1. No category

DISS. ETH NO. 22049
How kinetochore proteins control
the length of the human mitotic spindle
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
MICHELLE GERALDINE MEIER
Master of Science UZH in Biologie Molekular- und Zellbiologie
University of Zurich, Switzerland
born on 08.02.1983
citizen of
Steinmaur, ZH, Switzerland
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Matthias Peter
Prof. Dr. Patrick Meraldi
Prof. Dr. René Medema
2014
chapter
1 Summary
The ultimate goal of mitosis is the proper distribution of the duplicated genetic
material into the two daughter cells. As mitosis is a succession of interacting,
intertwined processes, it is tightly controlled by the spindle assembly checkpoint to
ensure the achievement of this aim. In the first phase of mitosis, prophase, the spindle
apparatus forms by nucleating microtubules from the poles while the genetic material
starts to condense and the nuclear envelope breaks down. In collaboration with motor
proteins, the spindle poles reach opposing positions within the cell in prometaphase.
Due to the nuclear envelope breakdown, the microtubules are able to contact the sister
chromatids on specific, multiproteinous structures known as kinetochores. The
kinetochores are translating the forces exerted by the microtubules on the sister
chromatids resulting in the alignment of the genetic material on the metaphase plate
located on equator of the spindle apparatus. In last stage, the cell progresses into
anaphase resulting in the separation of the sister chromatids.
During mitotic progression the spindle shows phase-characteristic lengths whereupon
three different stages can be distinguished. In the first phase, the spindle increases the
interpolar distance until it reaches a steady-state length in metaphase in the second
stage. The last period is dominated by a further elongation in spindle length resulting
in a separation of the sister chromatids in anaphase. The steady-state metaphase
spindle length reaches a cell type-characteristic, species-specific size. However, the
biological significance and the molecular processes maintaining this evolutionary
conserved steady-state are poorly understood. The currently accepted force-balance
model, describes a set of three main forces, counteracting each other and thus
governing the metaphase spindle length: microtubule dynamics, the activity of motor
proteins and a tensile element called elastic spring. The passive inward directed force
of the elastic spring is measured by the extent of the centromeric stretch respectively
centromeric tension. The elastic spring was reported to be affected by the depletion or
loss of one of the major kinetochore protein assemblies, the MIS12 complex, and thus
causing elongated metaphase spindle lengths in yeast, in Drosophila or in human
cells.
My high-resolution kinetochore-tracking assay measuring the centromeric tensions in
living cells revealed that the centromeric stretch is functional and intact upon
depletion of the MIS12 complex. This result suggested that the elongated spindle
length is not caused by an affected integrity of the interchromatic region.
Rather my results reveal that loss of the Mis12 complex leads to a collapse of the
kinetochore structure that affects the activity of the protein kinase Aurora B.
Moreover, I found that Mis12 complex depletion leads to a severe reduction in the
levels of the microtubule depolymerase Kif2A at spindle poles, a condition that per se
is sufficient to elongate the spindle. Inhibition of Aurora B restores normal spindle
length and Kif2A levels at spindle poles, suggesting that Mis12 affects spindle length
via Aurora B and Kif2A, revealing an elaborate communication between kinetochores
and spindle poles. We propose that the affected kinetochore structure is modifying the
influence range of the centromeric located Aurora B kinase and thus changes the
amount of phosphorylated Aurora B kinase targets.
3 Zusammenfassung
Das Ziel der Mitose ist die gleichmässige Verteilung des duplizierten genetischen
Materials in die zwei Tochterzellen. Dieser Vorgang besteht aus interagierenden,
ineinander greifenden Prozessen, deren korrekter Ablauf durch den mitotischen
Kontrollpunkt, den Spindle Assembly Checkpoint, streng kontrolliert wird und
gewährleistet, dass das Ziel der Mitose erreicht wird.
In der ersten Phase der Mitose, der Prophase, entsteht der Spindel-Apparat durch den
Aufbau von Mikrotubuli an den Polen. Währenddessen kondensiert das genetische
Material und die Kernhülle wird abgebaut. Mithilfe von mit Motorproteinen nehmen
die Spindelpole innerhalb der Zelle gegenüberliebende Positionen während der
Prophase ein. Der Abbau der Kernhülle ermöglicht den Mikrotubuli mit den
Schwesterchromatiden über spezifische Multiprotein- Strukturen, allgemein bekannt
als Kinetochoren, Kontakt aufzunehmen. Die Kinetochoren übertragen die von den
Mikrotubuli ausgeübten Kräfte auf die Schwesterchromatiden, was in einer auf der
Metaphase-Platte am Äquator des Spindel-Apparates ausgerichteten Anordnung des
genetischen Materials resultiert. In der letzten Etappe der Mitose erreicht die Zelle die
Anaphase, während der die Schwesterchromatide separiert werden.
Während des Verlaufs der Mitose weist die Spindel phasen-charakteristische Längen
auf, welche drei verschiedenen Stadien zugeordnet werden können. Das erste Stadium
ist durch eine Vergrösserung der interpolaren Distanz gekennzeichnet. In der
Metaphase, der zweiten Phase, wird ein temporäres Gleichgewichts-Stadium
betreffend der Länge erreicht. Die letzte Phase zeichnet sich durch eine weitere
Verlängerung der Spindel aus, was zur Trennung der Schwesterchromatiden in der
Anaphase führt. Die Gleichgewichtslänge der Spindel in der Metaphase erreicht eine
zelltyp-charakteristische, spezies-spezifische Grösse. Jedoch ist die biologische
Signifikanz und die molekularen Prozesse, welche dieses evolutionär konservierte
Gleichgewicht aufrecht erhalten, nur schlecht verstanden. Das gegenwärtig gängige
Kräfte-Balance Modell beschreibt drei Hauptkräfte, welche entgegengesetzt zu
einander wirken und dadurch die Metaphasen-Spindellänge beeinflussen: die
Dynamik der Microtubuli, die Aktivität von Motorproteinen und ein dehnbares
Element, welches als „elastische Feder“ bekannt ist. Die passiv nach innen gerichtete
Kraft der elastischen Feder wird anhand des Ausmasses der Dehnung der
centromerischen Region respektive der centromerischen Spannung ermittelt. Einige
Publikationen zeigten auf, dass die elastische Feder durch die Depletion oder den
Verlust von einem der Hauptkinetochor-Aggregate, des MIS12 Komplexes, betroffen
ist und als Konsequenz eine vergrösserte Metaphasen- Spindellänge in Hefe, in
Drosophila oder in der menschlichen Zelle hervorruft. Durch meine hochauflösende
Kinetochor-Tracking-Methode, welche die centromerischen Spannungen in lebenden
Zellen erfasst, konnte ich zeigen, dass die centromerische Elastizität auch bei einer
Depletion des MIS12 Komplex funktional und intakt bleibt. Dieses Resultat deutet
darauf hin, dass die vergrösserte Spindellänge nicht durch eine beeinträchtigte
Integrität der interchromatischen Region hervorgerufen wird.
Stattdessen machen meine Resultate deutlich, dass der Verlust des MIS12 Komplexes
zu einem Kollaps der Kinetochorstruktur führt, welcher die Aktivität der
Proteinkinase Aurora B beeinflusst. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass die MIS12
Komplex-Depletion zu einer starken Reduktion des Mikrotubuli-Depolymerase Kif2A
Levels an den Spindelpolen führt – eine Begebenheit welche per se schon genügend
ist, die Spindel zu verlängern. Die Aurora B- Inhibierung stellt die normale
Spindellänge über Aurora B und Kif2A wieder her, was eine raffinierte
4 Kommunikation zwischen Kinetochoren und Spindelpolen suggeriert. Wir stellen
deshalb die Hypothese auf, dass die beeinträchtigte Kinetochorstruktur die Reichweite
des Einflusses der centromerisch-lokalisierten Aurora B Kinase modifziert und daher
die Anzahl der phosphorylierten Aurora B Kinase- Ziele verändert.
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