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Biomaterials Research (2013) 17(2) : 067-072
Biomaterials
Research
C The Korean Society for Biomaterials
중간엽줄기세포 부착 및 증식을 위한 poly-l-lysine 도입 PLGA
나노섬유 제조 및 분석
Fabrication and Analysis of PLGA Nanofiber with poly-l-lysine for
Adhesion and Expansion of Mesenchymal Stem Cell
강광식1·차병현1·박광숙1·김희천2·박한수3·박귀덕4·이수홍1*
Gwang-Sik Kang1, Byung-Hyun Cha1, Kwang-Sook Park1, Hee-Chun Kim2, Han-Soo Park3, Kwi-Deok Park4,
and Soo-Hong Lee1*
1
차의과학대학교 의생명과학과, 2차의과대학병원 정형외과,
중앙대학교 융합공학부 바이오메디컬공학과, 4한국과학기술연구원 생체재료연구단
1
Stem Cell Engineering Laboratory, Department of Biomedical Science, CHA University, Korea
2
Department of Orthopedic, CHA University, Korea
3
School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, Korea
4
Center for Biomaterials, Korea Institute of Science and Technology, Korea
(Received May 1, 2013/Acccepted May 7, 2013)
3
Cell-substrate interaction is fundamentally essential for phenotypic maintenance and multipotency of stem cells. To regulate the cell-substrate interaction, many researchers have tried to mimic the native cellular environment by introducing physical and chemical factors. Electrospinning technique is a useful tool to produce nanofibers with various
diameters, porosities and structures like the native cellular physical environment. In electrospinning technique, however, most synthetic biodegradable polymers such as poly(lactic acid) (PLA), poly(glycolic acid) (PGA) and poly(lactic
acid-co-glycolic acid) (PLGA) show low adhesion and proliferation of cells on them. Recently, poly-l-lysine (PLL) has
been reported as a common coating material for the improvement of cell adhesion. In this study, we hypothesized
that PLL introduction in PLGA nanofiber would enhance the adhesion and proliferation of human adipose-derived
stem cells (hASCs). To aim this, we fabricated PLGA/PLL nanofiber by electrospinning and evaluated cellular behavior
of hASCs on it. PLGA/PLL nanofiber significantly promoted the attachment and proliferation of hASCs without cytotoxicity. Thus, PLGA/PLL nanofiber would be a useful scaffold to enhance adhesion and proliferation of stem cells and
presumably to regulate differentiation of them in tissue engineering field.
Key words: nanofiber, electrospinning, poly-l-lysine, mesenchymal stem cell, cell adhesion
서
론
(PLGA), poly-ε-caprolactone (PCL) 등 합성고분자를 이용하여
제작되고 있다. 천연고분자는 생분해성을 가지며, 합성고분자에
는 부족한 생물학적 기능을 제공 할 수 있기 때문에, 조직을
구현할 가능성이 높다. 또한, 천연고분자는 합성고분자와 달리
세포 배양을 위한 표면 개질 과정이 불필요하다는 장점을 가
진다. 하지만 이러한 천연고분자로 제작한 나노섬유는 합성고
분자에 비해 정교한 물성 조절이 어렵고, 기계적 강도가 떨어
지는 단점을 가지고 있어 주로 합성고분자를 이용하여 나노섬
유를 제작하고 있다. 특히 PLGA 같은 합성고분자를 이용한
나노섬유는 천연고분자 나노섬유와 마찬가지로 생분해성을 가
지며, 앞에서 언급한 대로 물성 조절이 용이하고 상대적으로
견고하다는 장점을 가진다. 하지만 대부분 합성고분자는 소수
성을 띄고 있기 때문에, 세포를 부착시키기 힘들며 세포 배양
에 이용 시 표면 개질 과정이 필요하다.
세포 배양에 용이한 합성고분자 나노섬유를 제작하기 위해선
줄
기세포가 다분화능을 유지하며 증식하기 위해선 주변 기
질과의 상호작용이 중요하다. 이러한 환경요인을 조절하
기 위한 방법으로 그동안 많은 연구자들은 다양한 물리적, 화
학적 인자를 활용함으로써 자연 상태의 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM) 환경을 모방하기 위해 노력해 왔다.1,2)
특히 전기방사(electrospinning)로 제작된 나노섬유(nanofiber)는
실제 세포외 기질과 매우 흡사한 구조를 가지고 있기 때문에
조직재생 연구에 널리 활용되고 있다.3-7)
대부분의 나노섬유는 fibrinogen, silk protein, elastinmimetic peptide, casein, DNA, collagen 과 같은 천연고분자
와 poly-L-lactic acid (PLLA), poly(lactic acid-co-glycolic acid)
*책임연락저자: [email protected]
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강광식·차병현·박광숙·김희천·박한수·박귀덕·이수홍
많은 연구자들이 화학물질 처리, 단백질 첨가 등의 표면 개질
방법을 이용해왔다. 예를 들어, Peach 등은 PCL nanofiber를
세포배양에 이용하기 위해 poly [(ethylalanato)(1)(p-methylphenoxy)(1)] phosphazene (PNEA-mPh)를 사용하였고 결과적
으로 표면의 습윤성을 증가시켜 세포 부착정도를 개선하였다.8)
Chua 등은 2-step carbodiimide cross-linking method를 사
용하여 ethylene diamine (EtDA)을 도입하였고 세포 부착정도
를 높여 세포 배양에 사용하였다.9) 또한, Rim 등은 PCL
nanofiber 제작 시 gelatin을 섞어서 전기방사한 후 골세포 분
화에 사용하였음을 보고한 바 있다.10) Huang 등은 poly-3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (PHBV) 나노섬유에
hydroxyapatite를 첨가한 나노섬유를 제작하였으나. 세포의 초
기 부착률과 증식률은 hydroxyapatite를 도입하지 않은 나노섬
유보다 오히려 낮은 결과를 보고했다.15) Jeong 등은 천연고분
자인 alginate에 poly-ethyleneoxide (PEO)와 세포 부착성 펩
타이드 서열의 일종인 RGD 서열을 포함한 나노섬유를 제작하
여 세포 부착정도가 증진됨을 확인하였다. 하지만 세포 배양
시 72 시간 이후 60% 이상 질량이 감소하는 결과를 확인하
였다.16) 따라서, 합성고분자를 이용한 나노섬유를 세포배양에
적용하기 위해서는 적절한 세포 부착 물질 선정과 방법이 중
요하다.
Poly-l-lysine (PLL)은 양전하를 띤 합성 폴리아미노산으로 세
포 배양 시 코팅 물질로서 널리 이용되고 있다. PLL은 단백질
에 대한 강한 친화성을 갖고 있어, 세포 배양 기질(substrate)에
코팅하였을 때 세포부착 정도를 향상시킨다.11) 그러나 이러한
PLL의 세포 부착 향상 기능에도 불구하고 PLL이 지금까지 세
포 배양을 위해 제작된 나노섬유의 표면 개질을 위하여 PLL이
이용된 예는 없다.
따라서 본 연구에서는 PLGA 합성고분자를 사용하여 나노섬
유를 제작 시에 발생하는 세포의 낮은 부착력과 증식률을 증
진하기 위하여, PLGA 합성고분자에 PLL을 도입하여 PLGA/
PLL 나노섬유를 제작하였다. 또한 제작된 PLGA/PLL 나노섬유
위에 인간지방줄기세포(human adipose derived stem cells,
hASCs)를 배양하고 그에 대한 부착과 증식에 관한 영향을 조
사하였다.
재료 및 방법
PLGA/PLL 나노섬유지지체 제작
전기방사를 위해 eS-Robot machine (Nano NC, Korea)을
이용하여 전기방사를 수행하였으며 chloroform (JT.Baker,
Germany)과 methanol (DUKSAN, Korea)을 3 : 1 의 비율로
혼합한 용매를 제작하여 실험에 사용하였다. PLGA (lactic acid :
glycolic acid = 82 : 18, MW 218 kDa, Evonik, Germany)는
5.5 wt%의 농도로 600 rpm, 1 시간 조건에서 교반기를 이용
하여 용해하였다. 이후 방사 노즐과 집전판과의 거리는 15 cm,
전압은 15 kv, 토출량은 50 µl/min의 속도조건으로 전기방사를
Biomaterials Research 2013
수행하였다. PLL (MW 70~150 kDa, Sigma-Aldrich, USA)을
PLGA 나노섬유에 도입하기 위해서 PLGA 용액에 PLL용액을
첨가하여 1000 rpm에서 유중수적형 에멀젼화를 유도한 뒤 동
일한 조건으로 방사를 수행하였다.
PLL 분석
PLGA/PLL 나노섬유의 PLL 도입 여부를 확인하기 위하여
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)가 연결된 PLL (FITC-PLL)을
사용하여 전기방사를 수행하였다. PLL의 도입 여부는 형광현미
경을 이용하여 관찰하였다. 그리고 X-ray photoelectron spectroscope (PHI-VERSAProbe XPS microscope, ULVAC-PHI,
Japan)를 통해 표면분석 실험을 수행하여 PLGA/PLL 나노섬유
표면에 PLL의 도입 여부를 재확인하였다.
인간지방줄기세포의 분리
지방조직은 분당 차병원에서 지방흡입술과 인공관절 치환술
시행 시 얻어지는 지방조직을 집도의와 환자의 동의하에 공급
받아 본 실험에 사용하였다. 지방조직에 2% antibiotics
(Wisent, Canada)를 포함한 HBSS (Wisent, Canada)를 첨가
하여 10 분 동안 3 회 세정한 다음 멸균된 수술용 메스와
가위를 이용하여 가능한 잘게 잘라주었다. 이후 DMEM에 녹
인 0.2% collagenase type II (Sigma-Aldrich, USA) 용액을
조직에 처리하여 37oC 에서 1 시간 동안 분해시켰다. 분해된
용액을 원심분리하여 지방층을 제거하였다. 분리한 세포를 세
포배양접시(TPP, Switzerland)에서 10% FBS (Wisent, Canada)
와 1% antibiotics가 포함된, low-glucose DMEM (Wisent,
Canada) 배양액을 사용하여 5% CO2, 37oC 조건에서 배양하
고 배양액은 2 일 마다 교체하였다. 세포 배양에 사용된
PLGA 또는 PLGA/PLL 나노섬유는 75% ethanol (Duksan,
Korea)을 1 시간 동안 처리하여 멸균한 뒤 사용하였다.
세포 형태 분석
PLGA 나노섬유와 부착하여 증식하는 세포의 형태를 관찰하
기 위하여 주사전자현미경 (PHENOM Pro series, PHENOM,
USA)을 사용하여 분석하였다. 주사전자현미경으로 확인하기 위
한 모든 시료는 4% para-formaldehyde로 30 분간 고정화한
뒤 75%와 100% ethanol을 각각 1 시간씩 처리하여 탈수한
다음 건조하여 준비하였다. 이후 시료를 60 초간 백금 코팅을
수행하여 관찰하였다.
세포 생존 분석
나노섬유 위에서 세포의 생존을 조사하기 위하여 배양된 세
포를 DPBS로 세정 한 뒤 Live & Dead Kit (LIVE/DEAD
Viability/Cytoxicity Kit, for mammalian cells, Invitrogen, USA)
용액을 처리하여 37oC 에서 3 분간 염색하였다. 이후 DPBS
로 세정한 다음 형광현미경을 이용하여 살아있는 세포와 죽은
세포를 관찰하였다.
중간엽줄기세포 부착 및 증식을 위한 poly-l-lysine 도입 PLGA 나노섬유 제조 및 분석
세포의 초기부착과 증식률 분석
나노섬유 위에서 배양한 세포의 초기 부착률과 증식률을 측
정하기 위하여 세포를 배양하고 CCK-8 용액과 DMEM 배양액
을 1 : 9 의 비율로 혼합하여 처리하였다. 37oC 에서 2 시간
배양한 뒤 흡광도를 측정하여 정량하였다.
통계 분석
모든 측정값은 student t-test 법으로 검증하였으며 p < 0.05
미만의 확률수준에서 유의한 결과로 간주하였다.
결과 및 고찰
PLGA 용액 농도 차에 의한 전기방사체 분석
PLGA를 사용한 전기방사 수행 시 나노미터 직경의 섬유 제
작에 필요한 방사조건을 선정하기 위해 PLGA 용액의 농도를
조절하여 전기방사를 수행하였다. 제작된 나노섬유를 주사전자
현미경을 통해 관찰한 결과, 6 wt% 농도의 방사실험에서는 마
이크로미터 직경의 리본 형태의 섬유가 관찰되었다(Figure 1A,
1D). 5.5 wt% 용액의 실험에서는 약 170~230 nm 범위의 나
노섬유가 관찰되었으며(Figure 1B, 1E). 5 wt% 농도에서는 직
경 200~300 nm 범위의 섬유와 함께 다공성 구슬이 관찰되었
다(Figure 1C, 1F). Figure 1A, 1D에서 리본형태의 섬유가
관찰된 이유는 높은 점도로 인한 섬유직경의 증가와 용매의 휘
발성 감소가 원인이며 반대로 낮은 점도의 경우 5.0 wt%
(Figure 1B, 1E)의 결과와 같이 구슬상의 섬유가 나타나는 것
으로 기존의 연구에서 알려져 있다.17-19) 이러한 실험 결과를
바탕으로 균일한 나노섬유를 획득한 5.5 wt%의 PLGA 용액으
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로 농도 조건을 고정하여 나노섬유를 제작하였다.
주사전자현미경을 이용한 PLGA 용액 토출량에 의한 전
기방사체 분석
균일한 형상의 나노섬유를 제작하기 위해 PLGA 용액의 토
출량을 조절하여 전기방사를 수행한 후, 주사전자현미경을 통
해 제작된 나노섬유를 관찰하였다. 그 결과 50 µl/min의 속도
로 전기방사를 수행하였을때, 가장 균일한 크기와 모양을 가진
나노섬유가 제작되었다(Figure 2B). 반면 40 µl/min의 경우 형
성된 나노섬유가 불연속상의 섬유 단편의 모양을 나타내는 것
으로 관찰되었다(Figure 2A). 50 µl/min 이상의 토출량으로 전
기방사를 수행한 경우 나노섬유의 직경이 증가하였으며 이는
토출량이 증가할수록 직경이 증가하는 경향을 보였다. 따라서
전기방사 시 PLGA 용액의 토출량을 50 µl/min으로 고정하였
을 때 PLGA 나노섬유가 균일한 연속상의 섬유형태로 제작됨
을 알 수 있었다. 하지만 저속도의 토출량(40 µl/min)으로 전기
방사를 수행할 경우 토출량이 방사량보다 부족하여 테일러 콘
이 일정하게 유지되지 못하기 때문에 불연속상의 불규칙한 형
태를 지닌 섬유가 형성된다고 알려져 있다.20-22) 따라서 연속상
의 섬유형태로 나노섬유를 제작하기 위해 토출량을 50 µl/min
의 속도로 고정하여 PLGA 나노섬유를 제작하였다.
PLGA/PLL 나노섬유의 PLL 분석
PLGA/PLL 나노섬유의 PLL 도입 여부를 알아보기 위하여
FITC가 결합된 PLL (FITC-PLL)을 이용하여 PLGA/FITC-PLL
나노섬유를 제작하고 형광현미경을 통하여 표면에 존재하는
PLL를 관찰하였다. 그 결과 FITC에 의한 형광이 나노섬유의
Figure 1. SEM image of electrospun PLGA fiber at various concentration. (A,D) 6.0 wt%, (B,E) 5.5 wt%, (C,F) 5.0 wt%.
Vol. 17, No. 2
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강광식·차병현·박광숙·김희천·박한수·박귀덕·이수홍
Figure 2. SEM image of electrospun PLGA fiber at various flow rate. (A) 40 µl/min, (B) 50 µl/min, (C) 60 µl/min, (D) 70 µl/min, (E) 100 µl/min
(scale bar = 260 µm).
측정된 질소는 전기방사시 도입된 PLL에서 유래된 질소임을 확
인할 수 있다. 따라서 PLGA/PLL 나노섬유에 도입된 PLL이 나
노섬유 표면에 화학적으로 노출되어 존재함을 확인할 수 있었
다. 본 연구에서 PLL이 비교적 쉽게 표면에 위치할 수 있었던
이유는 PLGA에 비해 비교적 친수성인 PLL이 용매가 증발되어
섬유가 형성되는 과정에서 보다 쉽게 노출되어 나노섬유 표면
에 위치하게 된 것으로 사료된다.24)
Figure 3. Fluorescent microscope images and X-ray photoelectron
spectroscopy analysis (XPS) of PLGA and PLGA/PLL nanofiber scaffold. (A) electrospun PLGA nanofiber. (B) co-eletrospiun PLGA/FITCPLL nanofiber. (C) XPS analysis of electrospun PLGA and PLGA/PLL
nanofibers.
형태로 관찰됨에 따라 PLL이 나노섬유에 성공적으로 도입되었
음을 확인하였다(Figure 3A, 3B). 또한, XPS 장비를 이용하여
PGLA 나노섬유의 표면에 존재하는 원소의 비율을 관찰하였을
때 1.99%의 질소원자가 측정되었다(Figure 3C). PLGA가 질소
를 포함하지 않는 점을 감안할 때23) PLGA/PLL 나노섬유에서
Biomaterials Research 2013
주사전자현미경을 이용한 세포의 형태분석
PLGA/PLL 나노섬유에서 세포를 배양한 후 주사전자현미경을
통해 세포 모양을 관찰하였다. PLGA 나노섬유와 PLGA/PLL
나노섬유에서 배양된 모든 세포에서 잘 뻗은 모양으로 관찰되
었다(Figure 4A, 4F). 반면, PLGA/PLL 나노섬유에서 배양된
세포의 경우 PLGA 나노섬유에서 배양된 세포에 비하여 더 넒
은 부착면적이 관찰되었으며, 이는 PLL의 양전하와 세포막의
음전하와의 상호작용에 의한 부착증진 효과로 추론된다.11,25) 따
라서 PLGA 나노섬유에 PLL을 도입함으로써 세포가 나노섬유
에 더 넓게 부착되어 배양됨을 확인할 수 있었다.
나노섬유에서 세포 생존 분석
나노섬유에서 배양한 세포의 생존을 조사하기 위해 PLGA와
PLGA/PLL 나노섬유에서 세포를 배양하고 Live/Dead 염색을
통해 7 일간 생존을 관찰하였다. PLGA와 PLGA/PLL 나노섬유
에서 모든 세포들이 정상적으로 부착하여 생존하였다(Figure 4).
또한 PLGA 나노섬유와 PGLA/PLL 나노섬유 모두 사멸한 세포
는 거의 관찰되지 않았다. 따라서, 전기방사 시에 PLL을 도입
하여 제작된 PLGA/PLL 나노섬유는 세포 독성을 나타내지 않
중간엽줄기세포 부착 및 증식을 위한 poly-l-lysine 도입 PLGA 나노섬유 제조 및 분석
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Figure 4. Cell morphology and viability of hASC on PLGA and PLGA/PLL nanofiber scaffold (A,F) SEM image of hASC cultured on PLGA and
PLGA/PLL nanofiber scaffold. (B~E) hASC cultured on PLGA nanofiber scaffold (G~J) hASC cultured on PLGA/PLL nanofiber scaffold (B~E and
G~J) were visualizing by staining with LIVE/DEAD staining kit.
Figure 5. Analysis of cell attachment and proliferation in hASC on PLGA and PLGA/PLL nanofiber scaffold by CCK-8 analysis (OD 450 nm) (A)
hASC attachment on PLGA and PLGA/PLL nanofiber scaffold (B) hASC proliferation on PLGA and PLGA/PLL nanofiber scaffold.
으면서 효과적으로 세포 부착과 증식을 유도 할 수 있음을 확
인하였다.
나노섬유에서 세포의 초기 부착과 증식률 분석
PLGA/PLL 나노섬유가 세포의 초기 부착과 증식에 미치는 영
향을 평가하기 위해 PGLA/PLL 나노섬유에서 세포를 배양하고
CCK-8을 이용하여 세포의 초기부착과 증식률을 정량화하였다.
PLGA/PLL 나노섬유에서 배양된 세포는 PLGA 나노섬유에서 배
양된 세포에 비해 약 36.36 ± 3.9% 이상 높은 초기 부착률을
나타내었다(Figure 5A). 이후 2 일 마다 세포 수를 정량하여
증식률을 평가한 결과 PLGA/PLL 나노섬유에서 높은 세포증식
률을 나타내었다. 특히, 7 일 결과에 PLGA 나노섬유에 비해
PLGA/PLL 나노섬유에서 약 2.67배 이상의 더 많은 세포가 관
찰되었다. 이는 세포 배양 시 PLGA/PLL 나노섬유 표면의 양
전하와 세포막의 음전하 간의 정전기적 인력이 형성되어 세포
의 부착에 보다 용이한 환경을 제공하기 때문으로 판단된다.
결
론
본 연구에서 PLGA와 나노섬유에 PLL을 도입하여 복합나노
섬유를 제작하였고 표면 원소분석을 등을 통하여 나노섬유의
표면에 PLL이 성공적으로 도입되었음을 확인하였다. 또한, 세
포 생존 및 초기 부착, 증식률을 분석하였을 때 PLGA 나노섬
유에 PLL을 도입함으로써 세포의 초기 부착률과 증식률이 증
진되었음을 확인하였다. 이렇게 생체이식재료로써 적합한 PLGA
에 PLL의 기능성을 도입하여 전기방사를 수행한 결과 실제 세
포외 기질과 유사한 구조체를 제작할 수 있었고, 기존의 생분
해성 고분자의 단점을 극복하고 세포의 증식과 초기 부착 및
증식을 증진시킬 수 있는 세포 지지체를 제작할 수 있었다. 또
한, PLGA/PLL 나노섬유에 세포의 증식, 성장, 그리고 분화와
같은 총체적 거동을 조절할 수 있는 물질(DNA, protein,
chemical)을 적용한다면 향후, 세포치료영역에서 많은 활용 가
능성을 지닌 기능성 생체이식재료로써 발전할 수 있을 것으로
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강광식·차병현·박광숙·김희천·박한수·박귀덕·이수홍
사료된다.
감사의 글
13.
본 연구는 한국교육과학기술부 줄기세포연구과제 (과제번호:
2012-0101)와 나노/마이크로 미세환경 기반 줄기세포 분화조
절 연구 과제 (과제번호: 2E24190-13-022)로 이루어졌으므로
이에 감사드립니다.
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