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렌티바이러스를 이용한 유전자발현시스템
Lentiviral Systems and Tools
Lenti-X
• 높은 역가의 재조합 렌티바이러스 제작 시스템
• 비분열세포를 포함한 포유류 세포에 유전자 도입 효율 극대화
• 안정적인 stable cell line 제작에 효과적인 바이러스 시스템
H I G H - E F F I C I E N C Y
L E N T I V I R A L
L E N T I - X™
H T X
PA C K A G I N G
S YS T E M
Clontech의 렌티바이러스 발현 시스템의 특징과 개요
재조합 렌티바이러스는 primary cell, 줄기세포, 신경세포와 같이 유전자 도입이 어려운 세포와 비분열세포를 포함한 대부분의 포유류세포에
유전자를 도입할 수 있는 강력한 바이러스 시스템이다. pLVX lentiviral vector와 Lenti-X HTX Packaging System Mix를 Xfect Transfection
Reagent로 Lenti-X 293T 세포주에 cotransfection하면 48시간 후에 높은 역가titer의 재조합 렌티바이러스를 얻을 수 있다.
◦ 최대 ~108 IFU/㎖의 매우 높은 역가의 렌티바이러스 조제 가능
◦ 감염성이 뛰어난 VSV-G 또는 ecotropic pseudotype의 렌티바이러스를 48시간내 획득 가능
◦ 5개의 vector로 분리된 packaging mix를 통해 바이러스 감염에 대한 안전성 확보
시스템의 핵심 요소
최적화된 Lenti-X Vector
cPPT/CTS(central polypurine tract/central termination
sequence)와 WPRE(woodchuck hepatitis virus post
- transcriptional regulatory element)를 포함하여
transduction과 유전자 발현을 증가시킨다.
최적화된 Lenti-X HTX Packaging Mix
패키징에 필요한 필수 바이러스 구성요소를 가진 vector가
Gene of Interest
5' LTR
PCMV IE
Ψ
RRE
cPPT
PPGK
PuroR
WPRE
3' LTR
MCS
tTA
바이러스 생산을 극대화할 수 있도록 최적화된 비율로 섞
여 있다.
Xfect
transfection
Tetracycline Transactivation
Lenti-X HTX
Packaging Mix
Tetracycline-responsive promoter elements(TREs)를 이
용한 Tet-Off 전사촉진에 의해 렌티바이러스 패키징에 핵심
Lenti-X 293T cells
구성요소가 고발현 된다.
최적화된 트랜스펙션
나노 입자 기반의 트랜스펙션 시약인 Xfect (제품 내 포함)
를 사용하여 Lenti-X 293T 세포에 최대 95%이상의 트랜스
1. Collect virus after 48 hr
2. Transduce host cells
펙션 효율을 가능하게 한다.
특화된 Lenti-X 293T 세포주
높은 트랜스펙션 효율을 가능하게 하는 최적화된 세포주로 렌티바이러스의 생산을 극대화한다.
쉽고 간편한 인스턴트 역가 측정
System 제품에 포함된 Lenti-X GoStix을 이용하면 30초~10분 이내 렌티바이러스의 역가가 충분한지, 아닌지 확인할 수 있다. 역가가 충분하지
않다면 Lenti-X Concentrator를 이용하여 농축할 수 있으며, 이때도 Lenti-X GoStix을 이용하면 렌티바이러스의 회수 타이밍을 판단하기 쉽다.
Lenti-X Vector와 LentiX HTX Packaging System을 함께 이용하면 105~106 IFU/㎖의 재조합 렌티바이러스를 얻을 수 있으며, 녹색 형광 단백질
인 AcGFP1 또는 ZsGreen1과 적색 형광을 발현하는 DsRed, mCherry 또는 tdTomtao 등의 형광을 동시에 발현할 수 있는 다양한 fluorescent
protein vector도 판매하고 있다.
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H T X
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고역가의 4세대 렌티바이러스 패키징 시스템
Lenti-X™ HTX Packaging System (Code 631247, 20회/ 631249,60회)
◦ 고역가의 렌티바이러스 제작을 가능하게 하는 패키징 시스템
◦ Pantropic (VSV-G)와 Ecotropic(gp70)의 2 종류 시스템 보유
◦ 바이러스 제작 필수 구성품 포함 : Packaging Mix, Transfection 시약,
Tet System Approved FBS, 간이 역가 측정 시약
Lenti-X HTX Packaging Mix는 렌티바이러스 패키징 필수 구성 유전자가 최적의 비율
로 포함되어 바이러스 생산을 극대화하며, 또한 이 구성요소들이 각각의 분리된 vector로
되어 있어 바이러스 자가 복제 가능성을 효과적으로 억제하여 안정성을 확보했다. 제품내
포함된 Lenti-X GoStix을 이용하면 10분이내에 간편하게 바이러스 역가 판단을 통해 바
이러스 회수의 최적 시점을 신속하게 확인할 수 있다.
Genome으로 삽입되지 않는 Integrase가 결핍된 렌티바이러스 제작
Lenti-X™ HTX Packaging System (Integrase Deficient) (Code 631258, 20회)
◦ 비분열 세포에서 안정적 발현, 분열 세포에서는 일시 발현에 적용
◦ 대부분의 세포에 적용시킬 수 있는 VSV-G pseudotype, 기존 렌티바이러스 벡터와 함께 사용 가능
◦ 숙주 게놈으로 삽입 우려없이 효과적으로 유전자 도입 가능, mutagenesis 발생 위험 감소
◦ 고역가의 렌티바이러스 생산 가능
Lenti-X Packaging System 비교
Lenti-X™ HTX Packaging System
Lenti-X™ HTX Ecotropic Packaging System
(631247, 20회/ 631249, 60회)
(631251, 20회)
광범위한 세포에 적용 가능
Pantropic VSV-G viral envelope protein의
렌티바이러스 생산
Mouse나 rat 세포에 효과적 적용
MLV ecotropic envelope glycoprotein: gp70을
가진 렌티바이러스 생산
Lenti-X™ HTX Packaging System
(Integrase Deficient) (631258, 20회)
Genome으로 삽입되지 않는 pantropic VSV-G
viral envelope protein의 렌티바이러스 생산
높은 형질전환 능력과 고역가의 바이러스 생산
Lenti-X™ 293T Cell Line (Code 632180, 1ml)
◦ 고역가 재조합 렌티바이러스의 생산을 가능하게 하는 렌티바이러스 패키징용 세포주
Lenti-X 293T 세포주는 HEK 293T 세포로부터 SV40 Large T Antigen을 고발현하는 세포주 중 더 높은 형질전환 능력과 더 높은 바이러스 역가를 얻을
수 있는 세포주를 선별하여 제작된 세포이다(그 외 adenovirus E1A 단백질을 발현한다).
[A]
[B]
Titer（IFU/ml）
109
6배이상
6倍以上
108
30배이상
30倍以上
107
Lenti-X 293T
HEK 293
293FT
유전자 도입 48시간 후의 HUVEC 세포
[A] Lenti-X 293T 세포주를 일반적인 세포주와 비교 결과 293FT세포 대비 6배 이상, wild type의 HEK 293 세포 대비 30배 이상의 고역가 바이러스를 생산하였다.
[B] pLVX-AcGFP1-C1 vector에 Cdt1 유전자를 클로닝하여 Lenti-X HTX Packaging System과 Lenti-X 293T세포주를 이용하여 재조합 렌티바이러스 조제
바이러스 (역가: 3.6 x 109 copies/ml의 RNA titer)의 상청액 150 ㎕를 HUVEC세포에 도입하였다. 도입 후 48시간 후 형광현미경으로 Cdt1과 융합 발현한 AcGFP1을 확인할 수
있었다.
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O P T03I /M04 I Z E D
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최적화된 Lenti-X™ Vector와 발현 시스템
Lentiviral
vector의
핵심
부분
Core
lentiviral
vector
backbone
cPPT
RRE /CTS
5' LTR
WPRE
:
3' LTR
Vector-specific elements
Constitutive cDNA Expression
Tetracycline-Inducible Expression
CMV promoter를 이용해 목적유전자를 발현시키고 항생제 마커를 활용해 렌티바이러스가 integration
된 세포를 선별한다.
Tet-On 3G나 Tet-Express vector system을 사용하면 정밀하고 높은 유전자 유도발현을 가능하게 한다.
pLVX-Tet3G
PCMV IE
MCS
pLVX-Puro*
PPGK
PCMV IE
Puror
Tet-On 3G
IRES
Neor
MCS
pLVX-TRE3G
PTRE3GV
EF-1 Alpha Promoter
PPGK
Puror
EF-1 α promoter를 이용하면 조혈모세포나 줄기세포와 같은 세포에서 CMV promoter 사용시 나타나
는 silencing을 극복하고 목적유전자를 발현시킬 수 있다.
shRNA Expression
PEF1B
MCS
pLVX-EF1B-IRES-Puro*
U6 promoter 뒤쪽으로 목적 shRNA 서열을 클로닝하면 트랜스펙션 시키기 어려운 세포에서도 유전자
발현을 knockdown시킬 수 있다.
Puror
IRES
IRES
PU6
FP
PPGK
Puror
PCMV IE
ZsGreen1
pLVX-shRNA2**
FP = fluorescent protein (mCherry or ZsGreen1)
PU6
MCS
MCS
PEF1B
MCS
pLVX-shRNA1*
pLVX-EF1B-IRES-FP**
PEF1B
MCS
pLVX-EF1B-FP-N1**
PPGK
FP
Puror
ProteoTuner™ Protein Control
PPGK
Puror
FP = fluorescent protein (AcGFP1, DsRed-Monomer, or mCherry)
ProteoTuner destabilization domain(DD) 뒤쪽에 목적 유전자를 클로닝하면 리간드ligand인 Shield1을
이용하여 목적유전자의 안정화를 조절할 수 있다. Shield1은 소분자 리간드로 DD와 융합된 단백질이
proteosomal degradation되는 것을 방지하여 “protein on”으로 세포에 축적되도록 한다.
pLVX-PTuner**
PCMV IE
Bicistronic Expression
IRES
Puror
IRES
ZsGreen1
pLVX-PTuner Green**
MCS
IRES
MCS
IRES가 포함된 렌티바이러스 vector를 이용하면 하나의 전사산물에서 목적유전자와 또 하나의 유전자
(항생제 내성 유전자 또는 형광발현 유전자)를 공발현시킬 수 있다.
pLVX-IRES-Puro/Neo/Hyg*
PCMV IE
DD
MCS
FP
MCS
PEF1B
MCS
pLVX-EF1B-FP-C1**
IRES
Puror
PCMV IE
DD
Neo/Hyg
Promoter Reporters
pLVX-IRES-FP*
형광단백질이나 분비형 luciferase를 발현시키는 리포터시스템을 사용하여 promoter의 활성을 모니
터 할 수 있다.
FP
pLVX-MetLuc*
MCS
FP = fluorescent protein (mCherry, tdTomato, or ZsGreen1)
MCS
PPGK
Puror
PCMV IE
FP
MCS
pLVX-FP-C1**
PPGK
DD
FP
Promoter DD
특징
FP
FP = :fluorescent
protein 항상
(AmCyan1,
ZsGreen1,
or tdTomato)
•CMV
도입한 유전자를
안정하게
발현한다
•EF-1α : 다른 promoter(CMV 등)로 발현이 낮거나, 줄기세포와 같이 promoter가
silencing이 되는 경우 유용하다.
※ PGK promoter의 하류에 항생제 내성 유전자(neo, hyg, puro 내성)가 포함되어 있어 stable cell
line 선별에 이용할 수 있다.
Puror
FP = fluorescent protein (AcGFP1, AmCyan1, DsRed-Express2,
DsRed-Monomer, mCherry, tdTomato, or ZsGreen1)
* Vector는 system 구성품으로만 판매된다.
** Vector는 별도 구매 가능하다.
MCS
다양한 형광단백질(FP) 중 하나가 MCS의 N-말단 또는 C-말단에 클로닝 되어있어 목적 유전자가 단
백질로 발현되고 세포내 위치하는 것을 모니터 할 수 있게 한다.
pLVX-FP-N1**
FP
MetLuc
FP = fluorescent
protein (AmCyan1, ZsGreen1, or tdTomato)
*
pLVX-DD-FP
Fluorescent Protein Expression
PCMV IE
pLVX-DD-FP*
MCS
PCMV IE
형광단백질의 특징
•AcGFP1(monomer) : 목적단백질과의 융합 발현에 적합하다.
•ZsGreen1(Tetramer) : 유전자 도입효율을 모니터하는 리포터 발현에 적합하다.
(IRES서열에 의해 목적유전자와 별도로 각각 번역된다)
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Q U I C K
&
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빠르고 간편한 렌티바이러스 역가 측정
qPCR법을 활용한 역가 측정
TM
Lenti-X
qRT-PCR Titeration Kit (Code 631235, 200회)
◦ 4시간만에 렌티바이러스의 역가(RNA 역가) 측정 가능
◦ 정확한 역가 측정을 통해 일정한(재현성있는) 바이러스 감염 실험 가능
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit을 이용하면 RNA를 정제하여 SYBR Green I법을 이용한 One-Step qRT-PCR을 통해 4시간만에 렌티바이러스
의 역가를 측정 할 수 있다. 검량선standard curve 작성을 위한 control RNA는 제품에 포함되어 있다. 또한 FACS나 콜로니 선별 등을 통해 바이러스의 생
물학적 역가(IFU/ml)와 RNA 역가(copies/ml)와의 상관관계(copies/IFU)를 계산해 두면, RNA의 역가를 통해 2시간만에 생물학적 역가를 추정하여
MOI(Multiplicity of Infection)를 결정할 수 있다.
바이러스 상청액
회수
바이러스 RNA
를 정제한 후
DNaseI 처리
qRT-PCR
데이터분석
ELISA법을 활용하여 역가 측정
TM
Lenti-X
p24 Rapid Titer Kit (Code 632200, 96회)
操作手順
◦ 배양 상청 중의 렌티바이러스의 역가 측정
Streptavidin HRP
◦ 간편한 ELISA법 기반의 역가 측정 방법
Anti-p24 (biotinylated)
/HQWLYLUDOS
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit은 바이러스 상청액을 이용하여 capsid에 존재
Anti-p24-coated well
바이러스
상청액
ウイルス上清を
回収
회수
하는 p24 단백질 양을 측정하여 렌티바이러스의 역가를 계산하는 제품이다.
현재 연구용으로 사용되는 3세대와 4세대 재조합 렌티바이러스는 capsid
protein(p24)를 발현시키는 gag 유전자를 유지하고 있어 적용 가능하다.
Anti-p24 Coated Plate
10분 이내 역가가 충분한지 확인 가능
TM
TM
Lenti-X
GoStix
(Code 631243, 20회/ 631244, 50회/ 631241, 200회)
◦ 30초~10분 이내에 렌티바이러스의 역가 판단
◦ 바이러스 회수 최적 타이밍 판단
操作手順
20 µl
C
上清を20
µl μl
サンプリ
ング
상청액 20
샘플링
T
S
C
T
Chase Buffer 1を4滴添加
Chase Buffer 4방울 첨가
30秒∼10分
-
C
+
C
T
T
S
S
렌티바이러스의 역가
가 회수/정제에 적합
한 경우 test band(T)
가 명료하게 나타난
다.
＞5×105 IFU/ml
Test band의 유무 확인
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렌티바이러스 농축 시약
Lenti-X™ Concentrator (Code 631231,100 ml/ 631232, 500ml)
4 x Lenti-X
4×Lenti‐X
Concentrator 첨가
Concentratorを添加
◦ Ultracentrifugation 불필요 - 최대 100배까지
농축 가능, ~ 90% 회수율
◦ 짧고 간편한 프로토콜 - 30분 ~ O/N incubation 후
1500 x g에서 45분 원심분리
4℃で30分∼
4℃, 30분~O/N
一晩
incubation
インキュベート
pellet를
ペレ
ットを元の
원래
volume의
1/10∼1/100
1/10~1/100에
容量に再懸濁
현탁
1500x ×
1500
g, g、
4℃,
4℃で45分間
45분간
遠心分離
원심분리
• Store at ‒80°
C
• Titrate
• Infect targets
렌티바이러스 정제를 통해 오염물질 제거
Lenti-X™ Maxi Purification Kit (Code 631233, 2 preps/ 631234, 5 preps)
◦ Gravity column 방식으로 렌티바이러스 입자 손상 방지
◦ 세포 오염물 제거로 transduction 효율 높임
◦ 최대 10배까지 농축 효과와 60 ~ 80 % 회수율
(실린지 필터 방식보다 virus 손상 없이 효과적으로 회수)
Bind
Wash
Elute
Polybrene 없이 신속하고 효과적인 Transduction
Lenti-X™ Accelerator (Code 631256, 400 μl)
◦ Magnetic bead를 활용한 방법으로 lentivirus와 MMLV retrovirus 적용 가능
◦ 5분만에 효과적으로 transduction하기 때문에 민감한 세포
(예: 줄기세포, 조혈모 세포)에 이상적
100
2,500
Positive cells
Positive cells (%)
2,000
60
1,500
40
1,000
20
500
Mean fluorescent intensity (MFI)
80
MFI
0
0
Negative
control
Lentivirus +
Polybrene
5 min
Lentivirus +
Lentivirus +
Lenti-X Accelerator Polybrene O/N
5 min
Lenti-X Accelerator (25 min)
와 Polybrene (16 h)을 이용한
transduction 효율 비교
렌티바이러스의 감염 효율 향상
RetroNectin
(Code T100A, 0.5 ㎎ / T100B, 2.5 ㎎)
◦ 렌티바이러스나 레트로바이러스를 이용한 transduction 효과 향상
Target cell
◦ Jurkat cell이나 조혈모세포에 유전자 도입시 특히 유용
Viral receptor
RetroNectin은 3종류의 fibronectin 기능성 도메인을 포함한 재조합 단백질로,
culture plate에 코팅을 함으로써 렌티바이러스나 레트로바이러스를 이용한 포유류
세포로의 유전자 도입시 효율을 크게 향상시킬 수 있다.
LV
RetroNectin
Heparin binding domain
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삽입된 렌티바이러스의 카피수를 신속하게 측정
Lenti-X™ Provirus Quantitation Kit (Code 631239, 200회)
◦ Transduction된 세포로부터 integrated lentivirus (provirus)의 카피수를 측정
◦ 실험 조건이나 세포 종류가 달라져도 형질전환시의 감염력을 일정하게 유지하기 위해 사용
렌티바이러스를 감염시킨 세포의 genomic DNA 중에 삽입된 렌티바이러스
Integrated proviruses
組み込まれたプロウイルス
(provirus)의 카피수를 신속하게 측정하
기 위한 제품이다. 프로바이러스 카피수
측정을 통해 바이러스의 실제 유효한 역
가(예: 효과적인 역가)를 확인하고 정확한
Primers, SYBR
MOI(multiplicity of infection)로 타겟 세포
에 감염이 가능해진다.
6
6
感染さ
1x10せた1×10
형질전환된個の
細胞を回収
세포 회수
NucleoSpinで
genomic
DNA 정제
ゲノムDNAを精製
qPCR
수행
qPCR
재조합 바이러스 발현계 비교
Clontech에서는 본 자료에서 소개한 lentivirus 발현 시스템 이외에 retrovirus나 adenovirus를 이용한 시스템을 제공하고 있다.
Lentivirus 발현계
Retrovirus 발현계
Adenovirus 발현계
Cell Lines (Dividing)
○
○
○
Primary Cultures (Dividing)
○
○
○
Target Cell Type
Primary Cultures (Nondividing)
○
○
Neurons
○
○
Stem Cells
Hematopoietic Cells
in vivo
○
○
○
○ (RetroNectin추천)
○ (RetroNectin추천)
-
○
–
○
○
○
(※ 1)
△(※ 2)
–
○
Transgene Expression
Stable
Transient
Tet-inducible Expression System
○
○
○
shRNA/RNAi
○
○
○
Bicistronic /Dual Expression
○
○
–
Fluorescent Protein Vectors
○
○
–
○
○
◎
Expression Feature
High Titers
Expression Levels
○
○
◎
Safe, Replication-Incompetent
○
○
○
Broadly Tropic
○
○
○
Vector Long-Term Stability/Storage
–
–
○
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit
Lenti-X GoStix
Lenti-X Provirus Quantitation Kit
Retro-X qRT-PCR Titration Kit
Adeno-X qPCR Titration Kit
Adeno-X Rapid Titer Kit
Lenti-X Maxi Purification Kit
–
Adeno-X Maxi Purification Kit
Lenti-X Concentrator
Retro-X Concentrator
–
Lenti-X Accelerator
RetroNectin
Lenti-X Accelerator
RetroNectin
–
Related products
Titration Kit
Purification Kit
Concentrator Reagent
Transduction
(※1)：비분열 세포에서는 안정 발현
(※2) : Clontech의 Lenti-X HTX Packaging System (Integrase Deficient)으로 제작된 lentivirus 사용시 적용 가능
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Lentiviral Vector, Packaging & Transduction Tool 제품리스트
Code
제품명
용량
Lentiviral Packaging Systems
631247/631249
Lenti-X HTX Packaging System
631251
Lenti-X HTX Ecotropic Packaging System
20 회/60 회
20 회
631258
Lenti-X HTX Packaging System(Integrase Deficient)
20 회
632180
Lenti-X 293T Cell Line
1 ml
Lentiviral Vector Systems (추가 정보는 www.takara.co.kr 또는 www.clontech.com 에서 확인 바람)
632164*
Lenti-X Expression System
each
CMV Promoter
631253*
Lenti-X Expression System (EF1alpha)
each
EF-1α promoter
632182*
Lenti-X Bicistronic Expression System (Hyg)
each
632181*
Lenti-X Bicistronic Expression System (Neo)
each
632183*
Lenti-X Bicistronic Expression System (Puro)
each
631187*
Lenti-X Tet-On 3G Inducible Expression System
each
631189*
Lenti-X Tet-Express Inducible Expression System
each
632177*
Lenti-X shRNA Expression System
each
632179
pLVX-shRNA2 Vector
10 μg
632154/(632155)
pLVX-AcGFP1-N1/(C1) Vector
10 μg
632558/(632557)
pLVX-AmCyan1-N1/(C1) Vector
10 μg
632560/(632559)
pLVX-DsRed-Express2-N1/(C1) Vector
10 μg
632152/(632153)
pLVX-DsRed-Monomer-N1/(C1) Vector
10 μg
632562/(632561)
pLVX-mCherry-N1/(C1) Vector
10 μg
632563/(632564)
pLVX-tdTomato-N1/(C1) Vector
10 μg
632565/(632566)
pLVX-ZsGreen1-N1/(C1) Vector
10 μg
631983/(631984)
pLVX-EF1alpha-AcGFP1-N1/(C1) Vector
10 μg
EF-1α promoter
631990/(631989)
pLVX-EF1alpha-DsRed-Monomer-N1/(C1) Vector
10 μg
EF-1α promoter
631987
pLVX-EF1alpha-IRES-mCherry Vector
10 μg
EF-1α promoter
631982
pLVX-EF1alpha-IRES-ZsGreen1 Vector
10 μg
EF-1α promoter
631986/(631985)
pLVX-EF1alpha-mCherry-N1/(C1) Vector
10 μg
EF-1α promoter
631237
pLVX-IRES-mCherry Vector
20 μg
631238
pLVX-IRES-tdTomato Vector
20 μg
632187
pLVX-IRES-ZsGreen1
10 μg
Lentiviral Transduction Tools
631231/631232
Lenti-X Concentrator
100 ml/ 500 ml
631233/631234
Lenti-X Maxi Purification Kit
631245
Lenti-X Maxi Purification Kit (with Rack)
2 preps/ 5 preps
631243/631244
Lenti-X GoStix
632200
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit
631235
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit
200 회
631239
Lenti-X Provirus Quantitation Kit
200 회
631254
Lenti-X Accelerator Starter Kit
631256/631257
Lenti-X Accelerator
T110A
RetroNectin Precoated Dish
T100A/T100B
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment
5 preps
20 회/ 50 회
96 회
96 회
400 μl/ 1,000 μl
10 dishes
0.5 mg/2.5 mg
Transfection Reagent
631317/631318
Transfection Reagent Xfect
100회/300회
Note: C-terminal fusion vector는 괄호안에 제품 코드를 표기하였다. 별표 (*)가 표기된 제품은 Lenti-X HTX Packaging System (20 회)을 포함한다.
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