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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
CUAUTITLÁN
NEOSPOROSIS EN HATOS LECHEROS DE MÉXICO:
LESIONES Y DETECCIÓN POR INMUNOHISTOQUÍMICA
DE Neospora caninum EN FETOS.
ACTIVIDAD DE INVESTIGACIÓN
ARTÍCULO
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
P R E S E N T A:
MARIO BERNARDINO SANTA CRUZ AGUILAR
ASESORA:
DRA. ELIZABETH MORALES SALINAS
CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MEX.
2008
Í N D I C E
PÁG
RESUMEN
2
INTRODUCCIÓN
3
MATERIAL y MÉTODOS
5
RESULTADOS
7
DISCUSIÓN
14
AGRADECIMIENTOS
17
REFERENCIAS
18
RESUMEN
De 211 fetos bovinos abortados que se obtuvieron de hatos lecheros de México entre
enero de 1996 y marzo de 1999, 73 mostraron lesiones microscópicas compatibles con
Neosporosis. De estos 73 fetos, 58 (79%) mostraron miocarditis linfocítica, 39 (53%)
mostraron microgliosis y necrosis en cerebro, 39 (53%) mostraron hepatitis linfocítica y
19 (26%) mostraron miositis linfocítica.
El examen por inmunohistoquímica de
cerebro, miocardio e hígado se realizó en 53 de estos 73 fetos, y se evidenciaron
antígenos de Neospora caninum en 41 (77%), de los cuales 19 (46%) dieron resultados
positivos en uno de los tres órganos, 15 (37%) en dos y 7 (17%) en los tres sitios u
órganos.
Los resultados indicaron la presencia de Neosporosis en las principales
regiones lecheras de México.
INTRODUCCIÓN
Neospora caninum es un protozoario, reconocido por primera vez en Estados
Unidos de América, ocasiona enfermedad en los perros (Dubey et al., 1988a; Dubey,
1992), ganado lechero (Anderson et al., 1991a, b; Barr et al., 1991a; Nietfeld et al.,
1992), ganado bovino productor de carne, ovinos, equinos, cabras y venados (Dubey y
Lindsay, 1996).
En primates, excepto humanos, y en otras especies la infección
experimental con Neospora caninum induce la enfermedad clínica (Dubey y Lindsay,
1996). Neospora caninum fue primeramente aislada de perros (Dubey et al., 1988a, b),
y más tarde de fetos bovinos abortados (Conrad et al., 1993). La Neosporosis en el
ganado está caracterizada por aborto, parálisis neonatal o el nacimiento de becerros
portadores asintomáticos (Anderson et al., 1991a, b; Paré et al., 1996). El ganado
puede infectarse transplacentariamente o como resultado de la ingestión de ooquistes,
eliminados por heces de perros, los cuales representan al huésped definitivo (Barr et al.,
1993; Paré et al.,1996; Anderson et al., 1997; McAllister et al., 1998).
En California, Nueva Zelanda y Holanda, la Neosporosis es la causa más
frecuentemente diagnosticada de aborto bovino (Anderson et al., 1991b; Thornton et al.,
1991; Dubey y Lindsay, 1996).
Dentro del continente americano, además de los
Estados Unidos, la Neosporosis bovina ha sido identificada sólo en Canadá (McIntosh y
Haines, 1994), México (Abbitt et al., 1993; Delgado et al., 1995; Morales et al., 1997) y
Argentina (Venturini et al., 1995). Las técnicas diagnósticas usadas consisten de 1°
histopatología e inmunohistoquímica provenientes de tejidos de fetos o animales recién
nacidos, y 2° ELISA o inmunofluorescencia que demuestren anticuerpos específicos en
suero, fluidos fetales o suero de la madre (Dubey y Lindsay, 1996). Las lesiones
microscópicas más significativas son la encefalomielitis linfocítica con microgliosis
multifocal, necrosis en cerebro y médula espinal.
Además puede encontrarse
miocarditis linfocítica y miositis, también como hepatitis periportal linfocítica con o sin
focos de necrosis hepatocelular. Ocasionalmente hay inflamación y necrosis en otros
órganos. Los quistes frecuentemente son confinados al sistema nervioso central (SNC)
como grupos de taquizoitos en tejido muscular, hígado y SNC (Dubey et al., 1989,
1990a,b; Barr et al., 1990, 1991b, 1993). La histopatología e inmunohistoquímica son
los métodos de diagnóstico más confiables y han sido usados para diagnosticar casos
individuales, pero son pocos los estudios epidemiológicos basados en estas técnicas
(Lindsay y Dubey, 1989; Anderson et al., 1990; Barr et al., 1990, 1991b; Wouda et al.,
1997) y en México existe poca información acerca de esta enfermedad. El primer
reporte fue de 6 fetos de un hato de 800 vacas en el noreste de México (Abbitt et al.,
1993), subsecuentemente fetos con lesiones sugestivas de Neosporosis fueron
reportadas por los laboratorios de diagnóstico en Torreón, Coahuila (Delgado et al.,
1995), y en la Ciudad de México (Morales et al., 1997). En vista de lo escaso de los
datos sobre Neosporosis bovina en México, este reporte presenta información
epidemiológica sobre la enfermedad basada en estudios histopatológicos e
inmunohistoquímicos en tejidos provenientes de fetos abortados.
MATERIAL y MÉTODOS
Animales
Fetos abortados (n = 211) de los principales estados lecheros del país: Hidalgo,
Coahuila, Querétaro, Guanajuato, Durango, Aguascalientes, Jalisco, Estado de México,
Tamaulipas, Tlaxcala y Chihuahua, fueron remitidos a la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la UNAM, para su diagnóstico durante los meses de enero de
1996 a marzo de 1999.
Histopatología
Muestras de cerebro, miocardio, músculo diafragmático, hígado, pulmón, riñón
y bazo fueron fijadas en formalina neutra amortiguada al 10 %, y procesadas por los
métodos de rutina. Secciones de 5 µm fueron cortados y teñidos con hematoxilina y
eosina (HE), y secciones seleccionadas de cerebro fueron también teñidas por el método
de Tinción periódica ácida de Schiff (PAS).
Inmunohistoquímica
De 73 fetos con lesiones sugestivas de Neosporosis, 53 (73 %) fueron sometidas
a examen inmunohistoquímico de cerebro, miocardio e hígado (ejemplos de órganos
más severamente afectados) para identificar el parásito. Una serie de secciones (3 µm)
fueron montados en portaobjetos cubiertos con poli-L-lisina, calentados a 56ºC,
desparafinados en xilol y rehidratados a través de etanol. La proteasa, a una
concentración al 10% (Sigma Chemical Company, St. Louis Missouri, USA), fue
aplicada por 10 minutos a 37ºC seguido de un lavado por 5 min. con agua desionizada.
La peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3 %, las laminillas
fueron bloqueadas por la aplicación de suero normal de conejo (Dako Corporation,
Carpintería, California, USA) por 10 min. Las secciones fueron entonces tratadas por
30 min. a 37ºC con anticuerpos primarios de cabra anti-Neospora caninum (Veterinary
Medical Research and Development, Pullman, Washington, USA) diluido 1/3000. Un
anticuerpo secundario biotinilado (Dako) diluido 1/600 fue aplicado por 20 min. a 37ºC
seguido por un complejo avidina-biotina peroxidasa (ABC) (Dako) por 20 min. a 37ºC.
Para desarrollar la reacción inmunológica las laminillas fueron tratadas durante 5 min.
con una solución de diaminobencidina (DAB) (Zymed Laboratories, South San
Francisco, California, USA). Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina. Se
consideraron positivas cuando se observaron estructuras consistentes con la morfología
del parásito inmunomarcado por este método. Como control negativo, los anticuerpos
anti-Neospora fueron remplazados por suero normal de cabra (Dako), y los controles
positivos en secciones de cerebro canino conteniendo cúmulos de taquizoitos de
Neospora caninum (proporcionado por la Dra. Deborah Haines, University of
Saskatchewan, Saskatoon, Canadá).
RESULTADOS
Histopatología
De los 211 fetos examinados, sólo en 104 (49 %) se detectaron lesiones. De
estos, 73 tuvieron lesiones compatibles con Neosporosis, el resto mostró cambios
sugestivos de infecciones virales o bacterianas.
Los 73 casos sospechosos de
Neosporosis provinieron de los estados de Hidalgo (38 casos), Coahuila (29),
Aguascalientes (2), Querétaro (1), Guanajuato (1), Edo. de México (1) y Tlaxcala (1).
Las lesiones por Neosporosis fueron clasificadas como ligeras, severas o
moderadas. En los casos ligeros los focos compuestos por pocas células inflamatorias
estuvieron presentes en miocardio o hígado, y unos cuantos focos de microgliosis, con o
sin necrosis, fueron vistos en cerebro. En casos severos hubo abundancia de células
inflamatorias en el miocardio o hígado, focos de microgliosis con o sin necrosis. Los
casos moderados caen entre estas dos clasificaciones.
Las lesiones más significativas y consistentes de Neosporosis fueron aquellas
presentes en miocardio, cerebro, hígado y músculo diafragmático. El tipo y severidad
de las lesiones están resumidas en el cuadro 1. Cincuenta y ocho (79 %) de los 73 fetos
mostraron miocarditis linfocítica (multifocal o difusa de severidad variable). La forma
ligera fue la más común, seguida por moderada y finalmente severa. En ninguno de
estos casos hubieron taquizoitos visibles en fibras musculares con la tinción de HE. Se
observaron lesiones de necrosis focal y focos de microgliosis en tejido cerebral de 39
fetos (53 %), en algunos casos la necrosis estuvo rodeada por células microgliales y
linfocitos (Foto 1). Sin embargo estas lesiones estuvieron dispersas a través del SNC y
fueron encontradas más frecuentemente en la corteza cerebral, algunas veces
multifocales y comúnmente cerca de vasos sanguíneos. En un solo feto (de 8 meses de
gestación), se detectó inflamación linfocítica perivascular, y en solo 6 fetos (8 %)
hubieron quistes de Neospora de diferentes tamaños. Cada quiste de forma redonda u
oval y con un tamaño de 21 x 21 µm a 49 x 33 µm, con una pared gruesa PAS-positivo
(Foto. 2). En solo una ocasión fue vista una reacción inflamatoria circundante al tejido
del quiste con cambios degenerativos asociados. Con la tinción de HE no se observaron
taquizoitos libres.
La severidad de las lesiones en el SNC fueron variables, los cambios ligeros
ocurrieron más frecuentemente, seguidos por los moderados y al final los severos.
Treinta y nueve fetos (54 %) presentaron hepatitis linfocítica periportal de severidad
variable, las lesiones ligeras fueron las más comunes. También se observaron lesiones
de necrosis focal, distribuidas aleatoriamente en seis de los 39 casos. Las estructuras
parasitarias no fueron identificadas en las secciones de hígado teñidas con HE. En 19
fetos (26 %), se observó miositis linfocítica multifocal, generalmente ligera, en músculo
diafragmático pero no se encontró ninguna estructura parasitaria. Solo en tres casos (4
%) hubo una reacción inflamatoria pulmonar ligera formada por macrófagos alveolares
con algunos linfocitos. El riñón y el bazo no mostraron cambios significativos. En solo
47 de los 73 fetos pudo tenerse la certeza de la edad de la gestación la cual osciló entre
3 y 8 meses (
= 5.5).
Cuadro 1
Tipo y Severidad de las Lesiones Compatibles con Neosporosis en 73 Fetos Bovinos
Severidad de
Tipo de Lesión y Número ( % ) en las muestras de los 73 Fetos
las Lesiones
Microgliosis y
Miocarditis
Hepatitis
Miositis
necrosis
Ligera
28 (38)
26 (36)
26 (36)
11 (15)
Moderada
9 (12)
21 (29)
11 (15)
6 (8)
Severa
2 (3)
11 (15)
2 (3)
2(3)
Foto 1.
Cerebro fetal con un foco necrótico central rodeado por
células
microgliales. H.E. X 400
Foto 2. Quiste de Neospora caninum en el cerebro de un feto abortado.
Nótese la ausencia de inflamación. PAS. X 1000
Inmunohistoquímica
Se examinaron por medio de inmunohistoquímica tejidos de cerebro, miocardio
e hígado en 53, de los 73 fetos, con lesiones microscópicas consistentes con
Neosporosis. El Antígeno de Neospora caninum fue identificado en 41 (77 %) de estos
53 fetos, siendo detectada la reacción inmunológica en un solo órgano en 19 (46 %) de
los 41 casos positivos, en dos órganos en 15 (37 %), y 7 (17 %) en los tres órganos. En
el cerebro fueron identificados quistes de Neospora, sin lesiones asociadas, en dos (4 %)
de los 53 fetos.
Los taquizoitos, ya sean de manera aislada o en grupos, fueron
identificados en el cerebro de 19 (36 %) de los 53 fetos, algunas veces asociados con
microgliosis y necrosis. En el miocardio los taquizoitos fueron identificados en 24 (45
%) de los 53 fetos, principalmente en el interior de las fibras miocárdicas, donde ellos
estuvieron asociados con infiltrados o áreas de necrosis o ambos. En el hígado los
taquizoitos, ya sea también aislados o en grupos, fueron identificados en 25 (47 %) de
los 53 fetos (Foto 3, Cuadro 2).
Cuadro 2
Examen inmunohistoquímico de cerebro, miocardio e hígado de 53 de los 73 fetos que
mostraron lesiones compatibles con Neosporosis
Número (%) de 53 fetos abortados mostrando
Resultado de
inmunoreacción por la presencia de taquizooitos
Inmunoreacción
en :
Cerebro *
Miocardio
Hígado
Positivo
19 (36)
24 (45)
25 (47)
Negativo
17 (32)
24 (45)
16 (30)
No concluyente
15 (28)
5 (9)
12 (23)
* Los cerebros de 2 de los 53 fetos (4 %) mostraron quistes inmunoreactores sin
lesiones asociadas.
Foto 3.
Hígado con un acumulo de taquizoitos de Neospora caninum.
ABC, que reaccionaron con suero anti-Neospora caninum. X 1000
DISCUSIÓN
De los resultados histopatológicos, los cuales fueron similares a los reportados
en otros trabajos (Barr et al., 1990, 1991a; Anderson et al., 1991a; Dubey y Lindsay,
1993; Lindsay et al., 1993), se puede concluir que los tejidos más frecuentemente
afectados y por lo tanto los mas viables para propósitos diagnósticos son SNC,
miocardio, músculo esquelético e hígado. Algunos autores señalan que la miocarditis
tiende a ser severa pero es fácilmente ocultada por los cambios autolíticos (Barr et al.,
1990; Dubey y Lindsay, 1996; Wouda et al., 1997). Sin embargo en el presente estudio
la miocarditis fue comúnmente ligera; algunos casos mostraron casos autolíticos. En un
estudio de lesiones cerebrales por Neospora de seis fetos bovinos abortados, Helman y
cols. (1998) encontró la mayor parte de las lesiones en el cerebro, seguida por el
cerebelo y luego por la médula espinal. En el presente estudio la distribución de las
lesiones en el cerebro no fueron específicamente revisadas pero muchas lesiones fueron
vistas en la corteza cerebral.
Los quistes de Neospora, como en otros reportes (Dubey y Lindsay, 1996),
fueron escasos y solo uno fue asociado con una reacción inflamatoria; esta reacción fue
posiblemente debida a la ruptura de la pared del quiste, con la consecuente liberación de
contenido, como lo han mencionado anteriormente (Dubey et al.,1990a, Dubey, 1992).
En solo un caso hubo un infiltrado linfocítico perivascular apreciable y esto ocurrió en
el feto de mas edad (8 meses de gestación), soportando la hipótesis de que la madurez
del sistema inmune es un factor colaborador importante (Ogino et al., 1992).
Desafortunadamente el presente estudio no arroja información acerca de la médula
espinal, órgano en el cual las lesiones y los quistes de Neospora han sido descritos
(Dubey et al., 1989; 1990a; Dubey y Lindsay, 1996). A diferencia de Dubey y Lindsay
(1993) no se encontraron hemorragias en el parénquima cerebral. Al igual que en otros
reportes (Barr et al., 1990; Wouda et al., 1997) se presentó hepatitis linfocítica con
tendencia periportal y fue ocasionalmente asociada con necrosis focal. En 19 casos se
observó miositis linfocítica, indicando el valor diagnóstico de las muestras de músculo
diafragmático. La edad promedio de gestación de los fetos abortados (5.5 meses) fue
similar a la reportada en California (Anderson et al, 1991b).
En lo que respecta a la prueba de inmunohistoquímica, los organismos de
Neospora caninum fueron identificados más frecuentemente y en un mayor número en
el hígado, indicando el valor de este tejido para demostrar la presencia del parásito. El
cerebro fue útil como un tejido en el cual los taquizoitos y ocasionalmente los quistes
pudieron ser demostrados, sin embargo los parásitos fueron escasos. Los resultados
difirieron de aquellos obtenidos en Holanda por Wouda y cols. (1997), cuyo estudio
inmunohistoquímico demostró antígenos de Neospora en 85 % de las muestras de
cerebro de casos de Neospora, comparada con 26 % de muestras de hígado y 14 % de
muestras de miocardio.
Las lesiones descritas en el presente estudio no pudieron ser consideradas
patognomónicas para Neosporosis y no fue posible demostrar por inmunohistoquímica
antígenos de Neospora en todos los tejidos revisados. Sin embargo la microgliosis y
necrosis del SNC fueron considerados útiles indicadores de Neosporosis, y fuertemente
sugestivos cuando van acompañados con miocarditis y hepatitis (Barr et al., 1990;
Anderson et al., 1991b; Nietfeld et al., 1992). Los hallazgos en el presente estudio y los
reportados por Wouda y cols. (1997) sugieren que para el diagnóstico de Neosporosis el
examen inmunohistoquímico de cerebro, hígado y miocardio, representan el método de
elección.
Finalmente, este estudio demostró la presencia de Neosporosis bovina en
algunas de las principales regiones lecheras de México.
A G R A D E C I M I E N T O S
Estamos en deuda con el Dr. J. P. Dubey (USDA Parasite Biology and epidemiology
Laboratory, Beltsville, MD, USA) y el Dr. A. M. López (University of Prince Eward
Island, Canadá) por proveernos de información y de sus consejos.
Agradecemos también a Dr. D. Haines (University of Saskatchewan, Canadá) por
proporcionarnos tejido positivo a Neospora caninum, y a J. G. Jiménez (Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootécnia de la UNAM, D.F. Méx.) por la asistencia en la
histología e inmunohistoquímica.
A mi familia, por todo el amor que siempre me han brindado, su apoyo, sus consejos, su
paciencia y mucho más. Gracias los quiero mucho.
A mis compañeros y amigos, a Irene, María Cruz, Antonio Vázquez, por apoyarme en
este proyecto, por sus consejos, comentarios y jalones de orejas. Por estar conmigo en
momentos de tristeza y alegría mil gracias y que Dios los bendiga así como a toda su
familia.
A ti Dr. Jesús Zavaleta por tu invaluable apoyo.
A usted Dr. Javier Hernández Balderas por siempre creer en mí sin merecerlo y
apoyarme en todo momento. GRACIAS.
Gracias a esa persona que ocupa un lugar en mi vida, donde quiera que se encuentre, y
que Dios cuide sus pasos y la bendiga por siempre.
Perdemos la sencillez, Señor.
La ciencia, la técnica y el progreso
nos transforman.
Construimos un mundo extraño
donde la maquina mata al hombre.
La simplicidad, la sencillez,
la verde naturaleza,
el don de encantamiento, el respeto por las cosas íntimas,
el silencio ante el misterio.
En tu reino Señor, el hombre más grande
es el que está de rodillas.
En tu reino Señor, y en las pasarelas
de la humanidad,
el gran hombre es el sabio y santo, con alma de niño.
Señor, que yo sea humilde,
silencioso, santo y sabio,
sin perder jamás mi corazón de niño
y la capacidad de valorar
los menores detalles de la vida
J. Comp. Path. 2001 Vol. 125, 58-63
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