URN:NBN:fi:jyu-20 - Jyx
TIIVISTELMÄ Heiska, Leena Esriinin merkitys syövässä Jyväskylä: Jyväskylän yliopisto, 2014, 69 s. Yhteenveto: Esriinin merkitys syövässä Lisensiaatintutkimus. Tutkimukseni selvittää esriinin tehtäviä ja säätelyä erityisesti syövän kannalta. Esriini kuuluu ERM-proteiiniperheeseen (esriini/radiksiini/moesiini). Nämä proteiinit tarttuvat toisaalta solun aktiinitukirankaan, toisaalta solukalvon reseptoreihin. Esriini vaikuttaa solutukirangan järjestäytymiseen ja solun kortikaalisiin muodonmuutoksiin. Voimistunut esriinin ekspressio korreloi tiettyjen syöpätyyppien maligniteettiin ja erityisesti metastointikykyyn. Esriinin tiedetään esimerkiksi olevan välttämätön osteosarkooman metastaasissa. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää Src-kinaasin katalysoiman fosforyloinnin merkitystä esriinin toiminnalle syöpään liittyvissä ilmiöissä, esim. invaasiossa ja migraatiossa. Tutkimme soluja, jotka eivät ilmennä endogeenistä esriiniä (poistogeenisistä hiiristä tuotetut solulinjat). Solulinjoissa ilmennettiin esriiniproteiinin erilaisia mutanttiversioita ja solujen käyttäytymistä verrattiin toisiinsa Src-kinaasiin liittyvissä funktionaalisissa kokeissa. Solujen proliferaatiokyvyn, adheesiokyvyn ja migraatiokyvyn havaittiin olevan keskenään verrannollisia normaaleissa kaksiulotteisissa viljelyolosuhteissa. Jos soluja kuitenkin kasvatettiin kolmiulotteisten matriksien sisällä tai päällä, saatiin mielenkiintoisia tuloksia. Tällaiset kasvatusolosuhteet muistuttavat fysiologisia kasvuolosuhteita, joita kasvainsolut kudoksissa kohtaavat. Villityyppisen esriinin ilmentäminen antoi soluille selvän kasvuedun sekä ns. soft agar -kokeessa, jossa soluja kasvatetaan kiinteän agarin sisällä, että Matrigelkokeissa, joissa solut kasvavat hiiren tuumorista uutetun tyvikalvomatriksin päällä tai sisällä. Sitä vastoin esriinin Y477F-mutanttimuoto ei kasva näissä olosuhteissa esriiniä ilmentämätöntä vektorikontrollia paremmin. Villityyppisen esriinin antama kasvuetu oli lisäksi Src-kinaasista riippuvainen, koska ilman aktiivista Src-kinaasia solut eivät kasvaneet näissä oloissa esriinistä huolimatta. Samankaltaisia tuloksia saimme kollageenimatriksilla kasvatetuilla solusferoideilla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että esriinin Src-välitteisen fosforylaation merkitys liittyy nimenomaan fosforylaation solulle antamaan kykyyn selviytyä paremmin kolmiulotteisissa kasvuoloissa, kuten kudoksissa. Hakusanat: Esriini; kasvaimet; etäpesäkkeet; fosforylaatio. Leena Heiska, Jyväskylän yliopisto, Bio- ja ympäristötieteiden laitos, PL 35, 40014 Jyväskylän yliopisto, Suomi Tekijän osoite Leena Heiska Bio- ja ympäristötieteiden laitos PL 35 40014 Jyväskylän yliopisto [email protected] Ohjaajat Prof. Matti Vuento Bio- ja ympäristötieteiden laitos PL35 40014 Jyväskylän yliopisto Prof. Olli Carpén PL 52 20521 Turku Tarkastajat Prof. Jari Ylänne Jyväskylän yliopisto Bio- ja ympäristötieteiden laitos PL 35 40014 Jyväskylän yliopisto LKT, ylilääkäri Jan Böhm Keski-Suomen sairaanhoitopiiri Keskussairaalantie 19 40620 Jyväskylä SISÄLTÖ ALKUPERÄISJULKAISU LYHENTEET 1 JOHDANTO JA KIRJALLISUUSKATSAUS ......................................................... 9 1.1 Syöpäsolujen ominaisuudet ja syövän tunnusmerkit ................................. 9 1.1.1 Riippumattomuus ulkoisista kasvusignaaleista ............................. 10 1.1.2 Kasvua estävien signaalien välttäminen .......................................... 12 1.1.3 Ohjelmoidun solukuoleman välttäminen ........................................ 13 1.1.4 Kyky jakautua rajattomasti ................................................................ 13 1.1.5 Verisuonten uudismuodostus ........................................................... 14 1.1.6 Kyky tunkeutua kudokseen ja muodostaa etäpesäkkeitä ............. 14 1.1.7 Syövän syntyä edesauttavat tekijät ................................................... 16 1.1.8 Kasvaimen mikroympäristö............................................................... 17 1.2 Esriini ja ERM-proteiinit ................................................................................ 18 1.2.1 Esriinin rakenne ja ERM-proteiiniperhe .......................................... 18 1.2.2 Esriinin ekspressio soluissa ja kudoksissa ....................................... 20 1.2.3 Esriinin säätely ..................................................................................... 21 1.2.4 Esriini ja merliini .................................................................................. 23 1.3 Esriini ja syöpä ................................................................................................ 24 1.3.1 Esriini ja syövän tunnusmerkit: riippumattomuus kasvusignaaleista ...................................................................................................... 26 1.3.2 Esriini ja syövän tunnusmerkit: kasvua estävien signaalien välttäminen ...................................................................................................... 29 1.3.3 Esriini ja syövän tunnusmerkit: ohjelmoidun solukuoleman välttäminen ...................................................................................................... 31 1.3.4 Esriini ja syövän tunnusmerkit: kyky jakautua rajattomasti ja verisuonten uudismuodostus ....................................................................... 32 1.3.5 Esriini ja syövän tunnusmerkit: kyky tunkeutua kudokseen ja muodostaa etäpesäkkeitä .............................................................................. 33 1.3.5.1 Metastaattisen solun irtautuminen primaarikasvaimesta ja tunkeutuminen kudokseen ........................................ 34 1.3.5.2 Uuteen paikkaan kulkeutuminen, ekstravasaatio ja kolonisaatio ............................................................................................. 38 1.3.5.3 Metastaasitutkimuksen haasteita .......................................... 42 2 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ........................................................................... 45 3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT .................................................................... 46 3.1.1 Solulinjat ............................................................................................... 46 3.1.2 Vasta-aineet, reagenssit ja immunopresipitaatio ............................ 46 3.1.3 Solujen proliferaatiokoe ...................................................................... 47 3.1.4 Soluadheesion analysointi .................................................................. 47 3.1.5 Mikroskopiamenetelmät ..................................................................... 47 3.1.6 Sferodien muodostaminen ja solujen hajaantumiseen liittyvät kokeet ............................................................................................................... 48 3.1.7 Soluviljely soft agarilla ja suspensiossa ............................................ 48 3.1.8 Invaasiokoe ja soluviljely Matrigel-matriksissa .............................. 48 3.1.9 Virtaussytometria ................................................................................ 49 4 TULOKSET JA POHDINTA .................................................................................. 50 4.1.1 Esriinipoistogeenisen hiiren alkion fibroblasteja voidaan käyttää mallina esriinin toiminnan tutkimiseen ........................................ 50 4.1.2 Esriiniä ei tarvita Src-kinaasin aiheuttamiin solumuutoksiin, kun soluja kasvatetaan kaksiulotteisilla pinnoilla ..................................... 51 4.1.3 Esriinin läsnäolo ja tyrosiini 477:n fosforylaatio on välttämätön Src-kinaasin aiheuttamissa pahanlaatuisissa muutoksissa, kun soluja kasvatetaan kolmiulotteisissa malleissa tai suspensiossa ........................ 51 5 PÄÄTELMÄT .......................................................................................................... 54 KIITOKSET ...................................................................................................................... 57 LÄHTEET ........................................................................................................................ 58 ALKUPERÄISJULKAISU Lisensiaattitutkielma perustuu seuraavaan viitataan tekstissä roomalaisella numerolla I. I alkuperäisjulkaisuun, johon Heiska L., Melikova M, Zhao F., Saotome I., MacClatchey A.I. & Carpén O. 2011. Ezrin is key regulator of Src-induced malignant phenotype in threedimensional environment. Oncogene 30: 4953–4962. Tutkimuksessa Leena Heiska suunnitteli ja toteutti useimmat kokeet, analysoi niiden tulokset ja kirjoitti käsikirjoituksen. Maria Melikova oli mukana yhden kokeen suunnittelussa ja toteutti sen. Fang Zhao auttoi kolmiulotteisessa kuvantamisessa. Ichiko Saotome ja Andrea MacClatchey loivat esriinipoistogeenisen hiiren ja tuottivat niistä hiiren alkion fibroblastit, joihin kaikki kokeet perustuivat. Olli Carpén johti tutkimusryhmää ja toimi työn ohjaajana. LYHENTEET 4E-BP1 AMPK AKT APC Bcl bFGF CD44 CDC42 CDK4, CDK5 C-ERMAD E2 EGF (R) EMT eNOS ERM FAK FAS FERM FGF GDP HER2/neu HIF ICAM LKB1 MAPK mTOR N-CAM N-ERMAD NHERF-1/EBP50 p130Cas PDGF PI3K PI(4,5)P2 PKC pRb PTEN PTHrP Rac1 Rho Rho GDI S6K1 eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 AMP-activated protein kinase AKT8 retrovirus oncogene Adenomatous polyposis coli (protein) B cell lymphoma (protein) basic fibroblast growth factor cluster of differentiation-44 cell division control protein homolog 42 cyclin dependent kinase-4, 5 C-terminal ezrin-radixin-moesin assiociation domain 17β-estradiol epidermal growth factor (receptor) epithelial-mesechymal transition endothelial nitcic acid oxide ezrin-radixin-moesin focal adhesion kinase fatty acid synthase four point one - ezrin - radixin -moesin fibroblast gwowth factor guanosine diphosphate human epithelial growth factor-2 hypoxia inducible factor intercellular adhesion molecule liver kinase B1 mitogen activated protein kinase mammalian target of rapamycin neural cell adhesion molecule N-terminal ezrin-radixin-moesin assiociation domain Na+/H+ exchanger regulatory factor-1/ezrin binding protein-50 Crk (CT10 regulator of kinase) associated substrate 130 kD platelet derived growth factor phosphoinositide 3-kinase phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate protein kinase C retinoblastoma protein phosphatase and tensin homolog parathyroid hormone related protein Ras-related C3 botulinum toxin substrate-1 Ras homolog Rho GDP dissociation inhibitor p70 ribosomal protein S6 kinase shRNA siRNA Smad4 SOS Src TGFβ TNFα TSC1 VEGF short hairpin RNA small interfering RNA Sma and Mad related family son of sevenless (protein) Rous sarcoma virus oncogene protein transforming growth factor beta tumour necrosis factor alpha tuberous sclerosis protein-1 (hamartin) vascular endothelial growth factor 9 1 JOHDANTO JA KIRJALLISUUSKATSAUS 1.1 Syöpäsolujen ominaisuudet ja syövän tunnusmerkit Tiedelehti Cell julkaisi vuosituhannen 2000 ensimmäisessä numerossaan tulevaisuuteen suuntautuneita katsausartikkeleita keskeisiltä tutkimusaloilta. Syöpätutkijat Douglas Hanahan ja Robert A. Weinberg kirjoittivat artikkelin, jossa he käsittelivät syövän kehittymistä ja etsivät olennaisia tekijöitä, jotka liittyisivät pahanlaatuiseen kasvuun syöpätyypistä riippumatta. He esittivät uuden ajatuksen syövän kuudesta tunnusmerkistä, jotka normaalin solun täytyy vaiheittain saavuttaa muuttuakseen invasiiviseksi syöpäsoluksi (Hanahan & Weinberg 2000). Artikkelista tuli nopeasti alan siteeratuin julkaisu. Ajatus eri syöpätyypeille ja kasvainten kudosspesifisille alatyypeille yhteisistä tunnusmerkeistä on osoittautunut kiinnostavaksi ajatusmalliksi syöpätutkimukselle. Vuonna 2011 Hanahan ja Weinberg julkaisivat artikkelista päivitetyn ja laajennetun version, jossa he käsittelivät kahta uutta syövän tunnusmerkkiä ja syövän syntymiseen yleisesti myötävaikuttavia tekijöitä (Hanahan & Weinberg 2011). Elimistön syöpää estävä puolustus on yleisesti ottaen hyvä, ja solun kehittyminen syöpäsoluksi on harvinainen tapahtuma. Hanahan ja Weinberg pohtivat artikkeleissaan, kuinka monen säätelypiiristön täytyy häiriytyä, ennen kuin solu muuttuu normaalista solusta syöpäsoluksi. He ehdottavat kuutta olennaista muutosta, jotka esiintyvät lähes kaikissa ihmisen syöpätyypeissä: 1) riippumattomuus ulkoisista kasvusignaaleista 2) kasvua estävien signaalien välttäminen 3) ohjelmoidun solukuoleman välttäminen 4) kyky jakautua rajattomasti 5) verisuonten uudismuodostus 6) kyky tunkeutua kudokseen ja muodostaa etäpesäkkeitä. Eri syöpätyypit saavat vaiheittain kaikki nämä hankitut ominaisuudet, mutta niiden ilmaantumisjärjestys ja -aika saattavat vaihdella (ks. kuvio 1). Toisaalta kasvaimet ovat monimutkaisia kudoksia, joissa eri tyyppiset solut ovat 10 toistensa kanssa heterotyyppisessä vuorovaikutuksessa. Tämän vuoksi pelkkien syöpäsolujen ominaisuuksien tunteminen ei riitä, vaan myös kasvaimen mikroympäristö vaikuttaa kasvaimen kehittymiseen. KUVIO 1 Syövän kuusi tunnusmerkkiä ja esimerkkejä niiden mekanismeista. Mukaelma artikkelista Hanahan ja Weinberg, 2000. Seuraavissa luvuissa käsittelen tarkemmin Hanahanin ja Weinbergin ehdottamia tunnusmerkkejä heidän kahteen artikkeliinsa perustuen (Hanahan & Weinberg 2000; Hanahan & Weinberg 2011). Tässä esittelyosiossa esitettyjen tutkimustulosten tarkat viitetiedot löytyvät näistä kahdesta artikkelista. 1.1.1 Riippumattomuus ulkoisista kasvusignaaleista Normaalisolut eivät kykene lisääntymään ilman kasvua stimuloivia signaaleja. Nämä mitogeeniset signaalit saavat solun poistumaan lepotilasta aktiivisesti lisääntyviksi. Tällaisina signaaleina voivat toimia vapaasti diffundoituvat kasvutekijät, solunulkoisen väliaineen osat tai solujen kiinnittymismolekyylit. Kasvainsoluissa tarve ulkoisille kasvusignaaleille on voimakkaasti vähentynyt, jolloin kudoksen tasapainoa (homeostaasia) ylläpitävä mekanismi häiriytyy. Kasvainsolut muuttuvat kasvusignaalien suhteen autonomisiksi erilaisten mekanismien kautta: itse solunulkoiset kasvusignaalit muuttuvat, näitä signaaleja soluun välittävät tekijät muuttuvat tai ne solunsisäiset säätelypiirit muuttuvat, jotka muuttavat signaalit toiminnaksi. Normaalikudoksissa eri solujen välillä esiintyy heterotyyppistä signalointia. Syöpäsoluilla taas on usein 11 kyky syntetisoida itse samoja kasvutekijöitä, joille solu on vastaanottavainen. Näin syntyy positiivinen takaisinkytkentä (autokriininen stimulaatio), jolloin solu ei enää tarvitse kudoksen muiden solujen tuottamia kasvutekijöitä. Esimerkkeinä tällaisista kasvutekijöistä voidaan mainita verihiutalekasvutekijä PDGF ja transformoiva kasvutekijä TGFα. Solun pintareseptorit välittävät kasvua stimuloivia signaaleja solun sisälle. Monet syöpäsolut ilmentävät reseptoreita liiallisesti normaalisoluihin verrattuina, jolloin kasvainsolut saattavat tuottaa hypervasteen normaaleillekin kasvusignaaleille. Reseptorit saattavat muuttua myös ligandista riippumattomiksi esimerkiksi mutaation tai rakennemuutoksen kautta, jolloin reseptori välittää signaalin, vaikka siihen ei olisi fysiologista tarvetta. Lisäksi syöpäsoluilla on havaittu muuttuneita reseptorikokoonpanoja, jotka suosivat kasvua edistäviä signaaleja välittäviä reseptoreita. Solupinnan reseptorit ovat usein kalvon lävistäviä tyrosiinikinaaseja, jotka välittävät kasvusignaaleja solunsisäisen osansa entsyymitoiminnan kautta. Esimerkkejä syövissä liiallisesti ilmennetyistä tai mutatoituneista reseptoreista ovat epidermaalisen kasvutekijän reseptorit EGF-R ja HER2/neu. Riippumattomuus kasvusignaaleista saattaa syntyä myös sellaisen solunsisäisen säätelypiirin häiriöstä, joka vastaanottaa kasvua edistävät signaalit ja prosessoi ne toiminnaksi. Esimerkiksi SOS-Ras-Raf-MAPK-kaskadi on erityisen tärkeä syöpien syntymekanismeissa. Viime aikoina yleistyneet genomiset tehoseulontatekniikat ovat osoittaneet ihmiskasvaimissa sellaisia mutaatioita, jotka todennäköisesti aktivoivat kasvutekijäreseptorien signalointipiirejä. Hanahan ja Weinberg olettavatkin, että kasvusignaalien reitit ovat itse asiassa häiriytyneet kaikissa ihmisen syövissä. Osa häiriöistä saattaa johtua myös signalointia vaimentavien negatiivisten takaisinkytkentämekanismien heikentymisestä (esimerkkeinä Ras-GTPaasin toiminnan väheneminen tai PTEN-fosfataasin ekspression väheneminen). Eri signaalikaskadit lisäksi yhdistyvät toisiinsa monimutkaisilla, ristiin vaikuttavilla yhteyksillä. Näin solun ulkopuolelta tulevat signaalit saattavat tuottaa monia sellulaarisia vaikutuksia. Tästä monimutkaisuudesta on kiinnostavana esimerkkinä mTOR-kinaasireitti, jota käsitellään jäljempänä esriinin yhteydessä tarkemmin. Hanahan ja Weinberg toteavat, että kun mTOR sijaitsee PI3K-reitillä sekä ylä- että alavirtaan, syöpähoitona tapahtuva mTOR:n farmakologinen inaktivoiminen rapamysiinillä estää kyllä PI3K-signalointia, mutta tähän liittyvä negatiivisen takaisinkytkennän häviäminen johtaakin PI3K:n lisääntyneeseen aktiivisuuteen, mikä estää hoidon vaikutusta. Vaikka tämä signaalireittien moninaisuuskin lisää kompleksisuutta, viime aikoina tutkimus on painottanut kasvainten mikroympäristöä ja myös kasvainta ympäröivien normaalisolujen vaikutusta kasvainsolujen kasvuun. Kasvusignaalit saattavat olla peräisin kasvainta ympäröivältä solukolta (parakriininen signalointi). Näin voidaan ajatella, että kasvainsolut ovat onnistuneet ottamaan ympäristön normaalit solut omaan käyttöönsä mukauttamalla ne kasvua edistävien signaalien vapauttamiseen. Itse asiassa myös tulehdussolut voivat edistää kasvaimen kasvupotentiaalia. Nämä mekanismit lisäävät syöpäsolujen riippumattomuutta kudoksen tavanomaisista säätelykeinoista. 12 1.1.2 Kasvua estävien signaalien välttäminen Kasvusignaalien lisäksi solujen lepotilaan ja kudoshomeostaasiin liittyvät kasvua estävät tekijät. Nämäkin voivat olla joko liukoisia tai liukenemattomia (esimerkiksi solunulkoisen väliaineen komponentteja tai solujen pintarakenteita). Kuten kasvusignaaleillekin, myös näille kasvua inhiboiville tekijöille on omat pintareseptorinsa ja niihin kytkeytyvät solunsisäiset signalointireitit. Kasvua inhiboivat signaalit vaikuttavat kahden eri mekanismin kautta. Solut voidaan joko pakottaa lisääntymissyklistä lepotilaan tai solut muutetaan pysyvästi postmitoottiseen tilaan, mihin usein liittyy solujen erilaistuminen. Normaalisolujen vaste kasvua estäville signaaleille liittyy erityisesti siihen, mitä solulle tapahtuu jakautumissyklinsä G1-vaiheessa. Tässä vaiheessa ympäristöstä saadut signaalit vaikuttavat siihen, etenevätkö solut lisääntymissykliin, jäävätkö ne lepotilaan vai etenevät postmitoottiseen tilaan. Molekyylitasolla tähän ilmiöön vaikuttavat keskeisesti retinoblastoomaproteiinit (pRb, p107 ja p130), jotka vaikuttavat transkriptiotekijöiden kautta solun etenemiseen solusyklin G1vaiheesta eteenpäin. Transformoiva kasvutekijä TGFβ on parhaiten tunnettu kasvua estävä liukoinen signaali, joka vaikuttaa pRb-reittiin. Syöpäsoluissa TGFβ-vaste saattaa muuttua esimerkiksi TGFβ-reseptorien vähenemisen tai mutatoitumisen kautta. Signaalia reseptorista eteenpäin välittävien solunsisäisten proteiinien toiminta saattaa myös muuttua tai puuttua kokonaan mutaatioiden vuoksi (esim. Smad4, CDK4). Myös itse retinoblastoomaproteiinin toiminta saatetaan menettää, joskus virusten onkoproteiinien kautta (ihmisen papilloomaviruksen E7-proteiini). Kasvainsoluissa integriinit ja muut solun adheesiomolekyylit muuttuvat siten, että niiden kasvua edistävät muodot vallitsevat. Oletettavasti tämäkin muutos vaikuttaa Rb-reitin kautta solusyklin etenemiseen. Soluviljelyssä on jo kauan on tunnettu kontakti-inhibition nimellä tunnettu ilmiö, jossa epiteelilähtöisten solujen väliset kontaktit estävät soluja lisääntymästä enempää. Kahden tuumorisuppressorigeenin tiedetään vaikuttavan ainakin osaksi solukontakteja voimistamalla. Esriinin läheisen sukulaisproteiinin merliinin yksi kasvua rajoittava ominaisuus voimistaa solujen välistä adheesiota E-kadheriinin kautta. Toinen kontakti-inhibitiossa vaikuttava kasvunrajoiteproteiini on LKB1. Kasvainsoluissa ominaisuus kuitenkin katoaa eikä kontakti-inhibitio enää vaikuta. Kasvainsolut pystyvät myös välttämään erilaistumisen ja postmitoottiset tilat. Tässä keskeinen tekijä on transkriptiotekijää koodaava c-myc-onkogeeni, jota ilmennetään kasvainsoluissa usein enemmän kuin normaalisoluissa. Tämä siirtää tasapainoa kasvun edistämiseen ja erilaistumisen vähenemiseen. Toinen esimerkki syöpämekanismista on APC/β-kateniini-reitin inaktivoituminen paksusuolen karsinogeneesin aikana, jolloin enterosyyttien eteneminen postmitoottiseen tilaan estyy. 13 1.1.3 Ohjelmoidun solukuoleman välttäminen Kudoshomeostaasiin ja syövän syntyyn vaikuttaa solujen lisääntymisen lisäksi myös solujen poistuma. Keskeinen mekanismi solujen hallitussa poistamisessa elimistöstä on apoptoosi (ohjelmoitu solukuolema), jota nykykäsityksen mukaan esiintyy latentissa muodossa kaikissa soluissa. Apoptoosin aktivoituessa solut hajotetaan tarkasti ajoitetuissa ja toisiaan seuraavissa vaiheissa niin, että elimistössä ei synny haitallisia reaktioita. Apoptoosin osatekijät voidaan jakaa kahteen luokkaan, sensoreihin ja efektoreihin. Sensorit seuraavat sekä solunulkoista että -sisäistä tilaa ja säätelevät sen mukaisesti efektorien toimintaa. Sensoreita ovat monet solupintareseptorit, jotka sitovat eloonjäämiseen tai apoptoosiin liittyviä tekijöitä (esimerkkeinä IGF1/IGF-2 ja vastaava reseptori tai FAS-ligandi ja vastaava reseptori). Solun sisällä on omat sensorit, jotka seuraavat esim. DNA-vaurioita tai signaloinnin epätasapainoa, hypoksiaa jne. Myös solujen vuorovaikutus solunulkoisen väliaineen ja muiden solujen kanssa vaikuttaa eloonjäämissignaaleihin. Signaalit muutetaan toiminnaksi mitokondrioissa Bcl-proteiiniperheen monimutkaisen säätelyn kautta. Tuumorisuppressoriproteiini p53 on tärkeä Bclperheen säätelijä, joka välittää tietoja DNA-vaurioista. Kun mitokondriot alkavat vapauttaa sytokromi c:tä, apoptoosin lopulliset efektorit eli kaspaasientsyymit aktivoituvat ja ohjelmoitu solukuolema lähtee toimintaan täsmällisessä järjestyksessä. Liiallisesti ilmennetty tai aktivoitunut onkogeeni (esimerkiksi myc) voi laukaista apoptoosin. Hanahan ja Weinberg esittävät, että apoptoosi saattaa itse asiassa olla ensisijainen keino aktivoituneita onkogeenejä kantavien solujen poistamiseen. Näin ollen apoptoottisen koneiston osien muuttuminen vaikuttaa huomattavasti kasvaimen kasvuun. Syöpäsolut ovat hyvin resistenttejä apoptoosille: esimerkiksi p53-proteiinin toiminnallinen inaktivoituminen havaitaan yli puolessa ihmisen syövistä, jolloin tärkeä DNA-vaurioita, hypoksiaa ja onkogeenien hyperekspressiota havaitseva komponentti puuttuu. Myös eloonjääntisignaaleja välittävä PI3-kinaasi-AKT-reitti vaikuttaa apoptoosin välttämiseen monissa kasvaimissa. 1.1.4 Kyky jakautua rajattomasti Hanahan ja Weinberg toteavat, että vaikka edellä olevat kolme ominaisuutta irrottavatkin solun kasvuohjelman ympäristöstä tulevista signaaleista, tämä ei vielä riitä makroskooppisten kasvainten syntymiseen. Nisäkässoluissa on sisäinen autonominen kontrolli, joka rajoittaa solujen kahdentumista. Useimmat normaalisolut kykenevät noin 60–70 jakautumiseen. Tämä kyllä riittäisi suurten kasvainmassojen syntymiseen, ellei niissä tapahtuisi koko ajan myös massiivista apoptoosia ja solujen poistumaa. Kromosomien päiden (telomeerien) etenevä lyheneminen jokaisen solusyklin aikana johtaa siihen, että kromosomien päitä ei enää voida suojata ja syntyy kromosomaalisia häiriöitä, jotka lopulta aiheuttavat solun kuoleman. 14 Lähes kaikissa pahanlaatuisissa soluissa telomeerit kuitenkin säilyvät ja solut pystyvät välttämään vanhenemisen ja muuttumaan immortaaleiksi. Tämä tapahtuu joko telomeraasientsyymiä yliekspressoimalla tai muulla mekanismilla. Näin normaalien solujen rajallinen replikaatiokyky muuttuu rajoittamattomaksi syöpäsoluissa. Rintasyövän kehittymisvaiheiden vertailevissa analyyseissä onkin havaittu telomeraasin vähittäistä aktivoitumista ja telomeerien pitenemistä. Viimeaikaisissa tutkimuksissa telomeraasilla on havaittu olevan myös muita funktioita, jotka saattavat liittyä solujen lisääntymiseen ja siten kasvainten syntyyn. 1.1.5 Verisuonten uudismuodostus Verisuoniston kuljettamat happi ja ravinteet ovat ratkaisevia solun toiminnalle ja eloonjäämiselle. Kun kudos muodostuu, uusien verisuonten kasvu on väliaikaista ja tarkkaan säänneltyä. Myös muodostuvat kasvaimet ovat riippuvaisia kapillaarisuonista, ja kasvainten onkin kehitettävä angiogeneesiä aikaansaava kyky kasvaakseen suuremmiksi. Toisiaan tasapainottavat positiiviset ja negatiiviset signaalit säätelevät verisuonten uudismuodostusta. Tärkeitä positiivisia mekanismeja ovat liukoiset tekijät ja niiden endoteelisoluissa sijaitsevat tyrosiinikinaasireseptorit (esim. VEGF ja FGF-1/2 ja niiden reseptorit). Estävistä tekijöistä tunnetuin on trombospondiini-1, jonka reseptori CD36 kytkeytyy Src-tyyppisiin kinaaseihin. Angiogeneesiä sääteleviä tekijöitä tunnetaan useita kymmeniä. Myös integriinien kautta tulevat signaalit vaikuttavat verisuonten uudismuodostukseen. Lepotilaisissa verisuonissa ilmennetään tiettyä integriiniryhmää ja kasvavissa verisuonissa toista. Soluadheesio ja siihen liittyvät solunulkoiset proteaasit vaikuttavat siis solujen angiogeneettiseen ohjelmointiin. Proteaasit voivat ohjata angiogeenisten aktivaattorien ja inhibiittorien biologista saatavuutta esimerkiksi vapauttamalla bFGF-kasvutekijää solunulkoisesta väliaineesta. Verisuonten uudismuodostuksen merkityksestä syövässä on olemassa paljon vakuuttavia hiirimalleja. Ne yhdessä eri vaiheen syöpien histologisten analyysien kanssa osoittavat, että angiogeneesin indusoituminen on useimmiten aikainen tapahtuma syövissä. Kyseessä on angiogeneesiä edistävien ja estävien tekijöiden tasapainon siirtyminen uudismuodostusta suosivaksi. Tämän prosessin tarkkoja mekanismeja ei vieläkään tunneta. Koska verisuonten uudismuodostus on ilmeisen houkutteleva kohde syöpähoidoille, ala on erittäin intensiivisen tutkimuksen kohteena. 1.1.6 Kyky tunkeutua kudokseen ja muodostaa etäpesäkkeitä Edellä olevat viisi syövän tunnusmerkkiä pätevät sekä hyvänlaatuisiin että pahanlaatuisiin kasvaimiin. Kyky irtautua kasvainmassasta, tunkeutua kudokseen ja edetä kaukaisiin paikkoihin ja alkaa siellä uusi kasvu on nimenomaan pahanlaatuiseen soluun liittyvä ominaisuus. Kudosinvaasio ja etäpesäkkeiden eli metastaasien muodostaminen ovat viimeisinä kehittyvät 15 syöpäsolun tunnusmerkit. Koska metastaasit aiheuttavat jopa 90 % ihmisen syöpäkuolemista, näiden ilmiöiden ymmärtäminen ja hoitaminen on keskeistä syöpäbiologiassa. Invaasio- ja metastaasiprosessit ovat mekanistisesti toisiinsa läheisesti liittyneitä. Solujen fysikaalinen kytkeytyminen mikroympäristöönsä muuttuu ja solunulkoiset proteaasit aktivoituvat. Solujen kiinnittymiseen liittyviä signaaleja välittävät integriinit ja erilaiset solu-solu-adheesion molekyylit muuttuvat. Tyypillinen invaasioon liittyvä muutos tapahtuu epiteelisolujen E-kadheriinissa, joka yhdistää soluja toisiinsa homotyyppisesti, mikä tuottaa normaalisoluissa kasvua estäviä signaaleja. E-kadheriini auttaa epiteelisolukerrosten muodostumista ja lepotilan ylläpitämistä epiteelisoluissa. Monissa epiteelisyövissä E-kadheriinin toiminta on hävinnyt eri mekanismien kautta. Ekadheriinia pidetään siten invaasiota ja metastaasia estävänä tekijänä. N-CAM-adheesiomolekyylin ilmentyminen syöpäsoluissa vähenee ja molekyyli myös muuttuu erittäin adhesiivisesta muodosta heikosti adhesiiviseen muotoon. Myös integriinien alayksiköissä tapahtuu siirtymiä. Integriinigeenien ja erilaisten heterodimeerien suuri määrä tuottaa valtavan monimuotoisuuden, jolloin tuloksena voi olla joko invaasiota estävä tai edistävä signaali. Karsinoomasoluissa integriinien ekspressio muuttuu invaasiota helpottavaan suuntaan. Yleinen kudosinvaasion ja metastaattisen kyvyn mekanismi käsittää solunulkoisia proteaaseja. Niiden ilmentyminen saattaa lisääntyä, niiden inhibiittorien ilmentyminen saattaa vähentyä tai niiden inaktiiviset tsymogeenimuodot saattavat aktivoitua. Näitä entsyymejä on solun pinnalla, integraalisina solukalvoproteiineina tai integriineihin liittyneenä. Myös kasvainta ympäröivät stroomasolut sekä tulehdussolut tuottavat solunulkoisia proteaaseja. Viime aikoina on tutkittu paljon solujen säätelyohjelmaa, jota kutsutaan epiteeli-mesenkyymi-muutokseksi (EMT). Epiteelisolut voivat saada kyvyn tunkeutua ympäröivään kudokseen muuttumalla mesenkymaalisten solujen suuntaan tiettyjen transkriptiotekijöiden toiminnan kautta. Tähän liittyy solujen vyöliitosten häviäminen, muutos kulmikkaista soluista sukkulamaisiksi, solujen väliainetta hajottavien entsyymien ilmentäminen, lisääntynyt liikkuvuus ja lisääntynyt vastustuskyky apoptoosille. EMT-ilmiön merkitys muissa syövissä kuin epiteelistä peräisin olevissa karsinoomissa on vielä epäselvä. Myös muita invaasiomuotoja on havaittu. Näissä solut etenevät kudoksiin joko suurempana massana (kollektiivinen invaasio) tai ameebamaisesti, jolloin yksittäinen solu ei niinkään etene mesenkymaalisesti ja entsyymitoiminnalla itselleen reittiä avaten, vaan ennemminkin yksittäin soluväliaineen läpi pujahtamalla. Kasvainsolut saattavat myös erittää kemoattraktantteja, jotka kutsuvat paikalle tulehdussoluja, jotka auttavat invaasioprosessissa. Itse etäpesäkkeen synty edellyttää mikrometastaasin syntymistä vieraassa ja yleensä kasvultaan normaalissa kudosympäristössä (kolonisaatio). Mikrometastaasit eivät aina kasva makroskooppisiksi kasvaimiksi tai kasvavat vasta primaarikasvaimen poistamisen jälkeen, joko heti tai vasta pitkän ajan kuluttua. Etäpesäkkeen syntyyn liittyykin monia kudoksen mikroympäristön tekijöitä, jotka vaikuttavat esimerkiksi invasoivien solujen ravinteiden saantiin, 16 uudisverisuonituksen aktivointiin tai soluväliaineen kasvua estäviin aineisiin jne. Tulehdussolut saattavat auttaa etäpesäkkeen synnylle sopivan ympäristön kehittymistä. Viime aikoina onkin määritetty geenien sarjoja (metastatic signatures), joiden ilmentyminen näyttää korreloivan makroskooppisten etäpesäkkeiden syntymiseen. Kasvainta ympäröivien stroomasolujen vaikutus on ilmeisesti erittäin suuri etäpesäkkeen kasvun sallivan mikroympäristön muodostumisessa. 1.1.7 Syövän syntyä edesauttavat tekijät Uudemmassa artikkelissaan Hanahan ja Weinberg käsittelevät myös syövän syntymistä edistäviä tekijöitä ja esittävät kaksi uutta esiin noussutta syöpäsolujen piirrettä. Solut muuttuvat syöpäsoluiksi eri kasvaintyypeissä erilaisten mekanismien kautta, ja muutokset tapahtuvat eri aikoina kasvaimen syntyprosessin aikana. Muutokset mahdollistaa perimän epävakauden kehittyminen. Tämä lisää harvinaisia geneettisiä tapahtumia, kuten mutaatioita ja kromosomien uudelleenjärjestäytymisiä. Spontaanien mutaatioiden määrät ovat tavallisesti erittäin pieniä, koska genomia ylläpitävä järjestelmä kykenee havaitsemaan virheet DNA:ssa ja korjaamaan ne. Syöpäsolussa tämä genomin eheyttä puolustava järjestelmä on häiriytynyt. Eri kasvaintyypeillä näyttää olevan niille ominaiset mutaatiomallit. Toinen kasvainten kehittymistä edistävä seikka on tulehdustila, johon vaikuttaa sekä synnynnäinen että hankinnainen immuniteetti. Tulehdus tuottaa kasvaimen ympäristöön kasvutekijöitä, solujen eloonjääntiin ja verisuonten uudismuodostukseen liittyviä tekijöitä sekä soluväliainetta muuttaviin entsyymeihin vaikuttavia tekijöitä. Lisäksi tulehdussolut vapauttavat mm. reaktiivisia happiyhdisteitä, jotka ovat sinänsä mutageenisiä. Esiin nousseena uutena syöpäsoluominaisuutena Hanahan ja Weinberg mainitsevat energiametabolian. Normaalisolut tuottavat energiaa tehokkaasti hapen läsnäollessa hajottamalla glukoosia mitokondrioissa tapahtuvassa sitruunahappokierrossa ja sitä seuraavassa oksidatiivisessa fosforylaatiossa. Kun happea ei riitä, käytetään anaerobista glykolyysiä, joka on aerobista energiantuotantoa tehottomampaa. Syöpäsolut voivat muuttaa energiantuotantoaan siten, että ne tuottavat aerobisissakin oloissa ATP:tä anaerobisella glykolyysillä, ja tämän tehottomuutta kompensoidaan esimerkiksi glukoosia kuljettavien proteiinien määrää lisäämällä. Monissa kasvainsoluissa esiintyy hapen niukkuutta (hypoksiaa), joka myös aikaansaa glukoosin kuljettajien ja glykolyysireitin entsyymien lisäävää säätelyä. Sekä Ras-onkoproteiinin että hypoksian tiedetään lisäävän tiettyjen HIF-transkriptiotekijöiden määriä, jotka puolestaan pystyvät lisäämään glykolyysiä. Energiantuotannon muuttumisen merkitys syöpäsoluille on epäselvä, mutta se voisi liittyä glykolyyttisten väliyhdisteiden tuottamiseen erilaisille biosynteesireiteille, jolloin uusien solujen muodostumisessa tarvittavia aineosia olisi saatavana. 17 Toinen esiin noussut uusi ominaispiirre on immuunipuolustuksen välttäminen. Immuunijärjestelmän on katsottu kykenevän puolustamaan elimistöä useimmilta syntyviltä mikrokasvaimilta; tämä pitää ilmeisesti paikkansa ainakin virusten aiheuttamissa kasvaimissa. Hyvinkin immunogeeniset syöpäsolut pystyvät välttymään immuunijärjestelmän aiheuttamalta tuholta erittämällä immunosuppressiivisia tekijöitä tai rekrytoimalla immunosuppressiivia tulehdussoluja. Viime aikoina syöpähoidon uudeksi kiinnostavaksi kohteeksi onkin tullut T-solujen koreseptori PD-1, jonka kautta kasvaimiin kohdistuvaa immuniteettia yritetään lisätä (esim. katsaus Topalian et al. 2012). 1.1.8 Kasvaimen mikroympäristö Kasvaimia ei enää ajatella suhteellisen homogeenisten syöpäsolujen kokoelmana, vaan ennemminkin monimutkaisena erilaisten solutyyppien verkostona. Esimerkiksi karsinoomissa epiteelisolut muodostavat parenkyymin, jota mesenkymaaliset solut ympäröivät. Syöpäsolut ovat kasvainten kasvun alkaessa suhteellisen homogeenisiä; myöhemmin kasvaimen kehittyessä ilmaantuu syöpäsolujen alapopulaatioiden erillisiä klooneja. Ihmiskasvaimet sisältävätkin histopatologisesti hyvin erilaisia alueita, jotka edustavat erilaisia erilaistumisen, lisääntymisen, verisuonituksen, tulehduksen ja kudokseen tunkeutumisen asteita. Viime vuosina on lisäksi havaittu, että kasvaimissa esiintyy syövän kantasoluja. Ne määritellään soluiksi, jotka kykenevät tehokkaasti kylvämään uusia kasvaimia, kun niitä siirretään vastaanottajakudoksiin. Tällaista kantasolumääritelmää tukee se, että syövän kantasolujen transkriptiomallit ovat osittain samanlaisia kuin normaalien kudosten kantasoluissa. Näyttää siltä, että esimerkiksi edellä mainittu epiteeli-mesenkyymi-muutos EMT saattaa indusoida syövän kantasolut jakautumaan. Tarkemmat tiedot syövän kantasolujen määrästä ja ominaisuuksista ovat puutteellisia, mutta näiden kantasolujen katsotaan kuitenkin olevan vastustuskykyisempiä tavallisesti käytettäville kemoterapeuttisille lääkeaineille. On mahdollista, että kantasolujen muovautuvuus edesauttaa heterogeenisen kasvainmassan syntymistä. Saman kasvaimen eri osista mikrodissektiotekniikan avulla saadut genomitiedot osoittavat, että kasvaimen sisällä on suurta heterogeenisyyttä myös perimän tasolla. Esriinistä on vuosien mittaan julkaistu mittava määrä tutkimusartikkeleita, ja monissa niistä on havaittu yhteyksiä syöpään tai onkogeenisiin proteiineihin. Näiden moninaisten artikkelien sisältämän tiedon jäsentämiseksi sovellan tässä Hahananin ja Weinbergin artikkeleita lähtökohtana, kun pohdin esriinin väitettyä osuutta syövän syntyyn. Miten solun tukirankaa ja solukalvoa yhdistävä pieni proteiini voi liittyä kasvaimiin ja etäpesäkkeisiin? 18 1.2 ESRIINI JA ERM-proteiinit Esriini (tunnetaan myös nimellä sytovilliini) löydettiin samoihin aikoihin kahdessa eri laboratoriossa. Suomalainen tutkijaryhmä tunnisti esriinin mikrovillusrakenteita värjäävän vasta-aineen antigeeninä (Suni et al. 1984). Sama proteiini oli tunnistettu tärkeäksi fosforyloituvaksi proteiiniksi, kun A431-soluja stimuloitiin epidermaalisella kasvutekijällä (EGF) (Hunter & Cooper 1981). Esriinistä on tämän jälkeen julkaistu satoja artikkeleita ja katsauksia, jotka käsittelevät sen rakennetta, toimintaa ja säätelyä. 1.2.1 Esriinin rakenne ja ERM-proteiiniperhe Esriini on esriini-radiksiini-moesiini (ERM) -proteiiniperheen ensimmäisenä kuvattu jäsen. Ihmisen esriinin, radiksiinin ja moesiinin aminohapposekvenssit ovat n. 73–81-prosenttisesti identtisiä (Turunen et al. 1998). Kaikilla ERMproteiineilla erotetaan kolme domeenia: noin 300 aminohapon N-terminaalinen domeeni, noin 190 aminohapon alfahelikaalinen keskidomeeni (α-domeeni) ja noin 100 aminohapon C-terminaalinen domeeni. ERM-proteiinien Nterminaalisen domeenin röntenkristallografiamenetelmällä saatuja atomisia rakenteita (kiderakenteita) on julkaistu yksin tai ligandin kanssa (Hamada et al. 2003; Smith et al. 2003; Edwards & Keep 2001; Hamada et al. 2000), ja myös moesiinin N- ja C-terminaalisten domeenien ei-kovalenttisen kompleksin rakenne on selvitetty (Pearson et al. 2000). Lopulta saatiin selville myös yhden hyönteislajin (Spodoptera frugiperda) kokonaisen ERM-proteiinin kiderakenne, jolloin voidaan paremmin arvioida alfahelikaalisen rakenteen vaikutusta molekyylin aktivoitumiseen (Li et al. 2007). Kaavamainen molekyylirakenne esitetään kuviossa 2. N-terminaalinen domeeni on samankaltainen kuin Band 4.1. -perheen proteiineilla, ja tämän domeenin nimeksi on vakiintunut FERM (four-point-one, ezrin, radixin, moesin) (Chishti et al 1998) tai N-ERMAD (N-terminaalinen ERMassosiaatiodomeeni, (Bretscher et al. 1995)). FERM-domeeni on hyvin yleinen domeenirakenne proteiineissa (ks. esim. Takeuchi et al. 1994). Kiderakenteiden perusteella on päätelty, että domeeni muodostaa apilanlehtimäisen, kolmelohkoisen rakenteen. Esriinin FERM-domeeni välittää sitoutumista solukalvolla oleviin reseptoreihin tai adaptoriproteiineihin, esimerkiksi solujen toisiinsa kiinnittymistä välittäviin ICAM-proteiineihin (Yonemura et al. 1998; Heiska et al. 1998; Serrador et al. 1997), hyaluronihappoa sitovaan CD44solupintareseptoriin (Tsukita et al. 1994), CD43-glykoproteiiniin (Serrador et al. 1998) ja NHERF-1/EBP50-adaptoriproteiiniin (Reczek et al. 1997). 19 KUVIO 2A Spodoptera frugiperdan moesiinin 3,0 Å:n kiderakenne (Li et al. 2007). Alfahelikaalinen rakenne esitetty keltaisena, FERM-domeeni sinisenä ja Cterminaalinen domeeni (C-ERMAD) punaisena. B. Kaavamainen kuva esriinimolekyylistä, sen tunnetuista fosforylaatiokohdista ja F-aktiinin sitoutumiskohdasta (mukaeltu julkaisusta Fehon 2010). P = fosforyloituva aminohappo. Alfahelikaalinen domeeni koostuu kolmesta pitkästä heliksistä. Hyönteisen moesiinin kiderakenne paljasti yllättäen, että alfahelikaalinen domeeni muodostaa paljon kontakteja FERM-domeenin kanssa ja peittää lepotilaisen molekyylin sitoutumiskohtia yhdessä C-terminaalisen domeenin kanssa. Kontaktipintojen aminohapot ovat erittäin konservoituneita. Alfahelikaalisen domeenin ja C-pään väliin jää lyhyt liitosalue, joka sisältää esriinissä ja radiksiinissa polyproliinisekvenssejä, jotka muodostavat klassisen tyypin II polyproliiniheliksin (Li et al. 2007, ks. myös kuvio 2A). C-terminaalinen domeeni (C-ERMAD eli C-terminaalinen ERMassosiaatiodomeeni (Bretscher et al. 1995)) on sitoutuneena FERM-domeeniin, silloin kun proteiini on epäaktiivinen, ts. kun molekyylin sisäinen laskostuminen peittää ligandien sitoutumiskohdat. N–C-sitoutumisen katsotaan siis pitävän ERM-proteiinin lepotilassa. C-ERMAD:ssa on solun ehkä tärkeää tukirankaproteiinia, aktiinia, sitova kohta (noin 30 viimeistä aminohappoa) (Gary & Bretscher 1995; Turunen et al. 1994). Kun esriini on aktiivisessa tilassaan, se on konformationaalisesti avoin ja yhdistää siten solukalvoproteiineja solun tukirankaan. ERM-proteiinit ovat rakenteellisesti hyvin samankaltaisia keskenään. Esriini poikkeaa muista ERM-proteiineista erityisesti tiettyjen tyrosiinien suhteen, joita ei esiinny muissa perheen proteiineissa. Nämä tyrosiinit ovat solujen signaalijärjestelmän kannalta mielenkiintoisia, koska tyrosiinifosforylaatio on yksi tärkeimmistä solujen keinoista tuottaa ja välittää signaaleja. Vasta-aineiden ristireagointi haittaa varsinkin alkuaikojen ERMproteiinitutkimusten arviointia. Myös solun signaalijärjestelmiä käsittelevissä tutkimuksissa tämä on pulma, koska spesifisiksi ajatellut, fosfoproteiineja tunnistavat vasta-aineet saattavat hyvinkin tunnistaa myös muita proteiiniperheen jäseniä. ERM-proteiinit ovat myös molekyylimassaltaan melko 20 samankokoisia ja ajautuvat elektroforeettisesti lähellä toisiaan, mikä saattaa osaltaan vaikeuttaa eri artikkeleissa esitettyjen tulosten tulkintaa. 1.2.2 Esriinin ekspressio soluissa ja kudoksissa Esriini on solunsisäinen proteiini, jota useimmiten havaitaan kortikaalisella alueella. Esriiniä esiintyy aktiivisissa solukalvon osissa, kuten mikrovilluksissa, filopodioissa ja kalvon poimuissa. Esriiniä saattaa esiintyä myös solu-solukontakteissa, lymfosyyttien uropodirakenteissa tai hermosolujen kasvualueilla; toisaalta esriini voi lokalisoitua myös diffuusisti koko solun alueelle (omat havainnot). Joissakin julkaisuissa esriiniä on osoitettu myös tumassa. Tumalokalisaatio liittyy TNF-α-stimulaatioon, joka saa esriinin siirtymään tumaan ja repressoimaan sykliini A:n ilmentymistä sen promoottorialueeseen sitoutumalla (Kishore et al. 2005b). Myös osteosarkoomasoluissa on nähty fosforyloituneiden muotojen tumalokalisaatiota (Di Cristofano et al. 2010). Eläimissä esriiniä ilmennetään erityisesti epiteelisoluissa ja imukudoksen soluissa. Toisaalta lähes kaikissa in vitro viljellyissä soluissa esiintyy vastaaineilla tunnistettavia määriä esriiniä, joskin määrä saattaa olla vähäinen (prof. Carpén, julkaisematon tieto). Esriinin läsnäolo ei siis häiritse solujen elinkykyä ainakaan viljelyolosuhteissa. Viljellyillä soluilla tehtyjen tutkimusten tuloksia tulkittaessa on muistettava, että useimmiten näissä soluissa on myös endogeenistä esriiniä soluun vietyjen kokeellisten konstruktien lisäksi. Tämän lisäksi solut saattavat ilmentää myös jotain toista ERM-proteiinia. Poistogeenisen hiiren solut tai poistogeenisiksi käsitellyt viljelmäsolut ovat ainoita tutkimuksissa käytettyjä soluja, joissa ei esiinny endogeenistä esriiniä. Kudostasolla esriiniä esiintyy maha-suolikanavan epiteelisoluissa kaikissa ihmisen kehitysvaiheissa, erityisesti suolinukan sukasauma-alueella. Lisäksi esriiniä havaitaan munuaisten, pernan, imusolmukkeiden ja kerrostuneen levyepiteelin kaikkien kehitysvaiheiden aikana sekä lisämunuaisten tietyillä alueilla (Xie et al. 2011b). Esriinin ekspressio on sekä ajallisesti että paikallisesti tarkkaan säädeltyä. Poistogeenisillä hiirillä tehdyissä tutkimuksissa havaittiin, että esriini on välttämätön maha-suolikanavan epiteelin järjestäytymisessä ja suolinukan kehittymisessä (Saotome et al. 2004). Vaikka poistogeeniset hiiret syntyvätkin, esriinin puuttuminen johtaa poikasten kuolemaan ennen vieroitusta. Esriinin puuttuminen aiheuttaa myös silmän verkkokalvon mikrovillusten vähenemistä ja valoreseptorien kehittymisen hidastumista (Bonilha et al. 2006). Esriinin toiminta näyttää siten liittyvän erityisesti solukalvorakenteiden organisointiin. Kun esriini poistetaan indusoitavan poistogeenin menetelmällä aikuisen hiiren suolen epiteelistä, suolen apikaalinen rakenne rikkoutuu ja villusmuodostus häiriytyy. Esriini vaikuttaa siten myös kypsän suolen homeostaasiin (Casaletto et al. 2011). Eri ERM-proteiinien ilmentymisestä eri kudoksissa ei ole julkaistu kattavaa vertailevaa tutkimusta. Pääpiirteittäin eri ERM-proteiinit esiintyvät eri kudoksissa. Esriiniä esiintyy epiteelisolujen apikaalisissa nukkalisäkkeissä, kun taas moesiinia havaitaan pääasiassa endoteelisoluissa (Berryman et al. 1993; Schwartz-Albiez et al. 1995). Radiksiinia on erityisesti maksasoluissa (Amieva et 21 al. 1994). Vaikka esriiniä ilmennetään runsaasti imukudoksen prekursorisoluissa, poistogeenisellä hiirellä lymfoidikudoksen esriini on kuitenkin korvattavissa, nähtävästi moesiinin kautta (Shaffer et al. 2010). Ilmeisesti ERM-proteiinit voivat omaksua ainakin jonkin verran toistensa tehtäviä (Kitajiri et al. 2004). Drosophilassa on vain yksi ERM-homologi, Dmoesin, jonka puuttuminen johtaa kehityksen ja morfologian häiriöihin (Jankovics et al. 2002; Polesello et al. 2002). 1.2.3 Esriinin säätely Koska ERM-molekyylit voivat siis olla konformaatioltaan aktiivisessa tai inaktiivisessa tilassa suhteessa ligandeihinsa, proteiinien funktionaalinen säätely on erityisesti kiinnostanut tutkijoita. Proteiinin vaihteleva sijainti sytosolissa (hyvin konsentroitunut vs. diffuusi, mahdollinen tumalokalisaatio) viittaa siihen, että esriinin kulloisetkin sitoutumiskumppanit ja/tai konformaatio vaikuttavat esriinin sijaintiin ja sitä kautta toimintaan. Lisäksi jo esriinin varhaisissa biokemiallisissa karakterisoinneissa havaittiin myös dimeerisiä ja oligomeerisiä muotoja proteiinista, joita esiintyi myös in vivo (Bretscher et al. 1995; Berryman et al. 1995). Näiden muotojen merkitys ja säätely on edelleen epäselvä (ks. yksi mahdollinen malli eri muodoista, kuvio 3). Fluoresenssiresonanssienergiatekniikalla on kuitenkin havaittu, että mahalaukun parietaalisoluissa esriinin oligomeerinen muoto solukalvolla edustaa lepäävää, inaktiivista proteiinia (Zhu et al. 2005). Myös ERM-proteiinien välinen heterodimerisaatio voidaan osoittaa viljellyistä soluista erilaisilla affiniteettisaostustekniikoilla, mutta tämän merkitys saattaa olla todellisuudessa pieni, koska luonnossa ERM-proteiineja ilmennetään lähinnä eri solutyypeissä ainakin normaalikudoksissa. Adheesio‐ molekyyli Solukalvo ERM‐proteiini ERM‐domeenit F‐aktiini KUVIO 3. FERM‐domeeni a ‐helik. domeeni C‐term. domeeni F‐aktiinia sitova kohta Malleja ERM-proteiinin sitoutumisesta itseensä ja F-aktiiniin (Turunen et al. 1998). A. Proteiinin monomeeri (konformationaalisesti suljettu). B. Vastakkaissuuntainen dimeeri, jonka F-aktiinin sitoutumiskohta on peittynyt. C. Samansuuntainen dimeeri solukalvolla. D. Pää-häntä-oligomeeri solukalvolla. Dkohdassa ajatellaan myös N-terminaalisen kohdan sitovan aktiinia. Mallit ovat edelleen osittain hypoteettisia. 22 Molekyylin konformationaaliseen aktivoitumiseen vaikuttavat sekä treoniinifosforylaatio että fosfolipidi PI(4,5)P2:n sitoutuminen. Koko ERMperheessä konservoitunut treoniini 5671 sijaitsee C-ERMAD-domeenissa, ja sen fosforyloitumisen katsotaan johtavan N- ja C-domeenien dissosioitumiseen toisistaan. Toisaalta myös PI(4,5)P2:n sitoutuminen FERM-domeenin lohkojen väliin saattaa tuottaa vähäisiä konformaation muutoksia, jotka myötävaikuttavat molekyylin avautumiseen. Näiden tapahtumien keskinäinen järjestys ja merkitys on ollut intensiivisen tutkimuksen kohteena, mutta on jäänyt osittain avoimeksi kysymykseksi (Yonemura et al. 2002; Fievet et al. 2004; Carvalho et al. 2010; Bosk et al. 2011). Täyteen aktivoitumiseen tarvitaan luultavasti useita aktivoivia tapahtumia, koska eri säätelykohtien ja sitoutumiskohtien paljastuminen edellyttää suurta konformaatiomuutosta. Kiderakenteen perusteella myös alfahelikaaliseen domeeniin sitoutuvien proteiinien sitoutuminen edellyttää peittyneiden hydrofobisten aminohappotähteiden paljastumista (Li et al. 2007). Toisaalta kokeellisesti nämä proteiinit kykenevät sitoutumaan täysipitkään esriiniin, jonka on katsottu olevan konformationaalisesti epäaktiivinen, joten molekyylin aktivoitumista ei ehkä tarvita ennen sitoutumista (Dransfield et al. 1997; Chirivino et al. 2011). Esriinin lokalisaatio solukalvolla ei näytä myöskään edellyttävän treoniinin 567:n fosforyloitumista, mutta jos treoniinin dynaaminen fosforylaatio-defosforylaatio estetään, tuloksena on poikkeavia membraanirakenteita (Zhu et al. 2008). Esriinin ja ERM-proteiinien on osoitettu sijaitsevan aktiinitukirankaa säätelevän Rho-proteiiniperheen reitillä sekä ylä- että alavirtaan. ERM-proteiinit toimivat Rho-proteiinin aktiinitukirankavaikutusten efektorina (Mackay et al. 1997), ja Rho-kinaasi fosforyloi ERM-proteiinien/esriinin konformaation avaavan (aktivoivan) treoniinitähteen (Matsui et al. 1998; Tran Quang 2000). Tästä on julkaistu myös poikkeava tutkimustulos, jonka mukaan Rho-kinaasi ei kuitenkaan suoraan fosforyloi ERM-proteiineja in vivo, vaan kyseinen kinaasi on PI4P5K-kinaasi (Matsui et al. 1999). Myös PI(4,5)P2 on Rho-proteiinien efektori, joten esriinin avautuminen ja aktivoituminen liittyy läheisesti Rho-signaalireitteihin. PI(4,5)P2-reitteihin liittyy myös PKC-kinaasi, jonka eri muotojen on myös osoitettu fosforyloivan ERM-molekyylien aktivoivaa treoniinia (Pietromonaco et al. 1998; Ng et al. 2001; Wald et al. 2008). Esriini havaittiin ensimmäiseksi A431-soluissa tyrosiinifosforyloituvana proteiinina EGF-stimulaation jälkeen (Hunter & Cooper 1981). Tämän fosforylaation kohteena ovat tyrosiinit 145 ja 353. Tyr145 sijaitsee FERM-domeenissa, ja tähde on konservoitunut kaikissa ERM-proteiineissa ja lisäksi joissakin muissa tämän domeenin omaavissa proteiineissa. Näiden muiden proteiinien vastaavasta tyrosiinifosforylaatiosta ei ole kuitenkaan julkaistu raportteja. Tyr353 on sen sijaan ainoastaan esriinissä esiintyvä aminohappotähde. Se sijaitsee alfahelikaalisessa domeenissa, ja on mahdollista, että fosforyloituminen vapauttaisi alfahelikaalisen domeenin FERM:stä ja osallistuisi siten esriinin konformatio1 Tässä julkaisussa esriinin aminohapposekvenssin numeroinnissa noudatetaan perinteistä julkaisun (Krieg and Hunter, 1992) mukaista numerointia, jossa ensimmäistä (pois pilkottavaa) metioniinia ei lasketa mukaan. 23 naaliseen avautumiseen (Li et al. 2007). Tästä ei ole kuitenkaan julkaistu mitään kokeellisia tutkimuksia. Omissa tutkimuksissamme havaitsimme onkogeenisen Src-kinaasin fosforyloivan tyrosiinia 477 (Heiska & Carpén 2005). Tyr477 esiintyy yksinomaan esriinissä, sen liitosalueella, heti polyproliinipitoisen alueen jälkeen. Tämä sijainti on hyvin mielenkiintoinen fosforylaatiotapahtuman kannalta, sillä hyönteismoesiinin kiderakenteen perusteella tämä aminohappotähde kyettäisiin fosforyloimaan molekyylin ollessa suljetussa konformaatiossa, jolloin esriini pystyisi inaktiivisessakin muodossa rekrytoimaan signaalinvälitykseen liittyviä molekyylejä fosforyloituneen Tyr477:n kautta (esim. Fes-kinaasi, ks. julkaisu Naba et al. 2008). Esriini on myös kalpaiiniproteaasin tunnettu substraatti (Yao et al. 1993; Shcherbina et al. 1999). Kalpaiinin kautta tapahtuva säädelty pilkkominen voisi olla yksi tapa esriinin toimintojen säätelyyn. Esriinin treoniini 567:n kohdalta eifosforyloitunut muoto näyttäisi olevan alttiimpi kalpaiinin aiheuttamalle pilkkoutumiselle, ja myös PI(4,5)P2:n sitoutuminen vähensi pilkkoutumista (McRobert 2012). Nämä havainnot viittaisivat siihen, että konformationaalisesti suljettu (inaktiivinen) proteiinimuoto olisi kalpaiinisäätelyn pääasiallinen kohde. Itse havaitsin tutkimuksissani, että tyrosiinifosforylaatio lisää esriinin kalpaiiniproteolyysiä (julkaisematon havainto). 1.2.4 Esriini ja merliini Neurofibromatoosi 2 (NF2) on kromosomissa 22 periytyvä harvinainen sairaus. Mutaatiot NF2-geenissä johtavat ääreishermoston hyvänlaatuisiin kasvaimiin, useimmiten molemminpuoliseen kuulohermon schwannoomaan, joka voi johtaa kuulon menetykseen. Kun sairauden aiheuttava geeni tunnistettiin (Trofatter et al. 1993; Rouleau et al. 1993), geenin koodaaman tuumorisuppressorin homologia ERM-proteiineihin herätti suurta kiinnostusta, koska tämän ajateltiin helpottavan kasvaimen muodostumismekanismin ymmärtämistä. Lisäksi NF2-geeni olisi kasvunrajoitegeeniksi poikkeuksellinen, jos se todella koodaisi solukalvoa ja tukirankaa yhdistävää proteiinia. NF2-proteiinin nimeksi annettiin merliini (moesin-esrin-radixin-like protein, tunnetaan myös nimellä schwannomin). Merliinin suurin rakenteellinen homologia ERM-proteiinien kanssa sijaitsee FERM-domeenissa (n. 60-prosenttisesti homologinen ihmisen esriinin kanssa). Merliinin FERM-domeeni sitoutuu moniin samoihin proteiineihin kuin ERMproteiinien vastaava domeeni (esim. NHERF-1 ja CD44). Merliinin on myös osoitettu sitovan F-aktiinia. Vaikka merliini saattaa toimia solukalvon ja tukirangan välissä muiden ERM-proteiinien tapaan, merliinillä on myös useita muita toimintoja, jotka voivat suoremmin liittyä sen tuumorisuppressorikykyyn. Näitä ovat esim. solu-soluadheesioon, solusykliin tai kasvutekijäreseptorien internalisaatioon liittyvät toiminnot. Kasvaimissa esiintyvät pistemutaatiot esiintyvät hyvin laajalti koko geenissä, ja useat niistä johtavat typistyneeseen proteiiniin. Merliini pystyy kokeellisesti sitoutumaan ERM-proteiineihin, mutta tämä ei ehkä ole fysiologisesti merkityksellistä kuin poikkeustapauksissa, koska 24 proteiineja ilmennetään harvoin samoissa soluissa, ainakaan stoikiometrisesti samoja määriä (Turunen et al. 1994; Bretscher 2000; McClatchey 2003). 1.3 Esriini ja syöpä Esriinin esiintymistä erilaisissa kasvaimissa on tutkittu kiihtyvällä tahdilla. Esriiniproteiinin ilmentymistä on kuvattu perinteisillä immunohistokemiallisilla menetelmillä patologisista näytteistä, ja viime aikoina on otettu entistä enemmän käyttöön myös mikrosirumenetelmiä. Lähes kaikissa julkaisuissa on havaittu jonkinlainen korrelaatio esriinin lisääntyvän ilmentymisen ja kasvainmuodostuksen tai -asteen välillä, ja vakuuttavia tuloksia on esitetty esriinin ekspression yhteyksistä nimenomaan loppuvaiheen kasvaimiin ja erityisesti metastaaseihin. Koska metastaasit aiheuttavat suurimman osan ihmisen syöpäkuolemista, tähän alueeseen kohdistuu erityistä kiinnostusta. Luonnollisesti myös läheisen sukulaisproteiinin, merliinin, toiminta tuumorisuppressorina herättää kysymyksiä siitä, miten esriini voi liittyä pahanlaatuisten kasvainten muodostumiseen. Seuraavan sivun taulukossa 1 esitetään otos julkaisuista, jotka käsittelevät esriiniä ihmisen kasvaimissa. Merkillepantavaa on, että esriini näyttäisi liittyvän sekä sarkoomiin että karsinoomiin. Suurin osa julkaisuista koskee erilaisia karsinoomia. Esriinin esiintyminen erityisesti osteosarkoomassa ja sen metastaasissa on osoitettu vakuuttavasti useassa julkaisussa. 25 TAULUKKO 1 Julkaisuja kasvaimissa tai etäpesäkkeissä. Kasvaintyyppi >5000erilaista ihmisensyöpää astrosytooma astrosytooma,oligo‐ astrosytooma ei‐pienisoluinen keuhkokarsinooma GIST hepatosellulaarinen karsinooma hepatosellulaarinen karsinooma ihomelanooma kapillaarinen hemangioblastooma keuhkosyöpä kohdunkaulansyöpä kolorektaali‐ karsinooma kolorektaalisyöpä kondrosarkooma mahakarsinooma mahasyöpä,metastaasit jamyöhäisasteet nenänielukarsinooma osteosarkooma osteosarkooman metastaasi pehmytkudos‐ sarkooma pehmytkudos‐ sarkooma päänjakaulanalueen karsinooma rhabdomyosarkooma rintasyöpävs.effuusiot rintasyöpävs.imu‐ solmukemetastaasit rintasyöpä,invasiivinen rintasyöpä,paikallisesti laajallelevinnyt ruokatorvenlevy‐ epiteelikarsinooma seroosimunasarja‐ karsinooma uveamelanooma esriinin esiintymisestä erilaisissa ihmisen Esriininosuus esriininekspressiosuurempisarkoomissakuinkarsinoomissa; selväassosiaatiosarkoomieneteneväänasteeseenjarintasyövänhuonoonhoitotulokseen(kudossiruanalyysi) lisääntynytekspressiokorreloiastrosyyttistenkasvainten lisääntyväänmaligniteettiin immunovärjäysjaimmunopositiivistensolujenmääräkorreloi lisääntyväänmaligniteettiin(kudossiruanalyysi) lisääntynytekspressiokorreloikasvaimenasteenkanssaja merkitsevästiimusolmukemetastaasinkanssa huonoonennusteeseenliittyvätekijä ekspressioliittyyinvaasioonjadedifferentaatioon Viite maksasyöpänäytteidenmassaspektrometrisetanalyysit, Thr567:nhyperfosforylaatiokorreloiläheisestiinvasiivisen fenotyypinjahuononennusteenkanssa immunovärjäyksenintensiteettikorreloikasvaimen paksuuteenjakasvaimeninvaasiotasoon ekspressoituudiffuusististroomasolujensytoplasmassa Chen2011 ekspressiolisääntyysyövässäjalokalisaatiomuuttuusyto‐ plasmiseksi;ekspressiosuurempiprimaarikasvaimeninvasiivisessaetureunassajasuurinimusuonistonetäpesäkkeissä lisääntynytekspressio,merkitsevästi imusolmukemetastaasissa prognostinenmerkkiaine,korreloikasvaimenaggressiivisuudenjaheikonennusteenkanssa(kudossiruanalyysi) tyypillisestisytoplasminenvärjäytyminensyöpäepiteelissä, huonoeloonjääntiennuste ekspressionjakasvaimenasteenvälilläpositiivinenkorrelaatio ekspressioliittyymahakarsinoomanesiintymiseenja progressioon merkitsevästilisääntynytekspressio,korreloihuonon ennusteenkanssa expressioriippumatonprognostinentekijäheikolleennusteelle merkitseväassosiaatiosuurenekspressiotasonjahuonon ennusteenvälilläosteosarkooma‐lapsipotilailla;meta‐ analyysissäesriininvoimakasekspressioliittyyalhaiseen kokonaiselonjääntiin esriininThr‐fosforylaatiodynaamisestisäädeltyäerilaisten metastaasivaiheidenaikana(immunohistokemiallinenvärjäys) positiivinenimmunoreaktiivisuuskorreloilyhyempään eloonjääntiin;ekspressiokorreloimerkitsevästimetastaasiin ekspressioennustaapaikallistenuusiutumienjametastaasien kehittymistä(kudossiruanalyysi) sytoplasminenesriinikorreloihuonoonennusteeseen Li2012 ekspressiokorreloikliinisenvaiheenetenemisenkanssa ekspressiomerkitsevästisuurempieffuusioissa(siruanalyysi) Yu2004 Konstantinovsky 2010 Li2008 ekspressiolisääntynytrintasyövässä,erityisestiimusolmuke‐ metastaaseissa,joissalokalisaatiomuuttunutsytoplasmiseksi muutosesriininlokalisaatiossaapikaalisestasytoplasmiseksi liittyyheikkoonennusteeseen isokokoistenrintasyöpienesriinivoimakkaastisytoplasminen; tämäliittyymyöspositiiviseenimusolmukestatukseen korreloihuonoonennusteeseen Bruce2007 Geiger2000 Tynninen2004 Zhang2012 Wei2009 Yeh2009 Ilmonen2005 Böhling1996 Tan2011 Patara2011 Elzagheid2008 Söderström2010 Zhao2011 Jin2012 Wang2011 Khanna2004,Lun 2014 Ren2009 Weng2005 Carneiro2011 Schlecht2012 Sarrio2006 Arslan2012 Xie2011 esriininkatoaminenliittyyheikkoonennusteeseen Moilanen2003 esriinivärjäytyvyyskorreloisuurempaanmortaliteettiin Mäkitie2001 26 Tässä luvussa käsittelen esriiniä koskevia tutkimustuloksia Hanahanin ja Weinbergin esittelemien syövän tunnusmerkkien kannalta. Koska solujen signalointijärjestelmät ovat niin monimutkaisia ja moniin suuntiin risteäviä, monet tutkimukset voitaisiin sijoittaa useankin tunnusmerkin alle. 1.3.1 Esriini ja syövän tunnusmerkit: riippumattomuus kasvusignaaleista Kasvainsolut eivät tarvitse normaaleja ulkoisia signaaleja jakautumiseen ja solunsisäiset signaalireitit ovat muuntuneita. Monet kasvutekijäreitit liittyvät esriiniin. Koska esriini tunnistettiin tyrosiinifosforyloituvana proteiinina EGFkasvutekijästimulaation jälkeen, on ilmeistä, että esriini on jollakin reitillä, jota pitkin EGF vaikuttaa solun toimintaan ja lopulta jakautumiseen. Myös maksasolujen kasvutekijä (HGF) välittää esriinin fosforylaatiota, ja esriinin osoitettiin olevan HGF-reseptori-tyrosiinikinaasin (c-Met) suora substraatti (Crepaldi et al. 1997). Lisäksi verihiutalekasvutekijä PDGF:n aiheuttaman solunsisäisen signaalin etenemiseen tarvitaan esriiniä (Sperka et al. 2011). Koska useimmiten ainakin osa solun sisältämästä esriinistä lokalisoituu solun kortikaaliselle alueelle ja voi sitoa hyvin erilaisia molekyylejä, esriini voi välittää signaaleja solun kalvoreseptoreilta solun sisälle ja aktiinitukirankaan ja muodostaa signaalinvälitykseen tarvittavan molekyylikompleksin. Tästä esimerkkinä on SOS-Ras-Raf-MAPK-kaskadi, joka on ehkä parhaiten karakterisoitu signaalivälitysreitti kasvutekijöistä tumaan. Esimerkiksi EGF, PDGF, HGF ja TNFα aktivoivat tämän kaskadin. Kaskadin keskeisen proteiinin, pienen Gproteiini Ras:n, aktivaatioon tarvitaan SOS-katalysaattoria. Tämän lisäksi kasvutekijän indusoimaan Ras-aktivaatioon tarvitaan esriiniä, joka tuo yhteenreseptorin koreseptoreineen, Sos- ja Ras-signaalimolekyylit sekä Faktiinin. Esriinin tiedetään sitovan sekä Ras- että SOS-proteiinia, ja Ras-proteiinin suora interaktio esriinin kanssa on välttämätöntä Ras-aktivaatiolle (Sperka et al. 2011). Aiemmassa julkaisussa osoitettiin toisaalta, että merliinin tuumorisuppressoritoiminnalle keskeistä on nimenomaan Ras-signaalin estäminen. Tämä ei kuitenkaan tapahdu Ras- tai SOS-proteiiniin sitoutumalla, vaan ERM-proteiineja estämällä (Morrison et al. 2007). Tämä on yksi harvoista julkaisuista, joissa on osoitettu merliinin ja esriinin samanaikaiset vastakkaiset toiminnot solussa. Esriinin on osoitettu liittyvän samantyyppisen proteiinikompleksin muodostumiseen myös HGF-kasvutekijän signaloinnissa. Esriini sitoutuu CD44hyaluronaanireseptorin sytoplasmiseen osaan (Yonemura et al. 1998; Legg et al. 2002). CD44v6-isoformi toimii HGF-reseptorin koreseptorina, ja signaalin eteenpäinvientiin tarvitaan sekä CD44-reseptoria, Ras-aktivaatiota, esriinin sitoutumista että F-aktiinia. ERM-proteiini on Ras-aktivaation edellytys (OrianRousseau et al. 2007). Näin esriini on keskeinen tekijä, joka yhdistää solun kiinnittymiseen ja solujen jakautumiseen liittyvät solunulkoiset signaalit solunsisäisiin signaali- ja tukirankajärjestelmiin. Näillä signaalireiteillä esriinistä alaspäin sijaitsevia molekyylejä saattaa olla erilaisia mm. kudos- ja solutyypistä riippuen. Yksi HGF-stimulaation esriinistä 27 riippuvainen efektoriproteiini on tyrosiinikinaasi Fes, joka sitoutuu tyrosiinista 477 fosforyloituneeseen esriiniin. Sitoutumisen seurauksena Fes sekä siirtyy solukalvolle että aktivoituu. Fes on kinaasi, joka säätelee solujen kiinnittymistä toisiin soluihin ja soluväliaineeseen. Esriinin ja Fes-kinaasin interaktio on välttämätön solun leviämiselle ja HGF:n aikaansaamalle solujen levittäytymiselle (scattering) kollageenimatriksilla (Naba et al. 2008). Jo aiemmin oli osoitettu HGF:n aiheuttaman esriinin fosforylaation vaikutus polarisoituneiden epiteelisolujen migraatioon ja tubulogeneesiin (Crepaldi et al. 1997). HGF-reseptorin (c-Met) ja esriinin välillä löytyi mielenkiintoinen yhteys, kun havaittiin, että esriini ubikitinyloituu WWP1-ubikitiiniligaasin kautta, jonka määrä lisääntyy rinta- ja eturauhassyövissä. Esriinin ubikitinylaatio ei kuitenkaan johda normaalilla tavalla ubikitinyloidun proteiinin hajottamiseen, vaan itse asiassa HGF-reseptorin ekspressio ja vaste HGF-stimulaatiolle lisääntyvät esriinin kautta. Tähän tarvitaan esriinimolekyylin liitosalueen PPVY477-motiivia, johon WWP1 sitoutuu (Zaarour et al. 2012). Näin esriinillä on siis säätelevä vaikutus HGF-reitin ylävirran signalointiin. WWP1:llä on aiemmin osoitettu olevan samanlainen vaikutus EGFR- ja ErbB2-reseptoreihin (Chen et al. 2008). Monien eri solukalvoreseptorien signalointiin liittyy solunsisäinen tyrosiinikinaasi Src. Tutkimusryhmämme havaitsi Src-perheen lymfosyyttispesifisen Lck-kinaasin fosforyloivan esriiniä T-soluissa (Autero et al. 2003). Tämän jälkeen tutkimusta jatkettiin alustaan kiinnittyvissä soluissa, ja havaitsimme Src:n fosforyloivan esriiniä tyrosiinista 477 (Heiska et al. 2005). Myös tyrosiini 145 on osoitettu Src-kinaasin kohteeksi eri solutyypissä (Srivastava et al. 2005). Tyr477 esiintyy ainoastaan esriinissä, kun taas Tyr145 sisältyy useisiin FERM-domeeneja sisältäviin proteiineihin. Tyr477:n fosforyloituminen on todettu jo useammassa tutkimuksessa (Naba et al. 2008; Mak et al. 2012; Zaarour et al. 2012). Merkitys saattaa olla otaksuttua tärkeämpikin, sillä monissa aiemmissa julkaisuissa käytetty, fosfotyrosiinille 145 spesifiseksi ajateltu vasta-aine ristireagoi fosfotyrosiini Y477:n kanssa (julkaisematon havainto). Src-kinaasi oli ensimmäinen löydetty onkogeeni, ja se on liitetty erityisesti metastaaseihin (Irby & Yeatman 2000; Frame 2002). Src:n on osoitettu aktivoituvan esimerkiksi EGFR-, p185HER2/neu- ja HGFR-reittien kautta erittäin metastaattisissa koolonkarsinoomasoluissa (Mao et al. 1997). Src-perheen kinaasit paitsi fosforyloivat esriiniä, myös sitoutuvat siihen SH2-domeeninsa kautta (Naba et al. 2008; Srivastava et al. 2005). Näin esriini voi tuoda myös aktiivisen tyrosiinikinaasin muodostamiensa proteiinikompleksien osaksi ja yhdistää kompleksin F-aktiinitukirankaan. Esriinin itsensä fosforyloituminen Src:n kautta taas vaikuttaa solujen proliferaatioon 3D-kollageenilla sekä solujen leviämiseen ja fokaaliadheesioiden muodostumiseen fibronektiinillä (Srivastava et al. 2005). Aktiivinen Src ja esriini vaikuttavat yhdessä hiiren mammakarsinoomasolujen solu-solu-kontaktien heikkenemiseen ja solujen hajaantumiseen (Elliott et al. 2004). Itse havaitsimme, että esriinin Tyr477:n fosforyloitumista tarvitaan, jotta solut kasvavat kudosolosuhteita muistuttavissa 3D-viljelyolosuhteissa tai alustaan kiinnittymättöminä (Matrigel-geeli, soft agar tai suspensioviljely) (I). 28 Signaali esriinistä alavirtaan näytti menevän mTOR-proteiinireitin kautta, jota käsitellään tarkemmin tuonnempana apoptoosin yhteydessä. Äskettäisessä julkaisussa saatiin samantyyppiset tulokset Tyr477fosforylaation merkityksestä, kun hiiren mammakarsinoomasoluja kasvatettiin 3D-olosuhteissa. Lisäksi esriinin Tyr477-fosforylaation osoitettiin säätelevän solujen metastaattista ja invasiivista potentiaalia ja etäpesäkkeiden muodostumista keuhkoihin in vivo hiiren ortotooppisessa kasvainsolujen transplantaatiomallissa (Mak et al. 2012). Tämä on merkittävä osoitus yhden ainoan aminohapon merkityksestä keskeisillä signaalireiteillä. On huomattava, että Src-kinaasi välittää signaaleja paitsi kasvutekijäreseptoreista, myös integriineistä (osittain fokaaliadheesiokinaasin FAK kautta). Src-kinaasista signaali lähtee alavirtaan Ras-reitin lisäksi myös PI3K-reitille, jota käsitellään tarkemmin apoptoosin yhteydessä. Kuviossa 4 esitetään pääpiirteet esriinin toiminnoista, kun solu muuttuu normaaleista kasvusignaaleista riippumattomaksi. KUVIO 4 Esriini ja kasvusignaalit. Esriini muodostaa molekyylikomplekseja, joiden kautta Ras-MAPK-reitin signaalit etenevät tumaan. Toisaalta esriini vaikuttaa suoraan solujen kiinnittymiseen ja leviämiseen sekä HGF-reitin reseptorikinaasi c-Metin ekspressioon. 29 1.3.2 Esriini ja syövän tunnusmerkit: kasvua estävien signaalien välttäminen Esriini kytkeytyy solusykliin tai solujen erilaistumiseen TGFβ-pRb-reitin kautta. Kasvunrajoiteproteiini pRb on keskeinen tekijä, joka kontrolloi solun etenemistä solusyklissä. Jos kasvaimiin viedään aktiivista retinoblastoomaproteiinia, solut siirtyvät senesenssitilaan eli poistuvat solusyklistä. Yksittäisessä julkaisussa osoitettiin, että esriinin ilmentyminen lisääntyy retinoblastoomaproteiinin aiheuttaman senesenssin aikana. Samalla CDK5-kinaasi katalysoi esriinin fosforylaatiota, mikä aiheuttaa solumuodon muutoksia esriinin lokalisaatiomuutoksen kautta. Esriinin ajatellaan siten vaikuttavan pRb:n tuumorisuppressoritoiminnassa nimenomaan tukiranka- ja adheesiovaikutustensa kautta (Yang & Hinds 2006). Vaikutus olisi siis kasvainten synnylle vastakkainen. Senesenssiin liittyviä esriinijulkaisuja on kuitenkin hyvin vähän, eikä artikkelin esittämän fosforyloituvan treoniinin (235) säätelystä ole julkaistu muita tutkimuksia. Kasvainsolut pystyvät ohittamaan pRb:n solusyklikontrollin, mutta myös erilaistumisen. Tässä olennainen tekijä on transkriptiotekijä c-myc, joka on mutatoitunut monissa syövissä, mikä johtaa sen konstitutiiviseen aktiivisuuteen. c-myc-geenin mutaatio liittyy esimerkiksi eturauhassyövän metastaasiin. Esriiniä ilmennetään eturauhasen epiteelisoluissa androgeenihormonien vaikutuksesta, ja PKCα- ja Src-kinaasi aktivoivat ja fosforyloivat esriinin (Chuan et al. 2006). Esriinin ilmentymistä välittää c-myc:n sitoutuminen esriinin promoottoriin, ja ilmentyminen on välttämätöntä solujen c-myc-riippuvaiselle invaasiokyvylle. Toisaalta esriinillä osoitettiin olevan c-myc:n proteiinimääriä lisäävä vaikutus (Chuan et al. 2010). Tässä yhteydessä on kiinnostavaa, että myös estrogeenihormonin on osoitettu lisäävän esriinin ilmentymistä, ja esriinin määrä korreloi munasarjasyöpäsolujen invaasiokykyvyn kanssa (Song et al. 2005). Tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan tutkittu, mitkä transkriptiotekijät tähän liittyvät. Solujen differentaatioon ja proliferaatioon ja siten solusykliin liittyviä transkriptiotekijöitä ovat c-mycin lisäksi mm. Six-1 ja AP-1. Rhabdomyosarkoomasoluissa Six-1 säätelee suoraan esriinin ilmentymistä, joka on välttämätön solujen metastaasikyvylle (Yu et al. 2006). AP-1:n taas on osoitettu säätelevän esriinin ekspressiota keuhkosyöpäsoluissa (Gao et al. 2009). Kuten Hanahan ja Weinberg totesivat, tuumorisuppressori merliini vaikuttaa solujen kontakti-inhibitioon E-kadheriinia säätelemällä. Myös esriinin ja E-kadheriinin suhteesta on ilmestynyt useita julkaisuja. Esriinin konformaatioltaan konstitutiivisesti avoin muoto vähentää E-kadheriinin määrää solukalvolla, E-kadheriinia kertyy solun sisään ja solu-solukontaktit heikkenevät. Tämä vaikutus johtuu Rac1-proteiinin aktivoitumisesta (Pujuguet et al. 2003). Myös Src-kinaasin aktivoituminen aiheuttaa E-kadheriinin internalisaatiota (Avizienyte et al. 2002). Esriini ja Src yhdessä heikentävät E-kadheriinista riippuvaisia solu-solukontakteja hiiren mammakarsinoomasoluissa (Elliott et al. 2004). Voimakkaasti metastaattisissa rintasyöpäsoluissa esriiniproteiinin määrä on lisääntynyt ja E-kadheriinin vähentynyt, ja esriini on siirtynyt solukalvolta 30 sytoplasmaan. Esriinin vaimentaminen shRNA:lla vähentää solujen migrointia ja invaasiota, lisää E-kadheriinin ilmentymistä ja vähentää β-kateniinin fosforylaatiota, mahdollisesti Src-kinaasin kautta (Li et al. 2008). Lisäksi julkaisussa osoitetaan, että rintasyövän imusolmukemetastaaseissa E-kadheriinin ilmentyminen vähenee, esriinin ilmentyminen lisääntyy ja molemmat siirtyvät solukalvolta sytoplasmaan. Sama tutkimusryhmä sai äskettäin samankaltaisia tuloksia keuhkosyöpäsoluilla ja osoitti lisäksi, että E-kadheriinin ja β-kateniinin määrä ei muutu mRNA-tasolla, vaan muutos liittyy posttranskriptionaaliseen säätelyyn (Li et al. 2012). Näin esriini liittyisi solujen kasvua estäviin signaaleihin sekä solusyklisäätelyyn että kontakti-inhibitioon osallistumalla. Kaavakuva esriinin merkityksestä kasvua estävissä signaaleissa esitetään kuviossa 5. KUVIO 5 Esriini ja kasvua estävät signaalit. Esriini on mukana niin solujen erilaistumisen, solusyklin kuin solu-solukontaktien säätelyssä. Retinoblastoomaproteiinin aiheuttamassa senesenssissä CDK5 fosforyloi esriinin, mikä vaikuttaa solun morfologian muutoksiin (yläosa). Solusyklin keskeinen transkriptiotekijä cmyc lisää esriinin ilmentymistä, mikä johtaa positiiviseen takaisinkytkentään (keskellä). c-myc-aktivoituu mm. MAPK-reitin kautta, vrt. kuvio 4. Toisaalta esriini vaikuttaa solu-solukontakteihin E-kadheriinin kautta (vasemmalla). 31 1.3.3 Esriini ja syövän tunnusmerkit: ohjelmoidun solukuoleman välttäminen Hanahan ja Weinberg totesivat, että apoptoosi saattaa olla tärkein keino aktiivisia onkogeenejä ilmentävien solujen poistamiseen. Esriinin on osoitettu olevan Fasvälitteisen apoptoosin negatiivinen säätelijä T-lymfosyyteissä (Parlato et al. 2000; Kuo et al. 2010). Toisaalta esriini yhdistettiin jo toistakymmentä vuotta sitten solujen eloonjäämissignaaleihin liittyvään PI3K-Akt-reittiin, joka suojaa kasvainsoluja apoptoosilta. Esriini sitoutuu PI3-kinaasin säätelevään alayksikköön (p85). Sitoutumiseen tarvitaan esriinin tyrosiini 353:n fosforyloitumista, mutta myös esriinin FERM-domeenia. Jos tyrosiini mutatoidaan, PI3-kinaasireitin keskeinen kohde, proteiinikinaasi Akt, ei voi aktivoitua (Gautreau et al. 2003). Tämä signaalireitti voi välittää signaaleja suoraan EGF-reseptoreista, koska EGF:n tiedetään aikaansaavan Tyr353:n fosforylaation. PI3K on soluissa hyvin tärkeä tekijä, koska se aktivoituu sekä kasvutekijä- että adheesioreseptorien stimuloinnin kautta. Myös Src-proteiinin tiedetään aktivoivan PI3-kinaasia. Esriini on välttämätön metastaasille hiiren osteosarkoomamallissa. Esriinin ekspressio antaa keuhkoihin eteneville soluille eloonjäämisedun. Jos esriinin ilmentyminen estetään, Akt:n fosforylaatio eli aktiivisuus vähenee. Esriinivälitteiset varhaiset metastaasit eivät kuitenkaan ole Akt:sta riippuvaisia (Khanna et al. 2004). Myöhemmin sama tutkimusryhmä osoitti signaalin etenevän mTOR/S6K1/4E-BP1-reittiä pitkin alavirtaan. mTOR-reitin estäminen rapamysiinillä in vivo sekä pidentää hiirten eloonjääntiä että estää esriiniriippuvaista metastaasia merkitsevästi. Esriinin estäminen (antisensekonstruktin, siRNA-konstruktin tai T567A-mutanttikonstruktin avulla) vaikuttaa sekä S6K1:n ja 4E-BP1:n määrää että niiden fosforyloitumista vähentävästi (Wan et al. 2005). Lisäksi Akt/mTOR-signaalireitin merkitys on osoitettu Ewingin sarkoomasoluissa. Esriini ilmentyy niissä voimakkaasti, mutta Thr567Amutantin ilmentäminen hidastaa solujen kasvua. Tämä johtuu lisääntyneestä apoptoosista ja estää myös kokeellisten metastaasien syntyä in vivo. Vaikutus välittyy Akt/mTOR-reitin kautta (Krishnan et al. 2006). Myös rinta- ja eturauhassoluissa on osoitettu, että esriinin vaimentaminen vähentää Akt:n aktiivisuutta ja solujen invasiivisuutta (Sizemore et al. 2007). Apoptoosimekanismien efektoreja ovat Bcl-proteiiniperheen jäsenet, joita säädellään monimutkaisen mekanismin kautta. Olli Carpénin tutkimusryhmä havaitsi positiivisen korrelaation esriinin ekspression ja antiapoptoottisen Bcl-2:n välillä kondrosarkoomissa (Söderström 2010). Maligneissa ihmisen glioomasoluissa esriinin estäminen ei muuta Akt:n fosforylaatiota, mutta vähentää Bcl2:n ilmentymistä ja pidentää hiirten eloonjäämistä ksenograftimallissa. Bcl-2:n määrän väheneminen ei kuitenkaan vaikuttanut solujen apoptoosiherkkyyteen (Wick et al. 2001). Ras-MAPKja P13K-mTOR-signaalinvälitysreitit ovat keskenään monimutkaisesti ristiinkytkettyjä. Niissä esiintyy sekä keskinäistä kompensointia että reitinsisäistä ja reittienvälistä takaisinkytkentää (ks. katsausartikkeli (Mendoza 2011). Eri julkaisuissa saattaakin esiintyä esriinin suhteen keskenään ristiriitaisia tai vaikeasti kokonaiskuvaan sopivia tuloksia, jotka liittyvät eri 32 reiteille kuuluvien molekyylien mukanaoloon. Varmaa kuitenkin on, että esriinin on osoitettu kytkeytyvän kummankin reitin hyvin karakterisoituihin proteiineihin ja signaalinvälitykseen, vaikka näiden keskinäisiä suhteita ei luultavasti koskaan voida yksiselitteisesti osoittaa mm. kudoserojen vuoksi. Kuviossa 6 esitetään kaavamaisesti, mitä esriinin ja apoptoosin yhteyksistä tällä hetkellä tiedetään. KUVIO 6 Esriini ja apoptoosin välttäminen. Esriinin tyrosiinin 353 fosforyloituessa (vasemmalla) esriini voi sitoutua PI3K-kinaasiin. Tämä aktivoituu ja fosforyloi solun eloonjäämisen keskeisen säätelijän, Akt:n. Useat ristikkäiset reitit johtavat solujen proliferaatioon ja toisaalta syöpäsolujen invaasioon ja metastaasiin. Jos esriiniä estetään kokeellisesti (punainen katkoviiva), mTOR-reitin signaali estyy. Esriini vaikuttaa myös antiapoptoottiseen Bcl-proteiiniin (yläosa). 1.3.4 Esriini ja syövän tunnusmerkit: kyky jakautua rajattomasti ja verisuonten uudismuodostus Esriinin yhteydestä solujen rajattomaan jakautumiseen on hyvin vähän evidenssiä. Esriinin ja telomeraasin suhteista ei ole yhtään julkaisua. Joidenkin tietojen mukaan esriiniä esiintyy myös tumassa, mutta tämän merkityksestä tai tumamuodon toiminnoista on vähän tietoa. Tumalokalisaatiota esiintyy kaikilla ERM-proteiineilla, ja sitä säädellään solutiheyden mukaan (Batchelor et al. 2004). Esriinin tumalokalisaatio on osoitettu myös osteosarkoomapotilaiden kasvainnäytteistä. Näissä tumaan keskittyi erityisesti Tyr353- ja Thr567-fosforyloituneita muotoja (Di Cristofano et al. 2010). On tosin epävarmaa, voidaanko fosforylaatio 33 todella osoittaa tällä resoluutiolla immunokemiallisilla menetelmillä parafiiniin valetuista potilasnäytteistä. Verisuonten uudismuodostuksessa merkitystä voisi olettaa olevan lähinnä moesiinilla, jota ilmennetään endoteelisoluissa, kun taas esriiniä ilmennetään normaalioloissa epiteelissä (Berryman et al. 1993). Joitakin esriiniin liittyviä julkaisuja on kuitenkin ilmestynyt. Tuumorinekroositekijä-alfa (TNFα) on keskeinen tekijä sekä endoteelisolujen proliferaatiossa että angiogeneesissä. Tekijä vaikuttaa solysyklin säätelijäproteiinia sykliini A:ta vaimentamalla. Yksittäisessä julkaisussa osoitettiin, että TNFα indusoi esriinin siirtymistä tumaan ja sitoutumista sykliini A:n promoottorin repressorielementteihin. Jos esriinin toiminta estetään hiiren iskemiamallissa in vivo, tämä lisää endoteelisolujen proliferaatiota ja verisuonten uudismuodostumista (Kishore et al. 2005a). Tämän julkaisun mukaan esriinillä on siis lähinnä antiproliferatiivinen eikä niinkään syövän kehittymistä edesauttava vaikutus. VEGF-kasvutekijän indusoimassa angiogeneesissä osoitettiin kalpaiinin aktivaatio ja kalpaiinin ja esriinin nopeasti tapahtuva kolokalisaatio solukalvolle. Kun esriini sammutettiin RNAi-menetelmällä, VEGF:n vaikutukset vähenivät. Tämä välittyi ilmeisesti AMPK/AKT/eNOS-reitin kautta (Youn et al. 2009). VEGFR-2:n kautta tapahtuva signaalinvälitys on yhdistetty jo aiemmin kasvutekijäsignaloinnin kohdalla mainittuun CD44v6-solukalvoproteiiniin, joka toimii endoteelisoluissa paitsi HGFR:n, myös VEGFR-2:n koreseptorina. Molempien välittämä signaali edellyttää esriinin sitoutumista CD44:n solunsisäiseen osaan ja CD44v6:n kytkeytymistä solutukirankaan. Näin esriinin muodostama proteiinikompleksi osallistuu endoteelisolujen migraatioon, versomiseen ja tubulusmuodostukseen (Tremmel et al. 2009). 1.3.5 Esriini ja syövän tunnusmerkit: kyky tunkeutua kudokseen ja muodostaa etäpesäkkeitä Esriini on liitetty useissa julkaisuissa toisaalta solujen migraatioon ja invaasiokykyyn, toisaalta kasvainten etäpesäkkeisiin (ks. taulukko 1) tai kokeellisiin metastaaseihin. Koemalleina ovat olleet esim. osteosarkooman keuhkometastaasi koirilla (Khanna et al. 2004), levyepiteelikarsinoomasolujen luumetastaasi hiirillä (Deng et al. 2007), mammakarsinoomasolujen erilaiset metastaasit hiirillä (Elliott et al. 2005), hepatokarsinoomasolujen metastaasinodulit hiirillä (Chen et al. 2011), Ewingin sarkooman keuhkometastaasi hiiren häntäinjektiosta (Krishnan et al. 2006) sekä mammakarsinoomasolujen lokaalinen invaasio ja metastaasi hiirillä (Mak et al. 2012). Etäpesäkkeen syntyyn liittyy monia erilaisia vaiheita, joihin metastaattinen proteiini voi vaikuttaa. Solujen irtautuminen ja liikkuminen primaarikasvaimesta, tunkeutuminen veri- tai imuteihin (intravasaatio), siirtyminen uuteen ympäristöön ja edelleen uuteen kudokseen (ekstravasaatio), sopeutuminen vieraaseen kasvupaikkaan ja uuden kasvun aloittaminen (kolonisaatio) edellyttävät soluilta monia erilaisia ominaisuuksia. Metastaasi on erittäin tehoton prosessi. Arvioidaan, että alle 0,01 % verenkiertoon päätyvistä syöpäsoluista lopulta muodostaa metastaaseja (Chambers et al. 2002). Etäpesäkkeen muodostumisen nopeutta rajoittavana 34 vaiheena ovat mikrometastaasin muodostuminen ja (vielä tätäkin enemmän) makrometastaattinen kolonisaatio. Etäpesäkkeet saattavatkin kehittyä makroskooppisiksi vasta vuosia primaarikasvaimen poisleikkauksen jälkeen. Silti etäpesäkkeet muodostavat ylivoimaisesti suurimman osan syöpäkuolleisuudesta. Koska esriini on liitetty voimakkaasti nimenomaan tähän syövän tunnusmerkkiin, joka on myös syöpähoitojen kannalta erittäin ratkaiseva, käsittelen etäpesäkkeen syntymisen eri vaiheita toisaalta yleisesti, toisaalta esriiniin liittyen. Tämä metastaasin eri vaiheiden jaottelu on osittain keinotekoinen, ja monet esriinitutkimuksista käsittelevätkin yhtä aikaa useita etäpesäkkeisiin liittyviä ilmiöitä. 1.3.5.1 Metastaattisen solun irtautuminen primaarikasvaimesta ja tunkeutuminen kudokseen Jopa aggressiivisten primaarikasvainten sisällä on suhteellisen vähän liikkuvia soluja. Silti kasvaimesta voi vapautua verenkiertoon miljoonia soluja vuorokaudessa (ks. esim. katsausjulkaisu Sahai 2007). Solun irtautumiseen primaarikasvaimesta vaikuttavat kasvaimiin usein liittyvät makrofaagit, jotka tuottavat soluja houkuttelevien molekyylien gradientteja, esim. EGF-gradientteja. EGF-reseptoreja yliekspressoivat solut ovat liikkuvampia kuin kontrollisolut, ja lisäksi tämä korreloi lisääntyneeseen metastaattiseen potentiaaliin (Xue et al. 2006). Primaarikasvaimesta irtoamisessa ja kudokseen tunkeutumisessa adheesioon ja liikkuvuuteen liittyvien reittien merkitys on luonnollisesti suuri. Invasoivien syöpäsolujen on havaittu käyttävän ainakin kolmea erilaista liikkumistapaa: liikkumista solujoukkona, liikkumista yksittäisinä fibroblastoidityyppisinä soluina tai liikkumista pyöreänä, yksittäisenä soluna ameebamaisesti (ks. esim. katsaukset Sahai 2007; Alexander & Friedl 2012). Solut kykenevät myös muuttamaan liikkumismuotoa, jos esimerkiksi proteaasiaktiivisuus estetään. Yksittäisissä julkaisuissa esriinin on osoitettu liittyvän kaikkiin näihin syöpäsolujen liikkumistapoihin. Invaasioprosessiin liittyvää solujen liikkumista ja muotoa säätelevät mm. Rho-perheen pienet G-proteiinit (Rho-, Rac- ja Cdc42-alaperheet) aktiinitukirangan kautta. Näiden G-proteiinien säätelyyn liittyy monimutkainen inhibitoristen ja aktivoivien tekijöiden joukko. Rho-GDP-dissosiaatiotekijä (Rho GDI) muodostaa kompleksin Rho-proteiinien inaktiivisen, GDP-nukleotidiin sitoutuneen muodon kanssa, jolloin Rho:ta aktivoivat tekijät eivät pysty aktivoimaan Rho-proteiinia. ERM-proteiinien FERM-domeenin on osoitettu sitoutuvan RhoGDI-proteiiniin, jolloin sen inhibitorinen vaikutus Rho-proteiiniin nähden loppuu ja Rho-reitti aktivoituu (Takahashi et al. 1997). Myös Rac1proteiinin esriinivälitteinen aktivaatio on osoitettu (Pujuguet et al. 2003, ks. edellä luku 3.2). Koska Rho-kinaasi näyttää suoraan fosforyloivan esiiniä (ks. luku 2.3), esriini toisaalta säätelee Rho-perheen signaalireittiä, toisaalta on sen kohteena omassa aktivoitumisessaan. Syöpäsolujen liikkuessa kollektiivisena ryhmänä solut ovat toisiinsa kiinnittyneitä ja niillä on monisoluinen polariteetti ja kolmiuloitteiset fokaaliadheesiot soluja ympäröivään väliaineeseen. Hidasta kollektiivista 35 invaasiota, jota patologit havaisevat syöpänäytteistä, ei ole helppoa havaita esim. intravitaalimikroskopialla, koska kuvantamista pitäisi tehdä pitkiä aikoja (Sahai 2007). Solujen liikkumista kollektiivisena massana on tutkittu soluviljelmässä erilaistuneilla hepatosyyteillä. TGFβ-stimulaation on havaittu aikaansaavan muutoksen niiden integriineissä (α5β1-integriini alkaa ilmentyä solukalvolla) ja kiinnittymisessä (solut alkavat myös syntetisoida fibronektiiniä, joka on α5β1integriinin ligandi). Solut irtoavat viljelyalustasta lähes kokonaan ja muodostavat tiiviin pallon, mutta ajan kuluessa solut leviävät ja kiinnittyvät uudelleen. Solut liikkuvat n. 20–30 solun joukkiona siten, että joukon kärjestä työntyvät reitinetsintäsolut, jotka määräävät liikkeelle jatkuvan ja selvän suunnan. Esriini on polarisoitunut solukalvon ulokkeisiin, jotka ovat liikkeeseen nähden edessä. Tämä esriinin polarisaatio korreloi Rac1:n aktiivisuuteen (Binamé et al. 2008). Liikkuvuuteen ja invaasioon liittyy epiteeli-mesenkyymimuutos EMT, jossa epiteliaaliset solut muuttuvat mesenkymaaliseen suuntaan, jolloin epiteelisolujen polariteetti häviää ja solut muuttuvat sukkulamaisiksi ja erittäin liikkuviksi (ns. fibroblastoidi liikkuvuus). Liikkumiseen vaikuttavat väliainetta hajottavat aktiiviset proteaasit, joiden avulla solut pääsevät vapaammin etenemään soluväliaineessa. EMT:tä välittävät ainakin useat Ras-kinaasista lähtevät signaalireitit. Esriinistä on yksi julkaisu, jossa esriini liitetään EMT:hen, jota mitattiin maksasoluista lähinnä mikrovillusten esiintymisen perusteella. MAPkinaasin inhibiittorit vähentävät esriiniproteiinin määrää, mutta samaa muutosta ei esiinny RNA-tasolla. Koska esriini liittyy yleisesti mikrovillusrakenteiden organisoitumiseen, esriinin häviäminen epiteelisolujen mikrovillusrakenteiden vähentyessä ei sinänsä ole yllätys. Julkaisussa osoitetaan, että yksi EMT:hen liittyvä mekanismi on esriiniproteiinin MAP-kinaasin kautta välittyvän fosforylaation häviäminen (Lan et al. 2006). Solujen on havaittu etenevän kudoksissa myös ameebamaisella tavalla, jolloin solut eivät käytä etenemiseen proteaasien apua, vaan pujahtavat yksittäin soluväliaineen läpi. Tämä ilmiö ei ole kovin hyvin tunnettu. Nämä solut liikkuvat erittäin nopeasti kollageenisäikeitä pitkin eivätkä muodosta klassisia fokaaliadheesioita, joiden kypsyminen vie minuutteja. Soluilla ei myöskään ole stabiilia polariteettia. Rho-kinaasit ovat keskeisiä ameebamaisessa liikkeessä in vivo. Esriini lokalisoituu ameebamaisella tavalla liikkuvissa soluissa voimakkaasti liikkeen suuntaan, ja liike estyy esriiniä tai Rho-signaalireittiä estämällä (Sahai & Marshall 2003). Toisen tutkimuksen mukaan esriiniä tarvitaan melanoomasolujen ameebamaiseen invaasioon, mutta esriini konsentroituu näissä soluissa liikkuvan solun takaosan uropodirakenteeseen (Lorentzen et al. 2011). Kuviossa 7 esitetään yhteenveto syöpäsolujen erilaisista invaasiotavoista ja esriinin osuudesta niissä. 36 KUVIO 7 Esriini ja kyky tunkeutua kudokseen. Alaosan inserttineliö kuvaa solutason tapahtumia. Metastaattiseen invaasioon liittyvinä tutkimusmenetelminä on käytetty solujen jakamista kolmiulotteisiin väliaineisiin, joiden on katsottu jäljittelevän kudosolosuhteita paremmin kuin solujen kasvatus normaaleilla kaksiulotteisilla viljelyalustoilla (ks. esim. epiteelisoluista Schmeichel & Bissel 2003; Debnath & Brugge 2005). Näissä julkaisuissa esille tulleet esriinin kanssa vuorovaikutuksessa olevat proteiinit ovat paljolti samoja kuin edellisissä kappaleissa esitellyt. Esimerkiksi rintasyöpäsoluissa on osoitettu, että estrogeeni aiheuttaa esriinin aktivoitumisen (Thr567-fosforylaatio) ja lisää solujen horisontaalista migrointia ja invaasiota kolmiulotteisissa viljelymatrikseissa. Tämä voidaan estää esriinispesifisellä siRNA-menetelmällä (Zheng et al. 2011). Esriinistä riippuvainen syöpäsolujen invaasiokyky Matrigel-soluväliaineessa on osoitettu julkaisussa I sekä julkaisuissa Elliott et al. 2005; Chuan et al. 2010; Chen et al. 2011; ja Mak et al. 2012. Adheesioon ja liikkuvuuteen liittyvien geenien merkitys metastaasissa havaittiin tutkimuksessa, jossa verrattiin rintakarsinoomia ja niiden effuusioita (nestepurkautumia) geeniekspressioanalyysillä. Effuusioiden esiintyminen liittyy potilaan nopeaan kuolemaan. Esriinin ilmentymisen havaittiin lisääntyvän effuusioissa merkitsevästi primaarikasvaimiin verrattuna (Konstantinovsky et al. 2010). Kiinnostavasti mTOR-reitin inhibitorinen tekijä TSC1 (tuumorisuppressoriproteiini hamartiini) vastaavasti vähenee. Aiemmin on osoitettu, että esriini ja muut ERM-proteiinit sitoutuvat tähän tuumorisuppressoriin (Lamb et 37 al. 2000). Tämä sitoutuminen tarvitaan Rhon aktivoitumiseen ja fokaaliadheesioiden muodostumiseen. Konstantinovskyn artikkelissa todetaan, että esriinin lisääntynyt ilmentyminen effuusioissa on myös yhteydessä lyhyempään taudittomaan elinaikaan, mutta tuloksia ei esitetä. Effuusioihin liittyy myös p130Cas-proteiinia ilmentävän BARC1-geenin aktivoituminen. Sama tutkimusryhmä julkaisi myöhemmin kiinnostavia tuloksia erittäin metastaattisesta rintasyöpälinjasta, joka pystyy muodostamaan Matrigelmatriksissa invasiivisia kolonioita, jotka lähettävät matriksiin satelliittikolonioita. Samoissa viljelyoloissa ei-metastaattiset rintakudossolut organisoituvat normaalia kudosrakennetta muistuttavaksi rauhasrakkularakenteeksi. Esriinin ilmentyminen lisääntyy metastaattisessa linjassa viljelyn kuluessa, kun taas Ekadheriinia esiintyy vain organisoituneissa soluissa. Metastaattisten solujen invasiivista kykyä voidaan vähentää sammuttamalla p130Cas- ja esriiniproteiinin ekspressio. Esriinin vähentäminen ei kuitenkaan yksistään riittänyt siihen, että rakenteet muuttuisivat takaisin organisoituneiksi (Konstantinovsky et al. 2012). Samantyyppisiä invasiivisia kolonioita muodostuu voimakkaasti metastaattisista hiiren mammakarsinoomasolulinjoista. Y477F-esriinikonstruktin yliekspressoiminen (esriinin kokonaismäärä soluissa n. kolminkertainen) estää kolonioiden invaasion matriksiin ja hidastaa migraatiota. Nämä solut eivät myöskään kykene tunkeutumaan ympäröivään stroomaan ja kudokseen in vivo, kun soluja ruiskutetaan hiiren mammakudokseen, toisin kuin villityyppistä esriiniä normaalimäärässä ilmentävät solut. Tämä mutaatio vähentää myös keuhkometastaasien määrää, mutta ei vaikuta primaarikasvaimen kasvuun (Mak et al. 2012). Monissa syövissä esriinin lokalisaation havaitaan muuttuvan apikaalisesta diffuusiksi ja sytoplasmiseksi (esimerkiksi keuhkosyöpä, invasiivinen rintasyöpä sekä pään ja kaulan alueen syövät, Li et al. 2012, Sarrio et al. 2006, Schlecht et al. 2012). Tämä muutos voi korreloida myös huonoon ennusteeseen. Esriinin epätyypillistä sytoplasmista lokalisaatiota voidaan jopa pitää isokokoisen, paikallisesti edenneen rintasyövän (LABC) markkerina (Arslan 2012). Toisaalta esriinin määrä lisääntyy yksittäisissä invasiivisissa syöpäsoluissa, syövän invasiivisessa reunassa ja etäpesäkkeissä, ja lokalisaatio voi jälleen muuttua takaisin solukalvolle (Li et al. 2012, Elgazheid et al. 2008). Näiden lokalisaatiomuutosten mekanismin tunteminen olisi tärkeää esriinin syöpäkytkennän ymmärtämiseksi. Sytoplasminen esriini todennäköisesti helpottaa syöpäsolun irtautumista ympäristöstään ja mahdollisesti myös liikkumista. Invasiivisessa reunassa esriiniä tarvitaan jälleen aktiinitukirangan ja solukalvon kytkemiseen, kun invasoivat solut etsivät ja avaavat reittiä eteenpäin. Kuten aiemmin todettiin, esriini vaikuttaa esimerkiksi adhesiivisen E-kadheriinin määrään solukalvolla ja β-kateniinin fosforylaatioon Src-kinaasin kautta (Li et al. 2008 ja 2012, Srivastava et al. 2005), jotka ovat invaasioon ja metastaasiin voimakkaasti liittyviä ilmiöitä. Esriinin lokalisaatioon vaikuttavia tekijöitä ei ole kuitenkaan tutkittu perusteellisesti, vaikka niiden ymmärtäminen voisi auttaa myös invaasiomekanismin ymmärtämistä. Yksi mahdollinen esriinin lokalisaatioon vaikuttava tekijä on antiadhesiivinen sialomusiini podokalyksiini, joka on liitetty aggressiivisiin syöpiin 38 ja muodostaa kompleksin esriinin kanssa. Podokalyksiinin kokeellinen ilmentäminen aiheuttaa esriinin siirtymisen solu-solukontakteihin ja lisää esriinin fosforylaatiota (Tyr353). Yhdessä nämä tapahtumat lisäävät MAPK- ja PI3K-reittien signalointia ja solujen invaasiokykyä (Sizemore et al. 2012). 1.3.5.2 Uuteen paikkaan kulkeutuminen, ekstravasaatio ja kolonisaatio Metastaattiset solut etenevät muita soluja helpommin verisuoniin ja kestävät suonissa esiintyvää leikkaavaa virtausrasitusta paremmin (Wyckoff et al. 2000). Yleensä solut säilyvät verenkierrossa enintään muutamia tunteja. Nykykäsityksen mukaan eri metastaattiset kloonit kykenevät kolonisoimaan vain tiettyjä kudostyyppejä, ja suurin osa verenkiertoon päässeistä soluista kuolee, koska niillä ei ole kudostyyppiin sopivaa oikeaa biologista ohjelmaa, jotta ne etenisivät kaikkien ekstravasaatiovaiheiden läpi (Bustelo 2012). Vielä ekstravasaation jälkeenkin solut saattavat kuolla tai jäädä lepotilaan, jos oikeita biologisia olosuhteita etäpesäkekasvuun ei ole (Bustelo 2012). Tietyt syöpäkasvaimet metastasoituvat mieluiten tiettyihin sekundaarikohtiin (tropismi). Tämä ei välttämättä ole pelkästään imu- ja veriteiden mallista riippuvaista. On esimerkiksi havaittu, että TGFβ-signalointi on voimistunut niissä rintasyöpäsoluissa, jotka metastasoituvat luuhun, mutta ei niissä, jotka kolonisoivat lisämunuaisen (Kang et al. 2005). Itse ekstravasaatio on huonosti tunnettu, aktiivinen prosessi. Osa metastaattisista soluista voi proliferoitua jo suonen sisällä, jolloin lisääntyvä massa saattaa rikkoa endoteelin ja solut pääsevät kudokseen. Kolonisaatio on vielä intravasaatiotakin tehottomampaa: arvioidaan, että useimmat solut kuolevat apoptoosin kautta 24 tunnin sisällä ekstravasaatiosta (Chaffer & Weinberg 2011). Kolonisaatiomekanismeja ei juurikaan tunneta. Ratkaisevia vaikuttavat olevan syöpäsolun ja solunulkoisen väliaineen vuorovaikutukset; invaasiokohdan väliaine poikkeaa usein huomattavasti primaarikasvaimen väliaineesta sekä rakenteensa että sisältämiensä kasvutekijöiden suhteen. Myös ympäröivät kudosspesifiset, immuunipuolustukseen liittyvät ja endoteelin solut ovat erilaisia kuin primaarikasvaimen vastaavat (Shibue & Weinberg 2011). On esitetty ajatuksia esim. premetastaattisesta nichestä ja primaarikasvaimeen takaisin palaavista syöpäsoluista, jotka osaltaan 'valmistelevat' tiettyjen syöpäsolutyyppien kolonisoitumista tiettyihin kudoksiin, tai kasvainten kantasolujen merkityksestä kolonisaatiossa, mutta nämä ovat suurimmaksi osaksi vielä hypoteesejä. Kudostyypillä on suuri merkitys syöpätyyppien kehittymisessä mikrometastaasiksi. Vaikka Src-kinaasin aktiivisuutta ei tarvita rintasyöpäsolujen metastasoimisessa luuhun tai keuhkoihin, kinaasin merkitys on ratkaisevaa syöpäsolujen eloonjäännille luussa, mutta ei keuhkoissa. Luuytimessä rintasyöpäsolut kuolevat ilman Src-aktiivisuutta (Zhang et al. 2009). Esriinin merkitys kolonisaatiossa on osoitettu aiemmin mainituissa kokeellisissa metastaasimalleissa, mutta itse mekanismit ovat suurelta osalta tuntemattomia. Osteosarkoomamallissa on tutkittu esriinin treoniinifosforylaatiota, joka on PKC-kinaasin dynaamisesti säätelemää metastaasin edetessä. Kun metastaasisolut saapuvat keuhkoihin, esriini on aluksi fosforyloitunut (Thr567), mutta vain invasiivisen rintaman etureunassa, jossa myös PKC ilmentyy. Tämä esiintymistapa näyttää pitävän paikkansa myös 39 ihmispotilaiden keuhkojen etäpesäkenäytteissä. Treoniinifosforylaatio häviää hetkeksi metastaasiprosessin jatkuessa, mutta ilmaantuu uudelleen, kun metastaasi on kasvanut suuremmaksi, edelleen pesäkkeen invasiivisessa etureunassa (Ren et al. 2009). Tämä mielenkiintoinen tulos osoittaa, että metastaasi on prosessi, jonka kuluessa solut tarvitsevat erilaisia ominaisuuksia, ja tämä voidaan aikaansaada vain tarkasti säädellyllä tavalla. Sama tutkimusryhmä jatkoi tätä tutkimusta ekspressoimalla esriinimutantteja, joiden ajatellaan edustavan konstitutiivisesti avointa (T567D) tai konstitutiivisesti suljettua esriinimolekyyliä (T567A). Tulokset eivät ole aivan samantyyppisiä kuin edellä mainitussa tutkimuksessa, sillä kumpikaan konstrukti ei pysty tuottamaan metastaaseja, eikä T567D-konstrukti pysty tuottamaan edes primaarituumoreita. Tämä osoittaa edelleen, että fosforylaation on oltava dynaamista. T567A-konstruktia kantavat solut joutuivat apoptoosiin jo varhain saapuessaan keuhkoihin, ja artikkelissa tämän syyksi osoitetaan hapenkulutuksen ja glykolyysin väheneminen (Ren et al. 2012). Tämä on ainoa julkaisu, jossa esriini liitetään suoraan syöpäsolujen energiametaboliaan, joka siis oli Hanahanin ja Weinbergin mukaan yksi uusista, esille nousseista syövän syntyä edesauttavista tekijöistä. Nykytutkimuksessa voidaan käyttää mikrodissektiotekniikkaa esimerkiksi etäpesäkkeiden analysointiin. Etäpesäkkeelliset ja etäpesäkkeettömät haimasyöpänäytteet eroteltiin mikrodissektiotekniikalla ja näytteiden proteiiniprofiileja verrattiin DIGE-ajossa (differentiaalinen geelielektroforeesi), joka analysoitiin massaspektrometrialla (Cui et al. 2008). Tulokset varmistettiin perinteisimmillä menetelmillä, ja yllättäen havaittiin, että radiksiinilla ja moesiinilla, mutta ei esriinillä, on merkitsevästi lisääntynyt ekspressiotaso metastaattisissa syövissä. Esriinin kohdalla on kuitenkin kiinnostavaa, että 2Dgeelissä havaitaan kaksi täplää, joista happamampi (fosforyloitunut) muoto on vähentynyt ja emäksisempi (ei-fosforyloitunut) lisääntynyt metastaasipositiivisessa haimasyöpäryhmässä. Muilla menetelmillä ei voida erottaa muuta kuin kokonaisproteiinin määrä. Immunohistokemiallisen värjäyksen perusteella esriinimäärä on suuri sekä imusolmukemetastaasin suhteen positiivisissa että negatiivisissa syövissä. Tämäkin tulos osoittaa, miten tärkeää on pystyä havaitsemaan eroja proteiinien funktionaalisissa tiloissa, jotta signaalireiteillä dynaamisesti säädeltyjen molekyylien ajallista ja paikallista merkitystä voitaisiin todella arvioida. Tämä on erityisen tärkeää, kun tutkitaan etäpesäkkeiden muodostumista, koska mikroympäristö on niin oleellinen tekijä yksittäisten invasoivien solujen ja mikrometastaasien kohtalolle. Yhdessä siruanalyysitutkimuksessa on tutkittu solun geeniekspression muuttumista metastaattisessa mikroympäristössä (Deng et al. 2007). Keuhkosyöpäsolujen luumetastaasia tutkittiin keuhkojen levyepiteelisyöpäsoluilla, joita viljeltiin vastasyntyneen hiiren pääkallossa. Yhdeksän geenin ekspressio lisääntyy, ja näihin kuuluvat mm. CD44, luuta hajottava paratyroidihormonin sukuinen proteiini (PTHrP) ja esriini. Tulokset varmistettiin hiirimallissa, jossa esriinin ja PTHrP:n lisääntyminen luumetastaasissa havaitaan myös käänteis-PCR:n ja immunohistokemian tekniikoilla. Myös aikuisen hiiren pitkien luiden kanssa viljellyissä keuhkosyöpäsoluissa esriinimäärä lisääntyy 40 noin 3,5-kertaiseksi lähtötasoon verrattuna, kun taas munuais- tai maksakudoksen kanssa esriinimäärä ei lisäänny ja keuhkokudoksessa lisäys on noin 1,8-kertainen. TGFβ-stimulaatio lisää esriinin määrää näissä soluissa, joten on mahdollista, että PTHrP:n luuta hajottava vaikutus vapauttaa tätä kasvutekijää, jolloin esriinin määrä soluissa lisääntyy. Tämä on ainoa tämäntyyppinen tutkimus, jossa on suoraan katsottu mikroympäristön vaikutusta esriinin määrään metastasoivassa solussa. Lisäksi on ilmestynyt julkaisuja esriinin liittymisestä yleisesti metastaasiin. Viime aikoina on löytynyt yhä enemmän todisteita erilaisten syöpien säätelystä pienten, ei-koodaavien mikro-RNA:iden kautta. Esimerkiksi miR-183:n on osoitettu yliekspressoituvan erilaisissa kasvaintyypeissä, joissa se säätelee mm. EGFR1-reseptoria (Sarver et al. 2010). miR-183:n ilmentymisellä on havaittu olevan käänteinen korrelaatiosuhde esimerkiksi keuhkosyöpäsolujen metastaattisen kyvyn kanssa, ja miR-183:n ektooppinen ilmentäminen estää erittäin metastaattisten keuhkosyöpäsolujen migraatiota ja invaasiota. miR-183:n kohteena on esriini (Wang et al. 2008). Osteosarkoomakudoksissa miR-183:n ilmentyminen on merkitsevästi vähentynyt, mikä korreloi osteosarkooman keuhkometastaasiin ja paikallisen uusiutuman esiintymiseen. Ektooppisesti ilmennetty miR-183 estää osteosarkoomasolujen migraatiota ja invaasiota. Esriini on näissä soluissa miR-183:n suora kohde, ja esriinin vaimentaminen vähentää fosforyloituneen p44/42:n määrää (Zhu et al. 2012). Rintasyöpäsolut ovat kolmas syöpäsolutyyppi, jossa miR-183:n kohteena on esriini. miR-183:n yliekspressio estää rintasyöpäsolujen migrointia, mutta ei vaikuta proliferaatioon tai apoptoosiin (Lowery et al. 2010). Kuviossa 8 esitetään kaavamainen kuva kolonisaatiotapahtumista ja esriinin merkityksestä. 41 KUVIO 8 Esriini ja kolonisaatio. Alaosan inserttineliö kuvaa solutason tapahtumia. Esriinigeenin epigeneettisen säätelyn yhteys metastaasiin osoitetaan julkaisussa, jossa erittäin metastaattisten rhabdomyosarkoomasolujen suuri esriinipitoisuus liittyy esriinigeenin asetylaatioon ja metylaatioon. Nämä muutokset korreloivat esriinin ilmentymiseen. Vähäisiä esriinimääriä ilmentävien solujen metastaasiprotentiaalia voidaan lisätä hiirissä in vivo, kun esriinin ekspressio indusoidaan käsittelemällä kasvainsoluja epigeneettisiä tekijöitä estävillä aineilla (Yu et al. 2010). Yllättäviä tuloksia saatiin tutkimuksesta, jossa verrattiin esriiniä paljon tai vähän ilmentäviä osteosarkoomasoluja cDNA-mikrosirutekniikalla. Samassa tutkimuksessa käytettiin myös proteomiikkamenetelmiä, kun etsittiin kasvainsolulysaateista proteiineja, jotka sitoutuivat esriinin N-päähän. Näiden tuloksena esriinin havaittiin liittyvän ribonukleoproteiinikompleksiin ja siten proteiinien translaatiokoneistoon. Koska sama ryhmä oli havainnut esriinin polarisoitumisen metastaasissa, he erottelivat kokeellisesti solujen pseudopodit soluvartalosta ja osoittivat, että myös translaation aloittamiseen tarvittavia proteiineja keskittyy näihin invasoiviin solunosiin esriinin kanssa (Briggs et al. 2012). Tässäkin metastaattisen prosessin tutkiminen ja ymmärtäminen näyttäisi edellyttävän toimintojen erottelemista ajallisesti ja paikallisesti hyvinkin pieniin ikkunoihin, joiden tutkiminen vaatii erityistekniikoita. 42 1.3.5.3 Metastaasitutkimuksen haasteita Viime aikoina on alettu painottaa kasvaimien heterogeenisuutta ja toisaalta ympäröivien solujen vaikutusta kasvaimen muodostumiseen. Myös etäpesäkkeitä muodostavien solujen tropismi tiettyihin kudoksiin tai mikrometastaasin kasvaminen makroskooppiseksi etäpesäkkeeksi voi riippua mikroympäristön tekijöistä. Metastaasien tutkimus kolmiuloitteisissa ympäristöissä sekä in vitro että in vivo on ratkaisevaa yksittäisten syöpäsolujen ja niiden mikroympäristön tutkimuksessa. Tarvitaan kuvantamistekniikkoja, jotka voivat erottaa varhaisia muutoksia normaalikudoksessa tai maligneja muutoksia hyvänlaatuisiin muutoksiin verrattuna. Invasiivisten solujen tai solumassojen tunnistaminen olisi lopulta yksi tärkeimmistä tavoitteista syöpäpotilaiden hoidon kannalta. Näiden tutkiminen vaatii pitkälle kehittyneitä ja herkkiä tekniikoita. Tutkimuksen pitää pystyä erottamaan hyvinkin hienovaraisia muutoksia proteiineissa; esimerkiksi esriinin kokonaismäärän tai edes fosfoproteiinin staattinen tuntemus ei riitä, kun signaalinvälitys (fosforylaatio-defosforylaatio jne.) vaihtelee ajallisesti ja paikallisesti hyvinkin pienissä vaihtelurajoissa ja pieninä kokonaismäärinä. Koska esriini on liitetty niin monissa erilaisissa syövissä invaasiokykyyn ja metastasointiin, mekanismin ymmärtämiseksi tarvittaisiin edelleen nimenomaan mikroympäristön huomioivaa tutkimusta. Aiemmin mainittujen kolmiulotteisten soluviljelytekniikoiden lisäksi on kehitelty mikroympäristötekniikoita, joiden avulla voidaan jäljitellä kudosten välipintoja, spatiotemporaalisia kemiallisia gradientteja ja solujen mekaanista ympäristöä muokatussa mikroympäristössä. Näin voidaan tutkia kudosspesifistä kontekstia ja lääkeaineiden vaikutusta sirutyyppisissä kudosmalleissa (organson-chips, ks. Huh et al. 2011). Metastaasitutkimuksissa keskeisiä ovat olleet erilaiset hiirimallit; on käytetty mm. ihmiskasvainten siirteitä immuunipuolustukseltaan puutteellisiin hiiriin. Hiirimallit ovat kuitenkin kalliita ja hitaita, eivätkä ne sovellu tehoseulontasovelluksiin geneettisiä tai farmakologisia seulontoja varten. Lisäksi hiiret poikkeavat huomattavasti ihmisestä mm. solujen transformoitumisen suhteen. Yksi ratkaisu on kehittää viljelymalleja. Khavarin tutkimusryhmä transformoi erilaisia ihmisen normaaleja epiteelisoluja aktivoimalla niissä Rasreitin ja ohittamalla Rb-välitteiset solusyklirajoitukset. Näitä soluja kasvatettiin kolmiulotteisissa organotyyppisissä in vitro -kudosmalleissa, joissa epiteelisoluja kasvatettiin elävien stroomasolujen ja niiden tuottaman solunulkoisen matriksin ja tyvikalvon päällä. Näissä olosuhteissa normaalit epiteelisolut kerrostuvat ja erilaistuvat normaalisti, kun taas transformoituneet solut eivät organisoidu ja läpäisevät tyvikalvon jo 6 päivän kuluessa. Tällaista järjestelmää voidaan käyttää esim. inhiboivien aineiden seulomiseen. Tutkijat estivät invaasion Ras-RafMAPK-reitin estäjillä, kun taas PI3K-reitin estäjillä ei ollut vaikutusta. Mikä kiinnostavinta, kun kolmiulotteisesti kasvatetuista soluista tehtiin transkriptomin siruanalyysi, tulokset muistuttivat itse karsinoomista saatuja tuloksia, kun taas normaalissa kaksiulotteisissa viljelmässä kasvatettujen, vastaavasti transfor- 43 moitujen epiteelisolujen transkriptomi ei osoittanut mitään korrelaatiota in vivo esiintyvien syöpien kanssa (Ridky et al. 2010). Esriinin tehtävät solutukirangan ja kalvorakenteiden organisoinnissa vaikuttavat osaltaan solujen biomekaanisiin ominaisuuksiin, kuten jäykkyyteen, elastisuuteen, vetolujuuteen ja supistuvuuteen. Biomekaaniset ominaisuudet taas vaikuttavat suoraan solujen liikkuvuuteen ja invaasiokykyyn. Nämä ominaisuudet vaihtelevat esim. soluväliaineiden mukaisesti, ja ne myös muuttuvat kasvainmuodostuksen ja kasvaimen kehitysvaiheiden aikana. Esim. esriiniin liittyvät Rho- ja EGFR-reitit vaikuttavat biomekaanisiin ominaisuuksiin. Tälläkin alueella vaikuttaa siltä, että normaalissa soluviljelyssä eristetyistä kasvainsoluista saadut tulokset saattavat olla ristiriitaisia in situ saatujen tulosten kanssa (ks. katsausartikkeli Yu et al. 2011). Esriinitutkimuksia läpikäydessä voi vain hämmästellä, miten yksi proteiini voi sitoa niin monia proteiineja. Tätä asiaa on käsitelty proteiini-proteiiniinteraktiokarttojen solmuproteiinien yhteydessä (Tsai et al. 2009). Kyseessä ei ole yksi proteiinirakenne (tai yksi esriinimolekyyli), joka voi sitoa monia proteiineja, vaan oikeastaan sarja eri geenituotteita, jotka edustavat yhtä solmukohtaa (esim. oligomeerit, mutantit, posttranslationaaliset modifikaatiot, allosteeriset rakenteet). Tähän pitää lisätä vielä aikaulottuvuus (sekä solun normaalitoiminnassa että kasvaimen kehittymisen vaiheissa). Vaikka erilaiset siruanalyysit tuottavat jo itsestään valtavat määrät dataa, tähän pitäisi vielä yhdistää sirujen aikasarjoja, jotta nähtäisiin tapahtumien aikajärjestys, niiden mahdollinen yhtäaikaisuus jne. Syöpään ja metastaasiin liittyvät monimutkaiset soluprosessit. Esimerkiksi kalvon tyrosiinikinaasit ovat jatkuvassa liikkeessä ja vaihtuvissa vuorovaikutuksissa muiden proteiinien ja kalvon mikrodomeenien kanssa. Ligandin sitoutuminen voi muuttaa diffuusiota ja saattaa laukaista homo- tai heterooligomerisaation tai endosytoosin. Biokemiallisilla ja perinteisillä patologisilla menetelmillä on vähäinen spatiaalinen ja temporaalinen resoluutio. Signaalinvälitystapahtumien havaitsemiseen elävissä soluissa tarvitaan reaaliaikaisia ja herkkiä menetelmiä (ks. esim. Lidke & Wilson 2009; Provenzano et al. 2009; Sahai 2007). Perinteisen fluoresenssimikroskopian kolokalisaation resoluutio on esimerkiksi >250 nm. FRET (Förster-/fluoresenssiresonanssienergian siirto) -menetelmän resoluutio on n. 10 nm, mutta tekniikka on hankalammin hallittava eikä osoita esim. isojen proteiinikompleksien muodostumista. On kehitelty uusia kuvantamismenetelmiä (esimerkkeinä yhden hiukkasen seuranta (SPT)), jossa käytetään usein apuna kvanttipisteitä. Näillä menetelmillä on esimerkiksi voitu todistaa, että solukalvolla tosiaan on diffuusiota rajoittavia mikrodomeeneja ja että aktiinitukiranka muodostaa fysikaalisen, mutta dynaamisen esteen proteiinien diffuusiolle solun pinnalla. Teknisesti pitkälle kehittyneillä metodeilla on voitu kuvata jopa mikro- tai millisekuntien vuorovaikutuksia. Näin on tutkittu esim. fokaaliadheesiokinaasin, paksilliinin ja vinkuliinin dynamiikkaa fibroblastien adheesiokomplekseissa (Digman 2009). Jos ajatellaan nimenomaan esriinitutkimuksia, osassa invaasiota ja metastaaseja käsittelevistä tutkimuksista (ja muissakin tutkimuksissa) on käytetty esriinin toimintojen estämistä esriinin N-terminaalisella konstruktilla, jota pidetään 44 vaikutukseltaan dominantisti negatiivisena. Tämä on kuitenkin varsin epäspesifinen tapa estää esriinin vaikutuksia, kun ottaa huomioon FERM-domeenin laajan esiintymisen eri proteiineissa. Konstruktin aikaansaamien vaikutusten spesifisyyttä on vaikea todentaa. Menetelmien kehittyessä on otettu käyttöön erilaiset RNA-tekniikat (siRNA, shRNA), jotka ovat astetta spesifisempiä, mutta eivät hävitä endogeenistä esriiniä kokonaan. Lisäksi spesifisyyttä on vaikea osoittaa muiden proteiinien tasolla. Esriinipoistogeenisiä soluja on käytetty vasta hyvin harvassa julkaisussa. Yksi tapa on käyttää erilaisia (piste)mutaatiokonstrukteja, jotka kohdistuvat tunnettuihin kohtiin signaalinvälityksessä. Tavallisesti mutaatiot kohdistetaan fosforyloituviin treoniini- tai tyrosiinitähteisiin, joiden fosforylaatio joko estetään tai sitä jäljitellään toisella aminohapolla korvaamalla. Näissä tapauksissa käytetään konstruktien yliekspressoimista, eikä endogeenisen esriinin vaikutuksia voida kontrolloida. 45 2 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää esriinin osuutta pahanlaatuisiin solumuutoksiin liittyvissä tapahtumissa käyttämällä mallia, jossa endogeenisen esriinin osuus voitiin poissulkea. Tarkemmat tavoitteet olivat seuraavat: 1. tutkia, kuinka esriinin poistaminen tai toisaalta läsnäolo vaikuttaa solun syöpään liittyviin ominaisuuksiin 2. määrittää, vaikuttaako kasvuympäristö (normaali soluviljelymalja vs. kolmiulotteinen viljely) esriinistä riippuvaisiin muutoksiin 3. määrittää jo aiemmin tunnettujen mutaatioiden vaikutus soluissa, jotka eivät sisällä endogeenista esriiniä, lisäämällä soluihin joko villityyppisiä tai mutatoituja esriinikonstrukteja ja vertaamalla näin saatujen solujen ominaisuuksia erityisesti metastaattiseen Srckinaasiin ja esriinin tyrosiinifosforylaatioon liittyen. 46 3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT 3.1.1 Solulinjat Esriinin suhteen poistogeenisestä hiirestä (−/−) (Saotome et al. 2004) saadut alkion fibroblastit immortalisoitiin spontaanisti laimennossarjoja käyttäen. Laimennosten tuloksena saatiin kaksi toisistaan riippumatonta MEF (mouse embryonic fibroblast) -solulinjaa, joita molempia käytettiin rinnakkain kaikissa kokeissa spontaanien mutaatioiden aiheuttaman variaation vaikutuksen vähentämiseksi. Villityyppinen (WT) esriinikonstrukti ja erilaisia mutatoituja esriinikonstrukteja lisättiin cDNA-muodossa pBABEpuro-ekspressiovektoriin (Morgenstein & Land 1990). 293 Eco Phoenix -retroviruksen pakkaussolulinja transfektoitiin näillä ekspressiokonstrukteilla. Virussupernatanttia käytettiin MEF-solujen transduktioon (Miller et al. 1993), ja soluja selektoitiin puromysiinillä (2,5 mg/ml, Sigma-Aldrich). MEF-soluihin vietiin myös Src-kinaasin konstitutiivisesti aktiivinen muoto retroviruskonstruktilla pLXSH-SrcY527F (Cary et al. 2002), jolloin positiiviset solut selektoitiin hygromysiini B:llä (Calbiochem). Lisäksi käytettiin rotan epiteelisolulinjaa RK3E ja sen v-Srctransformoitua alalinjaa (Fu et al. 2005). 3.1.2 Vasta-aineet, reagenssit ja immunopresipitaatio Fosfotyrosiini detektoitiin monoklonaalisella anti-fosfotyrosiinivasta-aineella, klooni PT-66 (Sigma). Esriinin detektioon käytettiin aiemmin kuvattuja polyklonaalisia vasta-aineita Ez9 ja pY477 (Alfthan et al. 2004, Heiska & Carpén 2005). Kontrolleina käytettiin hiiren IgG1:tä (Dako Cytomation) tai kaniinin immunisointia edeltävää seerumia. Aktiivisen Src-kinaasin tunnistukseen käytettiin BioSourcen fosfospesifistä (pY418) vasta-ainetta, ja moesiinin fosforyloitunut T558 tunnistettiin Santa Cruz Biotechnologyn vasta-aineella. Moesiinivasta-aine saatiin Sa. Tsukitalta (Kioton yliopisto, Japani). Hiiren sykliini D, fosfo-p38MAPK, fosfo-p44/42 MAPK, fosfo-p70S6, fosfo-4EBP1, Akt ja fosfoAkt tunnistettiin Cell Signaling Technologyn vasta-aineella, ja hiiren tubuliinin tunnistava monoklonaalinen vasta-aine oli hankittu Sigmalta. Sigmalta saatiin myös Rho-kinaasin inhibiittori Y-27632. 47 Esriini immunopresipitoitiin hajottamalla solut kylmässä RIPA-puskurissa (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1-prosenttinen NP-40, 0,5-prosenttinen deoksikolaatti, 0,1-prosenttinen natriumdodekyylisulfaatti, 1 mM ortovanadaatti, proteaasi-inhibiittorien seos, pH 7,4). Supernatantteihin lisättiin Ez9-vasta-ainetta ja protein G Sepharose -helmiä (Amersham Pharmacia). Analysointi tehtiin Western blot -menetelmällä sopivia vasta-aineita ja ECL-detektiota (Amersham Pharmacia) käyttäen. 3.1.3 Solujen proliferaatiokoe 24-kuoppaiseen soluviljelymaljaan maljattiin 5 x 103 solua / kuoppa. Analyysipäivänä kuoppia inkuboitiin 200 µl:ssa fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta, joka sisälsi 40 mg/ml MTT:tä ([3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi], Sigma Aldrich). Kolmen tunnin inkuboinnin jälkeen muuttunut väriaine suspensoitiin 200 µl:aan dimetyylisulfoksidia. 100 µl:n erät analysoitiin mikrotiitterilevyjen lukijalla aallonpituudella 550 nm. 3.1.4 Soluadheesion analysointi Soluja kasvatettiin yön ajan ilman seerumia. Sen jälkeen solut irrotettiin trypsiinillä ja maljattiin tiheydessä 5 x 105 solua / kuoppa seerumittomassa elatusaineessa 96-kuoppaiseen viljelymaljaan, jonka kuopat oli päällystetty fibronektiinillä (10 µg/ml, SPR). Soluja seurattiin kiinnittymisen aikana valomikroskoopin avulla. Kiinnittyneet solut värjättiin eri aikapisteissä kristallivioletilla. Sitoutunut väriaine uutettiin 0,1-prosenttisella Triton X-100-liuoksella ja mitattiin mikrotiitterilevyjen lukijalla aallonpituudella 595 nm. 3.1.5 Mikroskopiamenetelmät Solut kasvatettiin peitinlaseilla, kiinnitettiin 3,5-prosenttisessa paraformaldehydissä ja permeabilisoitiin fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1 % Triton X-100:aa. Peitinlaseja inkuboitiin peräkkäin vasta-aineiden kanssa. Sekundaarisina vasta-aineina käytettiin aasin rodamiinikonjugoitua antikaniinitai anti-hiiri-F(AB')2-fragmenttia (Jackson Immunoresearch Laboratories). F-aktiini leimattiin rodamiinikonjugoidulla falloidiinilla (Invitrogen Molecular Probes). Matrigeelin sisällä kasvavat solut värjättiin julkaisun Debnath et al. (2003) mukaisella menetelmällä, jota hieman muunneltiin. Kahdeksankuoppainen lasinen kammio-objektilasi päällystettiin Matrigel-kerroksella (50 µl/kuoppa, BD Biosciences), jonka päälle maljattiin seos, joka sisälsi 5 x 103 solua, Matrigeliä (1/3 tilavuudesta) sekä elatusainetta (yht. 100 µl). 24–36 tunnin inkuboinnin jälkeen kuopat kiinnitettiin 3,5-prosenttisessa paraformaldehydissä, permeabilisoitiin fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1 % Triton X-100:aa, ja huuhdeltiin liuoksella 130 mM NaCl, 7 mM Ha2HPO4, 3,5 mM HaH2PO4 ja 100 mM glysiini. Kuopat peitettiin 10-prosenttisella sian seerumilla liuoksessa 130 mM NaCl, 7 mM Ha2HPO4, 3,5 mM HaH2PO4, 0,1-prosenttinen naudan seerumi- 48 albumiini, 0,2-prosenttinen Triton X-100 ja 0,05-prosenttinen Tween-20. Tämän jälkeen kuoppia inkuboitiin vasta-aineiden läsnäollessa. Objektilasit peitettiin Mowoililla (Calbiocem), johon oli sekoitettu 1,4-diatsabisyklo-oktaania (Sigma Aldrich, 1:3). Soluja tarkasteltiin epifluoresenssi- tai konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems). 3.1.6 Sferodien muodostaminen ja solujen hajaantumiseen liittyvät kokeet Solusferoidien muodostamisessa noudatettiin julkaisun Eleveld-Trancikova et al. (2002) sisältämää menetelmää. Sferoideja muodostettiin maljaamalla 5 x 103 solua U-pohjaisiin mikrotiitterimaljan kuoppiin, jotka oli esivalettu ohuella kerroksella 1-prosenttista agaria. Soluja inkuboitiin 24–48 tuntia, jonka jälkeen sferoidit siirrettiin varovasti 24-kuoppalevylle, johon oli valmiiksi valettu seosta, joka sisälsi 1 mg/ml tyypin I kollageenia (BD Biosciences), 10 % naudan sikiön seerumia ja 50 mM NaHCO3-puskuria. Sferoidien päälle lisättiin elatusaineliuosta, ja niitä tarkkailtiin valomikroskoopin avulla. 3.1.7 Soluviljely soft agarilla ja suspensiossa Esivaletulle 0,6-prosenttiselle agarkerrokselle maljattiin yhteensä 5 x 104 solua DMEM-elatusaineessa, joka sisälsi 0,3 % agaria ja 10 % vasikan sikiön seerumia. Solukolonnien määrää ja laatua seurattiin valomikroskoopilla 14–21 vrk. Suspensiokasvatusta varten ympättiin 5 x 105 solua 35 mm:n bakteerikasvatusmaljoille, joiden elatusaine sisälsi 0,5 % metyyliselluloosaa (Sigma Aldrich). Yli 10 solun keräytymät laskettiin valomikroskoopin avulla 7–10 vrk:n kuluttua. 3.1.8 Invaasiokoe ja soluviljely Matrigel-matriksissa Invaasiota mitattiin Matrigel-invaasiokammiossa, jossa kasvutekijöitä oli vähennetyt pitoisuudet (BD Biosciences). Kokeessa käytettiin valmistajan antamaa menetelmää. Kammion sisäosat rehydroitiin 0,5 ml:lla elatusaineliuosta, kammioon ympättiin 5 x 104 solua elatusaineessa, johon oli lisätty 1 % vasikan sikiön seerumia. Maljan kuopat täytettiin 0,75 ml:lla elatusainetta, johon oli lisätty 10 % vastaavaa seerumia. 36 tunnin kuluttua ylimääräiset solut poistettiin kammion yläosasta, invaasiokalvo kiinnitettiin 3,5-prosenttisessa paraformaldehydissä ja värjättiin kristallivioletilla. Kalvon läpi tunkeutuvat solut laskettiin viidestä eri mikroskooppikentästä 20 x suurennoksen avulla. 96-kuoppaiset mikrotiitterimaljoille esivalettiin 50 µl Matrigeliä (laimennos 1:3 D-MEM-elatusaineeseen). Kerroksen päälle valettiin 100 µl:n seos, joka sisälsi 5 x 103 solua, Matrigeliä (1/3 tilavuudesta) ja elatusainetta. Kun seos oli geeliytynyt, päälle annosteltiin elatusaineliuosta ja soluja inkuboitiin 14 vrk. Matrigel-tulppa kiinnitettiin 3,5-prosenttisessa paraformaldyhydissä, jonka jälkeen tulppa muutettiin nestemuotoon jäiden päällä inkuboimalla. Solut laskettiin hemosytometrin avulla. 49 3.1.9 Virtaussytometria Virtaussytometriakokeet tehtiin FACS Calibur -virtaussytometrilla (BectonDickinson). Solut kiinnitettiin 70-prosenttisessa etanolissa ja värjättiin propidiumjodidilla 30 minuutin ajan 37 °C:ssa liuoksessa, joka sisälsi 100 mg/ml RNAasi A:ta. Koetta kohden mitattiin yhteensä 10 000 solua. 50 4 TULOKSET JA POHDINTA 4.1.1 Esriinipoistogeenisen hiiren alkion fibroblasteja voidaan käyttää mallina esriinin toiminnan tutkimiseen Esriinin ja sen fosforylaation tutkimukseen on yleensä käytetty vakiintuneita solulinjoja, jotka kuitenkin sisältävät vaihtelevissa määrin endogeenistä esriiniä, joka saattaa vaikuttaa tuloksiin mm. oligomerisaation kautta. Esriinin poistogeenisen hiiren solut vaikuttivat mielenkiintoiselta mahdollisuudelta tutkia esriinin merkitystä "puhtaassa" ympäristössä. Eritoten tiettyjen fosforylaatiokohtien solutason merkitystä on helpompi tutkia, kun voidaan verrata keskenään soluja, joissa ei joko ilmennetä esriiniä lainkaan tai joissa ilmennetään pelkästään villityyppistä, fosforylaatiolla normaalisti säädeltävää esriiniä tai toisaalta pelkästään eri tavoin fosforylaatiokohdista mutatoituja esriinimolekyylejä. Poistogeenisen hiiren alkioista tuotettiin kaksi eri fibroblastisolulinjaa (MEF). Käyttämämme esriinivasta-aine osoittautui solulysaattien perusteella spesifiseksi, koska se tunnisti esriinin kokoisen proteiinivyöhykkeen normaalihiiren alkion fibroblastilysaateista Western blot -analyysissä, mutta ei tunnistanut vastaavaa MEF-linjojen lysaateista. Näissä poistogeenisissä MEFlinjoissa kyettiin viruskonstruktien avulla ilmentämään stabiilisti sekä aktiivista Src-proteiinia että erilaisia esriinimuotoja. Immunopresipitaatiotutkimuksilla voitiin todentaa, että aktiivista Src-kinaasia ilmentävissä soluissa esriini oli voimakkaasti tyrosiinifosforyloitunutta (villityyppinen esriini ja Y145F-mutantti), mutta Y477F-mutanttimuoto osoitti vain heikkoa fosforylaatiota. Tämä varmisti aiemmat havainnot siitä, että tyrosiini 477 on Src-kinaasin pääkohde esriinissä (Heiska & Carpén 2005). Näiden kokeiden perusteella voidaan sanoa, että ensimmäistä kertaa tutkimuksen apuna voitiin käyttää malleina hiiren soluja, jotka eivät sisällä lainkaan endogeenistä esriiniä. Näin proteiinin mutanttimuotoja voitiin tutkia ilman solun oman proteiinin mahdollisesti aiheuttamia vaikutuksia. 51 4.1.2 Esriiniä ei tarvita Src-kinaasin aiheuttamiin solumuutoksiin, kun soluja kasvatetaan kaksiulotteisilla pinnoilla Aktiivisen Scr-kinaasin ilmentäminen muutti MEF-solujen morfologiaa ja tukirankaa merkittävästi, kun soluja viljeltiin tavalliseen tapaan peitelaseilla (kaksiuloitteisilla pinnoilla). Solut muuttuivat muodoltaan lähes suorakulmaisista soluista runsaasti erilaisia ulokkeita sisältäviksi soluiksi. F-aktiini väkevöityi voimakkaasti ns. podosomi- tai rosettirakenteisiin, jotka ovat tyypillisiä aktivoitunutta Src-kinaasia sisältäville soluille. Näihin rakenteisiin kerääntyi tyypilliseen tapaan myös tukirankaproteiini kortaktiinia. Esriinin puuttuminen tai läsnäolo ei vaikuttanut näihin muutoksiin, eikä esriinin mutanttimuodoillakaan havaittu olevan vaikutusta solun morfologiaan tai Srckinaasin tai kortaktiinin paikallistumiseen. Sekä villityyppinen esriini että mutanttiesriinit lokalisoituivat soluissa samankaltaisesti, osittain diffuusisti, osittain solukalvon ulokerakenteisiin. Pystyimme siis todentamaan uudessa soluviljelymallissamme Src-kinaasin jo aiemmin osoitetut vaikutukset solun morfologiaan ja tukirankaan. Lisäksi havaittiin, että esriinillä ei ollut merkitystä Src-kinaasin indusoimassa podosomien muodostumisessa. Src-kinaasin toimintaan liitetään myös lisääntynyt soluproliferaatio ja solujen liikkuvuus sekä nopeampi soluadheesio. MEF-soluissa voitiin havaita nämä aktiivisen Src:n aiheuttamat muutokset pelkällä vektorikonstruktilla transfektoituihin kontrollisoluihin verrattuna. Sen sijaan esriinikonstruktien läsnäololla tai puuttumisella ei ollut näihin mitään vaikutusta, oli Src-konstrukti mukana tai ei. Tutkimuksen perusteella näytti siltä, että tavallisissa soluviljelyolosuhteissa esriinillä ei ole osuutta aktiivisen Src-kinaasin soluissa aiheuttamiin muutoksiin. 4.1.3 Esriinin läsnäolo ja tyrosiini 477:n fosforylaatio on välttämätön Srckinaasin aiheuttamissa pahanlaatuisissa muutoksissa, kun soluja kasvatetaan kolmiulotteisissa malleissa tai suspensiossa Aiemmissa tutkimuksissa on saatu todisteita esriinin merkityksestä munuaissolujen tai syöpäsolujen liikkumiselle erilaisissa kolmiulotteisissa matrikseissa. Kun MEF-solujamme kasvatettiin kolmiulotteisessa Matrigelväliaineessa, villityypin esriiniä ilmentävissä soluissa esriini polarisoitui voimakkaasti solunkalvon alapuolisiin kertymiin. Sensijaan Y477F-mutanttimuoto pysyi diffuusina sytoplasmassa eikä paikantunut solukalvolle tai ulokkeisiin. Aktiivinen Src-kinaasi paikantui myös solukalvon alle. Tähän lokalisaatioon esriini ei vaikuttanut. Tämä tulos viittasi siihen, että kolmiulotteisessa viljelyssä esriinin tyrosiinifosforylaatiolla saattaisi olla erityistä merkitystä. Tätä tukivat myös kokeet, joissa solujen annettiin muodostaa pallomaisia solusferoideja, jotka sitten siirrettiin kollageenin sisään. Kun pallosta erkanevia soluja tarkkailtiin valomikroskoopilla, villityyppistä esriiiniä sisältävät solut säilyivät pitempään elinvoimaisina. Sferoidista kollageeniin liikkuvat solut olivat pyöreitä muistuttaen julkaisun Sahai & Marshall (2003) ameebamaista liikkuvuutta, kun taas Y477F-mutanttia 52 sisältävät solut näyttivät liikkuvan pitkänomaisina. Kuten aiemmassakin julkaisussa, Rho-kinaasin estäminen inhibiittorilla muutti villityyppiset liikkuvat solut myös pitkänomaisiksi. Src-kinaasin estäminen taas hajotti koko sferoidirakenteen, eivätkä solut säilyttäneet elinkelpoisuuttaan kollageenissa. Yksi syöpäsolujen ominaisuuksista on kyky kasvaa soft agarissa. Jos kasvatimme soft agarissa soluja, jotka sisälsivät villityyppistä esriiniä, mutta ei aktiivista Src-kinaasia, solut eivät pystyneet muodostamaan kolonioita. Jos soluissa oli aktiivista Src-kinaasia, mutta ei esriiniä, muodostui jonkin verran solukolonioita. Sitä vastoin sekä villityyppistä esriiniä että aktiivista Src-kinaasia sisältävät solut muodostivat muutamassa päivässä suuria ja monisoluisia kolonioita. Jos esriiniä oli läsnä, noin kahden viikon jälkeen solujen määrä oli noin nelinkertainen pelkkää Src-kinaasia sisältäviin soluihin verrattuna. Sekä Y477F-mutanttiesriini että Src-kinaasin estäminen inhibiittorilla hävittivät kolonioiden kasvun lähes kokonaan. Syöpäsoluilla on normaalisoluihin verrattuna parempi kyky invasoida kudoksia ja kokeellisia matrikseja. Tämän vuoksi teimme kokeen, jossa testasimme solujemme kykyä lävistää huokoisen kalvon päälle valettu Matrigelkerros. Villityyppinen esriini auttoi selvästi solujen migraatiota kolmiuloitteisen väliaineen läpi aktiivisen Src-kinaasin läsnäolosta riippuen, kun taas Y477Fmutantilla tällaista ei havaittu. Normaalit fibroblastit tarvitsevat myös adheesiota solukasvuun, kun taas syöpäsolut pystyvät kasvamaan jopa suspensiossa. Kun MEF-solujamme testattiin suspensiokasvatuksessa, sekä villityyppisen esriinin että aktiivisen Srckinaasin ilmentäminen edisti solukasvua moninkertaisesti pelkkään Src-kinaasiin verrattuna. Toisaalta Y477F-mutantin ilmentäminen ei auttanut solujen suspensiokasvua. Myös virtausssytometrinen analyysi osoitti, että suspensiossa kasvaneista villityyppistä esriiniä sisältävistä soluista merkitsevästi suurempi osa oli jakautuvia (S + G2-vaiheessa). Kun suspensiossa kasvaneiden solujen lysaateista analysoitiin eri signaalinvälitysreittien merkkiaineproteiineja, fosforyloituneiden 4E-BP1- ja p70S6K-proteiinien määrässä nähtiin ero villityyppisen ja mutanttilinjan välillä. Tämä viittaa mTOR-reitin merkitykseen villityyppisen esriinin vaikutusmekanismina. Nämä kokeet osoittivat selvästi esriinin ja sen Src-fosforylaation merkityksen ominaisuuksissa, jotka liittyvät hiiren fibroblastilinjojen pahanlaatuisiin muutoksiin. Lisäksi vaikutukset voitiin paikantaa Src-kinaasin pääkohteeseen, tyrosiiniin 477. Halusimme vielä testata, voitaisiinko vastaavia ilmiöitä havaita myös epiteelisolumalleissa, koska esriini on nimenomaan epiteliaalinen proteiini. Tähän käytimme rotan epiteelilinjaa, joihin oli viety vSrc-proteiini (Fu et al. 2005). v-Src aikaansai esriinin fosforyloitumisen, jonka pääkohteena oli tyrosiini 477. Tämä fosforylaatio edesauttoi solujen kasvua Matrigel-väliaineessa. Vaikuttaa siltä, että samat mekanismit toimivat myös epiteelisoluissa. Tämän varmistamiseksi on tulevaisuudessa kuitenkin vielä kehitettävä epiteelisoluja, joissa ei ole endogeenistä esriiniä. Tutkimus varmisti aiemman löydöksemme (Heiska & Carpén 2005) siitä, että esriinin Y477 on Src-kinaasin kohteena. Sen lisäksi saimme yllättävän selvän osoituksen siitä, miten yhden proteiinin yhden aminohapon fosforyloitumisella 53 voi olla merkitystä koko solun käyttäytymisen kannalta. Erityisen mielenkiintoista on se, että solujen kokeelliset kasvuolosuhteet vaikuttavat suuresti tuloksiin, joita saadaan syöpään liittyviä soluilmiöitä testattaessa. Tällä on suuri merkitys tutkimuksen kannalta, koska kokeellisten kasvuolosuhteiden on selvästikin jäljiteltävä mahdollisimman hyvin solujen kolmiulotteista kasvuympäristöä. Varsinkin syöpään liittyvä tutkimus olisi hyvä tehdä nykyistä useammin monimutkaisemmissa tutkimusolosuhteissa, jotta tulokset edustaisivat todellisia, elimistössä tapahtuvia ilmiöitä. 54 5 PÄÄTELMÄT Hanahanin ja Weinbergin luokittelemat syövän tunnusmerkit auttavat jäsentämään valtavaa määrää kirjallisuutta, joka liittyy esriinin merkitykseen syövässä. Silti aineisto tuntuu hajanaiselta, yhtä monimutkaiselta kuin syöpä ilmiönä. Esriini voidaan liittää useimpiin näistä tunnusmerkeistä, mutta kuten syövän hoidossakin on huomattu, monet signaalireitit ovat moninkertaisesti päällekkäisiä ja risteäviä, ja vaikuttaakin siltä, että soluissa on aina runsaasti korvaavia reittejä tai proteiineja. Esriini on kuitenkin epiteelin tärkeä organisoiva proteiini, ja kun noin 90 % syövistä on epiteliaalista alkuperää (Horner 2010), esriinin merkitystä on syytä pohtia. Kuten signaalivälitysreittejä sivuavilla proteiineilla voisi kuvitellakin, esriinin on osoitettu olevan osallisena hyvin monissa kasvaimen ja etäpesäkkeen syntymiseen vaikuttavissa mekanismeissa. Esriinin toiminta liittyy solukalvon rakenteisiin, solun tukirankaan ja solun kiinnittymiseen, jotka kaikki muuttuvat jollakin tavalla, kun solukasvun muuttuu patologiseksi. Monimutkaisessa ilmiössä on vaikea enää erotella syitä tai seurauksia. Koska esriini on mukana erilaisten kasvainten tai etäpesäkkeiden kehittymiseen vaikuttavien proteiinikompleksien muodostumisessa, esriinin molekyylitason muutokset tai sitoutumiset vaikuttavat osaltaan signaalien etenemiseen ja siihen, miten solun reagoi niin ulkoisiin kuin sisäisiinkin ärsykkeisiin. Toisaalta esriinillä voi olla merkitystä myös syövän parenkyymin muuttumisessa esimerkiksi invaasiota, intravasaatiota, ekstravasaatiota tai kolonisaatiota suosivaksi, mutta tämä syöpäbiologian tutkimusalue on melko uusi, eikä yksityiskohtaisia tietoja vielä ole. Eniten todisteita on esriinin vaikutuksesta etäpesäkkeiden syntyyn. Metastaasien aikainen havaitseminen ja ehkäisy on syöpäpotilaiden kannalta ratkaisevan tärkeää. On huomattava, että kun potilaat saapuvat primaarikasvaimen vuoksi hoitoon, useimmiten heidän verenkierrossaan ja kaukaisissa kudoksissaan on jo kylväytyneitä kasvainsoluja. Primaarikasvaimeen kohdistettu hoito ei useinkaan sanottavammin tehoa metastaattisiin soluihin (ks. esim. Valastyan & Weinberg 2011). Siten on erittäin tärkeää kehittää aineita, jotka vaikuttavat nimenomaan näiden primaarikasvaimesta jo irtautuneiden kasvain- 55 solujen kehittymiseen ja eloonjääntiin. Tällaisia aineita on jo kliinisissä tutkimuksissa (esimerkiksi esriiniä fosforyloivaa Src-kinaasia estävät dasatinib ja saracatinib, joita kokeillaan sarkoomien metastaasien estämiseen). Hoito voi kohdistua myös metastaasin mikroympäristöön, esimerkkinä luuhun vaikuttava bisfosfonaatti. Olisiko vaikkapa esriinistä metastaasin estämisen tai hoidon kohdemolekyyliksi? Esriiniin sitoutuvia pieniä estäviä yhdisteitä on kyllä etsitty johtoyhdisteeksi. Khannan ja Urenin tutkimusryhmä löysi kaksi molekyyliä, jotka sitoutuvat esriiniin mikromolaarisella affiniteetilla. Ne estävät endogeenisen esriinin treoniinin 567 fosforylaation, aktiinin sitoutumisen esriiniin sekä kasvainsolujen invaasion istukan endoteelisolukerroksen läpi. Molemmat vaikuttavat seeprakalojen solujen liikkuvuuteen ja siten kalan fenotyyppiin. Molemmat pystyvät myös estämään metastaattisten nodulien syntymisen hiiren keuhkokudosviljelmässä sekä estämään esriinivälitteisen keuhkometastaasin in vivo. Molekyyleillä on vaikutus- ja kinetiikkaeroja, jotka viittaavat erilaisiin toimintamekanismeihin, mutta ei kuitenkaan synergististä etua (Bulut et al. 2012). Tästä on tietenkin äärimmäisen pitkä matka käytännön hoitosovellutuksiin, mutta esriinitutkijalle tämä on silti sydäntä lämmittävä tutkimustulos. Toinen tutkimusryhmä on tutkinut baicalein-flavonoidia, jota esiintyy kiinalaisen rohdosopin tuntemassa yrtissä Scutellaria baicalencis. Baicalein vähentää esriinin ja fosfoesriinin (Thr567) määrää levyepiteelikarsinoomasoluissa sekä solujen liikkuvuutta ja invaasiokykyä annos- ja aikariippuvaisella tavalla. Vaikutusta ei esiinny, jos soluissa ilmennetään T567A-mutanttia, jolloin liikkuvuus ja invaasiokyky vähenee jo muutenkin huomattavasti. Tutkijat päättelivät, että estävä vaikutus on siis esriinin fosforylaatiosta (avautumisesta) riippuvainen (Wu 2011). Jos ajatellaan hoitoa, on kuitenkin mietittävä, mitä proteiinin muotoa tai toimintoa halutaan estää tai vähentää. Koska kyse on dynaamisista prosesseista, pelkän "perusmolekyylin" estäminen tai vähentäminen ei ehkä anna toivottua tulosta. Solujen tärkeimpien signaaliproteiinien poistaminen kokonaan ei välttämättä aiheuta suurtakaan muutosta solujen toimintoihin mm. redundanssin takia. Esimerkiksi integriinien "adhesomissa" Src on yksi 156 komponentin ja 690 interaktion keskipisteproteiineista (hub) (Zaidel-Bar et al. 2007). Silti Src-geenin poistaminen hiiriltä ei vaikuta solujen yleiseen elinkykyisyyteen, vaan vaikuttaa lähinnä vain luun muotoutumiseen (Soriano et al. 1991). Toisaalta monet syöpää estävät lääkeaineet aiheuttavat monenlaisia sivuvaikutuksia, koska ne vaikuttavat muihinkin prosesseihin kuin vain tiettyyn syöpäominaisuuteen. Esriinimolekyylin monet toiminnot liittyvät fosforylaatio- ja muihin säätelytapahtumiin, jotka aktivoivat tai inaktivoivat tiettyjä proteiini-interaktioita tai proteiininsisäisiä sitoutumiskohtia. Kuten havaittiin, monet näistä molekyylitason tapahtumista on yhdistetty syöpäsoluominaisuuksiin (ks. kuvio 9). Jos esriinin osuutta etäpesäkkeiden muodostumisessa halutaan estää, on tiedettävä tarkkaan, mitä molekyylimuotoa pitäisi estää, ja tunnettava, miten tämä vaikuttaa esriinin muihin toimintoihin tai muihin aktivoitumis- tai sitoutumiskohtiin. 56 KUVIO 9 Esriinimolekyylin tunnettuja säätelykohtia, joiden on osoitettu liittyvän syöpäsolujen ominaisuuksiin. Ajatus solun tukirankaa ja solukalvoa yhdistävän proteiinin osallisuudesta syöpään ei siis olekaan niin mahdoton kuin aluksi voisi päätellä. Ihmisen geenikokoelma olikin odotettua suppeampi, joten geenituotteilla on kompleksisemmat tehtävät kuin mitä "yksi geeni – yksi proteiini" -malli edellytti. Syöpä taas on todella monimuotoinen ryhmä sairauksia, joihin esriini voi monella tapaa liittyä dynaamisen säätelynsä kautta. 57 Kiitokset Kiitokset kuuluvat minua tiedemaailmaan opastaneelle Matti Vuennolle. Hänen ansiostaan jatkoin luonnontieteellisen leipäpuun parissa. Toinen tärkeä ihminen on Olli Carpén, jonka ryhmässä opettelin tutkimuksen tekemistä. Hänen kanssaan oli ilo löytää tien varrelta joitakin kultahippuja. Lämpimät kiitokset! Kiitän myös kaikkia rakkaita lähimmäisiä, joiden ansiosta tämäkin puuhastelu oli mahdollista. Tekijä ottaa vastuun kaikista tässä julkaisussa olevista mahdollisista virheistä. 58 LÄHTEET Alexander, S. & Friedl, P. 2012. Cancer invasion and resistance: interconnected processes of disease progression and therapy failure. Trends Mol Medic 18: 13–26. Amieva M.R., Wilgenbus K.K. & Furthmayr H. 1994. Radixin is a component of hepatocyte microvilli in situ. Exp Cell Res 210: 140–144. Alfthan,K., Heiska,L., Gronholm,M., Renkema, G.H. & Carpen, O. 2004. Cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylates merlin at serine 518 independently of p21-activated kinase and promotes merlin-ezrin heterodimerization. J Biol Chem 279: 18559–18566. Arslan, A.A., Silvera D., Arju R., Giashuddin S., Belitskaya-Levy I., Formenti SC. & Schneider R.J.. 2012. Atypical ezrin localization as a marker of locally advanced breast cancer. Breast Cancer ResTreat 134: 981–988. Autero M., Heiska L., Ronnstrand L., Vaheri A., Gahmberg C.G. & Carpen O. 2003. Ezrin is a substrate for Lck in T cells. FEBS Lett 535: 82–86. Avizienyte E., Wyke A.W., Jones R.J., McLean G.W., Westhoff M.A., Brunton V.G. & Frame M.C. 2002. Src-induced de-regulation of E-cadherin in colon cancer cells requires integrin signalling. Nat Cell Biol 4: 632–638. Batchelor C.L., Woodward A.M. & Crouch D.H. 2004. Nuclear ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins: regulation by cell density and nuclear import. Exp Cell Res 296: 208–222. Berryman M., Gary R. & Bretscher A. 1995. Ezrin oligomers are major cytoskeletal components of placental microvilli: a proposal for their involvement in cortical morphogenesis. J Cell Biol 131: 1231–1242. Berryman M., Franck Z. & Bretscher A. 1993. Ezrin is concentrated in the apical microvilli of a wide variety of epithelial cells whereas moesin is found primarily in endothelial cells. J Cell Sci 105: 1025–1043. Binamé F. 2008. Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin. Mol Biol Cell 19: 945–956. Bonilha V.L., Rayborn M.E., Saotome I., McClatchey A.I. & Hollyfield J.G. 2006. Microvilli defects in retinas of ezrin knockout mice. Exp Eye Res 82: 720–729. Bosk, J., Braunger J.A., Gerke V. & Steinem C. 2011. Activation of F-actin binding capacity of ezrin: synergism of PIP2 interaction and phosphorylation. Biophys J 100: 1708–1717. Bretscher A.A. 2000. ERM-Merlin and EBP50 protein families in plasma membrane organization and function. Annu Rev Cell Dev Biol 16 (2000): 113–143. Bretscher A., Gary R. & Berryman M. 1995. Soluble ezrin purified from placenta exists as stable monomers and elongated dimers with masked C-terminal ezrinradixin-moesin association domains. Biochemistry 34: 16830–16837. Briggs J.W., Ren L., Nguyen R., Chakrabarti K., Cassavaugh J., Rahim S., Bulut G., Zhou M., Veenstra T.D., Chen Q., Wei J.S., Khan J., Uren A. & Khanna C. 2012. The Ezrin Metastatic Phenotype Is Associated with the Initiation of Protein Translation. Neoplasia 14: 297–310. 59 Bruce B., Khanna G., Ren L., Landberg G., Jirström K., Powell C., Borczuk A., Keller E.T., Wojno K.J., Meltzer P., Baird K., McClatchey A., Bretscher A., Hewitt S.M. & Khanna C. 2007. Expression of the cytoskeleton linker protein ezrin in human cancers. Clin Exp Metastasis 24: 69–78. Bulut G., Hong S-H., Chen K., Beauchamp E.M., Rahim S., Kosturko G.W, Glasgow E., Dakshanamurthy S., Lee H-S., Daar I., Toretsky J.A., Khanna C. & Uren A. 2012. 2012. Small molecule inhibitors of ezrin inhibit the invasive phenotype of osteosarcoma cells. Oncogene 31: 269–281. Bustelo X.R. 2012. Intratumoral stages of metastatic cells: A synthesis of ontogeny, Rho/Rac GTPases, epithelial-mesenchymal transitions, and more. Bioessays 34: 748–759. Böhling T., Turunen O., Jääskeläinen J., Carpen O., Sainio M., Wahlström T., Vaheri A. & Haltia M. Ezrin expression in stromal cells of capillary hemangioblastoma. An immunohistochemical survey of brain tumors.1996 Am J Pathol 148: 367–373. Carneiro A., Bendahl P.O., Åkerman M., Domanski H.A., Rydholm A., Engellau J. & Nilbert M. 2011. Ezrin expression predicts local recurrence and development of metastases in soft tissue sarcomas. J Clin Pathol 64: 689–694. Carvalho, K., Khalifat N., Maniti O., Nicolas C., Arold S., Picart C. & Ramos L. 2010. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-induced conformational change of ezrin and formation of ezrin oligomers. Biochemistry 49: 9318–9327. Cary,L.A., Klinghoffer,R.A., Sachsenmaier,C. &. 2002. SRC catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol 22: 2427–2440. Casaletto J.B. 2011. Ezrin-mediated apical integrity is required for intestinal homeostasis. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11924–11929. Chaffer, C.L. & Weinberg, R.A. 2011. A perspective on cancer cell metastasis. Science 331: 1559–1564. Chambers, A.F., Groom A.C. & MacDonald I.C. 2002. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Rev Cancer 2: 563–572. Chen, C., Zhou Z., Liu R, Li Y., Azmi P.B. & Seth A.K. 2008. The WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1 upregulates ErbB2 and EGFR through RING finger protein 11. Oncogene 27: 6845–6855. Chen, Y., Wang D., Guo Z., Zhao J., Wu B., Deng H., Zhou T., Xiang H., Gao F., Yu X., Liao J., Ward T., Xia P., Emenari C., Ding X., Thompson W., Ma K., Zhu J., Aikhionbare F., Dou K., Cheng S.Y. & Yao X. 2011. Rho kinase phosphorylation promotes ezrin-mediated metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Res 71: 1721–1729. Chirivino D., Del Maestro L., Formstecher E., Hupe P., Raposo G., Louvard D. & Arpin M. 2011. The ERM proteins interact with the HOPS complex to regulate the maturation of endosomes. Mol Biol Cell 22: 375–385. Chishti,A.H., Kim,A.C., Marfatia,S.M., Lutchman,M., Hanspal,M., Jindal,H., Liu,S.C., Low,P.S., Rouleau,G.A., Mohandas,N., Chasis,J.A., Conboy,J.G., Gascard,P., Takakuwa,Y., Huang,S.C., Benz,E.J.,Jr, Bretscher,A., Fehon,R.G., Gusella,J.F., Ramesh,V., Solomon,F., Marchesi,V.T., Tsukita,S., Tsukita,S., & 60 Hoover,K.B. 1998. The FERM domain: a unique module involved in the linkage of cytoplasmic proteins to the membrane. Trends Biochem Sci 23: 281–282. Chuan Y. 2010. Ezrin mediates c-Myc actions in prostate cancer cell invasion. Oncogene 29: 1531–1542. Chuan Y. 2006. Androgen Induction of Prostate Cancer Cell Invasion Is Mediated by Ezrin. J Biol Chem 281: 29938–29948. Crepaldi T., Gautreau A., Comoglio P.M., Louvard D. & Arpin M. 1997. Ezrin is an effector of hepatocyte growth factor-mediated migration and morphogenesis in epithelial cells. J Cell Biol 138: 423–434. Cui, Y., Wu J., Zong M., Song G., Jia Q.J., Jinbo J. & Han J. 2009. Proteomic profiling in pancreatic cancer with and without lymph node metastasis. Int J Cancer 124: 1614–1621. Debnath,J., Muthuswamy,S.K. & Brugge, J.S. 2003. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods 30: 256–268. Debnath J. & Brugge J.S. 2005. Modelling glandular epithelial cancers in threedimensional cultures. Nat Rev Cancer 5: 675–688. Deng X., Tannehill-Gregg S.H., Nadella M.V., He G., Levine A., Cao Y. & Rosol T.J. 2007. Parathyroid hormone-related protein and ezrin are up-regulated in human lung cancer bone metastases. Clin Exp Metastasis 24: 107–119. Di Cristofano C., Leopizzi M., Miraglia A., Sardella B., Moretti V., Ferrara A., Petrozza V. & Della Rocca C. 2010. Phosphorylated ezrin is located in the nucleus of the osteosarcoma cell. Mod Pathol 23: 1012–1020. Digman,M.A., Wiseman,P.W., Choi,C., Horwitz, A.R. & Gratton, E. 2009. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proc Natl Acad Sci USA 106: 2170–2175. Dransfield D.T., Bradford A.J., Smith J., Martin M., Roy C., Mangeat P.H. & Goldenring J.R. 1997. Ezrin is a cyclic AMP-dependent protein kinase anchoring protein. EMBO J 16: 35–43. Edwards S.D. & Keep N.H. 2001. The 2.7 A crystal structure of the activated FERM domain of moesin: an analysis of structural changes on activation. Biochemistry 40: 7061–7068. Elzagheid, A., Korkeila E., Bendardaf R., Buhmeida A., Heikkilä S., Vaheri A., Syrjänen K., Pyrhönen S. & Carpén O. 2008. Intense cytoplasmic ezrin immunoreactivity predicts poor survival in colorectal cancer. Hum Pathol 39: 1737–1743. Eleveld-Trancikova,D., Kudela,P., Majerciak,V., Regendova,M., Zelnik,V., Pastorek,J., Pastorekova,S. & Bizik, J. 2002. Suppression subtractive hybridisation to isolate differentially expressed genes involved in invasiveness of melanoma cell line cultured under different conditions. Int J Oncol 20: 501–508. Elliott B.E., Qiao H., Louvard D. & Arpin M. 2004. Co-operative effect of c-Src and ezrin in deregulation of cell-cell contacts and scattering of mammary carcinoma cells. J Cell Biochem 92: 16–28. Elliott B.E., Meens J.A., SenGupta S.K., Louvard D. & Arpin M. 2005. The membrane cytoskeletal crosslinker ezrin is required for metastasis of breast carcinoma cells. Breast Cancer Res 7: R365–73. 61 Fehon R.G. 2010. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 11: 276–287. Fievet B.T., Gautreau A., Roy C., Del Maestro L., Mangeat P., Louvard D. & Arpin M. 2004. Phosphoinositide binding and phosphorylation act sequentially in the activation mechanism of ezrin. J Cell Biol 164: 653–659. Frame M.C. 2002. Src in cancer: deregulation and consequences for cell behaviour. Biochim Biophys Acta 1602: 114–130. Fu S.-L., Huang Y.-J., Lieng F.-P., Huang Y.-F., Chuang C-F. & Wang S.-W. 2005. Malignant transformation of an epithelial cell by v-Src via tv-a-mediated retroviral infection: a new cell model for studying carcinogenesis. Biochem Biophys Rec Comm 338: 830–838. Gao S. 2009. Identification of Elements and Transcription Factors for ezrin Basal Transcriptional Activity in Lung Cancer Cells. Prog Biochem Biophys 36: 288–296. Gary R. & Bretscher A. 1995. Ezrin self-association involves binding of an Nterminal domain to a normally masked C-terminal domain that includes the Factin binding site. Mol Biol Cell 6: 1061–1075. Gautreau A., Fievet B.T., Brault E., Antony C., Houdusse A., Louvard D. & Arpin M. 2003. Isolation and characterization of an aggresome determinant in the NF2 tumor suppressor. J Biol Chem 278: 6235–6242. Geiger K.D., Stoldt P., Schlote W. & Derouiche A. 2000. Ezrin immunoreactivity is associated with increasing malignancy of astrocytic tumors but is absent in oligodendrogliomas. Am J Pathol 157:1785–1793. Hamada K., Shimizu T., Yonemura S., Tsukita S. & Hakoshima T. 2003. Structural basis of adhesion-molecule recognition by ERM proteins revealed by the crystal structure of the radixin-ICAM-2 complex. EMBO J 22: 502–514. Hamada K., Shimizu T., Matsui T., Tsukita S. & Hakoshima T. 2000. Structural basis of the membrane-targeting and unmasking mechanisms of the radixin FERM domain. EMBO J 19: 4449–4462. Hanahan D. & Weinberg R. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100: 57–70. Hanahan D. & Weinberg R.A. 2011. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell 144: 646–674. Heiska L. & Carpen O. 2005. Src phosphorylates ezrin at tyrosine 477 and induces a phosphospecific association between ezrin and a kelch-repeat protein family member. J Biol Chem 280: 10244–10252. Heiska L., Alfthan K., Gronholm M., Vilja P., Vaheri A. & Carpen O. 1998. Association of ezrin with intercellular adhesion molecule-1 and -2 (ICAM-1 and ICAM-2). Regulation by phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate. J Biol Chem 273: 21893–21900. Hunter T. & Cooper J.A. 1981. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell 24: 741–752. Huh, D., Hamilton, G.A. & Ingber D.E. 2011. From 3D cell culture to organs-onchips. Trends Cell Biol 21: 745–754. Ilmonen S., Vaheri A., Asko-Seljavaara S. & Carpen O. 2005. Ezrin in primary cutaneous melanoma. Mod Pathol 18: 503–10. Irby R.B. & Yeatman T.J. 2000. Role of Src expression and activation in human cancer. Oncogene 19: 5636–5642. 62 Jankovics F., Sinka R., Lukacsovich T. & Erdelyi M. 2002. MOESIN crosslinks actin and cell membrane in Drosophila oocytes and is required for OSKAR anchoring. Curr Biol 12: 2060–2065. Jin T., Jin J., Li X., Zhang S., Choi Y.H., Piao Y., Shen X. & Lin Z. 2014 Prognostic implications of ezrin and phosphorylated ezrin expression in non-small cell lung cancer. BMC Cancer 15: 191–198. Kang, He Y.W., Tulley S., Gupta G.P., Serganova I., Chen C-R., ManovaTodorova K., Blasberg R.G., William L. & Massague J. 2005. Breast cancer bone metastasis mediated by the Smad tumor suppressor pathway. Proc Natl Acad Sci USA 102: 13909–13914. Khanna C., Wan X.L., Bose S., Cassaday R., Olomu O., Mendoza A., Yeung C., Gorlick R., Hewitt S.M. & Helman L.J. 2004. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med 10: 182–186. Kishore R., Qin G., Luedemann C., Bord E., Hanley A., Silver M., Gavin M., Goukassain D. & Losordo D.W. 2005a. The cytoskeletal protein ezrin regulates EC proliferation and angiogenesis via TNF-α-induced transcriptional repression of cyclin A. J Clin Invest 115: 1785–1796. Kishore R., Qin G., Luedemann C., Bord E., Hanley A., Silver M., Gavin M., Yoon Y.S., Goukassian D. & Losordo D.W. 2005b. The cytoskeletal protein ezrin regulates EC proliferation and angiogenesis via TNF-alpha-induced transcriptional repression of cyclin A. J Clin Invest 115: 1785–1796. Kitajiri S., Fukumoto K., Hata M., Sasaki H., Katsuno T., Nakagawa T., Ito J., Tsukita S. & Tsukita S. 2004. Radixin deficiency causes deafness associated with progressive degeneration of cochlear stereocilia. J Cell Biol 166: 559–570. Konstantinovsky S., Smith Y., Zilber S., Tuft Stavnes H., Becker A.M., Nesland J.M., Reich R. & Davidson B. 2010. Breast carcinoma cells in primary tumors and effusions have different gene array profiles. J Oncol 2010: 969084. Konstantinovsky S. 2012. Ezrin and BCAR1/p130Cas mediate breast cancer growth as 3-D spheroids. Clin Exp Metastasis 29: 527–540. Krieg J. & Hunter T. 1992. Identification of the two major epidermal growth factor-induced tyrosine phosphorylation sites in the microvillar core protein ezrin. J Biol Chem 267: 19258–19265. Krishnan K.K. 2006. Ezrin mediates growth and survival in Ewing's sarcoma through the AKT/mTOR, but not the MAPK, signaling pathway. Clin Exp Metastasis 23: 227–236. Kuo W.-C., Yang, K.-T., Hsieh, S.-L. & Lai, M. Ezrin is a negative regulator of death receptor-induced apoptosis. Oncogene 29: 1374–1383. Lamb R.F., Roy C., Diefenbach T.J., Vinters H.V., Johnson M.W., Jay D.G. & Hall A. 2000. The TSC1 tumour suppressor hamartin regulates cell adhesion through ERM proteins and the GTPase Rho. Nature Cell Biol 2: 281–287. Lan M.M. 2006. Phosphorylation of ezrin enhances microvillus length via a p38 MAP-kinase pathway in an immortalized mouse hepatic cell line. Exp Cell Res 312: 111–120. Legg J.W., Lewis C.A., Parsons M., Ng T. & Isacke C.M. 2002. A novel PKCregulated mechanism controls CD44 ezrin association and directional cell motility. Nat Cell Biol 4: 399–407. 63 Li Q., Nance M.R., Kulikauskas R., Nyberg K., Fehon R., Karplus P.A., Bretscher A. & Tesmer J.J. 2007. Self-masking in an intact ERM-merlin protein: an active role for the central alpha-helical domain. J Mol Biol 365: 1446–1459. Li Q. 2012. Expression of ezrin correlates with malignant phenotype of lung cancer, and in vitro knockdown of ezrin reverses the aggressive biological behavior of lung cancer cells. Tumour Biol 33: 1493–1504. Li Q. 2008. Ezrin silencing by small hairpin RNA reverses metastatic behaviors of human breast cancer cells. Cancer Lett 261: 55–63. Lidke, D.S. & Wilson B.S. 2009. Vaught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol 19:566–574. Lorentzen A. 2011. An ezrin-rich, rigid uropod-like structure directs movement of amoeboid blebbing cells. J Cell Sci 124: 1256–1267. Lowery A.J., Miller N., Dwyer R.M. & Kerin M.J. 2010. Dysregulated miR-183 inhibits migration in breast cancer cells. BMC Cancer 10 (2010): 502–515. Lun D.X., Hu Y.C., Xu Z.W., Xu L.N. & Wang B.W. 2014. The prognostic value of elevated ezrin in patients with osteosarcoma. Tumour Biol 35: 1263–1266. Mackay D.J., Esch F., Furthmayr H. & Hall A. 1997. Rho- and rac-dependent assembly of focal adhesion complexes and actin filaments in permeabilized fibroblasts: an essential role for ezrin/radixin/moesin proteins. J Cell Biol 138: 927–938. Mak H. 2012. Ezrin phosphorylation on tyrosine 477 regulates invasion and metastasis of breast cancer cells. BMC Cancer 12: 82–96. Mao W., Irby R., Coppola D., Fu L., Wloch M., Turner J., Yu H., Garcia R., Jove R. & Yeatman T.J. 1997. Activation of c-Src by receptor tyrosine kinases in human colon cancer cells with high metastatic potential. Oncogene 15: 3083–3090. Matsui T., Yonemura S., Tsukita S. & Tsukita S. 1999. Activation of ERM proteins in vivo by Rho involves phosphatidyl-inositol 4-phosphate 5-kinase and not ROCK kinases. Curr Biol 9: 1259–1262. Matsui T., Maeda M., Doi Y., Yonemura S., Amano M., Kaibuchi K., Tsukita S. & Tsukita S. 1998. Rho-kinase phosphorylates COOH-terminal threonines of ezrin/radixin/moesin (ERM) proteins and regulates their head-to-tail association. J Cell Biol 140: 647–657. McClatchey A.I. 2003. Merlin and ERM proteins: Unappreciated roles in cancer development? Nature Rev Cancer 3: 877–883. McRobert, E.A., Young,A.N. & Bach,L.A. 2012. Advanced glycation end-products induce calpain-mediated degradation of ezrin. FEBS J 279: 3240–3250. Mendoza M.C. 2011. The Ras-ERK and PI3K-mTOR pathways: cross-talk and compensation. Trends Biochem Sci 36: 320–328. Miller A.D., Miller D.G., Garcia J.V. & Lynch C.M. 1993. Use of retroviral vectors for gene transfer and expression. Methods Enzymol 217: 581–599. Moilanen J., Lassus H., Leminen A., Vaheri A., Bützow R. & Carpén O. 2003. Ezrin immunoreactivity in relation to survival in serous ovarian carcinoma patients. Gynecol Oncol. 90: 273–281. Morgenstern J.P. & Land H. (1990). Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucl Acid Res 18: 3587–3596. 64 Morrison H. 2007. Merlin/Neurofibromatosis Type 2 Suppresses Growth by Inhibiting the Activation of Ras and Rac. Cancer Res 67: 520–527. Mäkitie T., Carpén O., Vaheri A. & Kivelä T. 2001. Invest Ophthalmol Vis Sci 42: 2442–2449. Naba A., Reverdy C., Louvard D. & Arpin M. 2008a. Spatial recruitment and activation of the Fes kinase by ezrin promotes HGF-induced cell scattering. EMBO J 27: 38–50. Naba A., Reverdy C., Louvard D. & Arpin M. 2008b. Spatial recruitment and activation of the Fes kinase by ezrin promotes HGF-induced cell scattering. EMBO J 27: 38–50. Ng T., Parsons M., Hughes W.E., Monypenny J., Zicha D., Gautreau A., Arpin M., Gschmeissner S., Verveer P.J., Bastiaens P.I. & Parker P.J. 2001. Ezrin is a downstream effector of trafficking PKC-integrin complexes involved in the control of cell motility. EMBO J 20: 2723–2741. Orian-Rousseau V., Morrison, H., Matzke, A., Kastilan, T., Pace, G., Herrlich, P. & Ponta, H. 2007. Hepatocyte Growth Factor-induced Ras Activation Requires ERM Proteins Linked to Both CD44v6 and F-Actin. Mol Biol Cell 18: 76–83. Parlato S., Giammarioli A.M., Logozzi M., Lozupone F., Matarrese P., Luciani F., Falchi M., Malorni W. & Fais S. 2000. CD95 (APO-1/Fas) linkage to the actin cytoskeleton through ezrin in human T lymphocytes: a novel regulatory mechanism of the CD95 apoptotic pathway. EMBO J 19: 5123–5134. Patara M., Santos E.M., Coudry Rde A., Soares F.A., Ferreira F.O. & Rossi B.M. 2011. Ezrin expression as a prognostic marker in colorectal adenocarcinoma. Pathol Oncol Res 17: 827–833. Pearson M.A., Reczek D., Bretscher A. & Karplus P.A. 2000. Structure of the ERM protein moesin reveals the FERM domain fold masked by an extended actin binding tail domain. Cell 101: 259–270. Pietromonaco S.F., Simons, P.C., Altman, A. & Elias, L 1998. Protein kinase Ctheta phosphorylation of moesin in the actin-binding sequence. J Biol Chem 273: 7594–7603. Polesello C., Delon I., Valenti P., Ferrer P. & Payre F. 2002. Dmoesin controls actin-based cell shape and polarity during Drosophila melanogaster oogenesis. Nat Cell Biol 4: 782–789. Provenzano P.P., Eliceiri K.W. & Keely P.J. 2009. Shining new light on 3D cell motility and the metastatic process. Trends Cell Biol 19: 638–648. Pujuguet P., Del Maestro L., Gautreau A., Louvard D. & Arpin M. 2003. Ezrin regulates E-cadherin-dependent adherens junction assembly through Rac1 activation. Mol Biol Cell 14: 2181–2191. Reczek D., Berryman M. & Bretscher A. 1997. Identification of EBP50: A PDZcontaining phosphoprotein that associates with members of the ezrin-radixinmoesin family. J Cell Biol 139: 169–179. Ren L., Hong S.H., Cassavaugh J., Osborne T., Chou A.J., Kim S.Y., Gorlick R., Hewitt S.M. & Khanna C. 2009. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene 28: 792–802. Ren, L., Hong S.-H., Chen Q.-R., Briggs J., Cassavaugh J., Srinivasan S., Lizardo M.M., Mendoza A., Xia A.Y., Avadhani N., Khan J. & Khanna C. 2012. 65 Dysregulation of ezrin phosphorylation prevents metastasis and alters cellular metabolism in osteosarcoma. Cancer Res 72: 1001–1012. Ridky, T.W., Chow J.M., Wong D.A. & Khavari P.A. 2010. Invasive threedimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med 16: 1450–1455. Rouleau G.A., Merel P., Lutchman M., Sanson M., Zucman J., Marineau C., Hoang-Xuan K., Demczuk S., Desmaze C., Plougastel B., Pulst S.M., Lenoir G., Bijlsma E., Fashold R., Dumanski J., de Jong P., Parry D., Eldrige R., Aurias A., Delattre O. & Thomas G. 1993. Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neuro-fibromatosis type 2. Nature 363: 515– 521. Sahai, E. 2007. Illuminating the metastatic process. Nature Rev Cancer 7: 737–749. Sahai E. & Marshall C.J. 2003. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nature Cell Biol 5: 711–719. Saotome I., Curto M. & McClatchey A.I. 2004. Ezrin is essential for epithelial organization and villus morphogenesis in the developing intestine. Dev Cell 6: 855–864. Sarrió, D., Rodríguez-Pinilla S.M., Dotor A., Calero F., Hardisson D. & Palacios J. 2006. Abnormal ezrin localization is associated with clinicopathological features in invasive breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat 98:71–79. Sarver A.L., Li H. & Subramanian S. 2010. MicroRNA miR-183 functions as an oncogene by targeting the transcription factor EGR1 and promoting tumor cell migration. Cancer Res 70: 9570–9580. Schlecht, N.F., Brandwein-Gensler M., Smith R.V., Kawachi N., Broughel D., Lin J., Keller C.E., Reynolds P.A., Gunn-Moore F., Harris T., Childs G., T.J. Belbin T.J. & Prystowsky M.B. 2012. Cytoplasmic Ezrin and Moesin Correlate with Poor Survival in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Head and Neck Pathol 6:232–243. Schmeichel K.L. & Bissel M. J. 2003. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci 116: 2377–2388. Schwartz-Albiez R., Merling A., Spring H., Moller P. & Koretz K. 1995. Differential expression of the microspike-associated protein moesin in human tissues. Eur J Cell Biol 67: 189–198. Serrador J.M., Alonso-Lebrero J.L., del Pozo M.A., Furthmayr H., SchwartzAlbiez R., Calvo J., Lozano F. & Sanchez-Madrid F. 1997. Moesin interacts with the cytoplasmic region of intercellular adhesion molecule-3 and is redistributed to the uropod of T lymphocytes during cell polarization. J Cell Biol 138: 1409– 1423. Serrador J.M., Nieto M., Alonso-Lebrero J.L., del Pozo M.A., Calvo J., Furthmayr H., Schwartz-Albiez R., Lozano F., Gonzalez-Amaro R., Sanchez-Mateos P. & Sanchez-Madrid F. 1998. CD43 interacts with moesin and ezrin and regulates its redistribution to the uropods of T lymphocytes at the cell-cell contacts. Blood 91: 4632–4644. Shaffer M.H., Huang Y., Corbo E., Wu G.F., Velez M., Choi J.K., Saotome I., Cannon J.L., McClatchey A.I., Sperling A.I., Maltzman J.S., Oliver P.M., 66 Bhandoola A., Laufer T.M. & Burkhardt J.K. 2010. Ezrin is highly expressed in early thymocytes, but dispensable for T cell development in mice. PLoS One 5: e12404. Shcherbina A., Bretscher A., Kenney D.M. & Remold-O'Donnell E. 1999. Moesin, the major ERM protein of lymphocytes and platelets, differs from ezrin in its insensitivity to calpain. FEBS Lett 443: 31–36. Shibue, T. & Weinberg, R. 2011. Metastatic colonization: Settlement, adaptation and propagation of tumor cells in a foreign tissue environment. Semin Cancer Biol 21:99–106. Sizemore S., Cicek M., Sizemore N., Kwok P.N. & Casey G. 2007. Podocalyxin increases the aggressive phenotype of breast and prostate cancer cells in vitro through its interaction with ezrin. Cancer Res 67: 6183. Smith W.J., Nassar N., Bretscher A., Cerione R.A. & Karplus P.A. 2003. Structure of the active n-terminal domain of ezrin - Conformational and mobility changes identify keystone interactions. J Biol Chem 278: 4949–4956. Söderström M. 2010. Expression of ezrin, Bcl-2, and Ki-67 in chondrosarcomas. APMIS 118: 769–776. Song J. 2005. Estradiol-induced ezrin overexpression in ovarian cancer: a new signaling domain for estrogen. Cancer Lett 220: 57–65. Soriano, P., Montgomery C., Geske R. & Bradley A. 1991. Targeted disruption of the c-src proto-oncogene leads to osteopetrosis in mice. Cell 64:693–702. Sperka T., Geißler K.J., Merkel U., Scholl I., Rubio I., Herrlich P. & Morrison H.L. 2011. Activation of ras requires the ERM-dependent link of actin to the plasma membrane. PLoS ONE 6: e27511. Srivastava J., Elliott B.E., Louvard D. & Arpin M. 2005. Src-dependent ezrin phosphorylation in adhesion-mediated signaling. Mol Biol Cell 16: 1481–1490. Suni J., Narvanen A., Wahlstrom T., Aho M., Pakkanen R., Vaheri A., Copeland T., Cohen M. & Oroszlan S. 1984. Human placental syncytiotrophoblastic Mr 75,000 polypeptide defined by antibodies to a synthetic peptide based on a cloned human endogenous retroviral DNA sequence. Proc Natl Acad Sci U S A 81: 6197-6201. Takahashi K., Sasaki T., Mammoto A., Takaishi K., Kameyama T., Tsukita S. & Takai Y. 1997. Direct interaction of the Rho GDP dissociation inhibitor with ezrin/radixin/moesin initiates the activation of the Rho small G protein. J Biol Chem 272: 23371–23375. Takeuchi K., Kawashima A., Nagafuchi A. & Tsukita S. 1994. Structural diversity of band 4.1 superfamily members. J Cell Sci 107 ( Pt 7): 1921–1928. Tan J, Zhang C & Qian J. 2011. Expression and significance of Six1 and Ezrin in cervical cancer tissue. Tumour Biol. 32:1241–1247. Tran Quang ,C.C. 2000. Ezrin function is required for ROCK-mediated fibroblast transformation by the Net and Dbl oncogenes. EMBO J 19: 4565–4576. Tremmel M., Matzke A., Albrecht I., Laib A.M., Olaku V., Ballmer-Hofer K., Christofori G., Héroult M., Augustin H.G., Ponta H. & Orian-Rousseau V. 2009. A CD44v6 peptide reveals a role of CD44 in VEGFR-2 signaling and angiogenesis. Blood 114: 5236–5244. 67 Trofatter J.A., MacCollin M.M., Rutter J.L., Murrell J.R., Duyao M.P., Parry D.M., Eldridge R., Kley N., Menon A.G., Pulaski K., et al. 1993. A novel moesin-, ezrin-, radixin-like gene is a candidate for the neurofibromatosis 2 tumor suppressor. Cell 75: 826–826. Tsai, C., Buyong M. & Nussinov R. 2009. Protein–protein interaction networks: how can a hub protein bind so many different partners? TIBS 34:594–600. Tsukita S., Oishi K., Sato N., Sagara J., Kawai A. & Tsukita S. 1994. ERM family members as molecular linkers between the cell surface glycoprotein CD44 and actin-based cytoskeletons. J Cell Biol 126: 391–401. Turunen O., Wahlstrom T. & Vaheri A. 1994. Ezrin has a COOH-terminal actinbinding site that is conserved in the ezrin protein family. J Cell Biol 126: 1445– 1453. Turunen O., Sainio M., Jaaskelainen J., Carpen O. & Vaheri A. 1998. Structurefunction relationships in the ezrin family and the effect of tumor-associated point mutations in neurofibromatosis 2 protein. Biochim Biophys Acta 1387: 1–16. Tynninen O., Carpén O., Jääskeläinen J., Paavonen T. & Paetau A. 2004. Ezrin expression in tissue microarray of primary and recurrent gliomas. Neuropathol Appl Neurobiol 30:472–477. Valastyan, S. & Weinberg R. 2011. Tumor mestastasis: Molecular insights and evolving paradigms. Cell 147:275–292. Wald F.A. 2008. Atypical protein kinase C (iota) activates ezrin in the apical domain of intestinal epithelial cells. J Cell Sci121: 644–654. Wan X., Mendoza A., Khanna C. & Helman L.J. 2005. Rapamycin inhibits ezrinmediated metastatic behavior in a murine model of osteosarcoma. Cancer Res 65: 2406–2411. Wang D.S., Pan C.C., Lai H.C. & Huang J.M. 2013. Expression of HMGA1 and ezrin in laryngeal squamous cell carcinoma. Acta Otolaryngol 133: 626–632. Wang G., Mao W. & Zheng S. 2008. MicroRNA-183 regulates Ezrin expression in lung cancer cells. FEBS Lett 582: 3663–3668. Wei Y.C., Li C.F., Yu S.C., Chou F.F., Fang F.M., Eng H.L., Uen Y.H., Tian Y.F., Wu J.M., Li S.H., Huang W.W., Li W.M. & Huang H.Y. 2009. Mod Pathol 22: 1351– 1360. Weng W.H, Ahlén J., Aström K., Lui W.O. & Larsson C. 2005. Prognostic impact of immunohistochemical expression of ezrin in highly malignant soft tissue sarcomas. Clin. Cancer Res 11: 6198–6204. Wick W., Grimmel C., Wild-Bode C., Platten M., Arpin M. & Weller M. 2001. Ezrin-dependent promotion of glioma cell clonogenicity, motility, and invasion mediated by BCL-2 and transforming growth factor-beta2. J Neurosci 21: 3360– 3368. Wu B., Li J., Huang D., Wang W., Chen Y., Liao Y., Tang X., Xie H. & Tang F. 2011. Baicalein mediates inhibition of migration and invasiveness of skin carcinoma through Ezrin in A431 cells. BMC Cancer 11 :527–535. Wyckoff, J.B., Jones J.G, Condeelis J. & Segall J.E. 2000. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res 60: 2504–2511. 68 Xie J.J., Zhang F.R., Tao L.H., Lu Z., Xu X.E., Jian-Shen, Xu L.Y. & Li E.M. 2011. Expression of ezrin in human embryonic, fetal, and normal adult tissues. J Histochem Cytochem 59: 1001–1008. Xue, C., Wyckoff J., Liang F., Sidani M., Violini S., Tsai K-L., Zhang Z.-Y., Sahai E., Condeelis J. & Segall J.E. 2006. Epidermal Growth Factor Receptor Overexpression Results in Increased Tumor Cell Motility In vivo Coordinately with Enhanced Intravasation and Metastasis. Cancer Res 66:192–197. Yang H.S. & Hinds P.W. 2006. Phosphorylation of ezrin by cyclin-dependent kinase 5 induces the release of Rho GDP dissociation inhibitor to inhibit Rac1 activity in senescent cells. Cancer Res 66: 2708–2715. Yao X., Thibodeau A. & Forte J.G. 1993. Ezrin-calpain I interactions in gastric parietal cells. Am J Physiol 265: C36–46. Yeh C.N., Pang S.T., Chen T.W., Wu R.C., Weng W.H. & Chen M.F. 2009. Expression of ezrin is associated with invasion and dedifferentiation of hepatitis B related hepatocellular carcinoma. BMC Cancer 9: 233–242. Yonemura S., Matsui T., Tsukita S. & Tsukita S. 2002. Rho-dependent and independent activation mechanisms of ezrin/radixin/moesin proteins: an essential role for polyphosphoinositides in vivo. J Cell Sci 115: 2569–2580. Yonemura S., Hirao M., Doi Y., Takahashi N., Kondo T., Tsukita S. & Tsukita S. 1998. Ezrin/radixin/moesin (ERM) proteins bind to a positively charged amino acid cluster in the juxta-membrane cytoplasmic domain of CD44, CD43, and ICAM-2. J Cell Biol 140: 885–895. Youn J. 2009. An ezrin/calpain/PI3K/AMPK/eNOSs1179 signaling cascade mediating VEGF-dependent endothelial nitric oxide production. Circ Res 104: 50. Yu, Y., Khan J., Khanna C., Helman L., Meltzer P.S. & Merlino G. 2004. Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six-1 as key metastatic regulators. Nat Med 10: 175– 181. Yu Y., Davicioni E., Triche T.J. & Merlino G. 2006. The homeoprotein six1 transcriptionally activates multiple protumorigenic genes but requires ezrin to promote metastasis. Cancer Res 66: 1982–1989. Yu Y., Zeng P., Xiong J., Liu Z., Berger S.L. & Merlino G. 2010. Epigenetic Drugs Can Stimulate Metastasis through Enhanced Expression of the Pro-Metastatic Ezrin Gene. PLoS ONE 5: e12710. Yu, H., Mouw J. & Weaver V.M. 2011. Forcing form and function: biomechanical regulation of tumor evolution. TIBS 21: 47–56. Zaarour R.F., Chirivino D., Del Maestro L., Daviet L., Atfi A., Louvard D. & Arpin M. 2012. Ezrin ubiquitylation by the E3 ubiquitin ligase, WWP1, and consequent regulation of hepatocyte growth factor receptor activity. PLoS ONE 7: e37490. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz S., Ma'ayan A., Iyengar R., ja Geiger B. 2007. Functional atlas of integrin adhesome. Nat Cell Biol 9: 858–867. Zhang, X., Wang Q., Gerald W., Hudis C.A., Norton L., Smid M., Foekens J.A. & Massague J. 2009. Latent Bone Metastasis in Breast Cancer Tied to Src-Dependent Survival Signals. Cancer Cell 16: 67–78. 69 Zhang, X., Chen G., Wu T., Yan J. & Zhou J. 2012. Expression and clinical significance of ezrin in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer 13: 196–204. Zhao J., Zhang X. & Xin Y. 2011. Up-regulated expression of Ezrin and c-Met proteins are related to the metastasis and prognosis of gastric carcinomas. Histol Histopathol 26: 1111–1120. Zheng S., Huang J., Zhou K., Zhang C., Xiang Q., Tan Z., Wang T. & Fu X. 2011. 17β-Estradiol enhances breast cancer cell motility and invasion via Extra-Nuclear activation of Actin-Binding protein ezrin. PLoS ONE 6: e22439. Zhu L., Hatakeyama J., Chen C., Shastri A., Poon K & Forte J.G. 2008. Comparative study of ezrin phosphorylation among different tissues: more is good; too much is bad. Am J Physiol Cell Physiol 295: C192 - C202. Zhu J. 2012. Down-regulation of miR-183 promotes migration and invasion of osteosarcoma by targeting Ezrin. Am J Pathol 180: 2440–2451. Zhu L., Liu Y. & Forte J.G. 2005. Ezrin oligomers are the membrane-bound dormant form in gastric parietal cells. Am J Physiol - Cell Physiol 288: C1242– C1254.
© Copyright 2024