1. No category

Aus dem Physiologischen Institut der
Tierärztlichen Hochschule Hannover
und aus dem
Universitätsklinikum Münster
Medizinische Klinik und Poliklinik C (Kardiologie und Angiologie)
__________________________________________________________
Kardiale Phänotypisierung heterozygoter Plakoglobin-defizienter
Mäuse mittels Echokardiographie und Telemetrie
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Melanie Zwiener
aus Schloß Holte- Stukenbrock
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder
Tierärztliche Hochschule Hannover
PD Dr. Paulus Kirchhof
Universitätsklinikum Münster
1. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder
2. Gutachter:
Prof. Dr. Gregor Hauschild
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2006
Die Dissertation wurde angefertigt im Rahmen des Projektes Ki 099-04 des IZKF
Münster mit Unterstützung der zentralen Projektgruppe „Kleintierphänotypisierung“
des IZKF Münster (ZPG 4).
Meinem Mann
und meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung..............................................................................................9
2. Stand der Forschung..........................................................................12
2.1 ARVC (Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie)................ 12
2.1.1
Naxos-Disease beim Menschen.......................................................... 17
2.1.2
ARVC bei Tieren ................................................................................. 19
2.1.2.1
Poll Hereford Kälber ........................................................................ 19
2.1.2.2
Hund ................................................................................................ 19
2.1.2.3
Katze ............................................................................................... 21
2.1.2.4
Maus................................................................................................ 21
2.2 Plakoglobin............................................................................................. 22
2.2.1
Aufbau................................................................................................. 22
2.2.2
Funktion .............................................................................................. 22
2.2.2.1
Intercalated Discs – Plakoglobin vs. β-Catenin ............................... 24
2.2.2.1.1
Desmosomen............................................................................... 25
2.2.2.1.2
Adherens Junctions ..................................................................... 26
2.2.2.2
Wnt-Signalweg ................................................................................ 26
2.2.2.3
Phosphorylierung............................................................................. 27
2.2.2.4
Plakoglobin als Transkriptionsfaktor ................................................ 29
2.2.2.5
Apoptose / Tumorentwicklung ......................................................... 30
2.3 Plakoglobin-Defizienz............................................................................. 32
2.4 Elektrokardiographie bei der Maus ........................................................ 34
2.5 Echokardiographie bei der Maus ........................................................... 36
2.6 Fragestellung.......................................................................................... 38
3. Experimenteller Teil............................................................................40
3.1 Tiere und Tierhaltung ............................................................................. 40
3.1.1
3.1.2
Plakoglobin-defiziente Mäuse ............................................................. 40
Tierhaltung .......................................................................................... 42
3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen ................................................. 43
3.2.1
3.2.2
3.2.2.1
3.2.2.2
3.2.2.3
3.2.2.4
3.2.3
3.2.4
3.2.4.1
Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms................................ 43
Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms .......................... 44
Aufbau der Anlage........................................................................... 44
Implantation des Transmitters ......................................................... 47
Erstellung des Ruhe-EKGs.............................................................. 49
Erstellung des Belastungs-EKGs..................................................... 49
Auswertung der Elektrokardiogramme ................................................ 50
Telemetrisches EKG mit sympathomimetisch wirksamen Pumpen..... 52
Implantation der Pumpen ................................................................ 52
3.3 Transthorakale Echokardiographie ........................................................ 53
3.3.1
3.3.2
Durchführung ...................................................................................... 53
Auswertung ......................................................................................... 58
3.4 Schwimmtraining .................................................................................... 63
3.4.1
3.4.2
Durchführung ...................................................................................... 63
Auswertung ......................................................................................... 63
3.5 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen .................... 65
3.5.1
3.5.2
Durchführung ...................................................................................... 65
Auswertung ......................................................................................... 69
3.6 Histologische Untersuchung................................................................... 71
3.7 Positronen Emissions Tomographie (PET) ............................................ 72
3.8 Versuchsablauf und Tierversuchsgruppen............................................. 73
3.9 Statistik................................................................................................... 78
4. Ergebnisse .........................................................................................79
4.1 Echokardiographie ................................................................................. 79
4.1.1
4.1.2
Altersabhängiger Vergleich ................................................................. 79
Auswirkung von Ausdauertraining....................................................... 88
4.2 Elektrokardiogramm ............................................................................. 102
4.2.1 Oberflächenelektrokardiogramm ............................................................ 102
4.2.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm ...................................................... 104
4.3 Implantation von sympathomimetisch-wirksamen Pumpen ................. 109
4.4 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen .................. 112
4.5 Histologische Untersuchung................................................................. 116
5. Diskussion ........................................................................................117
5.1 Methodik............................................................................................... 117
5.1.1 Mausmodell ............................................................................................ 117
5.1.2 Echokardiographie.................................................................................. 118
5.1.3 EKG-Aufzeichnung ................................................................................. 120
5.1.4 Gabe von Sympathomimetika ................................................................ 122
5.2 Versuchsergebnisse............................................................................. 125
5.2.1 Zusammenfassung ................................................................................. 125
5.2.2 Rechtsventrikuläre Dilatation.................................................................. 126
5.2.3 Funktionsverminderung .......................................................................... 128
5.2.4 Arrhythmien ............................................................................................ 128
5.2.5 EKG-Morphologie ................................................................................... 130
5.3 Schlussfolgerungen.............................................................................. 132
6. Zusammenfassung...........................................................................134
7. Summary ..........................................................................................136
Literaturverzeichnis ..............................................................................137
Abbildungsverzeichnis..........................................................................177
Tabellenverzeichnis..............................................................................181
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................182
Anhang .................................................................................................186
Geräte ........................................................................................................ 186
Verbrauchsmaterialien ............................................................................... 187
1. Einleitung
1. Einleitung
Der plötzliche Herztod ist ein gefürchtetes Ereignis, das in Europa und den USA je
ca. 300.000 Todesfälle pro Jahr verursacht (PRIORI et al. 2001). Er ist definiert als
ein plötzlich und unerwartet auftretender Todesfall ohne vorausgehende Symptome
oder mit einem Symptombeginn von maximal 24 Stunden vorher (KANNEL et al.
1982;
ZIPES
und
WELLENS
1998).
Verantwortlich
dafür
sind
zumeist
Kammertachykardien und Kammerflimmern. Diese Arrhythmien entstehen häufig in
der linken Herzkammer. Allerdings wurden in Italien in 20% der Fälle bei jungen
Menschen und Sportlern die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie
(ARVC) als Ursache beschrieben (CORRADO et al. 2000a). Trotz zunehmender
Erkenntnisse zur klinischen Manifestation und zum Krankheitsverlauf sind die
pathogenetischen
und
-physiologischen
Ursachen
der
ARVC
und
die
Pathophysiologie der Arrhythmien bei ARVC noch weitgehend unbekannt.
Verursacht wird der plötzliche arrhythmische Herztod durch Kammerflimmern und
ventrikuläre Kammertachykardien, die zu einem Verlust der Pumpfunktion des
Herzens und damit zu einem Kreislaufstillstand führen. Für diese Arrhythmien gibt es
in einigen Fällen eine genetische Prädisposition. Neben dem langen QT-Syndrom
und
dem
Brugada-Syndrom,
die
durch
mutierte
Ionenkanäle
und
primär
elektrophysiologische Veränderungen verursacht werden, findet sich bei der ARVC
ebenfalls
eine
genetisch
bedingte
Neigung
zu
Kammertachykardien
und
arrhythmischem Herztod. Eine Dilatation des rechten Ventrikels sowie Reduktion der
rechtsventrikulären Ejektionsfraktion, ein Umbau des Myokards zu Fett- und
Bindegewebe und ein Vorkommen von Epsilonwellen bzw. Verbreiterung des QRSKomplexes im EKG sind Hauptkriterien zur Diagnose von ARVC. Sie weist zwar
charakteristische strukturelle Veränderungen des Herzens auf, geht jedoch zumeist
primär mit Kammertachykardien und plötzlichem arrhythmischem Herztod einher
(WICHTER et al. 2002). Die Arrhythmien treten bei ARVC-Patienten vor allem unter
Belastung auf. Zudem scheint ein hoher Anteil von Kammertachykardien bei
Sportlern mit inapparenten Formen der ARVC assoziiert zu sein (HEIDBUCHEL et al.
2003). Bei der ARVC gibt es bislang nur wenige Hinweise, dass die Zell-Kontakt-
9
1. Einleitung
Proteine verändert sind, wohingegen Gendefekte als Ursache des langen QT- und
Brugada-Syndroms schon länger bekannt sind (WICHTER et al. 2002).
Bei Patienten mit Naxos disease, einer Sonderform der ARVC mit zusätzlicher
palmo-plantarer Hyperkeratose und gelocktem Haar, finden sich Mutationen im
Plakoglobin-Gen, die ein nicht-funktionales Protein codieren (McKOY et al. 2000;
PROTONOTARIOS et al. 2002). In Untersuchungen des Universitätsklinikums
Münster konnte nachgewiesen werden, dass bei Patienten mit typischer ARVC der
Plakoglobin-Gehalt im Myokard selektiv im rechten Herzen vermindert ist
(unveröffentlichte Daten). Diese Befunde legen nahe, dass eine reduzierte
Expression von Plakoglobin ursächlich für die ARVC sein könnte. Plakoglobin ist ein
zytoskelettäres Protein aus der Familie der Catenine (RUIZ et al. 1996). Es verbindet
die Zytoskelettfilamente mit den Zellkontaktproteinen der so genannten Intercalated
Discs. Es wird angenommen, dass bei einer Veränderung dieser Verbindung der
Zellverband instabil wird (PROTONOTARIOS et al. 2002).
Homozygot Plakoglobin-defiziente Tiere weisen einen embryonal letalen Phänotyp
auf (RUIZ et al. 1996), der durch ein Fehlen der Desmosomen im Herzen und
Rupturen der Herzwand charakterisiert ist. Dagegen erreichen heterozygote Tiere
das Erwachsenenalter.
Um dem postulierten vermehrten Vorkommen von Arrhythmien durch ARVC bei
Ausdauersportlern Rechnung zu tragen, sollten in dieser Arbeit an einem transgenen
Tiermodell mit verminderter Expression von Plakoglobin die Auswirkungen von akuter
körperlicher und mentaler Belastung sowie von körperlichem Ausdauertraining auf
kardiale Funktion und Arrhythmien untersucht werden.
Im Einzelnen war es zunächst das Ziel der vorliegenden Studie, den Zusammenhang
zwischen
veränderter
rechtsventrikulärer
Plakoglobin-Expression
Kardiomyopathie
durch
kardiale
und
arrhythmogener
Phänotypisierung
an
heterozygoten Plakoglobin-defizienten Mäusen zu untersuchen. Des Weiteren sollten
die pathophysiologischen Ursachen der ARVC anhand des Mausmodells näher
charakterisiert
werden.
Hierzu
10
wurden
echokardiographische,
1. Einleitung
elektrokardiographische
und
elektrophysiologische
In-vivo-
und
In-vitro-
Untersuchungen durchgeführt, um folgende Fragen näher zu beleuchten:
Hat das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens Auswirkungen auf die
Elektrophysiologie und die Morphologie des Herzens?
Sind die Folgen einer heterozygoten Plakoglobin-Defizienz vom Alter der Tiere
und/oder dem Trainingszustand abhängig?
Treten unter Medikation mit β-Adreno-Rezeptor-Agonisten vermehrt Arrhythmien
oder Funktionsstörungen auf?
11
2. Stand der Forschung
2. Stand der Forschung
2.1 ARVC (Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie)
Im Jahr 1961 wurde die arrhythmogene rechtsventrikulare Dysplasie von DALLA
VOLTA et al. zuerst beschrieben und anschließend von FONTAINE et al. (1977)
charakterisiert. Eine familiäre Häufung ist bei 50% der Patienten nachweisbar.
Hierfür werden bereits diagnostizierte ARVC, plötzliche Herztode (SCD) und
ventrikuläre Tachykardien (VT) evaluiert. Eine variable Expression und eine
unvollständige Penetranz (30%) liegen bei der Vererbung der autosomal dominanten
Formen vor (McKENNA et al. 1994). Eine autosomal rezessive Form wurde in
Verbindung mit der Naxos disease (PROTONOTARIOS et al. 1986; McKOY et al.
2000) und mit Mutationen im Desmoplakin-Gen beschrieben (ALCALAI et al. 2003).
Es wurden bisher neun verschiedene Genloci entdeckt, die mit der ARVC in
Zusammenhang gebracht werden (s. Tab. 2.1.1).
12
2. Stand der Forschung
Tabelle 2.1.1: Mutationen, die mit der ARVC assoziiert sind
ARVC= Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie; Aut.-dom.= Autosomal-dominant; Aut.rez.= Autosomal-rezessiv; in der Chromosomenspalte steht die erste Zahl für die
Chromosomennummer, q steht für den langen Arm des Chromosoms und p für den kurzen Arm;
RyR2= kardialer Ryanodinrezeptor2; ?= noch unbekannt
Nach TOME ESTEBAN et al. 2004, McKOY et al. 2000 und ALCALAI et al. 2003
Lod-
Mutiertes
Score
Gen
Typ
Modus
Chromosom
ARVC1
Aut.-dom.
14q23-q24
5.4
ARVC2
Aut.-dom.
1q42-q43
4.0
Transf.
Wachstumsfaktor-β3
RyR2 (?)
ARVC3
Aut.-dom.
14q12-q22
4.7
?
SEVERINI et al. 1996
ARVC4
Aut.-dom.
2q32.1-q32.3
3.5
?
RAMPAZZO et al. 1997
ARVC5
Aut.-dom.
3p23
6.9
?
AHMAD et al. 1998
ARVC6
Aut.-dom.
10p12-p14
3.9
?
LI et al. 2000
ARVC7
Aut.-dom.
10q22
3.1
?
MELBERG et al. 1999
ARVC8
Aut.-dom.
6p24
4.3
Desmoplakin
RAMPAZZO et al. 2002
NAXOS
Aut.-rez.
17q21
3.6
Plakoglobin
COONAR et al. 1998
Aut.-rez.
6p24
?
Desmoplakin
NORGETT et al. 2000
Carvajal
Syndrom
Quelle
RAMPAZZO et al. 1994
BEFFAGNA et al. 2005
RAMPAZZO et al. 1995
Die ARVC führt vor allem bei jungen, männlichen, zuvor gesunden Patienten zu
einem plötzlichen Herztod ohne vorherige Symptome. Der plötzliche Herztod (SCD)
führt jährlich zu 300.000 Todesfällen in Europa (PRIORI et al. 2001). Allein in Italien
verursachte ARVC 20% aller plötzlichen Herztode in Individuen unter 35 Jahren und
22% der plötzlichen Herztode bei Athleten (ASANO et al. 2004). Etwa 50-75% der
plötzlichen arrhythmischen Todesfälle werden durch Kammerflimmern (KANNEL et
al. 1982) und ventrikulären Kammertachykardien verursacht. Diese führen zu einem
Verlust der Pumpfunktion des Herzens und damit zu einem Kreislaufstillstand. Für
diese Arrhythmien gibt es in einigen Fällen eine genetische Prädisposition. Neben
dem langen QT-Syndrom und dem Brugada-Syndrom, die durch mutierte
Ionenkanäle und primär elektrophysiologische Veränderungen verursacht werden,
findet sich bei der Arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVC)
13
2. Stand der Forschung
ebenfalls
eine
genetisch
bedingte
Neigung
zu
Kammertachykardien
und
arrhythmischem Herztod (WICHTER et al. 2002).
Man teilt die ARVC in vier Stadien ein:
1. Die frühe und stille Phase, die meistens asymptomatisch verläuft. Es kann
allerdings bereits zu der ersten Manifestation des plötzlichen Herztodes
kommen (FURLANELLO et al. 1998).
2. Die instabile Phase, in der symptomatische Arrhythmien dominieren, vor allem
in
Form
von
Kammertachykardien
mit
Linksschenkelblock,
also
mit
rechtsventrikulärem Ursprung.
3. Phase der rechtsventrikulären Fehlfunktion, mit einer noch relativ gut
ausgeprägten linksventrikulären Funktion.
4. Finale Phase mit progressiver biventrikulärer Dilatation, oftmals nicht mehr
von einer dilatativen Kardiomyopathie zu unterscheiden. Die häufigsten
Komplikationen in diesem Stadium sind Thrombembolien und Vorhofflimmern
(CORRADO et al. 2000a).
Indirekte Hinweise lassen vermuten, dass Ausdauersport die Manifestation der
ARVC begünstigt. In einer Erfassung von Sportlern mit Arrhythmien oder Synkopen
hatten
mehr
als
die
Hälfte
der
Patienten
rechtsventrikuläre
Arrhythmien
(HEIDBUCHEL et al. 2003). Bei der ARVC wurde eine Imbalanz der adrenergen
Innervation als ein möglicher Faktor in der Genese von Arrhythmien beschrieben. In
einer Studie von WICHTER et al. (2000) zeigte sich eine reduzierte β-adrenerge
Rezeptorendichte
bei
ARVC-Patienten.
So
könnte
bei
einer
verstärkten
Katecholaminausschüttung die Neigung zu ventrikulären Arrhythmien vor allem bei
sportlicher Belastung ansteigen (WICHTER et al. 2000).
Die
ARVC
ist
eine
der
häufigsten
angeborenen
degenerativen
Herzmuskelerkrankungen, bei denen es zu einer Verdünnung der rechtsventrikulären
Wand, aneurysmaler Dilatation des rechten Ventrikels und/oder dessen Dysfunktion
kommen kann. Sie führt wahrscheinlich zu regional induzierter Apoptose (MALLAT et
al. 1996) vorwiegend des rechtsventrikulären Myokards mit nachfolgendem Ersatz
durch Fett- und/oder Bindegewebe (WICHTER et al. 2002). Hierbei erfolgt der
14
2. Stand der Forschung
Umbau vom Subepicardium ausgehend zum Subendocardium (THIENE et al. 1988;
CORRADO et al. 1997; MARCUS et al. 1982). Ebenso wurden in kleineren Bezirken
inflammatorische Infiltrate (hauptsächlich Lymphozyten) beschrieben (THIENE et al.
1991).
Aufgrund der Komplexität dieser Erkrankung wurden standardisierte diagnostische
Kriterien von der ARVC-Arbeitsgruppe der “Myocardial and Pericardial Disease of the
European
Society
of
Cardiology”
und
von
dem
„Scientific
Council
on
Cardiomyopathies of the International Society and Federation of Cardiology“ verfasst
(McKENNA et al. 1994; s. Tab. 2.1.2).
15
2. Stand der Forschung
Tabelle 2.1.2: Diagnostische Kriterien der ARVC
Die Diagnose wird gestellt bei Vorliegen von mindestens zwei Hauptkriterien oder einem
Hauptkriterium und zwei Nebenkriterien oder bei vier Nebenkriterien aus verschiedenen
Diagnosekategorien (I-VI). EKG: Elektrokardiogramm; LV: linker Ventrikel; RV: rechter Ventrikel; VT:
ventrikuläre Tachykardie
a
entdeckt mit Hilfe der Echokardiographie, Angiographie, MRI (magnetic resonance imaging) oder
Radionuklid Szintigraphie
I. Familiäre Häufung
Hauptkriterium
Familiäre Erkrankung bestätigt durch Autopsie oder Chirurgie
Nebenkriterium
Familiäres Vorkommen eines plötzlichen Todes im Alter von unter 35 Jahren und
einer vermuteten klinischen Diagnose von ARVC bei Familienmitgliedern
II. EKG Depolarisations Abnormalitäten
Hauptkriterium
Epsilonwellen oder Verbreiterung des QRS-Komplexes (≥110ms) in den
Ableitungen V1-V3
Nebenkriterium
Späte positive Potentiale
III. EKG Repolarisations Abnormalitäten
Nebenkriterium
T-Wellen Inversion in den rechts präkordialen Ableitungen (V2-V3) bei Patienten
über 12 Jahren ohne Rechtsschenkelblock
IV. Arrhythmien
Nebenkriterium
Linksschenkelblock-Morphologie bei anhaltender oder nicht anhaltender VT im
EKG, Holter monitoring oder unter Belastung
V. Globale und/oder regionale Dysfunktion und strukturelle Abnormalitätena
Hauptkriterium
Deutliche Dilatation und Reduktion der RV Ejektionsfraktion, mit/ohne geringe
Einbeziehung des LV
RV Aneurysma (akinetische oder dyskinetische Regionen mit diastolischer
Ausweitung)
Deutliche segmentale Dilatation des RV
Nebenkriterium
Moderate globale RV Dilatation und Reduktion der RV Ejektionsfraktion mit
normalem LV
Moderate segmentale RV Dilatation
Regionale RV Hypokinesie
VI. Gewebecharakterisierung
Hauptkriterium
Umbau des Myokards mit Ersatz durch Fett- und/oder Bindegewebe bei einer
endomyokardialen Biopsie
Die medikamentöse Behandlung mit Sotalol und Amiodaron in Verbindung mit oder
ohne Beta-Blocker hat sich als effektiv bei symptomatischen Arrhythmien bewährt
(CORRADO et al. 2000b; DALIENTO et al. 1990). Bei Patienten mit einem erhöhten
16
2. Stand der Forschung
Risiko sollte eine Implantation eines Defibrillators in Betracht gezogen werden
(WICHTER et al., 2004).
2.1.1 Naxos-Disease beim Menschen
Bei der Naxos-Disease, einer rezessiv vererbten Sonderform der ARVC, handelt es
sich um eine 2-Basen-Deletion im Plakoglobin-Gen, die einen Frameshift verursacht,
und dadurch zu einem vorzeitiger Kettenabbruch führt. Der Genlocus 17q21 ist die
chromosomale Lokation von Plakoglobin und liegt auf dem langen Arm des
Chromosoms 17 (COONAR et al., 1998; WICHTER et al., 2002; COWLEY et al.,
1997). Die Mutationen im Plagoklobin-Gen codiert ein nicht-funktionales Protein und
führt zu einem Abbruch im C-terminalen Ende nach der 56. Aminosäure (McKOY et
al., 2000). Das mutierte Protein hat wahrscheinlich trotz der Abwesenheit des Cterminalen Endes noch einige funktionelle Aktivität, da der Phänotyp dieser Patienten
bei weitem nicht so gravierend ist, als der von Plakoglobin-/- Mäusen (BIERKAMP et
al., 1996; RUIZ et al., 1996).
Bei Patienten mit Naxos-Disease geht die Erkrankung mit einer zusätzlichen palmoplantaren Hyperkeratose und gelocktem Haar einher (PROTONOTARIOS et al.
2002). Die Expression des Haut- und Haarphänotyps entwickelt sich bereits in der
frühen Kindheit, wohingegen die pathologischen Anzeichen am Herzen sich erst im
Erwachsenenalter zu einer 100%igen Penetranz manifestieren (PROTONOTARIOS
et al. 1997). Eine Synkope ist meist das erste Anzeichen der kardialen Erkrankung.
Mit einem 12-Kanal EKG und einer zweidimensionalen Echokardiographie kann man
diese Form der ARVC nach den etablierten Kriterien (siehe Tab. 2.1.2)
diagnostizieren (PROTONOTARIOS et al. 2002). Die charakteristische Ausprägung
der kardialen Veränderung entspricht denen im ARVC-Kapitel beschriebenen. Es tritt
eine rechtsventrikuläre Dilatation ein, die bei fortgeschrittenen Formen auch den
linken Ventrikel betreffen kann. Die rechtsventrikuläre freie Wand ist dünner und geht
mit fettig-fibrösem Ersatzgewebe im Einfluss- und/oder Ausflusstrakt des rechten
Ventrikels sowie im rechtsventrikulären Apex einher. In einem 12-Kanal Ruhe-EKG
findet man in 90% der Fälle kleinere, oft unspezifische Abweichungen bei erkrankten
Adulten.
Am
häufigsten
kommen
T-Wellen-Inversion
und
QRS-Komplex-
Verbreiterungen (>110 ms) in den Ableitungen V1 bis V3 vor (PROTONOTARIOS et
17
2. Stand der Forschung
al. 2002). Inkompletter oder kompletter Rechtsschenkelblock liegt bei Naxos disease
Patienten im gleichen Verhältnis, wie bei den anderen Formen der ARVC vor
(MARCUS et al., 1982). Bei fortgeschrittener Progression mit Einbeziehung des
linken Ventrikels zeigen einige Patienten auch einen Linksschenkelblock. Dies ist
nicht
zu
verwechseln
mit
den
linksschenkelblockähnlichen
ventrikulären
Extrasystolen, die beim Großteil der Patienten auftreten (PROTONOTARIOS et al.
2002).
Andere Familien mit ähnlichen klinischen Manifestationen wurden dokumentiert
(HAMMILL et al. 1988; TOSTI et al. 1994; CARVAJAL-HUERTA 1998). Bei einer
weiteren Sonderform der ARVC in Ecuador befindet sich eine Mutation im Gen von
Desmoplakin, einem weiteren zytoskelettären Protein, das an der Bildung der
Desmosomen beteiligt ist. Dies führt zu einer klassischen, autosomal-dominant
vererbten Form der ARVC (NORGETT et al. 2000). Interessanterweise liegt diese
Mutation im Bereich einer Bindungsstelle am Plakoglobin (RAMPAZZO et al. 2002).
Zusätzlich entdeckten ALCALAI et al. (2003) eine rezessive Mutation des
Desmoplakingens, das zu ARVC, Hautveränderung und lockigem Haar führte.
Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass Veränderungen in den ZytoskelettProteinen,
wie
beispielsweise
Plakoglobin,
eine
Pathogenese der ARVC spielen (WICHTER et al. 2002).
18
wesentliche
Rolle
bei
der
2. Stand der Forschung
2.1.2 ARVC bei Tieren
2.1.2.1
Poll Hereford Kälber
Ein letales, autosomal-rezessives, kardiokutanes Syndrom (CWH: Cardiomyopathy
and wooly haircoat syndrome) wurde bei Poll Hereford Kälbern in Australien
dokumentiert (WHITTINGTON und COOK 1988; COOK 2003). Betroffene Tiere
können bereits bei der Geburt anhand des unverwechselbaren wolligen Haarkleides
erkannt werden und leiden an ventrikulären Arrhythmien. In manchen Fällen
entwickelt sich eine neonatale Keratitis. In der Elektrokardiographie werden geringe
Amplituden, flache T-Wellen, ventrikuläre Extrasystolen und
Episoden von nicht-
anhaltenden ventrikulären Tachykardien registriert (WHITTINGTON und COOK
1988). Der Tod tritt meist innerhalb der ersten 12 Wochen nach der Geburt ein und
kann plötzlich, aufgrund von Kammerflimmern (oft nach physischer Anstrengung),
oder als Folge von einer Herzinsuffizienz auftreten. Der klinische Phänotyp der CHW
teilt Ähnlichkeiten mit dem humanen kardiokutanen Syndrom der Naxos disease
beim Haarphänotyp, bei kardialen Arrhythmien und elektrokardiographischen
Abnormalitäten. Bei dem CWH-Syndrom können Schäden in beiden Herzkammern
auftreten, die einen multifokalen bis lokalen extensiven Myokardmangel mit fibrösem
Ersatzgewebe und gelegentlich kalzifizierte Bereiche beinhalten. Subepikardiale
Fibrosen der rechtsventrikulären freien Wand sind meistens die führende
Veränderung (COOK 2003). Das Fehlen einer fettigen Infiltration könnte eine
schnelle Entwicklung der Krankheit in Kälbern widerspiegeln, die zu einem
frühzeitigen Herztod führt. Die ventrikuläre Kalzifikation ist vergleichbar mit dem
beschriebenen Phänomen bei einem Menschen mit einer homozygoten Mutation des
Plakoglobin-Gens, wobei ebenso eine Kalzifikation der rechtsventrikulären freien
Wand auftreten kann (BASSO et al. 2001).
2.1.2.2
Hund
1994 und 1995 wurden bereits Fallbeispiele von rechtsventrikulärer Kardiomyopathie
bei Hunden beschrieben (SIMPSON et al. 1994; BRIGHT et al. 1995). Eine Dekade
19
2. Stand der Forschung
später wurde von BASSO et al. (2004) eine Studie mit 23 Boxern erstellt, bei denen
eine Form der ARVC und/oder ein plötzlicher Herztod eintrat. Die klinischen Profile
sind plötzlicher Herztod, Synkopen und ventrikuläre Arrhythmien (vermutlich
ausgehend von dem rechten Ventrikel). Die pathologischen Abnormalitäten sind
rechtsventrikuläre Dilatation und Aneurysmata, rechtsventrikulärer Myokardschwund
und fettiges oder fettig-fibröses Ersatzgewebe, Myokarditis und Apoptose. Die
Kombination der klinischen Profile und der pathologischen Abnormalitäten scheint
ein deutlicher Beleg für das canine Modell der ARVC zu sein. In der Studie starben
39% der Tiere plötzlich, wobei dies bei 78% während einer leichten oder stärkeren
körperlichen Anstrengung passierte. Bei 83% der Tiere zeigten sich ventrikuläre
Extrasystolen
in
einer
Linksschenkelblock-Morphologie
und
in
48%
traten
ventrikuläre Tachykardien auf. Ein familiärer Zusammenhang konnte in 43% der
Fälle dokumentiert werden. Bei allen Tieren wurde Myokard durch entweder fettiges
(65%) oder fettig-fibröses (35%) Gewebe ersetzt, das sich vom Epikard zum
Endokard ausbreitete. Myokarditis wurde beim größten Teil der Tiere sowohl im
rechten als auch im linken Ventrikel und teilweise sogar im rechten oder linken
Atrium entdeckt. Zusätzlich konnte eine Apoptose der Myozyten in 39% der Fälle
histologisch belegt werden. Myokarditis und fettig-fibröses Ersatzgewebe waren
charakteristisch für Boxer mit ARVC, die plötzlich verstorben sind (BASSO et al.
2004). Bei einer Untersuchung von SPIER und MEURS (2004a) wurden bei zehn
Boxern, die an ARVC erkrankt waren, Langzeit-EKGs angefertigt. Hierbei zeigten
sich Änderungen von ≤ 80% in der Häufigkeit von ventrikulären Arrhythmien, die
wahrscheinlich in der spontanen Variabilität bei der caninen Form der ARVC
begründet liegen (SPIER und MEURS 2004a). Weiter konnte eine verringerte
Herzfrequenzvariabilität bei Boxern mit einer kongestiven Herzinsuffizienz gezeigt
werden (SPIER und MEURS 2004b). Bei ARVC betroffenen Hunden mit
ausgeprägten Arrhythmien werden momentan zwei Therapieprotokolle empfohlen: 1.
Sotalol (1,5 – 2,0 mg/kg oral, 2x täglich) oder 2. eine Kombination aus Mexiletine (5-8
mg/kg oral, 3x täglich) und Atenolol (12,5 mg pro Hund, oral 3x täglich) (MEURS
2004). Aufgrund jüngster Studien kann bei der ARVC des Boxers eine Veränderung
20
2. Stand der Forschung
im kardialen Ryanodinrezeptor vermutet werden (MEURS et al. 2005), wie sie auch
in der ARVC 2 vorliegt.
2.1.2.3
Katze
In einer Studie über ARVC bei Katzen, konnten 12 Tiere mit eindeutigen Symptomen
beschrieben werden (FOX et al. 2000). Bei allen Tieren lag eine moderate bis
erhebliche
Rechtsherzvergrößerung
mit
gleichzeitiger
Wandverdünnung
und
teilweise ein oder mehrere Aneurysmata vor. Ebenso konnten bei allen Tieren mit
Hilfe einer histologischen Untersuchung eine rechtsventikuläre Schädigung (aufgrund
von myozytärem Tod und Atrophie) sowie das Vorkommen von Ersatzgewebe (fettig
oder fettig-fibrös) belegt werden. Diese histologisch erkennbaren Schäden waren bei
dem Großteil der Tiere auch im linken Ventrikel und teilweise auch in den Vorhöfen
darstellbar. Eine Myokarditis war in zehn Fällen und Apoptose in neun Fällen
nachweisbar. Im EKG wurden supraventrikuläre Tachyarrhythmien, ventrikuläre
Tachykardien, polymorphe ventrikuläre Arrhythmien und Rechtsschenkelblöcke
beschrieben.
2.1.2.4
Maus
ASANO et al. (2004) haben eine Mauslinie mit erblicher rechtsventrikulärer Dysplasie
gefunden, verursacht durch eine Mutation des Laminin Rezeptor 1-Gens (Lamr1).
Hierbei traten keine letalen Tachyarrhythmien auf, wie sie häufig bei der humanen
ARVC zu finden sind. Im EKG wurden aber elektrische Übergangsleitungsinhomogenitäten,
die
zu
einer
verlängerten
QRS-Dauer
führten,
entdeckt.
Typischerweise wurde auch hier eine Degeneration der rechtsventrikulären
Kardiomyozyten festgestellt. Dabei waren besonders die äußeren Kardiomyozyten
betroffen. Aufgrund dessen wurde von den Autoren vermutet, dass ein erhöhter
mechanischer Streß eine vermehrte Expression von zytoprotektiven Genen
hervorruft. Dies würde den Unterschied zwischen links- und rechtsventrikulär sowie
zwischen den inneren und äußeren Kardiomyozyten erklären (ASANO et al. 2004).
Weiter wurden ähnliche rechtsventrikuläre Veränderungen bei einem Nerz
beschrieben (ISHIKAWA et al. 1977).
21
2. Stand der Forschung
2.2 Plakoglobin
2.2.1 Aufbau
Plakoglobin (COWIN et al. 1986), auch bekannt unter der Bezeichnung γ-Catenin
(OZAWA et al. 1989), wurde als erstes Mitglied der Armadillo Protein Familie
entdeckt (COWIN et al. 1986; FRANKE et al. 1989). Diese ist charakterisiert durch
eine zentrale Domäne, die zusammengesetzt ist aus einer variablen Anzahl von arm
(Armadillo) repeats. Diese Wiederholungen, die je 42 Aminosäuren beinhalten,
wurden identifiziert als ein Genprodukt von Drosophila armadillo, das in die wingless
Signalkette involviert ist (PFEIFER und WIESCHAUS 1990; PFEIFER et al. 1994;
PFEIFER 1995). Weitere Mitglieder dieser Familie sind β-Catenin, α-Importin, p120ctn
und
das
APC-(adenomatous
polyposis
coli)
Genprodukt.
Sie
haben
unterschiedlichste Funktionen, wie z.B. Kontrolle in der Embryogenese, Zell-ZellKontakte, Tumorprogression, Kernimport und Signaltransduktion (HÜLSKEN et al.
1994; KUSSEL und FRASCH 1995; TÖRÖK et al. 1995; PFEIFER 1996).
Plakoglobin besteht aus drei Subdomänen. Die zentrale Domäne setzt sich aus 12
arm repeats zusammen. Diese Region weist einen hohen Homologitätsgrad (76-83%
identisch) zwischen Plakoglobin und β-Catenin auf (WILLIAMS et al. 2000; BUTZ et
al. 1992; FOUQUET et al. 1992). Es ist in einer Superhelix gefaltet, die sich aus 36
kleinen α-Helices (drei je armadillo repeat) zusammensetzt (HUBER et al. 1997). Die
Armadillo repeat Domäne wird durch saure terminale Amino- und Carboxyl-Domänen
begrenzt. Die Ähnlichkeit der Proteinendungen zwischen β-Catenin und Plakoglobin
sind relativ gering: die C-terminale Domäne stimmt in 41-57% und die N-terminale
Domäne in 15-29% überein (WILLIAMS et al., 2000; FOUQUET et al., 1992).
2.2.2 Funktion
Plakoglobin
dient
als
Komponente
an
verschiedenen
Zell-Zellverbindungen
einschließlich Desmosomen, Zonulae adherentes im Epithel, Belt-Plaques im
Endothel und in Verbindungen ohne nachweisbare Filamente, wie im lymphatischen
Endothel und Granularzellen der zerebellären Glomeruli (FRANKE et al. 1987;
GARROD 1993; SCHMIDT et al. 1994; ROSE et al. 1995). Es ist das einzige Protein,
22
2. Stand der Forschung
das sowohl in Desmosomen als auch in Adherens Junctions vorkommt (MATHUR et
al. 1994; SACCO et al. 1995; CHITAEV et al. 1996; WITCHER et al. 1996).
Plakoglobin liegt in freier und in gebundener Form im Zytosol vor.
Abbildung 2.2.2: Die verschiedenen Funktionen von Plakoglobin (ZHURINSKY et al. 2000b)
Plakoglobin (Pg) kann an dem zytoplasmatischen Ende des Cadherin AdhäsionsRezeptors in den Adherens Junctions (AJ) binden. Über α-Catenin (α) gehen
Plakoglobin und β-Catenin (β) eine Cadherin-Verbindung mit dem Aktin-Zytoskelett
ein. Plakoglobin kann im Gegensatz zum β-Catenin zusätzlich mit den
desmosomalen Cadherinen Desmocollin und Desmoglein in den Desmosomen
(DES) eine Verbindung eingehen, und über Desmoplakin (Dsp) und Plakophilin
(Plp) auch mit intermediären Filamenten (IF).
Wenn die Wnt (wingless bei Drosophila)-Signalkette nicht aktiviert ist, wird freies
Plakoglobin in einem Multimolekularem Komplex abgebaut. Dieser beinhaltet den
Tumor Supressor APC (adenomatous polyposis coli), Axin und GSK (Glykogen
Synthase Kinase), die wiederum Plakoglobin phosphoriliert (PP). Dieser Komplex
steht über die Ubiquitin Lygase β-TrCP in Verbindung mit dem UbiquitinProteasomen System, welche (zusammen mit Cul1 und Skp1) die Ubiquitination
(Ub) von Plakoglobin vermittelt und somit zu dem Abbau durch Proteasomen führt.
Die Verbindung von Wnt mit dem Frizzled (Frz)-Rezeptor aktiviert die WntSignalkette, und Dishevelled (Dsh) unterdrückt die Plakoglobin Phosphorilierung
durch Hemmung der GSK-Aktivität. Dies führt zu einer Akkumulation von
Plakoglobin. Die Fähigkeit von Plakoglobin zur Transkription in einem Komplex mit
TCF (T-Zell Faktor) wird noch kontrovers diskutiert.
23
2. Stand der Forschung
2.2.2.1
Intercalated Discs – Plakoglobin vs. β-Catenin
Plakoglobin ist ein zytoskelettäres Protein aus der Familie der Catenine (RUIZ et al.
1996). Es verbindet die Zytoskelettfilamente mit den Zellkontaktproteinen der
Intercalated Discs (RUIZ et al. 1996) und spielt somit eine entscheidende Rolle in
den Desmosomen und Adherens Junctions. Es dient als Stützpfeiler in der
Architektur der Intercalated Discs und ist damit auch für die Stabilität des
Herzgewebes verantwortlich (RUIZ et al. 1996). Bei einer Veränderung in diesen
Verbindungen wird eine darauf folgende Instabilität des Zellverbandes vermutet
(PROTONOTARIOS et al. 2002).
Sowohl in kardialen als auch epidermalen Zell-Zell-Kontakten formt Plakoglobin
zusammen mit Cateninen, klassischen und desmosomalen Cadherinen und
Mitgliedern der Plakinfamilie die Kernstruktur für Adhäsion und interzelluläre
Signalleitung (RUIZ et al. 1996).
Plakoglobin kommt sowohl in den Desmosomen, als auch in den Adherens Junctions
vor (COWIN et al. 1986; s. Abb. 2.2.2) und hat hier eine vergleichbare Funktion wie
β-Catenin (COWIN und BURKE 1996; SCHMIDT et al. 1994). Ein Wettbewerb
zwischen
den
klassischen
und
den
desmosomalen
Cadherinen
um
eine
Plakoglobinbindung ist Bedingung für eine Regulation des Aufbaus dieser Zell-ZellVerbindungen (BEN-ZE’EV und GEIGER 1998; COWIN und BURKE 1996; LEWIS et
al. 1997).
Obwohl Plakoglobin die klassischen Cadherine über α-Catenin mit Aktin in den
Adherens Junctions verankern kann, verliert es diese Fähigkeit, wenn es in den
Desmosomen eingebunden ist (CHITAEV et al. 1998).
Im Gegensatz zu den Arm-Domänen von β-Catenin und Plakoglobin sind die N- und
C-terminalen Domänen nur in wenigen Bereichen ähnlich (COWIN und BURKE
1996). Weitere Studien belegen, dass die terminalen Domänen auch verantwortlich
sind für die Interaktionen der Arm-Domäne mit anderen Proteinen (CHITAEV et al.
1996; PALKA und GREEN 1997; ZHURINSKY et al. 2000a). Zum Beispiel wird durch
Deletion der C-terminalen Domäne die Bindung von Cateninen zu Cadherinen mit
dem Arm repeats positiv beeinflusst (CHITAEV et al. 1996). Solch eine Deletion kann
24
2. Stand der Forschung
ebenso den Aufbau von Plakoglobin-beinhaltenden Desmosomen stimulieren
(PALKA und GREEN 1997).
SCHNITTLER et al. (1997) haben eine verringerte Zelladhäsion bei Inhibition der
Plakoglobinexpression
in
endothelialen
Flüssigkeitsscherspannung
ausgesetzt
Zellen
waren.
Diese
entdeckt,
Entdeckung
die
lässt
einer
die
Vermutung zu, dass Plakoglobin für die endothelialen interzellulären Verbindungen
benötigt wird, um dem mechanischen Stress standzuhalten. Plakoglobin scheint
somit eine entscheidende Rolle in der endothelialen Zell-Zell-Adhäsion und
Barrierefunktion inne zu haben (VENKITESWARAN et al. 2002).
2.2.2.1.1
Desmosomen
Desmosomen kommen gehäuft in Herzmuskelzellen und in Keratinozyten vor. Hier
formen sie symmetrische Plaques, die mehrere Mikrometer im Durchmesser und ca.
100 nm dick sind. Jede Hälfte der Desmosomen ist abgeleitet von einer
benachbarten Zelle, in welcher intermediäre Filamente einen Anker durch die
zytoplasmatische Peripherie zu bilden scheinen (KELLY 1966).
Plakoglobin bindet in den Desmosomen die desmosomalen Cadherine (Desmocollin
und Desmoglein (TROYANOVSKY et al. 1994a,b)) an Desmoplakin, Plakophilin
(KOWALCZYK et al. 1997) und epidermales Keratin (SMITH und FUCHS 1998).
Plakoglobin stellt über Desmoplakin, Plakophilin und Keratin eine Verbindung zu dem
intermediären Filamenten des Zytoskeletts her (SCHMIDT et al. 1994; s. Abb. 2.2.2).
Besonders
dokumentiert
wurde
die
Verbindung
zwischen
Plakoglobin
und
Desmoglein, die stärker zu sein scheint als zwischen Plakoglobin und Desmocollin
(MATHUR et al. 1994; TROYANOVSKY et al. 1994b; TROYANOVSKY et al. 1996;
CHITAEV et al. 1996; WAHL et al. 1996; WITCHER et al. 1996; KOWALCZYK et al.
1997).
Das Fehlen von Plakoglobin führt zu drastischen Veränderungen in der Architektur
der Intercalated Discs: Typische Desmosomen fehlen in den Intercalated Discs von
Plakoglobin-/- Mäusen (RUIZ et al. 1996). In epithelialen Zellen findet man
stattdessen bei Plakoglobin Knockout-Mäusen β-Catenin in den sonst β-Cateninfreien Desmosomen. Trotzdem kann β-Catenin nicht alle desmosomalen Proteine mit
25
2. Stand der Forschung
all ihren molekularen Interaktionen korrekt verbinden; dies erscheint besonders
auffällig, wenn Zellen normalem mechanischen Stress ausgesetzt sind (BIERKAMP
et al. 1999; RUIZ et al. 1996). SMITH und FUCHS (1998) haben auch in einer In
vitro-Analyse eine Plakoglobin-unabhängige Verbindung zwischen desmosomalen
Cadherinen und Desmoplakin darstellen können.
Aufgrund von mutiertem Plakoglobin herrschte in einer anderen In-vitro-Studie eine
Desmosomen-Dysfunktion, die wiederum zu einem progressiven Myozytensterben
bei mechanischem Stress führte (RUIZ et al. 1996).
2.2.2.1.2
Adherens Junctions
Adherens Junctions sind ebenso wie die Desmosomen für die Zell-Zell-Adhäsion
verantwortlich. Sie setzen sich aus den klassischen Cadherinen (E-, N-, P- und VECadherin), Plakoglobin, β-Catenin und α-Catenin zusammen. In dieser Architektur
bindet Plakoglobin zum einen an die distale Region des zytoplasmatischen Endes
der Cadherine (catenin binding domain) (VINCENT et al. 2004) und zum anderen an
α-Catenin und bildet über dieses Protein einen Anker zu dem Aktin-Zytoskelett für die
Adherens Junctions (KNUDSEN et al. 1995; s. Abb. 2.2.2).
Aufgrund des hohen Homologitätsgrades liegt ein Wettbewerb um dieselben
Bindungsstellen zwischen β-Catenin und Plakoglobin nahe. So kann ein hoher Level
an exogenem Plakoglobin dazu führen, dass endogenes β-Catenin von den
Adherens Junctions verdrängt wird und zu dessen proteasomaler Degradation führt
(SALOMON et al. 1997).
2.2.2.2
Wnt-Signalweg
Die Wnt-Protein Familie spielt eine entscheidende Rolle als Wachstums- und
Differenzierungsfaktor in der Spezifizierung der Zellen während der embryonalen
Entwicklung. Wenn das abgesonderte wingless-Glycoprotein (Wnt) an einen
Zelloberflächenrezeptor frizzled/ frizzled-2-type bindet (BHANOT et al. 1996; BHAT
1998; KENNERDELL und CARTHEW 1998; MULLER et al. 1999b), aktiviert es das
zytoplasmatische Protein dishevelled (Dvl) (YANAGAWA et al. 1995), das wiederum
26
2. Stand der Forschung
zu einer Inaktivierung der Glykogenkinase-3β (Gsk3b) führt (YOST et al. 1997).
Gsk3b ist für die Phosphorylierung von β-Catenin und Plakoglobin verantwortlich
(siehe Phosphorylierung).
Die Beteiligung von Plakoglobin in der Wnt-Signalkaskade wird immer noch
debattiert (KARNOVSKY und KLYMKOWSKY 1995; KOFRON et al. 1997; MILLER
und MOON 1997; SIMCHA et al. 1998). In manchen Studien teilt man Plakoglobin
eine einzigartige Rolle, die unterschiedlich zu der Funktion des β-Catenin ist, in
diesem Signalweg zu (CHARPENTIER et al. 2000; SIMCHA et al. 1996;
ZHURINSKY et al. 2000a).
Auch wenn in verschiedenen Zelltypen eine Überexpression von Wnt zu einer
Akkumulation von Plakoglobin führt (BRADLEY et al. 1993; PAPKOFF et al. 1996),
ist die Beteiligung von Plakoglobin in dem Wnt-Signalweg in vivo immer noch
umstritten, da Plakoglobin die Abwesenheit von β-Catenin bei Knockout-Mäusen
nicht ausgleichen kann (BIERKAMP et al. 1996; HAEGEL et al. 1995; HÜLSKEN et
al. 2000; RUIZ et al. 1996).
Interessanterweise wurde in einer neueren Studie erkannt, dass eine Expression von
Plakoglobin in der Haut von transgenen Mäusen (CHARPENTIER et al. 2000) zu
einem anderen Phänotyp führt (verringerte epitheliale Proliferation und verringertes
Haarwachstum)
als
bei
einer
β-Catenin
Expression
(de
novo
Haarfollikel
Morphogenese und Tumorentwicklung) (GAT et al. 1998). Ein ähnlicher Phänotyp
tritt auch auf, wenn spätere Komponenten im Wnt-Signalweg (WNT-3 oder DVL-2,
eine Isoform von Dishevelled) in der Haut überexpremiert werden (MILLAR et al.
1999). Dies könnte ein Hinweis auf eine Beteiligung von Plakoglobin in dem WntSignalweg in einer Reaktion, die nach WNT-3 und DVL-2 auftritt, sein (MILLAR et al.
1999).
2.2.2.3
Phosphorylierung
Bei den Cateninen wird Serin/Threonin und Tyrosin phosphoryliert, um die
Reaktionen mit anderen Proteinen zur regulieren (YOST et al. 1996; HAMAGUCHI et
al. 1993; MATSUYOSHI et al. 1992).
27
2. Stand der Forschung
Plakoglobin ist Ziel des proteasomalen Abbaus mit Hilfe des Axin-APC-Komplexes
(KODAMA et al. 1999; SADOT et al. 2000; s. Abb. 2.2.2). Plakoglobin kann einen
Komplex mit APC (adenomatous polyposis Coli) (RUBINFELD et al. 1993; SHIBATA
et al. 1994), Axin (BEHRENS et al. 1998; IKEDA et al. 1998; KODAMA et al. 1999)
und Gsk3b (ABERLE et al. 1997) formen. Die N-terminale Domäne von Plakoglobin
wird von Gsk3b (Glykogenkinase-3β) am Serin-Rest phosphoryliert (ABERLE et al.
1997; YOST et al. 1996; KODAMA et al. 1999). Die Gsk3b-vermittelte
Phosphorylierung führt zum proteasomalen Abbau über eine Ubiquitination von
Plakoglobin (ABERLE et al. 1997; SADOT et al. 2000).
Solange Plakoglobin in den Desmosomen oder Adherens Junctions gebunden ist, ist
es
unzugänglich
für
die
Degradationsmaschinerie
(SADOT
et
al.
2000).
Punktmutationen oder Deletion der N-terminalen Phosphorylierungsstelle haben
keinen Effekt auf die Halbwertszeit von Plakoglobin (WILLIAMS et al. 2000).
Trotzdem ist die N-terminale Gsk3b Phosphorilierungstelle wichtig für die
Plakoglobinstabilität, da eine Überexpression von Axin, das die Gsk3b-abhängige
Phosphorilierung fördert, zu einem Plakoglobinabbau führt (KODAMA et al. 1999).
Plakoglobin kann ebenso am Tyrosin über eine Rezeptor-vermittelte und eine nicht
Rezeptor-vermittelte Tyrosin-Kinase phosphoryliert werden (HAMAGUCHI et al.
1993; MATSUYOSHI et al. 1992). Der EGF-Rezeptor (epidermal growth factor)
reagiert direkt mit Plakoglobin (HOSCHUETZKY et al. 1994; MATSUYOSHI et al.
1992) und phosphoriliert dabei Tyrosin, so dass eine Verbindung mit Desmoplakin,
nicht aber mit Desmoglein verhindert wird (GAUDRY et al. 2001). Zusätzlich wurde
entdeckt, dass Peroxyvanadat die Tyr(P)-Phophatase inhibiert. Dies führt zu einer
verringerten Zell-Zell-Adhäsion, da die Verbindungen zwischen Plakoglobin mit αCatenin und E-Cadherin abnehmen. Dieser Effekt kann mit Hilfe der Tyr(P)Phosphatase wieder rückgängig gemacht werden (HU et al. 2001). Auch wenn βCatenin und Plakoglobin hochgradig verwandt sind, so phosphorilieren dieselben
Kinasen doch unterschiedliche Stellen in den beiden Proteinen (SOLANAS et al.
2004). Darüber hinaus hat die Phosphorylierung an den entsprechenden gleichen
Stellen verschiedene Effekte auf die Reaktionen von β-Catenin und Plakoglobin mit
deren Zellpartnern (MIRAVET et al. 2003).
28
2. Stand der Forschung
2.2.2.4
Plakoglobin als Transkriptionsfaktor
Plakoglobin kann an LEF/TCF (lymphocyte enhancer binding factor-1/ T-Zell Faktor)
binden (HECHT et al. 1999; HUBER et al. 1996; SIMCHA et al. 1998; ZHURINSKY
et al. 2000a) und hat einen Transaktivierungsbereich an der C-terminalen Domäne
(HECHT et al. 1999; SIMCHA et al. 1998).
Da β-Catenin vor allem mit seiner Arm-repeat-Domäne an die Transkriptionsfaktoren
bindet, und diese mit der von Plakoglobin nahezu homolog ist (COWIN und BURKE
1996), liegt es nahe, dass Plakoglobin auch mit denselben Kernmolekülen
interagiert. Plakoglobin kann einen Komplex mit LEF-1 eingehen, wenn eine
Cotransfektion beider Moleküle in der Zelle durchgeführt wird (HUBER et al. 1996;
SIMCHA
et
al.
1998).
Catenine
haben
keine
klassischen
Kern-
Lokalisationssignalsequenzen (NLSs) und sammeln sich über zwei verschiedene
Mechanismen im Kern an. Zum einen konnte gezeigt werden, dass β-Catenin über
einen Importin-unabhängigen Weg in einem semipermeablen Zellmodell für
Kernimport in den Zellkern gelangt (FAGOTTO et al. 1998; YOKOYA et al. 1999).
Dies könnte in einer Verbindung von β-Catenin und dem Nukleoporin Nup1
begründet liegen (FAGOTTO et al. 1998). Zum anderen führt eine Überexpression
von LEF/TCF zu einer Akkumulation von β-Catenin in dem Zellkern (BEHRENS et al.
1996; MOLENAAR et al. 1996; SIMCHA et al. 1998). Es wird vermutet, dass der
Kernimport von dem β-Catenin/LEF-, bzw. Plakoglobin/LEF-Komplex über die
klassischen NLS der LEF/TCF-Proteine möglich ist. Nachdem ein Anstieg der
intranukleären Plakoglobinkonzentration bei einem geringen Vorkommen von
LEF/TCF festgestellt wird (SIMCHA et al. 1996, 1998), sind in vivo wahrscheinlich
auch LEF/TCF-unabhängige Transportmechanismen von großer Bedeutung.
Auch wenn Plakoglobin an LEF-1 genauso stark bindet wie β-Catenin, so ist doch die
Verbindung von Plakoglobin-LEF-1 und DNA sehr schwach (ZHURINSKY et al.
2000a). Dies hängt wahrscheinlich mit der Struktur der terminalen Domänen von
Plakoglobin zusammen, da ein Konstrukt, das nur die Arm-Domäne von Plakoglobin
enthält, sehr wohl eine effektive Bindung des Dreifachkomplexes mit LEF-1 und DNA
eingehen kann (ZHURINSKY et al. 2000a). Eine Bindung von Transkriptionsfaktoren
(z.B. CBP, TBP) an die terminalen Domänen eines Catenins könnte eine erhöhte
29
2. Stand der Forschung
Affinität des LEF-Catenin-Komplexes zur DNA hervorrufen (ZHURINSKY et al.
2000a). Es wird unter anderem vermutet, dass der positive Effekt von Plakoglobin
auf TCF-vermittelte Transkription darin begründet liegt, dass ein verstärkter
Transport von β-Catenin in den Zellkern stattfindet (ZHURINSKY et al. 2000b). Es
wurde beobachtet, dass β-Catenin und Plakoglobin an verschiedenen Stellen von
TCF-4
binden
(MIRAVET
et
al.
2002):
β-Catenin
bindet
an
die
Aminosäurensequenzen 1-51 und Plakoglobin an die Aminosäurensequenzen 51110 (SOLANAS et al. 2004). Die N- und C-Terminalen Domänen sind verantwortlich
für die Spezifität von Plakoglobin, indem sie potenzielle Bindungstellen in den
armadillo repeats verdecken (SOLANAS et al. 2004). Das führt dazu, dass
Bindungspartner aus den Intercalated Discs und den Transkriptionellen Cofaktoren,
auch wenn sie jeweils an den entsprechenden Stellen der arm repeats von β-Catenin
und Plakoglobin binden könnten, über die unterschiedlichen terminalen Domänen
reguliert werden (SOLANAS et al. 2004).
2.2.2.5
Apoptose / Tumorentwicklung
In Tumorzellen ist häufig die Menge an Plakoglobin verringert (ABERLE et al. 1995;
NAVARRO et al. 1993; SOMMERS et al. 1994). Eine Wiederherstellung der
Plakoglobinexpression in hochgradig kanzerogenen Zellen konnte die Tumorgenese
verringern (BEN-ZE’EV 1997; SIMCHA et al. 1996). Andererseits kann Plakoglobin
auch die Apoptose inhibieren. Es wurden drei verschiedene Plakoglobinmutationen
in chemisch induzierten murinen Blasentumoren beschrieben (SHIINA et al. 2001).
Weiter konnte in einem Fall eine Plakoglobinmutation in einem Magentumor erkannt
werden (CACA et al. 1999) und es wurde eine transformierende Aktivität von
Plakoglobin beobachtet, indem es die Effizienz von einer MYC-Induktion erhöhte
(KOLLIGS et al. 2000). Eine erhöhte Plakoglobinexpression verursachte zudem eine
erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins BCL-2 in SCC9-Zellen und
führte somit zu unkontrolliertem Wachstum (HAKIMELAHI et al. 2000).
Während des apoptotischen Zelltodes werden die Desmosomen mit Hilfe von
Caspasen und Metalloproteinasen proteolisiert (WEISKE et al. 2001), wobei
30
2. Stand der Forschung
Plakoglobin von Caspase-3 gespalten wird (BRANCOLINI et al. 1998; SCHMEISER
et al. 1998).
Die folgende Tabelle führt zusammenfassend alle bisher identifizierten Proteinpartner
von Plakoglobin auf:
Tabelle 2.2: Proteinpartner von Plakoglobin (nach ZHURINSKY et al. 2000b)
ND = noch nicht ermittelt
Proteinpartner
Bindungsstelle
an Plakoglobin
Funktion
der Verbindung
Quelle
Klassische
Cadherine
Arm repeats
Adhäsion
KEMLER 1993
Desmocollin
Arm repeats
Adhäsion
Desmoglein
Arm repeats
Adhäsion
Desmoplakin
Arm repeats
Adhäsion
KOWALCZYK et al. 1997
Keratin 5
ND
Adhäsion
SMITH und FUCHS 1998
Protein-tyrosine
phosphatase LAR
ND
Adhäsion
MULLER et al. 1999a
α -Catenin
N Terminus und
der erste arm
repeat
Adhäsion
ABERLE et al. 1996
APC
Arm repeats
Degradation
Axin/conductin
Arm repeats
Degradation
β -TrCP
N terminus
Degradation
Caveolin-1
ND
Membran
Lokalisation (?)
GALBIATI et al. 2000
LEF-1
Arm repeats
Transaktivierung
BEHRENS et al. 1996;
HUBER et al. 1996
TBP
C Terminus
Transaktivierung
HECHT et al. 1999
TCF-4 (an den
Aminosäuren 5180)
Arm repeats
Transaktivierung
MIRAVET et al. 2002
31
TROYANOVSKY et al.
1994b
TROYANOVSKY et al.
1994a
RUBINFELD et al. 1993;
SHIBATA et al., 1994
BEHRENS et al. 1998;
IKEDA et al. 1998;
KODAMA et al. 1999
HART et al. 1999;
SADOT et al. 2000;
WINSTON et al. 1999
2. Stand der Forschung
2.3 Plakoglobin-Defizienz
Eine homozygote Deletion des Plakoglobin-Gens führt bei Mäusen zu einem
Versterben der Tiere in der Embryogenese. Charakteristisch bei diesen Tieren sind
rupturierte Ventrikel und ein Fehlen von Desmosomen (RUIZ et al. 1996). Häufig
reißen die Hauptkammern des Herzens, und das Perikard füllt sich mit Blut, so dass
die meisten Tiere am 12.-16. Tag der Embryogenese sterben. Die Plakoglobin-/Tiere waren am 12. Tag der Entwicklung im Wachstum zurückgeblieben, und die
Blutzufuhr, vor allem in der Leber und der Plazenta war verringert (RUIZ et al. 1996).
Die Gewebeinstabilität hängt mit dem Fehlen von Desmosomen im Herzen
zusammen. Die epithelialen Organe (Haut und Darmtrakt) scheinen davon unberührt
zu sein. Stattdessen finden sich verbreiterte Adherens Junctions (bis zu 4,5 µm) im
Herzen, die desmosomale Proteine, wie z.B. Desmoplakin beinhalten (RUIZ et al.
1996).
Überlebten die transgenen Mäuse bis zur Geburt, zeigte sich ein zusätzlicher
Hautphänotyp, mit Blasenbildung und einer subcornealen Akantholyse (BIERKAMP
et al. 1999). Hierbei ersetzte β-Catenin Plakoglobin in den epithelialen Desmosomen.
Dies geschieht jedoch unzureichend in Bezug auf die Struktur und in einer
verringerten
Anzahl
der
Desmosomen
(BIERKAMP
et
al.,
1999).
Der
unterschiedliche Effekt von einem Plakoglobinmangel in den kardialen und
epithelialen
Desmosomen
liegt
wahrscheinlich
in
deren
unterschiedlicher
Zusammensetzung begründet. In den kardialen Desmosomen sind nur einige
Proteine
der
Desmosomen
ausgebildet:
Desmoglein-2,
Desmocollin-2
und
Plakophilin-2. In den epithelialen Geweben sind 3 Desmogleine (1-3), 3
Desmocolline (1-3) und Plakophilin-1 ausgebildet (GARROD 1993; KOCH und
FRANKE 1994; SCHMIDT et al. 1994; MERTENS et al. 1996).
Ähnliche pathologische Veränderungen, auch in einem vergleichbaren Zeitfenster
(10,5 – 12. Entwicklungstag), findet man bei Plakophilin-2 defizienten Tieren.
Allerdings ist kein Desmoplakin bei dieser Mutation mit den Intercalated Discs
assoziiert (GROSSMANN et al. 2004). Bei der Genentfernung des Zytoskelett-
32
2. Stand der Forschung
verbindenden Desmoplakin (GALLICANO et al. 1998) oder des desmosomalen
Cadherins Desmoglein-2 (ESHKIND et al. 2002) wird die Embryogenese schon
früher unterbrochen.
In einer In-vitro-Studie zeigte sich eine verringerte passive Compliance bei
embryotischen
Herzfasern
von
Plakoglobin-defizienten
Mäusen
gegenüber
Wildtypen. Bei der Untersuchung des passiven Kraft-Dehnungsverhaltens dieser
Fasern war die Dehnbarkeit vor allem bei einem geringen Extensionsgrad deutlich
verringert. Da die Kontraktilitätsparameter keine Veränderungen aufwiesen, wurde
postuliert, dass Plakoglobin nicht notwendig sei, um den myofibrillären Apparat über
die Adherens Junctions zu befestigen, aber unabdingbar für die kardiale Compliance
(ISAC et al. 1999).
Heterozygote Tiere unterschieden sich nicht von den Wildtypen in der Morphologie
während der Embryogenese und erreichen das Erwachsenenalter (RUIZ et al. 1996).
Trotzdem konnte ein verringerter Plakoglobingehalt in murinen Herzfasern
gegenüber Wildtypen festgestellt werden (ISAC et al. 1999).
33
2. Stand der Forschung
2.4 Elektrokardiographie bei der Maus
1929 wurde das erste murine Elektrokardiogramm (EKG) von AGDUHR und
STENSTRÖM aufgezeichnet und darüber berichtet, dass keine deutliche T-Welle
erkennbar war. Über 20 Jahre später wurde dann das EKG kleiner Säugetiere
eingehender beschrieben (LOMBARD 1952; RICHARDS et al. 1953). Hierbei wurde
wiederum berichtet, dass keine deutlichen T-Wellen entdeckt wurden, mit Ausnahme
vom Meerschweinchen. Allerdings wurde in manchen Fällen eine Einkerbung am
Ende des QRS-Komplexes als mutmaßliche T-Welle bezeichnet. Hierbei trat dann
kein isoelektrisches ST-Segment auf. Des Weiteren zeigten sich verkürzte P-R und
QRS-Intervalle und eine bis zu zehnfach schnellere Herzfrequenz im Vergleich zum
Menschen. Diese Erkenntnisse belegten bereits die deutlichen Unterschiede in den
Charakteristika der EKGs zwischen Mensch und Maus. Aufgrund des Phänomens,
dass kein deutliches ST-Segment vorliegt, definierten GUSSAK et al. (1995) den JPunkt als Repolarisationsbeginn der Ventrikel und das Ende der T-Welle als
Repolarisationsende. Der abrupte Übergang vom QRS-Komplex zum ST-Segment
stellt den J-Punkt dar. Von einer J-Welle spricht man, wenn der J-Punkt nicht auf der
isoelektrischen Linie liegt. Diese Definition wurde anschließend auch bei der Maus
angewandt, bei der physiologischerweise kein isoelektrisches ST-Segment vorliegt
(GUSSAK et al. 2000). Dieses Charakteristikum liegt darin begründet, dass bei der
Maus die Repolarisation bereits beginnt, während in anderen Bereichen des Herzen
noch die Depolarisation stattfindet. Erklärbar ist dies durch das Fehlen einer
Plateauphase der Aktionspotentiale in erwachsenen Mäusen (LONDON 2001). Die
Aktionspotentiale zeigen für eine kurze Zeit nach der Geburt eine Plateauphase, die
dann aber mit zunehmenden Alter kürzer wird (GUSSAK et al. 2000). Hierbei
resultiert
eine
altersabhängige
Zunahme
eines
4-AP-sensitiven
Kaliumauswärtsstromes (ITO) in eine sehr schnelle Repolarisation. Bei ITO
unterscheidet man ITO,f -Ströme (schnelle Öffnung, schnelle Inaktivierung) und ITO,sStröme (schnelle Öffnung, langsame Inaktivierung). In den Mausventrikelzellen
adulter Tiere liegt eine hohe Dichte von ITO vor und diese korreliert direkt mit der
verkürzten Plateauphase der Aktionspotentiale und der J-Welle im EKG (GUSSAK et
34
2. Stand der Forschung
al. 2000). Interessanterweise ist ITO bei verschiedenen Herzerkrankungen bei
Mensch und Hund reduziert (GUSSAK et al. 2000). Für die langsamere
Repolarisationsphase und die Rückkehr der Zelle zum Ruhemembranpotential sind
zwei weitere Kalium-Auswärtsströme (IK,s und Iss) verantwortlich (GUSSAK et al.
2000).
In Abbildung 2.4 sind die verschieden aussehenden EKG-Kurven von Mensch und
Maus dargestellt, die aus den beschriebenen elektrophysiologischen Besonderheiten
resultieren.
Abbildung 2.4: Schematische Darstellung der unterschiedlichen EKG-Kurven bei Mensch und
Maus
Im oberen Teil der Abbildung ist ein typisches Maus EKG, im unteren Teil das eines
Menschen dargestellt.
35
2. Stand der Forschung
2.5 Echokardiographie bei der Maus
MANNING et al. beschrieben 1994 den hochfrequenten kardialen Ultraschall bei
Mäusen zur Errechnung der linksventrikulären Masse. HOIT et al. (1995) wandte die
transthorakale Echokardiographie bei Mäusen an, um Unterschiede in der
linksventrikulären
Funktion
darzustellen.
transthorakale
Die
zwischen
Wildtypen
und
Echokardiographie
ist
transgenen
Mäusen
eine
invasive
nicht
Untersuchungsmethode, die eine morphologische und funktionale Charakterisierung
des kardialen Phänotyps ermöglicht (TANAKA et al. 1996). Veränderungen des
linken Ventrikels wie Kammergröße, Wanddicken, Masse und Funktion konnten
durch diese Methode bereits in der Vergangenheit zuverlässig ermittelt werden.
Neuere Untersuchungen bestätigen, dass die 2D Echokardiographie die Möglichkeit
einer kostengünstigen, akkuraten und nicht invasiven Methode zur Beurteilung der
kardiovasculären,
strukturellen
und
funktionellen
Veränderungen
in
den
verschiedenen Mausmodellen bietet (COLLINS et al. 2003). 1998 zeigten STEUDEL
et
al.
und
SCHERRER-CROSBIE
et
al.
zuerst
eine
transösophagiale
Echokardiographiemethode zur Darstellung von Größe und Funktion des rechten
Ventrikels bei Mäusen. Hierbei wurde ein intravasculärer Ultraschallkatheter in den
Ösophagus eingeführt und es wurden vier bis sechs Querschnitte des rechten
Ventrikels erstellt. In diesen verschiedenen Ebenen wurden sowohl die endo- als
auch die epikardialen Wände umfahren und darüber die Fläche der freien
rechtsventrikulären Wand und nach der Simpson-Methode auch das gesamte
Volumen der rechtsventrikulären Wand sowie das rechtsventrikuläre Volumen an
sich errechnet. Mit Hilfe des diastolischen und systolischen Volumens wurde ebenso
das
Schlagvolumen
Anschließend
wurde
und
die
rechtsventrikuläre
der
Durchmesser
der
Ejektionsfraktion
freien
Wand
ermittelt.
unterhalb
der
Trikuspidalklappe direkt gemessen. Diese echokardiographische Methode erlaubte
zum
ersten
Mal
eine
zuverlässige
Visualisierung und Quantifizierung der
rechtsventrikulären Struktur und Funktion bei Mäusen (SCHERRER-CROSBIE et al.
1998). Beim adulten Menschen wurde eine zuverlässige Vermessung des rechten
36
2. Stand der Forschung
Ventrikels mit Hilfe der transthorakalen Echokardiographie bereits 1986 von FOALE
et al. beschrieben. Hierbei wurden sieben verschiedene Einstellungen gewählt:
1. die parasternale lange Achse,
2. die parasternale lange Achse zur Darstellung der Trikuspidalklappe,
3. die parasternale kurze Achse in verschiedenen Ebenen (um auch eine
Darstellung des rechtsventrikulären Ausflusstraktes zu ermöglichen),
4. den apikalen Vierkammerblick,
5. den apikalen Zweikammerblick,
6. die subcostale lange Achse,
7. die subcostale kurze Achse des rechtsventrikulären Ausfluss- und Einflusstraktes.
Mit Hilfe dieser Schnitte konnte die Breite des rechtsventrikulären Ausfluss- und
Einflusstraktes, sowie die Breite und Länge des rechten Ventrikels bestimmt werden
(FOALE et al. 1986). Die Messung des Trikuspidal- und Pulmonalflusses mit Hilfe
eines gepulsten Dopplers wurde auch mehrfach in der Humanmedizin beschrieben
(DINI et al. 2004; JAUSSI et al. 1989; SHIMIZU et al. 2003). In einer Studie von
ZHOU et al. (2003) wurden gepulste Dopplermessungen des Trikuspidalflusses bei
neugeborenen und juvenilen Mäusen durchgeführt.
37
2. Stand der Forschung
2.6 Fragestellung
Die molekularen Funktionen von Plakoglobin wurden bereits in verschiedenen
Arbeiten beschrieben. Ebenso wurde ein Tiermodell von homozygoten Plakoglobindefizienten Mäusen bereits näher charakterisiert. Weitere Mausmodelle arbeiteten
mit Tieren, bei denen eine Defizienz im Plakophilin-2-, Desmoplakin- und
Desmoglein-2-Gen vorlag, die ebenso für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich ist.
Hier wurden hauptsächlich die homozygoten Tiere, die bereits in der Embryogenese
verstarben,
ausführlich
beschrieben.
Systematische
Untersuchungen
der
heterozygoten Tiere zur Elektrophysiologie, Einfluss von Belastungen oder zur
Morphologie im Rahmen von echokardiographischen Untersuchungen adulter Mäuse
wurden bisher nicht durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Herzen der
transgenen Mäuse in vivo phänotypisiert. Dies ermöglichte auch die Darstellung
eines
alters-
und
trainingsabhängigen
Verlaufs
eventuell
auftretender
Veränderungen.
Die humane, autosomal-rezessive Plakoglobindefizienz-Erkrankung (Naxos Disease)
zählt zu den arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathien (ARVC). Die
phänotypische Ausprägung der ARVC findet man in juvenilen sowie adulten
Menschen, und sie kann vermutlich durch Ausdauersport verstärkt werden. Hier tritt
die letale Phase weitaus später als in den homozygoten Tiermodellen auf. Um die
pathophysiologischen Ursachen der ARVC näher zu charakterisieren, sollen bei
diesem
Mausmodell
echokardiographische,
elektrokardiographische
und
elektrophysiologische Untersuchungen in vivo durchgeführt werden.
Es sollen folgende Fragen untersucht werden:
Hat das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens Auswirkungen auf die
Elektrophysiologie und die Morphologie des Herzens?
Sind die Folgen einer heterozygoten Plakoglobin-Defizienz vom Alter der Tiere oder
dem Trainingszustand abhängig?
38
2. Stand der Forschung
Treten unter Medikation mit β-Adreno-Rezeptor-Agonisten vermehrt Arrhythmien
oder Funktionsstörungen auf?
39
3. Experimenteller Teil
3. Experimenteller Teil
3.1 Tiere und Tierhaltung
Sowohl der Entwurf als auch die Durchführung der Studie erfolgte nach den
allgemeinen und lokalen Richtlinien des Tierschutzes (Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals (NIH publication No. 85- 23, revised 1996)).
3.1.1 Plakoglobin-defiziente Mäuse
Die Plakoglobin+/-Mäuse wurden im Max-Delbrück-Center für Molekularmedizin in
Berlin für diese Studie gezüchtet und genotypisiert. Aufgrund dessen soll hier nur
kurz auf die Verfahrensweise eingegangen werden.
Ein Plakoglobin-Klon wurde aus einer 129/SV Maus Genom Bibliothek (Stratagene,
La Jolla, CA, U.S.A.) ausgewählt, und es wurde ein Vektor aus einem 11-kb GenomFragment zusammengestellt. In diesem Vektor (Großteil des Exons 3) wurden die
folgenden intrinsischen Sequenzen und die 5`Region des Exons 4 (verschlüsselt die
Aminosäuren 70-160) durch eine Neomycin Gen Kassette (Neo) in derselben
transkriptionellen Ausrichtung ersetzt. Eine Herpes-Simplex-Virus-Thymidine-KinaseGen-Kassette (HSV-TK) wurde an dem 3´Ende des Konstruktes eingefügt
(MANSOUR et al. 1988; s. Abb. 3.1.1). Der linearisierte Vektor wurde mit Hilfe der
Elektroporation in E14.1 murine embryonale Stammzellen (ES) transferiert.
Die Integration und Rekombination dieser Konstruktion wurde durch Southern Blot
verifiziert. Die Zellen wurden in Lysepuffer bei 55°C und mit 0,1 mg/ml Proteinase K
verbracht und die genomische DNA wurde ausgefällt. Nach dem Aufschluss mit XhoI
und XbaI wurden die Fragmente per Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel separiert
und auf Hybond-N+-Membranen (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) übertragen.
Mit
32
P-gekennzeichnete Proben wurden aus genomischen Plakoglobin-Sequenzen
hergestellt, die für die Konstruktion des Zielvektors benutzt wurden. Nach Aufschluss
mit BspEI und XabI (1.1 kb 3`externer Abschnitt) und mit BstEII und NdeI (1.3 kb
interner Abschnitt) wurden Fragmente isoliert und mit Hilfe des multiprime labeling
40
3. Experimenteller Teil
system (Amersham) gekennzeichnet. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C über
Nacht in einem Hybridisationspuffer, und die Blots wurden für 24 h einem
Röntgenfilm exponiert. ES-Zell Klone, die die gewünschte Integration beinhalteten,
wurden
in
eine
C57Bl/6-Empfänger-Blastocyste
injiziert
und
diese
in
scheinschwangere NMRI Weibchen übertragen, um Mäusechimäre zu erzeugen
(MANSOUR et al. 1988). Männliche Nachkommen mit deutlichem FellfarbenChimärismus wurden mit C57Bl/6 Weibchen gekreuzt. Um die Genotypen zu
identifizieren, wurde isolierte DNA aus den Schwanzspitzen zuerst mit Hilfe der
Polymerasekettenreaktion (PCR) und dann mit Southern Blot analysiert.
Für die PCR Genotypisierung wurden die Proben mit 0,1mg/ml Proteinase K
aufgeschlossen und die DNA präzipitiert. Es wurden drei verschiedene Primer
benutzt. Die Reaktionsprodukte wurden mit einer Ethidium-Bromid-Färbung auf 1,2%
Agarosegel sichtbar gemacht.
Abbildung 3.1.1: Eine Restriktionsübersichtstafel
von dem genomischen Plakoglobin Klon, der für die Vektorkonstruktion genutzt
wurde (oben), der Zielvektor für die Genentfernung (Mitte) und der Zielort (unten).
Exon3 und 4 sind als graue Rechtecke dargestellt (ex3 und ex4). Die 1,1-kb lange
externe Probe, die für die Southern Blot Analyse genutzt wird, ist als schwarzer
Balken dargestellt (probe). Pfeile kennzeichnen die Restriktionsstelle für Xbal und
Xhol. (RUIZ et al.1996)
41
3. Experimenteller Teil
3.1.2 Tierhaltung
Alle Tiere wurden in Makrolonkäfigen Typ II
auf staubfreiem Weichholzgranulat
gehalten. Zusätzlich wurden die Käfige mit zwei Papiertüchern als Nestmaterial
ausgestattet, um den Tieren eine Rückzugsmöglichkeit zu bieten. Tiere, die nur für
elektro- oder echokardiographische Untersuchungen oder für das Schwimmtraining
verwendet wurden, wurden in Gruppen mit bis zu vier Tieren aufgestallt. Während
der Telemetriephase wurden die Tiere einzeln gehalten.
Für alle Tiergruppen lag die Raumtemperatur bei 22 +/- 2°C, die relative
Luftfeuchtigkeit bei 55 +/- 5% und die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ
statt.
Pelletiertes, autoklaviertes Haltungsfutter für Ratten/Mäuse der Firma Altromin
GmbH (Lage, D) (Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,0%, Rohfett 4,0%, Rohfaser 6,0%,
Rohasche 7,0%, Calcium 0,9% und Phosphor 0,7%; Zusatzstoffe je kg: Vit. A 15.000
IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg) wurde ad libidum gefüttert, zusätzlich
wurde Leitungswasser aus Tränkeflaschen ad libidum bereitgestellt.
Genehmigung
Das Versuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Münster unter der Nummer
G 59/2003 genehmigt.
42
3. Experimenteller Teil
3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen
3.2.1 Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms
Es wurden ein digitales 6 Kanal EKG (EMKA Technologies ECG Auto user manual)
und ein manuelles 6 Kanal EKG (Siemens Megacart, 1993 Siemens Erlangen) für
mindestens zehn Sekunden erstellt (KORTE et al. 2002). Es wurden die bipolaren
Standardableitungen
I,
II
und
III
nach
Einthoven,
sowie
die
unipolaren
Standardableitungen aVR, aVL, aVF nach Goldberger abgeleitet. Manuell wurden
zusätzlich Brustwandableitungen geschrieben. Das manuelle EKG wurde bei einer
Laufgeschwindigkeit von 20 mm/s und Amplitudenhöhe von 10 mm/mV auf
handelsüblichem EKG-Papier ausgedruckt. Es wurde ein Tremorfilter 35Hz und ein
Schwächungsfilter 100Hz verwendet.
Vor jeder Aufzeichnung wurden die Mäuse mit dem jeweils entsprechenden
Narkotikum für die darauf folgende Untersuchung narkotisiert bzw. sediert. Bei einer
anstehenden echokardiographischen Untersuchung wurden die Tiere mit Diazepam
(17,5 mg pro kg Körpergewicht) sediert, vor der Langendorff-Untersuchung mit
Urethan (2 g pro kg Körpergewicht) und vor einer Transmitter-OP mit einem XylazinKetamin-Gemisch (50 mg Ketamin pro kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin pro kg
Körpergewicht) narkotisiert, jeweils über eine intraperitoneale Verabreichung. Im
späteren Verlauf wurde die Transmitter-OP mit einer Isofluran-Inhalationsnarkose
(2% Isofluran, 98% Sauerstoff) durchgeführt und unter dieser Medikation ein
Oberflächen-EKG aufgezeichnet. Um die Qualität der Signalübertragung der
Brustwandableitungen zu verbessern, wurde den Mäusen die Brust rasiert.
Zur Aufzeichnung der Oberflächen-EKGs wurden die Mäuse zunächst in Rückenlage
auf eine Wärmeplatte (40°C) gelegt. Die Gliedmaßen der Mäuse wurden mit
Elektrodengel benetzt und Schlaufenelektroden aus weichem, geflochtenem,
nichtoxidierbarem Stahldraht wurden sanft darüber gezogen.
Die EKG-Schlaufenelektroden waren mit einem herkömmlichen EKG-Schreiber
(Siemens Megacart, 1993 Siemens Erlangen) für die manuelle Aufzeichnung und
gleichzeitig mit einem ITF 16 EKG Verstärker (EMKA Technologies, Paris, F)
43
3. Experimenteller Teil
verbunden, so dass zusätzlich ein digitales EKG mit IOX-Software auf dem
Computer aufgezeichnet werden konnte.
3.2.2 Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms
Die drahtlose Radiotelemetrie, die Messwerte mit Hilfe von Funkwellen überträgt,
wurde zur telemetrischen Datenerfassung genutzt.
3.2.2.1
Aufbau der Anlage
Abbildung 3.2.2.1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Telemetrieanlage
Radiotelemetrie, die zur Erfassung von Daten lebender Tiere dient, wird als
Biotelemetrie bezeichnet (KRAMER et al. 2000). In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der
Biotelemetrie Elektrokardiogramme von Mäusen aufgezeichnet, die sich frei
bewegen konnten.
44
3. Experimenteller Teil
Die vom schlagenden Mausherzen erzeugten elektrischen Potentialänderungen
wurden von einem in dem Mauskörper implantierten Transmitter registriert und die
empfangenen Signale mit Hilfe von elektrischen Schaltsystemen innerhalb des
Transmitters verstärkt und gefiltert. Die Signale wurden in Radiofrequenzsignale
konvertiert und über weitere Schaltkreise und Antennen des Transmitters an einen
Receiver
(Empfänger)
gesandt.
Dieser
Receiver
deckte
den
gesamten
Aktivitätsrahmen der Maus (z.B. beim Airjet) ab und hatte die Form einer Platte, die
sich unter dem Käfig der Maus befand. Die vom Transmitter verstärkten Signale
wurden als Radiofrequenzsignale von dem Receiver empfangen, und über ein Kabel
an eine so genannte „Input-Matrix“ weitergeleitet. Die Input-Matrix digitalisiert und
filtert die Signale. Über ein weiteres Kabel werden die Daten auf einen PC
übertragen, der mit Hilfe des Computerprogramms der Firma „Data Science“ die
Daten registriert und die Funktion der einzelnen Receiver überwacht. Über eine
„Output-Matrix“ wurden die Informationen erneut analogisiert und anschließend an
einen weiteren Computer, der die Daten mit Hilfe eines in der Arbeitsgruppe
vorhandenen Programmes für die Auswertung von Maussignalen aufzeichnet,
weitergeben. Dieses Programm basiert auf einer bereits veröffentlichten Software zur
Analyse von monophasischen Aktionspotentialen (FRANZ et al. 1995). Mit einer
Sampling rate von 1000 Hz wurden hier die Elektrokardiogramme aufgezeichnet und
zur Offline-Analyse auf CD gespeichert.
Es wurde ein kommerziell erhältlicher implantierbarer EKG-Transmitter bestehend
aus einem versiegelten, biokompatiblen Plastikgehäuse verwand. Der Transmitter
hatte ein Volumen von 1,9 ml und wiegt 4 g. Er enthält die Batterie, die für das
hauptsächliche
Volumen
verantwortlich
ist,
einen
Signalverstärker
und
Radiofrequenzelektronik. Der Transmitter entlässt am vorderen Ende zwei flexible,
ca. 7 cm lange, rostfreie, flexible Stahldrähte, die mit farbigem Silikon zur Isolierung
überzogen (rot (-) und weiß (+)) sind. Mit einem Magnet läßt sich der Transmitter
aktivieren
und
deaktivieren.
Mit
einem
handelsüblichen
Radio
kann
der
Aktivitätsstatus durch Empfang der Amplituden-modulierten Signale überprüft
werden. Ist der Transmitter korrekt implantiert, ist für jeden Herzton ein „Piep“-Ton
hörbar.
45
3. Experimenteller Teil
Die Lokalisation der Drahtenden des Transmitters innerhalb des Mauskörpers
(rechter Arm, linker Rippenbogen) ließen die Ableitung der Standardableitung II nach
Einthoven zu.
46
3. Experimenteller Teil
3.2.2.2
Implantation des Transmitters
Die Anästhesie erfolgte mit 50 mg Ketamin pro kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin
pro
kg
Körpergewicht,
Inhalationsnarkose
(2%
intraperitoneal
Isofluran,
98%
injiziert,
oder
Sauerstoff).
mit
Zur
einer
Isofluran-
Überprüfung
der
Narkosetiefe wurde der Zwischenzehen-Reflex genutzt. Nach dessen Ausfall wurde
die Haut im Bereich des Bauches, großzügig rasiert, und anschließend mit einer
medizinischen Enthaarungscreme vollständig von Haaren befreit.
Die Maus wurde auf einer steril abgedeckten Wärmeplatte, die über die
Rektaltemperatur geregelt wird, sanft fixiert. Ein handelsübliches Desinfektionsspray
wurde zur Keimreduktion im Operationsfeld genutzt.
Die Haut wurde mit einem 2 cm langen medianen Bauchschnitt durchtrennt.
Anschließend wurde subkutan die Unterhaut von der Muskulatur abgehoben, so dass
zwei Kanäle für die Transmitterkabel entstanden. Ein Kanal soll dabei bis zur rechten
Achselhöhle führen, der andere bis kurz über den letzten linken Rippenbogen.
Dann erfolgte eine 2 cm lange Inzision der darunterliegenden Bauchmuskulatur
entlang der Linea alba, um die Bauchhöhle zu eröffnen. Der Transmitter wurde nun
vollständig in die Bauchhöhle und vorsichtig auf das Darmkonvolut geschoben. Die
Drähte zeigten dabei in kaudaler Richtung, die in den Transmitter eingelassenen
"Fixierschlaufen" in Richtung des Betrachters. Ein Verrutschen des Transmitters in
der Bauchhöhle wurde durch Fixierung der drei Schlaufen an der Bauchmuskelnaht
verhindert. Im Bereich des kaudalen Wundwinkels wurde die Bauchmuskulatur auf
der rechten Seite ca. 2 mm unterhalb des Wundrandes mit einem dünnen Trokar (1,2
mm x 40 mm) von außen nach innen durchstochen. Der rote Draht (negative
Elektrode) wurde erst in eine Schleife gelegt, dann eingefädelt und nach außen
gezogen. Mit dem weißen Draht (positive Elektrode) verfuhr man ebenso an der
anderen Bauchwandseite. Nun wurde die restliche Bauchmuskulatur mit Einzelheften
aus nicht resorbierbarem Nahtmaterial vollständig verschlossen. Anschließend
wurden die Kabelenden mit Silikonhütchen versehen, um spätere Irritationen zu
vermeiden und mit Hilfe einer Pinzette in die vorbereiteten subkutanen Kanäle
eingelegt. Das rosafarbene Kabel sollte nun in der rechten Achselhöhle der Maus
enden und an der rechten Flanke per Knopfheft an der Bauchmuskulatur festgenäht
47
3. Experimenteller Teil
werden. Das weiße Kabel liegt an der linken Mausseite und die nicht isolierte Stelle
soll so an den Muskel genäht werden, dass sie vollständig vom Muskel umgeben ist.
Zu diesem Zeitpunkt konnte die Herzfrequenz mit Hilfe eines Radios bereits überprüft
werden.
Nun wurden die Hautwunden mit fortlaufenden Kürschnernähten aus resorbierbarem
Nahtmaterial verschlossen. Die Hautnaht wurde zum Infektionsschutz mit einem
handelsüblichen Sprühpflaster versehen.
Die Gesamtzeit der Operation (Einleitung der Narkose bis Hautverschluss) betrug
etwa 35 Minuten.
Nach der Operation wurde die Maus in ihren Käfig gelegt. Zur Regulation des
Flüssigkeitshaushaltes, sowie um einer Obstipation vorzubeugen, erhielten die Tiere
innerhalb von 15 Minuten direkt im Anschluss 2 ml
Stereofundin® subkutan in zwei bis vier Dosen. Zur
Vermeidung eines Auskühlens in der postoperativen
Aufwach- und Erholungsphase wurden die Mäuse noch 24h
unter Rotlicht gehalten.
Ein Analgetikum (Ibuprofen 7 mg/kg, GABRISCH u.
ZWART (Hrsg.) 1998) wurde über vier bis fünf Tage über
das Trinkwasser und über eingeweichte Futterpellets
verabreicht. Im Bedarfsfall wurde über drei Tage zusätzlich
ein Antibiotikum (Enrofloxacin 5 mg/kg, GABRISCH u.
ZWART (Hrsg.) 1998) täglich subkutan injiziert.
Abbildung 3.2.2.2: Postoperatives Röntgenbild nach Transmitterimplantation
In der post-operativen Phase wurden die Tiere regelmäßig klinisch und über den
implantierten Transmitter überwacht. Während dieser Zeit wurde täglich das Gewicht
kontrolliert und es erfolgte eine kontinuierliche EKG-Überwachung. Nach einer
48
3. Experimenteller Teil
ausreichenden Wundheilungsperiode, typischerweise 12-14 Tage nach dem Eingriff,
begannen frühestens die Belastungstests.
3.2.2.3
Vor
Erstellung des Ruhe-EKGs
der
jeweiligen
Belastung
und
einer
mindestens
2-stündigen
Eingewöhnungsphase werden 15 Minuten aufgezeichnet, wobei jegliche Aufregung
für das Tier vermieden werden soll.
3.2.2.4
Erstellung des Belastungs-EKGs
Schwimmen
Die Tiere wurden zum 6-minütigem Schwimmen in warmes Wasser (36°C) gesetzt.
Ein Makrolonkäfig Typ II (20*35*13,5 cm) wurde als „Schwimmbecken“ genutzt.
Die Belastung wurde bei bis zu vier Mäusen gleichzeitig unter ständiger Kontrolle
durchgeführt. Das Schwimmen fand einzeln statt und mit genügend Abstand
zwischen den Tieren, so dass jeder Maus ein Receiver zugeordnet werden konnte.
Nach Ablauf der sechs Minuten wurde die Schwimmaufzeichnung gestoppt,
gleichzeitig die Maus in ihren Käfig gesetzt, der Käfig auf einer Transponderplatte
platziert
und
das
EKG
anschließend
noch
eine
Stunde
(Erholungs-
/Reperfusionsphase) aufgezeichnet. Um die Trocknungsphase der Maus zu
beschleunigen, wurde während der ersten halbe Stunde ein Teil des Käfigs mit
Rotlicht ausgeleuchtet. Dies verringerte die Fellpflegeaktivität und sicherte somit eine
bessere Qualität des EKGs.
Airjetstreß
Bei diesem Belastungs-EKG wurden die Tiere über 15 Minuten einem kontrolliertem
„mentalen Stress“ (KNOLLMANN et al. 2003) unterzogen. Dabei saßen bis zu vier
Tiere einzeln in luftdurchlässigen Gitterkäfigen (20*37*16 cm). Jeder dieser Käfige
wurde auf einem Receiver platziert. Anschließend wurde mit Hilfe eines
herkömmlichen Föns jede Maus für jeweils 15 Sekunden pro Minute über 15 Minuten
einem mäßigen Luftstrom bei Raumtemperatur ausgesetzt.
49
3. Experimenteller Teil
Nach Ablauf der 15 Minuten wurde die Maus in ihren Käfig gesetzt, der Käfig auf
einer Transponderplatte platziert und das EKG anschließend noch eine Stunde
(Erholungs- /Reperfusionsphase) aufgezeichnet.
3.2.3 Auswertung der Elektrokardiogramme
Die Auswertung der Daten erfolgte bezüglich des Genotyps (Wildtyp, transgenes
Tier) geblindet.
Die Oberflächen-EKGs wurden digital und zum Teil manuell ausgewertet. Zur
digitalen Auswertung wurde die Software „ECG Auto 1.5.7.36“ (EMKA Technologies,
Paris, F) verwand. Hierbei wurden automatisch bis zu 20 einzelne Herzschläge
übereinander gelegt und somit ein durchschnittlicher Komplex erstellt. Bei drei von
diesen „average beats“ wurden folgende Punkte bestimmt: Anfang/ Höhepunkt/ Ende
der P-Welle, Q, R, S, Anfang/ Ende der T-Welle und die Nulllinie. Aus diesen Daten
errechnete das Programm den PR-Abstand (ms), P-Wellendauer (ms), QRS-Dauer
(ms), QT-Dauer (ms), S bis Anfang T-Welle (ms), T-Wellendauer (ms), RR-Abstand
(ms), P-Wellen-Amplitude (mV), Q-Amplitude (mV), R-Amplitude (mV), S-Amplitude
(mV), T-Wellen-Amplitude (mV), relative/ absolute Fläche unter der P-Welle
(mV*ms), relative/ absolute Fläche unter dem QRS-Komplex (mV*ms), relative/
absolute Fläche unter der T-Welle (mV*ms) und die Herzfrequenz (Schläge/min).
Dies erfolgte für jede der Standardableitungen (I, II, III, aVR, aVL, aVF). Aus den drei
Einzelwerten wurde der Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Parameter
ermittelt.
Zur Überprüfung wurden von einigen Mäusen zusätzlich Papier-EKGs manuell
ausgewertet. Dabei wurde der Herzrhythmus, die Amplitude und die Dauer der PWelle, die Amplitude des QRS-Komplexes, die Dauer des PQ sowie des RRIntervalls bestimmt. Aus zehn gemessenen Einzelwerten wurde der Mittelwert und
die Herzfrequenz errechnet. Hierbei wurden ebenso alle Standardableitungen
analysiert.
Aufgrund der Lage der Drahtenden der jeweiligen Transmitter stand in der Telemetrie
nur die Standardableitung II nach Einthoven zur Verfügung.
50
3. Experimenteller Teil
Abbildung 3.2.3: Schematische Darstellung eines einkanaligen Maus-Elektrokardiogramms
Quelle: HAGENDORFF et al. 1999
Die Analyse der telemetrischen Daten erfolgte mit einem halb-automatischen
Analyseprogramm für die offline-Analyse von Maus-EKG-Signalen mit Hilfe eines in
der Arbeitsgruppe Kirchhof / Fabritz in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Franz,
Dept. of Pharmacology, Georgetown University, Washington DC, U.S.A. erstellten
Labview-basierten-Programmes.
Mit diesen Protokollen konnten Herzfrequenz, Herzfrequenzvariabilität, spontane
Arrhythmien und die chronotrope Reaktion auf Belastung untersucht werden, indem
die EKGs vollständig visuell kontrolliert wurden.
Das Unterprogramm LabView-Atrial analyzer bestimmte die Länge der R-R-Intervalle
und errechnete die Herzfrequenz automatisch. In Kooperation mit der Firma signetix
wurde ein Programm zur Auswertung der Frequenzen entwickelt. Hierbei wurden
eventuelle durch Rauschen oder Muskelartefakte bedingte „Ausreißer“ erkannt und
eliminiert und aus den verbliebenen Werten ein Mittelwert, die Standardabweichung,
sowie die Quantile berechnet und das maximale und minimale Intervall für jede Maus
bestimmt. Diese Analyse erfolgte für die Aufzeichnungen der Ruhe-EKGs, der
Belastungs-EKGs, als auch in der Erholungsphase.
51
3. Experimenteller Teil
3.2.4 Telemetrisches EKG mit sympathomimetisch wirksamen Pumpen
Um die dauerhafte Wirkung von Sympathomimetika bei Plakoglobin-defizienten
Tieren näher zu untersuchen, wurde bei zehn Tieren nach Abschluss der
Belastungsversuche jeweils eine mikro-osmotische Pumpe (Alzet®, Model 1007D)
unter Isoflurannarkose im Rückenbereich subkutan implantiert. Bei sechs Tieren
wurde eine Dosierung von 3 mg/kg/d Isoprenalin und bei den anderen vier Tieren
eine Dosierung von 30 mg/kg/d Isoprenalin, sowie 30 mg/kg/d Phenylephrin gewählt.
Die osmotischen Pumpen geben bei einer Temperatur von 37°C kontinuierlich 0,5
µl/h (± 0,1 µl/h) der Lösung über eine Dauer von sieben Tagen ab. Über die gesamte
Zeitspanne wurden telemetrische Aufzeichnungen angefertigt.
3.2.4.1
Implantation der Pumpen
Die Tiere wurden kurz vor der Implantation gewogen und dementsprechend wurden
die Pumpen mit einer gewichtsabhängigen Isoprenalindosis in Ascorbinsäurelösung
beschickt. Die Pumpen wurden dann für eine Stunde in angewärmter physiologischer
Kochsalzlösung gelegt, um die osmotische Pumpe zu aktivieren.
Die Maus wurde unter Isoflurannarkose anästhesiert. In der Einschlafphase hat das
Isofluran einen 4%igen Anteil der Beatmungsluft und wurde nach dem Ausfall des
Zwischenzehenreflexes auf 2% Isofluran mit einem 98%igem Sauerstoffanteil
reduziert.
Die
Maus
wurde
auf
eine
Metallwärmeplatte
gelegt,
und
die
Körpertemperatur wurde über einen rektalen Temperaturmessfühler erfasst. Über die
gemessene
Körpertemperatur
reguliert
ein
Temperatur-Kontroll-Modul
die
Temperatur der Wärmeplatte. Anschließend wurde der Lendenbereich von dem
Haarkleid befreit und ein 1 cm langer Schnitt quer zur Wirbelsäule gesetzt. Die Haut
wurde von der Unterhaut in einem 2 cm langen Kanal abgelöst und die Pumpe, mit
der Öffnung möglichst weit von der Inzision entfernt, eingeführt. Die Haut wurde mit
einigen Knopfheften mit resorbierbarem Nahtmaterial verschlossen.
52
3. Experimenteller Teil
3.3 Transthorakale Echokardiographie
3.3.1 Durchführung
Für die Ultraschalluntersuchung wurde die Maus zunächst sediert (17,5 mg
Diazepam (Valium®) pro kg Körpergewicht, intraperitoneal).
Anschließend wurden der Brustkorb- sowie der kraniale Bauchbereich großzügig mit
einer medizinischen Enthaarungscreme vom Haarkleid befreit.
Die sedierte Maus wurde in Rückenlage mit Hilfe von Leukosilk® an den Gliedmaßen
auf
einer
Metallwärmeplatte
sanft
fixiert.
Über
einen
rektal
eingeführten
Temperaturmessfühler wurde die Temperatur der Metallplatte automatisch, in
Abhängigkeit
von
der
Körpertemperatur
der
Maus,
gegenreguliert.
Mit
Elektrodencreme benetzte EKG-Elektrodenplättchen wurden unter die beiden
Vorderpfoten und die linke Hinterpfote geschoben und in die Fixation integriert. So
konnte simultan mit der echokardiographischen Untersuchung ein Ein-Kanal-EKG
aufgezeichnet werden. Das Ultraschallgerät HP Sonos 5500 (Firma Philips,
Hamburg, Germany) bestimmt laufend die Herzfrequenz der Maus. Im seltenen Fall
von tiefen Bradykardien (HF <200/min) wurde die Untersuchung abgebrochen und
tachykardisierende
Maßnahmen
(externe
Erwärmung,
Körpermassage,
Isoprenalingabe) eingeleitet.
Der Brustkorb wurde nun mit zentrifugiertem und angewärmtem Ultraschallgel (frei
von Lufteinschlüssen) ca. zwei Zentimeter dick bedeckt. Es wurden bekannte
Standardeinstellungen mit geringfügigen Modifikationen zur Rechtsherzdarstellung
aus der Echokardiographie des Menschen gewählt. Zunächst wurde mit einem 15
MHz Linearschallkopf ein Vierkammerblick dargestellt, indem der Schallkopf vom
kaudalen Sternum zur linken Achselhöhle weisend, sanft in das Gelkissen eintaucht,
ohne Druck auszuüben. In der bildlichen Darstellung lagen nun die beiden Vorhöfe
seitenverkehrt in dem unteren Bildausschnitt. Die Hauptkammern schlossen sich den
Vorhöfen im oberen Bildausschnitt an (s. Abb. 3.3.1.1).
53
3. Experimenteller Teil
Abbildung 3.3.1.1: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Vierkammeransicht
des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001)
LA:
LV:
RA:
RV:
Linkes Atrium
Linker Ventrikel
Rechtes Atrium
Rechter Ventrikel
Danach wurde die Wärmeplatte in einem Winkel von 15° gekippt, so dass die Maus
in linker Seitenlage zu Liegen kam.
Nun wurde die parasternale lange Achsenansicht dargestellt, indem der Schallkopf
zwischen dem linken Rippenbogen und der rechten Schulter liegt. Hierbei sollen die
Aortenklappe, die Mitralklappe und der
linke Ventrikel in einer Achse liegen. Bei
geschlossener
Aortenklappe
erschien
diese als Mittelecho innerhalb der Aorta.
Der linke Ventrikel schloss sich im Bild
waagerecht
nach
links
weisend
an.
Weiterhin sichtbar waren das linke Atrium
und der rechte Ventrikel. (s. Abb. 3.3.1.2).
Abbildung 3.3.1.2: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Längsachsenansicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001)
IVS:
LA:
LV:
LVOT:
LVW:
RV:
Interventrikuläres Septum
Linkes Atrium
Linker Ventrikel
Linksventrikulärer Ausflusstrakt
Hinterwand des linken Ventrikels
Rechter Venrikel
54
3. Experimenteller Teil
Durch Kippen des Schallkopfes um ca. 40° zur
Leber
hinweisend,
Trikuspidalklappe
bzw.
den
und
kann
die
man
die
Pulmonalklappe,
rechtsventrikulären
Ausflusstrakt,
(RVOT) visualisieren. (s. Abb. 3.3.1.3).
Abbildung 3.3.1.3: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht der
Trikuspidal- und Pulmonalklappe des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u.
TATARU 2001)
Ao:
IVS:
LA:
LV:
RA:
RV:
RVOT:
Aorta
Interventrikuläres Septum
Linkes Atrium
Linker Ventrikel
Rechtes Atrium
Rechter Venrikel
Rechtsventrikulärer Ausflusstrakt
In der parasternalen Querachsenansicht (Drehung des Schallkopfes um 90° im
Uhrzeigersinn, ausgehend von der parasternalen Längsachsenansicht) wurde die
Standardeinstellung durch die Papillarmuskelebene repräsentiert. Der rechte
Ventrikel lag dem linken Ventrikel dabei im linken oberen Bildauschnitt an (s. Abb.
3.3.1.4).
Abbildung 3.3.1.4: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Querachsenansicht
des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001)
IVS:
LV:
LVW:
RV:
Interventrikuläres Septum
Linker Ventrikel
Hinterwand des linken Ventrikels
Rechter Venrikel
55
3. Experimenteller Teil
Nähert man sich nun der Basis des Herzens
von der parasternalen Querachsenansicht
ausgehend, so wird die kurze Achse auf Höhe
der Aortenklappe dargestellt (s. Abb. 3.3.1.5).
Abbildung 3.3.1.5: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht der kurzen
Achse auf Höhe der Aortenklappe (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001)
Ao:
LA:
RA:
RV:
Aorta
Linkes Atrium
Rechtes Atrium
Rechter Venrikel
Kippt man dann den Schallkopf erneut um
ca. 30° zur linken Schulter hinweisend wird
der rechtsventrikuläre Ausflusstrakt deutlich
sichtbar (s. Abb. 3.3.1.6).
Abbildung 3.3.1.6: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht eines
rechtsventrikulären Ausflusstraktes (von der parasternalen kurzen Achse
ausgehend) des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001)
Ao:
LA:
RVOT:
Aorta
Linker Vorhof
Rechtsventrikulärer Ausflusstrakt
56
3. Experimenteller Teil
In Einzelfällen wurde ein Ultraschall-Kontrastmittel (Sonovue®) i.v. verabreicht, um
die Darstellung des rechten Ventrikels zu verbessern.
Time Motion-Modes (M-Mode) wurden in der parasternalen Längsachsenansicht
dicht unterhalb der Mitralklappe mit Darstellung der rechten Ventrikelwand und des
rechten Ventrikels, des interventrikulären Septums, des linken Ventrikels und der
linken Ventrikelwand angefertigt. Bei den angefertigten M-Modes im Querschnitt
wurde der Schallstrahl zwischen die Papillarmuskeln gelegt, um eine nahezu
identische Einstellung der Strukturen zu bekommen.
Zur Dopplerechokardiographie wurde ein 12 MHz Sektorschallkopf verwendet. Zur
Linearisierung der Ultraschallsignale wurde eine ca. 1 cm lange Vorlaufstrecke (ein
mit zentrifugiertem Ultraschallgel gefüllter Zeigefinger eines handelsüblichen
puderfreien Latexhandschuhs) vorgeschaltet. Mittels CW-Doppler (continious wave)
konnte der Blutstrom im Bereich der Aorten- und der Mitralklappe dargestellt werden.
Hierbei werden kontinuierlich Ultraschallwellen ausgesandt und empfangen, wobei
auch sehr schnelle Geschwindigkeiten registriert werden und die typischen
Dopplerfrequenzspektren entstehen können. Aufgrund der Frequenzspektren kann
der gedoppelte Gefäßbereich definiert und die Flussgeschwindigkeiten gemessen
werden (POULSEN NAUTRUP und TOBIAS (Hrsg) 2001).
Der
Schallkopf
wurde
dabei
so
ausgerichtet,
dass
im
2-D-Bild
eine
Längsachsenansicht des Herzens dargestellt wird. Der Strahl wurde für die
Aortendopplermessungen durch die Aorta und für die Mitraldopplermessungen
(durch Neigen des Schallkopfes) durch die Mitralklappe gelegt. Hierbei entstanden
Bilder, die denen des Menschen oder des Hundes ähneln. Zur Darstellung des
Trikuspidalflusses wurde der Schallkopf so gestellt, dass der Strahl in seiner
Verlängerung auf die rechte Schulter der Maus treffen würde (Annäherung an den
apikalen 4-Kammerblick).
Aufgrund der Häufung von kardialen Ereignissen unter Belastung wurde die
Untersuchung in verkürzter Form (M-Mode-Bilder des Querschnittes und DopplerBilder) nach intraperitonealer Gabe eines Sympathomimetikums (2 µg/g Isoprenalin)
wiederholt.
57
3. Experimenteller Teil
Die Bilddaten wurden digital auf Magneto-Optical Disc zur offline Analyse
gespeichert, hiermit wurde die Untersuchungszeit auf 25 bis 30 Minuten minimiert.
Nach der Untersuchung wurde die Fixation der Maus vorsichtig gelöst. Das
Ultraschallgel wurde sorgfältig von der Maus entfernt und unter Beobachtung
leuchtete eine Rotlichtquelle den Käfig über zwei Stunden aus.
3.3.2 Auswertung
Alle Messungen erfolgten offline durch einen bezüglich des Genotyps (transgennicht transgen) geblindeten Untersucher. Bei nicht optimal messbaren Variablen oder
wenn die Anschallungsebene nicht den Standardschnitten entsprach, wurden diese
nicht in der Auswertung berücksichtigt.
Das Echokardiographiegerät besaß ein integriertes Messsystem, mit dem alle
Messungen der verschiedenen Parameter erfasst wurden. Die „Leading-EdgeMethode“ (jeweils von der Vorderkante der betroffenen Echolinie messen) wurde bei
quantitativen
Distanzmessungen
nach
den
Leitlinien
der
„Amerikanischen
Gesellschaft für Echokardiographie“ angewendet.
Es wurden zehn Parameter zur Rechtsherzbestimmung in den zweidimensionalen
Standardeinstellungen gemessen (nach FOALE et al. 1986; s. Abb. 3.3.2).
58
3. Experimenteller Teil
Abbildung 3.3.2: Gemessene Rechtherzparameter modifiziert nach FOALE (1986)
TV: präsystolischer Durchmesser der Trikuspidalklappe, RVDd: diastolischer
rechtsventrikulärer Diameter in der Längsachsenansicht RVLAX: Länge des rechten
Ventrikels in der Diastole, RVSAX: Breite des rechten Ventrikels in der Diastole, RVIT3:
Durchmesser des Einflusstraktes des rechten Ventrikels in der Diastole, RVOT1/ RVOT4:
präsystolischer Durchmesser des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei gleichzeitiger
Darstellung der Trikuspidalklappe/ vom Querschnitt ausgehend, RVd Vierkammer/ RVd
lav/ RVd sav: diastolische Fläche des rechten Ventrikels gemessen im Vierkammerblick/
Längsachsenansicht/ Querachsenansicht
59
3. Experimenteller Teil
Im apikalen Vierkammerblick wurde in der Diastole die rechtsventrikuläre Fläche
(RVd Vierkammer) bestimmt. Zusätzlich wurde die rechtsventrikuläre Länge (RVLAX)
von dem Mittelpunkt des Anulus fibrosus dexter bis zum rechtsventrikulären Apex
und der rechtsventrikuläre Einflusstrakt (RVIT3) im ersten Drittel des rechten
Ventrikels hinter dem Trikuspidalklappenring gemessen. Die maximale Ausdehnung
im mittleren Drittel des rechten Ventrikels, der als Körper definiert wird, wird parallel
zum Einflusstrakt als RVSAX gemessen. In der diastolischen Längsachsenansicht
wurde die rechtsventrikuläre Fläche (RVd lav) und der rechtsventrikuläre Diameter
(RVDd) gemessen. Letztere Messung wurde senkrecht zur Aortenwurzel von der
rechtsventrikulären freien Wand zur vorderen Begrenzung der vorderen Aortenwand
vorgenommen. In der gekippten Längsachsenansicht bei gleichzeitiger Darstellung
der Trikuspidal- und Pulmonalklappe, wird präsystolisch die Trikuspidalklappe (TV)
und der rechtsventrikuläre Ausflusstrakt (RVOT1) vermessen. In der parasternalen
Kurzachsenansicht wird diastolisch die rechtsventrikuläre Fläche (RVd sav)
bestimmt. In der (von der Querachsenansicht ausgehenden) rechtsventrikulären
Ausflusstrakteinstellung wird präsystolisch kurz vor dem Pulmonalklappenring der
rechtsventrikuläre Ausflusstrakt (RVOT4) gemessen.
Des
Weiteren
wurden
neun
Parameter
zur
Linksherzbestimmung
in
den
zweidimensionalen Standardeinstellungen vermessen.
In der präsystolischen Längsachenansicht wurde der linksatriale Durchmesser (LA),
der linksventrikuläre Ausflusstrakt (LVOT) und der Aortenwurzeldurchmesser (AoV)
gemessen.
Für jeden Parameter in den zweidimensionalen Einstellungen wurden drei
Messungen vorgenommen und der jeweilige Mittelwert errechnet.
Für die weitere Linksherzvermessung wurden im M-Mode die Wanddicken des
Septums (IVSd / IVSs) und der linksventrikulären Kammerwand (LVWd / LVWs)
sowie der linksventrikuläre Ventrikeldurchmesser (LVEDd / LVEDs) in der Diastole
und in der Systole gemessen.
60
3. Experimenteller Teil
Für jeden Parameter wurden zwei Messungen im M-Mode des Längsschnittes und
drei Messungen im M-Mode des Querschnittes verwendet. Aus diesen fünf
Einzelwerten wurde dann der Mittelwert für jeden Parameter bestimmt.
Im CW-Doppler wurden weitere sieben Linksherz- und zwei Rechtsherz-Parameter
gemessen.
Im Aortendoppler wurde Folgendes bestimmt:
•
die maximale Flussgeschwindigkeit (AoVmax) als Punkt des frühsystolischen
Geschwindigkeitsmaximums,
•
die Kontur des Aortenflusses,
- als Geschwindigkeits-Zeit-Integral (VTI: velocity time integral),
- und zur weiteren automatischen Errechnung des maximalen und
durchschnittlichen Aortenflussdruckes (Ao max PG / Ao MPG),
•
und der Abstand zwischen zwei Aortenausschlägen (Ao R-R).
Im Mitraldoppler wurde in der frühen Diastole die maximale Flussgeschwindigkeit
(MV Vmax oder MV E Punkt) direkt nach der Mitralklappenöffnung gemessen. Von
diesem Zeitpunkt der höchsten Flussgeschwindigkeit bis zum Ende des ersten
Einstromes wurde die Dezelerationszeit (MV Decel-Zeit) in ms bestimmt. Am Ende
der Diastole wurde der Punkt der höchsten Flussgeschwindigkeit zum Zeitpunkt der
Vorhofkontraktion (MV A Punkt), der zweite Einstrom, ermittelt. Zusätzlich wurde die
Kontur des Mitralflusses zur automatischen Errechnung des maximalen und
durchschnittlichen Mitralflussdruckes (MV max PG / MV MPG) bestimmt.
Im Trikuspidaldoppler wurde ebenso der Punkt der höchsten Flussgeschwindigkeit
(TV max) gemessen. Im Gegensatz zum Mitraldoppler lag dieser meistens zum
Zeitpunkt der Vorhofkontraktion (also bei dem zweiten Einstrom) vor. Weiter wurde,
ebenso wie bereits beim Aorten- und Mitraldoppler, die Kontur des Flusses
umfahren, um den maximalen und durchschnittlichen Trikuspidalflussdruck (TV max
PG / TV MPG) automatisch zu errechnen.
Für jeden Parameter wurden jeweils drei Einzelwerte bestimmt und aus diesen der
Mittelwert errechnet.
61
3. Experimenteller Teil
Aus den gemessenen Werten wurden folgende Parameter rechnerisch ermittelt:
Tabelle 3.3.2: Errechnete Werte aus echokardiographischen Daten
Parameter
Abk.
Formel
Einheit
Herzfrequenz
HF
1000/AoRR* 60
Schläge/
min
Linksventrikuläre
Verkürzungsfraktion
FS
((LVEDdLVEDs)/LVEDd)* 100
%
Herzzeitvolumen
HZV
Schlagvolumen*Herzfrequenz
ml/min
Schlagvolumen (Aorta)
SV (Ao)
(AoV/2)2 * π * VTI/ 100
ml
Schlagvolumen (LVOT)
SV (LVOT)
(LVOT/2)2 * π * VTI/ 100
ml
Linksventrikuläre
Ejektionszeit
Verhältnis von E Punkt zum
A Punkt
LVET
MV E/A
Zeit in ms des
Aortendopplersignals
MV E Punkt (max)/ MV A Punkt
(max)
((IVSd+LVEDd+LVWd)³-LVEDd³)
* 1,055
ms
Masse des linken Ventrikels
LV Masse
Verhältnis von der
linksventrikulären Masse
zum Körpergewicht
LV/BW ratio
LV Masse/ KG (g)
Zirkuläre Faserverkürzung
Vcf
10* FS/ LVET
Circ/ s
nach HF korrigiert
Vcfc
Vcf/ Wurzel (RR×100)
Circ/ s
Verhältnis vom HZV zum
Körpergewicht
Rechtsventrikuläres
diastolisches Volumen nach
Wübbeling
Rechtsventrikuläres
Volumen nach der
ellipsoiden Methode
Enddiastolisches Volumen
des linken Ventrikels nach
Teichholz
Endsystolisches Volumen
des linken Ventrikels nach
Teichholz
Cardiac
index
HZV/ KG in z.B. g
ml/ min/
g
RVDV nach
Wübbeling
(
RVDV nach
ellipsoid
8 * π * RVd Vierkammer 2
3 * RVLAX
mm3
EDV
(7/(2,4+LVEDd))* LVEDd 3
mm2
ESV
(7/(2,4+ LVEDs))* LVEDs3
mm2
Ejektionsfraktion des linken
Ventrikels nach Teichholz
EF nach
Teichholz
(EDV-ESV)/ EDV* 100
%
4 1
+ ) * RVd sav* RVLAX
15 6
62
mg
µl
3. Experimenteller Teil
3.4 Schwimmtraining
3.4.1 Durchführung
Da vor allem bei Leistungsportlern plötzliche arrhythmische Herztode mit einer ARVC
in Verbindung gebracht wurden (WICHTER et al. 2002), wurden durch ein
Schwimmtraining ähnliche Bedingungen vorgegeben.
Das hierfür genutzte Schwimmbecken war 35 cm breit, 55 cm lang und 30 cm tief.
Die Wassertemperatur betrug 36°C. Um den Mäusen eine selbstbestimmte
individuelle Trainingsintensität zu ermöglichen, wurde ein mit Klebeband umwickelter
handelsüblicher 1-Liter Messbecher als freischwebendes Laufrad benutzt. Als
Erholungsmöglichkeit wurde ein mit Wasser und Luft gefüllter Latexhandschuh ins
Becken gegeben. Die Mäuse wurden in Gruppen von bis zu zehn Tieren, nach
Geschlecht getrennt, schwimmen gelassen. Die anfängliche Trainingszeit betrug fünf
Minuten und wurde dann in einem Zeitraum von acht Wochen im 5-Tage-Training-2Tage-Ruhe-Rhythmus auf 1,5 Stunden gesteigert. Zu Beginn des Trainings waren
die Tiere durchschnittlich 13 Wochen alt. Sowohl vor als auch nach dem Training
wurden eine echokardiographische Untersuchung durchgeführt und ein OberflächenEKG angefertigt.
3.4.2 Auswertung
Am Ende der Trainingszeit wurde die Aktivität der einzelnen Tiere analysiert. Bei
einer Trainingszeit von 90 Minuten wurden in den ersten 60 Minuten die Tiere bei
Pausen, die länger als vier Sekunden dauerten, durch einen taktilen Reiz (sanftes
„Anstupsen“) zum Weiterschwimmen animiert. Im 10-minütigen Abstand wurde die
Anzahl der Fremdmotivationen pro Maus ausgezählt. Anschließend wurde jede Maus
über fünf Minuten beobachtet, und es wurde detailliert registriert, wie viele Sekunden
die Maus jeweils schwamm, sich ausruhte oder auf dem Laufrad rannte. Aufgrund
dessen konnte jedem Tier eine Aktivitätszahl zugewiesen werden.
63
3. Experimenteller Teil
Diese setzte sich wie folgt zusammen:
•
Für die Zeit der Ruhe wurden keine Aktivitätspunkte gegeben.
•
Die Sekunden der Schwimmphase wurden als Aktivitätspunkte gezählt.
•
Die Sekunden der Laufphase wurden mit 2 multipliziert, da das Rennen auf dem
Laufrad die intensivste Bewegungsform darstellt, und als Aktivitätspunkte gezählt.
64
3. Experimenteller Teil
3.5 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen
3.5.1 Durchführung
Die Mäuse wurden heparinisiert (250 IE Natrium-Heparin, Liquimin®, intraperitoneal),
anästhesiert (2 g/kg KGW Urethan in einer 2 mg/kg KGW Natriumchloridlösung,
intraperitoneal) und auf einer Wärmeplatte gelagert.
Nach Ausfall des Zwischenzehenreflexes wurde die Maus auf dem Rücken gelagert
und mit den Pfoten auf einer Styroporplatte mit Nadeln fixiert. Die Haut wurde
entlang der Medianen vom Xiphoid bis zum Nabel durchtrennt. Die Bauchwand
wurde frei präpariert und die Bauchhöhle intradiaphragmental entlang dem
Rippenbogen eröffnet. Nun wurde das Diaphragma von der Bauchhöhle aus entlang
des Rippenbogens durchtrennt. Die Brustwand wurde bilateral in kraniale Richtung
mit der Schere zügig aufgeschnitten und ließ sich nun aufklappen. Die Vena Cava
wurde am rechten Vorhof und die Aorta auf Höhe des Aortenbogens durchtrennt.
Anschließend wurde das Herz mit anhängendem Lungengewebe entnommen. Der
Organkomplex wurde unmittelbar nach der Entnahme in eine Petrischale mit einer
37ºC
warmen
präoxygenierten
Krebs-Henseleit-Pufferlösung
(s.
Tab.
3.5.1)
überführt.
Tabelle 3.5.1: Zusammensetzung der Krebs Henseleit-Pufferlösung
Der Puffer wurde mit einem Gasgemisch aus 95% O2 und 5% CO2 (Carbogen-Gas) equilibriert und
mit Natronlauge (1 mol/l NaOH) oder Salzsäure (1 mol/l HCl) auf einen pH-Wert von 7,35 bis 7,45
titriert.
Substanz
mmol
NaCl
118
NaHCO3
24,88
KH2PO
1,18
Glukose
5,55
Na- Pyruvat
2
MgSO4
0,83
CaCl2
1,8
KCl
4,7
65
3. Experimenteller Teil
Die Lungen und das mediastinale Gewebe wurden entfernt und die Gefäßenden
gekürzt. Die etwa 3 mm lange Aorta wurde über eine Kanüle (27 Gauche) gestülpt
und mit einem Faden (Seide metric 3) fixiert. Das Herz wurde an die LangendorffApparatur angeschlossen (Hugo Sachs, March- Hugstetten, D), und retrograd mit
einem Perfusionsdruck von 110±5 mmHg und einem konstanten Fluss von 4±1
ml/min mit 37ºC warmen oxygeniertem Krebs- Henseleit-Puffer perfundiert (s. Abb.
3.5.1).
Abbildung 3.5.1: Der Versuchsaufbau einer Langendorffapparatur
A Der schematische Aufbau einer Langendorffapparatur zur Aufzeichnung von monophasischen
Aktionspotentialen am isolierten Mäuseherz
B In der schematischen Zeichnung sind die Aufzeichnungslokalisationen im Mäuseherz dargestellt,
zum einen die endocardialen Schrittmacher- und Aufzeichnungsstellen des oktapolaren Katheters,
2 epikardialen MAP-Aufnahmestellen und das Reizleitungssystem
C Eine simultane Aufnahme von einem Elektrogramm des rechten Vorhofs (obere Aufnahme), einer
epicardialen MAP-Aufnahme des rechten Ventrikels (zweite Aufnahme), der linksventrikulären freien
Wand (dritte Aufnahme) und des linksseitigen Septums (vierte Aufnahme), und die erste Ableitung
des EKGs (letzte Aufnahme) nach einem mechanisch gesetzten AV-Block. Der senkrechte Balken
im linken unteren Bildrand entspricht 1mV, der waagerechte Balken entspricht 100 ms.
66
3. Experimenteller Teil
Das Perfusat wurde über ein 39,8ºC warmes Wasserbad (Durchlauferhitzer, LAUDA
ecoline® 003) erwärmt und über eine Glasfritte moderat mit Carbogen begast. Über
eine Rollerpumpe (Isomatic® Hugo Sachs Electronic) und mit Hilfe eines
Perfusionsautomaten (Perfusor® sacura B- Braun) erfolgte die Zufuhr der
Wirkstofflösung. Der Zufluss war mit einem Überdruckabflusssystem versehen. Eine
verstellbare Druckmembran diente der Injektionsdruckregulation. Um artifiziellen
Gewebeschädigungen vorzubeugen wurde an der linksventrikulären Seite des Apex
cordis eine Injektionskanüle (1,3 mm Durchmesser) gestochen, um den Druck im
Ventrikel zu mindern.
Ein 2.0 French oktapolarer elektrophysiologischer Mauskatheter mit 0,5 mm breiten
Elektroden und 0,5 mm breiten Zwischenräumen (CIB´ER MOUSE, NuMED, Inc.,
Hopkinton, N.Y., U.S.A.) wurde über eine 2 mm große iatrogene Öffnung in den
rechten Vorhof und weiter bis in den rechten Ventrikel in Septumnähe vorgeschoben,
um zu stimulieren und ein intrakardiales Elektrogramm abzuleiten. EKG-Aufnahmen
wurden über in Schwämme eingebettete Ag-AgCl Elektroden, die mit speziell
angefertigten, gefederten Halterungen senkrecht an das Epikard gedrückt wurden,
aufgezeichnet.
Die EKG Signale wurden von einem Vorfilter mit einer Bandbreite von 0,1 – 300 Hz
verstärkt und gefiltert (Hugo Sachs, March-Hugstetten, D).
Über drei MAP-Katheter (monophasisches Aktionspotential) wurden simultan MAPs
vom rechten und linken Ventrikel und vom Septum aufgezeichnet. Die MAP-Katheter
wurden an speziell angefertigten gefederten Halterungen befestigt, die eine
konstante Andruckstärke senkrecht zum Epikard gewährleisteten. Die MAPs wurden
mit DC-gekoppelten Vorverstärkern verschaltet (Modell 2000, EP Technologie, San
Jose, CA, U.S.A.). Alle vorverstärkten Signale wurden mit einer speziell angepassten
halbautomatischen Software (Labview®) zur Analyse der Repolarisationen von
Mäuseherzen digitalisiert und aufgezeichnet. Dieses Programm wurde in der
Arbeitsgruppe Kirchhof / Fabritz in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Franz,
Dept. of Pharmacology, Georgetown University, Washington DC, U.S.A. erstellt.
Zur Erzeugung eines AV-Blockes wurde eine kleine anatomische Adson-Pinzette in
die 2 mm große Öffnung am rechten Vorhof eingeführt und bis zum septalen Anteil
67
3. Experimenteller Teil
des Anulus fibrosus vorgeschoben und dieser hier vorsichtig komprimiert. Bei
erfolgreicher Blockierung wird der Ventrikel elektrophysiologisch vom Vorhof
dissoziiert und schlägt in einem langsameren ventrikulären Ersatzrhythmus um.
Das Protokoll startete mit einer 10-minütigen Wartezeit, um eine Stabilität im Bezug
auf die Signalqualität und des Sinusrhythmus zu gewährleisten. Anschließend wurde
mit Hilfe des oktapolaren Katheters eine fixfrequente Vorhofstimulation bei 140 ms,
120 ms und 100 ms jeweils über 40 Sekunden durchgeführt. Die Veränderung der
Zykluslänge bei der Stimulation dient zur Ermittlung der AV-Knotenüberleitungszeit
(Wenckebach Punkt). Nach einer kurzen Pause wurde ein AV-Block induziert. Bei
Persistieren des AV-Blocks, nach 5-minütiger Beobachtung durch Elektrogramm und
MAP, und nach Registrierung der spontan auftretenden Arrhythmien, wurde der
Versuch fortgesetzt. Mit einer darauf folgenden programmierten Kammerstimulation
bei 200 ms, 150 ms und 100 ms (à 40 s) und jeweils einer zusätzlichen S2
Stimulation wurde das Auftreten von Arrhythmien provoziert und die effektive
Refraktärperiode (ERP) bestimmt. Danach wurde in einer 5-minütigen Einlaufphase
Orciprenalin (2,5 mg/l) dem Perfusat mit 90 ml/h hinzugefügt und über zehn Minuten
aufgezeichnet. Anschließend wurde das Protokoll der ventrikulären Stimulation
wiederholt.
68
3. Experimenteller Teil
3.5.2 Auswertung
Alle Aufzeichnungen wurden offline vollständig visuell kontrolliert und manuell mit
einer in der Arbeitsgruppe vorhandenen Software für MAP-Auswertungen analysiert.
Bei der MAP-Analyse wurde die Aktionspotentialsdauer (APD) bei 50%, 70% und
90% der Repolarisation bestimmt (s. Abb. 3.5.2). Die einzelnen MAPs mussten
folgende Qualitätskriterien erfüllen: stabile Grundlinie und eine MAP-Morphologie; ein
gerader Aufstrich, dessen Dauer weniger als 2 ms beträgt und eine Amplitudenhöhe
von wenigstens 1 mV erreicht, und eine schnelle erste Phase der Repolarisation
ohne Plateau (KNOLLMANN et al. 2001).
Abbildung 3.5.2: Monophasisches Aktionspotential einer Maus
Die anfängliche schnelle Repolarisation geht direkt über in eine langsamere Phase
der Repolarisation, die ein abfallendes Plateau beschreibt, um sich dann allmählich
der diastolischen Grundlinie anzunähern. Die Aktionspotentialdauer wurde von der
schnellsten Anstiegsgeschwindigkeit bis zu den verschiedenen Repolarisationslevel
(APD50, APD70, APD90) gemessen.
Da es bei der typischen murinen MAP-Form kein Plateau in der frühen
Repolarisationsphase gibt, wurde der Beginn der Repolarisation (0%) mit dem Peak
des MAPs definiert, und 100% der Repolarisation wurden in der elektrischen Diastole
gemessen (GUSSAK et al. 2000). Die Dispersion der Repolarisation wurde definiert
als Differenz der maximalen und minimalen APD von den simultan aufgenommenen
MAPs (KIRCHHOF et al. 1996).
69
3. Experimenteller Teil
Zusätzlich wurden alle Aufzeichnungen auf Arrhythmien überprüft. Hier wurde
zwischen Spontanen und Induzierten unterschieden. Induzierte Arrhythmien traten
bei der Kammerstimulation auf. Weiter werden monomorphe und polymorphe
ventrikuläre Tachykardien, Bigemini, Tripletts und Quadrupletts angegeben.
Bei der Analyse der Aktivierungszeiten (Überleitungszeiten) werden zum einen die
Gesamtaktivierungszeiten der Zykluslängen im EKG (vom Anfang des Stimulus bis
zum Beginn des MAP) und zum anderen die Aktivierungszeiten der einzelnen MAPs
(linksventrikulär, rechtsventrikulär und septal) gemessen.
Zur Ermittlung der Sinusknotenerholungszeit misst man den Abstand zwischen dem
letzten MAP der Stimulation bis zum ersten spontanen Schlag.
70
3. Experimenteller Teil
3.6 Histologische Untersuchung
Die Mäuse wurden mit Urethan (2g/kg Körpergewicht) tief narkotisiert. Dann wurde
zügig der Brustkorb eröffnet, das Brustbein vom kaudalen Ende angehoben, die
Rippen durchtrennt und das Herz von seiner Fixation gelöst. Nach Durchführung der
elektrophysiologischen Untersuchungen in der Langendorff-Apparatur wurden die
Herzen anschließend in Formalin (3,7%) fixiert. Die histologischen Untersuchungen
wurden
von
Prof.
B.
Levkau
am
Institut
für
Pathophysiologie
des
Universitätsklinikums Essen durchgeführt. Hematoxylin-Eosin (HE) wurde zur
Färbung der histomorphologischen Schnitte und Goldner`s Trichrome Färbung zur
Beurteilung der Fibrosierung genutzt. In jedem Herzen wurde der Zelldurchmesser in
100 Zellen, sowohl im linken als auch im rechten Ventrikel, auf Höhe des Zellkerns
vermessen.
71
3. Experimenteller Teil
3.7 Positronen Emissions Tomographie (PET)
In der Medizinischen Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin des Universitätsklinikum
Münster unter der Leitung von Prof. Dr. Michael Schäfers wurde die myokardiale
Glucoseaufnahme von MTA Christine Bätza in vivo nicht invasiv bei Mäusen über die
kardiale Aufnahme des Glucose Analogons [18F]Fluor-desoxy-glucose ([18F]FDG)
beurteilt. Die Mäuse wurden anästhesiert mit Isoflurane (1,5%), bei 37°C gehalten
und mit 10 MBq intravenös injiziert. 60 Minuten nach der Injektion wurde die
Strahlung mit einer hochauflösenden Kleintier PET Kamera (quadHIDAC, Oxford
Positron Ltd., Oxford, England) über 15 Minuten gemessen (SCHÄFERS et al. 2005).
Die emittierenden Positronen kollidieren mit einem Elektron im Gewebe, hierbei
entsteht eine Vernichtungsstrahlung unter Abgabe zweier Photonen mit einer
Energie von 511 keV. Die Photonen bewegen sich in einem Winkel von 180°
auseinander und diese Strahlung wird von ringförmig angeordneten Detektoren der
Kamera
gemessen
(Gleichzeitigkeit
zweier
Gammastrahlen
ermöglicht
die
Lokalisation des Zerfallsortes entlang der Verbindungslinie der beiden betroffenen
Detektoren). Die Bilder wurden in eine Matrix mit einer Voxelgröße von 0,4 mm3
rekonstruiert.
72
3. Experimenteller Teil
3.8 Versuchsablauf und Tierversuchsgruppen
Die Versuche wurden möglichst paarweise mit je einem transgenen und einem
nichttransgenen
Geschwistertier
gleichen
Geschlechts
und
gleichen
Alters
angeordnet. Die Durchführung erfolgte entweder gleichzeitig (Telemetrie) oder direkt
hintereinander (Oberflächen-EKG, Echokardiographie, Langendorff).
In der Planung der Protokollabschnitte wurde berücksichtigt, dass für jedes Tier
sämtliche angesetzte Versuche (Oberflächen-EKG, Telemetrie, Echokardiographie,
Training, Langendorff) nacheinander und mit genügendem Abstand zueinander
durchgeführt wurden.
Alle Tiere wurden nach Anlieferung in demselben Raum gehalten, in dem alle
nachfolgenden Versuche stattfanden. Nachdem die Tiere für die Echokardiographie
narkotisiert, bzw. sediert wurden, wurde ein Oberflächen-EKG geschrieben und
danach
die
echokardiographische
Untersuchung
durchgeführt.
Nach
einer
„Erholungsphase“ von zwei Tagen wurden die Tiere für weitere Versuche (Training,
Telemetrie) eingesetzt. Für die telemetrischen Aufzeichnungen wurden die Tiere am
Tag der Transmitterimplantation erneut narkotisiert. Wenn bei der Echokardiographie
ein anderes Narkotikum benutzt wurde als bei der Transmitterimplantation, wurde ein
weiteres Oberflächen-EKG geschrieben und die Mäuse anschließend operiert. Nach
einer Zeitspanne von zehn bis 14 Tagen wurden die telemetrischen EKGs
aufgezeichnet. Die unterschiedlichen Belastungs-EKGs wurden an aufeinander
folgenden Tagen durchgeführt, um eine genügende Erholung zwischen den
Belastungen zu gewährleisten. C57Bl/6 Mäuse wurden aufgrund ihres aggressiven
Beißverhaltens nicht für das Training und nicht für die Echokardiographie ohne
Anästhesie eingesetzt.
Die Versuche wurden nur an adulten Tieren durchgeführt.
Nur bei der ersten Versuchsgruppe wurde von dem oben genannten Protokoll
abgewichen. Anfangs wurden drei transgene und drei nichttransgene weibliche
73
3. Experimenteller Teil
129/SV-Geschwistertiere im Alter von 29-31 Wochen und vier transgene (eins
männlich, drei weiblich), sowie drei nichttransgene (zwei männlich, eins weiblich)
C57Bl/6-Mäuse für die telemetrischen Untersuchungen verwendet. Die 129/SV-Tiere
wurden mit 36 Wochen für die Echokardiographie ohne Anästhesie untersucht. Eine
Woche später wurden dieselben Tiere mit Diazepam sediert und es erfolgte mit 38
Wochen eine erneute echokardiographische Untersuchung. Dieselbe Untersuchung
wurde bei den C57Bl/6-Tieren, die bereits in der Telemetrie waren, mit 36-45
Wochen, und bei weiteren zwei transgenen männlichen C57Bl/6-Tieren mit 41 und
47 Wochen sowie bei drei zusätzlichen transgenen männlichen 129/SV-Mäusen
durchgeführt.
Bei
einer
transgenen
weiblichen
C57Bl/6-Maus
und
einer
nichttransgenen weiblichen 129/SV-Maus wurden die telemetrischen Belastungen im
Alter von 50 und 52 Wochen wiederholt.
Kurz vor der Untersuchung am isolierten Herzen in der Langendorffapparatur wurde
bei den bereits mit Urethan narkotisierten oben genannten Tieren eine stark
verkürzte echokardiographische Untersuchung mit einem i.v. injizierten Kontrastmittel
(Sonovue®) durchgeführt.
In der zweiten Versuchsgruppe wurden 19 transgene (neun männlich, zehn weiblich)
und 16 nichttransgene 129/SV-Mäuse (acht männlich, acht weiblich) mit 9-12
Wochen
echokardiographisch
unter
Diazepam
Anästhesie
untersucht
und
anschließend über 8 Wochen mit regelmäßigem Schwimmen trainiert. Am Ende des
Trainings wurden dieselben Tiere erneut mit Hilfe der Echokardiographie im Alter von
18-26 Wochen geschallt. Bei einem Pärchen wurde das Training verfrüht
abgebrochen, da ein männliches transgenes Tier den Anforderungen nicht mehr
gewachsen war. Hier wurde die abschließende Echokardiographie bereits im Alter
von 19 Wochen durchgeführt. Zum besseren Vergleich existierte eine Kontrollgruppe
mit neun transgenen und neun nichttransgenen 129/SV-Tieren (je zwei männlich,
sieben weiblich), die im gleichen Alter echokardiographisch untersucht, aber nicht
trainiert wurden.
Bei vier transgenen und vier nichttransgenen dieser trainierten männlichen 129/SVTiere
wurden
Telemetrie-Transmitter
74
nach
der
echokardiographischen
3. Experimenteller Teil
Abschlussuntersuchung implantiert. Im Alter von 21-22 Wochen wurden die
Belastungsuntersuchungen durchgeführt.
Um
unter
trainingsähnlichen
Bedingungen
gleichzeitig
telemetrische
EKGs
aufzuzeichnen, wurden folgende Schritte unternommen:
Bei vier transgenen und vier nichttransgenen männlichen C57Bl/6-Tieren wurde nach
einer echokardiographischen Untersuchung unter Diazepam (im Alter von 13-14
Wochen)
eine
Transmitterimplantation
mit
anschließenden
Belastungsuntersuchungen (im Alter von 16-20 Wochen) durchgeführt. Im Alter von
31-32 Wochen wurden bei drei Transgenen und drei Wildtypen osmotische Pumpen,
die mit Isoprenalin (3 mg/kg/d) gefüllt waren, implantiert. Die Implantation erfolgte
unter Isoflurannarkose, in der vorab noch eine kurze echokardiographische
Untersuchung
erfolgte.
Über
sieben
Tage
wurden
telemetrische
EKGs
aufgezeichnet. Danach wurde die Echokardiographie unter Isofluran wiederholt und
direkt im Anschluss erfolgte die Untersuchung an der Langendorffapparatur.
In einer weiteren Versuchsgruppe wurden zwei transgene und zwei nichttransgene
weibliche
129/SV-Mäuse
im
Alter
von
zehn
Wochen
unter
Isofluran
echokardiographisch untersucht, Telemetrie-Transmitter implantiert und im Alter von
14 Wochen Belastungenuntersuchungen durchgeführt. Mit 15 Wochen wurden den
Tieren mit Isoprenalin und Phenylephrin (je 30 mg/kg/d) gefüllte osmotische Pumpen
implantiert. Das Protokoll wurde nach aktuellen Literaturangaben (MAASS et al.,
2004) erstellt. Die Belastung führte innerhalb von 24 h zu letalen Komplikationen.
Um eine altersabhängige Entwicklung des kardialen Phänotyps zu untersuchen,
wurden bei acht transgenen (zwei männlich, sechs weiblich)
und neun
nichttransgenen (zwei männlich, sieben weiblich) C57Bl/6-Tieren im Alter von 42-46
Wochen eine echokardiographische Untersuchung unter Diazepam durchgeführt.
Bei allen Untersuchungen oder Maßnahmen, die unter Sedierung oder Narkose
erfolgten (Echokardiographie, Transmitterimplantation, Langendorff), wurden jeweils
Oberflächen-EKGs unter der jeweiligen Medikation vorab geschrieben. Tabelle 3.8
75
3. Experimenteller Teil
stellt eine Übersicht über die verschiedenen Versuchsgruppen und deren Anzahl der
ausgewerteten Tiere dar.
76
3. Experimenteller Teil
Tabelle 3.8: Anzahl der Mäuse in den einzelnen Versuchsgruppen
Bl6
untrainiert
WT TG
Maustyp
Genotyp
unsediert
Echokardiographie
Diazepam
Isofluran
Isofluran
Urethan
OberflächenEKG
Ket/Xyl
Diazepam
Papier-EKG
Diazepam
Telemetrie
mit Isoprenalin
Pumpe
mit PhenylephrinIsoprenalin Pumpe
Urethan
Langendorff
mit Isoprenalin
Pumpe
Histologie
SV
untrainiert
WT TG
SV
trainiert
WT
TG
36 Wochen
-
-
3
3
-
-
9-12 Wochen
2
1
25
28
-
-
13-26 Wochen
4
7
10
10
16
19
> 38 Wochen
12
14
3
7
-
-
vor/nach Isoprenalin
Pumpe
2
3
-
-
-
-
10-11 Wochen
-
-
3
3
-
-
31-32 Wochen
3
3
-
-
-
-
21-35 Wochen
-
-
6
8
7
10
42-53 Wochen
3
5
3
5
-
-
7-17 Wochen
9
10
3
6
-
-
10-19 Wochen
-
-
16
19
-
-
18-31 Wochen
-
-
-
-
14
17
42-46 Wochen
12
13
2
5
-
-
38-46 Wochen
3
5
2
2
-
-
14-20 Wochen
4
4
2
2
-
-
21-22 Wochen
-
-
-
-
4
4
29-39 Wochen
3
4
3
3
-
-
50-52 Wochen
-
1
1
-
-
-
31-33 Wochen
3
3
-
-
-
-
15 Wochen
-
-
2
2
-
-
16-34 Wochen
6
5
5
6
9
13
> 42 Wochen
4
8
3
5
-
-
33 Wochen
3
3
-
-
-
-
21-28 Wochen
1
-
3
2
6
11
> 42 Wochen
3
7
1
1
-
-
77
3. Experimenteller Teil
3.9 Statistik
Die Analyse erfolgte bezüglich des Genotyps geblindet. Alle Variablen wurden nach
Genotypen mit Hilfe des Post-doc Student`s T test (Microsoft Excel 2000) und
ANOVA Analyses (SPSS Version 12) verglichen. Der Fisher´s exact Test und der Chi
square Test wurden benutzt, um Arrhythmien zwischen den Genotypen zu
vergleichen. Um Korrelationen zu berechnen, wurde die Pearson Korrelation
verwand. Als signifikant wurden Unterschiede anerkannt, die einen p-Wert < 0,05
zeigten. Alle Werte wurden als Mittelwert +/- Standardfehler angegeben.
78
4. Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Echokardiographie
4.1.1 Altersabhängiger Vergleich
Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen wurden nach Altersklassen
zusammengefasst. In den Altersklassen von neun bis 12 Wochen und 13 bis 26
Wochen konnten keine signifikanten Unterschiede in den echokardiographischen
Parametern zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und den Wildtypen festgestellt werden.
Im höheren Alter konnte auch kein Unterschied in den Linksherzparametern evaluiert
werden. Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 4.1.1.1 zusammenfassend
dargestellt.
Tabelle 4.1.1.1: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Linksherzparameter bei 9 bis 12
Wochen und über 38 Wochen alten Tieren
Die
Werte
werden
angegeben
als
Mittelwert
±
Standardfehler.
HF: Herzfrequenz, LA: linkes Atrium, MV E Punkt: höchster Punkt der E-Welle im Mitraldoppler, MV
A Punkt: höchster Punkt der A-Welle im Mitraldoppler, MV Decel-Zeit: Dezelerationszeit der
Mitralwelle, IVSd: Durchmesser des Interventrikulären Septums in der Diastole, LVEDd/LVEDs:
linksventrikulärer Durchmesser diastolisch/systolisch, FS: Ventrikelverkürzungsfraktion, Ao Vmax:
maximale Geschwindigkeit des Aortendopplers, HZV: Herzzeitvolumen, Vcf: zirkuläre
Faserverkürzung, LV Masse: errechnete Masse des linken Ventrikels
Parameter
Atrium
Ventrikel
9-12 Wochen
>38 Wochen
WT
Plako +/-
WT
Plako +/-
Körpergewicht (g)
23,5 ± 0,7
23,4 ± 0,6
31,3 ± 1,6
31,3 ± 0,9
HF (Schläge/min)
455 ± 8
458 ± 14
509 ± 36
486 ± 35
LA (mm)
2,07 ± 0,08
2,15 ± 0,07
2,39 ± 0,10
2,51 ± 0,05
MV E Punkt (cm/s)
71,1 ± 1,8
72,4 ± 1,3
56,2 ± 4,1
59,6 ± 3,5
MV A Punkt (cm/s)
55,3 ± 2,8
57,5 ± 2,8
38,4 ± 4,2
36,2 ± 5,6
MV Decel-Zeit (ms)
32,0 ± 1,2
33,9 ± 1,6
34,3 ± 2,5
38,6 ± 2,3
IVSd (mm)
0,88 ± 0,05
0,90 ± 0,03
0,93 ± 0,03
0,94 ± 0,04
LVEDd (mm)
3,18 ± 0,05
3,12 ± 0,06
3,1 ± 0,11
3,2 ± 0,07
LVEDs (mm)
1,55 ± 0,05
1,49 ± 0,05
1,62 ± 0,11
1,58 ± 0,11
FS (%)
51,2 ± 1,2
52 ± 1,6
47,9 ± 2,9
51,6 ± 2,7
Ao V max (cm/s)
61,3 ± 1,5
59,6 ± 1,3
81,8 ± 6,9
95,3 ± 6,4
HZV (ml/min)
15,8 ± 0,9
15 ± 0,9
13,73 ± 1,5
16,12 ± 1,3
Vcf (circ/s)
8,61 ± 0,34
8,9 ± 0,37
8,44 ± 0,79
9,28 ± 0,83
korrigiert Vcf (circ/s)
184 ± 8
191 ± 10
195,5 ± 24
212 ± 24
LV Masse (mg)
86,2 ± 4,7
82,9 ± 3,4
93,7 ± 6,2
105,5 ± 6,2
79
4. Ergebnisse
In Tabelle 4.1.1.2 und 4.1.1.3 sind die Ergebnisse der Rechtsherzparameter
dargestellt.
Tabelle 4.1.1.2: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Rechtsherzparameter bei 9 bis 12
Wochen alten Tieren
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler (MW ± Stem) mit der dazugehörigen
Anzahl (n) der ausgewerteten Tiere.
TV: präsystolischer Durchmesser der Trikuspidalklappe, RVLAX: Länge des rechten Ventrikels in der
Diastole, RVSAX: Breite des rechten Ventrikels in der Diastole, RVIT3: Durchmesser des
Einflusstraktes des rechten Ventrikels in der Diastole, RVOT1/ RVOT4: präsystolischer Durchmesser
des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidalklappe/ vom
Querschnitt ausgehend, RVd Vierkammer (cm²)/ RVd lav (cm²)/ RVd sav (cm²): diastolische Fläche
des rechten Ventrikels gemessen im Vierkammerblick/ Längsachsenansicht/ Querachsenansicht,
RVdV (µl): errechnetes rechtsventrikuläres diastolisches Volumen nach Wübbeling
Parameter
TV (mm)
RVLAX (mm)
RVSAX (mm)
RVIT3 (mm)
RVOT1 (mm)
RVOT4 (mm)
RVd Vierkammer (mm²)
RVd lav (mm²)
RVd sav (mm²)
RVdV (µl)
WT
MW ± Stem
2,14 ± 0,07
4,96 ± 0,24
1,24 ± 0,06
1,48 ± 0,06
1,14 ± 0,04
1,18 ± 0,03
7,85 ± 0,50
5,42 ± 0,22
3,20 ± 0,22
6,98 ± 0,47
n
21
23
15
22
23
22
15
26
26
23
Plako +/MW ± Stem
2,24 ± 0,09
5,07 ± 0,20
1,22 ± 0,07
1,45 ± 0,08
1,12 ± 0,03
1,15 ± 0,03
7,32 ± 0,62
6,06 ± 0,48
4,64 ± 0,96
8,94 ± 1,69
n
24
24
17
24
26
24
17
26
25
24
Tabelle 4.1.1.3: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Rechtsherzparameter bei 13 bis 26
Wochen alten Tieren
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler (MW ± Stem) mit der dazugehörigen
Anzahl (n) der ausgewerteten Tiere.
TV: präsystolischer Durchmesser der Trikuspidalklappe, RVLAX: Länge des rechten Ventrikels in der
Diastole, RVSAX: Breite des rechten Ventrikels in der Diastole, RVIT3: Durchmesser des
Einflusstraktes des rechten Ventrikels in der Diastole, RVOT1/ RVOT4: präsystolischer Durchmesser
des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidalklappe/ vom
Querschnitt ausgehend, RVd Vierkammer (cm²)/ RVd lav (cm²)/ RVd sav (cm²): diastolische Fläche
des rechten Ventrikels gemessen im Vierkammerblick/ Längsachsenansicht/ Querachsenansicht,
RVdV (µl): errechnetes rechtsventrikuläres diastolisches Volumen nach Wübbeling
Parameter
TV (mm)
RVLAX (mm)
RVSAX (mm)
RVIT3 (mm)
RVOT1 (mm)
RVOT4 (mm)
RVd Vierkammer (cm²)
RVd lav (cm²)
RVd sav (cm²)
RVdV (µl)
WT
MW ± Stem
2,10 ± 0,07
4,35 ± 0,11
1,35 ± 0,11
1,40 ± 0,06
1,17 ± 0,03
1,18 ± 0,02
5,40 ± 0,62
7,20 ± 0,50
3,98 ± 0,53
7,80 ± 1,21
80
n
14
14
10
14
14
14
9
14
14
14
Plako +/MW ± Stem
2,09 ± 0,07
4,61 ± 0,20
1,51 ± 0,16
1,52 ± 0,11
1,11 ± 0,02
1,14 ± 0,03
5,94 ± 0,66
7,32 ± 0,43
4,72 ± 0,66
9,88 ± 1,50
n
14
14
10
14
14
14
10
17
17
14
4. Ergebnisse
Bei transgenen Tieren, die älter als 38 Wochen waren, konnte eine signifikante
Vergrößerung verschiedener Parameter des rechten Ventrikels dargestellt werden.
Im Vierkammerblick unterschied sich die Fläche (RVd Vierkammer: 7,16 ± 0,44 mm²
bei Wildtypen und 11,12 ± 0,76 mm² bei transgenen Tieren, p<0,05) sowie die Länge
(RVLAX: 5,24 ± 0,26 mm bei Wildtypen und 5,97 ± 0,16 mm bei transgenen Tieren,
p<0,05) und die Breite (RVSAX: 1,25 ± 0,06 mm bei Wildtypen und 1,81 ± 0,15 mm
bei
transgenen
Tieren,
p<0,05)
des
rechten
Ventrikels,
als
auch
der
rechtsventrikuläre Einflusstrakt (RVIT3: 1,40 ± 0,06 mm bei Wildtypen und 1,79 ±
0,16 mm bei transgenen Tieren, p<0.05).
Diese Vergrößerung der rechtsventrikulären Parameter im Vierkammerblick entsteht
somit erst im höheren Alter der transgenen Tiere (s. Tab. 4.1.1.2 und 4.1.1.3 sowie
Abb. 4.1.1.1 und 4.1.1.2).
180
% vs WT
160
WT
140
TG
120
*
*
*
*
100
80
RVLAX
Abbildung
RVSAX
RVIT3
RVd
Vierkam
4.1.1.1: Vergleich der Rechtsherzparameter im Vierkammerblick
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen, die älter als 38 Wochen sind
zwischen
Es wird die Länge (RVLAX), die Breite (RVSAX), der Durchmesser des Einflusstraktes
(RVIT3) und die Fläche (RVd Vierkam) des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei
Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter
über 38 Wochen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 9 (WT) und 9 (TG), Student’s T-Test)
81
4. Ergebnisse
Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick
Abbildung 4.1.1.2: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten
Ventrikels im Vierkammerblick bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind
Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung
dargestellt
A)
Wildtyp
B)
Plakoglobin+/-Maus
82
4. Ergebnisse
Auch in der Längsachsenansicht konnte eine Vergrößerung der Fläche des rechten
Ventrikels mit zunehmendem Alter bei Plakoglobin+/-Mäusen festgestellt werden (s.
Abb 4.1.1.3 u. 4.1.1.4).
rechtsventrikuläre Fläche in der
Längsachsenansicht
8,00
6,00
mm²
*
WT
TG
4,00
2,00
0,00
9-12Wo
>38Wo
Abbildung 4.1.1.3: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht
zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im Alter von 9 bis 12 Wochen
und älter als 38 Wochen
Es wird die diastolische Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei
Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter von
9 bis 12 Wochen und älter als 38 Wochen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 9-12Wo: 26 (WT) und 26 (TG), <38Wo: 15 (WT) und 21 (TG), Student’s
T-Test)
Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht
Abbildung 4.1.1.4: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten
Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Mäusen, die älter als 38 Wochen
sind
Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung
dargestellt
A)
Wildtyp
B)
Plakoglobin+/-Maus
83
4. Ergebnisse
In der Querachsenansicht war auch die rechtsventrikuläre Fläche in der Diastole bei
den transgenen Tieren (4,52 ± 0,29 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäuse) gegenüber
den Wildtypen (2,59 ± 0,22 mm², p<0,05) im höheren Alter vergrößert (s. Abb. 4.1.1.5
u. Abb. 4.1.1.6).
6,00
5,00
Rechtsventrikuläre Fläche in der
Querachsenansicht
*
mm²
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
WT
TG
Abbildung 4.1.1.5: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der Querachsenansicht
zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen älter als 38 Wochen
Es wird die diastolische Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei
Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken), die älter
als 38 Wochen sind, dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante
Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 15 (WT) und 21 (TG), Student’s T-Test)
Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht
Abbildung 4.1.1.6: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten
Ventrikels in der Querachsenansicht bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind
Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung
dargestellt
A)
Wildtyp
B)
Plakoglobin+/-Maus
84
4. Ergebnisse
Aufgrund der Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht (RVd sav) und
der Länge des rechten Ventrikels im Vierkammerblick (RVLAX) hat Dr. Frank
Wübbeling
von
der
Westfälischen
Wilhelms-Universität
Münster
aus
dem
Fachbereich Mathematik und Informatik eine auf der Integralberechnung beruhenden
Formel für das diastolische rechtsventrikuläre Volumen erstellt. Die Voraussetzung
für diese Formel ist die Annahme, dass die Form der rechten Ventrikel immer den
gleichen geometrischen Regeln folgt. Da dies in vivo aber nicht den natürlichen
Schwankungen entspricht, kann es sich bei der Formel nur um eine stark
vereinfachte Approximation handeln. Die geometrische Voraussetzung beinhaltet,
dass die Abmessung der Querschnittsfläche (RVd sav) immer an der Stelle des
größten Querschnitts genommen wird und dabei die Länge des rechten Ventrikels
(RVLAX) in einem 1/3:2/3 Verhältnis teilt. Weiter wird angenommen, dass die Höhe
des Querschnittes vom Apex zum Punkt der Querschnittsmessung im Verhältnis
x
zunimmt. Von der Basis bis zum Punkt der Querschnittsmessung soll die Höhe im
Verhältnis x zunehmen. Demzufolge ergibt sich folgende Berechnungsformel:
Diastolisches rechtsventrikuläres Volumen (nach Wübbeling) =
(
4 1
+ ) * RVdsav * RVLAX
15 6
Mit Hilfe dieser Formel konnte auch ein deutlich erhöhtes Rechtsherzvolumen bei
den über 38 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen gegenüber den Wildtypen
errechnet werden (12,79 ± 3,73 µl bei den transgenen Tieren und 4,98 ± 1,99 µl bei
den Wildtypen, p<0,05)(s. Abb. 4.1.1.7).
CLARK
et
al.
(2002)
haben
folgenden
Formel
zur
Errechnung
des
rechtsventrikulären Volumens bei Neugeborenen verwand:
Rechtsventrikuläres Volumen nach der ellipsoiden Annäherungsmethode =
8 * π * RVd Vierkammer 2
3 * RVLAX
Die Ergebnisse bei Verwendung dieser Formel in der altersabhängigen Studie waren
vergleichbar mit denen, die mit der Formel nach Wübbeling erstellt wurden.
85
4. Ergebnisse
Rechtsherzvolumen (µl)
Rechtsherzvolumen nach Wübbeling
14
12
*
WT
TG
10
8
6
4
2
0
9-12 Wo
13-26 Wo
>38 Wo
Abbildung 4.1.1.7: Vergleich des rechtsventrikulären Volumens nach Wübbeling zwischen
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im Alter von 9-12, 13-26 und über 38
Wochen
Es wird das diastolische Volumen des rechten Ventrikels aufgrund der erstellten
Integralen Berechnungsformel nach Wübbeling bei Plakoglobin+/-Mäusen
(schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter von 9-12, 13-26 und
über 38 Wochen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 9-12Wo: 23 (WT) und 24 (TG), 13-26Wo: 14 (WT) und 14 (TG),
<38Wo: 9 (WT) und 9 (TG), Student’s T-Test)
Weiter wurde bei der gleichzeitigen Ansicht der Trikuspidalklappe und des
rechtsventrikulären Ausflusstraktes eine signifikante Verbreiterung beider Parameter
bei den älteren Plakoglobin+/-Mäusen erfasst. So wurde bei den Wildtypen der
Durchmesser der Trikuspidalklappe mit 2,13 ± 0,08 mm und bei den transgenen
Tieren mit 2,45 ± 0,11 mm gemessen (p<0,05). Der rechtsventrikuläre Ausflusstrakt
bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidalklappe betrug bei den Wildtypen 1,08 ±
0,03 mm und bei den Plakoglobin+/-Mäusen 1,34 ± 0,04 mm (p<0,05)(s. Abb. 4.1.1.8
u. 4.1.1.9). Auch bei der basaleren Einstellung des Querschnittes zur Messung des
rechtsventrikulären Ausflusstraktes (RVOT4) wurde eine signifikante Verbreiterung
bei den transgenen Mäusen mit 1,26 ± 0,05 mm gegenüber den Wildtypen mit 1,11 ±
0,04 mm (p<0,05) festgestellt.
86
4. Ergebnisse
Trikuspidalklappe und rechtsventrikulärer
Ausflußtrakt
% vs WT
140
*
120
*
WT
TG
100
80
TV
Abbildung
RVOT1
4.1.1.8: Vergleich der Durchmesser der Trikuspidalklappe und des
rechtsventrikulären Ausflusstraktes zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und
Wildtypen, die älter als 38 Wochen sind
Es wird der Durchmesser der Trikuspidalklappe (TV) und der Durchmesser des
rechtsventrikulären Ausflusstraktes (RVOT1) bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer
Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter über 38 Wochen dargestellt.
Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen
Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 8 (WT) und 9 (TG), Student’s T-Test)
Trikuspidalklappe und rechtsventrikulärer Ausflusstrakt
Abbildung 4.1.1.9: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Durchmesser der
Trikuspidalklappe und des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei Mäusen,
die älter als 38 Wochen sind
Die präsystolisch gemessenen Durchmesser der Trikuspidalklappe (TV) und des
rechtsventrikulären Ausflusstraktes (RVOT1) sind mit einem weißen Strich
gekennzeichnet. Der Aortendurchmesser des Wildtypen beträgt 1,24 mm, der der
transgenen Maus 1,37 mm.
A)
Wildtyp
B)
Plakoglobin+/-Maus
87
4. Ergebnisse
4.1.2 Auswirkung von Ausdauertraining
Um die Bedeutung körperlichen Trainings für die Entwicklung der ARVC zu
verstehen, wurden Untersuchungen vor und nach Training durchgeführt. Das
mindestens achtwöchige Training startete mit einer 5-minütigen Schwimmphase im
durchschnittlichen Alter von 13 Wochen, und wurde regelmäßig im 5-Tage-Training2-Tage-Ruhe-Rhythmus auf 1,5 h Schwimmen erhöht. Sowohl vor als auch nach der
Trainingsphase wurden echokardiographische Untersuchungen durchgeführt. Am
Ende
der
Trainingsphase
wurden
bei
jedem
Tier
die
unterschiedlichen
Aktivitätsphasen am Ende einer Trainingseinheit über fünf Minuten ausgezählt.
Hierbei wurde zwischen Ruhe, Schwimmen und Laufen auf dem freischwimmenden
Rad unterschieden. Aufgrund dessen konnte jedem Tier eine Aktivitätszahl
zugewiesen werden. Diese setzt sich wie folgt zusammen:
•
für die Zeit der Ruhe gab es keine Aktivitätspunkte,
•
die Sekunden der Schwimmphase wurden als Aktivitätspunkte gezählt,
•
die Sekunden der Laufphase wurden mit 2 multipliziert, da das Rennen auf dem
Laufrad die intensivste Bewegungsform darstellt, und als Aktivitätspunkte gezählt
(s. Tab. 4.1.2).
Beispiel:
Tabelle 4.1.2: Beispiel zur Errechnung der Aktivitätszahl
Die Aktivitätszahl dieser Beispielmaus beträgt 303
Sekunden während einer 5minütigen Auszählphase
Aktivitätspunkte
Ruhe
87
0
Schwimmen
123
123
Laufen
90
180
Gesamt
300
303
88
4. Ergebnisse
Bei dem Vergleich der Aktivitätszahlen und der benötigten Fremdmotivation konnte
kein Unterschied zwischen den transgenen Mäusen und den Wildtypen festgestellt
werden. Weiter wurde die prozentuale Entwicklung der Größenverhältnisse
verschiedener Rechtsherzparameter vor und nach dem Training errechnet und mit
der Aktivität verglichen (s. Abb. 4.1.2.1 u. 4.1.2.2 u. 4.1.2.3 u. 4.1.2.4). Dabei konnte
bei den transgenen Tieren eine signifikante Korrelation zwischen einer hohen
Aktivität im Training und einer Rechtherzvergrößerung festgestellt werden. In der
Kontrollgruppe
ohne
Trainingseinfluss
konnte
kein
Unterschied
in
dem
entsprechendem Alter festgestellt werden (s. Tab. 4.1.1.3).
60
Veränderung der Länge des rechten
Ventrikels im Verhältnis zur Aktivität
RVLAX change (%)
50
40
r=0,859
p=0,000
30
20
10
0
0,00
-10
-20
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
Aktivität
Abbildung 4.1.2.1: Korrelation der Länge des rechten Ventrikels im Verhältnis zur errechneten
Aktivitätszahl
Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe
Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Verlängerung des rechten
Ventrikels vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der verschiedenen
transgenen Mäusen.
RVLAX change: Prozentuale Zunahme der Länge des rechten Ventrikels im
Vierkammerblick gemessen
Aktivität:
Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse
89
4. Ergebnisse
300
RVd Vierkam
change (%)
250
200
Veränderung der rechtsventrikulären
Fläche im Vierkammerblick im Verhältnis
zur Aktivität
r=0,728
p=0,003
150
100
50
0
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
Aktivität
Abbildung 4.1.2.2: Korrelation der rechtsventrikulären Fläche im Vierkammerblick im Verhältnis
zur errechneten Aktivitätszahl
Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe
Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Vergrößerung der
rechtsventrikulären Fläche vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der
verschiedenen transgenen Mäusen.
RVd Vierkam change:
Prozentuale Zunahme der rechtsventrikulären Fläche im
Vierkammerblick gemessen
Aktivität:
Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse
250
RVIT3 change
(%)
200
150
Veränderung der Breite des
rechtsventrikulären Einflußtraktes im
Verhältnis zur Aktivität
r=0,605
p=0,013
100
50
0
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
-50
-100
Aktivität
Abbildung 4.1.2.3: Korrelation des rechtsventrikulären Einflusstraktes im Verhältnis zur
errechneten Aktivitätszahl
Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe
Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Verbreiterung des
rechtsventrikulären Einflusstraktes vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der
verschiedenen transgenen Mäusen.
RVIT3 change:
Prozentuale Zunahme des rechtsventrikulären Einflusstraktes im
Vierkammerblick gemessen
Aktivität:
Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse
90
4. Ergebnisse
Veränderung der Fläche in der
Längsachsenansicht im Verhältnis zur
Aktivität
60
RV lav
change(%)
r=0,611
p=0,009
40
20
0
0,00
100,00
-20
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
Aktivität
Abbildung 4.1.2.4: Korrelation des rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht im
Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl
Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe
Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Zunahme des
rechtsventrikulären Fläche vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der
verschiedenen transgenen Mäusen.
RV lav change:
Prozentuale Zunahme des rechtsventrikulären Fläche in der
Längsachsenansicht gemessen
Aktivität:
Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse
Am Ende der Trainingsphase war bei der echokardiographischen Untersuchung der
rechte Ventrikel der Plakoglobin+/-Mäuse gegenüber dem der Wildtypen vergrößert.
Im Vierkammerblick unterschied sich bei allen Tieren die Fläche (RVd Vierkammer:
7,15 ± 0,58 mm² bei Wildtypen und 10,14 ± 1,07 mm² bei transgenen Tieren,
p<0,05)(s. Abb. 4.1.2.5). Eine Tendenz in der Größenzunahme zeigte sich in der
Länge (RVLAX: 5,35 ± 0,24 mm bei Wildtypen und 5,57 ± 0,19 mm bei transgenen
Tieren) und der Breite (RVSAX: 1,39 ± 0,09 mm bei Wildtypen und 1,81 ± 0,15 mm
bei transgenen Tieren) des rechten Ventrikels, als auch in der Breite des
rechtsventrikulären Einflusstraktes (RVIT3: 1,50 ± 0,10 mm bei Wildtypen und 1,75 ±
0,15 mm bei transgenen Tieren).
Betrachtet man gesondert die transgenen Tiere, die ein besonders hohes
selbstgewähltes Trainingspensum absolvierten (Aktivitätszahl >300) und vergleicht
dabei die Werte vor und nach dem Training, so sind alle im Vierkammerblick
gemessenen Parameter signifikant erhöht (RVd Vierkammer: 4,48 ± 0,33 mm² vor
und 10,00 ± 1,69 mm² nach dem Training, p<0,05; RVLAX: 4,09 ± 0,30 mm vor und
91
4. Ergebnisse
5,59 ± 0,36 nach dem Training, p<0,05; RVSAX: 0,93 ± 0,05 mm vor und 1,69 ± 0,32
mm nach dem Training, p<0,05; RVIT3: 1,07 ± 0,07 mm vor und 1,85 ± 0,25 mm
nach dem Training, p<0,05). Diese Vergrößerung der rechtsventrikulären Parameter
im Vierkammerblick entsteht somit nicht nur im höheren Alter der transgenen Tiere,
sondern diese Entwicklung kann auch durch Training akzeleriert werden.
12
Rechtsventrikuläre Fläche im
Vierkammerblick
Fläche (mm²)
10
*
WT
TG
8
6
4
2
0
vor Training
nach Training
Abbildung 4.1.2.5: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick zwischen
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training
Es wird die Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Plakoglobin+/Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) vor und nach Training
dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen
transgenen Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 16 (WT) und 19 (TG), Student’s T-Test)
Auch bei der rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht konnte eine
signifikante Vergrößerung bei den trainierten transgenen Tieren gegenüber den
trainierten Wildtypen festgestellt werden (5,80 ± 0,26 mm² bei den Wildtypen und
7,23 ± 0,62 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäusen, p<0,05)(s. Abb. 4.1.2.6 u. 4.1.2.7).
92
4. Ergebnisse
mm²
Rechtsventrikuläre Fläche in der
Längsachsenansicht
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
WT
TG
vor Training
nach Training
Abbildung 4.1.2.6: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht
zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training
Es wird die Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblicke bei Plakoglobin+/Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) vor und nach Training
dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen
transgenen Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 16 (WT) und 19 (TG), Student’s T-Test)
Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht
Abbildung
4.1.2.7:
Beispielhafte
echokardiographische Darstellung der Fläche
des
rechten
Ventrikels
in
der
Längsachsenansicht bei Mäusen vor und nach
Training
Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird
durch
die
weiße
Umrandung
dargestellt
A)
Plakoglobin+/-Maus vor Training
B)
Plakoglobin+/-Maus nach Training
C)
Wildtyp nach Training
93
4. Ergebnisse
Vergleicht man die Wildtypen mit den transgenen Tieren, die einen hohen
Trainingseinsatz zeigten (Aktivitätszahl >300), wurde eine deutliche Vergrößerung
der rechtsventrikulären Fläche in der parasternalen langen Achse (6,10 ± 0,28 mm²
bei den Wildtypen und 8,14 ± 0,67 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäusen, p<0,05), und
in der parasternalen kurzen Achse (2,73 ± 0,29 mm² bei den Wildtypen und 4,76 ±
0,60 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäusen, p<0,05) bei den transgenen Tieren sichtbar
(s. Abb. 4.1.2.8 u. 4.1.2.9).
RV Fläche nach intensivem Training
WT vs. TG
*
8
WT
4
TG
*
mm
2
6
2
0
RVd lav
RVd sav
Abbildung 4.1.2.8: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der Längs- und
Querachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training
Es wird die Fläche des rechten Ventrikels in der Längs- und Querachsenansicht (RVd lav
/ RVd sav) bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken)
nach intensivem Training (Aktivitätszahl >300) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede.
(MW±SE, n= 6 (WT) und 5 (TG), Student’s T-Test)
94
4. Ergebnisse
Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht
Abbildung
4.1.2.9:
Beispielhafte
echokardiographische Darstellung der Fläche
des
rechten
Ventrikels
in
der
Querachsenansicht
bei
Mäusen vor und nach Training
Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird
durch die weiße Umrandung dargestellt.
A)
Plakoglobin+/-Maus
vor
Training
B)
Plakoglobin+/-Maus
nach
Training
C)
Wildtyp nach Training
Weiter zeigte sich ein erhöhtes rechtsventrikuläres diastolisches Volumen (nach
Wübbeling) bei den trainierten Plakoglobin+/-Tieren (6,31 ± 1,03 µl) gegenüber den
Wildtypen (3,07 ± 0,51 µl, p<0,05) sowie ein vermindertes Schlagvolumen des linken
Ventrikels der trainierten Tiere in Ruhe (27,0 ± 2,4 µl bei den transgenen Tieren und
37,8 ± 4,0 µl bei den Wildtypen), als auch nach einer Isoprenalingabe (29,2 ± 2,1 µl
bei den transgenen Mäusen und 38,0 ± 3,0 µl bei den Wildtypen), wenn eine erhöhte
Aktivität (Aktivitätszahl >300) in beiden Gruppen zu sehen war (s. Abb. 4.1.2.10).
95
4. Ergebnisse
Schlagvolumen nach intensivem Training
WT vs. TG
50
40
*
*
WT
µl
30
TG
20
10
0
SV (Ruhe)
SV (+Iso)
Abbildung 4.1.2.10: Vergleich der Fläche des linksventrikulären Schlagvolumens zwischen
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training
Es wird das linksventrikuläre Schlagvolumen in Ruhe und nach Isoprenalingabe (SV
(Ruhe)/ SV (+Iso)) bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer
Balken) nach intensivem Training (Aktivitätszahl >300) dargestellt. Sternchen (*)
kennzeichnen signifikante Unterschiede.
(MW±SE, n= 6 (WT) und 5 (TG), Student’s T-Test)
Eine weitere Folge des Trainings zeigte sich bei allen trainierten Tieren unter
Isoprenalingabe in der M-Mode-Einstellung des linken Ventrikels. Hier fand sich ein
erhöhter systolischer innerer Diameter des LV bei transgenen Tieren (TG: 1,12 ±
0,06 mm; WT: 0,97 ± 0,03 mm, p<0,05) und eine nahezu signifikant verringerte FS
(TG: 58,87 ± 1,91 %; WT: 63,38 ± 1,11 %, p=0,051) gegenüber den Wildtypen. Das
endsystolische
Volumen
nach
Teichholz
war
dementsprechend
bei
den
Plakoglobin+/-Tieren gegenüber den Wildtypen deutlich erhöht (1,95 ± 0,18 bei
Wildtypen gegenüber 3,12 ± 0,42 bei transgenen Tieren, p<0,05). Aufgrund des
höheren endsystolischen Volumens war auch der Auswurf des linken Ventrikels,
gemessen als Ejektionsfraktion nach Teichholz geringer (92,43 ± 0,59 gegenüber
89,07 ± 1,23, p<0,05)(s. Abb. 4.1.2.11 u. 4.1.2.12).
96
4. Ergebnisse
M-Mode-Darstellung des linken Ventrikels nach Isoprenalingabe
Abbildung 4.1.2.11: Beispielhafte echokardiographische M-Mode-Darstellung des linken
Ventrikels nach Isoprenalingabe vor und nach Training
A)
B)
C)
D)
200
% vs WT
160
120
Wildtyp vor Training
Wildtyp nach Training
Plakoglobin+/-Maus vor Training
Plakoglobin+/-Maus nach Training
WT vs. TG nach Training MMode + ISO
*
WT
TG
*
*
80
40
0
FS (% )
LVEDs
ESV
EF nach
Teichholz
Abbildung 4.1.2.12: Vergleich der FS, des systolischen inneren LV-Diameters, des
endsystolischen Volumens und der Ejektionsfraktion nach Teichholz des linken
Ventrikels unter Isoprenalinwirkung nach Training
Es wird das das fractional shortening (FS), der systolische innere Diameter (LVEDs),
das endsystolische Volumen (ESV) und die Ejektionsfraktion nach Teichholz (EF nach
Teichholz) nach Isoprenalingabe bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarz) und Wildtypen
(weiß) nach Training dargestellt.
Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen
Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 16 (WT) und 19 (TG), Student’s T-Test)
97
4. Ergebnisse
Des
Weiteren
entwickelte
sich
durch
Trainingseinfluss
eine
verminderte
Kontraktionskraft des rechten Atriums nach Isoprenalingabe bei Plakoglobin+/Mäusen, darstellbar mit Hilfe des Trikuspidaldopplers. So konnten signifikante
Unterschiede in der maximalen Geschwindigkeit (76,3 ± 4,2 cm/s bei Wildtypen
gegenüber 60,4 ± 4,2 cm/s bei transgenen Tieren, p<0,05), des maximalen Druckes
(2,38 ± 0,26 mmHg bei Wildtypen gegenüber 1,51 ± 0,22 cm/s bei transgenen
Tieren, p<0,05) und des mittleren Druckes (1,27 ± 0,14 mmHg bei Wildtypen
gegenüber 0,81 ± 0,14 mmHg bei transgenen Tieren, p<0,05) im Trikuspidaldoppler
festgestellt werden (s. Abb 4.1.2.13 u. 4.1.2.14).
Trikuspidalfluß nach Isoprenalingabe trainierter Tiere
120
% vs WT
100
*
*
80
WT
TG
*
60
40
20
0
TV max (cm/s)
TV max PG (mmHg)
TV MPG (mmHg)
Abbildung 4.1.2.13: Vergleich der maximalen Geschwindigkeit, des maximalen Druckes und
des mittleren Druckes im Trikuspidaldoppler unter Isoprenalinwirkung
zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training
Es wird die maximale Geschwindigkeit (TV max), der maximale Druck (TV max
PG) und der mittlere Druck (TV MPG) im Trikuspidaldoppler nach Isoprenalingabe
bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) nach
Training dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen.
(MW±SE, n= 8 (WT) und 8 (TG), Student’s T-Test)
98
4. Ergebnisse
Trikuspidaldoppler nach Isoprenalingabe trainierter Tiere
Abbildung 4.1.2.14: Beispielhafte echokardiographische Trikuspidaldoppler-Darstellung nach
Isoprenalingabe vor und nach Training
A)
B)
C)
D)
Wildtyp vor Training
Wildtyp nach Training
Plakoglobin+/-Maus vor Training
Plakoglobin+/-Maus nach Training
99
4. Ergebnisse
Während der Trainingsphase wurde ein Tier besonders auffällig. Hierbei handelte es
sich um eine Plakoglobin+/-Maus, die bereits vor der Trainingseinheit einen deutlich
vergrößerten rechten Ventrikel zeigte, und innerhalb des Trainings auch den
Anstrengungen nicht mehr gewachsen war, so dass dieses Tier vorzeitig aus dem
Trainingsprogramm genommen wurde. Aber auch nach dem verkürzten 6-wöchigen
Training konnte eine zusätzliche Vergrößerung des rechten Ventrikels gezeigt
werden (s. Abb. 4.1.2.15 u. 4.1.2.16 u. 4.1.2.17).
Fallbeispiel einer besonders stark ausgeprägten rechtsventrikulären Dilatation
einer Plakoglobin+/-Maus:
Abbildung 4.1.2.15: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten
Ventrikels im Vierkammerblick bei Maus-Nr.320 und Wildtyp nach Training
Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung
dargestellt
A)
Wildtyp nach Training
B)
Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 nach Training
Abbildung 4.1.2.16: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten
Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Maus-Nr.320 und Wildtyp nach
Training
Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung
dargestellt
A)
Wildtyp nach Training
B)
Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 nach Training
100
4. Ergebnisse
Mit Hilfe eines Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographen konnten folgende Bilder
derselben Maus in der Medizinischen Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin des
Universitätsklinikum Münster unter der Leitung von Prof. Dr. Michael Schäfers von
MTA Christine Bätza erstellt werden:
Abbildung 4.1.2.17: PET Darstellung der Herzen von Maus-Nr.320 und eines Wildtyps vor und
nach Training
A)
B)
C)
D)
Wildtyp vor Training
Wildtyp nach Training
Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 vor Training
Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 nach Training
101
4. Ergebnisse
4.2 Elektrokardiogramm
4.2.1 Oberflächenelektrokardiogramm
Zur Erstellung der Oberflächen-EKG wurden Plakoglobin+/-Mäuse und Wildtypen in
unterschiedlichen
Altersgruppen untersucht. Es wurden
dabei
verschiedene
Injektionsnarkotika (Diazepam, Ketamin/Xylazin und Urethan) als auch ein
Inhalationsnarkotikum (Isofluran) verwendet (s. Tab. 3.8). Es wurden dabei
unabhängig von den verschiedenen Narkotika keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Plakoglobin+/-Tieren und den Wildtypen festgestellt. Einzelne
Untersuchungsergebnisse
sind
in
der
folgenden
Tabelle
zusammenfassend
dargestellt.
Tabelle 4.2.1: Oberflächen-EKG-Ergebnisse ausgewählter Parameter von 9 bis 15 Wochen und
über 38 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen unter Diazepamsedation
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. (n= 9-15 Wo: 11 (WT) und 12 (TG), >38
Wo: 13 (WT) und 16 (TG))
RR-Intervall (ms)
PQ-Intervall (ms)
QRS-Intervall (ms)
QT-Intervall (ms)
9-15 Wochen
WT
TG
134 ± 6
129 ± 4
36 ± 0,5
35 ± 0,6
17 ± 0,4
18 ± 1,0
99 ± 6
94 ± 6
102
>38 Wochen
WT
TG
117 ± 33
135 ± 34
37 ± 10
33 ± 8
14 ± 3,9
14 ± 3,6
57 ± 16
65 ± 16
4. Ergebnisse
Bei den trainierten Plakoglobin+/-Mäusen zeigte sich eine vermehrte, wenn auch
nicht signifikante Anzahl der R´-Zacken in der 2. Brustwandableitung (V2) (bei den
Wildtypen 1,86 ± 0,14 R´-Zacken gegenüber 2,42 ± 0,27 bei den transgenen Tieren,
s. Abb. 4.2.1). Diese Entwicklung zeigte sich bei keiner anderen Versuchsgruppe,
weder bei jungen noch bei älteren Tieren.
Abbildung 4.2.1: Vergleich der ersten beiden Brustwandableitungen (V1, V2) bei Plakoglobin+/Mäusen und Wildtypen vor und nach Training (repräsentative EKGs)
Die unterschiedliche Anzahl der R´Zacken ist mit den Pfeilen angedeutet.
A)
B)
C)
D)
Wildtyp vor Training
Wildtyp nach Training
Plakoglobin+/-Maus vor Training
Plakoglobin+/-Maus nach Training
103
4. Ergebnisse
4.2.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm
Bei den telemetrierten Mäusen herrschte sowohl unter Ruhe, bei Belastung als auch
eine Stunde nach Belastung bei beiden Genotypen vorwiegend ein Sinusrhythmus.
Allerdings traten eine Stunde nach Belastung vor allem bei transgenen Tieren eine
oder mehrere ventrikuläre Extrasystolen auf. Dieses Ergebnis war unabhängig von
der Züchtung (sowohl bei 129/SV als auch C57Bl/6) und wurde vorwiegend bei den
männlichen Tieren beobachtet (s. Abb. 4.2.2.1, 4.2.2.2 und 4.2.2.3).
VES nach Airjet-Belastung
keine VES
VES
Anzahl der Tiere mit VES
18
16
*
14
12
10
8
6
4
2
0
WT
TG
Abbildung 4.2.2.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen
und Plakoglobin+/-Mäusen nach einer Airjet-Belastung
Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären
Extrasystolen (VES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer
Balken) Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) eine Stunde nach AirjetBelastung dargestellt. Sternchen(*) kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber
den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test)
104
4. Ergebnisse
Anzahl der Tiere mit VES
VES nach Airjet-Belastung
12
10
*
keine VES
VES
8
*
*
6
4
2
0
WT
TG
129SV
WT
TG
C57Bl/6
WT
TG
männl
Abbildung 4.2.2.2: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen
und Plakoglobin+/-Mäusen bei den verschiedenen Züchtungen und bei männlichen
Tieren nach einer Airjet-Belastung
Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären
Extrasystolen (VES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer
Balken) bei Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) in den verschiedenen
Züchtungen (129/SV und C57Bl/6) und bei den männlichen Tieren eine Stunde nach einer
Airjet-Belastung dargestellt. Sternchen(*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test)
Abbildung 4.2.2.3: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus nach einer
Airjet-Belastung
Die Abbildung zeigt ein typisches EKG einer männlichen Plakoglobin+/-Maus (C57Bl/6)
mit einem regelmäßigem Sinusrhythmus, der von einer ventrikulären Extrasystole (*)
unterbrochen wird, 11 Minuten nach einer Airjet-Belastung.
105
4. Ergebnisse
Zusätzlich konnte bei den C57Bl/6 Tieren ein signifikanter Unterschied im
Vorkommen von ventrikulären Extrasystolen bei einer Airjet-Belastung zwischen
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen gezeigt werden (s. Abb. 4.2.2.4 und 4.2.2.5).
Anzahl der Tiere mit VES
VES unter Airjet-Belastung
9
keine VES
VES
8
7
*
6
5
4
3
2
1
0
WT
TG
Abbildung 4.2.2.4: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen
und Plakoglobin+/-Mäusen bei der C57Bl/6-Züchtung während einer AirjetBelastung
Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären
Extrasystolen (VES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer
Balken) bei Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) bei der C57Bl/6-Züchtung
während einer Airjet-Belastung dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante
Unterschiede gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test)
Abbildung 4.2.2.5: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus während
einer Airjet-Belastung
Die Abbildung zeigt ein typisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus (C57Bl/6) mit einem
regelmäßigem Sinusrhythmus, der von einer ventrikulären Extrasystole (*) unterbrochen
wird, während einer Airjet-Belastung.
106
4. Ergebnisse
Bei den männlichen Tieren fiel ein vermehrtes Vorkommen von atrialen Extrasystolen
unter Ruhe auf (s. Abb. 4.2.2.6 und 4.2.2.7).
Anzahl der Tiere mit ES (n)
12
ES bei Ruhe
10
keine ES
*
ES
8
6
4
2
0
WT
TG
Abbildung 4.2.2.6: Vergleich der spontanen atrialen Extrasystolen zwischen Wildtypen und
Plakoglobin+/-Mäusen bei den männlichen Tieren bei normaler Aktivität (Ruhe)
Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen atrialen
Extrasystolen (ES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer
Balken) bei Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) bei den männlichen Tieren
bei normaler Aktivität (Ruhe) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante
Unterschiede gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test)
Abbildung 4.2.2.7: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus bei normaler
Aktivität (Ruhe)
Die Abbildung zeigt ein typisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus (129/SV) mit einem
regelmäßigem Sinusrhythmus, der von einer atrialen Extrasystole (*) unterbrochen wird.
107
4. Ergebnisse
Es traten vereinzelt auch AV-Blöcke, tachykarde und bradykarde Phasen bei beiden
Genotypen besonders in der ersten Stunde nach einer Belastung auf.
Unterschiede in der Herzfrequenz zeigten sich in den verschiedenen Altersgruppen
jedoch nicht. Bei den trainierten Plakoglobin+/-Mäusen entwickelte sich jedoch eine
erhöhte minimale Herzfrequenz (285 ± 4 für Wildtypen, 393 ± 16 Schläge pro Minute
für Plakoglobin+/-Mäuse, p<0,05) bei normaler Aktivität (Ruhe). Die maximal
erreichte Herzfrequenz (für Wildtypen 847 ± 30, für transgene Tiere 840 ± 31
Schläge pro Minute) und der Mittelwert (492 ± 7, 534 ± 13 Schläge pro Minute)
unterschieden
sich
nicht
(s.
Abb.
4.2.2.8).
Ansonsten
konnte
keine
Herzfrequenzvariabilität zwischen den Genotypen, weder bei Belastung, noch eine
Stunde nach Belastung, in der Trainingsgruppe ermittelt werden. In der
altersabhängigen Untersuchungsstudie zeigten sich ebenso keine Unterschiede in
Herzfrequenz (Schläge/min)
der Herzfrequenz.
900
800
700
600
500
400
Normale Aktivität nach Training
WT
TG
*
300
200
100
0
Minimum
Mittelwert
Maximum
Abbildung 4.2.2.8: Herzfrequenzvergleich zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen bei
normaler Aktivität (Ruhe) nach Training
Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für trainierte
Plakoglobin+/-Mäuse (schwarze Balken) und trainierte Wildtypen (weiße Balken) während
normaler Aktivität (Ruhe) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante
Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Signifikant unterschiedlich ist
die minimale Herzfrequenz.
(MW±SE, n= 6 (WT) und 6 (TG), Student’s T-Test)
108
4. Ergebnisse
4.3 Implantation von sympathomimetisch-wirksamen Pumpen
In der ersten Versuchsgruppe wurden osmotische Pumpen implantiert, die 3 mg/kg/d
Isoprenalin über einen Zeitraum von sieben Tagen freisetzten. In dieser Gruppe
konnte weder vorher, noch nach der 7-tägigen Belastung ein Unterschied mit Hilfe
der Echokardiographie und des Oberflächenelektrokardiogramms zwischen den
Genotypen festgestellt werden.
Bei der Darstellung mit Hilfe des telemetrischen
Elektrokardiogramms konnte bei einer Plakoglobin+/-Maus in den ersten 45 Minuten
nach Implantation und einen Tag später jeweils eine ventrikuläre Tachykardie gezeigt
werden (s. Abb. 4.3.1).
Abbildung 4.3.1: Ventrikuläre Tachykardie bei einer Plakoglobin+/-Maus einen Tag nach
Implantation einer osmotischen Pumpe, die 3mg/kg/d Isoprenalin freisetzt
Bei einem Wildtyp trat ebenso eine ventrikuläre Tachykardie ca. 50 Minuten nach
Implantation auf.
Das EKG-Bild einer anderen Plakoglobin+/-Maus veränderte sich drei Stunden nach
Implantation deutlich. Das QT-Intervall war verlägert, die T-Welle war invertiert und
die P-Welle nicht mehr identifizierbar (s. Abb. 4.3.2). Diese Veränderung zeigte sich
bei den späteren Aufzeichnungen nicht mehr.
109
4. Ergebnisse
Abbildung 4.3.2: QRS-Morphologie nach Implantation einer Isoprenalin-freisetzenden Pumpe
bei einer Plakoglobin+/-Maus
A
B
1,5h nach Implantation sind die P-Wellen noch deutlich sichtbar
3h nach Implantation ist das QT-Intervall verlängert und die T-Welle invertiert
Ventrikuläre und atriale Extrasystolen, AV-Blöcke, tachykarde und bradykarde
Phasen wurden bei beiden Genotypen registriert.
110
4. Ergebnisse
In der zweiten Versuchgruppe wurde die Dosis des Isoprenalins auf 30 mg/kg/d
erhöht und zusätzlich Phenylephrin in der gleichen Dosierung beigefügt. Alle Tiere
der Versuchgruppe starben innerhalb der ersten 16 Stunden nach Implantation,
jedoch verstarben die transgenen Tiere (ca. 7 ½ h und 10 h nach Implantation)
deutlich vor den Wildtypen (ca. 11 ¾ h und 16 h nach Implantation). Bei einer
transgenen Maus führte die Implantation nach zehn Stunden zu einer Ruptur des
linken Ventrikels (s. Abb. 4.3.3).
Abbildung 4.3.3: Rupturierter linker Ventrikel nach Implantation einer osmotisch wirksamen
Isoprenalin-Phenylephrin-Pumpe bei einer transgenen Maus
111
4. Ergebnisse
4.4 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen
Bei den von Daniela Volkery und Nina Kreienkamp durchgeführten Untersuchungen
am isolierten Herzen mit Hilfe einer Langendorff-Apparatur ergaben sich keine
Unterschiede in der Aktionspotentialsdauer zwischen den Genotypen. Jedoch
zeigten sich vermehrt spontane Arrhythmien bei den über 42 Wochen alten
Plakoglobin+/-Mäusen und bei den trainierten transgenen Tieren gegenüber den
Wildtypen (s. Abb. 4.4.1 u. 4.4.2).
Spontane Ventrikuläre Tachykardien
Anzahl der Herzen mit VT
18
16
14
keine VT
VT
*
*
12
10
8
6
4
2
0
WT (trainiert + alt)
Plako +/- trainiert
Plako +/- alt
Abbildung 4.4.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Tachykardien zwischen Wildtypen,
trainierten und über 42 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen
Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären
Tachykardien (VT, schwarzer Balken) gegenüber Herzen ohne Arrhythmien (weißer
Balken) in folgenden verschiedenen Versuchsgruppen dargestellt: Trainierte und über 42
Wochen alte Wildtypen (WT (trainiert + alt)), trainierte Plakoglobin+/-Mäuse (Plako +/trainiert) und über 42 Wochen alte Plakoglobin+/-Mäusen (Plako +/- alt).
Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber den Wildtypen.
(Fisher´s exact Test und Chi square Test)
112
4. Ergebnisse
Bei den trainierten Wildtypen zeigten zwei von neun Tieren spontane Arrhythmien,
dem gegenüber standen sieben von 13 trainierte Plakoglobin+/-Mäuse mit einer
ventrikulären Tachykardie. Bei den älteren Tieren erhöhte sich der Anteil der Tiere,
die Arrhythmien zeigten, auf acht von 13 bei den transgenen Tieren, gegenüber eins
von sieben bei den Wildtypen.
Abbildung 4.4.2: Spontane ventrikuläre Tachykardie im monophasischen Aktionspotential und
im Elektrokardiogramm eines Plakoglobin+/-Herzens in der Langendorff-Apparatur
MAP: monophasisches Aktionspotential, EKG: Elektrokardiogramm
In den Plakoglobin+/-Herzen hatten die Arrhythmien ihren Ursprung in der
rechtsventrikulären freien Wand (n=6 Herzen) oder im Septum (n=11 Herzen), nicht
jedoch in der linksventrikulären Wand. Demgegenüber entsprangen die spontanen
Arrhythmien der Wildtypen mit gleichen Anteilen aus den drei verschiedenen
Aufzeichnungslokalisationen (s. Abb. 4.4.3).
113
4. Ergebnisse
Anzahl der Herzen (n)
12
Ursprung der spontanen
Arrhythmien
10
8
6
WT
TG
4
2
0
LV
Septum
RV
Abbildung 4.4.3: Vergleich der Ursprungslokalisationen der spontanen Arrhythmien zwischen
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen
Es wird die Verteilung der verschiedenen Ursprungsorte (LV, Septum und RV) der
spontanen Arrhythmien im Vergleich zwischen den Plakoglobin+/-Mäusen (schwarze
Balken) und den Wildtypen (weiße Balken) dargestellt.
LV: Linksventrikuläre freie Wand, RV: Rechtsventrikuläre freie Wand
Die rechtsventrikulären Überleitungszeiten waren in den älteren Plakoglobin+/Herzen während des endokardialen Pacings verlängert (Wildtypen: 3,11 ± 0,33 ms,
Plakoglobin+/-Mäuse: 5,27 ± 0,8 ms; p<0,05), während die linksventrikulären Zeiten
keinen Unterschied aufwiesen. Eine ähnliche Zunahme der rechtsventrikulären, nicht
aber der linksventrikulären Überleitungszeiten, zeigte sich bei den trainierten
Plakoglobin+/-Herzen (Wildtypen: 3,21 ± 0,32 ms, Plakoglobin+/-Mäuse: 5,0 ± 0,61
ms; p<0,05) (s. Abb. 4.4.4).
114
4. Ergebnisse
Rechtsventrikuläre Überleitungszeiten
rechtsventrikuläre
Überleitungszeit (ms)
7
6
WT
5
TG
*
*
4
3
2
1
0
jung
trainiert
alt
Abbildung 4.4.4: Vergleich der rechtsventrikulären Überleitungszeiten zwischen Plakoglobin+/Mäusen und Wildtypen
Es sind die rechtsventrikulären Überleitungszeiten beim endokardialen Pacing in den
verschiedenen Versuchgruppen (jung, trainiert und alt) der Plakoglobin+/-Herzen
(schwarze Balken) und der Wildtypherzen (weiße Balken) dargestellt.
(MW±SE, n= jung: 14 (WT) und 9 (TG), trainiert: 14 (WT) und 15 (TG), alt: 7 (WT) und 10
(TG), Student’s T-Test)
Die pathologische Ausprägung dieses Erkrankungsbildes zeigt sich somit vor allem
im Alter, und kann durch Training akzeleriert werden. Diese Ergebnisse decken sich
mit denen der Echokardiographie.
115
4. Ergebnisse
4.5 Histologische Untersuchung
Die Durchmesser der Kardiomyozyten wiesen keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Herzen der Wildtypen und der Plakoglobin+/-Mäuse (untrainiert/ jung,
untrainiert/ alt und trainert/ jung) auf (s. Tab. 4.5). Ebenso zeigte sich kein
vermehrtes Vorkommen von fibrös-fettigem Ersatzgewebes im rechtsventrikulären
Myokard der Plakoglobin+/-Herzen im Vergleich zu den Wildtypen.
Tabelle 4.5: Durchmesser der Kardiomyozyten in den Herzen von Plakoglobin+/-Tieren und
Wildtypen
Die Kardiomyozytengröße unterschied sich nicht bei den verschiedenen Genotypen. Weder Alter noch
Trainingszustand wirkten sich in einem Größenunterschied aus.
Wildtypen
Plakoglobin +/-
Rechter
Ventrikel
Linker
Ventrikel
Rechter
Ventrikel
Linker
Ventrikel
Untrainiert, 16-32 Wochen (µm)
11,3 ± 0,7
14,4 ± 1,2
10,4 ± 1,1
14,1 ± 1,5
Untrainert, >42 Wochen (µm)
10,6 ± 0,7
15,1 ± 1,2
10,7 ± 0,5
13,2 ± 0,9
Trainiert, 32 Wochen (µm)
10,6 ± 1,0
14,6 ± 0,9
11,7 ± 2,5
14,2 ± 1,0
116
5. Diskussion
5. Diskussion
5.1 Methodik
Durch die Untersuchung heterozygot Plakoglobin-defizienter Mäuse konnte hier
erstmals die funktionelle Bedeutung von Plakoglobin für die Entstehung einer ARVC
gezeigt werden. Die elektrophysiologischen und funktionellen In-vivo-Auswirkungen
der heterozygoten Plakoglobin-Defizienz wurden in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe
von
elektro-
und
echokardiographischen
Untersuchungen
in
vivo
näher
charakterisiert.
5.1.1 Mausmodell
Aufgrund der strukturellen und elektrophysiologischen Unterschiede zwischen Maus
und Mensch sollten Ergebnisse, die mit einem Mausmodell erarbeitet wurden, mit
Vorsicht interpretiert werden (LONDON 2001, LONDON et al. 2003). Trotzdem
ermöglichen sie ein erweitertes Veständnis von verschiedenen Erkrankungen
(LONDON 2004) und können als Grundlage genutzt werden, um neue Hypothesen
für humane Erkrankungen zu erarbeiten (GERULL et al. 2004). Ebenso werden
entdeckte Genmutationen bei vorliegenden Erkrankungen genutzt, um Mausmodelle
zu entwickeln, die die Entdeckungen stützen und/oder erweitern (GERULL et al.
2004). Allerdings handelt es sich bei den Mausmodellen häufig nur um eine
bestimmte
Genmutation,
wohingegen
ein
Erkrankungsbild
durchaus
von
verschiedenen Mutationslokalisationen ausgelöst werden kann (GERULL et al.
2004). Zudem kann es bei einer Mutation vorkommen, dass die Penetranz des
Erkankungsbildes unterschiedlich ist (GERULL et al. 2004). Selbst bei einer gleichen
Mutationslokalisation
kann
eine
unterschiedliche
phänotypische
Ausprägung
zwischen Individuen vorliegen (SYRRIS et al. 2006). So liegt auch eine
unterschiedlich starke Ausprägung des Phänotyps zwischen der Naxos disease
gegenüber der Mutation in diesem Mausmodell vor, auch wenn in beiden Fällen eine
Veränderung im Plakoglobingen präsent ist (siehe auch S.17). Ebenso sind einige
117
5. Diskussion
Symptome in der Naxos disease vorhanden, welche in diesem Mausmodell nicht
dokumentiert werden konnten (Hyperkeratose, wolliges Haar und fibrös-fettiges
Ersatzgewebe im Herzen). In dem kardiokutanen Syndrom bei Poll Hereford Rindern
ist neben dem sehr ähnlichen Symptombild zur Naxos disease allerdings auch keine
fettige Infiltration nachweisbar, so dass ein Artenunterschied immer berücksichtigt
werden muss. Weitere Einschränkungen konnten im Vergleich von polymorphen
ventrikulären Tachyarrhythmien entdeckt werden. So konnte JERON et al. (2000)
diese Form der Arrhythmien nicht in Kontrollmäusen erzeugen. Diese Arrhythmieform
kommt sehr wohl aber in gesunden Menschenherzen bei einem maximalen
Stimulationsprotokoll vor, welches Isoprenalin enthält (JERON et al. 2000). Trotzdem
werden transgene Mausmodelle häufig genutzt, um zum Beispiel kardiale
Arrhythmien zu erforschen, da eine einfache Manipulierbarkeit des Mausgenoms
möglich ist (LONDON 2001). So bleibt das transgene Mausmodell trotz der
genannten Einschränkungen ein hervorragendes Instrument zur Erforschung von
grundlegenden Mechanismen, denen auch das Herz anderer Arten unterliegt
(LONDON 2001).
In anderen Mausmodellen, die zur Erforschung der ARVC genutzt wurden (mit
Veränderungen im Plakoglobin-, Plakophilin-2-, Desmoplakin- und Desmoglein2Gen), wurden vor allem die pathologischen Veränderungen in der Embryologie
homozygoter Mäuse untersucht (RUIZ et al. 1996, GROSSMANN et al. 2004,
GALLICANO et al. 1998, ESHKIND et al. 2002). ARVC-Veränderungen im Alter oder
aufgrund einer sympathischen Stimulation (Training, Isoprenalin-Injektion) wurden an
einem Mausmodell meines Wissen noch nicht erforscht.
5.1.2 Echokardiographie
Die transthorakale Echokardiographie ist eine nichtinvasive Untersuchungsmethode,
die eine morphologische als auch funktionelle Charakterisierung des kardialen
Phänotyps von Mäusen ermöglicht (TANAKA et al. 1996). Linksventrikuläre
Parameter wurden bei der transthorakalen Echokardiographie bereits ausgiebig
beschrieben. So konnte man zuverlässig Veränderungen im linken Ventrikel, vor
118
5. Diskussion
allem Kammergröße, Wanddicken, Masse und Funktion in vivo feststellen. Die
Masse des Ventrikels kann dabei nach einer Formel berechnet werden (MANNING et
al. 1994; GARDIN et al. 1995). Es können Motion (M)-Modes von der parasternalen
kurzen
und
langen
Achse
angefertigt
werden,
um
die
Wanddicken
und
Ventrikeldurchmesser zu bestimmen. Mit einem nach apikal angenähertem Winkel
von der parasternalen Längsachse ausgehend, kann im gepulsten Doppler das
Maximum des Aortenflusses und des Mitralflusses bestimmt werden (TANAKA et al.
1996; STYPMANN et al. 2002). Die echokardiographische Vermessung des rechten
Ventrikels wurde bei Mäusen bisher nur transösophageal durchgeführt (SCHERRERCROSBIE et al. 1998). Die transthorakale Echokardiographie zur Vermessung des
rechten Ventrikels ist aber beim adulten und neugeborenen Menschen bereits
beschrieben (FOALE et al. 1986; CLARK et al. 2002). Beim Menschen werden
sieben Einstellungen (nach FOALE et al. 1986) in der 2D-Echokardiographie zur
Untersuchung der ARVC-Patienten durchgeführt. In dieser Arbeit wurden die
Einstellungen geringfügig modifiziert und auf sechs Schnitte beschränkt, um den
Besonderheiten des kleinen Mäuseherzens gerecht zu werden, da einige Ansichten
nicht mit einer genügenden Reproduzierbarkeit darstellbar waren. So wurden z.B.
der subcostale Vierkammerblick sowie die rechtsventrikuläre Ausflusstraktansicht,
die bereits beim adulten Menschen nur in einem geringen Maße reproduzierbar
waren (FOALE et al. 1986), in dieser Studie nicht verwendet. Es wurden vor allem
Messwerte genutzt, die auch beim Menschen eine geringe Variabilität der
Messungen bei einem Untersucher ergaben (FOALE et al. 1986). Zusätzlich wurden
rechtsventrikuläre
verschiedenen
Flächen
Ansichten
in
drei
sind
Standardschnitten
nötig
zur
zuverlässigen
vermessen.
Feststellung
Diese
von
Kammergröße (Länge und Breite) sowie der Breite des Einfluss- und Ausflusstraktes,
sowohl beim Menschen als auch bei der Maus. In dieser Arbeit wurden die
Kammergrößen beider Ventrikel in der Diastole und die Breite der links- und
rechtsventrikulären
Ausflusstrakte
sowie
der
linke
Vorhof
und
der
Aortendurchmesser präsystolisch bei der jeweils größten Ausdehnung vermessen.
Es wurden nur Darstellungen in die Auswertung einbezogen, in denen die zu
messenden Strukturen deutlich erkennbar waren.
119
5. Diskussion
Im modifizierten apikalen Vierkammerblick wurde der Dopplerstrahl durch die
Trikuspidalklappe gelegt. Eine gepulste Dopplermessung des Trikuspidalflusses
wurde bereits bei neugeborenen bis juvenilen Mäusen in der Literatur beschrieben
(ZHOU et al. 2003).
Für die echokardiographischen Studien in der vorliegenden Arbeit wurde für die
Sedierung der meisten Mäuse Diazepam, in einigen Fällen aber auch eine
Inhalationsnarkose mit Isofluran, verwendet. Neben dem vergleichsweise geringen
Einfluss auf die Herztätigkeit sind auch die Ergebnisse bei einer Isoflurannarkose im
Gegensatz zur Injektionsanästhesie besser reproduzierbar. Die Isoflurannarkose ist
somit auch Mittel der Wahl für die echokardiographische Untersuchung der Maus im
Vergleich mit einem Ketamin/Xylazin-Gemisch, einem Ketamin/Midazolam-Gemisch,
einer Halothannarkose und Tribromoethanol (CHAVES et al. 2001; ROTH et al.
2002). Der inotrope Effekt von Diazepam in vitro wurde unterschiedlich diskutiert.
NONAKA et al. (1997) beschrieb einen negativ inotropen Effekt, indem Diazepam die
Herzfrequenz und den Ca2+-Transienten (dynamischer intrazellulärer KalziumGehalt) herabsetzt. Demgegenüber entdeckte GIJON et al. (1988) einen positiv
inotropen Effekt von Diazepam und einen erhöhten Kalziumeinstrom, sowie einen
verringerten Natriumeinstrom bei auriculären Herzmuskelzellen. Bei unseren
Untersuchungen zeigte sich die durchschnittliche Herzfrequenz bei einer Sedierung
mit Diazepam (463 ± 15), gegenüber der Herzfrequenz bei einer Isoflurannarkose mit
438 ± 45 Schlägen/min (JANSSEN et al. 2004) oder der stressbedingten erhöhten
Herzfrequenz bei einer echokardiographischen Untersuchung ohne eine vorherige
Sedation (712 ± 6) am nächsten der Herzfrequenz von sich frei bewegenden Mäusen
ohne Narkose (504 ± 15). Daher wurde in dieser Arbeit unter Abwägung der Vor- und
Nachteile hauptsächlich eine Diazepamsedation für die echokardiographische
Untersuchung verwendet.
5.1.3 EKG-Aufzeichnung
Für die elektrokardiographischen Untersuchungen wurde ein 12-Kanal-OberflächenEKG von sedierten sowie EKGs mit einer Ableitung von sich frei bewegenden
Mäusen erstellt. Vor- und Nachteile dieser Methode werden im Folgenden
120
5. Diskussion
beschrieben. Die Durchführung des Oberflächen-EKGs ist nicht invasiv und aufgrund
der sedierungsbedingten reduzierten Muskelaktivität nahezu artefaktfrei. Sie ist durch
die sechs Extremitäten-Ableitungen und die sechs Brustwand-Ableitungen gut
charakterisiert. Der Einsatz von verschiedenen Anästhetika beeinflusst die normale
Herzaktivität. Die Wahl des Anästhetikums an sich kann schon Einfluss auf die zu
gewinnenden Ergebnisse nehmen (CHAVES et al. 2003). Daher wurden in dieser
Arbeit verschiedene Anästhetika verwendet: Diazepam, Ketamin/Xylazin, Urethan
und Isofluran (Injektions- und Inhalationsanästhetika).
Eine Sedierung mit Diazepam führt nicht zu einer tiefen Anästhesie und ist somit
näher an der normalen Herzaktivität. Demgegenüber wirkt eine Anästhesie mit der
Kombination von Ketamin und Xylazin kardiodepressiv, und die Herzfrequenz sinkt
deutlich (ROTH et al. 2002). Deutlich höhere Herzfrequenzen und eine sehr tiefe
Narkose, aus der die Tiere nur schlecht wieder erwachen, verursacht Urethan. Somit
wurde
dieses
Injektionsanästhetikums
nur
für
Terminalversuche
verwendet.
Nachdem das EKG geschrieben wurde, wurde das Herz für weitere Versuche
entnommen.
Der Einfluss von Anästhetika wird beim telemetrischen EKG ausgeschaltet. Hierbei
werden physiologische EKGs von sich frei bewegenden Tieren aufgezeichnet
(KRAMER et al. 1993). Analog zum Belastungs-EKG beim Menschen, kann die
EKG-Aktivität in Ruhe und unter Belastung bei der Anwendung von definierten
physiologischen
Belastungsprotokollen
aufgezeichnet
werden.
Aufgrund
der
invasiven Prozedur bei der Implantation des Transmitters verlieren die Mäuse nach
der Operation zunächst an Gewicht und brauchen einige Tage, um sich vollständig
zu erholen. Des Weiteren können auch Druck-/Volumenveränderungen im Brustkorb
durch das Transmittervolumen entstehen und dadurch die Herztätigkeit beeinflussen.
Die Methode ist jedoch für experimentelle Untersuchungen an Mäusen etabliert und
validiert (KRAMER et al. 2003). Zur Nutzung der verschiedenen Vorteile und zur
gegenseitigen Kontrolle der Oberflächen- und telemetrischen EKGs wurden beide
Methoden kombiniert.
121
5. Diskussion
5.1.4 Gabe von Sympathomimetika
Isoprenalin wirkt als β-Sympathomimetikum sowohl positiv chronotrop als auch
positiv inotrop (OUEDRAOGO et al. 1997). Es koppelt an den adrenergen Rezeptor,
so dass die stimulierende Untereinheit eines Gs-Proteins die Adenylatcyclaseaktivität
erhöht. Dadurch erhöht Isoprenalin die cAMP-Konzentration und aktiviert darüber die
Proteinkinase A, die dann Zielproteine (bspw. Ca2+-Kanäle) phosphoryliert. Diese
Reaktionskette erhöht die intrazelluläre Kalziumkonzentration. Dieser Effekt wurde
durch eine Isoprenalingabe während der echokardiographischen Untersuchung,
sowie bei sich frei bewegenden Tieren, bei denen mit Hilfe der Telemetrie
kontinuierlich ein EKG aufgezeichnet werden konnte, über eine osmotische Pumpe
nachgeahmt. Körperliches Training, wie das angewandte Ausdauerschwimmtraining,
bewirkt eine physiologische Sympathikusstimulierung.
WICHTER et al. (2000) zeigten, dass bei Patienten mit ARVC die β-adrenerge
Rezeptorendichte reduziert war. Dies ließe auf einen Zusammenhang von
Ausdauertraining,
verringerter
β-Rezeptorendichte
(aufgrund
eines
trainingsbedingten zeitweise erhöhten Sympathikotonus) und einer verringerten
Ansprechbarkeit auf Isoprenalin (im Bezug auf die Kontraktionskraft) schließen bzw.
eine entstehende autonome Dysbalance nach β1-Stimulation erklären.
In einer zweiten Versuchsgruppe wurde Phenylephrin in einem 1:1 Verhältnis mit
Isoprenalin gemischt und über eine osmotische Pumpe bei Mäusen in der Telemetrie
freigesetzt. Phenylephrin zählt zu den α1-Sympathomimetika und bewirkt an der
Gefäßmuskulatur eine Kontraktion. Hier aktiviert es rezeptorvermittelt ein Gq-Protein
und reguliert darüber die Phospholipase C, die ein Substrat aus der Plasmamembran
hydrolytisch in IP3 (Inositoltrisphosphat) und DAG (Diacylglycerol) spaltet. IP3 erhöht
die zelluläre Kalziumkonzentration, indem es über einen Rezeptor die verstärkte
Öffnung von Kalziumkanälen des sarkoplasmatischen Retikulums bewirkt. Vier
Kalzium-Ionen binden an vier Stellen an Calmodulin und formen so einen KalziumCalmodulin-Komplex, der wiederum an eine inaktiven Myosinkinase (light chain)
andockt. Die gesamte Verbindung reagiert nun als Holoenzym und katalysiert die
Phosphorylation von Myosin. Myosin-P interagiert mit Aktin und löst darüber eine
122
5. Diskussion
Kontraktion aus. DAG erhöht die MAPK-Konzentration, die verschiedene Zielproteine
phosphoryliert.
Dadurch
vermittelt
Phenylephrin
einen
α1-induzierten
Blutdruckanstieg, der durch Konstriktion der glatten Gefäßmuskulatur verursacht
wird.
Die Dosierung von 30 mg/kg/d Phenylephrin und 30 mg/kg/d Isoprenalin, die in dieser
Arbeit verwendet wurde, richtete sich nach den Untersuchungen von MAASS et al.
(2004), die diese Dosierung bei Mäusen mit einer Mutation des kardialen Troponin T
einsetzten. Bei den Versuchen von MAASS et al. (2004) verstarben alle männlichen
transgenen Tiere, nicht aber die Weiblichen. In der vorliegenden Arbeit wurden nur
weibliche Tiere in dieser Versuchsgruppe eingesetzt, hierbei verstarben allerdings
alle Tiere innerhalb von 16 Stunden, sowohl die Transgenen als auch die Wildtypen.
Die letale Wirkung zeigt sich bei den transgenen Tieren jedoch deutlich vor denen
der Wildtypen. Der Tod einer Plakoglobin+/-Maus trat aufgrund einer Ventrikelruptur
auf. Die Auswirkung von einem positiv inotropen und positiv chronotropen β1Sympathomimetikum bei gleichzeitig erhöhtem peripheren Widerstand, ausgelöst
durch Phenylephrin, ist bei den Plakoglobin+/-Mäusen somit schneller fatal als bei
den Wildtypen.
Es traten Veränderungen in der EKG-Morphologie unter Einwirkung von Isoprenalin
bei einer Plakoglobin+/-Maus auf. Nach einer anfänglichen Tachykardie zeigte sich
eine QT-Verlängerung und einer T-Welleninversion, die später in eine eventuell auf
Erschöpfung beruhende Bradykardie überging. Die P-Welle könnte durch die TWellenverbreiterung verdeckt oder aufgrund von AV-Blöcken dissoziiert sein. Die
Deutung der T-Wellenverbreiterung ließe eine länger anhaltende Repolarisation zu,
die wiederum bedingt sein kann durch eine inadäquate Energieversorgung der
myokardialen Zellen bei einer lang anhaltenden sympathomimetischen Stimulation.
Die Versorgung des linken Ventrikels über die Koronararterien ist nur in der Diastole
gewährleistet. Wird bei einer positiv chronotropen Stimulation die Diastole verkürzt,
so kann eine Ischämie in Bereichen des LV auftreten, die die Energieversorgung
weiterhin verschlechtert. Auch eine Dilatation des dünnwandigen rechten Atriums
könnte über die gleichen Bedingungen wie eine Dilatation des rechten Ventrikels
123
5. Diskussion
entstehen. Solch eine Ausweitung des Vorhofes kann auch einen verringerten
Trikuspidalfluss hervorrufen.
124
5. Diskussion
5.2 Versuchsergebnisse
5.2.1 Zusammenfassung
Das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens führt bei Mäusen zu einer
rechtsventrikulären Dilatation im Alter. Die Dilatation kann in verschiedenen Bereichen
und Einstellungen des rechten Ventrikels gemessen werden: im Ein- und Ausflusstrakt,
in der Fläche/Volumen und in der Breite/Länge. Diese Entwicklung kann durch
Ausdauertraining gefördert werden und steht in einem kausalen Zusammenhang zu
der Trainingsintensität. Das selbstgewählte Trainingspensum unterschied sich nicht
zwischen den Genotypen. Ebenso verursachte das Training eine rechtsventrikuläre
Dysfunktion nach sympathomimetischer Stimulation, die sich in einem verringerten
Trikuspidalfluss in der Dopplerechokardiographie ausdrückte.
Körperliches Ausdauertraining führt zu einer Beschleunigung der ARVC in diesem
Modell.
Bei Plakoglobin+/-Mäusen mit einem hohen selbstgewählten Trainingspensum
(Aktivitätszahl > 300) war die linksventrikuläre Funktion, sowohl in Ruhe als auch nach
Isoprenalingabe, gemessen als Schlagvolumen, vermindert. Abgesehen von dieser
Veränderung zeigte sich keine weitere linksventrikuläre Funktionsbeeinträchtigung bei
den Plakoglobin+/-Mäusen gegenüber den Wildtypen.
Rassenunabhängig traten bei den Plakoglobin+/-Mäusen vermehrt ventrikuläre
Extrasystolen nach einer Belastung auf. Es zeigte sich ein geschlechtsspezifischer
Unterschied. Männliche Tiere waren stärker betroffen von dieser Arrhythmieform.
Versuche am isolierten Herzen korrelierten mit den morphologischen Veränderungen
und bestätigten somit die Resultate der echokardiographischen Untersuchungen. So
entwickelten vor allem ältere und trainierte Tiere spontane Arrhythmien mit
rechtsventrikulären
Ursprung
und
eine
Verlängerung
der
rechtsventrikulären
Überleitungszeiten.
In den histologischen Untersuchungen zeigte sich weder eine kardiomyozytäre
Hypertrophie, noch ein fibrös-fettiges Ersatzgewebe bei den Plakoglobin+/-Mäusen.
In den elektrophysiologischen Untersuchungen sedierter Mäuse waren keine
signifikanten Unterschiede in den EKGs erkennbar. In einer der rechtsventrikulären
125
5. Diskussion
Brustwandableitungen (V2) ließ sich ein vermehrtes Vorkommen von R´Zacken bei
trainierten Tieren vermuten.
5.2.2 Rechtsventrikuläre Dilatation
Die Ursache der einseitigen Dilatation des rechten Ventrikels ist wahrscheinlich die
starke passive Dehnungsbelastung des rechten Ventrikels im Gegensatz zu dem
linken Ventrikel. Die besondere Betroffenheit des rechten Ventrikels bei der ARVC ist
bislang noch nicht vollständig verstanden. Möglicherweise sterben myokardiale
Zellen aufgrund einer Apoptose (MALLAT et al. 1996; VALENTE et al. 1998). Ein
Defekt innerhalb des Zelladhäsionskomplexes würde beide Aspekte kombinieren.
Der rechte Ventrikel hat eine relativ dünnere Wand und ist anfälliger bei steigender
Wandbelastung (FIFER u. GROSSMAN 1986). Eine vermehrte Beanspruchung der
Wand bei myokardialen Zellen, die einen Zelladhäsionsdefekt haben, kann zu einer
Zelltrennung führen (McKOY et al. 2000). Vorherige Studien über die ARVC zeigten
Veränderungen in der Zell-Zell-Verbindung, vor allem in Desmosomen und Adherens
Junctions (GUIRAUDON 1989; RONCALI et al. 1989).
Plakoglobin scheint ein essentieller Bestandteil der myokardialen Desmosomen zu
sein, sowie unabdingbar in der Architektur der Intercalated Discs und der Stabilität
des Herzgewebes und demzufolge auch der Herzfunktion (RUIZ et al. 1996).
Studien mit kultivierten Gefässendothelzellen zeigten, dass bei steigenden
Scherkräften
eine
Zellabtrennung
bei
Plakoglobindefizienz
induziert
wird
(SCHNITTLER et al. 1997). Zellabtrennung kann als ein proapoptotisches Signal
verantwortlich sein für den apoptotischen Zelltod (SARASTE u. PULKKI 2000).
Plakoglobin wurde bereits in Verbindung gebracht mit dem Reaktionsweg der
Apoptose (BRANCOLINI et al. 1998). So reguliert Plakoglobin die Expression des
antiapoptotischen BLC-2 (HAKIMELAHI et al. 2000).
Die
jüngsten
Studien
krankheitsverursachender
Mutationen
führten
zu
pathogenetischen Theorien, basierend auf interzellulärem, mechanischem Stress.
Deskriptive Studien indizieren, dass ein progressiver myokardialer Umbau in Fettund Bindegewebezellen nach einer übertriebenen Apoptose stattfindet (AHMAD et
126
5. Diskussion
al., 2003; RUNGE et al., 2000; DIEZ, 2000). Tiermodelle lassen vermuten, dass
zellulärer mechanischer Stress als ein Trigger der Apoptose wirkt (NAGATA et al.,
2000; VALENTE et al., 1998).
Die besondere Betroffenheit nach Ausübung von Ausdauersport könnte mit einer
dauerhaften
Dehnungsbelastung
vor
allem
des
rechten
Ventrikels
zusammenhängen. Eine elegante, aber bislang unbewiesene Hypothese verbindet die
negativen Auswirkungen von körperlicher Belastung, Ausdauersportarten und
gestörten interzellulären Verbindungen: Unter Belastung steigen die Drücke in den
Herzkammern. Aufgrund seiner dünnen Wanddicke sind dabei besonders die
Myozyten der rechten Herzkammer hohen Scherkräften ausgesetzt. So kann es bei
einer entsprechenden genetischen Prädisposition zu einem akuten Verlust der
interzellulären Kontakte kommen, was sowohl elektrophysiologische Auswirkungen
haben kann, als auch proapoptotische Signalwege in Myozyten aktiviert (HERREN et
al., 1998). Eine physiologische Reaktion auf eine erhöhte Dehnungsbelastung ist eine
über den Wachstumsfaktor (EGF) vermittelte Hochregulierung von Plakoglobin
(YAMADA et al., 2005; YIN et al., 2005). Diese Reaktion wird bei Plakoglobin+/Mäusen verringert sein. Die Hauptfunktion von Plakoglobin ist die mechanische
Stabilisierung der myokardialen Synzytien über die Verbindung der Desmosomen mit
den interzellulären
intermediären Filamenten (TROYANOVSKI et al., 1993).
Demzufolge wird eine verringerte Plakoglobinexpression zu einer Abnahme der
adhäsiven Kräfte führen (YIN et al., 2005), die wahrscheinlich in einer reduzierten
Anzahl von funktionalen Desmosomen begründet liegt (BIERKAMP et al., 1996). Dies
könnte sich prädisponierend auf eine rechtsventrikuläre Dilatation auswirken, die
zusätzlich aufgrund einer passiven Dehnungsbelastung der rechstventrikulären Wand
verstärkt wird. Eine weitere physiologische Reaktion auf einen Dehnungsreiz ist mit
dem Frank-Starling-Mechanismus beschrieben: Eine Dilatation des Ventrikels führt
über eine bessere Vordehnung zu erhöhter systolischer Kraft; dieser Mechanismus
funktioniert bei geschädigter Muskulatur nicht mehr. Wenn dieser Mechanismus auch
bei der ARVC nur noch vermindert funktioniert, kann dies ein weiterer Faktor in der
Entstehung einer Dilatation sein.
127
5. Diskussion
5.2.3 Funktionsverminderung
Bei den transgenen trainierten, nicht aber bei den alten Tieren, zeigte sich eine
tendenziell verringerte Kontraktion des linken Ventrikels und ein verminderter
Trikuspidalfluss bei β1-Stimulierung. So deutet dies auf eine unterschiedliche
Ausprägung der intensiven akuten gegenüber einer chronischen Belastung hin. Die
Adaptation der kardialen Funktion bei einem kurzfristig erhöhten Isoprenalinspiegel
scheint ohne einen erhöhten Sympathikustonus (ohne Training) eher gegeben zu
sein. Demgegenüber steht die akute Belastung des trainierten Herzens, die schneller
den funktionellen Tribut fordert. Die durch den Ausdauersport bedingte β1Stimulierung
führt
somit
Kontraktionsverminderung
bei
Plakoglobin-defizienten
gegenüber
den
Tieren
altersbedingten
zu
einer
Entwicklungen.
Interessant wäre ein Vergleich zwischen den Auswirkungen auf die β-adrenergen
Rezeptorendichte zwischen trainierten und gealterten transgenen Tieren, um eine
unterschiedliche Entwicklung aufgrund von β-adrenerger Stimulation mit Hilfe von
Ausdauersport gegenüber den natürlichen Alterungsprozessen darzustellen.
5.2.4 Arrhythmien
Die deutlichste elektrophysiologische Veränderung zeigte sich in den verlängerten
Überleitungszeiten in den rechten Ventrikeln der schlagenden Plakoglobin+/-Herzen.
Die kardiale Repolarisation war allerdings in den betroffenen rechten Ventrikeln nicht
verändert. Im Gegensatz zu der üblichen Annahme, dass eine Verlängerung der
rechtsventrikulären Überleitungszeit in anatomischen Barrieren während der
Aktivierung begründet liegt, wie zum Beispiel fokales fibrös-fettiges Ersatzgewebe
(McKENNA et al. 1994), konnte in dieser Studie eine Überleitungszeitverlängerung
ohne
diese
Veränderungen
gezeigt
werden.
Dies
läßt
einen
funktionalen
Überleitungsdefekt in Plakoglobin+/-Mäusen vermuten.
Das vermehrte Auftreten von ventrikulären Extrasystolen und ventrikulären
Tachykardien nach Belastung und sympathomimetischer Stimulation bei den
Plakoglobin-defizienten Mäusen könnte auch in einer autonomen Dysbalance
128
5. Diskussion
begründet sein, wie es für die ARVC beim Menschen bereits diskutiert wird
(WICHTER et al. 2002).
In der ARVC treten VTs vor allem bei körperlicher Anstrengung und mentaler
Belastung auf und können durch intravenöse Katecholamininfusion provoziert
werden (Katecholaminsensibilität). Dagegen können ventrikuläre Tachykardien mit
antiadrenergen Medikamenten unterdrückt werden (WICHTER et al. 2002). Bei
ARVC-Patienten
nachgewiesen
konnte
werden.
Noradrenalinkonzentration
eine
Es
im
verringerte
wird
β-adrenerge
vermutet,
synaptischen
Spalt
dass
zu
Rezeptorendichte
eine
einer
gesteigerte
konsekutiven
Herunterregulierung der β-Rezeptorendichte führt. Die Ursache der erhöhten
Noradrenalinkonzentration kann in einem gestörten Uptake-Mechanismus in der
präsynaptischen Membran oder in erhöhten Feuerungsraten der efferenten Neurone
liegen (WICHTER et al. 2002). Dieser Mechanismus (Herunterregulierung der βRezeptorendichte) kann teilweise mit Hilfe von antiadrenergen Medikamenten (βBlocker) reversibel sein. Dies wäre auch eine Erklärung für die gute Ansprechbarkeit
der ARVC-Patienten auf eine Behandlung mit β-Blockern zur Unterdrückung von
ventrikulären Tachyarrhythmien (WICHTER et al. 2000).
Der Mechanismus einer autonomen Dysbalance ist in der Abbildung 5.2.4
vereinfacht dargestellt.
129
5. Diskussion
Abbildung 5.2.4: Autonome Dysbalance in ARVC (nach WICHTER et al. 2000)
Bei einer Noradrenalinausschüttung in den synaptischen Spalt kommt es zur
Aktivierung der β-adrenergen Rezeptoren, die über Gs zu einer Aktivierung der
Adenylatcyclase mit nachfolgend steigendem cAMP-Spiegel, sowie einer erhöhten
Aktivität der Proteinkinase A führen. Das darauffolgende Ansteigen des intrazelluären
Kalziumspiegels triggert eventuell ventrikuläre Tachykardien.
AC: Adenylatcyclase, ATP: Adenosintriphosphat, β-AR: β-adrenerger Rezeptor,
cAMP: zyklisches Adenosinmonophosphat, Gs: stimulierendes G-Protein, NE:
Noradrenalin, RE: Noradrenalinfreisetzung, UP: Noradrenalin-WiederaufnahmeMechanismus
5.2.5 EKG-Morphologie
Die unterschiedlichen Befunde der
EKG-Morphologie zwischen den hier
beschriebenen Untersuchungsergebnissen und der Naxos Disease beim Menschen
können in den Speziesunterschieden begründet liegen. So könnte die typisch
auftretende T-Wellen Inversion bei der Plakoglobin-Defizienz beim Menschen eine
andere Ausprägung bei der Maus haben, da hier die T-Welle sich dem QRSKomplex direkt anschließt und es kein physiologisches isoelektrisches STStreckensegment bei der Maus gibt. Auch die nicht deutlich erkennbare EpsilonWelle könnte mit artspezifischen Unterschieden erklärt werden. Eine Epsilon-Welle
130
5. Diskussion
wird als spezifische Ausprägung bei ARVC geschildert (McKENNA et al. 1994). Sie
ist wahrscheinlich das Resultat einer späten Aktivierung von abnormalen
rechtsventrikulären myokardialen Muskelfasern, die zu einer Verlängerung der
Depolarisation beim Oberflächen-EKG führt (FONTAINE et al. 1977). Folglich kann
die Anwesenheit einer Epsilon-Welle vermutet werden, wenn die Differenz zwischen
dem breitesten QRS-Komplex in den rechtspräkordialen Ableitungen (V1, V2 oder
V3)
minus
V6
mehr
als
25
ms
ist
(normale
Differenz
plus
zwei
Standardabweichungen). Dagegen könnte eine sporadisch vorkommende erhöhte
Anzahl von R`Zacken in der rechtspräkordialen Brustwandableitung V2 bei den
trainierten Mäusen einen Hinweis auf eine artspezifische Variante der Epsilon-Welle
geben.
131
5. Diskussion
5.3 Schlussfolgerungen
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigten die Veränderungen, die
eine heterozygote Defizienz im Plakoglobin-Gen, in vivo über einen längeren
Zeitraum betrachtet sowie unter anhaltender sportlicher Belastung, bewirken können.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die heterozygote Deletion des
Plakoglobin-Gens
zum
vollen
Phänotyp
der
ARVC
führt.
Desmosomale
Veränderungen scheinen somit an der Entstehung der Erkankung zumindest beteiligt
zu sein. Weiter konnte dargestellt werden, dass ein körperliches Ausdauertraining
das Auftreten der rechtsventrikulären Schädigung und von Kammertachykardien
beschleunigt. Dieser Befund legt nahe, dass ARVC-Patienten kein Ausdauertraining
ausüben sollten. Interessanterweise tritt der ARVC-Phänotyp ohne den typischen
fibrös-fettigen Umbau von Myokard auf. Dies könnte ein Epiphänomen der ARVC
sein.
Die geschilderten Ergebnisse sind durch Beobachtungen transgener Mäuse in vivo
gewonnen worden. Solche Untersuchungen an transgenen Tieren erlauben es, die
physiologische Bedeutung definierter genetischer Defekte zu untersuchen. Die
Methoden,
die
für
diese
Arbeit
weiterentwickelt
wurden,
können
für
die
phänotypische Untersuchung weiterer transgener Mausmodelle herangezogen
werden.
Obwohl deutliche Unterschiede in der Herzfrequenz, im Vorkommen und den
Eigenschaften von Ionenkanälen und in der Größe von Herzen zwischen Mäusen,
größeren Säugetieren und dem Menschen bestehen, und eine Übertragung von
Forschungsergebnissen von der Maus auf den Menschen nur mit Vorsicht möglich
ist, geben die in dieser Arbeit beobachteten Befunde doch eindeutige Hinweise, dass
eine Plakoglobin-Defizienz über einen längeren Zeitraum zu morphologischen und
elektrophysiologischen Veränderungen führen kann, und dass diese Entwicklungen
durch Ausdauertraining akzeleriert werden. Die hypothetischen Schlussfolgerungen
dieser Arbeit zur Pathophysiologie der Plakoglobin-Defizienz sind in der Abbildung
5.3 dargestellt. Für die weiteren Forschungen wäre es interessant, ob nicht nur die
Arrhythmien, sondern auch die rechtsventrikulären Dilatation medikamentös, z.B. mit
132
5. Diskussion
β-Blockern (Propranolol), hinausgezögert werden kann. Auch wenn hierüber der
myokardiale Stretch nicht vermindert werden kann, so könnte eventuell der Faktor
der autonomen Dysbalance und die dadurch getriggerte Apoptose verringert werden.
Abbildung 5.3: Schematische Darstellung der hypothetischen Pathophysiologie bei
Plakoglobindefizienz
133
6. Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Melanie Zwiener:
Kardiale Phänotypisierung heterozygoter Plakoglobin-defizienter Mäuse mittels
Echokardiographie und Telemetrie
Die rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC) ist eine Herzmuskelerkrankung mit
einer noch unzureichend aufgeklärten Ätiologie. Sie verursacht Arrhythmien,
Herzversagen und plötzlichen Herztod. Die Diagnosestellung kann kompliziert sein,
und dies behindert eine Untersuchung der molekularen Basis. Eine Veränderung im
Plakoglobin-Gen führt zu einer Form der ARVC (Naxos disease). Plakoglobin ist als
zytoskelettales Protein sowohl in den Desmosomen als auch in den Adherens
Junctions vorhanden. Die genetische Inaktivierung führt zu einem embryonal letalen
Phänotyp aufgrund einer Dysfunktion in den Intercalated Discs, die eine
Einschränkung der Herzstabilität nach sich zieht. Um die phänotypischen
Auswirkungen einer Plakoglobindefizienz zu untersuchen, wurden vergleichende
elektro- und echokardiographische Untersuchungen sowie eine erhöhte β-adrenerge
Stimulation (medikamentös oder mit Hilfe von Ausdauertraining) an Mäusen
analysiert. EKGs wurden als 12-Kanal-Oberflächen-EKGs unter verschiedenen
Narkosen, sowie als Langzeit-EKG bei adulten Tieren mit Hilfe eines telemetrischen,
implantierten Transmitters bei sich frei bewegenden, sowie bei körperlich belasteten
Mäusen durchgeführt. Es wurden alters- und trainingsabhängige serielle elektro- und
echokardiographische Untersuchungen der Herzen vorgenommen.
Eine heterozygote Plakoglobin-Defizienz resultiert in einer altersabhängigen
rechtsventrikulären Dilatation, die durch Training akzeleriert werden kann. Eine
verminderte Kontraktionskraft zeigt sich bei einer β-adrenergen Stimulation der
trainierten Tiere. Ein verstärkte Neigung zu Arrhythmien wurde sowohl bei älteren als
auch bei trainierten Mäusen sowie bei einer β1-Stimulation deutlich. Die Erklärung zu
diesen
Befunden
scheint
in
einem
multifaktoriellen
Zusammenspiel
von
myokardialem Stretch mit der besonderen Dehnungsbelastung des rechten
Ventrikels
und
zytoskelettalen
Veränderungen
134
sowie
einem
funktionalen
6. Zusammenfassung
Überleitungsdefekt
bzw.
einer
autonomen
Dysfunktion
zu
liegen,
das
zu
apoptotischen Vorgängen und darüber zu einer myokardialen Atrophie führt. Aus
diesen Faktoren können letzten Endes eine Herzinsuffizienz und Arrhythmien
resultieren.
135
7. Summary
7. Summary
Melanie Zwiener:
Cardiac phenotype characterization of heterozygous plakoglobin deficient mice via
echocardiography and telemetry
The arrhythmogenic right ventricular disease (ARVC) is a heartmuscle disease of
which we have insufficient knowledge about the etiology. It causes arrhythmias, heart
failure and sudden cardiac death. It can be difficult to diagnose, which impedes the
analysis of the molecular base. A change in the gene of plakoglobin results in a
special type of ARVC (naxos disease). Plakoglobin is a cytoskeletal protein, which is
present in desmosomes as well as in adherens junctions. The genetic inactivation
leads to an embryonic lethal phenotype due to a dysfunction of the intercalated discs,
which limits the heart stability. Experiments were conducted on mice in order to
investigate electrophysiological and functional impact of plakoglobin deficiency.
These experiments included electro- and echocardiographic studies as well as
enhanced β-adrenergic stimulation (medicamentous or with endurance training). 12channel-surface-ECGs were carried out on adult mice under different narcosis, while
long-term ECGs were realized using telemetric transmitter implants on freely moving
and physically stressed adult mice. Age- and training-related echocardiographic and
electrocardiographic examination series were conducted.
Heterozygote plakoglobin deficiency results in an age-depending right ventricular
dilatation, which training can accelerate. A reduced contractility shows after βadrenergic stimulation of trained mice. Older and trained mice reveal an increased
predisposition to arrhythmia; furthermore β1-stimulation increases the risk. A
multifactorial interaction of myocardial stretch (with enhanced strain forces of the
right ventricle), cytoskeletal changes and a functional conduction defect/ autonome
dysbalance could lead to apoptotic action and in addition to myocardial atrophy.
These factors result in heart failure and arrhythmia.
136
Literaturverzeichnis
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176
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2.2.2: Die verschiedenen Funktionen von Plakoglobin (ZHURINSKY et
al. 2000b) ..........................................................................................................23
Abbildung 2.4: Schematische Darstellung der unterschiedlichen EKG-Kurven bei
Mensch und Maus .............................................................................................35
Abbildung 3.1.1: Eine Restriktionsübersichtstafel.....................................................41
Abbildung 3.2.2.1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Telemetrieanlage...44
Abbildung 3.2.2.2: Postoperatives Röntgenbild nach Transmitterimplantation .........48
Abbildung 3.2.3: Schematische Darstellung eines einkanaligen MausElektrokardiogramms.........................................................................................51
Abbildung 3.3.1.1: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Vierkammeransicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU
2001) .................................................................................................................54
Abbildung 3.3.1.2: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Längsachsenansicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU
2001) .................................................................................................................54
Abbildung 3.3.1.3: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Ansicht der Trikuspidal- und Pulmonalklappe des Herzens (modifiziert nach
KÖHLER u. TATARU 2001) ..............................................................................55
Abbildung 3.3.1.4: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Querachsenansicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU
2001) .................................................................................................................55
Abbildung 3.3.1.5: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Ansicht der kurzen Achse auf Höhe der Aortenklappe (modifiziert nach
KÖHLER u. TATARU 2001) ..............................................................................56
Abbildung 3.3.1.6: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Ansicht eines rechtsventrikulären Ausflusstraktes (von der parasternalen
kurzen Achse ausgehend) des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u.
TATARU 2001)..................................................................................................56
Abbildung 3.3.2: Gemessene Rechtherzparameter modifiziert nach FOALE
(1986) ................................................................................................................59
Abbildung 3.5.1: Der Versuchsaufbau einer Langendorffapparatur..........................66
Abbildung 3.5.2: Monophasisches Aktionspotential einer Maus ...............................69
Abbildung 4.1.1.1: Vergleich der Rechtsherzparameter im Vierkammerblick
zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen, die älter als 38 Wochen
sind....................................................................................................................81
Abbildung 4.1.1.2: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche
des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Mäusen, die älter als 38
Wochen sind......................................................................................................82
Abbildung 4.1.1.3: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der
Längsachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im
Alter von 9 bis 12 Wochen und älter als 38 Wochen .........................................83
177
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 4.1.1.4: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche
des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Mäusen, die älter als
38 Wochen sind.................................................................................................83
Abbildung 4.1.1.5: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der
Querachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen älter als
38 Wochen ........................................................................................................84
Abbildung 4.1.1.6: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche
des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei Mäusen, die älter als
38 Wochen sind.................................................................................................84
Abbildung 4.1.1.7: Vergleich des rechtsventrikulären Volumens nach Wübbeling
zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im Alter von 9-12, 13-26 und
über 38 Wochen ................................................................................................86
Abbildung 4.1.1.8: Vergleich der Durchmesser der Trikuspidalklappe und des
rechtsventrikulären Ausflusstraktes zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und
Wildtypen, die älter als 38 Wochen sind............................................................87
Abbildung 4.1.1.9: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der
Durchmesser der Trikuspidalklappe und des rechtsventrikulären
Ausflusstraktes bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind................................87
Abbildung 4.1.2.1: Korrelation der Länge des rechten Ventrikels im Verhältnis zur
errechneten Aktivitätszahl .................................................................................89
Abbildung 4.1.2.2: Korrelation der rechtsventrikulären Fläche im
Vierkammerblick im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl ..........................90
Abbildung 4.1.2.3: Korrelation des rechtsventrikulären Einflusstraktes im
Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl...........................................................90
Abbildung 4.1.2.4: Korrelation des rechtsventrikulären Fläche in der
Längsachsenansicht im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl ....................91
Abbildung 4.1.2.5: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels im
Vierkammerblick zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und
nach Training.....................................................................................................92
Abbildung 4.1.2.6: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der
Längsachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor
und nach Training..............................................................................................93
Abbildung 4.1.2.7: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche
des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Mäusen vor und nach
Training .............................................................................................................93
Abbildung 4.1.2.8: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der Längs- und
Querachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach
Training .............................................................................................................94
Abbildung 4.1.2.9: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche
des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei Mäusen vor und nach
Training .............................................................................................................95
Abbildung 4.1.2.10: Vergleich der Fläche des linksventrikulären Schlagvolumens
zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training .........................96
Abbildung 4.1.2.11: Beispielhafte echokardiographische M-Mode-Darstellung
des linken Ventrikels nach Isoprenalingabe vor und nach Training...................97
178
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 4.1.2.12: Vergleich der FS, des systolischen inneren LV-Diameters,
des endsystolischen Volumens und der Ejektionsfraktion nach Teichholz
des linken Ventrikels unter Isoprenalinwirkung nach Training ...........................97
Abbildung 4.1.2.13: Vergleich der maximalen Geschwindigkeit, des maximalen
Druckes und des mittleren Druckes im Trikuspidaldoppler unter
Isoprenalinwirkung zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach
Training .............................................................................................................98
Abbildung 4.1.2.14: Beispielhafte echokardiographische TrikuspidaldopplerDarstellung nach Isoprenalingabe vor und nach Training..................................99
Abbildung 4.1.2.15: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche
des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Maus-Nr.320 und Wildtyp
nach Training...................................................................................................100
Abbildung 4.1.2.16: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche
des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Maus-Nr.320 und
Wildtyp nach Training ......................................................................................100
Abbildung 4.1.2.17: PET Darstellung der Herzen von Maus-Nr.320 und eines
Wildtyps vor und nach Training ......................................................................101
Abbildung 4.2.1: Vergleich der ersten beiden Brustwandableitungen (V1, V2) bei
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training (repräsentative
EKGs)..............................................................................................................103
Abbildung 4.2.2.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen
Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen nach einer Airjet-Belastung .................104
Abbildung 4.2.2.2: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen
Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei den verschiedenen Züchtungen
und bei männlichen Tieren nach einer Airjet-Belastung ..................................105
Abbildung 4.2.2.3: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/Maus nach einer Airjet-Belastung....................................................................105
Abbildung 4.2.2.4: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen
Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei der C57Bl/6-Züchtung während
einer Airjet-Belastung ......................................................................................106
Abbildung 4.2.2.5: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/Maus während einer Airjet-Belastung..............................................................106
Abbildung 4.2.2.6: Vergleich der spontanen atrialen Extrasystolen zwischen
Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei den männlichen Tieren bei
normaler Aktivität (Ruhe).................................................................................107
Abbildung 4.2.2.7: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/Maus bei normaler Aktivität (Ruhe) ................................................................107
Abbildung 4.2.2.8: Herzfrequenzvergleich zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und
Wildtypen bei normaler Aktivität (Ruhe) nach Training....................................108
Abbildung 4.3.1: Ventrikuläre Tachykardie bei einer Plakoglobin+/-Maus einen
Tag nach Implantation einer osmotischen Pumpe, die 3mg/kg/d Isoprenalin
freisetzt............................................................................................................109
Abbildung 4.3.2: QRS-Morphologie nach Implantation einer Isoprenalinfreisetzenden Pumpe bei einer Plakoglobin+/-Maus .......................................110
Abbildung 4.3.3: Rupturierter linker Ventrikel nach Implantation einer osmotisch
wirksamen Isoprenalin-Phenylephrin-Pumpe bei einer transgenen Maus .......111
179
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 4.4.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Tachykardien zwischen
Wildtypen, trainierten und über 42 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen ......112
Abbildung 4.4.2: Spontane ventrikuläre Tachykardie im monophasischen
Aktionspotential und im Elektrokardiogramm eines Plakoglobin+/-Herzens in
der Langendorff-Apparatur ..............................................................................113
Abbildung 4.4.3: Vergleich der Ursprungslokalisationen der spontanen
Arrhythmien zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen .........................114
Abbildung 4.4.4: Vergleich der rechtsventrikulären Überleitungszeiten zwischen
Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen .............................................................115
Abbildung 5.2.4: Autonome Dysbalance in ARVC (nach WICHTER et al. 2000)....130
Abbildung 5.3: Schematische Darstellung der hypothetischen Pathophysiologie
bei Plakoglobindefizienz ..................................................................................133
180
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1.1: Mutationen, die mit der ARVC assoziiert sind ....................................13
Tabelle 2.1.2: Diagnostische Kriterien der ARVC .....................................................16
Tabelle 2.2: Protein Partner von Plakoglobin (nach ZHURINSKY et al. 2000b) .......31
Tabelle 3.3.2: Errechnete Werte aus echokardiographischen Daten........................62
Tabelle 3.5.1: Zusammensetzung der Krebs Henseleit-Pufferlösung.......................65
Tabelle 3.8: Anzahl der Mäuse in den einzelnen Versuchsgruppen .........................77
Tabelle 4.1.1.1: Echokardiographieergebnisse ausgewählter
Linksherzparameter bei 9 bis 12 Wochen und über 38 Wochen alten
Tieren ................................................................................................................79
Tabelle 4.1.1.2: Echokardiographieergebnisse ausgewählter
Rechtsherzparameter bei 9 bis 12 Wochen alten Tieren...................................80
Tabelle 4.1.1.3: Echokardiographieergebnisse ausgewählter
Rechtsherzparameter bei 13 bis 26 Wochen alten Tieren.................................80
Tabelle 4.1.2: Beispiel zur Errechnung der Aktivitätszahl .........................................88
Tabelle 4.2.1: Oberflächen-EKG-Ergebnisse ausgewählter Parameter von 9 bis
15 Wochen und über 38 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen und
Wildtypen unter Diazepamsedation.................................................................102
Tabelle 4.5: Durchmesser der Kardiomyozyten in den Herzen von
Plakoglobin+/-Tieren und Wildtypen................................................................116
181
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
4-AP
4-Aminopyridine
AC
Adenylatcyclase
AJ
Adherens Junctions
Ao
Aorta
Ao R-R
zeitl. Abstand zweier Aortenausschläge im Doppler
AoV
Aortenwurzeldurchmesser
AoVmax
maximale Geschwindigkeit des Aortendopplers
APC
Adenomatous polyposis coli
APD
Aktionspotentialsdauer
Arm
Armadillo (von Drosophila armadillo)
ARVC
Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie
Aut.-dom.
Autosomal-dominant
Aut.-rez.
Autosomal-rezessiv
AV-Knoten
Atrioventrikularknoten
β-AR
β-adrenerger Rezeptor
β-TrCP
β-Transducin repeat containing protein (Ubiquitin Lygase)
bzw
beziehungsweise
2+
Ca
Kalzium
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
CBP
CREB bindendes Protein
CSQ
Calsequestrin
CW-Doppler
Doppler im „continous wave“ Modus
CWH
Kardiokutanes Syndrom (Cardiomyopathy and wooly haircoat
syndrome)
DAG
Diacylglycerol
DES
Desmosomen
DNA
Desoxyribonucleinsäure
Dsh
Disheveled
Dsp
Desmoplakin
182
Abkürzungsverzeichnis
EDV
Enddiastolisches Volumen
EF
Ejektionsfraktion
EGF
Epidermaler Wachstumsfaktor
EKG
Elektrokardiogramm
ES
embryonale Stammzellen
ESV
Endsystolisches Volumen
Frz
Frizzled-Rezeptor
FS
Ventrikelverkürzungsfraktion: „fractional shortening“
Gs
stimulierendes G-Protein
GSK/ Gsk3b
Glykogen Synthase Kinase/ Glykogensynthasekinase-3β
HF
Herzfrequenz
HSV-TK
Herpes-Simplex-Virus-Thymidine-Kinase-Gen- Kassette
HZV
Herzzeitvolumen
I()
Ionenstrom
IF
Intermediäre Filamente
IP3
Inositoltrisphosphat
IVS
Interventrikuläres Septum
Kg
Kilogramm
KGW
Körpergewicht
LA
Linkes Atrium
Lav
Längsachsenansicht
LEF
Lymphocyte enhancer binding factor
LV
Linker Ventrikel
LVET
linksventrikuläre Ejektionszeit
LVOT
Linksventrikulärer Ausflusstrakt
LVW
Hinterwand des linken Ventrikels
MAP
monophasisches Aktionspotential
MAPK
Mitogen-activated Protein Kinase
M-Mode
Time Motion Mode
MRI
Magnet Resonance Imaging
MV A-Punkt
Höchster Punkt der A-Welle im Mitraldoppler
183
Abkürzungsverzeichnis
MV E-Punkt
Höchster Punkt der E-Welle im Mitraldoppler
MV-Decelzeit
Dezelerationszeit der Mitralwelle in ms
MV Vmax
Maximale Geschwindigkeit des Mitraldopplers
NA
Noradrenalin
ND
noch nicht ermittelt (non determined)
Neo
Neomycin Gen Kassette
NLS
Kern Lokalisations Signal Sequenzen
Nup
Nukleoporin
OP
Operation
PCR
Polymerasekettenreaktion
PG
Plakoglobin
Plp
Plakophilin
RA
rechtes Atrium
RV
Rechter Ventrikel
RVD
rechtsventrikulärer Diameter
RVDV
Rechtsventrikuläres diastolisches Volumen
RVIT
rechtsventrikulärer Einflusstrakt
RVLAX
Länge des rechten Ventrikels
RVOT
rechtsventrikulärer Ausflusstrakt
RVSAX
Breite des rechten Ventrikels
RyR2
Ryanodin Rezeptor2
Sav
Querachsenansicht
SCC9-Zellen
squamöse Karzinom9-Zellen
SCD
Plötzlicher Herztod (sudden cardiac death)
SV
Schlagvolumen
TBP
TATA Bindeprotein
TCF
T-Zell-Faktor
TG
Transgenes Tier
TV
Trikuspidalklappe
Tyr
Tyrosin
Vcf
Zirkuläre Faserverkürzung
184
Abkürzungsverzeichnis
VT
Ventrikuläre Tachykardie
VTI
Geschwindigkeits-Zeit-Integral
Wnt
Wingless-Glycoprotein (von der Wingless-Signalkette)
WT
Wildtyp
185
Anhang
Anhang
Geräte
Telemetrieanlage
Transmitter TA10ETA-F20-L20 (Data Science, St. Paul, MN)
Receiver RA1010 (Data Science, St. Paul, MN)
Standardcomputer
Input-Matrix
Output-Matrix
EKG-Gerät
Megacart (1993, Siemens, Erlangen)
AC 264 EKG Verstärker (EMKA Technologies, Paris)
ITF16 EKG Verstärker (EMKA Technologies, Paris)
Selbstangefertigte Schlaufenelektroden aus dünnem Stahldraht
Ultraschallgerät
Sonos 5500 (Philipps Medical Systems, Hamburg)
12 MHz Sektorschallkopf
15 MHz Linearschallkopf
Zentrifuge
Labofuge III (Heraeus)
Wärmeplatten
TKM – 0902 Temperatur-Kontrollmodul (FMI Föhr Medical Instruments, SeeheimOber Beerbach)
IOW – 3700 Rektaltemperatur geregeltes, intraoperatives Tierbewärmungssystem für
die Ratte oder die Maus (FMI Föhr Medical Instruments, Seeheim-Ober Beerbach)
186
Anhang
Elektrischer Rasierer
Golden A4, Model 5-55E (Oster, USA)
Waage
Sartorius CP 3202 S (Sartorius AG, Göttingen)
Radio / Magnet
Phapsody®, RY-103/H, AM/FM Radio, Dual Sound
Magnet (DSI, Data Science International)
Software
iox1.6.7 Cardiology Research Software (EMKA Technologies, Paris)
ecg Auto 1.5.7.36 Multi-species Multi-leads Analysis Software (EMKA Technologies,
Paris)
Datenakquisitions-Software, basierend auf der LabVIEW Programmiersprache
Semi-automatisches
EKG-Analyseprogramm,
basierend
auf
der
Programmiersprache
EKG-Analyseprogramm, visual basic basiert (signetix, Bielefeld)
Verbrauchsmaterialien
Desinfektion
Neo-Kodan, farblos (Schülke&Mayr, Norderstedt)
Handschuhe
SAFESKIN*PFE, Größe M (Kimberly-Clark, Belgien)
SAFESKIN*Satin Plus*, Größe S (Kimberly-Clark, Belgien)
Kanülen
Terumo® Neolus 27G, 0,4 mm (TERUMO EUROPE N.V., Leuven, Belgien)
Terumo® Luer 18G, 0,4 mm (TERUMO EUROPE N.V., Leuven, Belgien)
187
LabVIEW
Anhang
Klebeband
Leukosilk® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg)
Leukoplast® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg)
Leukofix® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg)
Medikamente
Baytril® 10%
(Bayer, Leverkusen)
Ibuflam® 2%
Sirup (Lichtenstein Pharmazeutika, Mühlheim-Kärlich)
Bepanthen®
Augen- und Nasensalbe (Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen)
Stereofundin® (Braun, Melsungen)
Isoproterenol® Isoprenalin (Sigma-AldrichChemie GmbH, Steinheim)
Nahtmaterial
Ethicon PROLENE® , 4/0 (1,5 metric), P-3, 45 cm (Johnson+Johnson Intl, Brüssel)
Ethicon VICRYL∗ , 4-0 (1,5 metric), P-3 (13,0 mm 3/8c) (Johnson+Johnson Intl,
Brüssel)
Narkose-Geräte
RUS-13-GA Inhalationsnarkose System (FMI Föhr Medical Instruments, SeeheimOber Beerbach)
Narkotika
Xylazin® 2% (CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf)
Ketamin 10% (CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf)
Ketanest® S (Parke-Davis GmbH, Berlin)
Isofluran Curamed (250ml, CuraMED Pharma GmbH, Karlsruhe)
Sedativa:
Diazepam-ratiopharm 10 Injektionslösung (Ratiopharm, Ulm)
188
Anhang
OP-Unterlagen
klinidrape® (Mölnlycke Health Care OY Fin, Finnland)
Speichermedien
Platinum® CD-R 80 min/700 MB
Magneto optical Disk, Fujifilm 1.3 GB MO rewritable
10 Mbit-Ethernet-kompatibles Netzwerk (telemetrisches EKG)
Spritzen
Omnifix®-F 1ml (Braun, Melsungen)
Amefa-Einmalspritzen, 20 ml (Braun, Melsungen)
Ultraschallgel
Aquasonic® 100 (Parker Laboratories, INC, Fairfield)
Sonstiges
Druckpapier für das Ultraschallgerät (Superior density printing paper, 110 mm × 18
m, Sony Corporation Tokyo Japan)
EKG-Papier, handelsüblich
Enthaarungscreme Pilca®med (ASID BONZ GmbH, Böblingen)
Sprühpflaster (Johnson + Johnson, Norderstedt)
Plastikröhrchen (50 ml) mit Schraubverschluss (Sarstedt, Nümbrecht)
Papiertücher KIMWIPES® Lite (Kimberly-Clark, Belgien)
Elektrodencreme (Marquette Hellige GmbH, Freiburg)
189
Anhang
DANKSAGUNG
Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen, die mich in irgendeiner Form unterstützt
und so zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, ganz herzlich bedanken.
Mein Dank gilt besonders:
Herrn PD Dr. Paulus Kirchhof für die Überlassung des Themas und die freundliche
Unterstützung bei der Planung und Ausführung der Experimente. Des Weiteren
möchte ich mich für die hervorragende Betreuung und Unterstützung bei der
Verfassung dieser Arbeit bedanken.
Herrn Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder (Physiologisches Institut der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover) danke ich für das Interesse und seine
Bereitschaft, das Gutachten zu erstellen.
Ein besonderes Dankeschön gilt auch Frau Dr. Larissa Fabritz für die unermüdliche
fachliche und persönliche Unterstützung und die kompetente und herzliche
Einarbeitung in die Echokardiographie der Maus.
Marcel Tekook danke ich für die freundliche Einarbeitung in das Laborleben der
Mäuseklinik.
Für die wundervoll unterhaltsamen Kaffeepausen und das freundschaftliche
Zusammenarbeiten danke ich Dr. Lisa Fortmüller, Nina Kreienkamp und Daniela
Volkery.
Meinen Versuchstieren danke ich für ihr friedliches Verhalten während der ganzen
Zeit.
Persönlich und von Herzen danken möchte ich meinem Mann, Michael Zwiener,
und meinen Eltern, Franz und Ursula Graute, für die immer selbstverständliche
Unterstützung und Aufmunterung während des Studiums und der Promotion.
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