1. No category

FYS 3710 Biofysikk og medisinsk fysikk
2015
16 – Biofysiske metoder I : Optisk spektroskopi
Einar Sagstuen, Fysisk institutt, UiO
22.11.2015
1
Følgende time: Om optisk spektroskopi, i essens absorpsjons‐ og emisjons (fluorescens og fosforescens)
spektroskopi
Utgangspunkt: på molekylært nivå  kvantemekanikken råder:
Et gitt molekyl eksisterer i én av et sett diskrete energitilstander
H = He +Hv + Hr + Ht
He : kinetisk og potensiell energi til alle elektroner
Hv: Vibrasjonsenergi (kun kjernekoordinater)
Hr: Rotasjonsenergi
Ht: Translasjonsenergi
Listet i rekkefølgen til energinivådifferenser, dvs. relativ betydning.
22.11.2015
2
• God approksimasjon: Kryssledd mellom termene er små eller fraværende grunnet ulike tidsskalaer
• F.eks. elektronene i et system tilpasser seg kjernebevegelsene pga masseforskjeller
• Elektron‐ og vibrasjonstilstander uavhengig av rotasjonstilstandene til molekylet, osv.
I slike tilfeller kan den totale tilstandslikningen løses faktorielt (kan ‘separeres’):
Når
H   Hi
i
kan tilstanden skrives som
   i
i
Tilstandslikningen
H  E  H ii   ii
Hver term i den totale Hamiltonoperatoren
Da er også
dvs. vi har en tilstandslikning for E  i
i
Dvs. totalenergien er summen av energiene for de ulike bidragene til den totale Hamiltonoperatoren.
22.11.2015
3
Den dominerende termen i den totale Hamiltonoperatoren er de elektroniske bidragene:
Born‐Oppenheimer approksimasjonen.
2
H 
2me
22.11.2015
e2 2
2

i i  4 
2
0 i  j 2rij
1
 2
 m


1
4 0

i,
Z  e2
r ,i

konstant
1
4 0

 

Z  Z e 2
2r
4
Et gitt molekyl befinner seg på et gitt tidspunkt i én tilstand ψi med en bestemt energi Ei.
For en ansamling av molekyler vil disse være distribuert (Ni) mellom de ulike tilstandene til systement, avhengig av de relative energidifferenser.
1
E
N i  exp( i )
Boltzmann: der (Z = partisjonsfunksjonen) Z   exp(  Ek / kT )
kT
Z
k
Det er π og n‐tilstander som til en stor grad bestemmer elektroniske egenskaper, idet de har minst bindingsenergi.
Overganger: Spontane (relaksasjon) og induserte:
• Spontane overganger er (A) ofte forbundet med termisk utveksling til omgivelsene (eks. T1 relaksasjon i EPR eller NMR/MR), men kan også resultere i spontan emisjon av lys.
• Induserte overganger (B) alltid knyttet til absorpsjon eller emisjon av elektromagnetisk stråling (lys).
22.11.2015
5
Den dominerende termen i den totale Hamiltonoperatoren er de elektroniske bidragene:
Born‐Oppenheimer approksimasjonen.
2
H 
2me
22.11.2015
e2 2
2

i i  4 
2
0 i  j 2rij
1
 2
 m


1
4 0

i,
Z  e2
r ,i

konstant
1
4 0

 

Z  Z e 2
2r
6
Elektroniske tilstandsfunksjoner er tidligere diskutert: π, σ, n
Eksempel Benzene (ser bort fra 1s‐elektroner): 6 σ, C‐C
6 σ, C‐H
3 π, 6 2pz elektroner
π til/fra π*
overganger er
sterkt tillatte: løst
bundet, samme
symmetri.
σ* C‐C
σ* C‐H
π*
ϵ=0 (bindingsenergi)
π
σ C‐H
σ C‐C
12 el. i1s‐tilstander
For andre molekyler (ex. H2O) vil n‐tilstander ligge nær ϵ=0, men ikke nødvendigvis eksakt på 0 22.11.2015
7
(avvik fra 0 kan f.eks. skyldes H‐bindinger)
Ulike måter å beskrive overgangsdiagrammer:
a) Enkelt‐tilstander • Ett π‐elektron stimuleres fra π til π* tilstand.
• Ett n‐elektron fyller (spontant) opp den tomme plassen (hullet)
• π* elektronet de‐eksiterer (spontant) til n‐tilstanden
b) Total‐tilstander
• Grunntilstanden G eksiteres til en π π* tilstand (ett enslig elektron i hver av π og π*)
• π π* de‐eksiterer spontant til n π*
• n π* de‐eksitetrer spontant tilbake til grunntilstanden G
22.11.2015
8
Dersom E0 og E* representerer hhv. elektronisk grunntilstand og 1. elektronisk eksiterte tilstand, vil vibrasjonstilstandene for molekylet i hver av disse elektroniske tilstandene representere en slags finstruktur på elektronenerginivåene (uthevede linjer), og tilsvarende vil rotasjonstilstandene kunne representeres ved en ytterligere superfinstruktur for hvert av vibrasjonsnivåene (tynnere linjer).
22.11.2015
9
La oss betrakte et to‐atomig molekyl, f.eks. H2
Potensialenergifunksjonen beskriver elektron‐elektron, elektron‐
kjerne og kjerne‐kjerne potensialene som funksjon av kjerne‐kjerne‐
avstand R (det såkalte Morse‐potensialet).
Vibrasjons‐tilstandene er beregnet ved å bruke harmonisk oscillator‐
modellen:
med den første anharmoniske
korreksjonen.
H
H
Grunntilstanden
22.11.2015
H
H
R
H
H
10
For et multiatomært system kan tilsvarende figurer konstrueres, der en benytter en generalisert koordinat langs x‐aksen:
H
H
O
C
O
N
Eksempel på vibrasjonsmoder for et lite radikal, oxazolidinone.
H
Frank‐Condon prinsippet: Under en overgang vil hverken bevegelsemengde eller geometri forandres  overganger representeres alltid med vertikale linjer i slike energi‐koordinat (geometri) ‐ diagram.
Kaller derfor ofte ‘vertikale’ overganger. Den eksiterte tilstanden vil normalt ikke være i lavest mulig energi (litt ulik elektronfordeling som i tur vil påvirke kjerne‐
22.11.2015
11
konfigurasjonen.
H
Karakterisering av ulike typer overganger mellom ulike typer tilstander:
Jablonski‐diagram
S0 : Grunntilstand (singlett) . Sx : xte eksiterte singlett‐tilstand T1 : Første triplett‐tilstand. Singlett, Stot = 0  2S+1 = 1
Triplett, Stot = 1  2S+1 = 3
• Tripletten ligger noe lavere i energi enn singletten, grunnet spin exchange.
22.11.2015
12
• Absorpsjon av elektromagnetisk energi (lys)
• Internal Conversion (IC): vibrasjonell relaksasjon (VR), avgivelse av termisk energi
IC dekker her både VR og Sx ‐> Sx‐1
overganger da potensialflatene for høyere eksiterte singletter ofte overlapper. • Intersystem crossing (ISC): singlet‐triplett overgang.
• Quenching = IC: S1 til S0 uten strålingsavgivelse
• Fluorescens (F) : umiddelbar lysutsendelse
• Fosforescens (P) : forsinket lysutsendelse
• Forsinket fluorescens
22.11.2015
13
Ofte defineres en størrelse som kalles fluorescens‐utbytte, eller ‐
kvanteutbytte ved en spektroskopisk analyse:
Fluorscens‐utbyttet = # fotoner som fluorescerer/# fotoner som absorberes.
Dette utbyttet er <1 fordi vi har strålingsløse overganger (IC) og evt. andre quenchingsprosesser, og fosforescens som de viktigste tapsfaktorer.
Utbyttet kan måles indirekte på flere måter, bl.a. ved å måle ratekonstanter for for gitte prosesser.
For å fremme spesifikke prosesser, er det nyttig å kunne måle kvanteutbyttet for de ulike prosessene i et system. For eksempel, for fotodynamisk kreft‐
terapi er det viktig med et høyt utbytte av ISC, idet levetiden til triplett‐
tilstanden generelt er tilstrekkelig lang til at eksitasjons‐energien kan utnyttes til å drive andre prosesser i systemet før fosforescens finner sted.
22.11.2015
14
Stokes shift:
Emisjons‐spekteret er alltid rødforskjøvet ift absorpsjons‐
spekteret. Abs
Emi
Skyldes at luminiscensen alltid har lavere energi /høyere bølgelengde) enn absorpsjonen grunnet VR og/eller IC.
22.11.2015
15
Grunnleggende prinsipp for optisk spektroskopi. En frekvens‐variabel monokromatisk lyskilde sweep‐es over gitte bølgelengdeområder. Ulike molekyler – eller deler av molekyler, absorberer ved ulike bølgelengder. Lyskilde
Laser eller monokrom.
hv
S
Absorpsjons‐
detektor
Emisjons‐
detektor
22.11.2015
16
Beer –
Lamberts lov:
Absorbert lys i en infinitesmal tykkelse dz, der vi har en konsentrasjon c av enheter hver med absorpsjonskoeffisient ϵ(λ) (proporsjonal med σ, enheten er meter-2).
22.11.2015
 dI z  I z    c  dz
dI z

   c  dz
Iz
Integrerer fra z = 0 til b, I = hhv. I0 og IT:
IT  I 0 e
  cb
17
Ofte plottes absorpsjonen i form av optisk tettet A,
A = log10 (I0/IT) = ϵ’Cb
der ϵ’ kalles den molare ekstinksjonskoeffisienten, C er uttrykt i mol, ε’ = ε log10e = ε/2.303.
• ϵ’ er karakteristisk for absorpsjon av lys i molekyler (bl.a. levetid i tilstander), eller i ulike deler av et molekyl.
• Ulike deler av et molekyl kan inneholde grupper som absorberer i ulike deler av spekteret, f.eks. >COOH, ‐C(O)‐N(H)‐ , ‐NH2, phenyl, etc.
• ϵ er kjent for alle disse, og også totalspektrene for mange ulike (referanse)‐
molekyler.
• Metoden kan derfor benyttes diagnostisk.
• Måling av røde blodlegemer: Fe2+ og Fe3+: Måles med λ = 410‐420 nm
og/eller 550‐580 nm. • 13g/dl for kvinner, 15g/dl for menn er rådgivende ‘normalverdier’
22.11.2015
18
Optisk titrering av reaksjoner, ulike komponenter absorberer (eller emitterer) lys ved spesifikke og kjente bølgelengder:
A + B  C + D
λ1
22.11.2015
λ2
19
FYS 3710 Biofysikk og medisinsk fysikk
2015
17 – Biofysiske metoder II : Enzym‐kinetikk
Einar Sagstuen, Fysisk institutt, UiO
22.11.2015
20
Tema: Enzymer, enzymatisk funksjon og enzymkinetikk
• De fleste kjemiske/biologiske prosesser som finner sted er avhengig av ekstern drahjelp i form av energitilførsel.
• Sucrose + vann ↔ glucose + fruktose : hurtig i sure løsninger (pH=1) mens ved pH=7 vil reaksjonsraten være laaaaaaaaang. • Men i en celle (pH ~ 6 – 8)er den meget hurtig!
• Selv om produktene har lavere totalenergi enn reaktantene, finnes det en aktiveringsenergi , ΔE, som må overkommes. • Svaret på denne utfordringen er et enzym
som heter INVERTASE:
+ H2O
22.11.2015
21
22.11.2015
22
• Enzymer er spesifikke, bare en del av makromolekylet er direkte involvert i reaksjonen.
• Katalytisk, eller enzymatisk sete
• En spesiell struktur, ofte i en loop mellom ulike domener i et protein, eller knyttet til et metall‐ion.
Strukturen av et slikt ‘aktivt sete’ var det som ble undersøkt av Hsia og Piette med EPR spin label teknikk:
22.11.2015
antigen
spinnlabel
23
• Spesifisiteten er knyttet til muligheten for å danne temporære H‐bindinger mellom enzymet og substratet, men flere kontaktpunkter.
• I kontakten blir bindinger tøyd eller svekket
• Eksempel: Degradering av urea til ammonium og CO2:
NH2‐C(=O)‐NH2 + H2O  2 NH3 + CO2
• Urea er et plant molekyl. For at H‐bindinger skal dannes (vinner energi) må molekylet åpnes (en av aminogruppene roteres ut av planet) (koster energi). Ved dette gjøres tilgang for et vannmolekyl, reaksjonen skjer, og produktene forlater åstedet. Enzymet (urease) er klart til å motta et nytt substrat.
• Den energi som systemet «tilføres» vinnes gjennom dannelse av temporære H‐
bindinger
22.11.2015
24
Michaelis og Menten (1913 !!) postulerte et mellomliggende kompleks for å kunne forklare de observasjoner av reaksjonskinetikk som de gjorde.
S + E ↔ ES*  E + P
Nettoreaksjonen er S  P
 ES * 

S  E 
 E  P
k1
k2
k 1
k 2
Anta: [P]<< [S]  k‐2 neglisjeres (reaksjonen drevet til høyre). Dessuten er den fysiske geometrien vanligvis ikke reversibel.
Anta:[E] + [ES] = konstant = [E]0 (alt E er enten fritt eller bundet til S, E destrueres ikke)
Anta: [S] >> [E] (gyldig i de fleste system, det er mye mere S enn tilgjengelig E)
Definerer: Reaksjonsfarten v = J = d[P]/dt. Det følger at v = k2[ES] (definisjon av kjemiske reaksjonsrater)
**** Ønsker: Beregn v som funksjon av [S] og [E]0 som er eksperimentelt målbare
22.11.2015
initialverdier. 25
k1
k2

 ES * 
S  E 
 E  P
k 1
k 2
d [ ES ]
 k1[ S ][ E ]  (k1  k2 )[ ES ]
dt
[S] stor betyr at alt E er bundet i ES, dvs. [ES] = konstant, eller d[ES]/dt = 0.
Setter 0 på venstre side og løser mhp [ES]:
k1
k1  k2
1
[ ES ] 
[ S ][ E ] 
[ S ][ E ], der K m 
k1  k2
Km
k1
1
[ ES ] 
[ S ]([ E ]0  [ ES ])
Km
[ ES ](1 
[ ES ] 
22.11.2015
Km er Michaelis‐Menten konstanten, dimensjonen er mol (skyldes ulike dimensjoner til k1 og k‐1, k2)
[ S ] [ S ][ E ]0
)
Km
Km
[ S ][ E ]0
Km  [S ]
[ S ][ E ]0
v  k2 [ ES ]  v  k2
Km  [S ]
26
v  k2
[ S ][ E ]0
K m  [S ]
Michaelis – Menten relasjonen
La oss se på grensebetingelsene: 1) [S] >> Km
v  k2[E]0 . Denne verdien kalles ofte vmax – med høy substratkonsentrasjon er det kun kun [E]0 som begrenser reaksjonen. Altså: v  vmax for økende [S], en konstant verdi.
Reformulerer deretter:
2) [S]<< Km
vmax [ S ]
v
Km  [S ]
vmax
[S ]
v
Km
Nå er v er lineært avhengig av [S], skjærer 0 for [S]=0
22.11.2015
27
Det følger av våre grensebetingelser at funksjonsforløpet blir som følger:
og den initielle helningskoeffisienten er vmax/Km
Når v=1/2 vmax
følger av tilfellet 1) ovenfor : v 
vmax [ S ]
Km  [S ]
at [S] = Km
22.11.2015
28
• Slike hyperbolfunksjoner er (var) herkete rent eksperimentelt. Det er vanlig å invertere uttrykket for v:
1 Km  [S ] Km 1
1



v vmax [ S ] vmax [ S ] vmax
og plotte 1/v mot 1/[S].
• Dette kalles et Lineweaver‐Burk diagram med linearitet mellom 1/v og 1/[S]:
•
Svakheten her er at en gjerne får en opphopning av 1/[S]‐verdier for høye [S]:
Verdiene 1,2,3,4,5,6,7,8, … går over til 1, ½, 1/3, ¼,1/5, 1/6, 1/7, 1/8,…..
22.11.2015
29
• Vi har snakket tidligere om allosteriske eller inhibitoriske enzymatiske prosesser, spesielt med DNA replikasjon og proteinsyntese. Mange enzymatiske prosesser er inne i feed‐back løkker der et co‐enzym, eller en inhibitor er involvert.
• Kompetetiv inhibering: enzym danner komplex med enten S eller I
• Ikke‐kompetetiv inhibering: I og S binder uavhengig til E, prosess kun når bare S er bundet.
• Slike prosesser kan også analyseres med Michaelis‐Menten kinetikk. 22.11.2015
30
FYS 3710 Biofysikk og medisinsk fysikk
2015
18 – Biofysiske metoder III : Sedimentasjon og sentrifugering
Einar Sagstuen, Fysisk institutt, UiO
22.11.2015
31
Metoder for å bestemme og differensiere størrelse, form og masse på biologiske makromolekyler.
Startpunkt: Diffusjon av store molekyl i løsning.
Partikkel som beveger seg i en væske – tilfeldige støt med nabopartikler
Påvirkes således av krefter i en tidsfunksjon. Disse kan separares i to deler:
• En del er rettet perpendikulært på partikkelens fart og midles til 0 over tid (‘random’ prosess)
• En del er en viskøs friksjonskraft rettet mot partikkelens hastighet
F = ‐f v
• Friksjonskoeffisienten f avhenger bl.a. av partikkelens masse og form.
• Stokes fant at for sfæriske molekyl er
F=6πŋa
der a er partikkelens radius, og ŋ er løsningens viskositet.
• For ikke‐sfæriske molekyl er denne ikke korrekt, men det er overraskende hvor sfærisk formet en lang rekke proteiner (tertiærstruktur) er!
22.11.2015
•
•
32
• En videreutvikling er nå å la partikler diffundere gjennom en konsentrasjons‐
gradient i løsningen.
• Dersom høy konsentrasjon ett sted i en løsning, så vil netto bevegelse for en gitt partikkel være ut av dette området, mot et område med lavere konsentrasjon (Blindern T‐banestasjon‐syndromet). Bevegelsen er stokastisk, horisontalt motstående krefter midles ikke ut).
• Fick formulerte to lover for diffusjon i konsentrasjonsgradienter , vi skal benytte den 1. lov:
Antall partikler pr. tid (dn/dt) gjennom et tverrsnitt A og gjennom en konsentrasjonsgradient dc/dx er gitt ved
dn/dt = ‐D∙A∙ δc/δx
‐ tegn fordi bevegelsen er rettet mot gradienten.
D er diffusjonskonstanten og er knyttet til friksjonskoeffisienten
f via Stokes‐Einstein relasjonen: D = kT/f ≈ kT/6πŋa
x
Diffusjonskonstanten kan således måles eksperimentelt  informasjon om 22.11.2015
molekylets (partikkelens) dimensjon.
33
Vi skal imidlertid ta dette videre gjennom en diskusjon om sentrifugering i to smaksvarianter: • likevekts‐sedimentasjon (formelt)
• tetthetsgradient‐sedimentasjon (kvalitativt)
Likevekts‐sedimentasjon
•
•
•
•
Sentrifuge: 10.000 – 60.000 omdreininger
i minuttet (rpm)
Tillater simultan observasjon i løsningen
Molekylvekter, heterogenitet, bunnfelling
I et tyngdefelt (tyngdens akselerasjon g) vil det virke en netto kraft på en partikkel med masse m:
FG = mg – oppdrift mL
= mg – (ρL ∙ V) g der ρL er løsningsmiddelets tetthet, og V er partikkelens volum.
La ρ være partikkelens tetthet, da er V = m/ ρ, så er
FG = m(1‐ (ρL/ ρ)) g
22.11.2015
34
FG = m(1‐ (ρL/ ρ)) g
Motvirkes av friksjonskraften: Ff = f∙v i løsningen
Konstant fart når disse to kreftene er like store (i hver sin retning): f∙v = m(1‐ (ρL/ ρ)) g
‐ eller v = (mg/f )(1‐ (ρL/ ρ)) Benytter nå en sentrifuge for å skape et kunstig gravitasjonsfelt g = ω2r der r
er avstand fra sentrifugeaksen og ω er sirkelfrekvensen.
Definerer en ny enhet: Svedberg [s]: s=v/ω2r [s] = s (sekund). Sedimentasjonskonstanten, i enheter av 10‐13 sek.
Setter inn: s = (m/f)(1‐ (ρL/ ρ)) = (mD/kT) )(1‐ (ρL/ ρ)) når D = kT/f Stokker om: m = (s∙kT/D) (1‐ (ρL/ ρ))‐1 Får mol.vekter ved mult. med Avogadro (N) begge sider: M = (s∙RT/D) (1‐ (ρL/ ρ))‐1 22.11.2015
35
M = (s∙RT/D) (1‐ (ρL/ ρ))‐1
*** med s=v/ω2r
Kjenner vi D kan vi måle s og derved beregne M.
Komplikasjon: Det vil bygge seg opp en konsentrasjonsgradient over cellen, og partiklene vil derfor begynne å diffundere den andre veien. Det vil således etableres en likevekt mellom sedimentasjon på den ene siden og diffusjon på den andre (husk – her er det et isotropt løsningsmiddel).
Antall partikler som sedimenterer gjennom et tverrsnitt A pr. tid, dn/dt, er gitt ved (v=konstant):
dn = A∙c∙v∙dt*  dn/dt (per areal) = v∙c
*alle partikler i volumet Avdt=Adx vil passere tversnittet i tiden dt
Tilbakediffusjonen er gitt ved Fick’s lov
dn/dt = ‐D∙A∙ δc/δx eller dn/dt = ‐D∙ δc/δx per areal
Likevekt – stopp i diffusjon vil skje når D∙ δc/δx = v∙c
Separerer variable:
dc/c = (v/D)dx = (Mω2/RT) ∙ (1‐ (ρL/ ρ)) r dr fra ***
22.11.2015
36
Integrerer mellom to konsentrasjoner c1 og c2 ved respektive avstander r1
og r2:
ln(c1/ c2) = (Mω2/RT) ∙ (1‐ (ρL/ ρ))∙ ½ ∙(r22 – r12)
Eller løst mhp M:
2RT ln(c2 / c1 )
M
(1  L /  )2 (r22  r12 )
Dersom vi er i stand til å måle relative konsentrasjoner ved to avstander fra senteraksen i sentrifugen, kan M bestemmes.
Denne metoden er således uavhengig av størrelse og form til partiklene.
Tetthetsgradient‐metoden
Elegant anvendelse av sentrifugen – kalles tetthetsgradient sentrifugering. Denne er basert på at løsningsmiddelet ikke er isotropt, men har en gradient som må tas inn i betraktningene.
22.11.2015
37
Eksempel: For en 7.7 mol løsning av CsCl ved 45.000 rpm vil løsningen ved likevekt få en tetthet som ligger i området
1.64 < ρ < 1.76 g/cm3 Tetthetsgradienten er 0.12 g/cm4
Tettheten til Cs‐saltet av DNA ligger i dette området.
Dersom litt Cs‐DNA tilsettes løsningen av CsCl, vil DNA bare sedimentere til den radius hvor tetthetene er like. Dersom vi har heterogent DNA, vil de ulike komponentene samles i hver sine «bånd» i sentrifugecellen, karakteristiske for sine tettheter.
Og da er vi tilbake til Meselsohn og Stahl‐eksperimentet ifra 1958 med replikasjon av DNA som problemstilling:
22.11.2015
38
DNA replikasjon
22.11.2015
39
Meselson –Stahl eksperimentet, 1958
DNA-replikasjonen
Matthew S. Franklin W.
Meselson
Stahl
(1930-)
22.11.2015
konservativ?
dispersiv? eller semikonservativ?
(1929-)
40
Meselson –Stahl eksperimentet, 1958
DNA-replikasjonen
Matthew S. Franklin W.
Meselson
Stahl
(1930-)
DNA-replikasjonen er semikonservativ
22.11.2015
(1929-)
41
Originale data ifra Meselsohn‐Stahl
eksperimentet.
Sverting av lysfølsom film er benyttet som primærdetektor, deretter er filmen scannet mhp svertingsgraden som mål for mengden absorberende materiale.
22.11.2015
42