1. No category

Next Generation Sequencing (NGS) –
Revolution i den kliniska vardagen?
Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent
Laboratoriemedicinska länskliniken
Molekylärdiagnostik & FOU
Universitetssjukhuset Örebro
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
INNEHÅLL
 BAKGRUND – DNA
 HISTORA – DNA SEKVENSERING
 NEXT GENERATION SEQUENCING
 MISEQ - ILLUMINA
 DATA ANALYS
 KLINISKA APPLIKATIONER
 FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
 NGS SOM RUTINANALYS
 SAMMANFATTNING
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
BAKGRUND - DNA
1953
Dubbelhelix
–
Watson & Crick
James D. Watson, 1928
Francis Crick, 1916
Baser:
G=Guanin
C=Cytosin
A=Adenin
T=Thymin
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
HISTORA - DNA SEKVENSERING
1975
Sanger sekvensering
(stoppnukleotider)
Frederick Sanger, 1918
1977
Maximam - Gilbert sekvensering
(kemisk nedbrytningssekvensering)
Walter Gilbert, 1932
1977
Utveckling av Sanger sekvensering
G* C* A* T*
G*
G*
G*
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
HISTORA - DNA SEKVENSERING
1977
Bakteriofag X174
1984
Epstein-Barr-virus, 170 tusen bp
1987
1:a Helautomatiska DNA
sekvenserings maskinen ABI 370
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
HISTORA - DNA SEKVENSERING
1995
1:a bakteriegenomet Haemophilus influenzae 1,8 miljoner bp
1996
Pyrosekvensering – Pål Nyrén & Mostafa Ronaghi,
KTH, Stockholm
2001
1:a Humana genomet >3 miljarder bp
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
NEXT GENERATION SEQUENCING
2000
MPSS – (Lynx Therapeutics)
Referensgenom
–
Massive Parallell Signature Sequencing
2010
SMRT (Pacific Bioscience) –
”massiv parallell sekvensering”
Single Molecule Realtime Technology
http://www.pacificbiosciences.com/products/smrt-technology/
Ordlista
Sekvenseringsdjup = x coverage, dvs hur många gånger samma bas ”täcks in”
De novo sequencing = sekvensering av ”okända” organismer
Resequencing = sekvensering av känd organism där ett referensgenom
används i analysen, se bild ovan.
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Bibl. prep
2h
hands-on
4-6 h
MiSeq sekv
20 min
hands-on
1-2 dygn
Analys
Helt automatiserad på
MiSeq eller alt. mjukvara
~1 dygn
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Tagmentering – fragmentering och inmärkning
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Kluster generering Flödescell
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Sekvensering
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Ex. MiSeq run
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Flödesschema - NexteraXT
DNA preparation
Tagmentering
PCR-amplifiering
PCR-rening
Normalisering
(BioAnalyzer & qPCR)
Normalisering
(kulor)
Poolning
Kritiska steg för kvalitén
på NGS data
MiSeq
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
DNA preparationen: kvalité + mängd
Wizard® Genomic
Purification Kit (Promega)
Qubit ® 2.0 Fluorometer
(Invitrogen)
2 loopar of >1µL kollonier
resuspi Nuclei Lysis Solution
sedan enl protokoll
Qubit dsDNA BR assay
Kit (Molecular Probes)
Eluera i Tris-HCL utan EDTA
Späd till 0,2 ng/µL
(mät mellan spädningar)
Bra kvalité
Exakt mängd: 1 ng (5µL)
(Även andra metoder fungerar,
tex QIASymphony)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Tagmentering
>1 ng DNA
minskad fragmentering (för långa fragment)
<1 ng DNA
ökad fragmentering (för korta fragment)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Normalisering
Libary quality check –
Bioanalyzer with High Sensitivity DNA kit (Agilent)
1 µL ospätt bibliotek
Figuren visar ett lyckat sekvenserat
bibliotek.
Ett typiskt bibliotek visar en distribution
från ~250 bp till 1000 bp men även
fragment upp till 1500 bp går att
sekvensera.
qPCR
Koncentrationen av varje bibliotek fastställs
med qPCR från KAPA vars primerar binder
in till Illuminas p5 och p7-indexar.
Samma mängd in i poolen – mer lika resultat
dvs antal reads per isolat
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
Samarbete med Bioinformatiker?
Lägga ihop sekvenser till Contigs ”assembla”: SPAdes, CLC, Velvet Optimiser m.fl.
contigs.fasta
databaser för Typning av bakterier: BIGSdb, SeqSphere m.fl.
databaser för Antibiotikaresistens tex ResFinder, BLAST m.fl.
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
MiSeq BaseSpace Apps
+
OR
+
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database
http://pubmlst.org/databases/
Neisseria locus/sequence definitions database
– Extract finetype from whole genome data
Assembled FASTQ file
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER
Mikrobiologi:
 Utbrottsutredningar
– smittspårning, källan till smitta
 Epidemiologisk typning – övervakning och rapportering
 Karaktärisering av resistensmarkörer –
koll på mutationer, hitta nya
 Identifiera “okända” organismer – kända/okända
 Detektera kända virulensfaktorer
– ident. sjukdomsframkallande bakterier
 Patologi/kemi:
 Cancerpaneler – ta reda på cancertyp och sen rikta behandlingen
 SNP analys
– analysera enstaka positioner i gener kopplade till viss sjukdom
 Transkriptom analys
– karaktärisera uttryck av gener ex kolla vilka gener som är
påslagna hos sjuka resp friska (RNA – cDNA – NGS)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER
MRSA utbrott
Multiresistenta
Staphylococcus aureus
”SUPERBUG”
http://www.bbc.co.uk/news/health-20314024
2013-10-14
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER
EHEC - utbrott
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
KLINISKA APPLIKATIONER
Ötzi = Ismannen
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
SYFTE
Undersöka de genetiska grunderna till ökningen
av N. meningitidis serogrupp Y i Sverige
50
Number of isolates
45
40
B
35
30
C
25
20
Y
15
10
W-135
5
0
Year
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
Incidens per 100,000 invånare
0,25
Finetyping
0,2
Övriga (n=44)
0,15
Klon YIII (n=6)
7 x MLST gener
porA
porB
Klon YII (n=7)
0,1
Klon YI (n=28)
0,05
fetA
fHbp
penA
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
År
(n=85)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
FORSKNING till KLINISK APPLIKATION
Genome-Based Characterization of Emergent Invasive Neisseria
meningitidis Serogroup Y Isolates in Sweden from 1995 to 2012
Bianca Törös, Sara T. Hedberg, Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Dorothea M.C. Hill, Per Olcén,
Hans Fredlund, Holly B. Bratcher, Keith A. Jolley, Martin C.J. Maiden, Paula Mölling
Accepted in Journal of Clinical Microbiology April 2015
Illumina HiSeq,
Strain type YII
P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23
(cc23);
Oxford
University
2-55; 25; 22
1995-2012 (n=185)
Subtype 1
2006-2012
Subtype 2
1995-2012
Strain type YIII
Strain
type YI
P1.5-1,2-2,36-2;
F5-8; ST-23 (cc23);
P1.5-2,10-1,36-2;
F4-1;
3-36; 25; 1
ST-23 (cc23); 3-36; 25; 22
NGS
ger samma grova indelning som ”fintypning” av de 12 generna
YI består egentligen av två subtyper där Subtyp 1
är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
NGS SOM RUTINANALYS
Misstänkt bakteriell meningit
Rutintypningar: genetiska/fenotypiska
- dagligen/veckovis
Epidemiol övervakning – 2 ggr/år
Utbrottsutredningar – i stunden
Serogruppering/antibiogram
DNA prep
PCR
SP GBS MC 16S
HI LM
A
Y
C
B
W-135
Kapselgener
Identifiering
Genogruppering
Finetyping
MLST (7)
MLVA
fHbp
fetA
penA
porB
VR1 VR2,3
porA
Genosubtypning
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
NGS
SAMMANFATTNING
NGS – enorma möjligheter!!!







Epidemiologisk typning
Utbrottsutredningar
Karaktärisera resistensmarkörer
Identifiera okända organismer
Hitta virulensgener
Cancerpaneler
etc
Begränsningar
 Saknar Bioinformatiskt kunnande!!!
 Dataanalysen tar ganska lång tid och datakraft
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Tack!
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro