신혈관성 고혈압 흰쥐 신장에서 Na, K
대한내과학회지: 제 78 권 제 4 호 2010 원저 09-290 신혈관성 고혈압 흰쥐 신장에서 Na, K-ATPase 단백 발현 감소 전남대학교 의과대학 1내과학교실, 2생리학교실 마성권1·오윤화2·김인진2·배은희1·이종은2·김수완1 Decreased expression of Na,K-ATPase in the kidneys of rats with two-kidney, one-clip hypertension Seong Kwon Ma, M.D.1, Yoon Wha Oh, Ph.D.2, In Jin Kim, M.S.2, 1 2 1 Eun Hui Bae, M.D. , Jong Un Lee, M.D. , and Soo Wan Kim, M.D. Departments of 1Internal Medicine and 2Physiology, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea Background/Aims: This study investigated the role of Na,K-ATPase, the local renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS), and atrial natriuretic peptide (ANP) system in the pathogenesis of renal tubular dysfunction and hypertension in rats with two-kidney, one-clip (2K1C) hypertension. Methods: Adult male Sprague-Dawley rats were made 2K1C hypertensive for 4 weeks. The renal expression of Na,K-ATPase was determined by immunoblotting. The mRNA expression of renin, angiotensin-converting enzyme (ACE), aldosterone synthase (CYP11B2), mineralocorticoid receptor (MR), and the ANP system were determined in the kidney using real-time polymerase chain reaction. Results: The blood pressure was increased in the 2K1C rats, compared with controls. The plasma renin activity and serum aldosterone concentrations were increased, as were the urine output and fractional excretion of sodium. The expression of Na,K-ATPase protein was decreased in the clipped kidney, as compared with the control kidney, while it remained unchanged in the contralateral kidney. The mRNA expression of renin, ACE1, CYP11B2, and MR was increased in the clipped kidney, but unchanged in the non-clipped kidney. The mRNA expression of ACE2 did not differ between the groups. The expression of ANP mRNA was increased in both clipped and non-clipped kidneys, as compared with control kidneys. Conclusions: The enhanced activity of the local RAAS may result in to ischemic tubular injury and the development of hypertension in 2K1C rats. The downregulation of Na,K-ATPase associated with tubular injury in the clipped kidney may account for the impaired tubular sodium reabsorption in 2K1C hypertension. (Korean J Med 78:477-484, 2010) Key Words: Renovascular hypertension; Na,K-ATPase; Aldosterone synthase; Atrial natriuretic peptide ∙Received: 2009. 9. 17 ∙Accepted: 2009. 11. 5 ∙Correspondence to Soo Wan Kim, M.D., Department of Internal Medicine, Chonnam National University Medical School, 8 Hak-dong, Gwangju 501-757, Korea E-mail: [email protected] * This work was supported by the grant from Korean Association of Internal Medicine (2006). - 477 - － The Korean Journal of Medicine: Vol. 78, No. 4, 2010 － 서 론 륨 재흡수를 감소시켜 나트륨 이뇨와 수분 이뇨를 일으키며, 15-17) 고혈압의 병인에도 관련되어 있다 신혈관성 고혈압은 신장혈관의 폐색에 의하여 발생하는 . 그러나 신혈관성 고혈 압에서 ANP계의 역할에 대하여는 정립되어 있지 않다18-20). 고혈압으로, 2차성 고혈압의 주요한 형태이며, 레닌-안지오텐 과거 전형적인 내분비계로서의 RAAS의 개념으로 마지막 신-알도스테론계(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS) 작용물질인 angiotensin II와 aldosterone은 여러 조직에 작용 의 활성 증가가 주된 병인으로 알려져 있다. 즉, 신장으로의 하여 혈관수축 및 염분과 수분 항상성 등에 관여하는 것으 혈류 감소로 인하여 RAAS가 활성화되고, 이로 인하여 혈중 로 알려져 왔다. 또한, 최근에 angiotgensin-converting enzyme angiotension II가 증가되어, 혈관 수축 및 말초 저항성이 증 2 (ACE2)와 aldosterone synthase (CYP11B2)의 발견으로 인하 1,2) 가되어 고혈압이 발생한다 . 그러나 angiotension II는 혈관 여 RAAS의 새로운 기능이 알려지게 되었다. ACE2는 angio- 수축을 통한 혈압상승작용 외에도 체액평형상태 조절에 중 tensin I과 angiotensin II를 분해하여 Ang-(1-7)을 생성시키고, 요한 역할을 하며, 신장혈관의 폐색이 발생한 신장에서 허혈 이는 angiotensin II의 생리적 작용과 상반되는 효과를 나타낸 성 손상이 발생하므로, 신혈관성 고혈압에서 신장 세뇨관의 다21,22). CYP11B2는 aldosterone을 합성하는 효소로서 주로 부 기능 장애가 동반되었을 것으로 사료된다. 이전의 보고들에 신에 존재하는 것으로 알려져 있으나, 최근에 이 효소가 신 의하면, 신혈관성 고혈압에서 체내의 수분 및 나트륨 평형상 사구체에서 발현되며, 국소적으로 aldosterone을 합성할 수 3,4) 태의 변조가 발생하며 소변량이 증가함이 보고되었으며 , 있음이 보고되었다23). 따라서 신장에서도 심장에서와 비슷 혈관 폐쇄가 발생한 신장의 aquaporin (AQP) 수분 통로의 발 한 기전으로 사구체경화 및 이로 인한 고혈압의 발생 병인 5) 현 감소가 다뇨 및 요 농축력 장애의 기전으로 제시되었다 . 으로 작용할 가능성을 시사한다. 또한 고혈압에 동반되는 흔 신장 세뇨관을 통한 체액의 재흡수는 세뇨관에 분포하는 한 신장 손상인 고혈압성 사구체경화의 병인으로 작용할 가 나트륨 수송체 및 AQP 수분 통로에 의하여 이루어지며, 고 능성이 있다. 본 연구는 two-kidney, one-clip (2K1C) 신혈관성 고혈압을 혈압 및 허혈성 손상 등의 체액 조절 장애를 수반하는 여러 6,7) 질환들에서 이의 기능 변조가 보고되었다 . 세뇨관에서의 유발시킨 흰쥐에서 고혈압과 더불어 신장의 Na,K-ATPase 나트륨 재흡수는 두 가지 단계의 기전에 의해 이루어지는데 단백 및 NP계의 변화가 동반되는지를 조사하였다. 또한, 신 첫 번째 과정은 세뇨관 상피세포의 기저외측막에서 Na,K- 장의 국소 RAAS의 변화 여부를 조사하였다. ATPase 작동에 의한 나트륨의 능동적 수송이며, 이어서 내 강측막의 다른 나트륨 공동수송체를 통한 수동적 이동이 일 대상 및 방법 8,9) 어나게 된다 . 이러한 과정을 통하여 나트륨이 재흡수되면 1. 실험재료 및 신장 기능 측정 서 삼투압 경사가 발생하고, 이로 인하여 수분이 재흡수된 다. 수분의 재흡수는 삼투압 경사에 의해 열리는 AQP 수분 10) 실험재료는 체중 200~250 g된 Sprague-Dawley 숫쥐를 사 통로 단백을 통하여 이루어진다 . 즉, Na,K-ATPase가 효율 용하였다. 전체 실험과정은 전남대학교 의과대학 실험동물 적으로 작동하는 것이 체액 조절에 일차적으로 중요한 역할 사용 윤리 규정을 준수하였다. 2K1C 고혈압을 유발하기 위 을 하며, 이의 조절에 angiotensin II, aldosterone 등의 RAAS 하여 ketamine (50 mg/kg, i.p.) 마취 후, 왼쪽 신동맥에 0.25 11-13) 가 관련되어 있음이 보고되었다 . 신혈관성 고혈압에서도 mm 내경의 silver clip을 끼웠다. 대조군은 실험군과 동일한 Na,K-ATPase의 효소 활성도의 변조가 발생함이 보고되었으 방법으로 처리하였으나, 클립을 끼우지 않았다. 4주일 후에 14) 나 , 이의 조절 기전 및 구체적인 양상에 대하여는 잘 알려 tail-cuff 방법을 이용하여 수축기 혈압을 측정하였으며, 마취 져 있지 않다. 하지 않은 상태에서 단두하여 혈액을 채취한 후 신속히 신 신장의 나트륨 배설 및 혈압 조절 기능은 여러 전신 및 국 장을 분리하고 액체질소로 얼려 사용할 때까지 -80℃에서 소 호르몬들에 의하여 조절되는데, 특히 나트륨이뇨호르몬 보관하였다. 동물들을 대사 상자에 넣고 유지하면서 소변을 (natriuretic peptide, NP)계가 중요한 역할을 한다. 신장은 이 채집하여 요량, 크레아티닌, 나트륨을 측정하였으며, 실험 러한 NP의 중요한 작용부위인 동시에 합성장소로 알려져 있 당일 단두하여 채취한 혈액에서 혈장 크레아티닌, 나트륨을 으며, 신장에서 심방나트륨이뇨호르몬(atrial natriuretic pep- 측정하였다. 또한, 혈장 renin 활성도 및 혈청 aldosterone을 tide, ANP)는 사구체 여과율을 증가시키거나 세뇨관의 나트 측정하였다. 혈장 크레아티닌은 Jaffe method에 의하여 측정 - 478 - － Seong Kwon Ma, et al. Renal expression of Na, K-ATPase in 2K1C hypertension － 하였으며(AU5431, Olympus, Tokyo, Japan), 크레아티닌 청소 sity 값을 이용하여 정량화하였다. cDNA는 총 RNA 5 µg을 율(creatinine clearance)은 다음과 같은 공식에 의하여 계산하 oligo (dT) priming과 superscript reverse transcriptase II (Invi- 였다. trogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 역전사시켜서 만들었 으며, Smart Cycler II system (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) 을 이용하여 증폭시키고, SYBR Green으로 확인하였다. CCr = UCr×UV/PCr 각각의 PCR 반응은 10 μM forward primer, 10 μM reverse (CCr, creatinine clearance; UCr, urine creatinine concentration; primer, 2×SYBR Green Premix Ex Taq (Takara Bio Inc., Shiga, UV, urine volume; PCr, plasma creatinine concentration) Japan), 0.5 μL cDNA와 멸균증류수를 포함하는 최종 20 μL 2. Western blot 분석 의 혼합물로 시행하였으며, PCR Rotor-GeneTM 3000 Detecter 신장 조직을 250 mmol/L sucrose, 1 mmol/L EDTA, 0.1 System (Corbette Research, Mortlake, New South Wales, mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)와 10 mM Tris-HCl Australia)를 사용하였다. 실험에 사용한 primer들은 표 1에 buffer가 함유된 pH 7.6 용액에 넣고 3,000 rpm으로 균질화하 기술하였다. PCR 반응 후에는 온도를 60℃에서 95℃로 증가 였다. 큰 조직 조각과 핵질 파편을 1,000×g, 15분 저속 회전 시켜 얻어진 해리 곡선을 확인하였다. 각각의 PCR 수행 시 으로 제거하였다. 단백 표본은 12.5% polyacrylamide resolv- 에는 cDNA가 포함되지 않은 음성 대조군도 함께 시행하였 ing gel과 5% polyacrylamide stacking gel로 구성된 불연속계 다. 2-⊿⊿TC을 이용한 상대 정량법으로 각각의 PCR 산물을 에서 전기영동하여 크기에 따라 분리하였다. 분리된 단백은 비교하였으며, 결과는 GAPDH mRNA 발현으로 보정하여 표 40 V로 3시간 동안 전기영동법으로 nitrocellulose 막으로 이 25) 시하였다 . 동시켰다. 막을 0.1% Tween-20을 함유한 Tris-based saline buffer [TBST (Amresco, Solon, OH, USA), pH 7.4]로 세척한 후 비특이적 결합을 방지하기 위해 5% 탈지분유(NFM)를 포 함한 TBST (NFM/TBST)에서 1시간 동안 반응시켰다. Nitrocellulose 막을 다시 0.2% NFM/TBST 용액에 넣고 anti-mouse monoclonal Na,K-ATPase α1 subunit (1:1,000, provided by Dr. DM Fambrough, Johns Hopkins University Medical School)24)를 첨가하여 2~3시간 동안 실온에서 반응시켰다. 발광체를 붙 Table 1. The primers used in the polymerase chain reactions Primers Sequences GAPDH sense: ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCTG antisense: CAGGTTTCTCCAGGCGGCATGTCAG Renin sense: AGGCAGTGACCCTCAACACCAG antisense: CCAGTATGCAGGTCGTTCCT ACE1 sense: GCCTCCCCAACAAGACTGCCA antisense: CCACATGTCTCCCCAGCAGATG ACE2 sense: GGAGAATGCCCAAAAGATGA antisense: CGTCCAATCCTGGTTCAAGT 이기 위해 막을 2% NFM/TBST 용액에 넣고 2차 항체[horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG (1:1,000)]를 첨가 하여 1시간 동안 반응시켰다. 고정된 항체는 enhanced chemiluminescence [ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chal- CYP11B2 sense: TGAGACGTGGTGTGTTCTTGC antisense: GGCCTCCAAGAAGTCCCTTGC font, UK)]으로 photographic film (Hyperfilm ECL, Amersham MR sense: TGGATGTGTCTATCATCGTT antisense: GGTCCTTCGTAGGCATAGA ANP sense: GGGGGTAGGATTGACAGGATT antisense: TCCGTGGTGCTGAAGTTTATT NPR‐A sense: AAGAGCCTGATAATCCTGAGTACT antisense: TTGCAGGCTGGGTCCTCATTGTCA 3. Real-time polymerase chain reaction (PCR) NPR‐C sense: CGAGGTGCTTGTGCTATTGC antisense: GCGAGTACTCCGTGTCCTTG 신장 피질 조직에 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; ACE1, angiotensin-converting enzyme 1; ACE2, angiotensin-converting enzyme 2; CYP11B2, aldosterone synthase; MR, mineralocorticoid receptor; ANP, atrial natriuretic peptide; NPR-A, natriuretic peptide receptor-A; NPR-C, natriuretic peptide receptor-C. Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)에서 탐지하였다. 상대 적 단백량은 자가방사법(autoradiograms)으로 도출된 신호를 transmitter scanning videodensitometer (Bioneer, Cheongwon, Korea)로 분석하여 측정하였다. USA)를 첨가하여 균질화하였다. 여기에 chloroform을 첨가 하여 RNA를 추출하고, isopropanol을 첨가하여 침전시켰다. RNA 침전물은 75% ethanol로 세척한 후 증류수로 희석하였 다. 분리된 RNA의 농도는 260 mm에서 측정된 optical den- 479 - － 대한내과학회지: 제 78 권 제 4 호 통권 제 596 호 2010 － Table 2. Changes in blood pressure and renal functional parameters 무게가 감소하였으며, 실험군의 클립을 끼우지 않은 우측 신 장의 무게는 대조군의 우측 신장에 비하여 증가하였다. 사구 Control (n=8) 2K1C (n=10) Body weight (g) 347.5±3.1 325.0±7.8* Right kidney (g) 1.25±0.02 1.80±0.08* Left kidney (g) 1.24±0.03 0.90±0.05* Systolic blood pressure (mmHg) 121.8±3.9 173.6±7.6* Plasma renin activity (ng/mL/h) 35.4±5.0 92.3±8.1* Serum aldosterone (ng/dL) 7.3±2.3 81.7±29.0* Creatinine clearance (mL/min) 1.63±0.13 1.55±0.08 대쪽 신장에서는 클립 신장에 비하여 단백 발현이 증가하였 Urine output (mL/day) 13.6±1.2 19.0±2.0* 고, 대조군과는 유의한 차이가 없었다(그림 1). FENa (%) 0.32±0.08 체 여과율은 양 군 간 차이가 없었으나, 실험군에서 소변량 및 나트륨 분획 배설이 유의하게 증가하였다. 2. Na,K-ATPase 단백 발현 Na,K-ATPase α1 subunit의 단백 발현을 신장의 피질 및 외 수질에서 조사하였다. 클립 신장의 단백 발현이 대조군에 비 하여 유의하게 감소하였다. 클립을 끼우지 않은 실험군의 반 * 0.61±0.10 3. 레닌-안지오텐신-알도스테론계의 mRNA 발현 * Values are the mean±SEM. p<0.05 vs. control. 2K1C, two-kidney, one-clip; FENa, fractional sodium excretion. 신장 조직의 renin 및 ACE1의 mRNA 발현은 실험군의 클 립 신장에서 대조군에 비하여 증가하였고, 클립을 끼우지 않 4. 통계 분석 은 반대쪽 신장에서는 클립 신장에 비하여 감소하였다. 반대 실험 결과는 평균±표준오차로 표시하였으며, 실험군 간 쪽 신장과 대조군 사이에는 발현의 차이가 없었다. ACE2 차이에 대한 통계적 유의성 분석은 ANOVA 또는 비쌍체 t- mRNA 발현은 대조군, 클립 신장 및 반대쪽 신장 조직에서 검정법을 사용하였다. 모두 유의한 차이가 없었다(그림 2). CYP11B2 및 mineralocorticoid receptor (MR)의 mRNA 발현 역시 클립 신장에서 결 대조군에 비하여 유의하게 증가하였으며, 반대쪽 신장과 대 과 조군 사이에는 발현의 차이가 없었다(그림 3). 1. 혈압 및 신장기능의 변화 4. ANP 및 수용체 mRNA 발현 표 2는 혈압 및 신장의 기능적 지표들을 요약하였다. 실험 군에서 수축기 혈압이 유의하게 증가하였으며, 혈장 레닌 활 클립 신장 및 반대쪽 신장의 ANP mRNA 발현이 대조군 성도 및 혈청 알도스테론 농도가 증가하였다. 또한, 실험군 에 비하여 유의하게 증가하였다. 하지만 natriuretic peptide 의 클립을 끼운 좌측 신장은 대조군의 좌측 신장에 비하여 receptor (NPR)-A 및 NPR-C mRNA 발현은 세 군 간에 유의 Figure 1. The protein expression of Na,K-ATPase α1 subunit in the cortex and outer stripe of the outer medulla (Cortex/OSOM) and inner stripe of the outer medulla (ISOM) of the kidney. Each column represents mean±SEM of rats (control=8, clipped=10, non-clipped=10). *p<0.05 vs. control, #p<0.05 vs. clipped kidney. - 480 - － 마성권 외 5인. 2K1C 고혈압에서 나트륨 수송계 변화 － Figure 2. The mRNA expression of renin, angiotensin-converting enzyme 1 (ACE1), and angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) in the cortex of the kidney. Legends as in Fig. 1. Figure 3. The mRNA expression of aldosterone synthase (CYP11B) and mineralocorticoid receptor (MR) in the cortex of the kidney. Legends as in Fig. 1. Figure 4. The mRNA expression of atrial natriuretic peptide (ANP), natriuretic peptide receptor-A (NPR-A), and natriuretic peptide receptor-C (NPR-C) in the cortex of the kidney. Legends as in Fig. 1. + + 도로 존재하며, type 3 Na /H exchanger의 작용을 직접적으 한 차이가 없었다(그림 4). 로 자극하여, 나트륨 재흡수를 증가시킴이 보고되었다26). 또 고 한, aldosterone 합성을 증가시켜서 원위 세뇨관에서의 나트 찰 11-13) 륨 재흡수를 증가시키는 것으로 알려져 있다 . 즉, angio- 본 연구에서 일측 신동맥 클립에 의하여 전신의 RAAS의 tensin II의 세뇨관에 대한 작용은 수분 및 나트륨의 재흡수 항진과 함께 고혈압이 발생하였다. 이는 신혈관성 고혈압이 를 증가시켜서, 체액량을 증가시키는 작용을 한다. 그러나 유발되었음을 나타낸다. 2K1C 고혈압에서 클립 신장으로 혈 angiotensin II-infusion에 의하여 유발된 고혈압에서는 혈압 류량이 감소하게 되면, 신장의 저관류 상태를 회복시키기 위 증가에 대한 적응 기전으로써 오히려 수분 및 나트륨 배설 하여 RAAS의 활성이 증가하며, 혈중 angiotensin II에 의한 이 증가하며 신장의 AQP2 및 Na-K-2Cl 수송체 발현이 감소 1,2) 전신 혈관 수축으로 인하여 고혈압이 발생한다 . 그러나 된다27). 또한, 신장혈관 폐색 상태가 지속되면, angiotensin II RAAS는 신장의 국소 호르몬으로써 신장 세뇨관에서의 수 에 의한 혈관 내피세포기능 저하, 염증유발 cytokines 증가, 분 및 염분 재흡수를 조절한다. 특히, 근위 세뇨관에 높은 농 산화 스트레스 등에 의하여 신장 조직의 섬유화가 발생하 - 481 - － The Korean Journal of Medicine: Vol. 78, No. 4, 2010 － 신장 조직의 CYP11B2는 RAAS의 새로이 알려진 구성 요 며, 신장 수질의 저산소증을 유발하여 허혈성 손상을 일으 28,29) . 이전의 보고에 의하면, 신장의 허혈성 손상 시 소로써 이 효소에 의한 aldosterone 합성 증가는 신사구체에 Na,K-ATPase 등의 나트륨 수송체 발현이 감소되고, 나트륨 서 국소적으로 세포비대, 기질 합성 증가 및 이로 인한 사구 킨다 7) 이뇨가 발생함이 보고되었다 . 이처럼 angiotensin II의 신장 34) 체 경화를 증가시킴이 제시되었다 . 본 연구에서 신혈관성 세뇨관에 대한 작용은 전신 혈압 및 신장 혈류 상태에 따라 고혈압의 클립 신장에서 CYP11B2 mRNA 발현이 유의하게 다르게 나타난다. 본 연구에서는 실험군에서 소변량의 증가 증가되었다. 이러한 결과는 부신 이외의 신장조직에서 자체 와 나트륨 분획 배설이 증가하였으며, 이와 함께 클립 신장 적으로 aldosterone을 합성함을 증명하는 결과이며, 국소적으 의 Na,K-ATPase 단백 발현이 감소하였다. 따라서 클립 신장 로 aldosterone 합성 증가가 사구체 경화 및 고혈압의 병인으 의 Na,K-ATPase 발현 감소가 2K1C 고혈압에서 발생하는 다 로 작용할 것임을 나타내는 결과이다. 또한 aldosterone이 작 뇨 및 나트륨 이뇨의 발생에 기여하였을 것으로 생각되며, 용하는 MR는 신장 집합관 뿐만 아니라, 메산지움세포에 존 이는 신장 세뇨관의 허혈성 손상과 관련되었을 것으로 생각 재하여 메산지움세포에서 국소적으로 합성되는 aldosterone 된다. 이 결합하는 수용체로 사구체 경화의 병인으로 작용함이 제 본 연구에서 클립 신장의 renin, ACE1, CYP11B2, MR의 시되었다35). 따라서 2K1C 고혈압에서 클립 신장에서 나타나 mRNA 발현이 모두 증가되었으며, 이는 신장 조직의 국소 는 CYP11B2 및 MR 발현 증가는 메산지움세포의 증식 및 RAAS의 활성 증가가 고혈압 및 세뇨관 손상에 중요한 역할 사구체경화를 유발하여 신기능 악화 및 고혈압 발생의 병인 을 하고 있음을 시사한다. RAAS는 혈압 및 체액 조절, 심혈 으로 작용할 것으로 보인다. 관계 및 신장 질환의 병태 생리에 관련되어 있으며, 주로 an- ANP계는 RAAS와는 길항적 관계로 혈압조절에 깊이 관 giotensin 및 aldosterone이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 여하고 있다. 최근 연구에서 신장은 이뇨 호르몬의 중요한 있다. 그러나 수많은 연구에도 불구하고 RAAS은 아직까지 작용부위이지만 또한 신장 자신이 이뇨 호르몬의 중요한 합 도 고혈압 및 장기 손상의 발생기전을 명확히 설명하는데 성장소임을 밝히고 있다. Immunoreactive ANP, brain natriu- 30) 있어서 많은 한계를 가지고 있다 . 최근에 RAAS의 구성 요 retic peptide (BNP) 및 C-type natriuretic peptide (CNP)가 사람 소들인 renin-like enzyme, angiotensinogen, ACE1, ACE2, an- 신장에서 검출되었고, 사람 및 흰쥐에서 ANP, BNP 및 CNP giotensin II receptor, CYP11B2, MR 등이 혈관벽의 평활근세 유전자 발현이 확인되었으며, 신장 ANP계는 심장 ANP 계와 포와 내피세포, 심장, 뇌 및 신장에 존재함이 알려지게 되었 독립적으로 조절된다36,37). 실제로 DOCA-salt 고혈압 및 당뇨 다31-33). 즉, RAAS의 국소 호르몬으로서의 작용이 심혈관계 쥐에서 혈장 renin 활성 감소와 더불어 신장 ANP mRNA 합 및 신장 질환의 병태생리에 중요한 역할을 함이 알려지게 성과 요중 ANP 배설 증가를 보였다 되었다. 특히 최근에 발견된 ACE2는 angiotensin I을 angio- 내 ANP 합성이 체액 용적 증가 및 고혈압에 반응하여 증가 tensin (1-9)와 (1-7)로 변환시키며 angiotensin (1-7)은 혈관 확 하며, 체액변화 및 혈압조절에 혈장 ANP보다 더욱 중요하게 장, 이뇨, 항증식, 산화질소 분비 자극 등의 작용을 하여 an- 작용할 것을 시사한다. 본 연구에서 클립 신장의 ANP giotensin II type 1 receptor (AT1R)에 결합한 angiotensin II와 mRNA 발현이 대조군 신장에 비하여 증가하였다. 이는 는 반대되는 작용을 나타낸다. 따라서 고혈압의 발생 및 유 Na,K-ATPase 발현 감소와 함께 나트륨 이뇨의 기전으로 생 지에 ACE1-angiotensin II-AT1R 축과 ACE2-angiotensin-(1-7)-Mas 각된다. 그러나 ANP의 수용체인 NPR-A 및 NPR-C의 발현은 31) 38,39) . 이러한 소견은 신장 receptor 축이 모두 중요하게 작용한다 . 실제로 고혈압의 유의한 차이가 없었다. 이전의 보고에 의하면, angiotensin II 병인에서 신장에서 ACE1/ACE2 발현의 상대적 비율이 RAAS 가 ANP에 의하여 자극되는 cGMP 합성을 감소시켜서 NPR 의 활성을 보여주는 표지로 이용될 수 있으며, 본태성 고혈 을 하향 조절한다고 하였다40). 따라서 2K1C 고혈압에서의 압 환자에서 ACE1/ACE2 비율이 증가되어 있다33). 본 연구 RAAS 활성도 증가가 NPR 발현에 영향을 주었을 것으로 생 에서 2K1C 고혈압 흰쥐의 클립 신장에서 ACE1 mRNA 발현 각된다. 이에 대하여는 신장 조직의 guanylyl cyclase 활성도 은 증가하였으나 ACE2 발현은 유의한 변화를 보이지 않았 측정 등의 추후의 연구를 요한다. 또한, 실험군의 클립을 끼 다. 이러한 결과는 ACE2에 비교하여 상대적으로 활성화된 우지 않은 신장에서도 ANP 발현이 증가되었다. 본 실험에서 ACE1에 의한 angiotensin II 합성 증가 및 이로 인한 혈관 수 클립 신장이 위축되고, 반대쪽 신장이 비후되었으므로, 반대 축 및 고혈압 발생에 기여할 것으로 생각된다. 쪽 신장의 상대적인 사구체 여과율 증가 및 혈압의 증가에 - 482 - － Seong Kwon Ma, et al. Renal expression of Na, K-ATPase in 2K1C hypertension － 것으로 사료되며, 신장 ANP계의 활성증가는 고혈압에 대한 대한 보상 기전으로 작용할 것으로 생각된다. 이상의 결과로 신혈관성 고혈압 유발 흰쥐에서 전신 및 보상기전으로 작용할 것으로 보인다. 또한, 세뇨관 손상과 신장의 국소 RAAS의 활성 증가가 고혈압 및 세뇨관 손상에 관련된 클립 신장의 Na,K-ATPase 발현 감소가 다뇨 및 나트 기여할 것으로 사료되며, 신장 ANP계의 활성증가는 고혈압 륨 재흡수 장애에 관여할 것으로 생각된다. 에 대한 보상기전으로 작용할 것으로 보인다. 또한, 세뇨관 손상과 관련된 클립 신장의 Na,K-ATPase 발현 감소가 다뇨 및 나트륨 재흡수 장애에 관여할 것으로 보인다. 요 중심 단어: 신혈관성 고혈압; 나트륨 수송체; 알도스테론; 나트륨이뇨호르몬 REFERENCES 약 목적: 본 연구는 two kidney, one clip (2K1C) 신혈관성 고 혈압을 유발한 흰쥐에서 신장의 Na,K-ATPase, 레닌-안지오텐 신-알도스테론계(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS) 및 심방나트륨이뇨호르몬(atrial natriuretic peptide, ANP)계가 고혈압 및 신장 손상의 병태생리에 관련되어 있는지를 조사 하고자 하였다. 방법: 실험재료는 Sprague-Dawley 숫쥐를 사용하였다. 2K1C 고혈압을 유발하기 위하여 ketamine (50 mg/kg, i.p.) 마 취 후 왼쪽 신동맥에 0.25 mm 내경의 silver clip을 끼웠다. 4 주일 후에 tail-cuff 방법을 이용하여 수축기 혈압을 측정하였 으며, 마취하지 않은 상태에서 단두하여 신장을 적출하였다. 신장 조직에서 Na,K-ATPase α1 subunit 단백 발현을 Western blot 분석법에 의하여 조사하였다. 또한, renin, angiotensinconverting enzyme (ACE), aldosterone synthase (CYP11B2), mineralocorticoid receptor (MR) 및 ANP계의 mRNA 발현을 real-time polymerase chain reaction으로 조사하였다. 결과: 실험군에서 수축기 혈압이 유의하게 증가하였으며, 혈장 레닌 활성도 및 혈청 알도스테론 농도가 증가하였다. 또한, 소변량 및 나트륨 분획 배설이 유의하게 증가하였다. Na,K-ATPase α1 subunit의 단백 발현은 클립 신장에서 대조 군에 비하여 유의하게 감소하였고, 클립을 끼우지 않은 실험 군의 반대쪽 신장의 단백 발현이 클립 신장에 비하여 증가 하였다. 신장 조직의 renin, ACE1, CYP11B2 및 MR의 mRNA 발현은 실험군의 클립 신장에서 대조군에 비하여 증가하였 고, 클립을 끼우지 않은 반대쪽 신장에서는 클립 신장에 비 하여 유의하게 감소하였다. ACE2 mRNA 발현은 대조군, 실 험군의 클립 신장 및 반대쪽 신장 모두에서 유의한 차이가 없었다. 또한, 클립 신장 및 반대쪽 신장의 ANP mRNA 발현 이 대조군에 비하여 유의하게 증가하였다. 결론: 신혈관성 고혈압 유발 흰쥐에서 전신 및 신장의 국 소 RAAS의 활성 증가가 고혈압 및 세뇨관 손상에 기여할 1) Garovic V, Textor SC. Renovascular hypertension: current concepts. Semin Nephrol 25:261-271, 2005 2) Garovic VD, Textor SC. Renovascular hypertension and ischemic nephropathy. Circulation 112:1362-1374, 2005 3) Machida J, Ueda S, Yoshida M, Soejima H, Ikegami K. Role of sodium and renal prostaglandin E2 in the maintenance of hypertension in the chronic phase of two-kidney one-clip renovascular hypertension in rabbits. Nephron 49:74-80, 1988 4) Ploth DW, Roy RN, Huang WC, Navar LG. 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