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Universitat Ulm
Zentrum fur Innere Medizin
Klinik fur Innere Medizin II
(Kardiologie, Angiologie, Pneumologie, Sport- und Rehabilitationsmedizin)

Arztlicher
Direktor: Prof. Dr. med. V. Hombach
Der Eekt von Mycophenolatmofetil im humanen
koronaren 3D-Leukozytenangrismodell
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultat der Universitat Ulm
vorgelegt von
Christian Michael Weber
aus Augsburg
2006
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin
1. Berichterstatter: PD Dr. Rainer Voisard
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Martin Griesshammer
Tag der Promotion: 25.10.2007
Inhaltsverzeichnis
Abkurzungsverzeichnis
ii
1 Einleitung
1
2 Material und Methoden
4
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
2.14
Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fixierung und Einbettung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Farbung und Immunzytochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Puerlosungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Verbrauchsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mikroskopie und Fotograe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kultivierung der koronaren Endothelzellen und glatten Muskelzellen
Aufbau und Kultivierung des Translter-Co-Kultur-Systems . . . .
Gewinnung der Monozyten mittels magnetaktivierter Zellsortierung
Versuchsbeschreibung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Aufarbeitung der Translter-Co-Kultur . . . . . . . . . . . . . . . .
Toluidinblaufarbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Ergebnisse
3.1
3.2
3.3
3.4
Adhasion . . . . . . . . . . . .
Transmigration . . . . . . . . .
Proliferation . . . . . . . . . . .
Qualitatskontrolle Toluidinblau
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4 Diskussion
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
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Pathophysiologie der fruhen Atherosklerose
Eigenschaften von Mycophenolatmofetil . .
Adhasion . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transmigration . . . . . . . . . . . . . . .
Proliferation . . . . . . . . . . . . . . . . .
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4
7
8
10
10
10
11
11
12
14
16
17
21
22
24
24
26
28
29
30
30
31
33
37
39
5 Zusammenfassung
41
6 Literaturverzeichnis
43
Danksagung und Widmung
49
i
Abku
rzungsverzeichnis
AEC = 3-Amino-9-Ethylcarbazol
ATP = Adenosintriphosphat
BMS = reine Metallstents
BRDU = 5-Bromo-2-desoxyuridin
CAD = koronare Herzerkrankung
CD = cluster of dierentiation, Antigen mit entsprechender Nummerierung
DAB = 3,3-Diaminobenzidin
DC = dendritische Zelle
DES = medikamentenfreisetzende Stents
DNA = Desoxyribonukleinsaure
DP = Diphosphat
EC = Endothelzelle
EBM = Basalmedium fur Endothelzellen
EDTA = Ethylendiamintetraessigsaure
EGM = Wachstumsmedium fur Endothelzellen
FCS = fetales Kalberserum
GF = Gesichtsfeld
HCAEC = humane koronararterielle Endothelzellen
HCMSMC = humane koronararterielle glatte Muskelzellen der Media
HGPRTase = Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
HUVEC = humane umbilikalvenose Endothelzellen
ICAM-1 = Intrazellulares Zelladhasionsmolekul 1
ICD = International Classication of Diseases
IMPDH = Inosinmonophosphatdehydrogenase
iNOS = induzierbare NO-Synthase
LDL = low density lipoprotein
LFA-1 = Lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen 1
MACS = magnetaktivierte Zellsortierung
ii
Abkurzungsverzeichnis j iii
MCP-1 = Monocyte chemoattractant protein 1
MHC-II = Haupthistokompatibilitatskomplex II
MMF = Mycophenolatmofetil
MP = Monophosphat
MPA = Mycophenolat (aktiver Metabolit von MMF)
NF-B = nuklearer Transkriptionsfaktor B
NO = Nitritoxid
OP = Operation
ox-LDL = oxidiertes low density lipoprotein (LDL)
PBS = Phosphat-gepuerte Kochsalzlosung
PECAM-1 = Platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (=P-Selektin)
PCI = perkutane Koronarintervention
PRPP = 5'-Phosphoribosyl-1'-pyrophosphat,
PTCA = perkutane transluminale Koronarangioplastie
RNA = Ribonukleinsaure
SMBM = Basalmedium fur glatte Muskelzellen
SMC = glatte Muskelzelle
SmGM = Wachstumsmedium fur glatte Muskelzellen
TCK = Translter-Co-Kultur
TNF = Tumornekrosefaktor-
TNS = Trypsinneutralisationslosung
TP = Triphosphat
VCAM-1 = Vaskulares Zelladhasionsmolekul 1
VLA-4 = very late antigen 4
vWF = von-Willebrand-Faktor
iii
1 Einleitung
Trotz groer Bemuhungen und Investitionen in die Forschung und Therapie stellen
kardiovaskulare Erkrankungen (CAD) noch immer einen groen Anteil an der Gesamtmortalitat in Deutschland und in den Vereinigten Staaten von Amerika. So starben
2004 laut Statistischem Bundesamt in der Bundesrepublik 266 630 Menschen an CAD,
dies entspricht einem Anteil von 32,6 % an der Jahresgesamtmortalitat. In den Vereinigten Staaten liegt der gleiche Prozentanteil fur das Jahr 2003 bei 28,0 %. Es lassen
sich hierbei geschlechts- und altersspezische Unterschiede (junge Frauen sterben prozentual am seltensten an CAD, altere Manner am haugsten) feststellen. Eine erhohte
prozentuale Gesamtmortalitat der weiblichen Bevolkerung beruht auf der Verlagerung
der Sterblichkeit ins hohere Alter, so dass entzundlich/degenerative Erkrankungen wie
die koronare Herzerkrankung in einer entsprechend hoheren relativen Mortalitat zu
Buche schlagen. In jeder Altersstufe liegt jedoch die absolute Mortalitat (Sterbefalle je
100 000 Personen) der Frauen deutlich (20{70 %) unterhalb derjenigen der mannlichen
Bevolkerung (52). Die genannten Statistiken beruhen auf einer Datenaquise mittels landesublicher Todesbescheinigungen, ausgestellt von Krankenhaus- und Hausarzten und
ausgewertet durch Kodierungsspezialisten der mit der statistischen Erfassung (nach der
internationalen Klassikation fur Krankheiten ICD-10) anvertrauten Institute.
Tabelle 1: Prozentualer Anteil der durch kardiovaskulare Erkrankungen bedingten
Mortalitat an der jeweiligen Gesamtmortalitat (11; 52)
Land
Altersgruppe
40-44
50-54
60-64
70-74
80-84
Gesamt
Deutschland
(2004)
Manner
Frauen
17.8 %
9.0 %
21.3 %
10.7 %
23.9 %
15.8 %
29.7 %
27.0 %
35.4 %
37.9 %
29.7 %
35.1 %
USA
(2003)
Manner
Frauen
18.7 %
13.5 %
26.2 %
16.4 %
28.5 %
20.1 %
28.4 %
23.8 %
31.7 %
30.1 %
28.0 %
28.0 %
Die CAD ist zu einem groen Teil auf atherosklerotische Lasionen zuruckzufuhren, so
dass sich die oben angefuhrte Mortalitat zu einem hohen Prozentsatz auf die Atherosklerose und ihre Komplikationen zuruckfuhren lasst. Hierbei sind verschiedene Entitaten
mit einer dennoch ahnlichen Pathophysiologie zu erwahnen: Spontane Atherosklerose, beschleunigte Atherosklerose (post transplantationem), Restenose nach perkutaner
Koronarintervention (PCI) und Atherosklerose venoser Bypasse (62).
Die PCI durchlief eine rasante Entwicklung und ersetzt seit der ersten perkutanen
transluminalen Angioplastie (PTCA) am Menschen im Jahr 1977 durch A. Gruntzig
(20; 21) bei immer umfangreicheren Patientenkollektiven eine Bypassoperation und sichert die Vitalitat des Myokard im Infarktfall. Limitierender Faktor ist trotz initial
hervorragender Ergebnisse nach wie vor die Restenose, d.h. eine Verengung des Arte-
1
j2
rienlumens um mehr als 50 % (nicht notwendigerweise verbunden mit entsprechender
Symptomatik) (39). Die in den 80er Jahren entwickelten Metallstents (BMS) reduzierten die primar sehr hohen Restenoseraten signikant, in den Studien um bis zu 30 %
(16; 47), allerdings nicht uber eine Reduktion der neointimalen Proliferation, die ganz
im Gegenteil eher zunimmt, sondern durch ein primar deutlich weiteres Gefalumen
als nach PTCA allein (17). So treten bei dem Einsatz von BMS im Idealfall bei 10{
20 % der Patienten, im Realfall bei komplexen Lasionen jedoch eher bei 20{30 % der
Patienten klinische (Tod, Myokardinfarkt) und angiographische Restenosen (Re-PCI,
Bypass-OP) auf (15). Mittlerweile liegen mittelfristige Ergebnisse mit beschichteten,
medikamentenfreisetzenden Stents (DES) vor, die eine klinisch (Tod, Myokardinfarkt)
nicht relevante Reduktion dieser Restenoseraten zeigen. Daruber hinaus zeigen sich
im wesentlichen angiographische Dierenzen im Rahmen der Re-PCI (angiographische Teilkomponente des Endpunkts), z.B. bei den Studien SIRIUS oder TYPHOON
(27; 50). Dieser Endpunkt hat nur bedingte Aussagekraft, da Lasionen aufgrund des
Studienprotokolls ohne entsprechende Symptomatik ab dem denierten Restenosekriterium von 50 % des initialen Arterienlumens erneut interveniert wurden und somit
vorhandene Unterschiede durch die binare Gestaltung dieses Kriteriums verstarkt wurden (26; 53). Nach anfanglicher Euphorie ist mittlerweile auch bei DES Nuchternheit
eingekehrt, da nach Fallberichten (34) und ersten Kohortenstudien (60) der scheinbare
angiographische Vorteil sich klinisch in einer erhohten Inzidenz akuter und todlicher
Spatstentthrombosen, haug nach Absetzen von Clopidogrel, manifestiert. Nachdem
die interventionelle Kardiologie sich immer weiter auf die Behandlung komplexerer
Lasionen inklusive Hauptstammstenosen verlegt, liegt im Realfall und je nach Komplexitat der Lasion die Restenoserate oftmals hoher als oben angefuhrt.
Es stellt sich nach wie vor die Frage nach einer systemischen Behandlung der Restenose
bzw. nach lokalen Alternativen. Bei dem systemischen Ansatz wurde eine ganze Reihe
von Medikamenten, die im Tierversuch erfolgsversprechend schienen, in klinischen Studien am Menschen getestet und wegen fehlender Wirkung wieder verworfen (15). Ein
moglicher Grund neben den Speziesunterschieden konnte in dem Einsatz von unzureichenden Plasmakonzentrationen liegen, die im menschlichen Organismus aufgrund des
hoheren Toxizitatspotentials haug deutlich niedriger als im Tierversuch lagen. Ein vielversprechendes Medikament ist hierbei Mycophenolatmofetil (CellCeptR , MMF), das
bereits in niedrigen Konzentrationen (50 g/ml), welche in vivo ca. 1 Stunde nach oraler Einnahme, wie von Bullingham et al. (9) in einem Review beschrieben, annahernd
erreicht werden konnen, eine statistisch totale Hemmung (100 %, p<0.01) der Proliferation von humanen koronaren glatten Muskelzellen der Media (HCMSMC) in der
Zellmonokultur aufweist (58). Die Proliferation von HCMSMC ist einer der zentralen
Schritte der Restenose und der fruhen Atherosklerose (39; 44; 45). Andere Arbeitsgruppen konnten mit MMF erfolgreich unterschiedliche Aspekte der Atherosklerose
j3
im Tierversuch (18; 41; 43; 46) gunstig beeinussen. Aus diesem Grund untersuchten
wir MMF in der oben genannten Konzentration in einem etablierten, komplexen dreidimensionalem Translter-Co-Kultur-(TCK)-Modell (55; 56), mit dem die Restenose
und fruhe Atherosklerose simuliert werden kann und im Gegensatz zu einer reinen Monokultur auch Interaktionen zwischen humanen koronaren Endothelzellen (HCAEC)
und HCMSMC berucksichtigt werden. Zielgroen waren dabei Adhasion und Migration/Chemotaxis aktivierter Monozyten sowie die reaktive Proliferation der HCMSMC
im Modell.
2 Material und Methoden
2.1 Zellkultur
2.1.1 Zellen
Humane koronararterielle Endothelzellen (HCAEC, Cambrex Bio Science,
Verviers, Belgien; fruher: BioWhittaker Europe)
Humane koronararterielle glatte Mediamuskelzellen
(HCMSMC, Cam-
brex Bio Science, Verviers , Belgien)
Humane Monozyten: Monozyten wurden aus dem Vollblut eines gesunden und
gleichbleibenden Spenders der Laborgruppe (Blutgruppe 0) aus der Vena mediana
cubiti gewonnen. Die Blutentnahme erfolgte mit einer 5 ml Monovette mit 0,5 ml
Na-Citrat-Losung (9NC, Sarstedt, Nurnbrecht).
2.1.2 Monozytenisolierung
2.1.2.1 Anreicherung der peripheren mononuklearen Zellen
Biocoll-Trennlosung (Dichte: 1,077 g/ml; Biochrom AG, Berlin) zur Gewinnung peripherer mononuklearer Blutzellen.
Phosphate-Buered Saline (PBS steril; Gibco BRL, Eggenstein) als Puer.
PBS + 2 mM Ethylendiamintetraessigsaure (EDTA) (Sigma, Deisenhofen) als Puer: 500 ml PBS + 0,372 g EDTA (Sigma, Deisenhofen) steril
ltrieren.
Steriler Filter: 0,22 m Filter mit Fullglocke (Millipore, Bedford, MA, USA)
oder FP030/3 0,2 m steril, pyrogenfrei (Schleicher und Schuell, Dassell).
2.1.2.2 Monozytenselektion mittels magnetischer Zellsortierung
30 m Pre-Seperation-Filter
aus Nylon (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch
Gladbach)
MACS multistand (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach): Magnetischer
Zellsortierer
MidiMACS Seperation Unit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach):
Trenneinheit
4
2.1 Zellkultur j 5
MidiMACS LS Column (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach): Trennsaule
Monocyte Isolation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach): FcR
Blocking Reagent (humane Immunglobuline), Hapten-Antikorper Cocktail (Mischung monoklonaler hapten-konjugierter CD3, CD7, CD19, CD45RA, CD56 und
Anti-IgE-Antikorper), MACS Anti-Hapten-MicroBeads (Microbeads konjugiert
an einen monoklonalen Anti-Hapten-Antikorper) zur Monozytenisolation durch
Depletion nichtmonozytarer Zellen.
Puer fur MicroBeads-Markierung: 90 ml PBS
+ 2 mM EDTA, 10 ml humanes
Serum (PAA, Colbe), 0,5 g bovines Serumalbumin (BSA; Sigma, Deisenhofen)
steril ltrieren.
2.1.3 Kulturmedien
Endothelial Cell Growth Medium (EGM): Als Basismedium wurde Endothelial Cell Basal Medium (EBM; Cambrex Bio Science, Verviers , Belgien) verwendet und mit folgenden Substanzen versetzt (je 500 ml; ebenfalls Cambrex Bio
Science, Verviers , Belgien):
{
{
{
{
{
{
Fetal calf serum (FCS) 25 ml =
b 5%
Bovine brain extract 6 mg =
b 12 g/ml
Epidermal growth factor 5 g =
b 10 ng/ml
Hydrocortison 0,5 mg =
b 1 g/ml
Gentamicin 25 mg =
b 50 g/ml
Amphotericin 25 g =
b 50 ng/ml
Smooth Muscle Cell Growth Medium (SmGM): Als Basismedium wurde
Smooth Muscle Basal Medium (SmBM; Cambrex Bio Science, Verviers , Belgien)
verwendet und mit folgenden Substanzen versetzt (je 500 ml; ebenfalls Cambrex
Bio Science, Verviers , Belgien):
{
{
{
{
{
{
Fetal calf serum (FCS) 25 ml =
b 5%
Fibroblast growth factor 1 g =
b 2 ng/ml
Epidermal growth factor 250 ng =
b 0,5 ng/ml
Insulin 2,5 mg =
b 5 g/ml
Gentamicin 25 mg =
b 50 g/ml
Amphotericin 25 g =
b 50 ng/ml
2.1 Zellkultur j 6
2.1.4 Enzymlosung
Trypsin/EDTA: 0,25 mg/ml Trypsin in EDTA (Cambrex Bio Science, Verviers,
Belgien)
Neutralisationslosung (TNS) zur Inaktivierung obengenannter Trypsin/EDTALosung (Cambrex Bio Science, Verviers, Belgien).
2.1.5 Adhasionsfaktoren zur Beschichtung der Kulturaschen
Kollagen Typ 1 Gebrauchslosung: 1 mg Kollagen Typ 1 (Rattenschwanz; Sigma,
Deisenhofen) gelost in 1 ml 0,1-molarer Essigsaure (Merck, Darmstadt)
2.1.6 Testsubstanz
Mycophenolatmofetil: CellCeptR 500 mg, gelost in 10 ml Aqua ad injectabilia (Kon-
zentration 50 mg/ml), Verdunnung 1:10, sterile Filtration, Zugabe zu SmGM bzw.
EGM in Verdunnung 1:100 (Zielkonzentration 50 g/ml)
2.1.7 Zytokin
TNF-: Tumornekrosefaktor (Sigma, Deisenhofen)
2.1.8 Bromdesoxy-Uridin-Markierung
Stammlosung (Serva, Heidelberg): 0,61 mg 5-Brom-2'-Deoxyuridin, 0,53 mg 2'Deoxycytidin-HCl gelost in 1 ml H2 0, steril ltriert.
2.1.9 Kulturgefae
Kulturschalen zur Einzelkultivierung:
{ Kulturschalen 100 mm: Wachstumsache 78,5 cm2 (Becton Dickinson,
Heidelberg).
{ Kulturaschen: 260 ml Zellkulturasche (Greiner, Nurtingen)
Translter-Co-Kultur-Schalen (siehe auch Abb. 1):
{ Petrischale: Duran Glas, 80 mm x 20 mm (VWR, Ulm)
{ Silikonring: Sylgrad 184 Elastomer-Kit (Sasco, Putzbrunn)
2.2 Fixierung und Einbettung j 7
{ Polycarbonatrahmen bestehend aus einem inneren und einem aueren Ring:
R (Rei GmbH, Reutlingen), verarbeitet in der Werkstatte der
Makrolan
Universitat Ulm, 50 mm, farblos
{ Silikonschlauch: 0,5 mm x 1,5 mm, kreisformig 50 mm (Reichelt-Chemie,
Heidelberg)
{ Polycarbonatlter: 50 mm, Porengroe 5 m (Costar Corning, Bodenheim)
2.1.10 Kollagenbeschichtung der Polycarbonatlter
Kollagen Typ 1 Gebrauchslosung (siehe 2.1.5)
Glutaraldehyd 25 % (Merck, Darmstadt)
Ammoniak 25 % (Merck, Darmstadt)
2.2 Fixierung und Einbettung
2.2.1 Fixierung
Formaldehyd 4 % (Merck, Darmstadt)
Methanol (Merck, Darmstadt)
2.2.2 Einbettung
Ethanol (Merck, Darmstadt)
Propylenoxid (Merck, Darmstadt)
Aralditgebrauchslosung
{ Araldit CY 212, 113 g (Serva, Heidelberg)
{ Harter HY 964, 111 g (Serva, Heidelberg)
{ Beschleuniger DY 964, 5 g (Serva, Heidelberg)
Substanzen 30 Minuten verruhren und bei -20 C lagern.
2.2.3 Aufbereitung
2.2.3.1 Schneiden
Mikrotom: Leica ULTRACUT (Leica Microsystems, Wetzlar)
Glasmesserbrecher: Leica EM KMR2 (Leica Microsystems, Wetzlar)
2.3 Farbung und Immunzytochemie j 8
2.2.3.2 Auslosung von Araldit
Methanol (Merck, Darmstadt)
1,2-Propylenoxid (Merck, Darmstadt)
Kaliumhydroxid (Merck, Darmstadt)
2.3 Farbung und Immunzytochemie
2.3.1 Farbstoe und Farbelosungen
Toluidinblau-Losung:
{ 1 g Natriumtetraborat (Merck, Darmstadt) in 100 ml destilliertem Wasser
losen,
{ 1 g Toluidinblau (Merck, Darmstadt) zugeben,
Losung unter Ruhren auf 60 C erwarmen, mehrfach ltrieren, vor Gebrauch 1:1
mit destilliertem Wasser mischen.
Hamalaun (Chroma Gesellschaft Schmid GmbH, Kongen)
2.3.2 Immunzytochemie
2.3.2.1 Erstantikorper
Maus-Anti-Bromodeoxyuridin (BRDU, Dakopatts, Hamburg): Monoklonaler Mausantikorper gegen das Thymidinanalogon BRDU, 1:100 verdunnt mit 0,5 % Tween
80 (siehe 2.4)
Kaninchen-Anti-von Willebrand Faktor (vWF, Dakopatts, Hamburg): Polyklonaler Kaninchenantikorper gegen das von-Willebrand-Protein, das als Marker von
Endothelzellen dient, 1:100 verdunnt mit PBS (siehe 2.4)
Maus-Anti-CD68 (Dakopatts, Hamburg): Monoklonaler Mausantikorper gegen
CD68, das als Marker von Monozyten dient, 1:100 verdunnt mit PBS
2.3 Farbung und Immunzytochemie j 9
2.3.2.2 Zweitantikorper
Pferd-Anti-Maus biotinyliert (Vektor, Alexis, Grunberg): Pferdeantikorper gegen
Maus-IgG, 1:100 verdunnt mit PBS
Ziege-Anti-Kaninchen biotinyliert (Vektor, Alexis, Grunberg): Ziegenantikorper
gegen Kaninchen IgG, 1:100 verdunnt mit PBS
Ziege-Anti-Maus-Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC; Dianova Immunotech, Hamburg): Mit Tetramethylrhodaminisothiocyanat konjugierter Ziegenantikorper gegen Maus IgG, 1:30 verdunnt mit PBS
2.3.2.3 Normalseren
Pferde-Normalserum (Dianova Immunotech, Hamburg), 1:10 verdunnt mit PBS
Ziegen-Normalserum (Dianova Immunotech, Hamburg), 1:10 verdunnt mit PBS
2.3.2.4 Reagenzien
Avidin-Biotin-Peroxydase (AB-Reagenz; Vektor, Alexis, Grunberg)
Diaminobenzidin-Substrat-Kit (DAB; Vektor, Alexis, Grunberg)
{
{
{
{
5 ml destilliertes H2 0 mit 2 Tropfen buer stock mischen,
4 Tropfen DAB stock solution zugeben, mischen,
2 Tropfen hydrogen peroxide solution zugeben, mischen,
2 Tropfen Nickel-Losung zugeben, mischen.
Aminoethylcarbazol-Substrat-Kit (AEC; Vektor, Alexis, Grunberg)
{ 5 ml destilliertes H2 0 mit 2 Tropfen buer stock mischen,
{ 3 Tropfen AEC stock solution zugeben, mischen,
{ 2 Tropfen hydrogen peroxide solution zugeben, mischen.
Wasserstoperoxid (30 %, Merck, Darmstadt)
Salzsaure 1 N (Merck, Darmstadt) zur Denaturierung der Desoxyribonukleinsaure
(DNA)
2.4 Puerlosungen j 10
2.3.2.5 Einschlussmedien
Mowiol 4-88 (Calbiochem, La Jolla, CA, USA): Einschlussmedium fur CD68Immunuoreszenz
Entellan (Merck, Darmstadt): Einschlussmedium fur Toluidinpraparate
Kaisers Glyceringelatine (Merck, Darmstadt): Einschlussmedium fur vWF/BRDUFarbungen
2.4 Puerlosungen
Phosphat-gepuerte Kochsalzlosung (PBS steril; Gibco BRL, Eggenstein) ohne
Magnesium/Calcium
PBS+ (steril; Gibco BRL, Eggenstein) mit Magnesium/Calcium
PBS (fur die Immunhistochemie): 5000 ml Aqua bidestillata, hierin gelost:
{
{
{
{
40 g NaCl (Fluka Chemie, Buchs, Schweiz)
1,0 g KCl (Merck, Darmstadt)
1,0 g KH2 PO4 (Merck, Darmstadt)
7,2 g Na2 HPO4 2 H2 O (Merck, Darmstadt)
0,5 % Tween 80 (Serva, Heidelberg): 5 ml Tween 80 gelost in 995 ml PBS
2.5 Verbrauchsmaterial
Pipetten, Becherglaser, Erlenmeyerkolben, Messzylinder, Objekttrager, Deckglaser (alles VWR, Ulm)
2.6 Mikroskopie und Fotograe
Mikroskopie: Optiphot-Mikroskop mit Auichtuoreszenz
Digitalkamera: Coolpix (Nikon, Dusseldorf)
2.7 Gerate j 11
2.7 Gerate
Autoklav (Integra Biosciences, Fernwald)
Laminarow-Arbeitsbank (BDK, Luft- und Reinraumtechnik, Sonnenbuhl)
Zentrifugen: Varifuge 3.0R (Heraeus, Fellbach)
Inkubatoren: B5061 5 % CO2 und Hera cell (Heraeus, Fellbach)
Zellcounter: Casy TTC / 2.04 (Scharfe System, Reutlingen)
2.8 Kultivierung der koronaren Endothelzellen und glatten
Muskelzellen
2.8.1 Aussaat
Die tiefgefrorenen Zellen wurden nach dem Auftauen in Kulturaschen in einer Konzentration von ca 1104 Zellen / cm2 ausgesat. Die Kulturaschen der Endothelzellen
(HCAEC) wurden dabei vor Aussaat mit 200 l Kollagen, gelost in 5 ml PBS , benetzt, 30 Minuten im Brutschrank inkubiert und erst anschlieend mit Endothelzellen
beschickt, um eine bessere Anhaftung der Zellen zu ermoglichen.
2.8.2 Kultivierung
Die Zellkulturen wurden in einem Brutschrank (CO2 -Auto-Zero; Heraeus, Fellbach)
bei 37 C in einer wasserdampfgesattigten Atmosphare mit 5 % CO2 inkubiert. Durch
diesen CO2 -Partialdruck wurde die Kultur uber das Puersystem der Medien auf einen
physiologischen pH-Bereich um 7,4 eingestellt.
2.8.3 Passage
Zum besseren Wachstum der Zellmonokulturen mit moglichst geringer Kontaktinhibition erfolgte nach lichtmikroskopischer Beurteilung der Wachtsumsdichte alle 2{3 Tage
eine Passage auf mehrere Kulturaschen. Hierbei wurde die Wachstumsache nach Absaugen des Wachstumsmediums zweimalig mit PBS gespult sowie jeweils nachfolgend
abgesaugt. Danach wurden die Wachstumsache mit 2 ml Trypsin-EDTA (2.1.4) benetzt und die Kulturaschen leicht gegen den Tisch geklopft, um eine Ablosung der Zellen zu erreichen. Nach lichtmikroskopischer Verizierung (kugelige Zellen, frei schwimmend, lichtbrechend) erfolgte eine Neutralisierung des zelltoxischen Trypsin-EDTAs
durch 5 ml TNS (2.1.4). Der komplette Inhalt wurde nach mehrmaliger Spulung der
2.9 Aufbau und Kultivierung des Translter-Co-Kultur-Systems j 12
Wachstumsache entnommen, 100 l zur Zahlung und Kontrolle der Zellvitalitat abgesondert und anschlieend 5 Minuten bei 300 g und 20 C zentrifugiert. Nach Absaugen

des Uberstands
sowie zweimaliger Resuspension in 2 ml Wachstumsmedium erfolgte
eine Aufteilung auf die neuen Kulturaschen (mit Kollagen benetzt). Hierbei wurde
eine lockere Verteilung der Zellen auf der Wachstumsache angestrebt.
2.8.4 Zellernte
Nach 3{5 Passagen wurden die Zellen analog zur Passagierung anstelle auf Kulturaschen auf TCK-Schalen ausgesat (siehe 2.9.3).
2.9 Aufbau und Kultivierung des Translter-Co-Kultur-Systems
2.9.1 Kollagenbeschichtung der Polycarbonatlter
Die Polycarbonatlter wurden mit auf 4 C gekuhltem Kollagen auf beiden Seiten
beschichtet. Zur Quervernetzung des Kollagens wurden die Filter 3 Minuten in Ammoniakdampf gehalten und anschlieend 3 Stunden in 4 % Glutaraldehyd (4 ml 25 %
Glutaraldehyd, gelost in 21 ml destilliertem Wasser) xiert. Nach funf Spulvorgangen in physiologischer Kochsalzlosung wurden die beschichteten Filter durch direkte
UV-Bestrahlung (15 Minuten je Seite) in keimarmer Umgebung (Flow) sterilisiert. Anschlieend erfolgte eine Lagerung steril (in Petrischalen) im Kuhlschrank bei 4 C.
2.9.2 Vorbereiten der Filterrahmen
Die sterilen kollagenbeschichteten Polycarbonatlter wurden unter sterilen Bedingungen zwischen dem inneren und aueren Ring des autoklavierten Polycarbonatrahmens
eingespannt. Anschlieend wurde die Co-Kulturschale mit 5 ml SmGM gefullt und der
Polycarbonatrahmen mit der eigentlichen Oberseite nach unten in die TCK-Schale eingelegt. Das nun obere Kompartiment wurde mit 3 ml SmGM gefullt. Eine Schraube in
den Luftungskanalen verhindert den Abuss des Kulturmediums.
2.9.3 Zellaussaat auf die Filter
In einem ersten Schritt wurde nun oben auf der eigentlichen Filterunterseite HCMSMC
in der Dichte von 2.5 { 5.0 104 Zellen / cm2 (1.0 { 2.0 105 Zellen je Schale) in je 3 ml
SmGM suspendiert ausgesat. Die Zellen wurden uber Nacht im Brutschrank inkubiert.
20 Stunden spater wurde der Rahmen unter sterilen Bedingungen (Flow) gewendet
und somit in Normalposition gebracht. Die Schraube wurde aus dem Entluftungskanal
2.9 Aufbau und Kultivierung des Translter-Co-Kultur-Systems j 13
entfernt. Im Anschluss daran wurden auf der Filteroberseite ebenfalls 2.5 { 5.0 104
HCAEC / cm2 (1.0 { 2.0 105 Zellen je Schale) in je 3 ml EGM suspendiert aufgebracht.
Der Mediumwechsel wahrend der folgenden 11- bis 14-tagigen Co-Kultur-Phase wurde
dreimal je Woche durchgefuhrt.
2.9.4 Kultivierung
Wie in Abschnitt 2.8.2 beschrieben wurden die Zellen in einem Brutschrank bei 37 C
mit CO2 -Begasung zur Konstanthaltung des pH-Wertes kultiviert.
Abbildung 1: Schematischer Schnitt durch eine Translter-Co-Kultur-Schale mit Polycarbonatlter, daruber angeordneter Endothelzellschicht, darunter angeordneter Zellschicht glatter Muskelzellen, eingespannt in einen Polycarbonatrahmen mit seitlicher Entluftungsonung
2.9.5 Mediumwechsel
Der Mediumwechsel wahrend der 11- bis 14-tagigen Cokultivierungsphase wurde am
auf die Filterbeschichtung folgenden Tag und daruberhinaus dreimal je Woche unter
sterilen Bedingungen (Flow) durchgefuhrt. Es erfolgte in getrennten Vorgangen ein
Ersatz (Absaugen und Wiederbefullen) des SMGM uber die Entluftungsonung sowie
direkt ein Austausch des EGM. Gleichzeitig erfolgte mit dem Mediumwechsel eine
makroskopische sowie lichtmikroskopische Begutachtung der Kulturschalen bezuglich
eventuell vorhandener Verunreinigungen.
2.10 Gewinnung der Monozyten mittels magnetaktivierter Zellsortierung j 14
2.10 Gewinnung der Monozyten mittels magnetaktivierter
Zellsortierung
2.10.1 Anreicherung der mononuklearen Zellen
Nach der Blutentnahme wurden periphere mononukleare Blutzellen uber Dichtegradientenzentrifugation in folgenden Schritten gewonnen:
100 ml Blut in 200 ml PBS losen,
Zentrifugationsschritt (800 g, 20 Minuten, 20 C, ohne Bremse),
Zentrifugationsschritt (300 g, 10 Minuten, 20 C),
50 ml Falcon-Rohrchen mit je 15 ml gekuhlter Biocoll-Losung fullen,
vorsichtig 35 ml verdunntes Blut uberschichten (ohne Vermischung mit Trennlosung),

Uberstand
absaugen bis 1 cm uber Buy Coat, Interphase aufnehmen und in
neues Falconrohrchen uberfuhren, dieses mit PBS auf 50 ml auullen,

Uberstand
absaugen, je Falcon-Rohrchen 1 ml PBS /EDTA zugeben, Pellets
resuspendieren, auf ein Falcon-Rohrchen poolen und mit PBS /EDTA auf 50 ml
auullen,
Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 20 C),

Uberstand
absaugen, Pellet mit 5 ml PBS /EDTA resuspendieren und mit PBS /
EDTA auf 50 ml auullen,
Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 20 C),

Uberstand
absaugen, Pellet mit 10 ml PBS /EDTA resuspendieren, Filtration
mit 30 l Nylon-Filter,
Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 20 C).
2.10.2 Isolierung der Monozyten
Die Monozytenisolierung aus den angereicherten peripheren mononuklearen Zellen wurde uber ein System zur magnetaktivierten Zellsortierung (MidiMACS) sowie bei einer
Temperatur zwischen 6 und 12 C durchgefuhrt (erreicht mittels Wasserbad mit Eis):
2.10 Gewinnung der Monozyten mittels magnetaktivierter Zellsortierung j 15
Absaugen nach dem letzten Schritt von 2.10.1, Resuspension des Pellets mit 60
l Puer je 107 Zellen,
Zugabe 20 l FcR Blocking Reagent je 107 Zellen,
mischen mit 1 ml Puer, auullen mit Puer auf 10 ml,
Zellsuspension (ca. 9,5 ml) in Kuhlschrank bis kurz vor Aussaat lagern,
Zugabe 20 l Hapten-Antikorper-Cocktail je 107 Zellen, Inkubation 5 Minuten,
mischen mit 1 ml Puer, auullen mit Puer auf 10 ml,
Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 6 C),
absaugen, Resuspension mit 1 ml Puer, auullen mit Puer auf 10 ml,
Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 6 C),
absaugen, Resuspension des Pellets mit 60 l Puer je 107 Zellen,
Zugabe 20 l FcR Blocking Reagent je 107 Zellen,
Zugabe 20 l MACS Anti-Hapten MicroBeads je 107 Zellen, Inkubation 15 Minuten,
Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 6 C),
absaugen, Resuspension mit 1 ml Puer, auullen mit Puer auf 10 ml,
Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 6 C),
Pellet aufnehmen in 500 l Puer je 108 Zellen, mindestens jedoch 500 l,
einsetzen der MidiMACS-Trennsaule in magnetische Halterung,
Saule mit 3 ml Puer spulen,
in Puer geloste Zellen in Trennsaule einbringen, durchspulen der Zellen mit
10 ml Puer; die Depletion der nichtmonozytaren Fraktion wird durch haptenkonjugierte Antikorper gegen spezische Antigene von T-Lymphozyten, BLymphozyten, naturliche Killerzellen, dendritische Zellen sowie Basophile erreicht
(anti-CD3, anti-CD7, anti-CD19, anti-CD45RA, anti-CD56, anti-IgE), die durch
Anti-Hapten Microbeads aufgefangen werden und durch das Magnetfeld festgehalten werden,
vor Aussaat erneuter Zentrifugationsschritt (200 g, 10 Minuten, 6 C),
das Zellpellet enthalt die Monozyten.
2.11 Versuchsbeschreibung j 16
2.11 Versuchsbeschreibung
2.11.1 Versuchsprotokoll
Die HCMSMC-Aussaat erfolgte an Tag 0, die HCAEC-Aussaat an Tag 1. Danach folgte
eine 11{14 Tage dauernde Cokultivierungsphase. Wie in Tabelle 2 vermerkt erfolgte in
manchen Gruppen 18 h vor dem Monozytenangri die Zugabe von MMF, sowie 6 h
zuvor die Zugabe von TNF-. Der Monozytenangri wurde nach 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 und
24 h durch Fixation beendet. Zielgroen waren Adhasion und Transmigration (siehe
Tabelle 2) in allen Gruppen und die Proliferation der HCMSMC in der Gruppe mit
24 h Angrisdauer (siehe Tabelle 3). Hierzu erfolgte 6 h nach Monozytenzugabe die
Zugabe von 50 l bzw. 30 l der BRDU-Stammlosung in das HCMSMC bzw. HCAECKompartiment.
Tabelle 2: Versuchsstruktur der Experimente fur Adhasion und Transmigration der Monozyten mit Angabe der Dauer des Monozytenangris in Abhangigkeit von
der Stimulation mit Tumornekrosefaktor- (TNF) und Mycophenolatmofetil
(MMF)
Monozytenzugabe [h]
0.5
0.5
1
1
2
2
3
3
4
4
6
6
24
24
24
24
TNF
MMF
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
ja
Tabelle 3: Versuchsstruktur der Experimente fur die glattmuskulare Proliferation mit
24-stundiger Dauer des Monozytenangris in Abhangigkeit von der Stimulation mit Tumornekrosefaktor- (TNF) und Mycophenolatmofetil (MMF)
Monozytenzugabe [h]
24
24
24
24
TNF
MMF
ja
ja
ja
ja
2.11.2 Vorkultivierung der Translter-Co-Kultur
Die TCK wurden 11{14 Tage (Beginn: Aussaat der HCAEC) cokultiviert, um eine
konuente HCAEC-Schicht sowie eine mehrlagige HCMSMC-Schicht zu erhalten. Der
Wechsel des Mediums erfolgte alle 2{3 Tage. Im Anschluss an die Vorkultivierungsphase
wurden die Schalen zufallig den Versuchsgruppen zugeteilt.
2.11.3 Experimentelle Zugabe von Mycophenolatmofetil
18 h vor dem Monozytenangri wurde bei allen Gruppen das Medium gewechselt
und fur jede Zugabedauer der Monozyten TCK-Schalen mit bzw. ohne Mycophe-
2.12 Aufarbeitung der Translter-Co-Kultur j 17
nolatmofetil (MMF) in einer Konzentration von 50 g/ml vorbereitet. Bei den 24h-Versuchsgruppen gibt es auerdem je eine Kontrollgruppe ohne Stimulation durch
TNF- ohne bzw. mit MMF.
2.11.4 Stimulierung
Als Simulation eines Entzundungsreizes und somit der Hochregulation der Adhasionsmolekule dienend wurde den TCK 6 h vor dem potentiellen Monozytenangri TNF-
in der Konzentration 20 ng/ml in beide Kompartimente zugegeben. Bei den 24-hVersuchsgruppen gibt es je eine Kontrollgruppe ohne Stimulation durch TNF- ohne
bzw. mit MMF. Um eine Beeinussung der nachfolgenden, unterschiedlich langen Angrisdauer durch vorhandenes TNF- bzw. MMF zu vermeiden, wurde vor Beginn der
Monozytenaussaat bei allen Versuchsgruppen ein Mediumwechsel durchgefuhrt.
2.11.5 Monozytenangri
3 105 Monozyten wurden in das obere Kompartiment der TCK zugegeben, xiert wurde wie oben beschrieben nach 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 und 24 h. Bei den 24-h-Versuchsgruppen
erfolgte nach 6 h die Zugabe von BRDU als Proliferationsmarker in einer Konzentration
von 20 M.
2.12 Aufarbeitung der Translter-Co-Kultur
2.12.1 Adhasion und Transmigration
Die Adhasion und Migration der Monozyten wurde durch indirekte Fluoreszenzzytochemie am Mikroskop erfasst. Hierzu wurde ein ca. 2 cm2 groes Stuckchen des Filters
in 4 %-igem Paraformaldehyd mit der Endothelzellseite nach oben xiert.
2.12.1.1 Farbung der Monozyten (CD68)
Die Monozyten wurden durch indirekte Immunuoreszenz nach folgendem Protokoll
gefarbt:
In 4 % Formaldehyd xierte Filterstuckchen funfmal mit 1-2 ml PBS waschen
und absaugen,
1 ml Antikorper Maus-Anti-CD68 im Brutschrank 40 Minuten inkubieren,
funfmal mit 1-2 ml PBS waschen und absaugen,
2.12 Aufarbeitung der Translter-Co-Kultur j 18
1 ml Antikorper Ziege-Anti-Maus-TRITC im Brutschrank 40 Minuten inkubieren,
funfmal mit 1-2 ml PBS waschen und absaugen,
gewaschenes Filterstuckchen mit 2 Tropfen Mowiol auf Objekttrager aufbringen
sowie mit Deckglas xieren.
2.12.1.2 Auswertung der Adhasion und Transmigration
Die Auswertung erfolgte an der Filteraufsicht. Die Anzahl der gefarbten Zellen (= Anzahl der Monozyten) wurden unter 40facher Vergroerung bei je zehn Gesichtsfeldern
pro Versuch und Versuchsgruppe ausgezahlt (siehe auch Abb. 2). Jedes Kompartiment
(Endothelzellseite = Adhasion, d.h. bei langsamer Fokussierung von oben kommend
die erste Schicht, glattmuskulare Zellseite = Transmigration, d.h. die zweite Schicht
nach Durchgang durch die Endothezellseite und kurzzeitiger Fokussierung des Filters)
wurde getrennt erfasst. Die graphische Darstellung erfolgt als Mittelwert mit Standardabweichung.
Abbildung 2: Filteraufsicht mit CD68-positiven Zellen (Monozyten) unter Immunuoreszenz
2.12.2 Proliferation der glatten Muskelzellen
Die Proliferation der glattmuskularen Zellen wurde uber die Einlagerung eines Basenanalogons (BRDU) in proliferierende Zellen detektiert. 18 h vor der Fixierung wurden 20 M BRDU dem Medium zugegeben. Anschlieend wurden die Filter in Araldit
eingebettet.
2.12.2.1 Einbettung in Araldit
Die Polycarbonatlter wurden zuerst mit 4 %-igem Paraformaldehyd xiert. Die weitere
Einbettung erfolgte nach folgendem Protokoll:
2.12 Aufarbeitung der Translter-Co-Kultur j 19
Zweimaliges Spulen je 10 Minuten in PBS ,
je 20 Minuten einlagern in Ethanol 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 96 % (jeweils gemischt
mit Aqua bidestillata),
dreimal 20 Minuten einlagern in Ethanol 100 %,
je 10 Minuten einlagern in Propylenoxid-Ethanol (100 %)-Gemisch (1:2, 1:1, 2:1),
zweimal 10 Minuten einlagern in Propylenoxid,
jeweils 1 h in Araldit-Propylenoxid-Gemisch einlagern (1:1, 3:1),
3 h in Araldit einlagern,
Einbettung in Araldit uber 36 h bei 60 C.
2.12.2.2 Schneiden der Aralditblocke
Mit einem Glasmesser wurden am Rotationsmikrotom Semidunnschnitte der Dicke 4
m angefertigt. Die Schnitte wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objekttrager
aufgebracht und bei 60 C getrocknet.
2.12.2.3 Auslosen des Araldits am Schnitt
Zur Immunhistochemie wurde das Araldit nach folgendem Protokoll wieder aus den
Dunnschnitten herausgelost:
40 g KOH-Platzchen, 200 ml Methanol und 100 ml Propylenoxid werden in einer
Wanne ca. 25 Minuten bis zur vollstandigen Auosung der Platzchen gemischt,
Inkubation 8 Minuten in der KOH/Methanol/Propylenoxid-Losung,
Inkubation 5 Minuten in Methanol/H2 O,
Spulung 5 Minuten in PBS .
2.12.2.4 Immunhistochemie (BRDU und vWF)
Fur eine Doppelfarbung der Proliferation (BRDU) und der Endothelzellen (vWF) am
Schnitt mit herausgelostem Araldit wurde folgendes Protokoll verwendet:
Inkubation 10 Minuten in 0,75 % H2 O2 in Methanol,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 20 Minuten in 1 N HCl,
2.12 Aufarbeitung der Translter-Co-Kultur j 20
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 20 Minuten mit Pferdeserum,
Inkubation 40 Minuten mit Antikorper Maus-Anti-BRDU,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 10 Minuten mit Antikorper Pferd-Anti-Maus biotinyliert,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 10 Minuten mit AB-Reagenz,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 2 - 10 Minuten mit DAB-Substrat-Kit,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 10 Minuten in 3 % H2 O2 in PBS ,
Inkubation 20 Minuten mit Ziegenserum,
Inkubation 40 Minuten mit Antikorper Kaninchen-Anti-vWF,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 10 Minuten mit Antikorper Ziege-Anti-Kaninchen biotinyliert,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 10 Minuten mit AB-Reagenz,
Spulung 5 Minuten in PBS ,
Inkubation 5 - 30 Minuten mit AEC-Substrat-Kit,
Spulung 5 Minuten in Aqua destillata,
Inkubation 10 Minuten in 3 % H2 O2 in PBS ,
Spulung 5 Minuten in Aqua destillata,
Inkubation 2 Minuten in Hamalaun,
Spulung 10 Minuten in Leitungswasser,
Eindeckeln mit Kaiser's Glyceringelatine.
2.13 Toluidinblaufarbung j 21
2.12.2.5 Auswertung der Proliferation
Durch Anfarbung des von-Willebrand-Faktors (vWF) erfolgt die Dierenzierung zwischen Endothelzellseite (vWF-positive Granula im Zytosol) und SMC-Seite (Abb. 3).
Die Auswertung der Proliferation der HCMSMC erfolgte durch Zahlung der BRDUpositiven Kerne (Abb. 4) und Gesamtanzahl aller Kerne an 8{10 kompletten Schnitten
je Gruppe und Versuch. Anschlieend erfolgte die Berechnung der prozentualen Proliferation und Darstellung aller Versuche als Mittelwert mit Standardabweichung.
Abbildung 3: Aralditschnitt mit von-Willebrand-Faktor(vWF)-gefarbten Endothelzellen (EC, roter Pfeil), xiertem Filter (blauer Pfeil) und einer mehrlagigen glatten Muskelzell(SMC)-Schicht und Bromodesoxyuridin(BRDU)negativen Kernen
2.13 Toluidinblaufarbung
Mittels Farbung mit Toluidinblau erfolgte eine Qualitatskontrolle der Aralditschnitte
(siehe 2.12.2.1 und 2.12.2.2) durch Zahlung der Zelllagen auf jeder Seite.
Es erfolgte keine Auslosung des Araldits aus den Schnitten. Die Farbung wurde nach
folgendem Protokoll durchgefuhrt:
Poly-L-Lysin beschichtete Objekttrager mit Aralditschnitten auf Warmebank auf
80 C aufheizen,
Schnitte mit Toluidinblau-Gebrauchslosung bedecken,
nach Goldrandbildung mit destilliertem Wasser abspulen,
eindeckeln mit Entellan.
2.14 Statistik j 22
Abbildung 4: Aralditschnitt mit Endothelzellen (EC, roter Pfeil), Polycarbonatlter (blauer Pfeil) und glatten Muskelzellen (SMC) und einem
Bromodesoxyuridin(BRDU)-positivem Kern
Am Toluidinblauschnitt lassen sich die verschiedenen Zellagen sehr gut erkennen. Es erfolgte eine semiquantitative Darstellung zur Qualitatskontrolle der TCK. Hierbei wurden auf der EC-Seite 1-2 Zellagen angestrebt, auf der HCMSMC-Seite 2-4 Zellagen
(Abb. 5).
Abbildung 5: Aralditschnitt in Toluidinfarbung (EC = Endothelzellen, roter Pfeil, SMC
= glatte Muskelzellen, violetter Pfeil)
2.14 Statistik
Die Daten wurden mit dem Programm Sigmastat Version 3.00 der SPSS Inc., Chicago, Illinois 60606, USA ausgewertet. Als Signikanzniveau wurde < 0.05 gewahlt.
Alle Vergleiche erfolgten uber den Mann-Whitney-Ranksum-Test, da eine Normalverteilung der Daten fur Adhasion, Transmigration und Proliferation nicht ohne weiteres
2.14 Statistik j 23
angenommen werden konnte. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt tabellarisch und
graphisch als Diagramme mit Mittelwert als Balken mit Standardabweichung.
3 Ergebnisse
3.1 Adhasion
3.1.1 Eekt der MMF-Zugabe
Als Kontrolle diente jeweils die zeitlich entsprechende Versuchsgruppe mit TNF-Inkubation ohne MMF-Zugabe. Bei der Versuchsgruppe uber 24 h wurde zusatzlich zur
Erfolgskontrolle der TNF--Stimulation ein Vergleich mit einer Gruppe ohne TNF-Stimulation durchgefuhrt.
Abbildung 6: Anzahl der adharierenden Monozyten (GF = Gesichtsfeld, MMF = Mycophenolatmofetil) in Abhangigkeit von der Dauer der Monozytenzugabe
und von der MMF-Zugabe jeweils mit Standardabweichung
Tabelle 4: Adhasion der Monozyten zu verschiedenen Zeiten in Abhangigkeit der Zugabe von Mycophenolatmofetil (MMF) bzw. Tumornekrosefaktor- (TNF),
n.s. = nicht signikant, vs. = versus
Vergleichsgruppe
0.5h
1h
2h
3h
4h
6h
24h
24h
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten mit vs. ohne TNF
MMF
MMF
MMF
MMF
MMF
MMF
MMF
Trend
Signikanz
+
+
+
+
+
+
+
+
n.s.
0.028
0.017
n.s.
n.s.
0.002
n.s.
n.s.
12.5 %
31.8 %
28.6 %
32.9 %
24.5 %
64.1 %
8.1 %
104 %
Die Adhasion der Monozyten bei 24 h wurde gegenuber der Gruppe ohne TNF-
um 104 % und nicht signikant gesteigert. Es zeigt sich nach 1, 2 und nach 6 h eine
24
3.1 Adhasion j 25
signikante Erhohung der Monozytenadhasion zwischen 28.6 % und 64.1 % unter MMFZugabe. Nach 0.5, 3, 4 und 24 h tendieren die Werte in gleicher Richtung, jedoch ohne
Signikanz (siehe Tabelle 4).
3.1.2 Zeitlicher Verlauf
Im zeitlichen Verlauf zeigt sich bei den Versuchsgruppen ohne MMF eine signikante
Abnahme der Adhasion von 2 h auf 3 h ( 24 %), von 4 h auf 6 h ( 40 %) und von 6 h
auf 24 h ( 39 %). Ansonsten waren nicht signikant eine Steigerung von 3 h auf 4 h
(+ 13 %) und Abnahmen von 0.5 h auf 1 h ( 15 %) und von 1 h auf 2 h ( 8,1 %) zu
beobachten. Bei den Versuchsgruppen mit MMF zeigten sich analoge Tendenzen mit
einer signikanten Abnahme der Adasion von 2 h auf 3 h ( 22 %), von 4 h auf 6 h
( 22 %) und von 6 h auf 24 h ( 60 %). Nicht signikant elen wie bei der Gruppe
ohne MMF eine Steigerung von 3 h auf 4 h (+ 5.9 %) und Abnahmen von 0.5 h auf
1 h ( 0.58 %) sowie von 1 h auf 2 h ( 10 %) auf (siehe Tab. 5).

Tabelle 5: Anderungen
der Adhasion der Monozyten bei Versuchsxation zu verschiedenen Zeitpunkten in Abhangigkeit von Mycophenolatmofetil (MMF) bzw.
Tumornekrosefaktor- (TNF), n.s. = nicht signikant, vs. = versus
Vergleichsgruppe
1h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
2h Monozyten, TNF vs. 1h Monozyten, TNF
3h Monozyten, TNF vs. 2h Monozyten, TNF
4h Monozyten, TNF vs. 3h Monozyten, TNF
6h Monozyten, TNF vs. 4h Monozyten, TNF
24h Monozyten, TNF vs. 6h Monozyten, TNF
1h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
2h Monozyten, TNF, MMF vs. 1h Monozyten, TNF, MMF
3h Monozyten, TNF, MMF vs. 2h Monozyten, TNF, MMF
4h Monozyten, TNF, MMF vs. 3h Monozyten, TNF, MMF
6h Monozyten, TNF, MMF vs. 4h Monozyten, TNF, MMF
24h Monozyten, TNF, MMF vs. 6h Monozyten, TNF, MMF
Trend
Signikanz
+
15 %
8.1 %
24 %
13 %
40 %
39 %
n.s.
n.s.
0.021
n.s.
< 0.001
< 0.001
+
0.58 %
10 %
22 %
5.9 %
22 %
60 %
n.s.
n.s.
0.014
n.s.
0.046
< 0.001
Bei Verwendung des Adhasionswertes nach 0.5 h Monozyteninkubation als Bezugsgroe (siehe Tab. 6) ergibt sich im Vergleich dazu ohne MMF bereits nach 2 h ( 22 %)
eine signikante Reduktion der Adhasion. Mit fortschreitender spaterer Fixierung der
TCK ergeben sich mit einer Ausnahme (4 h, 33 %, signikant) stetig steigende signikante Adhasionsabnahmen zwischen 22 % (2 h) und 76 % (24 h). Einzig nach
1 h ist eine nicht signikante Abnahme ( 15 %) der Adhasion zu beobachten. Unter
MMF-Vorinkubation ist eine analoge Tendenz wie ohne MMF, allerdings mit Signikanz erst ab einem Zeitpunkt von 3 h ( 30 %) zu beobachten. Die Adhasion nimmt
mit Ausnahme nach 4 h ( 26 %) stetig ab bis zu einer signikanten maximalen Ad-
3.2 Transmigration j 26
hasionsreduktion ( 77 %) bei 24 h. Zu den Zeitpunkten von 1 h bzw. 2 h sind nicht
signikante Adhasionsabnahmen um 0.58 % bzw. 28 % zu beobachten (siehe Tab. 6).
Tabelle 6: Zeitlicher Verlauf der Adhasion der Monozyten in Vergleich zum ersten Wert nach 0.5h ohne und mit Mycophenolatmofetil (MMF) unter
Tumornekrosefaktor- (TNF), n.s. = nicht signikant, vs. = versus
Vergleichsgruppe
Trend
Signikanz
1h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
2h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
3h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
4h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
6h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
24h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
15
22
40
33
60
76
%
%
%
%
%
%
n.s.
0.007
< 0.001
< 0.001
< 0.001
< 0.001
1h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
2h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
3h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
4h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
6h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
24h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
0.58 %
28 %
30 %
26 %
40 %
77 %
n.s.
n.s.
< 0.001
0.002
< 0.001
< 0.001
3.2 Transmigration
3.2.1 Eekt der MMF-Zugabe
Als Kontrolle diente jeweils die zeitlich entsprechende Versuchsgruppe mit TNF-Stimulation jedoch ohne MMF-Zugabe. Bei der Versuchsgruppe uber 24 h wurde zusatzlich noch zur Kontrolle der TNF--Stimulation ein Vergleich mit einer Gruppe ohne
TNF--Inkubation durchgefuhrt.

Tabelle 7: Anderungen
der Transmigration der Monozyten bei Versuchsxation zu verschiedenen Zeitpunkten in Abhangigkeit von Mycophenolatmofetil (MMF)
bzw. Tumornekrosefaktor- (TNF), n.s. = nicht signikant, vs. = versus
Vergleichsgruppe
0.5h
1h
2h
3h
4h
6h
24h
24h
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten, TNF mit vs. ohne
Monozyten mit vs. ohne TNF
Trend
MMF
MMF
MMF
MMF
MMF
MMF
MMF
0.00 %
+ 150 %
48.8 %
76.4 %
0.00 %
96.4 %
82.4 %
+ 580 %
Signikanz
n.s.
n.s.
0.033
0.003
n.s.
0.001
0.009
0.008
Die Transmigration der Monozyten bei 24 h wurde gegenuber der Gruppe ohne TNF-Stimulation um 580 % und signikant gesteigert. Es zeigten sich nach 2 h, 3 h,
3.2 Transmigration j 27
Abbildung 7: Transmigration der Monozyten (GF = Gesichtsfeld, MMF = Mycophenolatmofetil) in Abhangigkeit der Dauer der Monozytenzugabe und von
der MMF-Zugabe jeweils mit Standardabweichung
6 h und 24 h signikante Abnahmen der Transmigration zwischen 48.8 % und 96.2 %
im Vergleich zu den Gruppen ohne MMF. Bei 0.5 h, 1 h und 4 h zeigte sich eine
uneinheitliche Tendenz mit Transmigrationsanderungen zwischen 0 % und + 150 %
ohne Signikanz (siehe Tab. 7).
3.2.2 Zeitlicher Verlauf
Tabelle 8: Zeitlicher Verlauf der Transmigration der Monozyten nach Versuchsxation
zu unterschiedlichen Zeitpunkten ohne und mit vorheriger Zugabe von Mycophenolatmofetil (MMF) jeweils mit Tumornekrosefaktor- (TNF), n.s. =
nicht signikant, vs. = versus
Vergleichsgruppe
1h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
2h Monozyten, TNF vs. 1h Monozyten, TNF
3h Monozyten, TNF vs. 2h Monozyten, TNF
4h Monozyten, TNF vs. 3h Monozyten, TNF
6h Monozyten, TNF vs. 4h Monozyten, TNF
24h Monozyten, TNF vs. 6h Monozyten, TNF
1h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
2h Monozyten, TNF, MMF vs. 1h Monozyten, TNF, MMF
3h Monozyten, TNF, MMF vs. 2h Monozyten, TNF, MMF
4h Monozyten, TNF, MMF vs. 3h Monozyten, TNF, MMF
6h Monozyten, TNF, MMF vs. 4h Monozyten, TNF, MMF
24h Monozyten, TNF, MMF vs. 6h Monozyten, TNF, MMF
Trend
Signikanz
+ 600 % n.s.
+ 600 % < 0.001
+ 20.4 % n.s.
85.1 % < 0.001
+ 900 % 0.003
53.6 %
n.s.
41.7
37.1
63.6
119
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
+ 1700 %
+ 33.3 %
+
%
%
%
%
Im zeitlichen Verlauf zeigten sich bei den Versuchsgruppen ohne MMF signikante Stei-
3.3 Proliferation j 28
gerungen der Transmigration von 1 h auf 2 h (+ 600 %) und 4 h auf 6 h (+ 900 %) allerdings bei einer vorherigen signikanten Abnahme von 3 h auf 4 h ( 85.1 %). Ansonsten tendierten die aufeinanderfolgenden Versuchsgruppen uneinheitlich (von 53.6 %
bis + 600 %) und ohne Signikanz. Bei den Versuchsgruppen mit MMF zeigten sich
keine signikanten Transmigrationsanderungen bei uneinheitlicher Tendenz zwischen
63.6 % und + 1700 % (jeweils in Relation zum vorherigen Zeitpunkt, siehe Tab. 8).
Tabelle 9: Zeitlicher Verlauf der Transmigration in Vergleich zum ersten Wert nach
0.5h ohne und mit Mycophenolatmofetil (MMF) unter Tumornekrosefaktor (TNF), n.s. = nicht signikant
Vergleichsgruppe
1h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
2h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
3h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
4h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
6h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
24h Monozyten, TNF vs. 0.5h Monozyten, TNF
1h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
2h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
3h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
4h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
6h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
24h Monozyten, TNF, MMF vs. 0.5h Monozyten, TNF, MMF
Trend
Signikanz
+ 600 % n.s.
+ 4800 % < 0.001
+ 5800 % < 0.001
+ 780 % n.s.
+ 8700 % < 0.001
+ 3980 % 0.001
+ 1700 % n.s.
+ 2300 % 0.019
+ 1300 % n.s.
+ 780 % n.s.
+ 220 % n.s.
+ 600 % n.s.
Nimmt man den Transmigrationswert bei 0.5 h als Bezugsgroe, so ergeben sich ohne
MMF-Zugabe bei 2 h, 3 h, 6 h und 24 h signikante Transmigrationszunahmen zwischen
+ 3980 % und + 8700 % und nicht signikanter Tendenz bei 1 h (+ 600 %) und 4 h
(+ 780 %). Mit MMF-Zugabe ergibt sich im Vergleich zum entsprechenden Basiswert
(0.5 h Monozyten, TNF, MMF) nur bei 2 h ein signikanter Anstieg der Transmigration (+ 2300 %). Zu den anderen Zeitpunkten ergeben sich nicht signikante relative
Transmigrationszunahmen zwischen + 220 % und + 1700 % (siehe Tab. 9).
3.3 Proliferation
Als Kontrolle diente in jedem Versuch eine TCK, die wie in 2.11.1 beschrieben uber
24 h mit Monozyten inkubiert wurde und weder mit MMF noch mit TNF- inkubiert
wurde.
Die Proliferation der SMC mit TNF- gegenuber dieser Kontrolle wurde um 103 % und
hochsignikant stimuliert. Bei vorheriger Inkubation der TCK mit MMF und TNF wurde die Proliferation um 95.5 % und hochsignikant inhibiert im Vergleich zur
Inkubation mit TNF- allein. Auch ohne Stimulation mit TNF- war eine Hemmung
3.4 Qualitatskontrolle Toluidinblau j 29
Abbildung 8: Proliferation der glatten Muskelzellen (SMC) bei 24h Monozytenzugabe in Abhangigkeit von Mycophenolatmofetil (MMF) und
Tumornekrosefaktor- (TNF), BRDU = Bromodesoxyuridin, + Zunahme ( < 0.001), *, ** Abnahme ( < 0.001) jeweils signikant im Vergleich zur Kontrolle
Tabelle 10: Trend und Signikanzniveau der glattmuskularen Proliferation bei 24h
Monozytenangri in Abhangigkeit von Mycophenolatmofetil (MMF) und
Tumornekrosefaktor- (TNF)
Vergleichsgruppe
24h Monozyten, TNF-Zugabe vs. Kontrolle (+)
24h Monozyten, TNF-, MMF-Zugabe vs. TNF-Zugabe (*)
24h Monozyten, MMF-Zugabe vs. Kontrolle (**)
Trend
Signikanz
+ 103 % < 0.001
95.5 % < 0.001
86.6 % < 0.001
der SMC-Proliferation durch MMF gegenuber der reinen TCK-Kontrolle um 86.6 %
und hochsignikant moglich (siehe Tab. 10 und Abb. 8).
3.4 Qualitatskontrolle Toluidinblau
Bei allen Versuchsgruppen wurde eine 1- bis 2-lagige Endothelzell- und eine 2- bis
4-lagige SMC-Schicht erreicht.
4 Diskussion
4.1 Pathophysiologie der fruhen Atherosklerose
In den letzten Jahrzehnten hat sich das Bild der Atherosklerose von einer degenerativen
Erkrankung hin zu einer chronisch-entzundlichen Erkrankung gewandelt (3; 22; 23).
Atherosklerotische Lasionen entstehen dabei vor allem in Gefawandregionen gesteigerter endothelialer Aktivierung (38), deren Ursache in einer Modikation von Lipoproteinen wie LDL (z.B. durch Oxidation oder bei Diabetes mellitus durch Glykosylierung) zu sehen ist (45). Oxidiertes LDL (ox-LDL) fuhrt uber eine NF-B-vermittelte
Signalkaskade zu einer verstarkten Expression von Adhasionsfaktoren, welche einen
wichtigen ersten Schritt in der fruhen Atherosklerose, die Adhasion der Monozyten an
das Gefaendothel, auslosen (31). Hierbei ist endothelzellseitig zwischen (1.) Selectinen

Abbildung 9: Uberblick
uber die Pathophysiologie der fruhen Atherosklerose mit lockerer Anlagerung der Monozyten vermittelt uber P-/E-Selectine, feste Adhasion uber vascular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) und intercellular
adhesion molecule-1 (ICAM-1), welche durch oxidiertes low density lipoprotein (LDL) induziert werden, so dass nachfolgend eine Transmigration
via monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) und seinem Rezeptor auf
Monozyten (chemokine receptor-2, CCR-2) stattnden kann. Nach der
durch monocyte colony stimulating factor (M-CSF) ausgelosten Dierenzierung erfolgte eine Expression von LDL-Rezeptoren, den scavenger
receptors (scavenger receptor-A = SR-A und CD36), CD = cluster of
dierentiation mit entsprechender Nummer) (31, S. 552)
(P- bzw. E-Selectin) und (2.) Rezeptoren der Immunglobulinsuperfamilie zu unterscheiden: Wahrend die Selectine wie in Abb. 9 zu erkennen vor allem die lockere Anhaftung
30
4.2 Eigenschaften von Mycophenolatmofetil j 31
("rolling") vermitteln und nur nach Stimulation auf der Endothelzelloberache vorhanden sind, wird die feste Adhasion uber Rezeptoren der Immunglobulinsuperfamilie,
VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) und ICAM-1 (intracellular cell adhesion
molecule 1), vermittelt (36). Die genannten Adhasionsmolekule weisen im menschlichen
Korper ein variables Molekulargewicht auf, das stark durch posttranslationale Glykosylierung beeinusst wird und auch die jeweiligen Adhasionseigenschaften modizieren
kann (10). Die Endothelaktivierung fuhrt neben der Expression der Adhasionsfaktoren
auch zur ebenfalls NF-B-vermittelten Produktion von MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1), einem fur die Migration der Monozyten wesentlichen Faktor, der
sowohl von vaskularen glatten Muskelzellen, Endothelzellen als auch von den Makrophagen/Schaumzellen selbst ausgeschuttet wird (13). Die Akkumulation von Monozyten, die sich in Makrophagen umwandeln und nach massiver Lipidingestion aufgrund
ihrer morphologischen Struktur als Schaumzellen bezeichnet werden, zusammen mit
ebenfalls einwandernden T-Lymphozyten fuhrt zur Aktivierung der glatten Muskulatur im Sinne einer Migration in die Intima und einer nachfolgenden Proliferation (44).
Diese Ansammlung von Makrophagen, Lymphozyten und glatten Muskelzellen wird als
"fatty streak" bezeichnet, das erste Stadium der atherosklerotischen Lasion. Kontinuierliche Aktivierung dieses Komplexes fuhrt zur Freisetzung von hydrolytischen Enzymen
(z.B. Matrixmetalloproteinasen), die weitere Zellschadigungen verursachen und auch zu
einer fokalen Nekrose mit nachfolgender Fibrosierung fuhren konnen. Dieser Kreislauf
aus Einwanderung, Proliferation, Nekrose und Fibrosierung fuhrt zur Bildung eines "brous cap", welcher ein fortgeschrittenes Stadium der Atherosklerose darstellt und im
weiteren Verlauf zur Gefastenosierung fuhren kann (45).
4.2 Eigenschaften von Mycophenolatmofetil
4.2.1 Handelsname und Indikation
MMF ist in Deutschland unter dem Handelsnamen CellCept (Tabletten mit je 500 mg
Wirksto) in Kombination mit Ciclosporin und Corticosteroiden zur Prophylaxe von
akuten Transplantatabstoungsreaktionen bei Patienten mit allogener Nieren-, Herzund Lebertransplantation zugelassen (42).
4.2.2 Struktur und Wirkmechanismus
MMF ist der 2-Morpholinoethylester (siehe Abb. 10) von Mycophenolat (MPA), dem
aktiven Metaboliten, der selektiv, nicht-kompetitiv und reversibel die Inosinmonophosphatdehydrogenase (IMPDH), und somit den de-novo-Weg der Guanosin-Nucleotidsynthese hemmt, auf den vor allem B- und T-Lymphozyten angewiesen sind (2).
4.2 Eigenschaften von Mycophenolatmofetil j 32
Abbildung 10: Strukturformel von Mycophenolatmofetil und Mycophenolat (51, S.
2326)
Abbildung 11: Wege der Purinbiosynthese und Angrispunkt von Mycophenolatmofetil (\mycophenolic acid") an der Inosinmonophosphatdehydrogenase
(IMPD), Abkurzungen: ATP = Adenosintriphosphat, DNA = Desoxyribonukleinsaure, DP = Diphosphat, HGPRTase = HypoxanthinGuanin-Phosphoribosyltransferase, PRPP = 5'-Phosphoribosyl-1'pyrophosphat, RNA = Ribonukleinsaure, TP = Triphosphat (1, S. 4)
Wie in Abb. 11 erkennbar hat MMF wesentliche Auswirkungen auf (1.) DNA-Synthese,
(2.) RNA-Synthese und (3.) Glycoproteinsynthese. Zusatzlich zur Abhangigkeit der
Lymphozyten von der de-novo-Purinbiosynthese exprimieren sie vorwiegend diejenige
IMPDH-Isoform, fur die MPA eine funach hohere Anitat aufweist (1). Die Wirkung
von MMF auf Lymphozyten beruht somit auf der Notwendigkeit der de-novo-Synthese
und der hohen Anitat zur IMPDH-Isoform II. Daruberhinaus existiert auch eine
messbare Wirkung von MMF auf andere Zelltypen, wie z.B. Monozyten oder Endothelzellen. Hierbei beeinusst MMF die Adhasionseigenschaften auch durch die reduzierte Anlagerung von Fucose und Mannose an Glycoproteine, welche fur Adhasion und
Transmigration verantwortlich sind (1).
4.3 Adhasion j 33
4.2.3 Mycophenolat und Atherosklerose
Es gibt umfangreiche Hinweise und unterschiedlichste Wirkmechanismen fur die atherosklerosemodizierenden Eigenschaften von Mycophenolatmofetil. Auch wenn in den
ab 4.3 folgenden Ausfuhrungen nur auf Adhasion, Transmigration und Proliferation
eingegangen wird, so gibt es noch andere Eigenschaften, welche van Leuven et al. (54)

in einer Ubersichtsarbeit
zusammengestellt haben:
Abbildung 12: Angrispunkte von Mycophenolatmofetil (MMF) bei der fruhen Atherosklerose, Abkurzungen: SMC = glatte Muskelzelle, CD = cluster of
dierentiation, DC = dendritische Zelle, iNOS = induzierbare NO Synthase, LDL = low density lipoprotein, Ox-LDL = oxidiertes low density
lipoprotein, Th1/2 = T-Helferzelle Typ 1/2 (54, S. 344)
MMF inhibiert die reaktive T-Zell-Proliferation aufgrund der hoheren Anitat zur
IMPDH Isotyp II, die pradominant in Lymphozyten ausgepragt ist. Daruberhinaus wird
durch Inhibition induzierbaren Stickoxids (NO) aufgrund der Notwendigkeit der kontinuierlichen Neusynthese eines Cofaktors (Tetrahydrobiopterin) eine Verbeserung der
vasodilatatorischen Endothelfunktion erreicht. Durch eine von MMF vermittelte Reifungsinhibition dendritischer Zellen wird eine subsequent reduzierte T-Zell-Aktivierung
vermittelt, welche positive Eekte auf den Verlauf atherosklerotischer Lasionen haben
kann. In den folgenden Abschnitten werde ich auf die von uns untersuchten und fur
den Verlauf einer atherosklerotischen Lasion wichtigen Auswirkungen von MMF auf
Adhasion, Transmigration und Proliferation eingehen.
4.3 Adhasion
Die Ergebnisse des Adhasionsansatzes lassen sich wie folgt zusammenfassen:
4.3 Adhasion j 34
(1.) Unter MMF ist die Monozytenadhasion gegenuber den Vergleichswerten ohne MMF
gesteigert, und zwar nach 1 h, 2 h und 6 h signikant,
(2.) bereits nach 2 h (ohne MMF) bzw. 3 h (mit MMF) ist die Adhasion deutlich
(signikant) rucklaug in Relation zum Basiswert nach 0,5 h und
(3.) bei den langer dauernden Versuchsgruppen (6 h, 24 h) ist eine signikante Abnahme
gegenuber den jeweiligen Vorlaufergruppen (4 h, 6 h) zu beobachten.
Insgesamt ist somit trotz Zugabe eines Purinbiosynthesehemmers eine Steigerung der
Adhasion zu beobachten bei gleichzeitig geringer zeitlicher Latenz nach Stimulation
(bereits nach 2 h bzw. 3 h Monozytenzugabe ist eine signikante Abnahme der Adhasion
im Vergleich zu den Vorwerten zu beobachten). Daraus lassen sich folgende Schlusse
ziehen:
(1.) Die Zeit zwischen Stimulation und maximaler Adhasion betragt weniger als 2 h,
(2.) unter MMF ist die endotheliale Adhasion in unserem Modell gesteigert und
(3.) eine direkte Neusynthese des verantwortlichen Adhasionsmolekuls als unmittelbare
Antwort auf die Stimulation kann nicht Ursache fur die Adhasion sein (in diesem Falle
sollte eine signikante Zunahme unter MMF nicht moglich sein).
Als theoretische Alternative lasst sich auch ein Zufallsresultat trotz Verwendung eines
allgemein akzeptierten Signikanzniveaus (5 %) nicht ausschlieen.
Huang et al. (28) konnten bei zwei verschiedenen Konzentrationen von MMF (10 M
= 4,3 g/ml und 50 M = 21,7 g/ml) unter Stimulation mit TNF- zeigen, dass
sich sowohl die mRNA-Synthese als auch die ICAM-1-Expression durch MMF in der
Zellkultur bei HUVEC signikant hemmen lasst. Auch die Zugabe von Guanosin anderte nichts an dieser Hemmung, so dass den Autoren ein Mechanismus der ICAM1-Reduktion uber die DNA/RNA-Inhibition als unwahrscheinlich erscheint. In weiteren Experimenten (59) unserer Arbeitsgruppe zeigte sich bei der verwendeten MMFKonzentration (50 g/ml) keine Inhibition von ICAM-1 auf mRNA-Ebene und in der
Durchusszytometrie (bzw. eine nicht signikante marginale Zunahme); nach weiterer
Dosissteigerung bis auf 300 g/ml zeigten sich in beiden Ansatzen signikante Inhibitionen, allerdings bei Zelltoxizitat in der Cokultur, neben der oral erreichbaren Plasmadosierung ein weiterer Grund fur die Wahl dieser maximal tolerablen Konzentration von
50 g/ml fur die Cokulturexperimente. Der fehlende Eekt auf die ICAM-1-Expression
bei niedriger Konzentration in der HCAEC-Monokultur und die ICAM-1-Inhibition
durch MMF wie von Huang et al. (28) bei HUVEC-Monokulturen gezeigt und der
gegenteilige Eekt (bzw. eine Adhasionszunahme) in der Cokultur kann an mehreren
Faktoren liegen:
(1.) Unterschiedliche Zellarten (HUVEC vs. HCAEC in den Monokulturen) bzw. im
speziellen Fall eine Cokultur mit unterschiedlichen Eekten bzw. Crosstalk,
4.3 Adhasion j 35
(2.) die unterschiedliche Dauer der TNF--Stimulation mit 6 h in unserem Fall bzw.
24 h in o.g. Fall (28),
(3.) die zweizeitige Gestaltung des Experiments mit bei uns zuerst MMF-Gabe und
danach nur 6-stundige TNF--Aktivierung, bei im Gegensatz dazu bei Huang et al.
gleichzeitiger und 24 h-Aktivierung und Inhibition.
In der Cokultur zeigte sich unter Annahme der Adhasion als Marker fur Veranderungen der ICAM-1-Expression der gegenteilige Eekt (bei allerdings erweitertem Modell).
Auch die weitere Literatur ist bezuglich der Adhasion an sich sehr ambivalent: Leckel
et al. (33) zeigten eine dosisabhangige Reduktion der Adhasion von T-Lymphozyten
an HUVECs, unabhangig von der mit MMF inkubierten Zellart (d.h. sowohl bei Inkubation der jeweiligen T-Zellsubpopulation oder HUVEC allein als auch bei Coinkubation beider Zellarten). Bei diesem Adhasionsmodell, in dem eine Durchwanderung
nicht moglich war und es somit zu einer Akkumulation der T-Zellen kam, wurde jeweils nach ca. 4 h ein Adhasionsplateau erreicht, eine Zunahme der adharierenden
Zellen spater war nicht mehr zu beobachten. Einschrankend ist hier zu sagen, dass
aufgrund der fehlenden Passagemoglichkeit im Vergleich zu unserem Modell von einer
Sattigung der Adhasionsmolekule auszugehen ist und keine wirkliche Kinetik erfasst
wurde. Weigel et al. (61) konnten bei mittels Interleukin 1 stimulierten HUVECs in
der Durchusszytometrie eine signikante Zunahme der Adhasion bei einer Inkubation mit MMF (15 M) fur 24 h, unabhangig von einer Coinkubation mit zwei unterschiedlichen Guaninkonzentrationen (1,6 M bzw. 0,1 M) sehen. Daruberhinaus zeigte
sich eine Stabilisierung der mRNA mit subsequent langerer Dauer und umfangreicher
Transkription. Die Auswirkungen auf die Adhasion wurden in vivo (Tiermodell) an
verschiedenen Transplantatmodellen untersucht. Heemann et al. (25) zeigten in einem
Nierentransplantatmodell mit Allotransplantation histologisch eine Reduktion vor allem der LFA-1- und MHC-II-positiven Zellen in der mit MMF behandelten Gruppe.
McMurray et al. (35) zeigten in einem Mausmodell zum systemischen Lupus erythematodes eine Reduktion der Oberachenexpression von VLA-4 und ICAM-1 auf CD4positiven T-Lymphozyten. Insgesamt lasst sich in Tiermodellen in wenigen und der
Atherosklerose eher fernen Modellen (Nierentransplantat/systemischer Lupus erythematodes) eher ein inhibitorischer Eekt auf die leukozytare Adhasionsmolekulexpression beobachten. Engl et al. (12) zeigten in Untersuchungen des Adhasionsverhaltens
von Tumorzellen in Relation zu HUVEC einen weiteren wichtigen Aspekt von MMF:
Je nach eingesetzter Dosierung (0,1 oder 1 M, somit deutlich niedriger als bei uns)
und exponierter Tumorzelllinie (Nieren-, Kolon- und Pankreaskarzinomzellen) entwickelte sich das Adhasionsverhalten innerhalb der gleichen Zelllinie absolut gegensatzlich
(d.h. konzentrationsabhangig zeigte sich eine Zunahme bzw. Abnahme der Adhasion,
siehe Abb. 13). In einem ahnlichen Versuchsaufbau zeigten Blaheta et al. (6), aller-
4.3 Adhasion j 36
Abbildung 13: Adhasionsverhalten von Tumorzelllinien an humanen umbilicalvenosen
Endothelzellen (HT29 = Adenokarzinom des Kolons, DanG = Pankreaskarzinom, Caki I = Nierenzellkarzinom , Du-145 = Prostatakarzinom)
in Abhangigkeit von Mycophenolatmofetil (MMF) (12, S. 4)
dings unter Verwendung einer vierten Tumorzelllinie (Neuroblastomzellen) eine MMFund dosisabhangige Adhasionszunahme ebenfalls mit Erreichen eines Plateaus nach 4 h
im eindimensionalen Modell (MMF-Konzentrationen von 0,01 M bis 1 M). Hauser
et al. (24) zeigten mit einem dem unseren ahnlichen Ansatz (MMF-Vorbehandlung
10 M der HUVEC, keine Exposition der Monozyten bzw. der monozytaren Zellinie
U937) eine deutliche Adhasionssteigerung unter MMF-Zugabe (Faktor 2), bei fehlendem usszytometrischem Eekt auf ICAM-1, jedoch deutlicher Zunahme von VCAM-1
und P-Selektin. Dieser Eekt wurde vor allem auf eine deutlich reduzierte Halbwertszeit der jeweiligen mRNA (durch MMF-mediierte Modikation regulatorischer Faktoren) bei wiederum fehlender Reversibilitat auf Guanosinzugabe zuruckgefuhrt. Zur
Erklarung der Divergenzen sowohl auf zellularer Ebene (Monozyten, T-Lymphozyten,
Tumorzellen) als auch auf molekularer Ebene (ICAM-1, VCAM-1, P-Selektin) inklusive
unseres Ergebnisses scheidet somit die Guanosindepletion und deren Auswirkung auf

RNA/DNA-Ebene aus, so dass Anderungen
der Glykosylierung und deren Auswirkungen auf mRNA-Halbwertszeit und Adhasionsfaktorexpression (VCAM-1, P-Selektin)
als wahrscheinliche Ursache der Adhasionszunahme zu sehen sind. Ein weiteres Indiz
hierfur ist die bei uns beobachtete zeitliche Kinetik mit einem Adhasionsmaximum
nach weniger als 2 h. Wie Blann et al. (8) beschreiben, lasst sich P-Selektin innerhalb
von wenigen Minuten nach Stimulation durch z.B. Hypoxie und Thrombin bereits auf
4.4 Transmigration j 37
Endothelzellen vermehrt nachweisen mit einem Maximum nach 10 Minuten und Ruckkehr auf das Ursprungsniveau nach 3 h. Eine zusatzliche, zytokinmediierte (z.B. durch
TNF oder LPS) Neusynthese hat hierbei einen Zeitbedarf von mindestens 2 h, so dass
auch diese Kinetik ein weiterer Hinweis auf den vorrangigen Einuss der Glykosylierung und die eher nachrangige Rolle der Mindersynthetisierung als Wirkmechanismus
der Adhasionszunahme in unserem Modell ist (bereits nach 1 h ist eine signikante
Zunahme der Adhasion unter MMF zu beobachten). Auch der Einuss von MMF auf
die Glykosylierung ist durchaus ambivalent: Jepson et al. (29) beobachteten in lympho
zytaren Zellen keine Anderung
der Glykosylierung, wahrend Bertalany et al. (4) bei
Endothelzellen nicht nur nach 20 h Inkubation und Stimulation mit Interleukin 1 eine
reduzierte Oberachenexpression von E-Selektin beobachteten (50 % Reduktion unter
10 mol/l) sondern auch usszytometrisch eine Reduktion von Fucose/Mannose enthaltenden Oberachenmolekulen unter MMF zeigten. In Monozyten, die bei unseren
Experimenten keinerlei MMF-Gabe ausgesetzt waren, zeigten Laurent et al. (32) eine
direkt durch mangelhafte Glykosylierung ausgeloste Adhasionsreduktion an HUVEC,
hierbei konnte eine reduzierte Expression von VLA-4, dem monozytaren Liganden von
VCAM-1 nachgewiesen werden. Bereits 1993 haben Allison et al. (2) eine Reduktion
der T-Zell-Adhasion an HUVEC in einem Aktivierungsaufbau mit 4 h Interleukin 1
und unterschiedlichen Dosierungen von MMF (0,1 M, 10 M) unabhangig von der
mit MMF coinkubierten Zelllinie (HUVEC oder/und T-Zellen) gezeigt. Auf leukozytarer Seite wurde auch der Einu von MMF auf die VLA-4-Expression untersucht mit
einer bereits nach 8 h Coinkubation messbaren Inhibition. Sokoloski et al. (49) zeigten
in einer Sarcomzelllinie eine zeitabhangige Inhibition der Glykoproteinsynthese vor allem von Mannose unter MMF-Coinkubation. Dieser Metabolit war unter 10 M MMF
bereits nach 3 h um 40 % reduziert nachweisbar.
Schlussfolgernd lasst sich sagen, dass nur ein dosisabhangiger und durchaus divergenter
Einuss von MMF auf die Glykosylierung der Adhasionsfaktoren unsere Ergebnisse und
in Zusammenschau auch die Divergenz der veroentlichten Studien erklart. Es ist hier
sicher noch weiterer Forschungsbedarf vorhanden, um die genauen Einusse der Dosis
auf die Glykosylierung zu erklaren. In unserem von den genannten Modellen sicher
komplexesten und unter Einsatz der in vivo beteiligten Zelllinien (humanen koronaren
Endothelzellen, humanen glatten Muskelzellen und humanen Monozyten) sicher realistischsten in-vitro-Modell ist eine signikante, geringe Zunahme der Adhasion unter
MMF und Zytokinstimulation feststellbar.
4.4 Transmigration
Unsere Ergebnisse des Transmigrationsansatzes lassen sich wie folgt zusammenfassen:
4.4 Transmigration j 38
(1.) Ohne MMF-Zugabe sind zwei Maximalwerte der Transmigration bei 3 h und 6 h mit
einer signikante Reduktion gegenuber dem benachbarten Wert bei 4 h zu beobachten,
(2.) unter MMF-Zugabe wird nur bei 2 h eine (im Vergleich zum Ausgangswert ebenfalls
mit MMF) signikante Transmigrationszunahme erreicht und
(3.) unter MMF-Zugabe wird im direkten Vergleich zu den Werten ohne MMF die
Transmigration deutlich und signikant gehemmt.
Es zeigte sich hier interessanterweise ein gegenlauger Trend im Vergleich zu den Adhasionsexperimenten, d.h. die Transmigration der Monozyten war in unserem Fall nicht
logischer Folgeschritt einer Adhasion sondern ein eigenstandiger und durch MMFExposition der Endothelzellen und glatten Muskulatur gegensatzlich beeinussbarer
Prozess. Im zeitlichen Verlauf zeigten sich bei uns zeitliche Transmigrationsmaxima
zwischen 3 und 6 h, die jeweils signikant waren, und folgerichtig auch nach dem Adhasionsmaximum (1/2 h nach Angri) liegen.
Blaheta et al. (5) haben in einem einfachen Modell mit HUVEC als Monolayer einen
ahnlichen Eekt auf die Transmigration allerdings bei T-Zellen bobachtet: Im Vergleich
zur Kontrollgruppe wurde in einer unseren ahnlichen Konzentration von MMF eine
Abnahme der Adhasion um ca. 10{20 % beobachtet, wahrend gleichzeitig die Transmigration (\Penetration") um 70{80 % abnahm. In der gesamten Literatur gibt es nur
wenige Experimente, die diesen nach unseren Daten eigenstandigen Prozess in einem
komplexen Modell beobachten. Nach Kraemer (30) ist eines der hauptverantwortlichen Proteine fur die monozytare Migration MCP-1, welches von Endothelzellen und
glatten Muskelzellen als Folge einer vaskularen Schadigung sowohl bei der primaren
Atherosklerose an sich als auch bei Schadigungen nach einer mechanischen Manipulation freigesetzt wird. Hinweise auf eine unter MMF reduzierte MCP-1-Produktion
liefert ein Tiermodell von Farivar et al. (14): Hier zeigt sich nach MMF-Exposition
bei Lungenischamie eine signikante Reduktion der sezernierten MCP-1-Menge um
mehr als 50 %, bei deutlicher Einschrankung aufgrund des komplett anderen Untersuchungsaufbaus. Ein weiterer aufgrund seiner Lage (an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen) selektiv (7) an der Transmigration beteiligter Faktor ist
CD31 (PECAM-1), hierzu existiert im Zusammenhang mit MMF nur die bereits im
Adhasionsteil angefuhrte Untersuchung von Raab et al. (40), in der MMF in deutlich
niedriger Dosierung (4,3 g/ml, bei uns 50 g/ml) in der HUVEC-Monokultur keinerlei
Eekt auf die PECAM-1 Expression in Vergleich zu einer Kontrolle bzw. zu einer mit
TNF- stimulierten Kontrolle aufweist. Auch PECAM-1 weist eine nicht unerhebliche
Glykosylierung (37) auf, so dass hier wieder die Wirkung von MMF auf die Glykosylierung als potentieller Mechanismus in Frage kommt. Eine veranderte Expression von
PECAM-1 bzw. eine reduzierte Synthese von MCP-1 sind zwei mogliche Erklarungsansatze fur unser Ergebnis; die geringe Datenmenge zeigt, dass hier noch ein weites Feld
4.5 Proliferation j 39
fur eine weitergehende Forschungstatigkeit zur Verfugung steht. Ein prinzipiell nicht
unerheblicher Mangel unseres Modells liegt sicherlich in der isolierten Beobachtbarkeit
der in der Zellschicht vorhandenen Monozyten, da jegliche nicht fest anheftenden bzw.
durchgewanderten Monozyten nicht erfasst werden (konnen). Dies sollte jedoch das
Ergebnis nicht signikant in die eine oder andere Richtung verandern, da der Trend
prinzipiell stimmt: Proportional zur Anzahl der transmigrierenden Monozyten existieren zum Zeitpunkt der Fixierung entsprechend viele Monozyten in den verschiedenen
Zellschichten.
In den Prozess der Pathologie von Restenose bzw. Atherosklerose unter besonderer
Berucksichtigung von MMF als Immunsuppressivum lassen sich die Ergebnisse des
Transmigrationsansatzes wie folgt einordnen:
(1.) Die Transmigration der Monozyten ist ein reversibler und in mehreren Phasen
verlaufender Prozess (d.h. die Monozyten, die nach 3 h eingewandert waren, sind entweder in das SmGM eingewandert oder haben die SmC-Schicht wieder in Richtung
EGM verlassen).
(2.) Die Transmigration wird von einem Protein (z.B. CD31/PECAM-1) und/oder
einem chemotaktischen Faktor (z.B. MCP-1) unterstutzt, dessen Expression/Funktion
bereits nach 2 h durch MMF signikant gehemmt werden kann.
(3.) Adhasion und Transmigration im speziellen von Monozyten werden durch unter
schiedliche Prozesse vermittelt: Trotz zahlreicher Uberlappungen
der beteiligten Molekule/Proteine gibt es Adhasionsmolekule und Faktoren, die selektiv fur einen der
beiden Teilprozesse verantwortlich sind, da die Reaktion auf einen Purinbiosynthesehemmer diametral ausgefallen ist, d.h. trotz relativer Adhasionszunahme unter MMF
war gleichzeitig eine signikante Reduktion der Transmigration zu beobachten.
(4.) Eine mogliche Hypothese fur diese diametrale Reaktion ist die Beeintrachtigung
der funktionell oder chemotaktisch beteiligten Molekule (z.B. CD31 / MCP-1) durch
eine veranderte Glykosylierung durch MMF.
4.5 Proliferation
Hier zeigte sich zum einen eine signikante Proliferationszunahme der glatten Muskelzellen unter TNF--Stimulation und zum anderen eine signikante Proliferationsinhibition sowohl mit als auch ohne TNF--Stimulus. Dieser aufgrund des Purinantagonismus
von MMF zu erwartende Eekt (1) wurde von Voisard et al. (58) bereits in der Monokultur unter 6-tagiger Inkubation mit MMF nachgewiesen. Hier zeigte sich ab einer
Konzentration von 0,5 g/ml (weniger als 1 % der maximalen in vivo moglichen Plasmakonzentration von MMF) eine signikante Reduktion der Proliferation auf ca. 40 %
4.5 Proliferation j 40
des Ausgangswertes. Shimizu et al. (48) zeigten an Ratten in vivo sowie an kultivierten
Rattenmuskelzellen ex vivo ebenfalls eine signikante antiproliferative Aktivitat von
MMF. Auch Raisanen-Sokolowski et al. (41) zeigten in einem aortalem Allograftmodell
bei Ratten nicht nur eine signikante Reduktion der Inammation in Adventitia und
Media und Inhibition der intimalen Proliferation, sondern in der SmC-Monokultur an
den Tagen 1-3 (eingesetzt bis 3 Tage) auch eine signikante Inhibition der Proliferation
um 70 % (1 g/ml MMF) bzw. 100 % (10 g/ml MMF). Gregory et al. (46) zeigten einerseits in der Zellkultur von aortalen SMC von Ratten und andererseits im Tiermodell
eines mittels Ballondilatation der linken Arteria carotis vermittelten Schadigungsreizes
eine dosisabhangige (> 0,1 mol/l) signikante Reduktion der Zellkulturproliferation
sowie Reduktion der Intimaproliferation gegenuber den Kontrollcarotiden. Sokoloski et
al. (49) zeigten an einer Sarcomzelllinie eine nahezu komplette Proliferationsinhibition
beginnend ab 1,0 M bis 10 M MMF und einer 24-stundigen Inkubationsphase.
In unserem komplexeren Modell lieen sich sowohl erwartungsgema nach Wachstumsstimulus mit TNF- eine signikante Proliferationszunahme (Verdoppelung der proli
ferierenden glatten Muskelzellen) als auch, in Ubereinstimmung
mit o.g. Voruntersuchungen und dem guanosindepletierenden Eekt von MMF, eine signikante Proliferationshemmung um 80{90 % sowohl der mittels TNF- stimulierten als auch nichtstimulierten (und somit \normalaktiven") glatten Muskelzellen erzielen. Da dieser Eekt
unabhangig von den Eekten auf die Adhasion/Transmigration aufgetreten ist, zeigt
sich hier ein additiver Vorteil von MMF mittels des dualen Wirkmechanismus auf Proliferation und Glykosylierung. Aus den hier genannten Untersuchungen ergibt sich die
Moglichkeit, mittels der systemisch erreichbaren Plasmakonzentration von MMF eine
z.B. nach PTCA/Stent resultierende reaktive Proliferation glattmuskularer Zellen zu
reduzieren.
5 Zusammenfassung
Hintergrund: Nach wie vor haben die koronare Atherosklerose und die Restenose nach
Stentimplantationen einen groen Anteil an der Gesamtmortalitat und -morbiditat
weltweit. Wir haben unter den Bedingungen einer 3-dimensionalen Cokultur aus humanen koronaren Endothel- und glatten Muskelzellen die Auswirkungen einer antiproliferativen und immunsuppressiven Therapie mit Mycophenolatmofetil (MMF) auf
Adhasion, Transmigration von Monozyten und die glattmuskulare reaktive Proliferation erarbeitet.
Methodik: Das Translter-Co-Kultur(TCK)-Modell mit koronaren glatten Muskel-
zellen und koronaren Endothelzellen jeweils humanen Ursprungs imitiert die Gefainnenwand. Getrennt werden die beiden Zellarten analog zur Lamina elastica interna
durch einen kollagenbeschichteten porosen Polycarbonatlter. Dieses Modell erlaubt
im Gegensatz zur Monokultur auch die Untersuchung von Interaktionen der beteiligten Zellarten, wie sie in vivo stattnden. Nach zweiwochiger Co-Kultivierung erfolgt
die Zugabe von Monozyten (MC) ohne und mit 18-stundiger Prainkubation der Cokultur mit MMF. Nach 1, 2, 3, 4, 6 und 24 Stunden erfolgte eine Fixation der Filter und
mittels Fluoreszenzfarbung in der Filteraufsicht die Bestimmung von Adhasion und
Chemotaxis und im Falle der Werte fur 24 Stunden die Messung der reaktiven glattmuskularen Proliferation durch immunhistochemische Anfarbung eines eingebrachten
Basenanalogons.
Ergebnisse: Die Adhasion der Monozyten wird unter MMF zwischen 8 % und 64,1 %
jeweils nach Tumornekrosefaktor(TNF)--Stimulation gesteigert mit Signikanz bei 1,
2 und 6 Stunden. Das Adhasionsmaximum ist bereits eine halbe Stunde nach Monozytenzugabe erreicht. Die Transmigration der Monozyten wird unter MMF mit zunehmender Zeit und bei 2, 3, 6 und 24 Stunden signikant zwischen 48 und 96 % inhibiert.
Das Transmigrationsmaximum liegt zwischen 3 und 6 Stunden. In den Proliferationsexperimenten zeigte sich eine signikante (p< 0,001) Reduktion der Proliferation unter
MMF nach vorheriger TNF--Stimulation zwischen 87 % und 96 %.
Schlussfolgerung: Die Eekte von MMF auf Adhasion und Transmigration sind dia-
metral, d.h. es ndet eine signikante Adhasionszunahme bei signikanter Abnahme
der Transmigration statt. Dies kann nicht durch den Synthese hemmenden und somit eigentlich gleichgerichteten Eekt von MMF auf die Inosinmonophosphatdehydrogenase

zuruckgefuhrt werden. Denkbar ware, dass in Ubereinstimmung
mit den Ergebnissen
anderer Arbeitsgruppen eine durch MMF modizierte Glykosylierung der fur Adhasion
und Transmigration verantwortlichen Selektine und Integrine vorliegt. Es zeigte sich
in systemisch erreichbaren Konzentrationen von MMF (50 g/ml) eine Proliferationshemmung der glatten Muskelzellen, die zusammen mit der Inhibition der Monozyten-
41
j 42
transmigration im klinischen Einsatz in der Lage sein konnte, eine Restenose und auch
eine fruhe Atherosklerose zu reduzieren.
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Danksagung und Widmung
Ich danke allen, die mich bei der Anfertigung dieser Arbeit unterstutzt haben. Zuallererst mochte ich mich bei meinen Eltern, meiner Schwester und meiner Freundin
bedanken, die mir immer wieder zur Seite standen. Ein besonderer Dank gilt im speziellen Herrn PD Dr. med. Rainer Voisard fur die Anvertrauung der auerst interessanten
Fragestellung und die hervorragende Betreuung, Frau Regine Baur und Frau Tina Herter fur die stets tatkraftige Unterstutzung, die Hilfe beim Erlernen der technischen
Aspekte und das Schneiden der Paranblocke. Daruberhinaus danke ich der Universitat Ulm fur eine ausgesprochen interessante und erfahrungsreiche Studienzeit und den
kardiologischen Labors fur das angenehme Arbeitsklima.
Ich widme diese Arbeit meinem Patenkind Florian Emilio Christian Prumbs, moge
er bzw. vorerst seine Eltern in seinem noch jungen Leben immer die bestmoglichen
Entscheidungen treen.
49