1. No category

Bioessais in vitro
Évaluation de la contamination par des composés
perturbateurs endocriniens, dioxin-like et
génotoxiques
Selim AIT-AISSA
INERIS : S. Aït-Aïssa, N. Creusot, E. Maillot-Maréchal
Université de Paris Sud : Y. Lévi, L. Oziol
Université de Bordeaux : J. Cachot, C. Clérandeau, A. Pichon
Irstea : F. Serveto, M.J. Capdeville, C. Miège
Contexte ECHIBIOTEB
Eaux usées et boues = mélanges complexes
Des milliers de molécules
Lien entre contamination et effets ?
Quelles approches pour les évaluer ?
Approche analytique
(analyses ciblées / non ciblées)
Approche écotoxicologique
(bioessais standards)
 quantitatives, sélectives,
sensibles (traces)
 vision partielle / structurale de la
contamination
 intègrent l’ensemble des
composés actifs biodisponibles
 pertinence (éco)toxicologique
 identité des molécules ?
Approche Bio-analytique
Bioessais in vitro - Détection basée sur le
mécanisme d’action des substances
Perturbateurs endocriniens
Dioxin-like
Génotoxiques
2
Perturbateurs endocriniens:
mécanisme d’action
Hormones
Xéno-hormones
Récepteur
ERE
prom
Gènes cibles
Réponse cellulaire aux
hormones
Colloque final du programme de recherche ECHIBIOTEB - 3 février 2015 - Villeurbanne
3
Bio-essais in vitro basés sur le
mécanisme d’action
Tests cellulaires exprimant un gène rapporteur
(mesure simple et spécifique) sous contrôle de
récepteurs des hormones (ER, AR, GR, TR) ou
de la dioxine (AhR)
Récepteur
• Mise en évidence de la présence de
composés actifs au sein des échantillons
ADN
ERE
bGlob
luciferase
D-luciferine
• Quantification relative en équivalentshormones ou équivalents-dioxine dans
l’échantillon (TEQ)
lux
Composé de référence
120
+
Luciferase activity (%)
Concentration
-
100
80
60
Extrait environnemental
Réf.
Echant.
40
BIO-TEQ =
20
0
Microplaques
1.E-09
1.E-06
1.E-03
Concentration (g/L or g EQ sed/L)
1.E+00
+ une LD
EC20 réf.
EC 20 échant.
4
Des outils déjà éprouvés
Outils fonctionnels
criblage
quantitatifs
sensibilité (e.g. E2-Eq 0,1 ng/L)
Applications à différentes matrices environnementales
Eaux de surface, effluents (Harries et al 1998, Hislcherova 2000)
Sédiments (Kinani et al 2010)
Biote (Legler et al 2002)
Validation dans un contexte de surveillance des milieux aquatiques
DCE : alternatives à l’analyse de E2 et EE2 (liste de vigilance) dans les eaux
usées et eaux de surface
France: AQUAREF
Europe: NORMAN, SPI-Effect-based tools for estrogens (R Käse, eawag)
ISO: normes en cours d’élaboration (potentiel estrogénique des eaux)
5
Bioessais in vitro dans ECHIBIOTEB
Activité
Récepteur
Bioessai
Résultat
MELN
estradiol-Eq
Hormono-mimétiques
Estrogénique
Anti-estrogénique
Androgénique
ER
anti-ER
-
AR
MDA-kb2
dihydrotestostérone -Eq
anti-AR
MDA-kb2
flutamide-Eq
Glucocorticoïde
GR
MDA-kb2
dexaméthasone-Eq
Thyroïdien
TR
PC-DR-LUC
T3-Eq
anti-TR
PC-DR-LUC
-
HAP-like
AhR 4h
PLHC-1
BaP-Eq
dioxine-like
AhR 24h
PLHC-1
TCDD-Eq
anti-Androgénique
anti-thyroïdien
Dioxin-like
Génotoxicité : SOS Chromotest
Test basé sur l’expression d’un gène rapporteur lacZ
(mesure simple et spécifique) sous le contrôle du
promoteur du gène sfiA (gène de réparation de
l’ADN). Plus le composé est génotoxique, plus le gène
lacZ est induit et plus l’activité de l’enzyme β
galactosidase est élevée.
• Mesure du potentiel génotoxique des échantillons
• Test semi-quantitatif
Facteur
d’induction IF
Analyse
statistique
Concentration
IF
Génotoxicité
≤1
-
1 < ≤ 1,5
+/-
1,5 < ≤ 2
+
>2
++
7
Bioessais in vitro dans ECHIBIOTEB
Activité
Récepteur/
mécanisme
Bioessai
Résultat
MELN
estradiol-Eq
Hormono-mimétiques
Estrogénique
Anti-estrogénique
Androgénique
ER
Anti-ER
-
AR
MDA-kb2
dihydrotestostérone -Eq
anti-AR
MDA-kb2
flutamide-Eq
Glucocorticoïde
GR
MDA-kb2
dexaméthasone-Eq
Thyroïdien
TR
PC-DR-LUC
T3-Eq
anti-TR
PC-DR-LUC
-
HAP-like
AhR 4h
PLHC-1
BaP-Eq
dioxine-like
AhR 24h
PLHC-1
TCDD-Eq
anti-Androgénique
anti-thyroïdien
Dioxin-like
Génotoxicité
Génotoxicité (± S9)
SOS (±S9)
SOS chromotest
Induction gène sfiA
Objectifs de l’étude
Eaux
Boues
1. Profils de contamination sur la base des bioessais in vitro ?
2. Influence des traitements complémentaires ?
3. Lien avec la chimie ciblée ?
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Evaluation des eaux
6 sites de STEU
21 eaux d’entrée
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10
Protocole de bioanalyse des eaux
Eaux brutes
Extraction sur
phase solide
(SPE)
Luciferase activity (%)
Composé de référence
120
100
80
60
Extrait
organique
(DMSO)
Extrait environnemental
ER
Réf.
Echant.
ERE
bGlob
luciferase
40
D-luciferine
20
0
1.E-09
1.E-06
1.E-03
Concentration (g/L or g EQ sed/L)
1.E+00
lux
Bioessais in vitro
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11
Activités in vitro dans les eaux avant
traitement complémentaire
Activités
6 STEU,
21 eaux
analysées Estrogénique
Présence
Fréquence
Concentrations
++
100 %
(21/21)
E2-Eq :
0.1-1 ng/L
Glucocorticoïde
+/-
15%
(3/21)
Dexa-Eq :
0.5 – 1 µg/L
Androgénique
+/-
9%
(2/21)
DHT-Eq :
4 -14 ng/L
Anti-androgénique
+/-
4%
(1/21)
Fluta-Eq :
55 µg/L
(Anti)Thyroïdienne
-
0%
non détecté
HAP-like
+
57 %
(12/21)
BaP-Eq :
0.02 – 1 µg /L
Dioxin-like
-
0%
non détecté
Genotoxicité (SOS)
+
60%
(13/21)
non applicable
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12
Activité estrogénique des eaux avant
traitement complémentaire
1,4
1,2
bio-E2-EQ
E2-EQ ng/L
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Bw
Bw
Dw
Bw
Dw
Dw
Dw
Ew
Ew
Dw
Ew
Ew
Ew
Fw
Gw
Fw Gw
Stations
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Contribution des hormones, alkylphénols et
bisphénol A analysés dans les eaux
Substances
E2-EF
17b -estradiol
1
Ethinylestradiol
0,93
Estrone
0,02
17a-Estradiol
0,02
Estriol
0,17
4-NP mélange isomères
5,E-05
4-Nonylphénoxyacetic acid
4,10E-07
4-tert-octylphénol
1,10E-04
4 tert-butylphénol
1,20E-06
Bisphenol A
4,50E-05
Analyses
chimiques
Chem-E2-EQ =  (Ci × E2-EFi)
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14
Contribution des hormones, alkylphénols et
bisphénol A analysés dans les eaux
Exemple : STEU Dw
Substances
E2-EF
Conc. (ng/L)
Chem-E2-Eq (ng/L)
17b -estradiol
1
nd
-
Ethinylestradiol
0,93
nd
-
Estrone
0,02
4,9
0,10
17a-Estradiol
0,02
nd
-
Estriol
0,17
1,9
0,32
5,E-05
112
0,006
4-Nonylphénoxyacetic acid
4,10E-07
16
0,002
4-tert-octylphénol
1,10E-04
30
0,00004
4 tert-butylphénol
1,20E-06
150
0,007
Bisphenol A
4,50E-05
845
0,0003
4-NP mélange isomères
 = 0,43 ng/L
Bio-E2-Eq =
0,94 ng/L
% Chimie / Bioessai
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46 %
15
Contribution des hormones, alkylphénols et
bisphénol A analysés dans les eaux
1,4
 Contribution variable des hormones et des
AKPs : >1% à 80%
 Principaux contributeurs :
estrone > 17b-estradiol > 4NP, BPA
1,2
1
bio-E2-EQ
chem-E2-EQ
ng/L
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Aw
Bw
Bw
Dw
Bw
Dw
Dw
Dw
Ew
Ew
Dw
Ew
Ew
Ew
Fw
Gw
Fw Gw
Stations
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16
In vitro vs. analyses chimiques
ciblées: autres activités
• Activité anti-androgénique (1 échantillon): contribution faible
des AKP (< 1 %)
• Pas de données d’analyses ciblées de polluants connus
pour être actifs dans les bioessais : GR, AR, TR
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17
Eaux vs. échantillonneurs passifs
Eau
Extraction SPE
POCIS
SPMD
ER
ERE
bGlob
luciferase
D-luciferine
lux
Bioessais in vitro
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18
Eaux vs. échantillonneurs passifs
3 STEU : Aw, Dw, Ew
Activités
Eau
POCIS
SPMD
+
++
+/-
Glucocorticoïde
+/-
+
-
Androgénique
+/-
+
-
HAP-like
+
+/-
++
Anti-Androgénique
-
-
+
Thyroïdienne
-
-
+ (1 éch)
Anti-Thyroïdienne
-
-
-
Genotoxicité (SOS)
+
Non mesuré
Non mesuré
Estrogénique
 Cohérence avec
polarité des polluants,
e.g. hormones /
POCIS, HAP / SPMD
Apport des
échantillonneurs
passifs : concentrer /
révéler activités non
détectées en SPE
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19
Effet des procédés de traitements
complémentaires
Aw
O3 + CAG
Bw
O3 + H2O2
UV + H2O2 O3 + H2O2
Dw
UV + H2O2
Adsorbants alternatifs
S
S
S
CAG argile zéolite
E
S
E
S
E
S
E
S
E
S
E
Estrogénique
+
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-
-
+
Androgénique
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Glucocorticoïde
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
PAH-like
-
-
-
-
-
-
-
-
++
+
-
-
-
-
Génotoxicité directe
++
+
-
-
++
++
++
-
-
-
++
-
-
++
Génotoxicité indirecte
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
++
Une diminution de l’effet après traitement
Pas de diminution de l’effet après traitement
- : en dessous des seuils de détection, impossible de conclure
sur l’efficacité
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20
Effet de la lagune de finition
ER
Estrogénicité
3,5
E2-Eq ng/L
3
2,5
2
Activités œstrogénique
et génotoxique :
variation aléatoire en
sortie de lagune de
finition
1,5
1
0,5
0
E
S
E - j0
S - j0
E - j14
S - j14
E - j28
S - j28
Ew - lagune
SOS +/-S9
Génotoxicité
2,4
Résultats à vérifier au
regard des temps de
séjour
Fact. Induction
2,2
2
1,8
sans S9
1,6
avec S9
1,4
1,2
1
E
S
E - j0
S - j0
E - j14
S - j14
E - j28
S - j28
Cohérence avec chimie
ciblée (cf. Capdeville)
Ew - lagune
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21
Eaux : conclusions
Profils d’activités
Fréquente: œstrogénique, génotoxiques et HAP-like
Parfois : glucocorticoïdes, androgénique
Jamais détectées : (anti)TR, dioxin-like
Intérêt des échantillonneurs passifs pour concentrer et révéler
des activités (GR, AR)
Procédés de traitement globalement efficaces pour abattre ces
activités (résultats à approfondir pour la lagune de finition)
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22
Evaluation des boues
3 Boues de STEU
3 procédés de traitement
- Séchage solaire
- Compostage
- Lit de séchage planté de roseaux
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23
Protocole de bioanalyse des boues
Lyophilisation
Extraction ASE
(AcE / DCM / CH)
ER
ERE
bGlob
luciferase
D-luciferine
lux
Bioessais in vitro
Extrait
organique
(DMSO)
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24
ER
Act. œstrogénique
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
BaP-Eq µg/g
E2-Eq ng/g
Boues : activités PE
10
0
Entrée
Sécheur
Sortie
Sécheur
Cs
Brute
- Pas
d’activité
AR, Compost
GR etHaut de
Entrée
Sortie
Brute
Sécheur
filtre
TR Sécheur
détectable
roseaux
Compost Haut de Milieu de Fond de
filtre
filtre
filtre
roseaux roseaux roseaux
Fs
Cs
Is
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Fs
- Traitements peu
efficaces pour abattre
AhR24h
14
les
activités
Anti-AR
Act. anti-androgénique
12
10
TCDD-Eq ng/g
Flu-Eq µg/g
AhR4h
-60Fortes activités
50
estrogénique
(ER) et
40
anti-androgénique
30
(anti-AR)
20
Tox.
Entrée
Sortie
Sécheur Sécheur
Cs
Brute
Compost Haut de Milieu de Fond de
filtre
filtre
filtre
roseaux roseaux roseaux
Fs
Is
8
6
4
2
0
Entrée
Sécheur
Sortie
Sécheur
Cs
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Brute
Compost Haut de
filtre
roseaux
Fs
25
Boues : activités dioxin-like
Entrée
Sécheur
Sortie
Sécheur
Cs
- Procédés
de
Compost Haut de Milieu de
filtre
filtre
traitements
roseaux roseaux
inefficaces
pourIs
Fs
abattre les activités
Brute
HAP-like
AhR4h
60
50
BaP-Eq µg/g
ER
- Importantes
activités HAP-like et
dioxin-like en entrée
et sortie
40
30
20
10
0
Entrée
Sécheur
Fond de
filtre
roseaux
Sortie
Sécheur
Brute
Cs
Anti-AR
Compost Haut de Milieu de Fond de
filtre
filtre
filtre
roseaux roseaux roseaux
Fs
Is
AhR24h
Dioxin-like
14
12
TCDD-Eq ng/g
10
Entrée
Sortie
Sécheur Sécheur
Cs
Brute
Compost Haut de Milieu de Fond de
filtre
filtre
filtre
roseaux roseaux roseaux
Fs
Is
8
6
4
2
0
Entrée
Sécheur
Sortie
Sécheur
Brute
Compost Haut de Milieu de Fond de
filtre
filtre
filtre
roseaux roseaux roseaux
Cs
Fs
Colloque final du programme de recherche ECHIBIOTEB
- 3 février 2015
- Villeurbanne
Is
26
Boues : conclusions
Profils d’activités marqués
Fortes activités œstrogénique, anti-androgénique et dioxin-like
Autres activités non détectées
Procédés de traitement pas ou peu efficaces pour abattre ces
activités
Certains verrous méthodologiques
- interférence matricielle (e.g. ac humiques) : cytotoxicité,
« quenching »
- SOS Chromotest : problèmes de blancs positifs (données génotox
ininterprétables)
 Améliorer la préparation d’échantillon (clean-up) pour une meilleure
comparaison chimie ciblée / bioessais in vitro
Colloque final du programme de recherche ECHIBIOTEB - 3 février 2015 - Villeurbanne
27
Bilan sur la compartimentation des
activités in vitro
Activités
Eaux
POCIS
SPMD
Boues
+
++
+/-
+
Glucocorticoïde
+/-
+
-
-
Androgénique
+/-
+
-
-
Anti-Androgénique
+/-
-
+
++
Thyroïdienne
-
-
+/-
-
HAP-like
+
+/-
+
++
Dioxin-like
-
-
-
++
Genotoxicité (SOS)
+
Non
mesuré
Non
mesuré
(+)
Estrogénique
Colloque final du programme de recherche ECHIBIOTEB - 3 février 2015 - Villeurbanne
28
Conclusions
Apports des bioessais in vitro basés sur le mécanisme
d’action
 Outils de screening sensibles et quantitatifs
 Profils d’activité (e.g. eaux vs boues)
 Intérêt du couplage bioessais / échantillonneurs passifs
(concentration, répartition)
 Informations complémentaires à l’analyse chimique ciblée
• Identité des molécules détectées ?
 Cf. Approche EDA (présentation de Nicolas Creusot)
 Meilleur diagnostic de danger
 Surveillance de sites, optimisation et suivi de procédés
29
Besoins / Développements

Batterie de tests: autres « endpoints » à considérer



Standardisation/Normalisation des méthodes




Projet ANR-PROOFS (progestagènes)
Projet UE-FP7-SOLUTIONS (batterie large de bioessais)
AQUAREF (activité estrogénique)
Etudes inter-labos (réseau NORMAN; SPI-Effect-based tools/ R. Käse,
Eawag)
Norme ISO en cours (activité estrogénique)
Signification des TEQ en terme de danger ?
Perturbateurs endocriniens : intégration de modèles in vivo
Vers des valeurs seuils in vitro ?
30
Merci de votre attention