so tudi vključene v raziskave ishemičnih
poškodb ledvic (17, 18).
KIM-1 je transmembranski protein, ki se sintetizira v zelo majhni meri
v zdravem ledvičnem tkivu, zelo pa je izražen v ledvičnih proksimalnih
tubulnih celicah po ishemičnih in toksičnih poškodbah. Zunajcelični del
proteina se sprosti v urin, kjer je tudi dobro stabilen. Raziskave kažejo,
da je biooznačevalec zgodnjih ledvičnih okvar primeren za diferencialno
diagnostiko med akutno tubulno nekrozo in ostalimi vrstami ledvičnih
poškodb (19).
Klotho (fosfatonin) se izvirno izloča kot neaktivna oblika transmembranskega
proteina. Aktivacija poteka preko delovanja sekretaz in odstranitve
ekstracelularne domene (ADAM 10 and ADAM 17). Dva tipa Klotho se
79
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
sprostita, membranski in topni Klotho z različnimi funkcijami. Membranski
Klotho deluje kot receptor za fibroblast rastni faktor factor-23 (FGF-23),
kostni hormone, ki kontrolira metabolizem fosfata. Sproščeni topni Klotho
pa regulira ionske kanale (TRPV5 in ROMK), rastne faktorje (insulin/IGF-1) in
oksidativni stres. Klotho je izražen v višjih koncentracijah v renalnih tubulih,
možganih in v manjši meri v paratiroidni žlezi ter v srcu. Mehanizem delovanja
Klotho pri AOL je še nepoznan in ni odvisen od znižanja ekspresije Klotho
mRNA. Hitro znižanje koncentracije Klotha v urinu in plazmi kot odgovor
na renalno tubularno poškodbo in vrnitev koncentracij na bazalno vrednost
pred poškodbo kaže na vlogo Klotho pri popravi ledvične poškodbe. Študije
na živalskih in humanih modelih nakazujejo, da je AOL stanje pomanjkanja
Klotha in njegove vloge pri reverzibilni regeneraciji ledvic (20-22).
2.4 Citokini in kemokini
Pri ishemični poškodbi ledvic je pomemben imunski in vnetni odziv, kar je
povezano tudi z začetno poškodbo endotelija. Zato je povečana tudi sinteza
membranskih adhezivnih molekul (intercelularna adhezivna molekula
– ICAM-1), provnetnih citokinov in kemokinov. Interlevkin 18 (IL-18) je
mediator vnetja in ishemične poškodbe tkiv ter nastaja v mnogih organih
v telesu. V ishemičnih proksimalnih tubulnih celicah poškodbe povzroča s
kaspazo-1 posredovana aktivacija IL-18. Raziskave kažejo, da ima določanje
IL-18 v urinu občutljivost in specifičnost >90% za odkrivanje ALO. Zvišana
vazokonstrikcija je povezana tudi s tvorbo vazoaktivnih citokinov (npr.
tumor nekrozni faktor alfa-TNFα) in endotelina, kot posledice interakcije
endotelija in levkocitov (23)
3. Zaključek
AOL je zapleten in pogost sindrom, predvsem povezan z bolnišničnim
zdravljenjem, čigar diagnostika je desetletja ostajala nespremenjena in
nezadostna. Zaradi skupnih prizadevanj profesionalnih organizacij in številnih
raziskovalnih skupin je bil zadnja leta narejen precejšen napredek na tem
področju, predvsem v razumevanju poteka bolezni in odkritju mnogih novih
in potencialnih biooznačevalcev AOL. Vendar le ti potrebujejo še nadaljno
80
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
evaluacijo v večjih skupinah pacientov in v daljšem časovnem obdobju.
Trenutno še ni idealnega biooznačevalca AOL, uveljavlja pa se določanje
več panelov biooznačevalcev v urinu in serumu za zgodnje odkrivanje AOL
in prepoznavanje mest poškodbe ter za napoved poteka AOL in ogroženosti
bolnika.
Literatura
1.NICE. Acute kidney injury: Prevention, detection and management of acute kidney
injury up to the point of renal replacement therapy. In NICE clinical guideline 169:
National Institute for Health and Care Excellence, 2013
2.Triverio PA, Martin PY, Romand J, et al. Long-term prognosis after acute kidney injury
requiring renal replacement therapy. Nephrol Dial Transplant 2009; 24: 2186-89.
3.
KDIGO. KDIGO Clinical practice guideline for acute kidney injury. Kidney Int 2012;2: 8.
4.Mehta RL, Pascual MT, Soroko S, et al. Spectrum of acute renal failure in the intensive
care unit: The PICARD experience. Kidney Int 2014;66: 1613-21.
5.Kanagasundaram NS. Pathophysiology of ischaemic acute kidney injury. Ann Clin
Biochem 2015;52: 193-205.
6.Lattanzio MR, Kopyt NP. Acute Kidney Injury: New Concepts in Definition, Diagnosis,
Pathophysiology, and Treatment. J Am Osteopath Assoc 2009; 109:13-19.
7.Bagshaw SM, Gibney N. Conventional markers of kidney function. Crit Care Med 2008;
Vol. 36; No. 4.
8.Randers E., Erlandsen E.J. Serum cystatin C as an endogenous marker of the renal
function – a Review. Clin Chem Lab Med 1999; 37(4): 389–395.
9.Šter M. Ocena ledvične funkcije s cistatinom C pri bolnikih, operiranih na koronarnih
arerijah: magistrska naloga. Fakulteta za farmacijo, Ljubljana 2009.
10.Perazzella MA, Parikh CR. How can urine microscopy influence the differential diagnosis
of AKI. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4: 691-93.
11.Perazzella MA, Coca SG, Hall IE, et al. Urine microscopy is associated with severity
and worsening of acute kidney injury. Clin J Am Soc Nephrol 2010; 5: 402-8.
12.Bagshaww SM, Haase M, Haase-Fielitz, et al. A prospective evaluation of urine
microscopy in septic and non-septic acute kidney injury. Nephrol Dial Transplant 2012;
27: 582-88.
13.Schinstock CA, Semret MH, Wagner SJ, et al. Urinalysis is more specific and urinary
neutrophil gelatinase-associated lipocalin is more sensitive for early detection of
acute kidney injury. Nephrol Dial Transplant 2013; 28: 1175-85.
14.Mishra J, Mori K, Ma Q, e tal. Amelioration of ischemic of ischemic acute renal injury
by neutrophil gelatinase-associated lipocalin. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 3073 – 82.
15.Malyszko J. Biomarkers of acute kidney injury in different clinical settings: a time to
change the paradigm? Kidney Blood Press Res 2010; 33: 368-382.
16.Lisowska-Myjak B. Serum and Urinary Biomarkers of Acute Kidney Injury. Blood Purif
2010; 29: 357-365.
17.Muramatsu Y1, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PS,
Craig L, Hu X and Star RA. Early detection of cysteine rich protein 61 (CYR61, CCN1)
in urine following renal ischemic reperfusion injury. Kidney Int, 2002; 62:1601-10.
81
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
18.Lai CF, Lin SL, Chiang WC, et al. Blockade of Cysteine-rich Protein 61 Attenuates Renal
Inflammation and Fibrosis after Ischemic Kidney Injury. Am J Physiol Renal Physiol,
2014; 307: F581-F592.
19.Ichimura T, Asseldonk EJ, Humphreys BD, et al. Kidney injury molecule-1 is a
phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells.
J Clin Invest 2008: 118: 1657-68.
20.Hu MC , Moe OW. Klotho as a potential biomarker and therapy for acute kidney injury.
Nat Rev Nephrol, 2012. 8(7): p. 423-9.
21.Torregrosaa I, Montoliub C, Uriosb A, et al. Urinary Klotho measured by ELISA as an
early biomarker of acute kidney injury in patients after cardiac surgery or coronary
angiography. Nefrologia.2015;35:172-8.
22.Seo MY,Yang J, Lee JY, etal. Renal Klotho expression in patients with acute kidney injury
is associated with the severity of the injury. Korean J Intern Med. 2015;30:489-95.
23.Bonventre JV, Yang L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin
Invest 2011; 121: 4210-21.
82
83
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Novel markers neutrophil gelatinaseassociated lipocalin (NGAL) and cystatin
C in determining acute kidney injury after
heart operations using cardiopulmonary
bypass
/ Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na srcu z novejšimi
biooznačevalci /
Jurij Matija Kališnik1,2, Eva Hrovat1, Alenka Hrastovec3, Janez
Žibert4, Aleš Jerin5, Milan Skitek5
Department of Cardiovascular Surgery, University Medical Center, Ljubljana, Slovenia;
Department of Cardiac Surgery –Paracelsus Medical University Nuremberg, Germany;
3
Department of Anesthesiology, University Medical Center, Ljubljana, Slovenia;
4
Faculty of Health Sciences, Ljubljana, Slovenia;
5
Institute of Clinical Chemistry and Biochemistry, University Medical Centre, Ljubljana, Slovenia
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Results: According to AKIN classification 18 patients (44%) developed AKI
(AKI1-2 groups) and 23 (56%) did not (non-AKI group). Groups were similar
regarding demographics and operative characteristics. CysC levels differed
already preoperatively (non-AKI vs. AKI2; p=0.045; AKI1 vs. AKI2; p=0.011),
while postoperatively AKI2 group differed on first day and AKI1 on the second
regarding non-AKI group (p=0.004; p=0.021, respectively). NGAL showed
significant difference already 2h after CPB between groups AKI2 and non-AKI
and later on first postoperative day between groups AKI1 and AKI2 (p=0.028;
p=0.014, respectively).
Conclusions: Both novel markers NGAL and CysC proved efficient in
differentiating between AKI and non-AKI group after heart surgery using CPB.
While the postoperative peak of serum NGAL occurred as early as immediately
after separating from CPB, CysC peaked later in postoperative course, similarly
to creatinine only on the second postoperative day.
1
2
*The authors report no conflicts of interest. The Study was supported by funding from University
Medical Centre affiliated Research Trust under Grant Agreement No. 20100605.
The study was presented at 14th ISMICS annual scientific meeting in Boston (28-31 May 2014).
Abstract
Objective: Acute kidney injury (AKI) represents frequent complication after
cardiac surgery using cardiopulmonary bypass (CPB). The assessment of AKI
rests on creatinine levels, which are dependent on many parameters, causing
relatively late and less reliable AKI recognition after surgery. We tested the
utility of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and cystatin C
(CysC) for determination of AKI after cardiac surgery using CPB.
Methods: 41 patients met the inclusion criteria. Arterial blood samples collected
after induction of general anesthesia were used as baseline, further sampling
occurred at CPB termination, 2 hours after CPB, on the first and second day
after surgery.
84
1. Introduction
Acute kidney injury (AKI) after cardiac surgery with cardiopulmonary
bypass (CPB) represents a serious complication increasing morbidity and
mortality rate. Cardiac patients with AKI requiring renal replacement therapy
postoperatively suffer high mortality in the range from 30-80% (1-6). Not
surprisingly, to alleviate the devastating consequences of this serious
condition, reliable timely diagnosis is paramount.
Serum creatinine and/or diuresis remain first line diagnostic tools for AKI
determination despite well-known limitations. Firstly, creatinine serum
concentration is dependent on body weight and is therefore stable only
in stationary state. Secondly, it varies with respect to gender, age, muscle
mass, is affected by different drug uptake (e.g., cimetidine, cephalosporin),
hydration status and alimentation (7,8), so it may last as long as few days
until it becomes representative again after surgery (4). Kidney damage with
concomitant severe reduction in glomerular filtration rate (GFR) by 50% (9)
will result in serum creatinine increase, while small to moderate decrease
of GFR might not be detected at all. Not surprisingly, substantial kidney
tubular injury results in rise of creatinine concentration no earlier than 24
to 36 hours after the noxious event (1-3). Diuresis, on the other hand, is
85
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
not always a reliable marker of kidney function in the acute postoperative
period, as it is influenced by postoperative changes of endocrine regulation
and might already be induced by diuretic agents (3,10).
Due to the aforementioned reasons, classic markers of kidney function
exhibit low sensitivity, rendering them less suitable for early monitoring
and detection of AKI. Thus, the aim of our present study was to test the
utility of novel biomarkers neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)
and cystatin C (CysC) for early determination of AKI and assessing their
performance in identifying patients at risk of severe AKI after cardiac surgery
using CPB.
2. Methods
The study was designed as a prospective observational study, comparing
creatinine, NGAL and CysC levels in patients who develop AKI or not after
heart surgery using CPB. The National Medical Ethics Committee of the
Republic of Slovenia approved the study protocol and an informed consent
was obtained from all study participants prior to data collection. The study
was carried out at the Department of Cardiovascular Surgery, University
Clinical Centre Ljubljana, Slovenia from December 2012 to August 2013.
2.1 Study population
Patients, eligible for enrolment in our study, underwent one of the following
elective cardiac procedures using CPB: coronary artery bypass grafting
(CABG), isolated or combined aortic procedures, such as ascending aorta
and/or valve repair and/or replacement, mitral and/or tricuspid valve repair/
replacement in any combination. Exclusion criteria included: end stage
kidney disease on chronic dialysis, the use of radiocontrast agent 24 hours
prior to surgery, required emergent cardiac surgery, off-pump surgery,
age less than 18 years, history of previous open heart surgery and kidney
transplant recipients.
Preoperative patient’s characteristic, significant intraoperative risk factors
as well as peri- and postoperative complications were documented. Special
attention has been paid to account for any additional comorbidity, such as
86
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
arterial hypertension, diabetes mellitus, and hypercholesterolemia. Left
ventricular ejection fraction was determined for each patient preoperatively
using transthoracic echocardiography. Operative risk was calculated using
Euroscore II model. Estimated GFR (eGFR) was calculated using Modification
of Diet in Renal Disease (MDRD) formula (eGFR = 186 x serum creatinine-1.154
x age-0.203 x (1.210 if black) x (0.742 if female)). (11)
Patients were divided into two groups (AKI group and non-AKI group),
depending on the postoperative increase in serum creatinine. AKI group
was defined as having an increase in serum creatinine larger than or equal to
150% (1.5-fold) of baseline, or more than 26.4 µmol/L during the first 48 hours
after surgery. Results were compared between these two groups. Following
the Acute kidney Injury Network classification we further subdivided the AKI
group into three subgroups (AKI1, AKI2, AKI3) according to the severity of
postoperative peak creatinine rise (Table 1) (12).
Table 1. Acute Kidney Injury Network (AKIN) classification of AKI
Stage
Serum creatinine criteria
AKI1
Increase in serum creatinine of more than or equal to 26.4
μmol/L or increase to more than and equal to 150-200% from
baseline
AKI2
Increase in serum creatinine to more than or equal to 200-300%
from baseline
AKI3
Increase in serum creatinine to more than or equal to 300%
from baseline
*AKI = acute kidney injury
2.2 Blood samples collection and assays
Samples of arterial blood collected after induction of general anaesthesia
and before surgical incision were assigned as baseline reference. During
and after the operation, blood samples were obtained simultaneously at
four predetermined time-points: at the end of CPB, 2 hours after the end
of CPB, on the first and on the second postoperative day (24 and 48 hours
after surgery). Subsequent analyses were performed only in subjects with
87
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
available samples on all predetermined time-points. Blood samples were
collected in tubes without additive for the measurement of creatinine and
CysC. For the measurement of NGAL, tubes with ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) were used. After collection, samples were centrifuged to obtain
serum or plasma and then stored at -20°C for final analyses.
Determination of creatinine, CysC and NGAL was carried out by the Institute
of Clinical Chemistry and Biochemistry, University Medical Centre Ljubljana,
Slovenia. Creatinine in serum was measured using automated assay based
on modified kinetic Jaffe reaction (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.,
Newark, DE, USA); limit of detection was 9 µmol/L. For the measurement of
CysC in serum ELISA kit (BioVendor GmbH, Heidelberg, Germany) with 0.2
µg/L detection limit was used. Plasma concentration of NGAL was measured
with Advia analyser (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark, DE,
USA) using turbidimetric immunoassay (BioPorto Diagnostics, Gentofte,
Denmark); the limit of detection was 12 µg/L.
2.3 Statistical analysis
The differences of demographic and perioperative data between AKI and
non-AKI group were evaluated by two-tailed Student's t-test in normally
distributed data, while for non-normally distributed data a non-parametric
Mann-Whitney U test was applied. The differences in proportions between
AKI and non-AKI group were computed by Chi-square statistics. Mixeddesign repeated measures ANOVA was used in testing differences of serum
creatinine, CysC and plasma NGAL concentration measurements between
non-AKI, AKI1 and AKI2 groups. None of the subjects enrolled met the
criteria for AKI3. In repeated measures ANOVA a within-subjects factor was
time of measurement and a between-subject factor corresponded to AKI
groups. Further post-hoc pairwise tests using the Bonferroni correction were
applied to study differences of serum concentrations between different AKI
groups at each time point.
All statistical analyses were performed with a software package SPSS (version
20.0) and a p-value of less than 0.05 was considered to be statistically significant.
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
3. Results
41 patients were enrolled into the final study sample. 18 patients (44%)
developed AKI (AKI group) and 23 (56%) did not (non-AKI group). None
of AKI patients required renal replacement therapy. Importantly, AKI and
non-AKI groups were similar regarding preoperative creatinine level and
proportions of eGFR below 60 ml/min/1.73 m2. Other anthropometric and
demographic characteristics were comparable in AKI and non-AKI group
as depicted in Table 2.
Table 2. Clinical characteristics of the patients
Non-AKI
(n=23)
AKI
(n=18)
P-value
Age (yrs)
71.7 ± 11.7
77.0 ± 7.1
0.156
Gender (M/F)
14/9
12/6
0.146
BMI (kg/m2)
28.0 ± 4.9
28,2 ± 4,8
0.881
Euroscore II
2.3 ± 1.7
3.3 ± 2.3
0.189
Diabetes mellitus (non/oral/insulin)
19/4/0
14/2/2
0.240
Arterial hypertension (Y/N)
22/1
18/0
0.370
Hypercholesterolemia (Y/N)
10/13
12/6
0.139
Left ventricular ejection fraction (%)
65.2 ± 12.3
63.2 ± 6.9
0.603
Preoperative creatinine
79 ± 13
89 ± 25
0.129
Preoperative eGFR
82.2 ± 18.8
76.5 ± 27.0
0.431
eGFR ≤ 60 ml/min/1.73 m2 (number of
patients)
4
5
0.425
*Data are represented as mean ± SD. AKI = acute kidney injury; BMI = body mass index; eGFR = estimated
glomerular filtration rate. Statistically significant difference between the groups is considered at p < 0.05.
Among intraoperative factors, regardless of the type of operation, CPB
was associated with increased incidence of AKI with borderline significance
88
89
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
level, while AKI group received significantly more units of red blood cell
transfusion as shown in Table 3.
Table 3. Perioperative characteristics of the patients
Non-AKI
(n=23)
AKI
(n=18)
P-value
CPB time (min)
91.5 ± 21.7
106.4 ± 33.2
0.090
Cross clamp time (min)
70.1 ± 21.4
81.4 ± 31.6
0.215
RBC transfusion
2.6 ± 3.1
3.9 ± 2.8
0.036
Fresh frozen plasma
transfusion
2.22 ± 2.0
2.3 ± 3.2
0.593
Platelets transfusion
0.17 ± 0.49
0.28 ± 0.56
0.458
Respiratory support (h)
16.6 ± 22.3
13.8 ± 10.1
0.782
Inotropes (h)
27.4 ± 49.2
40.1 ± 41.1
0.204
ICU stay (days)
7.4 ± 9.4
4.8 ± 1.9
0.179
Hospital stay (days)
14.5 ± 14.2
11.4 ± 5.9
0.916
Dialysis
0
0
-
Death (Y/N)
0/23
1/17
0.252
Intraoperative data
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
early in the course and returned to baseline within 48 hours. Rise of serum
creatinine was significantly higher in AKI2 group already two hours after
CPB termination (p = 0.038) (Figure 1).
Given the AKI determination is predominantly based on creatinine dynamics,
a repeated measures ANOVA confirmed that the mean creatinine values
differed statistically significantly at different time points regardless of AKI
grade (p < 0.001) and also with respect to AKI group (p < 0.001) as presented
in Figure 1. While creatinine did not differentiate AKI groups according to
severity of renal impairment at CPB termination, it started to do so 2 hours
after CPB termination exhibiting rough 10% additional rise in AKI2 group.
24 and 48 hour samples revealed fully expressed differences across groups
as expected (Figure 1).
Postoperative data
Data are represented as mean ± SD. AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass; ICU = intensive
care unit; RBC = red blood cell. Statistically significant difference between the groups is considered at p < 0.05.
3.1 Creatinine
In AKI group serum creatinine concentration started to rise two hours after
CPB termination and progressively reaching peak or plateau levels within 24
or 48 hours after CPB. In non-AKI group serum creatinine levels stabilized
Figure 1. Estimated marginal means of serum creatinine. Blue dots correspond to
statistically significant differences of the post-hoc pair-wise comparisons of serum
creatinine concentrations in the repeated measures ANOVA, presented in Table 5.
AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass.
90
91
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
3.2 Cystatin C
3.3 NGAL
Preoperative serum CysC was highest in patients developing highest grade
of AKI postoperatively (p = 0.045) compared to non-AKI group. Starting
CysC levels differed also with respect to extent of AKI after surgery (p =
0.011). Postoperatively, CysC levels were significantly higher in AKI2 group
on the first and on the second postoperative day (p = 0.004; p < 0.001,
respectively), whereby excessive increase in CysC in AKI1 occurred later
on the second postoperative day (p = 0.021). Noteworthy, we found CysC
dynamics profile similar to that of creatinine within 48 hours following
cardiac surgery (Figures 1 and 2).
While not distinguishing between groups preoperatively, NGAL in AKI2
group at 2 hours after CPB termination exceeded the NGAL value in non-AKI
group by rough 50% (p = 0.028). As shown in Figure 3, it displayed highest
discriminatory power on the first postoperative day sharply differentiating
between AKI1 and AKI2 groups and AKI2 and non-AKI groups (p = 0.014; p <
0.001, respectively), while on the second postoperative day subsiding NGAL
values still demarcated AKI2 from non-AKI group (p < 0.001).
Figure 2. Estimated marginal means of serum Cystatin C. Blue dots correspond to
statistically significant differences of the post-hoc pair-wise comparisons of serum
Cystatin C concentrations in the repeated measures ANOVA, presented in Table 7.
AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass.
92
Figure 3. Estimated marginal means of plasma neutrophil gelatinase-associated
lipocalin (NGAL). Blue dots correspond to statistically significant differences of the
post-hoc pair-wise comparisons of plasma NGAL in the repeated measures ANOVA,
presented in Table 9.
AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass.
93
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
4. Discussion
Although without any manifested kidney dysfunction, we found that patients
developing highest grade of AKI after operation, that is AKI2, had significantly
elevated levels of CysC already before operation. Conversely, creatinine
and NGAL levels in patients with highest AKI grade were elevated already
two hours after CPB termination. NGAL peaked earliest directly after CPB
termination and returned towards baseline on the first postoperative day in
patients without or with only mild renal impairment (AKI1) while CysC and
creatinine incrementally achieved peak values only on the first and second
postoperative day respectively, having similar patterns in the first 24 hours
after CPB, consistent with a hemodilution effect.
Creatinine, CysC, NGAL and AKI
It is known that chronic kidney disease increases the incidence of AKI
following CPB (7,15,22). Including patients with pre-existing renal dysfunction
and preoperative GFR 60 ml/min/1,73 m2 or below did not uniformly predict
AKI in our study since only in half of them kidney function got worse in
postoperative period.
According to the literature, creatinine concentration immediately after CPB
drops below preoperative levels despite intraoperative kidney injury (23,24).
The latter is attributed to the influence of haemodilution. Svenmarker et al.
concluded that haemodilution induced by CPB significantly overestimates
the renal function as indicated by eGFR based on serum markers (25). In line
with previous observations we found lowered serum creatinine and CysC
consistent with haemodilution immediately after separation from CPB in
all studied groups. Despite the observed limitation, serum creatinine rose
significantly high already two hours post-CPB in patients developing AKI2.
On the other hand, lower grade AKI (AKI1) was reflected in creatinine rise
no earlier than first day after surgery, which is in line with other authors who
reported disability to diagnose AKI by serum creatinine until at least the first
postoperative day (2), since in their case serum creatinine did not increase
by 50% in AKI until second postoperative day (3). Thus, creatinine might be
helpful at predicting higher grades of AKI, while lower grades of AKI can be
missed easily immediately after surgery, the latter consequently enhancing
subsequent progress to more extensive kidney impairment, since appropriate
94
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
interventions are delayed because of late diagnosis.
CysC recently emerged as a potential diagnostic marker of AKI. CysC is a
nonglycosylated 13kDa basic protein that is a member of cystatin superfamily
of cysteine protease inhibitors (3). It is produced constantly by all nucleated
cells, unaffected by muscle mass (unlike creatinine), gender, age, race, and
protein intake (26,27). CysC is excreted by glomerular filtration and then fully
catabolized in the proximal renal tubule without being secreted or reabsorbed
(16). Serum values correspond to GFR, meanwhile high urinary values point
out tubular injury (3). Shlipak et al. concluded in their large, multi-center study
that pre-surgical CysC is better than creatinine or creatinine-based eGFR at
forecasting the risk of AKI after cardiac surgery (17), however they did not
find any difference regarding AKI grade. In contrast, we found that patients
developing AKI2 have increased CysC plasma levels before operation while
AKI1 patients have CysC levels similar to non-AKI group.
NGAL is a small 25kDa protein covalently bound to gelatinase and secreted
from neutrophils and epithelial cells. It is expressed at low levels in various
organs containing epithelial tissue, including the kidneys, trachea, lungs,
stomach and large intestine (28). During AKI, NGAL expression is increased
in kidneys as well as systemically, protein synthesis occur in other organs,
particularly the liver and the lungs, leading to the rise in systemic NGAL. NGAL
is released from neutrophils, macrophages and other immune cells, which
add part to the systemic rise in concentration (29), however, predominantly
elevated plasma NGAL concentration reflects a change in renal glomerular
function (decreased filtration) and /or in structural tubular injury (30).
With respect to preoperative values, plasma NGAL levels were not different
in patients who developed AKI postoperatively. This is in accordance with
results of Hasse-Fielitz et al. (9). Upgrading previous reports in adult cardiac
patients (2,3,9) results of our study demonstrate that significant plasma NGAL
increase 2h after CPB termination could identify patients that presented with
severe kidney impairment with a peak rise of creatinine up to 200 μmol/L 48
hours after surgery. In contrast to Koyner et al. (3), the conclusions could be
drawn from the results of plasma samples rather than urine. In sharp contrast
with serum CysC and creatinine, NGAL peaked highest in all three groups
immediately after separating from CPB demonstrating different temporal
profile as the other two markers. Although we could discriminate among
patients progressing to AKI1 and AKI2 group already two hours after CPB, it is
obviously too preliminary and beyond the scope of the present study to infer
any relationship between the peak NGAL values and any subsequent clinical
acute and intermediate consequences on the progression of kidney disease.
95
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
References
1.Wagener G, Gubitosa G, Wang S, et. al. Urinary Neutrophil Gelatinase-Associated
Lipocalin and Acute Kidney Injury After Cardiac Surgery. Am J Kidney Dis. 2008; 52:
425-33.
2.Tuladhar SM, Püntmann VO, Soni M, et. al. Rapid Detection of Acute Kidney Injury by
Plasma and Urinary Neutrophil Gelatinase–associated Lipocalin After Cardiopulmonary
Bypass. J Cardiovasc Pharmacol. 2009; 53: 261-6.
3.Koyner JL, Bennett MR, Worcester EM, et al. Urinary cystatin C as an early biomarker
of acute kidney injury following adult cardiothoracic surgery. Kidney Int. 2008; 74:
1059-69.
4.Dent CL, Ma Q, Dastrala S, et al. Plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin
predicts acute kidney injury, morbidity and mortality after pediatric cardiac surgery:
a prospective uncontrolled cohort study. Crit Care. 2007; 11: R12.
5.Conlon PJ, Stafford-Smith M, White WD, et al. Acute renal failure following cardiac
surgery. Nephrol Dial Transplant. 1999; 14: 1158-62.
6.Mangano CM, Diamonstone LS, Ramsay JG, et al. Renal dysfunction after myocardial
revascularization: risk factors, adverse outcomes and hospital utilization. Ann Intern
Med. 1998; 128: 194-203.
7.Hudson C, Hudson J, Swaminathan M, Shaw A, et al. Emerging Concepts in Acute
Kidney Injury Following Cardiac Surgery. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 2008; 12:
320-30.
8.Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL): A new marker of
kidney disease. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2008; 241: 89-94.
9.Haase-Fielitz A, Bellomo R, Devarajan P, et al. Novel and conventional serum biomarkers
predicting acute kidney injury in adult cardiac surgery- A prospective cohort study.
Crit Care Med. 2009; 37: 553-60.
10.Sykes E, Cosgrove JF. Acute renal failure and the critically ill surgical patient. Ann R
Coll Surg Engl. 2007; 89: 22-9.
11.National kidney foundation. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney
disease: evaluation, classification, and stratification. Am J Kidney Dis. 2002; 39 (2
Suppl 1): S1-266.
12.Mehta RL, Kellum JA, Shah SV, Molitoris BA, Ronco C, Warnock DG, Levin A, Acute
Kidney Injury Network: Report of an initiative to improve outcomes in acute kidney
injury. Crit Care 2007; 11: R31.
13.Shaw A. Update on acute kidney injury after cardiac surgery. J Thorac Cardiovasc Surg.
2012 Mar; 143: 676-81.
14.Thakar CV, Arrigain S, Worley S, et al. A Clinical Score to Predict Acute Renal Failure
after Cardiac Surgery. J Am Soc Nephrol. 2005; 16: 162-8.
15.Landoni G, Bove T, Crivellari M, et al. Acute renal failure after isolated CABG surgery:
six years of experience. Minerva Anestesiol. 2007; 73: 559-65.
16.Wald R, Liangos O, Perianayagam MC, et al. Plasma cystatin C and acute kidney injury
after cardiopulmonary bypass. Clin J Am Soc Nephrol. 2010; 5:1373-9.
17.Shlipak MG, Coca SG, Wang Z, et al. Presurgical serum cystatin C and risk of acute
kidney injury after cardiac surgery. Am J Kidney Dis. 2011; 58: 366-73.
18.Salis S, Mazzanti VV, Merli G, et al. Cardiopulmonary bypass duration is an independent
predictor of morbidity and mortality after cardiac surgery. J Cardiothorac Vasc Anesth.
96
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
2008; 22: 814-22.
19.Kumar AB, Suneja M. Cardiopulmonary Bypass–associated Acute Kidney Injury.
Anesthesiol. 2011; 114: 964-70.
20.Parikh CR, Devarajan P, Zappitelli M, et al. Postoperative biomarkers predict acute
kidney injury and poor outcomes after pediatric cardiac surgery. J Am Soc Nephrol.
2011; 22: 1737-47.
21.Alsabbagh MM, Asmar A, Ejaz NI, et al. Update on clinical trials for the prevention
of acute kidney injury in patients undergoing cardiac surgery. Am J Surg. 2013; 206:
86-95.
22.Doi K, Urata M, Katagiri D, et al. Plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin
in acute kidney injury superimposed on chronic kidney disease after cardiac surgery:
a multicenter prospective study. Crit Care. 2013; 17: R270.
23.Wagener G, Jan M, Kim M, et al. Association between Increases in Urinary Neutrophil
Gelatinase–associated Lipocalin and Acute Renal Dysfunction after Adult Cardiac
Surgery. Anesthesiol. 2006; 105: 485-91.
24.Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL): A new marker of
kidney disease. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2008; 241: 89-94.
25.Svenmarker S, Häggmark S, Holmgren A, et al. Serum markers are not reliable measures
of renal function in conjunction with cardiopulmonary bypass. Interact Cardiovasc
Thorac Surg. 2011; 12: 713-7.
26.Perianayagam MC, Seabra VF, Tighiouart H, et al. Serum Cystatin C for Prediction of
Dialysis Requirement or Death in Acute Kidney Injury: A Comparative Study. Am J
Kidney Dis. 2009; 54: 1025-33.
27.Keller CR, Odden MC, Fried LF et al. Kidney function and markers of inflammation in
elderly persons without chronic kidney disease: the health, aging, and body composition
study. Kidney Int. 2007; 71: 239-44.
28.Xu S, Venge P. Lipocalins as biomarkers of disease. Biochim Biophys Acta. 2000; 1482:
298-307.
29.Schmidt-Ott KM, Mori K, Li JY, et al. Dual action of neutrophil gelatinase-associated
lipocalin. J Am Soc Nephrol. 2007; 18: 407-13.
30.Pickering JW, Endre ZH. The clinical utility of plasma neutrophil gelatinase-associated
lipocalin in acute kidney injury. Blood Purif. 2013; 35: 295-302.
97
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Kronična ledvična bolezen
/ Chronic kidney disease /
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
for the proper multidisciplinary evaluation and treatment of kidney patients to
reverse the epidemic of chronic kidney disease.
Keywords: chronic kidney disease, screening.
Jelka Lindič
Klinični oddelek za nefrologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, 1000 Ljubljana
1. Uvod
Povzetek
Chronic kidney disease is a major public health problem. Mostly it is associated
with diabetes, arterial hypertension and aterosclerotic hearth and vessel disease.
With preventive lifestyle, early detection in the groups with risk factors and timely
initiation of treatment we can slow the deterioration of renal function, prevent
complications, reduce mortality and occurrence of end-stage renal disease.
The disease has nonspecific early signs, therefore assessment of estimated
glomerular filtration rate, proteinuria, erythrocyturia and other significant
changes in urine sediment are of crucial importance. With synergistic approach
between laboratory and clinical medicine we can create the right conditions
Kronična ledvična bolezen je bila prepoznana kot pogosta kronična bolezen
s slabim izhodom šele leta 2002, ko so bila s pomočjo delovne skupine
National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (NKF
KDOQI) opredeljena jasna merila za njeno prepoznavanje in obravnavo (1).
Ta merila so bila dopolnjena in usklajena leta 2012 v okviru delovne skupine
Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) in so izhodišča za
obravnavo teh bolnikov (2). Svetovna zdravstvena organizacija od leta 2006
uvršča kronično ledvično bolezen med prioritete pri obravnavi nenalezljivih
kroničnih bolezni, ker zaradi velike pogostosti predstavlja v svetu in pri nas
velik javnozdravstveni problem. Ocenjujemo, da ima v Sloveniji kronično
ledvično bolezen več kot 200.000 ljudi, pojavnost narašča sorazmerno s
starostjo. Ima jo kar vsaka deseta odrasla oseba, kar presega pojavnost
sladkorne bolezni. Vzrok za takšno pogostnost je dejstvo, da je pri večini
bolnikov posledica drugih najpogostejših kroničnih bolezni, kot so sladkorna
bolezen, arterijska hipertenzija in aterosklerotična srčno-žilna bolezen. Ima
jo kar vsaka tretja oseba s sladkorno boleznijo in vsaka peta z arterijsko
hipertenzijo, zato sta ti dve bolezni vzrok za kronično ledvično bolezen kar
pri 60% bolnikov. V poteku bolezni se pojavljajo zapleti kronične ledvične
bolezni, kot so ledvična anemija, presnovna acidoza in kostna bolezen, ki
dodatno vplivajo na zdravstveno stanje obolelih. Sčasoma lahko nastane
končna odpoved ledvic, ki poslabša kvaliteto bivanja in je združena z velikimi
stroški zdravljenja (1-3).
Poseben problem pri teh bolnikih, ki ga pri vsakdanjem delu še premalo
prepoznavamo, je večje tveganje za obolevnost in smrtnost zaradi srčnožilnih bolezni kot pri populaciji bolnikov brez kronične ledvične bolezni.
Tveganje za smrt je povečano pri stopnji kronične ledvične bolezni 3 in več
ali pri prisotni proteinuriji oziroma albuminuriji in se povečuje sorazmerno s
slabšanjem ledvičnega delovanja ter večanjem proteinurije ali albuminurije
in je kar 10-100x večje kot pri splošni populaciji. Večina starejših bolnikov
98
99
Kronična ledvična bolezen predstavlja velik problem javnega zdravja.
Najpogosteje je posledica sladkorne bolezni, arterijske hipertenzije in srčno-žilnih
bolezni. S preventivnim načinom življenja, zgodnjim odkrivanjem pri skupinah
z dejavniki tveganja in pravočasno uvedbo zdravljenja lahko upočasnimo
slabšanje ledvičnega delovanja in s tem povezane zaplete, zmanjšamo smrtnost
in nastanek končne odpovedi ledvic. Ker bolezen dolgo časa poteka tiho, so
preiskave za oceno glomerulne filtracije, oceno proteinurije, najdbo eritrociturije
in drugih značilnih sprememb v sedimentu ključnega pomena. Z usklajenim
sodelovanjem med laboratorijsko in klinično medicino je možno ustvariti ustrezne
pogoje za multidisciplinarno obravnavo bolnika na vseh nivojih zdravstvene
obravnave in zaustaviti epidemijo kronične ledvične bolezni.
Ključne besede: kronična ledvična bolezen, presejalne preiskave.
Abstract
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
zato umre prej kot pa nastane končna odpoved ledvic (1-2).
Pri obravnavi kronične ledvične bolezni so ključnega pomena:
•preventivni ukrepi za preprečevanje njenega nastanka z zdravim
življenjskim slogom,
•
zgodnje odkrivanje,
•
čim prejšnja uvedba neimunološkega in imunološkega zdravljenja,
•
primarna in sekundarna preventiva srčno-žilnih bolezni.
Na ta način lahko zmanjšamo pojavnosti bolezni, zaustavimo ali upočasnimo
njeno napredovanje, preprečimo nastanek srčno-žilnih zapletov in končne
ledvične odpovedi, zmanjšamo smrtnost in omogočimo pravočasno pripravo
na nadomestno zdravljenje končne odpovedi ledvic. Zaradi kompleksnosti
obravnave in prehajanja bolnika med primarnim, sekundarnim in terciranim
nivojem je potrebna multidisciplinarna obravnava bolnika, ki zahteva
usklajeno sodelovanje med laboratorijsko in klinično medicino.
2. Dejavniki tveganja za kronično ledvično bolezen
Kronična ledvična bolezen poteka tiho brez zanjo značilnih kliničnih znakov
in simptomov. Težave se pojavijo šele pri napredovali stopnji bolezni oziroma
uremiji, ko končne odpovedi ledvic ne moremo več preprečiti. Bolniki se
slabo počutijo, slabo jim je, bruhajo, imajo drisko, bolečine v prsih, zvišan
krvni tlak, otekajo, težko dihajo, odvajajo manj seča, ki se lahko peni in je
zelo prosojen ali pa temen. Za zgodnje odkrivanje kronične ledvične bolezni
je zato ključno prepoznati dejavnike tveganja za nastanek kronične ledvične
bolezni, ki so:
•
sladkorna bolezen,
•
arterijska hipertenzija,
•aterosklerotična srčno-žilna bolezen (ishemična bolezen srca, srčno
popuščanje, periferna arterijska okluzivna bolezen in cerebrovaskularna
bolezen),
•znana kronična ledvična bolezen pri sorodniku prvega kolena ne glede
na vzrok,
•
debelost (indeks telesne mase > 30 kg/m2),
•
kajenje,
•
slabši socialno-ekonomski status,
•strukturne motnje v sečilih z oviro odtoka seča (hiperplazija prostate,
sečni kamni, nevrogeni mehur in podobno),
100
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
•sistemska bolezen, ki lahko prizadene ledvice (SLE, sistemski vaskulitis,
plazmocitom, revmatioidni artritis in podobno),
•
starost nad 50 let.
S sistematičnim iskanjem prisotnosti kronične ledvične bolezni pri naštetih
skupinah ljudi bolezen odkrijemo v zgodnjem obdobju, kar vodi v hitro
diagnostično obravnavo in zdravljenje, s katerim zmanjšamo obolevnost
in umrljivost in ne povečamo, ampak celo zmanjšamo stroške obravnave
in zdravljenja (1-3).
3. Kriteriji za prisotnost kronične ledvične bolezni
Kako dobro ali slabo delujejo ledvice nam pove določitev glomerulne filtracije,
na vrsto ledvične bolezni pa sklepamo s pomočjo pregleda seča s testnim
lističem, sulfasalicilno kislino in mikroskopskim pregledom sedimenta
seča. Kriteriji za postavitev diagnoze kronična ledvična bolezen so jasno
opredeljeni, nazadnje so bili v mednarodnem smislu dopolnjeni leta 2012
v kliničnih in praktičnih smernicah za obravnavo kronične ledvične bolezni
KDIGO (2). O kronični ledvični bolezni govorimo, ko je v obdobju 3 mesecev
dokumentirano prisotna:
1.izmerjena ali ocenjena glomerulna filtracija (oGF) zmanjšana pod 60
mL/min/1,73 m2 ali
2. bolezen ledvic, ki se kaže z nenormalnimi najdbami v seču:
• proteinurija (albuminurija),
•nenormalnost v sedimentu seča (eritrociturija, ki je praviloma
glomerulna, eritrocitni cilinder, levkocitni cilinder, maščobni cilinder,
tubulni epitelni cilinder, ovalna maščobna telesca, maščobne
kapljice),
•nenormalnost v delovanju tubulov (ledvična tubulna acidoza,
nefrogeni diabetes insipidus, ledvično izgubljanje kalija ali magnezija,
Fanconijev sindrom, cistinurija),
3.morfološka sprememba pri slikovnih preiskavah (npr. ultrazvočna
preiskava pri avtosomno dominantni policistični bolezni ledvic),
4.z biopsijo dokazana ledvična bolezen.
Glede na ugotovljeno oGF in proteinurijo razvrstimo kronično ledvično bolezen
v več stopenj in razredov, hkrati s tem pa ugotovimo, kakšno je srčno-žilno
tveganje in tveganje za nastanek končne odpovedi ledvic (preglednica 1).
101
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Preglednica 1. Relativno tveganje za napredovanje, srčno-žilne zaplete in smrt glede
na stopnjo oGF in proteinurijo ali albuminurijo. Tveganje se povečuje s slabšanjem
ledvičnega delovanja in večanjem proteinurije, kot prikazuje stopnjevanje sivine v
poljih. Legenda: KLB – kronična ledvična bolezen, U – v vzorcu seča, alb. – albumin,
belj. – beljakovine, kreat. – kreatinin. Modificirano po (2).
Stopnja albuminurije,
proteinurije in ocena
glomerulne filtracije
oGF
(mL/
min/1,73
m2)
stopnja
KLB
> 90
KLB 1
60 - 89
KLB 2
45 - 59
KLB 3 A
30 - 44
KLB 3 B
15 - 29
KLB 4
< 15
KLB 5
normalno
albuminurija
U-alb./kreat.
> 3 g/mol
A1
A2
proteinurija
nefrotska
proteinurija
U-belj./kreat.
> 20 g/mol
U-belj./kreat.
> 300 g/mol
A3
A4
Med laboratorijske presejalne preiskave za ugotavljanje prisotnosti kronične
ledvične bolezni sodijo:
•
oGF, ki pove, kako dobro delujejo ledvice,
•ocena prisotnosti proteinurije in njene velikosti, na osnovi katere
sklepamo o vrsti ledvične bolezni, hitrosti napredovanja bolezni in
tveganju za sočasno srčno-žilno bolezen in s tem povezane zaplete,
•pregled seča s testnim lističem, s katerim ocenimo kemično sestavo
seča in ugotovimo eritrociturijo ali levkociturijo,
102
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
•pregled sedimenta seča, s katerim opredelimo vrsto eritrociturije in
iščemo prisotnost drugih celic, cilindrov in pomembnih bolezenskih
najdb v sedimentu seča, na osnovi katerih lahko sklepamo, kaj je vzrok
za ledvično bolezen.
4. Ocena glomerulne filtracije
Diagnostične presejalne preiskave za oceno glomerulne filtracije (oGF)
in prisotnost proteinurije ali albuminurije so bile pri nas opredeljene leta
2009 v okviru delovne skupine strokovnjakov različnih strok, ki se srečujejo
z obravnavo bolnikov s kronično ledvično boleznijo (ISIS) (4, 5). Posebna
pozornost je bila namenjena oGF in oceni proteinurije.V letu 2014 je na osnovi
priporočil 2012 Kidney Disease, Improving Global Outcomes (KDIGO) Clinical
Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney
Disease razširjeni strokovni kolegij za laboratorijsko diagnostiko sprejel
sklep o implementaciji nove enačbe za izračun hitrosti glomerulne filtracije
po enačbi raziskave Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration
iz leta 2009 (CKD-EPI) (2, 6). Spremembo priporočila so pogojevala nova
priporočila, osnovana na dejstvu, da je ocena glomerulne filtracije z oGF
CKD-EPI realnejša v primerjavi z oGF MDRD in realna prevalenca kronične
ledvične bolezni na osnovi uporabe oGF CKD-EPI manjša. V praksi si kliniki
želimo, da bi bile uporabljene metode takšne, da bi bil rezultat izmerjene
koncentracije kreatinina in izračunane oGF čim zanesljivejši, variabilnost
znotraj laboratorija in med laboratoriji pa čim manjša.
Ključna priporočila so:
•vsem laboratorijem je bila za določanje kreatinina v serumu ali plazmi
priporočena uporaba metode, ki je sledljiva do referenčne izotopske
dilucijske masne spektroskopske metode (IDMS),
•sočasno s poročanjem o koncentraciji kreatinina v serumu ali plazmi
se avtomatsko poroča tudi o oGF CKD-EPI,
•rezultati se izražajo kot kvantitativne vrednosti do 90 mL/min/1,73m2
in kot >90 mL/min/1,73m2, starostne omejitve nad 75 let ni več, ne
uporablja se do starosti 18 let.
•v primeru kronične ledvične bolezni stopnje 3, pri kateri ni drugih jasnih
označevalcev ledvične bolezni, lahko oGF izračunamo s pomočjo enačbe
oGFcys CKD-EPI na osnovi določitve koncentracije cistatina C v serumu.
103
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
5. Ocena proteinurije
Vsaka preiskava seča je odvisna od načina odvzema seča. Pravilen odvzem
seča mora biti standardiziran in izpolnjeni morajo biti določeni pogoji. Na izvid
vplivajo prehrana, stradanje, napor, počitek, čas zadrževanja seča v sečnem
mehurju, okužba in ejakulacija semena pri moških, zato preiskovance na to
opozorimo. Opozorimo jih tudi, da dva dni pred načrtovanim standardiziranim
odvzemom seča niso telesno aktivni (hoja v hrib, tek, tenis ipd.) in da ne
uživajo mesa. Moški naj bodo en dan pred preiskavo spolno vzdržni, ženske
pa naj ne opravljajo preiskav seča v času menstruacije (5).
Za vse preiskave seča je diagnostična preiskava srednjega curka drugega
jutranjega seča, o načinu odvzema seča mora biti preiskovanec ustno in pisno
dobro poučen. Preiskovanec od 22. ure prejšnjega dne ne pije, ko vstane,
urinira v straniščno školjko, spije do največ 2 dL vode, sedi ali hodi, nato pa
po dveh urah po predhodnem očiščenju spolovila zajame srednji curek seča
brez prekinitve mikcije. Napačen odvzem zaradi pomanjkljivih navodil še
vedno kar pogosto onemogoča interpretacijo izsledkov analize seča.
5.1 Testni listič in sulfosalicilna kislina
Za ugotavljanje proteinurije je najprej potrebna analiza vzorca seča s testnim
lističem za analizo seča in hkrati s sulfosalicilno kislino. Na ta način ne
spregledamo prelivne proteinurije, saj je testni listič najbolj občutljiv za
albumine, za druge beljakovine pa bistveno manj. S preiskavo s testnim
lističem ugotovimo, ali je prisotna proteinurija, ne pa, kako velika je.
5.2 Razmerje U-beljakovine/kreatinin
Če je pri preiskavi seča s testnim lističem prisotna proteinurija stopnje 1
ali več, njeno velikost ovrednotimo s kvantitativno določitvijo beljakovin
in kreatinina v drugem jutranjem vzorcu seča. Laboratorij izsledke podaja
kot količnik U-beljakovine/kreatinin v g/mol, dodatno z vrednostjo količnika
lahko poda še oceno dnevne proteinurije (oDP). Vrednost količnika nad 20 g/
mol ali oDP nad 0,150 g/dan/1,73 m2 je patološka. Z izražanjem rezultata na
enoto kreatinina zmanjšamo napako zaradi večje ali manjše koncentriranosti
104
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
seča. Če je seč preveč razredčen in zato koncentracija kreatinina v vzorcu
seča pod 2 mmol/L, laboratorij ne poda izsledkov meritve, ampak na izvid
napiše pojasnilo, da je vzorec seča neustrezen in meritve nezanesljive.
Zakaj je pri pozitivnem rezultatu testnega lističa bolj smiselno določati
proteinurijo, čeprav veliko smernic priporoča kot prvo preiskavo določitev
albuminurije? Prvi vzrok je, da v primeru določanja albuminurije pri kar 16
% bolnikih spregledamo proteinurijo, ki ni glomerulnega izvora, kar lahko
zaradi zakasnitve diagnostike in zdravljenja poslabša izhod bolezni (7).
To velja tudi za bolnike z diabetično ledvično boleznijo zaradi sladkorne
bolezni tipa 2, kjer kar tretjina kljub zmanjšani GF v seču nima albuminurije,
ampak tubulno proteinurijo (8). Drugi vzrok je, da določanje albuminurije in
tubulne proteinurije kot presejalne preiskave nima nobene prednosti pred
določanjem proteinurije, ki zazna večino beljakovin v seču, med drugim tudi
lahke verige in imunoglobuline, ki bi jih z usmerjenim iskanjem albuminurije
in tubulne proteinurije zlahka spregledali (5). Tretji vzrok je, da se z večanjem
albuminurije pojavi in veča tubulna proteinurija, ki je posledica resorbcijske
okvare tubulov, zato je celokupna proteinurija večja. Četrti vzrok je, da
proteinurija enako dobro kot albuminurija napoveduje tveganje za slabšanje
ledvičnega delovanja in nastanek končne odpovedi ledvic, srčno-žilne zaplete
in s tem povezano večjo smrtnost (9). Peti vzrok je ekonomske narave, saj je
določanje albuminurije do 10-krat dražje od določanja proteinurije in če bi
temu pridružili še določanje tubulne proteinurije, bi se dodatno zmanjšala
diagnostična zanesljivost pri odkrivanju proteinurije terstroški povečali.
5.3 Razmerje U-albumin/kreatinin
Če pri preiskavi seča s testnim lističem ni proteinurije (izsledek je 0), je
priporočena preiskava za odkritje bolezenske albuminurije kvantitativna
določitev albumina in kreatinina v vzorcu seča, ko je to klinično indicirano.
To velja tako za nediabetično kot diabetično ledvično bolezen. Laboratorij
izsledke podaja kot razmerje U-albumin/kreatinin v g/mol. Za bolezensko
vrednost štejemo vrednost več kot 3 g/mol ne glede na spol (5).
105
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
6. Mikroskopski pregled sedimenta seča
Mikroskopsko preiskavo sedimenta seča so redno začeli opravljati zdravniki
v prvi polovici 17. stoletja in je bila že takrat nepogrešljiv del obravnave.
Tudi danes je izjemno pomembna za opredelitev vzroka oziroma vrste
ledvične bolezni. S pojavom testnih lističev in večanjem potreb se je izvedba
preiskave večinoma preselila v laboratorije in postaja zaradi velike količine
vzorcev poslanih na analizo vedno bolj avtomatizirana. Avtomatizirana
analiza seča je v smislu presejalnih preiskav nepogrešljiva za ugotavljanje
kemičnih lastnosti seča in izključevanje bolezenskih najdb, kot so eritrociturija
in levkociturija. Poteka lahko dvostopenjsko na način, da se na osnovi
normalnih izvidov analize testnega lističa izbere vzorce, ki zahtevajo ročni
pregled sedimenta seča. Ta način je zamuden in v primerjavi s povsem
avtomatiziranimi sistemi, ki opravijo analizo v eni minuti, v povprečju traja
6 minut, v primeru kvantifikacije proliferativnega sedimenta pa bistveno dlje
(10). V zadnjih letih se je tehnologija na tem področju na srečo zelo razvila, na
tržišču so avtomatizirani analizatorji, ki omogočajo hitro analizo s testnimi
lističi, prepoznavo delcev v sedimentu in njihov prikaz (11). Na ta način je
možno v kratkem času opraviti analizo velikega števila vzorcev, povečati
zanesljivost analize in zmanjšati breme zaradi ročnih analiz sedimenta seča.
Analiza sedimenta seča s fazno-kontrastnim mikroskopom je ključna pri
ločevanju med glomerulno in neglomerulno eritrociturijo: pri glomerulni
eritrocituriji najdemo v sedimentu vsaj 40% dismorfnih eritrocitov ali vsaj
5% akantocitov (slika 1), pri neglomerulni pa izomorfno eritrociturijo (12).
Izraz izluženi eritrociti se je opustil, saj pomeni samo spremembo oblike
eritrocitov zaradi osmotskih lastnosti seča in niso dismorfni. Pomembne
najdbe v sedimentu so tudi eritrocitni, levkocitni in celični cilindri, prisotnost
ledvičnih tubulnih in uroepitelnih celic, Decoyevih celic, maščobnih kapljic
in diagnostičnih kristalov (13, 14).
106
Slika 1. Dismorfni eritrociti in akantociti .
Figure 1. Dysmorphic erythrocytes and acantocytes
Kljub napredku tehnologije in razvoju laboratorijske dejavnosti avtomatizirana
obravnava vzorcev še vedno ne more nadomestiti mikroskopskega pregleda
seča (15, 16), saj ekspertni sistemi niso idealni. Rezultati pregleda sedimenta
seča so za zdravnika izjemno pomembni, saj na osnovi tega sklepa o vrsti
ledvične bolezni. Prepoznava patologije s pomočjo avtomatskega odčitavanja
zaenkrat še ni popolnoma zanesljiva, pri obravnavi velikega števila vzorcev je
tudi iluzorno pričakovati, da bi bilo možno v tako omejenem času z omejenim
številom osebja pregledati vse sedimente seča. Vsaka bolezenska najdba,
opisana v sedimentu, je zato še posebej dragocena. Verjetno so navedeni
vzroki pogojevali ugotovitve raziskav, da v primerjavi z laboratorijskim
osebjem izurjen nefrolog pri bolniku, pri katerem za razliko od laboratorijskega
osebja potek bolezni dobro pozna, v večjem odstotku prepozna ledvične
tubulne celice, dismorfne eritrocite in akantocite, eritrocitne ali levkocitne
cilindre, celične cilindre in druge delce v sedimentu seča, kar omogoča
hitrejše in racionalnejše odločanje za invazivno diagnostiko in diferentno
zdravljenje (15, 16). Še posebej je to pomembno pri obravnavi bolnika z akutno
ledvično okvaro ali multiorgansko odpovedjo, kjer se zelo mudi in je izjemno
malo časa za postavitev diagnoze, saj so lahko s testnim lističem zaznane
spremembe seča sprva še minimalne in nepovedne, že en eritrocitni cilinder
v sedimentu seča pa diagnostičen za glomerulno ledvično bolezen. Ena od
utemeljiteljic analize sedimenta seča dr. Kincaid-Smith je zato že leta 1982
107
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
menila, da so najboljši zdravniki tisti, ki po kliničnem pregledu bolnika sami
opravijo analizo seča in lahko takoj postavijo diagnozo glomerulonefritisa
(17). Podobnega mnenja je italijanski nefrolog dr. Fogazzi, ki velja za enega
izmed od utemeljitelev sodobne analize sedimenta seča in zagotavljanja
njene kakovosti (16, 18, 19). To je seveda možno doseži le v sodelovanju in
tesnem povezovanju laboratorijske in klinične medicine.
7. Bodoče usmeritve
Sodelovanje laboratorijske in klinične medicine je na področju nefrologije
tradicionalno dobro in je pri prepoznavi ledvične bolezni nepogrešljivo.
Naša skupna dejavnost predstavlja piramido, ki s široko bazo omogoča hitro
prepoznavo večine bolezenskih najdb v primarnem zdravstvu in pravočasno
napotitev bolnika k nefrologu, nefrologu omogoča uvid v osnovno patologijo
ledvične bolezni in s pomočjo pregleda sedimenta seča pri izbranih bolnikih
še dodatno skrajša čas do pravilne diagnoze in ustreznega zdravljenja. Naš
skupen cilj je, da bi v prihodnosti v tesnem sodelovanju med laboratorijsko in
klinično medicino v vsej državi in regijah uskladili diagnostične laboratorijske
metode v javnem in privatnem zdravstvu, omogočili racionalno stopenjsko
diagnostiko in nadgradili sistem tako, da bi omogočili najboljši izhod
zdravljenja ledvičnih bolnikov.
Literatura
1.KDOQI Clinical Practice Guidelines for Chronic Kidney Disease: Evaluation, Classification,
and Stratification. Dostopno na: http://www2.kidney.org/professionals/KDOQI/
guidelines_ckd/toc.htm.
2.KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic
Kidney Disease. Kidney Int Suppl2013; 3: 1-150.
3.Levin A, Stevens PE. SummaryofKDIGO2012 CKD Guideline: behind the scenes, need
for guidance and a framework for moving forward. Kidney Int 2014; 85:49-61.
4.Hojs R, Gorenjak M, Krsnik M et al. Presejalne metode za kronično ledvično bolezen:
ocena glomerulne filtracije. ISIS 2009; 18: 44–6.
5.Lindič J, Gorenjak M, Hojs R et al. Presejalne metode za kronično ledvično bolezen:
ocena proteinurije in albuminurije. ISIS 2009; 18: 42–6.
6.Slovensko združenje za klinično kemijo in laboratorijsko medicino. Ocena glomerulne
filtracije. Dostopno na: http://www.szkk.si/default-30100.html.
108
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7.Methven S1, Traynor JP, Hair MD, St J O'Reilly D, Deighan CJ, MacGregor MS. Stratifying
risk in chronic kidney disease: an observational study of UK guidelines for measuring
total proteinuria and albuminuria. QJM 2011; 104: 663-70.
8.Kim SS, Song SH, Kim IJ, Kim WJ, Jeon YK, Kim BH, Kwak IS, Lee EK, Kim YK.
Nonalbuminuric proteinuria as a biomarker for tubular damage in early development
of nephropathy with type 2 diabetic patients. Diabetes Metab Res Rev 2014; 30:73641.
9.Methven S, MacGregor MS, Traynor JP, Hair M, O'Reilly DS, Deighan CJ. Comparison
of urinary albumin and urinary total protein as predictors of patient outcomes in CKD.
Am J Kidney Dis 2011; 57:21-8.
10.Chien TI, Kao JT, Liu HL, Lin PC, Hong JS, Hsieh HP, Chien MJ. Urine sediment
examination: a comparison of automated urinalysis systems and manual microscopy.
Clin Chim Acta. 2007; 384: 28-34.
11.Shayanfar N, Tobler U, vonEckardstein A, Bestmann L. Automated urinalysis: first
experiences and a comparison between the Iris iQ200 urine microscopy system, the
Sysmex UF-100 flowcytometer and manual microscopic particle counting. Clin Chem
Lab Med. 2007; 45: 1251-6.
12.Fogazzi GB, Edefonti A, Garigali G, Giani M, Zolin A, Raimondi S, Mihatsch MJ, Messa
P. Urine erythrocyte morphology in patients with microscopic haematuria caused by
a glomerulopathy. Pediatr Nephrol 2008;23: 1093-100.
13.Fogazzi GB, Verdesca S, Garigali G. Urinalysis: core curriculum 2008. Am J Kidney Dis
2008; 51:1052-67.
14.Fogazzi GB. The value of the examination of urinary sediment in kidney transplant
recepients. Dostopno na: https://www.youtube.com/watch?v=YfIbO1uPPsU.
15.Tsai JJ, Yeun JY, Kumar VA, Don BR. Comparision and interpretation of urnalysis
performmed by a nephrologist versus hospital-based clinical laboratory. Am J kidney
Dis 2005; 46: 820-9.
16.Verdesca S, Brambilla C, Garigali G, Croci MD, Messa P, Fogazzi GB. How a skillful
(correction of skilful) and motivated urinary sediment examination can save the
kidneys. Nephrol Dial Transplant. 2007; 22:1778-81.
17.Kincaid-Smith P. Haematuria and exercise-related haematuria. Br Med J (Clin Res Ed)
1982; 4: 1595-7.
18.Fogazzi GB, Grignani S. Urine microscopy analysis – an art abandoned by nephrologist.
Nephrol Dial Transplant 1998; 13: 2485-7.
19.Fogazzi GB, Secchiero S, Garigali G, Plebani M. Evaluation of clinical cases in External
Quality Assessment Scheme (EQAS) for the urinary sediment. Clin Chem Lab Med
2014; 52: 845-52.
109
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Uporaba vitamina D pri zdravljenju
pacientov z IgA nefropatijo
/ Use of vitamin D in the treatment of IgA nephropathy /
Joško Osredkar1, Tina Humar1, Damjan Kovač2
Univerzitetni klinični center Ljubljana, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo,
Zaloška cesta 2, Ljubljana
2
Univerzitetni klinični center Ljubljana, Interna klinika, Klinični oddelek za nefrologijo,
Zaloška cesta 2, Ljubljana
1
Povzetek
IgA nefropatija je najpogostejša oblika primarnega glomerulonefritisa. Nastane
zaradi kopičenja nepravilno glikoziliranega IgA1 v krvi in odlaganja imunskih
kompleksov v glomerulih. Izraža se kot hematurija, proteinurija, nefrotski
sindrom ali akutna ledvična okvara in običajno vodi v kronično ledvično
bolezen. Zdravimo jo z zaviralci renin-angiotenzin-aldosteronskega sistema
in kortikosteroidi.
Vitamin D ima pomembno vlogo pri zmanjševanju številnih kroničnih bolezni.
Aktivna oblika vitamina D (kalcitriol) značilno zmanjša proteinurijo pri IgA
nefropatiji, osnovna oblika vitamina D (holekalciferol) pa učinkovito zmanjša
albuminurijo pri diabetični nefropatiji in kronični ledvični bolezni. Pri bolnikih
z IgA nefropatijo še ni znana učinkovitost zdravljenja s holekalciferolom na
zniževanje proteinurije, kar smo v študiji želeli opredeliti.
Vrednotili smo zmanjšanje ocenjene dnevne proteinurije po uvedbi holekalciferola
in njeno spremembo glede na jemanje ali ne jemanje posameznega zdravila.
Uspeli smo dokazati, da uvedba holekalciferola pri bolnikih z IgA nefropatijo
poveča delež bolnikov, pri katerih se dnevna proteinurija zmanjša.
Ključne besede: IgA nefropatija, vitamin D, proteinurija, zdravljenje
110
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Abstract
IgA nephropathy is the most common form of primary glomerulonephritis.
The reason is the accumulation of incorrectly glycosylated IgA1 in the
blood and deposition of immune complexes in the glomeruli. It is expressed
as hematuria, proteinuria, nephrotic syndrome or acute renal failure, and
usually leads to chronic kidney disease. It can be treated with inhibitors of
the renin-angiotensin-aldosterone system and corticosteroids.
Vitamin D plays an important role in reducing the number of chronic
diseases. The active form of vitamin D (calcitriol) significantly reduces
proteinuria in IgA nephropathy; the basic form of vitamin D (cholecalciferol)
effectively reduces albuminuria in diabetic nephropathy and chronic kidney
disease. In patients with IgA nephropathy is not yet known efficacy of
cholekalciferol in lowering proteinuria, what we wanted to identify in the
present work.
We evaluated the reduction of the estimated daily proteinuria after the
introduction of cholecalciferol and its amendment with respect to taking or
not taking a particular drug.
We have managed to prove that the introduction of cholecalciferol in
patients with IgA nephropathy increases the proportion of patients in whom
the daily proteinuria decreases.
Key words: IgA nephropathy, vitamin D, proteinuria, treatment
1. Uvod
1.1 IgA NEFROPATIJA
Imunoglobulin A (IgA) nefropatija je najpogostejša oblika primarnega
glomerulonefritisa, vnetja ledvičnih telesc (1). Prizadene oba spola in se
najpogosteje pojavi v drugem in tretjem desetletju življenja (2). Privede do
končne odpovedi ledvic pri 15–20% bolnikov v 10 letih in pri 30–35% bolnikov
v 20 letih od nastopa bolezni (3).
111
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
1.1.1 Etiopatogeneza IgA nefropatije
Ljudje tvorimo dva podrazreda IgA – IgA1 in IgA2. Plazmatke, povezane z
respiratornim in gastrointestinalnim traktom, tvorijo tako IgA1 kot IgA2,
plazmatke v kostnem mozgu, bezgavkah in vranici pa v glavnem tvorijo
IgA1. Za IgA nefropatijo je značilna okvarjena O-galaktozilacija IgA1 (2), ki
nastane zaradi zmanjšane aktivnosti encima β-1,3-galaktoziltransferaze in/ali
prezgodnje in prekomerne sializacije N-acetilgalaktozamina, kar preprečuje
dodajanje galaktoze (4,5,6).
Obstaja alternativna hipoteza o vplivu infekcije na pojav IgA nefropatije.
Bakterijski lipopolisaharidi na perifernih monocitih povzročajo prekomerno
sintezo Tollu podobnega receptorja 4 (TLR4) (5), transmembranskega
receptorja, ki prepozna sestavni del zunanje membrane Gram-negativnih
bakterij (7,8).
Pri razvoju in napredovanju ledvične poškodbe sodelujejo številni citokini
in rastni dejavniki (2) in levkotrieni (9).
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
remisija bolezni. Poleg tega je pri 5% bolnikov z IgA nefropatijo prisotna
tudi pospešena hipertenzija (10,11).
1.1.3 Zdravljenje IgA nefropatije
Proteinurija je najpomembnejši napovedovalec napredovanja ledvične
okvare in dober prognostični označevalec. Pri bolnikih s proteinurijo nad
1 g/dan bolezen pogosteje napreduje do končne odpovedi ledvic, zato je
cilj zdravljenja zmanjšati proteinurijo pod 1 g/dan. Zdravljenje bolezni je
običajno najprej neimunološko in če to ni dovolj učinkovito, sledi imunološko
zdravljenje.
Druge oblike zdravljenja so mikofenolat (MMF), ribje olje, tonzilektomija
(odstranitev mandljev), antitrombotiki, ciklosporin in rituksimab (12).
1.2 Proteinurija
1.1.2 Klinično izražanje IgA nefropatije
1.2.1 Opredelitev albuminurije in proteinurije
Makroskopska hematurija
Pojavi se pri 40–50% bolnikov z IgA nefropatijo. Hematurijo ponavadi opazijo
bolniki v 24 urah od pojava simptomov infekcije zgornjih dihal. Urin je prej
rjav kot rdeč in običajno ni strdkov.
Glomeruli s filtriranjem krvi proizvajajo primarni urin. Pri tem zadržijo večje
proteine, vključno z večino serumskega albumina. Proteini z molekulsko
maso pod 60 kDa prosto prehajajo skozi glomerulno bazalno membrano in
so aktivno reabsorbirani iz tubulnega lumna. Vrsta proteinov, izločenih v urin,
je odvisna od vzroka ledvične bolezni. Izločanje albumina je bolj pogosto pri
glomerulni, diabetični ali hipertenzivni ledvični bolezni, nizko molekularni
proteini pa so pogosto tubulointersticijskega izvora (13).
Albuminurijo določimo s preiskavo razmerja albumin/kreatinin v drugem
jutranjem vzorcu urina (14). Izločanje kreatinina je konstantno in ni odvisno
od volumna urina, zato albumin/kreatinin razmerje ocenjuje dnevno izločanje
albumina (13).
Če je albuminurija večja kot 150 mg dnevno, je že v območju proteinurije.
Bolezensko proteinurijo določimo z analizo celokupnih proteinov v drugem
jutranjem vzorcu urina. S pomočjo določitve kreatinina podamo rezultat
kot razmerje proteini/kreatinin [g/mol]. To razmerje lahko pomnožimo s
povprečnim dnevnim izločanjem kreatinina, ki je približno 8,8 mmol/dan/1,73
m2 telesne površine (1000 mg/dan/1,73 m2), in dobimo ocenjeno dnevno
proteinurijo [g/dan/1,73 m2]. Proteinurijo delimo na blago (150 mg do 1 g
Asimptomatska hematurija in proteinurija
Bolniki z IgA nefropatijo so večinoma asimptomatski in jih lahko odkrijemo s
presejalnim testiranjem urina. Pri tem ugotovimo mikroskopsko hematurijo
z ali brez proteinurije.
Proteinurija in nefrotski sindrom
Proteinurija se redko pojavi brez mikroskopske hematurije. Nefrotski sindrom
se izrazi pri 5% bolnikov z IgA nefropatijo.
Akutna ledvična okvara
Pri bolnikih z IgA nefropatijo je zelo redka (<5%) (10), čeprav se lahko pojavi
pri do 27% bolnikov, starejših od 65 let (11).
Kronična ledvična bolezen
IgA nefropatija pri velikem deležu bolnikov napreduje v kronično ledvično
bolezen. Pri približno eni tretjini bolnikov je sicer možna tudi spontana
112
113
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
proteinov v 24-urnem urinu), zmerno (1–3 g proteinov v 24-urnem urinu) in
nefrotsko (nad 3 g proteinov v 24-urnem urinu ali nad 3,5 g/dan/1,73 m2) (14).
1.2.2 Mehanizmi proteinurije
Glomerulno filtracijsko bariero sestavljajo 3 plasti – endotelij z glikokaliksom,
glomerulna bazalna membrana in podociti (glomerulne epitelijske celice) –
ki prispevajo k prepustnosti albumina. Povečana glomerulna prepustnost
nastane zaradi okvar v glomerulni barieri ali povečanega filtracijskega tlaka
(13). Prehod proteinov ovirajo tudi podociti. Prekomerni oksidativni stres
sproži poškodbo podocitov, kar vodi do proteinurije (15).
1.2.3 Škodljivo delovanje proteinurije
Proteini v urinu spodbujajo izražanje vnetnih in fibroznih mediatorjev in tako
povzročajo intersticijsko vnetje in fibrozo. Proteinurija je dejavnik tveganja
napredovanja kronične ledvične bolezni, ledvične odpovedi in srčno-žilnih
dogodkov, zato je zmanjšanje proteinurije ali albuminurije terapevtska tarča
za kronično ledvično bolezen (16).
1.2.4 Zniževanje proteinurije
Povečana proteinurija je povezana s hitrejšo izgubo ledvične funkcije, zato
postane njeno zmanjšanje pomemben cilj zdravljenja ledvične proteinurične
bolezni (17). Čim bolj znižamo proteinurijo, tem boljša je prognoza
napredovanja kronične ledvične bolezni in nastopa ledvične odpovedi. Od
vseh antihipertenzivnih zdravil so zdravila, ki vplivajo na renin-angiotenzinaldosteronski sistem, najbolj znana po antiproteinuričnem učinku (18). Drugi
antiproteinurični ukrepi, ki nimajo vpliva na krvni tlak, so nizko-proteinske
diete (18) in nekirurška izguba telesne teže pri prekomerno prehranjenih
bolnikih (19).
Kortikosteroidno zdravljenje je učinkovito pri zmanjšanju proteinurije (20).
114
7. Jesenovčevi dnevi
1.3
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Vitamin D
Vitamin D3 nastaja v koži. Sončno ultravijolično B sevanje pretvori
7-dehidroholesterol v previtamin D3, ki se s toploto hitro pretvori v vitamin
D3. Vitamin D iz kože in prehrane se v jetrih presnovi v 25-hidroksivitamin D
[25(OH)D], ki se v obtoku kompleksira z vezavnim proteinom za vitamin D
(DBP). 25(OH)D–DBP kompleks se filtrira v glomerulih in nato reabsorbira
preko megalin-posredovane endocitoze v proksimalnih tubulih, pri čemer
ledvična 1α-hidroksilaza pretvori 25(OH)D v 1,25-dihidroksivitamin D
[1,25(OH)2D] (16,21).
Hormonska oblika vitamina D, 1,25(OH)2D, povzroča mineralizacijo okostja in
poveča serumski koncentraciji kalcija in fosforja z absorpcijo kalcija in fosfata
v prebavilih, mobilizacijo kalcija iz kosti in reabsorpcijo kalcija v distalnih
ledvičnih tubulih. Vitamin D hormon deluje preko vitamin D receptorja,
ki se nahaja v enterocitih, osteoblastih in celicah distalnega ledvičnega
tubula. Inhibira sintezo renina, povečuje miokardno kontraktilnost (21) in
ima pomemben vpliv na imunski sistem (22).
1.3.1 Pomanjkanje vitamina D
Pomanjkanje vitamina D je opredeljeno kot serumska raven 25(OH)D manj
kot 50 nmol/L. Raven 52–72 nmol/L 25(OH)D kaže insuficienco vitamina D in
raven nad 75 nmol/L predstavlja zadostno količino vitamina D. Zastrupitev
z vitaminom D je redka.
Pomanjkanje vitamina D ogroža mineralizacijo kosti.
Bolniki s kronično ledvično boleznijo imajo pogosto pomanjkanje 25(OH)D.
Ob napredovanju kronične ledvične bolezni se zmanjša aktivnost ledvične
1α-hidroksilaze, kar vodi v pomanjkanje 1,25(OH)2D (23).
1.3.2 Renoprotektivno delovanje vitamina D
Aktivna oblika vitamina D deluje renoprotektivno preko receptorja za
vitamin D (VDR) z regulacijo renin-angiotenzin-aldosteronskega sistema.
Kronična ledvična bolezen in pomanjkanje vitamina D aktivirata lokalni reninangiotenzin-aldosteronski sistem v ledvicah, kar poveča lokalno koncentracijo
115
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
angiotenzina II, ki spodbuja ledvično poškodbo. Vitamin D zavira izražanje
renina. Kombinirano zdravljenje z RAAS zaviralci in vitaminom D ima dodatne
terapevtske učinke pri zmanjšanju ledvične poškodbe in proteinurije, ker
vitamin D blokira kompenzacijsko indukcijo renina, ki jo povzročajo RAAS
zaviralci (16). Vitamin D lahko zmanjša proteinurijo z učinki na citokine (9).
Zmanjša izražanje vnetnih in profibroznih citokinov in tako izboljša ledvično
poškodbo (24).
1.3.3 Kalcitriol in holekalciferol
Zdravljenje s kalcitriolom, aktivno obliko vitamina D, je značilno zmanjšalo
proteinurijo in serumsko raven TGF-β pri bolnikih z IgA nefropatijo
preko inhibicije renin-angiotenzin-aldosteronskega sistema. Terapija s
holekalciferolom je učinkovito zmanjšala albuminurijo tudi pri bolnikih s
kronično ledvično boleznijo faz 3–4, ki so imeli nizke ravni 25(OH)D in visoke
ravni parathormona (25).
2. Namen študije
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
•korelacijo krvnega tlaka z ocenjeno dnevno proteinurijo, korelacije
starosti s krvnim tlakom, ocenjeno glomerulno filtracijo in ocenjeno
dnevno proteinurijo.
3. Materiali in metode
Podatki o preiskovani populaciji
V študijo smo vključili 18 bolnikov, ki se zdravijo na kliničnem oddelku za
nefrologijo Interne klinike Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani.
Skupina je bila sestavljena iz 14 moških in 4 žensk, s poprečno starostjo
47.06 let, standardno deviacijo 10.08 in razponom med 25 in 66 let.
Uporabljene laboratorijske metode
Vse laboratorijske določitve biološkega materiala smo izvedli s priporočenimi
metodami na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo UKC Ljubljana.
4. Rezultati in razprava
Namen študije je bil opredeliti učinkovitost zdravljenja s holekalciferolom
na zniževanje proteinurije pri bolnikih z IgA nefropatijo.
Z raziskavo smo želeli preveriti hipotezo, da zdravljenje s holekalciferolom
zmanjša proteinurijo pri bolnikih z IgA nefropatijo.
Z raziskavo smo želeli tudi preveriti:
•spremembo proteinurije glede na jemanje ali ne jemanje ACE zaviralca,
blokatorja angiotenzinskega II receptorja (sartana), zaviralca renina
(aliskirena), kalcitriola in holekalciferola,
•statistično značilnost sprememb parametrov po uvedbi holekalciferola
– ocenjene dnevne proteinurije, razmerij proteinov, eritrocitov in
levkocitov v urinu, koncentracij albumina in kreatinina v serumu,
ocenjene glomerulne filtracije, serumskih koncentracij vitamina D,
korigiranega kalcija in fosfata, ter telesne teže in krvnega tlaka,
•korelacije serumske koncentracije vitamina D z ocenjeno glomerulno
filtracijo, ocenjeno dnevno proteinurijo, razmerji proteinov, eritrociti
in levkociti v urinu, koncentracijami albumina, kreatinina, korigiranega
kalcija in fosfata v serumu, telesno težo, indeksom telesne mase in
krvnim tlakom,
116
4.1 Vrednosti proteinurije pred in po uvedbi holekalciferola
Preglednica 1. Povečanje/zmanjšanje ocenjene dnevne proteinurije po uvedbi
holekalciferola.
Table 1. Increase/decrease in the estimated daily proteinuria after the introduction of
cholecalciferol
Bolnik
oDP [g/d/1,73]
pred
po
razlika
12
3,835
6,873
3,038
17
3,643
4,657
1,014
4
0,567
1,195
0,628
5
0,329
0,509
0,180
*tabela se nadaljuje na naslednji strani
117
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
4.2 Vrednosti proteinurije glede na jemanje zdravil
0,413
0,005
14
0,952
0,854
-0,098
11
2,881
2,616
-0,265
13
0,489
0,221
-0,268
2
0,880
0,586
-0,294
3
1,018
0,666
-0,352
10
1,428
0,968
-0,460
7
0,727
0,099
-0,628
15
1,215
0,552
-0,663
6
2,590
1,905
-0,685
16
0,971
0,264
-0,707
9
2,964
1,509
-1,455
Slika 1. Povečanje/zmanjšanje ocenjene dnevne proteinurije po uvedbi holekalciferola.
Figure 1. Increase/decrease in the estimated daily proteinuria after the introduction
of cholecalciferol
t
oDP
mg
mg
mg
μg
št. kpl/
teden
g/d/1,73
oDP
mg
mg
mg
μg
št. kpl/
teden
g/d/1,73
10
100
0
0
0
1,320
10
1,438
1
-2
0
100
0
0
0
2,703
10
-2
1
-1
0
0
0
0
0
1,964
10
-1
100
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1,153
10
0
8,49 100
0
0
0
1,525
1
1
0
0
0
0
35
0,655
10
1
8,49
0
0
0
15
0,985
0,950
1
2
2
0
0
0
35
3,416
10
2
8,49
0
0
0
15
2
-2
4
0
0
0
0
1,261
11
-2
40
0
0
0
0
2,573
2
-1
0
80
0
0
0
0,381
11
-1
30
0
0
0
0
3,538
2
0
0
80
0
0
0
0,997
11
0
30
0
0
0,25
0
2,531
2
1
0
80
0
0
35
0,732
11
1
30
0
0
0,25
35
2,414
2
2
0
80
0
0
35
0,440
11
2
30
0
0
0,25
35
2,817
3
-2
12
-2
3
-1
12
-1
20
0
0
0
0
3,091
3
0
0
0
0
0
0
1,018
12
0
20
0
0
0
0
4,578
3
1
0
40
0
0
35
0,279
12
1
20
0
0
0,125
70
6,909
0
40
0
0
35
1,053
12
2
20
0
0
0,125
70
6,836
13
-2
3
2
4
-2
4
-1
0
80
0
0
4
0
0
80
0
4
1
0
80
0
4
2
0
160
5
-2
5
-1
20
5
0
5
1
5
2
6
-2
6
-1
0
0,676
13
-1
0
0
0,457
13
0
0
120
0
0
0
0,489
0
35
1,881
13
1
0
120
0
0
35
0,330
0
0
35
0,509
13
2
0
120
0
0
35
0,112
14
-2
0
160
150
0
0
0,857
50
0
0
0
0,368
14
-1
0
160
150
0
0
1,580
20
50
0
0
0
0,290
14
0
0
160
150
0
0
0,418
20
50
0
0
35
0,237
14
1
0
160
150
0
35
0,999
0
50
0
0
35
0,780
14
2
0
160
150
0
35
0,708
15
-2
0
80
0
0
0
1,305
15
-1
0
160
0
0
0
1,390
5
0
0
0
0
2,827
*tabela se nadaljuje na naslednji strani
118
t
holekalciferol
0,408
kalcitriol
18
aliskiren
0,096
sartan
2,036
ACE
1,940
bolnik
1
Preglednica 2. Odmerki zdravil in ocenjena dnevna proteinurija bolnikov ob petih
pregledih.
Table 2. Doses of drugs and estimated daily proteinuria of patients at five inspections.
holekalciferol
razlika
kalcitriol
po
aliskiren
pred
sartan
oDP [g/d/1,73]
ACE
Bolnik
7. Jesenovčevi dnevi
bolnik
7. Jesenovčevi dnevi
119
sartan
aliskiren
kalcitriol
holekalciferol
holekalciferol
mg
mg
μg
št. kpl/
teden
g/d/1,73
0
5
0
0
0
0
2,352
15
6
1
5
0
0
0
35
1,084
6
2
5
0
0
0
35
2,725
7
-2
7
-1
0
40
0
0
0
7
0
0
80
0
0
0
7
1
0
80
0
0
35
0,099
6
oDP
mg
mg
mg
μg
št. kpl/
teden
g/d/1,73
0
0
160
0
0
0
0,950
15
1
0
160
150
0
35
0,414
15
2
0
160
150
0
35
0,689
16
-2
2
0
0
0
0
1,159
1,309
16
-1
4
0
0
0
0
1,159
0,145
16
0
8
0
0
0
0
0,594
16
1
8
0
0
0
35
0,430
t
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Preglednica 3. Rezultati regresije s fiksnimi učinki.
Table 3. Results of regression with fixed effects
ACE
kalcitriol
mg
t
bolnik
aliskiren
oDP
bolnik
sartan
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
ACE
7. Jesenovčevi dnevi
7
2
16
2
8
0
0
0
35
0,098
8
-2
40
0
0
0
0
11,784
17
-2
0
0
0
0
0
4,336
8
-1
40
0
0
0
0
4,653
17
-1
0
0
0
0
0
3,578
8
0
0
0
0
0
0
3,081
17
0
5
0
0
0
0
3,015
8
1
17
1
3,4
0
0
0
35
5,644
8
2
17
2
3,4
0
0
0
35
3,669
9
-2
18
-2
5
0
0
0
0
0,502
9
-1
18
-1
7,5
0
0
0
0
0,313
9
0
0
50
0
0
0
2,964
18
0
9
1
4,5
0
0
0
35
1,040
18
1
9
2
4,5
0
0
0
35
1,978
18
2
10
0
0
0
35
0,413
Zapis časa pred, ob in po uvedbi holekalciferola smo prekodirali v -2 za 2. pregled
pred uvedbo, -1 za 1. pregled pred uvedbo, 0 za pregled ob uvedbi, 1 za 1. pregled
po uvedbi in 2 za 2. pregled po uvedbi. Prazna polja pomenijo, da pri posameznem
bolniku ni bilo podatka o določenem pregledu ali zgolj ni bilo podatka o dnevni
proteinuriji.
Recording time before, during and after the introduction of cholecalciferol are
transcoded to -2 for the second review before, -1 for the first review prior to the
introduction, 0 for the check at the introduction, 1 for the first review after the
introduction and 2 for the second review after the introduction. Empty fields mean
that an individual patient has not been given information on the review, or simply
there was no data on a daily proteinuria
120
121
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
4.3 Vrednosti parametrov pred in po uvedbi holekalciferola
Preglednica 4. Vrednosti biokemičnih parametrov, meritev krvnega tlaka in telesne
teže pred in po uvedbi holekalciferola, standardna deviacija in statistika (parni t-test).
Table 4. The values, standard deviation and statistics (paired t-test), of the biochemical
parameters, measurement of blood pressure and body weight before and after the
introduction of cholecalciferol.
povprečna
vrednost
standardni
odklon
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
4.4 Vrednosti korelacij med parametri
Preglednica 5. Korelacijski koeficienti med posameznimi parametri.
Table 5. Correlation coefficients between parameters.
parameter a
parameter b
korel. koef.
S-25(OH)D3
pred
oGF
pred
0,1755
S-25(OH)D3
pred
oDP
pred
-0,1551
S-25(OH)D3
pred
U-IgG/albumin
pred
-0,0592
S-25(OH)D3
pred
U-albumin/kreatin in
pred
-0,1474
S-25(OH)D3
pred
U-IgG/ kreatin in
pred
0,1008
S-25(OH)D3
pred
U-NAG/ kreat in in
pred
-0,0762
0,9398
S-25(OH)D3
pred
U-α1 mikroglobulin/ kreatin in
pred
-0,1819
P-vrednost
parameter
enote
pred
po
pred
po
oDP
g/d/1,73
1,58
1,52
1,16
1,79
0,8226
0,04
0,05
0,02
0,02
0,3506
U-IgG/albumin
7. Jesenovčevi dnevi
U-albumin/
kreatinin
g/mol
134,63
132,01
U-IgG/kreatinin
g/mol
5,39
8,16
5,49
16,29
0,5056
S-25(OH)D3
pred
U-eritrociti (SW)
pred
-0,1086
6,26
12,89
2,12
12,12
0,1443
S-25(OH)D3
pred
U-levkociti (SW)
pred
-0,1143
S-25(OH)D3
pred
S-albumin
pred
0,1876
S-25(OH)D3
pred
S-kreatin in
pred
-0,0277
S-25(OH)D3
pred
S-korigirani kalcij
pred
-0,0729
S-25(OH)D3
pred
S-fosfat
pred
0,1857
S-25(OH)D3
pred
telesna teža
pred
-0,1412
S-25(OH)D3
pred
ITM
U-NAG/kreatinin μkat/mol
102,36 158,12
U-α1mikroglobulin/
kreatinin
g/mol
2,63
3,13
1,61
2,71
0,4980
U-eritrociti (SW)
10^6/L
123,82
46,41
319,56
75,17
0,2966
U-levkociti (SW)
10^6/L
31,53
14,41
106,21 40,49
0,3004
S-albumin
g/L
40,94
42,78
S-kreatinin
μmol/L
189,11
206,44
143,18 178,81
0,1245
S-25(OH)D3
pred
sistolni krvni tlak AMB
pred
-0,0406
oGF
mL/
min/1,73
43,67
43,28
21,51
24,82
0,8813
S-25(OH)D3
pred
diastolni krvni tlak AMB
pred
-0,0396
S-25(OH)D3
nmol/L
40,50
65,00
17,62
27,25
0,0164
oDP
pred
sistolni krvni tlak AMB
pred
0,4721
S-korigirani kalcij
mmol/L
2,31
2,31
0,11
0,10
0,8502
oDP
pred
diastolni krvni tlak AMB
pred
0,3919
S-fosfat
mmol/L
1,13
1,11
0,25
0,20
0,7368
oDP
po
sistolni krvni tlak AMB
po
0,3769
oDP
po
diastolni krvni tlak AMB
po
0,3705
telesna teža
kg
82,83
81,88
18,57
18,22
0,2763
starost
sistolni krvni tlak AMB
pred
-0,1070
mmHg
139,50
136,33
16,44
15,40
0,3330
starost
diastolni krvni tlak AMB
pred
-0,1652
mmHg
84,50
85,28
9,13
10,14
0,7023
starost
oGF
pred
-0,1761
starost
oDP
pred
-0,1671
sistolni krvni tlak
AMB
diastolni krvni
tlak AMB
122
3,80
3,99
0,0086
-0,2223
123
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
4.1 Vrednotenje proteinurije
4.2 Vrednotenje ostalih parametrov
Po uvedbi holekalciferola se je ocenjena dnevna proteinurija 6 bolnikom
povečala, 11 bolnikom pa zmanjšala (Preglednica 1, Slika 1). Uvedba
holekalciferola torej vpliva na delež bolnikov, ki se jim je ocenjena dnevna
proteinurija zmanjšala. Zato lahko trdimo, da holekalciferol značilno poveča
delež bolnikov, pri katerih pride do zmanjšanja proteinurije. Ti rezultati so v
skladu z antiproteinuričnim delovanjem vitamina D (9, 16, 24). Podobno je pri
bolnikih z diabetično nefropatijo in bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz
3–4 holekalciferol statistično značilno zmanjšal razmerje albumin/kreatinin
v urinu (24, 25). Antiproteinurične učinke holekalciferola nam potrjujejo tudi
blago negativne korelacije serumske koncentracije vitamina D z ocenjeno
dnevno proteinurijo in razmerji proteinov v urinu, razen za razmerje IgG/
kreatinin, kjer smo lahko zaradi majhnega števila bolnikov dobili šibko
pozitivno korelacijo (Preglednica 5).
Na delež bolnikov, ki se jim je proteinurija zmanjšala, so lahko poleg
holekalciferola vplivala tudi druga zdravila in spremembe njihovih odmerkov.
Pri vrednotenju antiproteinuričnega učinka holekalciferola smo želeli
izključiti vpliv ACE zaviralca, sartana, aliskirena in kalcitriola na proteinurijo.
V ta namen smo naredili regresijo s fiksnimi učinki po bolnikih. Izračunani
regresijski koeficienti (Preglednica 3) za ACE zaviralec, sartan, kalcitriol
in holekalciferol so pozitivni (β = 0,0711 za ACE zaviralec, β = 0,0014 za
sartan, β = 3,5095 za kalcitriol in β = 0,0255 za holekalciferol) in čeprav
niso statistično značilni (P-vrednosti > 0,05), so ti rezultati v nasprotju s
pričakovanim delovanjem teh zdravil na zmanjšanje proteinurije. Vzroka za
takšne rezultate sta lahko majhen vzorec bolnikov in njihova heterogenost.
Bolniki, ki so imeli bolj izraženo bolezen in višjo dnevno proteinurijo, so
namreč dobili večji odmerek zdravil. Poleg tega sta kalcitriol prejemala
samo 2 bolnika, zaradi česar rezultat ni relevanten. Regresijski koeficient
za aliskiren pa je statistično značilno negativen (β = –0,0044, P-vrednost
[0,007] < 0,05), čeprav sta zdravilo prav tako prejemala samo 2 bolnika.
Tudi časovni trend je značilno negativen (β = –0,3733, P-vrednost [0,025] <
0,05), kar nam potrjuje, da zdravljenje z vsemi zdravili vpliva na zniževanje
proteinurije. Da bi izključili vpliv drugih zdravil od učinka holekalciferola,
pa bi morali v raziskavo vključiti večje število bolnikov s podobno stopnjo
proteinurije, ki bi jih razdelili v holekalciferolno in kontrolno skupino.
V Sloveniji je pri odrasli populaciji referenčna vrednost za S-25(OH)D3 50–107
nmol/L (pomladi) in 114–172 nmol/L (jeseni) (26). Vrednosti koncentracij
S-25(OH)D3 so bile pred uvedbo holekalciferola v območju 18–77 nmol/L,
kar predstavlja pomanjkanje ali insuficienco vitamina D. Spremembo
koncentracije S-25(OH)D3 po uvedbi holekalciferola pa bomo vrednotili v
nadaljevanju.
Pri bolnikih z IgA nefropatijo se je koncentracija S-25(OH)D3 po uvedbi
holekalciferola statistično značilno povečala (P-vrednost [0,0164] < 0,05). Pri
bolnikih z diabetično nefropatijo in bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4
se je podobno serumska koncentracija vitamina D izboljšala z dopolnjevanjem
holekalciferola (24, 25). Vitamin D povečuje koncentracijo kalcija in fosfata v
serumu (22). Korelacija koncentracije S-25(OH)D3 s koncentracijo S-fosfata (r
= 0,1857) je v skladu z delovanjem vitamina D, za koncentracijo S-korigiranega
kalcija (r = –0,0729) pa smo pričakovali pozitivno korelacijo. Pri naših bolnikih
sta koncentraciji S-korigiranega kalcija in S-fosfata po uvedbi holekalciferola
v povprečju ostali enaki. Spremembi seveda nista statistično značilni
(P-vrednosti [0,8502 in 0,7368] > 0,05). V raziskavi bolnikov z diabetično
nefropatijo holekalciferol prav tako ni imel vpliva na serumski koncentraciji
korigiranega kalcija in fosfata (24). V raziskavi bolnikov s kronično ledvično
boleznijo faz 3–4 tudi niso potrdili korelacij serumske koncentracije vitamina
D s koncentracijama S-korigiranega kalcija in S-fosfata (25). Pri bolnikih s
kronično ledvično boleznijo faz 3–4 pa so v holekalciferolni skupini opazili
značilen dvig fosfata in kalcij–fosfat produkta (25).
Vitamin D vpliva ugodno na ledvično delovanje (zmanjša vnetje in
glomerulosklerozo, poveča sintezo nefrina) (9, 16), s tem se zmanjša izguba
albumina v urin in lahko izboljša očistek kreatinina. Po uvedbi holekalciferola
smo opazili statistično značilno povečanje koncentracije S-albumina
(P-vrednost [0,0086] < 0,05), koncentracija S-kreatinina pa se ni statistično
značilno spremenila (P-vrednost [0,1245] > 0,05). Učinek holekalciferola
na albumin in kreatinin v serumu nam nakazujeta tudi pozitivna korelacija
koncentracije S-25(OH)D3 s koncentracijo S-albumina (r = 0,1876) in negativna
korelacija koncentracije S-25(OH)D3 s koncentracijo S-kreatinina (r = –0,0277).
Korelacija koncentracije S-25(OH)D3 z ocenjeno glomerulno filtracijo je sicer
šibko pozitivna (r = 0,1755), a bolnikom se je glomerulna filtracija zelo malo
zmanjšala, njena sprememba ni statistično značilna (P-vrednost [0,8813]
> 0,05). Z našo raziskavo torej nismo potrdili renoprotektivnega učinka
124
125
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
holekalciferola. Podobno so pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4
po terapiji holekalciferola opazili neznačilno zmanjšanje glomerulne filtracije
tako v holekalciferolni kot v kontrolni skupini (25), pri bolnikih z diabetično
nefropatijo pa holekalciferol ni imel vpliva na ledvično funkcijo (24).
Korelaciji koncentracije S-25(OH)D3 z U-eritrociti (SW) in U-levkociti (SW) pa
sta blago negativni (r = –0,1086 za eritrocite in r = –0,1143 za levkocite v urinu).
Po uvedbi holekalciferola sta se številčni koncentraciji eritrocitov in levkocitov
v urinu v povprečju zmanjšali, vendar zaradi velikih standardnih odklonov
med bolniki spremembi nista statistično značilni (P-vrednosti [0,2966 in
0,3004] > 0,05). Spremembi v eritrocituriji in levkocituriji tako nista vplivali
na zmanjšanje proteinurije, je pa sicer neznačilno zmanjšanje eritrociturije
lahko povezano z zmanjšanjem vnetja zaradi učinka holekalciferola.
Za zmanjšanje proteinurije bi bilo ugodno tudi zmanjšanje telesne teže in
krvnega tlaka (13, 19). Korelacije koncentracije S-25(OH)D3 s telesno težo,
indeksom telesne mase, sistolnim in diastolnim krvnim tlakom so sicer blago
negativne (korelacijski koeficienti so –0,1412, –0,2223, –0,0406 in –0,0396),
vendar nismo pričakovali, da bo holekalciferol vplival na telesno težo in
krvni tlak. Zmanjšanje telesne teže po uvedbi holekalciferola namreč ni bilo
statistično značilno (P-vrednost [0,2763] > 0,05). Sistolni krvni tlak se je po
uvedbi holekalciferola v povprečju zelo malo zmanjšal, diastolni krvni tlak
pa celo povečal. Spremembi nista statistično značilni (P-vrednosti [0,3330
in 0,7023] > 0,05). S tem smo izključili vpliv telesne teže in krvnega tlaka na
spremembo proteinurije. Pri bolnikih z diabetično nefropatijo po zdravljenju
s holekalciferolom podobno niso opazili sprememb krvnega tlaka (24), pri
bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4 pa prav tako ni bilo sprememb
telesne teže in krvnega tlaka (25).
Povečanje krvnega tlaka lahko vpliva na povečanje proteinurije (13). To
povezavo smo potrdili s srednje močno pozitivnimi korelacijami krvnega
tlaka s proteinurijo (korelacijska koeficienta sistolnega in diastolnega krvnega
tlaka z ocenjeno dnevno proteinurijo [oDP] pred uvedbo holekalciferola sta
0,4721 in 0,3919, korelacijska koeficienta sistolnega in diastolnega krvnega
tlaka z oDP po uvedbi pa sta 0,3769 in 0,3705). S starostjo se povečuje krvni
tlak in slabša ledvična funkcija, s tem se poveča tudi proteinurija (27,28).
Izračunane korelacije starosti s sistolnim in diastolnim krvnim tlakom ter
ocenjeno glomerulno filtracijo [oGF] in ocenjeno dnevno proteinurijo so
šibko negativne – korelacija starosti z oGF je pravilno negativna (r = –0,1761),
ostale korelacije pa so v nasprotju s pričakovanji (r = –0,1671 za oDP, r =
–0,1070 za sistolni in r = –0,1652 za diastolni krvni tlak).
126
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
5. Sklep
Bolnikom z IgA nefropatijo se je z dopolnjevanjem vitamina D v obliki
holekalciferola zvečala serumska koncentracija vitamina D. Z raziskavo smo
dokazali, da zdravljenje bolnikov z IgA nefropatijo s holekalciferolom poveča
delež bolnikov, pri katerih pride do zmanjšanja proteinurije. Antiproteinurične
učinke holekalciferola nam potrjujejo tudi negativne korelacije serumske
koncentracije vitamina D z ocenjeno dnevno proteinurijo in razmerji proteinov
v urinu. S korelacijo krvnega tlaka z ocenjeno dnevno proteinurijo pa smo
potrdili povečanje proteinurije zaradi večjega krvnega tlaka, kar potrjuje
dosedanje ugotovitve, da je pri terapiji IgA nefropatije zelo pomembna
ureditev arterijskega krvnega tlaka.
Literatura
1.Ferluga D, Vizjak A. Histopatologija in patogeneza glomerulonefritisa. Medicinski
razgledi 2005; 44: 265–290.
2.
Donadio JV, Grande JP. IgA Nephropathy. N Engl J Med 2002; 347: 738–748.
3.Szeto CC, Chow KM, Kwan BC, Chung KY, Leung CB, Li PK. Oral calcitriol for the
treatment of persistent proteinuria in immunoglobulin A nephropathy: an uncontrolled
trial. Am J Kidney Dis 2008; 51: 724–31.
4.Yano N, Endoh M, Miyazaki M, Yamauchi F, Nomoto Y, Sakai H. Altered production
of IgE and IgA induced by IL-4 in peripheral blood mononuclear cells from patients
with IgA nephropathy. Clin Exp Immunol 1992; 88: 295–300.
5.Floege J. The pathogenesis of IgA nephropathy: What is new and how does it change
therapeutic approaches? Am J Kidney Dis 2011; 58(6): 992–1004.
6.Glassock RJ. The pathogenesis of IgA nephropathy. Curr Opin Nephrol Hypertens
2011; 20: 153–160.
7.Akira S, Hemmi H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR
family. Immunology Letters 2003; 85: 85–95.
8.Ju T, Cummings RD. A unique molecular chaperone Cosmc required for activity of the
mammalian core 1 β3-galactosyltransferase. Stuart A. Kornfeld, Washington University
School of Medicine, St. Louis, 2002; 99: 16613–16618.
9.Shin JI, Lee JS. The beneficial effect of oral calcitriol treatment on proteinuria in IgA
nephropathy: another point of view. Am J Kidney Dis 2008; 52: 804–5.
10.Feehally J, Floege J. IgA nephropathy and Henoch-Schönlein nephritis. In: Floege J,
Johnson RJ, Feehally J, eds.: Comprehensive clinical nephrology, 4th ed., St. Luis,
Elsevier Saunders, 2010; 270–81.
11.Rivera F, Lopez-Gomez JM, Perez-Brea MF, et al. Clinicopathologic correlations of
renal pathology in Spain. Kidney Int 2004; 66: 898–904.
12.Pozzi C. Current treatment of IgA nephropathy. 5. slovenski nefrološki kongres z
mednarodno udeležbo, Univerzitetna knjižnica Maribor, Ljubljana, 2012; 52–54.
127
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
13.Gorriz JL, Martinez-Castelao A. Proteinuria: detection and role in native renal disease
progression. Transplant Rev (Orlando) 2012; 26: 3–13.
14.Lindič J. Pregled seča. V: Kovač D, Lindič J, Malovrh M, Pajek J, ur.: Bolezni ledvic, 2.
izdaja, Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana, 2009; 19–35.
15.Chen S, Meng X-F, Zhang C. Role of NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species
in podocyte injury. BioMed Research International 2013; ID 839761.
16.Li YC: Vitamin D. roles in renal and cardiovascular protection. Curr Opin Nephrol
Hypertens 2012; 21: 72–79.
17.Liu LJ, Lv JC, Shi SF, Chen YQ, Zhang H, Wang HY. Oral calcitriol for reduction of
proteinuria in patients with IgA nephropathy: a randomized controlled trial. Am J
Kidney Dis 2012; 59: 67–74.
18.de Zeeuw D. Targeting proteinuria as a valid surrogate for individualized kidney
protective therapy. Am J Kidney Dis 2008; 51: 713–716.
19.Floege J, Eitner F. Current therapy for IgA nephropathy. J Am Soc Nephrol 2011; 22: 1785–94.
20.Pozzi C, Bolasco PG, Fogazzi GB, et al. Corticosteroids in IgA nephropathy: A randomized
controlled trial. Lancet 1999; 353: 883–887.
21.Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007; 357: 266–81.
22.DeLuca HF. Overview of general physiologic features and functions of vitamin D. Am
J Clin Nutr 2004; 80: Suppl: 1689S–96S.
23.Matias P, Ferreira A. 25-hydroxyvitamin D and chronic kidney disease. Port J Nephrol
Hypert 2011; 25(4): 253–261.
24.Kim MJ, Frankel AH, Donaldson M, Darch SJ, Pusey CD, Hill PD, Mayr M, Tam FWK.
Oral cholecalciferol decreases albuminuria and urinary TGF-β1 in patients with type 2
diabetic nephropathy on established renin-angiotensin-aldosterone system inhibition.
Kidney Int 2011; 80: 851–60.
25.Molina P, et al. The effect of cholecalciferol for lowering albuminuria in chronic kidney
disease: a prospective controlled study. Nephrol Dial Transplant 2014; 29: 109–118.
26.Osredkar J, Marc J. Vitamin D in presnovki: fiziologija, patofiziologija in referenčne
vrednosti. Medicinski razgledi 1996; 35: 543–565.
27.Lindič J. Preiskave ledvičnega delovanja. V: Kovač D, Lindič J, Malovrh M, Pajek J, ur.:
Bolezni ledvic, 2. izdaja, Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana, 2009; 9–17.
28.Hitij JB. Primarna arterijska hipertenzija. V: Kovač D, Lindič J, Malovrh M, Pajek J, ur.:
Bolezni ledvic, 2. izdaja, Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana, 2009; 225–232.
128
129
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Mikroskopski pregled sedimenta seča
/ Microscopic examination of urine sediment /
Mateja Šter
Univerzitetni klinični center Ljubljana, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo,
Njegoševa 4, 1000 Ljubljana
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
standardized procedures, for examination of urine sediment it is recommended
to use phase contrast microscope. The formed elements in urine sediment
are numerous and diverse: hematopoietic and epithelial cells, lipids, casts,
mucus, crystals, contaminants and artifacts. Cells are present in characteristic
morphological shapes or they may be changed because of different conditions:
urine properties, sample ageing, specimen preparation, diseases and conditions.
Characteristic changes of urine sediment are caused with various clinical
conditions, mainly kidney and urinary tract. Correct identification of normal,
disease altered cells and various pathological findings in urine sediment is still
basic and reliable method for detection and monitoring of kidney and urinary
tract diseases.
Key words: urinary sediment, urinalysis, erythrocytes, casts, kidney
diseases, urinary tract diseases
Povzetek
Mikroskopski pregled sedimenta seča je preiskava, katere začetki segajo daleč
v zgodovino in je danes še vedno ena od najpogosteje izvajanih analiz bioloških
vzorcev. Odvzem vzorca seča in priprava sedimenta seča morata biti izvedena po
standardiziranih postopkih, pregled sedimenta seča pa je priporočljivo izvesti s
fazno-kontrastnim mikroskopom. Sestavine prisotne v sedimentu seča so lahko
zelo številne in raznolike: hematopoetske in epitelijske celice, lipidi, cilindri,
sluz, kristali ter kontaminanti in artefakti. Celice so lahko prisotne v značilnih
morfoloških oblikah ali pa so spremenjene zaradi različnih pogojev, lastnosti
seča, staranja vzorca, priprave vzorca ali zaradi bolezenskih stanj. Značilne
spremembe sedimenta seča so povezane z različnimi boleznimi, predvsem ledvic
in sečnih poti. Dobro prepoznavanje normalnih, bolezensko spremenjenih celic
in raznih patoloških najdb v sedimentu seča je še vedno osnoven in zanesljiv
način odkrivanja in spremljanja bolezni ledvic in sečnih poti.
1. Uvod
Microscopic examination of urine sediment is laboratory test with its beginnings
far in history and it is now one of the most performed tests of biological fluids.
Urine collection and preparation of urine sediment should be performed by
Začetni poskusi mikroskopiranja vzorcev seča segajo daleč nazaj v zgodovino
v prvo polovico 17. stoletja, kar je bilo samo nekaj desetletij po tem, ko
so postali v Evropi dostopni prvi mikroskopi. Prvo mikroskopiranje seča je
verjetno izvedel Francoz Nicolaus Fabricius de Pieresc (1580- 1637) leta 1630,
ki je v seču našel veliko romboidnih kristalov in jih opisal z besedami »a heap
of rhomboidal bricks«. Do konca 18. stoletja so v seču opisane samo najdbe
kristalov. V prvi polovici 19. stoletja, ki je bilo najpomembnejše obdobje v
razvoju mikroskopiranja seča, pogojeno z izboljšanimi mikroskopi, sta Pierre
Rayer (1793-1867) in Eugene Napoleon Vigla (1813-1872) iz Pariza uvedla
mikroskopiranje seča v vsakodnevno klinično prakso. Opisala sta postopek
priprave vzorca seča in veliko število formiranih elementov seča: kristale,
ploščate in okrogle epitelijske celice, sluz, levkocite, eritrocite, lipide, spermije
in glive. Obenem pa sta povezala veliko najdb v seču pri zdravih ljudeh in
bolnikih z različnimi boleznimi. Nemški raziskovalci pa so naredili pomemben
prispevek z opisovanjem cilindrov. Prvi jih je opazil v ledvičnih tubulih Gabriel
Gustav Valentin (1810-1883) leta 1837, leta 1842 pa jih je Johann Franz Simon
(1807-1843) lepo nazorno opisal in narisal. Njegove risbe so tudi najzgodnejše
znane risbe cilindrov. Za drugo polovico 19. stoletja je značilen velik tehnološki
napredek, uporaba centrifug in uvedba apokromatskih objektivov. Tako so bili
130
131
Ključne besede: sediment seča, osnovna urinska analiza, eritrociti, cilindri,
bolezni ledvic in sečnih poti.
Abstract
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
proti koncu 19. stoletja opisani že vsi formirani elementi v seču. Med njimi je
bilo zadnje odkritje leta 1872 dismorfnih eritrocitov in akantocitov, ki jih je
odkril Anglež George Harley (1829-1896) (1,2).
2. Priprava in pregled sedimenta seča
Najprimernejši vzorec za analizo je prvi ali drugi jutranji seč, vzorec, ki je
zadostno koncentriran in svež, hitro dostavljen v laboratorij (3) - najkasneje
v dveh urah od odvzema vzorca (4). Laboratorij mora imeti standardizirane
postopke priprave sedimenta seča. V Sloveniji uporabljamo Priporočene
postopke za odvzem, zbiranje, hranjenje, stabiliziranje in transport urina (5) in
Priporočene postopke za osnovno analizo urina (4). Za pregled sedimenta seča
je priporočena uporaba fazno-kontrastnega mikroskopa (3,6), ki omogoča
boljšo razpoznavnost bakterij, hialinih cilindrov, eritrocitov ter bolje vidne
celične značilnosti. Priporočljivo je mikroskop tudi opremiti s polarizirano
svetlobo za potrditev lipidnih delcev in kristalov (6).
Referenčne vrednosti za eritrocite so do 3 in za levkocite do 5, oboje v vidnem
polju pri 400× povečavi. Sediment seča lahko poleg tega vsebuje še malo
sluzi, epitelijskih celic in kristalov sečnih kamnov (brez patoloških kristalov)
na vidno polje pri večji povečavi (400×) ter do 2 hialina cilindra na vidno polje
pri manjši povečavi (100×) (5). Ledvične tubulne in prehodne epitelijske
celice niso normalno prisotne v vidnem polju pri večji povečavi (400×) (6).
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
in lomni količnik eritrocitov so spremenljivi, odvisni od različnih pogojev. V
hipotoničnem seču so eritrociti povečani – napihnjeni, lahko tudi izgubijo
hemoglobin (izluženi eritrociti). V hipertoničnem seču pa postanejo eritrociti
skrčeni, nagubani, na površini membran imajo vidna zrnca. Spremembe v
obliki eritrocitov zaradi osmotskih vplivov nimajo diagnostičnega pomena (7).
Vzroki za eritrociturijo (hematurijo) so ledvične bolezni, okvare, infekcije,
tumorji ali lezije, tvorbe kamnov, generalizirane krvavitve ali pa motnje
koagulacije zaradi uporabe antikoagulantov (8).
Oblika eritrocitov v seču je lahko zelo spremenjena. Eritrociti nepravilnih
oblik, s spremenjeno celično membrano, z granulacijami v citoplazmi se
imenujejo dismorfni eritrociti (Slika 1) in so značilni za glomerulne krvavitve.
Med dismorfne eritrocite uvrščamo tudi akantocite (Slika 1), ki so eritrociti
z enim ali več izrastki na površini. Eritrociti se poškodujejo, spremenijo pri
prehodu skozi glomerulno membrano in ob nadaljnjem prehodu tubulnega
sistema ledvic. Za glomerulno hematurijo je značilna prisotnost vsaj 5%
akantocitov ali vsaj 40% dismorfnih eritrocitov (7,9).
3. Sestavine sedimenta seča
V seču je lahko prisotno zelo veliko število različnih neraztopljenih sestavin
– formiranih elementov. To so celice, hematopoetske in epitelijske, lipidi,
cilindri, sluz, kristali, mikroorganizmi ter kontaminanti in artefakti.
3.1 Celice
•
ERITROCITI
Eritrociti so majhne okrogle celice povprečnega premera 6,6 μm (od 4 do
10 μm) brez jedra z gladko površino in bikonkavno obliko. Velikost, oblika
Slika 1. Dismorfni eritorciti, dva akantocita (puščici) (fazni kontrast, x400)
Figure 1. Dysmorphic erythrocytes, two acanthocytes (arrows)(phase contrast, x400)
132
133
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
•
LEVKOCITI
Najpogosteje so v seču prisotni nevtrofilni granulociti, ki merijo v premeru okoli
10 do 12 μm (2). So brezbarvni, okroglih oblik, imajo drobne citoplazemske
granulacije in običajno segmentirano jedro. Tudi velikost in izgled nevtrofilcev
se lahko spremeni, v hipertoničnem seču so citoplazemske organele zbite
in jedro težko vidno, v hipotoničnem vzorcu so večji in nabrekli, jedro
in citoplazemske organele so vidne, slednje se lahko gibljejo (Brownovo
gibanje). Nevtrofilni granulociti zelo hitro razpadajo, včasih imajo lahko v seču
tudi spremenjeno obliko – podolgovato ali z izrastki. Njihovo združevanje
v skupke je najpogosteje posledica okužb sečil (8).
Najpogostejši vzroki za levkociturijo so bakterijske okužbe sečnega mehurja
(cistitis) in ledvic (pielonefritis). Med neinfekcijskimi vzroki pa so najpogostejši
glomerulonefritis, intersticijski nefritis, policistična bolezen ledvic in urološke
bolezni (7).
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
večje, okroglih do ovalnih oblik, premera od 17 do 43 μm, za celice iz globjih
plasti pa je značilno, da so najpogosteje podolgovate ali ovalne ter imajo
vzdolžni premer od 10 do 38 μm. Celice iz površinskih plasti so najpogostejše
pri pacientih s cistitisom, celice iz globjih plasti pa pri poškodbah zaradi
ledvičnih kamnov in pri karcimomu mehurja (7).
Ledvične tubulne epitelijske celice (Slika 2) izvirajo iz različnih segmentov
nefrona, ledvičnih tubulov in zbirnih kanalčkov. Imajo okroglo, ovalno,
večkotno ali podaljšano obliko in granulirano citoplazmo. Velike so od 9 do
25 μm. V seču so prisotne pri aktivnem ledvičnem obolenju tubulov: akutni
tubulni nekrozi, akutnem intersticijskem nefritisu, zavrnitveni reakciji po
presaditvi ledvice in tudi pri pri glomerulnih boleznih (7).
V seču so lahko prisotni tudi eozinofilni granulociti in limfociti, ki jih zanesljivo
prepoznamo samo s citološkimi tehnikami in barvanjem. Eozinofilurija danes
velja za nespecifično najdbo z manjšim pomenom kot v preteklosti. Prisotna
je pri z zdravili povzročenim intersticijskim nefritisu, pri preobčutljivosti na
nekatera zdravila, pri akutnih urogenitalnih infekcijah in nekaterih drugih
vzrokih. Limfociturija je prisotna pri kroničnih vnetnih stanjih in virusnih
okužbah, v prvih nekaj tednih po transplantaciji ledvic pa je lahko prvi znak
zavrnitvene reakcije organizma (3).
Makrofagi v seču so okrogle celice z zelo različnim premerom, od 13 do 95
μm. Imajo eno ali več jeder, ki ležijo centralno ali periferno, pogosto pa jedra
niso vidna, zaradi granul, vakuol in ostalih delcev v citoplazmi. V seču so
najpogosteje prisotni pri proliferativnem glomerulonefritisu, IgA nefropatiji,
polioma BK infekciji po transplantacijah ledvic (7) in pri okužbah sečil (3).
•
EPITELIJSKE CELICE
Ploščate epitelijske celice izvirajo iz končnih delov sečnice (uretre) in iz
nožnice. So največje epitelijske celice v seču, premera od 17 do 118 μm (7). So
tanke, poligonalnih oblik z veliko citoplazme ter majhnim centralno ležečim
jedrom. Zaradi stalnega obnavljanja epitelija se stare celice izločajo v seč in
so pri ženskah običajno vedno prisotne v majhnem številu. Pri neustreznem
zbiranju seča (vaginalni izločki) so lahko prisotne v zelo velikem številu (10).
Prehodne epitelijske (uroepitelijske) celice pokrivajo večplastni epitelij
sečil od ledvičnih čašic do mehurja pri ženskah in do zgornjega dela sečnice
pri moških. Celice različnih plasti se razlikujejo, celice iz površinskih plasti so
Raziskave kažejo, da z natančnim pregledom sedimenta seča ter z uporabo
fazno-kontrastnega mikroskopa lahko v sedimentu seča prepoznamo
tudi neobičajne, spremenjene celice, ki jih sicer ocenjujemo v preparatih,
pripravljenih s citološkimi tehnikami in barvanjem, kot so maligne urotelijske
134
135
Slika 2. Skupek ledvičnih tubulnih epitelijskih celic (fazni kontrast, x400)
Figure 2. A clump of renal tubular epithelial cells (phase contrast, x400)
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
celice (11) in celice inficirane s polioma virusom (Decoy celice). Slednje so
lahko prisotne po transplantacijah ledvic in povzročajo zaplete, ki se lahko
končajo z izgubo presajene ledvice (7).
3.2 Lipidi
V seču najdemo lipide kot proste maščobne kapljice, ovalna maščobna
telesca, maščobne cilindre in kristale holesterola. Proste maščobne kapljice
(Slika 3 in slika 4), posamezne ali v skupkih, so okrogli delci, zelo različnih
velikosti s svetlo rumeno barvo. Imajo velik lomni količnik (pri mikroskopiranju
so dobro vidne). Najdbo maščobnih kapljic potrdimo s polarizirano svetlobo
mikroskopa (v kapljicah holesterola so vidni malteški križi) ali z barvilom
Sudan III. Ovalna maščobna telesca so z maščobo napolnjene ledvične
tubulne epitelijske celice ali makrofagi. Maščobni cilindri vsebujejo maščobne
kapljice, ki jih je lahko od samo nekaj pa vse do številnih, lahko popolnoma
prekrijejo matriks cilindra. Kristali holesterola so zelo redki (7).
Lipidne delce najdemo pri pacientih z nefrotskim sindromom, kliničnim
sindromom, ki je rezultat velike prepustosti glomerulne membrane za
plazemske proteine. Prisotni so tudi pri bolnikih s primarnimi anomalijami
presnove maščob (Fabrijeva bolezen), pri nekaterih glomerulnih boleznih
in pri policistični bolezni ledvic (10).
Slika 3. Proste maščobne kapljice (fazni kontrast, x400)
Figure 3. Free lipid droplets (phase contrast, x400)
136
Slika 4. Proste maščobne kapljice (polarizirana svetloba, x400)
Figure 4. Free lipid droplets (polarized light, x400)
3.3 Cilindri
So odlitki ledvičnih tubulov, cilindrični formirani elementi, ki nastajajo v
distalnih tubulih in zbirnih kanalčkih. Sestavljeni so iz beljakovine uromodulin
(Tamm-Horsfallov glikoprotein, THG). Pri določenih fizioloških in patoloških
stanjih se fibrile THG prepletajo in združujejo v lumnu tubulov. Cilindri
pogosteje nastajajo v kislem seču, pri večji koncentraciji topljencev,
zmanjšanem pretoku seča in ob prisotnosti plazemskih beljakovin. So
različni po velikosti in obliki, ki je odvisna od mesta nastanka. Imajo različen
premer, običajno so ožji, razširjeni pa so prisotni pri tubulni atrofiji ali ledvični
obstrukciji. Osnova je hialini cilinder, ki je sestavljen samo iz THG in ima
zelo nizek lomni količnik. V hialino osnovo pa so lahko vključene še druge
sestavine kot so celice, lipidi, granule, kristali ali mikroorganizmi. Katerekoli
sestavine, ki so prisotne v tubulnem lumnu, se lahko vključijo v cilinder. To
pojasnjuje veliko različnih vrst cilindrov, različne morfologije, sestave in
diagnostičnega pomena (12).
Hialini cilindri so lahko prisotni pri naslednjih fizioloških stanjih: po naporu,
dehidraciji, pri povišani telesni temperaturi. Nastanejo tudi pri večini ledvičnih
bolezni in pri kongestivni srčni odpovedi.
137
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Eritrocitne cilindre najdemo pri glomerulnih krvavitvah, zelo redko pri
intersticijskem nefritisu.
Levkocitni cilindri so prisotni pri akutnem pielonefritisu, tubulnointersticijskih
boleznih ali glomerulonefritisu.
Epitelijski cilindri imajo vključene ledvične tubulne epitelijske celice.
Nastanejo pri hujših tubulnih okvarah kot je akutna tubulna nekroza in
akutni intersticijski nefritis. Prisotni tudi pri glomerulnih boleznih.
Granulirani cilindri (Slika 5) so cilindri z vključenimi granulami. Njihovo
število, velikost in obarvanost so lahko različni. Razlikujemo drobno ali grobo
granulirane cilindre. Prisotni so pri številnih glomerulnih in tubulnih boleznih.
Maščobni cilindri so prisotni v seču skupaj z ostalimi lipidnimi delci, pri
nefrotski proteinuriji.
Voščeni cilindri (Slika 6) so dobili ime po svojem izgledu, ki spominja na
stopljen vosek. Imajo homogen izgled, izrazite ostre robove, ki so pogosto
zamaknjeni in prelomljeni. Pogosto imajo večji premer in so lahko temnejše
barve. Še vedno ni znano kako nastanejo in iz česa so sestavljeni. Povezani
pa so z večjimi koncentracijami serumskega kreatinina in z različnimi vrstami
kroničnih in hitro napredujočih ledvičnih bolezni (13).
Slika 5. Drobno granulirani cilinder (fazni kontrast, x400)
Figure 5. A finely granular cast (phase contrast, x400)
Pigmentni cilindri so značilno obarvani. Hemoglobinski cilinder nastane
z razpadom eritrocitov v cilindru, redko pa z intravaskularno hemolizo.
Mioglobinski cilindri so prisotni pri akutnih ledvični bolezni zaradi rabdomiolize.
Pri ljudeh s povišano koncentracijo direktnega (konjugiranega) bilirubina v
seču se cilindri (hialini, granulirani, celični, voščeni) zaradi bilirubina obarvajo
značilno rumeno – bilirubinski cilindri (3).
Mešani cilindri so sestavljeni iz različnih sestavin, med njimi so daleč
najpogostejši hialino-granulirani cilindri. Prisotni so pri bolnikih z različnimi
oblikami glomerulonefritisov in akutnega intersticijskega nefritisa (12).
Slika 6. Voščeni cilinder (fazni kontrast, x400)
Figure 6. A waxy cast (phase contrast, x400)
138
139
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
3.4 Sluz
Sluz ali mukus je pogosta sestavina seča, ki pa nima diagnostičnega pomena.
Ima zelo majhen lomni količnik in vlaknasto strukturo, vlakna so večja in
rahlejše sestave kot hialini cilindri (10).
3.5 Kristali
Najdbe kristalov v sedimentu seča so dokaj pogoste. Najpogosteje najdemo
kristale kalcijevega oksalata, sečne kisline, tripel fosfata (Slika 7 in slika 8),
kalcijevega fosfata ter amorfnih fosfatov in uratov, ki so posledica prehodne
hipersaturacije seča po določeni hrani, zaradi premajhnega vnosa tekočine
ali spremembe pH seča (14). Včasih pa je nastajanje kristalov povezano z
nastajanjem ledvičnih kamnov, nastajajo tudi pri akutni uratni nefropatiji
po kemoterapiji, pri zastrupitvah z etilenglikolom in pri okužbah sečil (tripel
fosfat in amonijev biurat). Patološki kristali holesterola, cistina, leucina,
tirozina in 2,8-dihidroksiadenina nastajajo pri presnovnih motnjah in
nekaterih drugih boleznih. Kristali lahko nastanejo tudi po terapiji z nekaterimi
zdravili (aciklovir, ciprofloksacin, sulfadiazin...), predvsem pri predoziranjih,
dehidraciji, hipoalbuminemiji, pri visokem ali nizkem pH-ju seča. Na kristale
zdravil pomislimo pri najdbi številnih kristalov z nenavadno obliko. Zaradi
precipitacije kristalov v tubulih lahko nastanejo tudi akutne ledvične okvare
(15). Prepoznavanje kristalov v seču je diagnostično pomembno. Potrebno je
analizirati sveže vzorce seča in poznati značilne morfološke oblike kristalov
ter pH seča. Pri mikroskopiranju nam je v pomoč tudi polarizirana svetloba.
Slika 7. Kristali tripel fosfata (svetlo polje, x200)
Figure 7. Triple phosphate crystals (bright field, x400)
Slika 8. Kristali tripel fosfata (polarizirana svetloba, x400)
Figure 8. Triple phosphate crystals (polarized light, x400)
140
141
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
3.6 Mikroorganizmi
4. Značilni izvidi sedimenta seča pri boleznih ledvic in sečnih poti
Bakterije so zelo majhne, po obliki so najpogostejše paličaste in okrogle.
Lahko so prisotne posamične, v parih, po štiri ali osem skupaj, v verigah,
odvisno od vrste bakterij. Največ okužb sečil povzročajo srednje velike gramnegativne paličaste bakterije Escherichia coli in Proteus sp. (8). Njihova
prisotnost je lahko tudi posledica vaginalne kontaminacije. Pri nepravilnem
hranjenju vzorcev se bakterije namnožijo. Okužba sečil je zelo verjetna, če
so v svežem vzorcu srednjega curka seča skupaj z bakterijami prisotni tudi
levkociti.
V seču je najpogosteje prisotni parazit Trichomonas vaginalis. Je ovalne ali
okrogle oblike, običajno malo večji od levkocita, ima jedro in pet bičkov. V
mokrih preparatih ga hitro prepoznamo po gibanju. Njihova prisotnost v
seču je najpogosteje posledica kontaminacije seča z genitalnimi izločki, saj
so pogost vzrok vaginitisa (ali uretritisa), zato pogosto najdemo tudi številne
ploščate epitelijske celice, levkocite, bakterije in/ali glive (8).
Glive so enocelični organizmi z izrazito celično steno, težko opaznim jedrom
in homogeno citoplazmo brez očitnih organel. So lahko ovalne, okrogle
ali podolgovate oblike, kar je značilnost posamezne vrste gliv. Prisotne so
v oblikah brstenja ali nitastih struktur - psevdohif. Najpogosteje prisotna
vrsta glive v seču je Candida albicans. V seču so običajno prisotne zaradi
kontaminacije pri ženskah s primarnim glivičnim vnetjem nožnice. Lahko
pa je prisotna primarna okužba sečil z glivami, predvsem pri sladkornih
bolnikih, ljudeh s strukturnimi nepravilnostmi sečil, bolnikih z vstavljenim
urinskim katetrom, ob daljšem antibiotičnem zdravljenju in zdravljenju z
imunosupresivi (7,8).
S specifičnimi najdbami v sedimentu seča in z oceno proteinurije lahko
opredelimo značilne klinične sindrome, ki so povezani z različnimi
bolezenskimi stanji (16).
3.7 Kontaminanti in artefakti
Kontaminanti in artefakti so vsi formirani elementi, ki se pojavijo v seču,
potem ko le ta zapusti sečni mehur. Delno se jim je možno izogniti s pravilno
pripravo pacienta na odvzem seča in čistimi delovnimi pogoji. Kontaminanti,
ki izvirajo od preiskovanca so menstrualna kri, eritrociti, levkociti in bakterije
- posledica genitalnih infekcij, spermiji, blato in črevesne celice, vlakna
tkanin, škrob, smukec (magnezijev silikat) in delci krem. Iz laboratorija in
iz okolja pa izvirajo delci stekla, mehurčki zraka, škrob, pelod, rastlinske
celice ter spore gliv (7).
142
Pri nefrotskem sindromu so za izvid značilni: nefrotska proteinurija (>3,5 g/
dan), lipidurija (maščobni cilindri, maščobna ovalna telesca, proste maščobne
kapljice), ledvične tubulne epitelijske celice, epitelijski cilindri. Lahko je prisotna
tudi mikroskopska hematurija. Vzrok nefrotskega sindroma so večinoma
glomerulne bolezni, ki ne povzročajo pomembnega vnetnega dogajanja
v glomerulih. Zaradi povečane prepustnosti glomerulne membrane, ki je
posledica poškodb in sprememb v električnih nabojih, se filtrirajo beljakovine
z večjo molekulsko maso in lipidi, kar povzroča hipoalbuminemijo, dodatno
stimulira nastajanje lipidov v jetrih, posledica je tudi nastajanje oteklin (16,17).
Za nefritični sindrom so značilni: proteinurija, glomerulna eritrociturija
(dismorfni eritrociti, akantociti), levkociturija, ledvične tubulne epitelijske
celice, eritrocitni in epitelijski cilindri (17). Pri nefritičnem sindromu
hitro poraste koncentracija kreatinina v serumu, povezan je tudi z
nastankom oligurije in hipertenzije. Je posledica primarnih in sekundarnih
glomerulonefritisov. Zaradi imunoloških vnetnih dogajanj nastanejo v
glomerulni bazalni membrani majhne vrzeli, skozi katere prehajajo eritrociti
in levkociti v Bowmanov prostor in v seč (18).
Značilnosti nefritičnega in nefrotskega sindroma lahko najdemo pri vseh
proliferativnih glomerulonefritisih (17).
Sediment seča s številnimi ledvičnimi tubulnimi epitelijskimi celicami
najdemo pri tubulnih poškodbah pri širokem spektru bolezni. Glede na
vzrok poškodb so v sedimentu seča sočasno prisotne različne spremljajoče
značilnosti:
•pri sočasno prisotnih epitelijskih cilindrih in temnih granuliranih cilindrih
je vzrok akutna tubulna nekroza, ki jo povzroči zmanjšana prekrvavitev
ledvic – ishemija ali prisotnost nefrotoksičnih snovi,
•
ri sočasno prisotnih eritrocitih, levkocitih, levkocitnih cilindrih je
p
vzrok akutni intersticijski nefritis, ki nastane zaradi preobčutljivostne
reakcije na zdravila (antibiotiki, nesteroidni antirevmatiki...),
143
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
7. Jesenovčevi dnevi
•ob sočasni najdbi temnih pigmentiranih cilindrov je vzrok
hemoglobinurija ali mioglobinurija (rabdomioliza),
5. Kakovost
•ob sočasno prisotnih kristalih je lahko vzrok za akutne tubulne poškodbe
precipitacija kristalov (16).
Za izvajanje mikroskopskega pregleda sedimenta seča je potrebno veliko
znanja in izkušenj. Pomembno je, da ga opravlja motivirano in dobro izučeno
osebje, kar lahko odločilno prispeva k pravočanemu odkrivanju bolezni
in odkrivanju napredovanja bolezni. Osebje se mora redno izobraževati,
obenem mora biti vzpostavljena tudi redna notranja kontrola – interni nadzor
(4). Zagotovljeno mora biti tudi sodelovanje v nacionalnih ali mednarodnih
ocenah kakovosti dela in rezultatov: Sneqas (Slovenija) (22), Labquality
(Finska), Centre of Biomedical Research (Italija) (23), Instand (Nemčija).
Glavni namen teh shem je prepoznavanje predstavljenih sestavin sedimenta
seča, tudi manj pogostih in poznanih, obenem pa tudi uporaba pravilnega
poimenovanja. Rezultati raziskav kažejo, da prepoznavanje nekaterih sestavin
sedimenta seča ni dobro (23, 24). Nekatere sheme vključujejo tudi klinični
pomen najdb sedimenta seča – interpretacijo rezultatov. Laboratorijski
strokovnjak, specialist medicinske biokemije, ki ima veliko izkušenj pri
opazovanju in prepoznavanju sestavin sedimenta seča, lahko podaja natančno
in podrobno morfologijo in tudi interpretacijo rezultatov (25). Izredno
pomembno pa je dobro medsebojno sodelovanje laboratorijskega osebja
in zdravnikov, kar prinaša največjo korist, dobrobit bolnikom.
Sediment seča z eritrociturijo
Kadar je eritrociturija povezana s proteinurijo je vzrok hematurije običajno
glomerulna bolezen. Če pa ni sočasno prisotne proteinurije, je stanje
poimenovano izolirana mikroskopska hematurija, ki je povezana z urološkimi
boleznimi (najpogosteje z rakom) ali nefrološkimi boleznimi (IgA nefropatija,
bolezen tanke bazalne glomerulne membrane). V teh primerih je zelo
pomembna ocena morfologije eritrocitov, opredelitev nefrološkega ali
urološkega vzroka krvavitve (16,17).
Sediment seča z bakterijami in levkociti
Znano je, da je vzrok bakteriurije in levkociturije okužba sečil. Kljub temu
je potrebno izključiti kontamincijo z vaginalnimi izločki pri ženskah (če je
prisotno večje število ploščatih epitelijskih celic, lahko tudi glive). Blaga
izolirana bakteriurija je običajno posledica nesterilnega odvzema vzorca.
Izolirana levkociturija pa je lahko povezana s širokim spektrom bolezni, kot je
tudi tuberkuloza sečil, kronični intersticijski nefritis, ledvični kamni (16,19)...
Minimalne spremembe seča
Neznačilne spremembe seča, ki jih lahko interpretiramo samo v povezavi s
kliničnimi informacijami in drugimi diagnostičnimi preiskavami. Prisotnost
manjšega števila cilindrov, blaga hematurija in/ali levkociturija s sočasno blago
proteinurijo je lahko prisotna pri širokem spektru glomerulnih, intersticijskih,
vaskularnih ledvičnih bolezni (16).
Sediment seča je biooznačevalec ledvičnih bolezni, diagnostičen je za
mesto okvar v nefronu, lahko usmerja terapijo in zagotavlja prognostične
informacije o poteku bolezni (20). Za odkrivanje akutnih okvar ledvic, hitrega
zmanjševanja ledvičnega delovanja, se uveljavljajo novi biooznačevalci
(lipokalin povezan z nevtrofilno gelatinazo, NGAL; interlevkin 18; KIM-1),
ki skupaj z mikroskopskim pregledom sedimenta seča omogočajo zgodnje
odkrivanje bolezni, razlikovanje predledvičnih okvar in akutne tubulne
nekroze, napovedovanje poteka bolezni in ogroženosti bolnika (21).
144
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
6. Sklep
Enostavno, neinvazivno pridobljen vzorec seča – tekoča ledvična biopsija
nam nudi veliko število informacij o dogajanju v ledvicah, sečnih poteh in
celotnem dogajanju v organizmu. Mikroskopski pregled sedimenta seča
je preiskava z zelo dolgo zgodovino, ki pa danes marsikdaj ni izvedena
optimalno, najboljše. Zato morata biti odvzem vzorca seča in priprava
sedimenta seča izvedena po standardiziranih postopkih. Pregled mora biti
izveden čim hitreje po odvzemu vzorca, s primerno opremo, predvsem
pa le-ta zahteva veliko znanja, ki ga je potrebno vseskozi dopolnjevati,
nadgrajevati na izobraževanjih in z udeležbo v zunanjih shemah kakovosti
dela in rezultatov.
145
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Literatura
1.Fogazzi GB, Cameron JS. Urinary microscopy from the seventeenth century to the
present day. Kidney Int 1996; 50: 1058–1068.
2.Cameron JS. Historical introduction. In: Fogazzi GB. The Urinary Sediment: An
Integrated View, 3rd edition. Elsevier Masson, 2010: 1-15.
3.Kouri T, Gant VA, Fogazzi GB, Hofmann W, Hallander H, Walter GG. European urinalysis
guidelines. Scand J Clin Lab Invest Suppl 2000; 231:1-86.
4.Plazar N, Pahor V, Berce K. Priporočeni postopki za osnovno analizo urina. Slovensko
združenje za klinično kemijo 2004.
5.Skitek M, Trampuš Bakija A. Priporočeni postopek za odvzem, zbiranje, hranjenje,
stabiliziranje in transport urina. Slovensko združenje za klinično kemijo 2001.
6.Fogazzi GB, Garigali G. Collection, preparation and examination of the samples, and
report of the urinary findings. In: Fogazzi GB. The Urinary Sediment: An Integrated
View, 3rd edition. Elsevier Masson, 2010: 20-38.
7.Fogazzi GB, Garigali G, Croci MD, Verdesca S. The formed elements of the urinary
sediment. In: Fogazzi GB. The Urinary Sediment: An Integrated View, 3rd edition.
Elsevier Masson, 2010: 41-152.
8.Munson Ringsrud K, Jorgenson Linne J. Urinalysis and Body Fluids, A Colortext and
Atlas. Mosby-Year book 1995.
9.Fogazzi GB, Edefonti A, Garigali G, Giani M, Zolin A, Raimondi S, Mihatsch MJ, Messa
P. Urine erythrocyte morphology in patients with microscopic haematuria caused by
a glomerulopathy. Pediatr Nephrol. 2008 Jul;23(7):1093-100
10.Brunzel NA. Fundamentals of Urine and Body Fluid Analysis. Elsevier Sounders 1994.
11.Fogazzi GB, Pallotti F, Garigali G. Atypical/malignant urothelial cells in routine urinary
sediment: worth knowing and reporting. Clin Chim Acta. 2015, 15; 439:107-11.
12.Caleffi A, Lippi G. Cylindruria. Clin Chem Lab Med. 2015.
13.Spinelli D, Consonni D, Garigali G, Fogazzi GB. Waxy casts in the urinary sediment of
patients with different types of glomerular diseases: results of a prospective study.
Clin Chim Acta. 2013; 23; 424:47-52.
14.Fogazzi GB. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis.Nephrol Dial
Transplant. 1996; 11(2):379-87.
15.Khan M, Ortega LM, Bagwan N, Nayer A. Crystal-induced acute kidney injury due to
ciprofloxacin. J Nephropathol. 2015; 4(1): 29–31.
16.Fogazzi GB, Verdesca S. Interpretation of the urinary sediment findings. In: Fogazzi
GB. The Urinary Sediment: An Integrated View, 3rd edition. Elsevier Masson, 2010:
211-219.
17.Lindič J, Škoberne A. Preiskave seča. In: Lindič J, Kovač D, Kveder R, Malovrh M, Pajek
J, Aleš Rigler A, Škoberne A. Bolezni ledvic, tretja izdaja 2014.
18.King Strasinger S, Schaub Di Lorenzo M. Urinalysis and body fluids. Fifth edition, E.A.
Davis Company 2008.
19.UpToDate. http://www.uptodate.com. Dostop: 03-07-2015.
20.Perazella MA. The urine sediment as a biomarker of kidney disease. Am J Kidney Dis. 2015.
21.Perazella MA, Coca SG. Traditional urinary biomarkers in the assessment of hospitalacquired AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 2012;7(1):167-74.
22.Sneqas. http://www.kikkb.si/sneqas.htm. Dostop: 06-07-2015.
23.Fogazzi GB, Secchiero S, Consonni D, Sciacovelli L, Zardo L, Garigali G, Verdesca S,
146
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Messa P, Plebani M. An Italian external quality assessment (EQA) program on urinary
sediment. Clin Chim Acta. 2010 3;411(11-12):859-67.
24.Wald R, Bell CM, Nisenbaum R, Perrone S, Liangos O, Laupacis A, Jaber BL. Interobserver
reliability of urine sediment interpretation. Clin J Am Soc Nephrol. 2009 Mar;4(3):567-71.
25.Fogazzi GB, Secchiero S, Garigali G, Plebani M. Evaluation of clinical cases in External
Quality Assessment Scheme (EQAS) for the urinary sediment.Clin Chem Lab Med.
2014 Jun;52(6):845-52.
147
7. Jesenovčevi dnevi
Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana
Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani
Zbornik predavanj raziskovalnega srečanja
6. JESENOVČEVI DNEVI - Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine
CIP - Kataložni zapis o publikaciji
Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana
616-074(082)
JESENOVČEVI dnevi (6 ; 2014 ; Ljubljana)
6. Jesenovčevi dnevi : raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine, 30. september 2014, Fakulteta za farmacijo,
Aškerčeva 7, Ljubljana : [zbornik predavanj] / [urednika Darko Černe in Milan Skitek ; organizator srečanja Katedra
za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani in Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo,
Univerzitetni klinični center Ljubljana]. - Ljubljana : Fakulteta za farmacijo, Katedra za klinično biokemijo : Univerzitetni
klinični center, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, 2014
ISBN 978-961-6378-61-1 (Fakulteta za farmacijo)
1. Dodat. nasl. 2. Černe, Darko 3. Fakulteta za farmacijo (Ljubljana). Katedra za klinično biokemijo
4. Univerzitetni klinični center (Ljubljana). Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo
275591424
148