Untersuchungen zum subklinischen Verlauf einer Lawsonia

Tierärztliche Hochschule Hannover
Klinik für kleine Klauentiere
und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik
und Institut für Pathologie
______________________________________________________
Untersuchungen zum subklinischen Verlauf
einer Lawsonia-intracellularis-Infektion bei Schweinen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.)
Vorgelegt von
Daniel Brandt
aus Soltau
Hannover 2008
I
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. M. Wendt
Univ.-Prof. Dr. W. Baumgärtner, Ph.D.
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. M. Wendt
2. Gutachter:
PD Dr. E. große Beilage
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2008
II
Meiner Familie
III
IV
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung......................................................................................................1
2
Literaturübersicht ........................................................................................2
2.1
Lawsonia intracellularis .......................................................................... 3
2.1.1
Morphologie........................................................................................ 3
2.1.2
Übertragungswege ............................................................................. 6
2.1.3
Epidemiologie..................................................................................... 7
2.1.4
Pathogenese ...................................................................................... 9
2.1.5
Eindringen in die Wirtszelle .............................................................. 11
2.1.6
Intrazelluläre Vermehrung ................................................................ 11
2.1.7
Zellproliferation................................................................................. 12
2.2
Krankheitsbilder ................................................................................... 13
2.2.1
Porzine intestinale Adenomatose ..................................................... 13
2.2.2
Subklinische Ileitis ............................................................................ 15
2.2.3
Nekrotisierende Enteritis .................................................................. 15
2.2.4
Regionale Ileitis ................................................................................ 15
2.2.5
Porzine hämorrhagische Enteropathie ............................................. 16
2.3
Immunität ............................................................................................. 19
2.4
Diagnostik ............................................................................................ 22
2.4.1
Klinik................................................................................................. 22
2.4.2
Pathologie ........................................................................................ 22
2.4.2.1
2.4.3
2.4.3.1
Makroskopische Untersuchung
23
Labordiagnostische Verfahren.......................................................... 23
Indirect Immunoflourescent Antibody Test (IFAT) und
Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA)
23
2.4.3.2
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
24
2.4.3.3
Polymerase Chain Reaktion (PCR)
24
2.4.3.4
Histologie
25
2.4.3.5
Immunomagnetic beads und ATP Biolumineszenz
26
2.5
Kontroll- und Prophylaxe-Maßnahmen................................................ 28
2.5.1
Desinfektion...................................................................................... 28
2.5.2
Fütterung .......................................................................................... 28
2.5.3
Antibiotische Behandlung ................................................................. 30
V
Inhaltsverzeichnis
2.5.4
Vakzine............................................................................................. 31
Material und Methoden ..............................................................................33
3
3.1
Bestand und Versuchsgruppe ............................................................. 33
3.2
Klinische Untersuchung ...................................................................... 35
3.2.1
Probenentnahme .............................................................................. 36
3.3
PCR .................................................................................................... 37
3.3.1
DNA-Extraktion aus Kotproben ........................................................ 37
3.3.2
Protokoll ........................................................................................... 37
3.3.3
Replikation der DNA mittels PCR ..................................................... 38
3.3.4
Agarose-Gelelektrophorese.............................................................. 39
3.3.5
Auswertung der Gele........................................................................ 39
Serologie ............................................................................................. 40
3.4
3.4.1
Kompetitiver Enzyme Linked Immunsorbent Assay.......................... 40
3.5
Pathomorphologische Untersuchungen .............................................. 41
3.5.1
Sektion ............................................................................................. 41
3.5.2
Gewebeproben für die lichtmikroskopische Untersuchung............... 43
3.5.3
Mikroskopische Beurteilung der HE-gefärbten Schnitte ................... 44
3.6
Immunhistologische Untersuchung ...................................................... 47
3.6.1
Protokoll der Immunhistologie (ABC-Methode) für Paraffinschnitte.. 47
3.7
Sonstige Untersuchungen und Behandlungen der Versuchstiere ........ 51
3.7.1
Diagnostische Untersuchungen zum Ausschluss weiterer Erreger
von Darmerkrankungen .................................................................... 51
3.8
Verdaulichkeitsanalyse ........................................................................ 55
3.8.1
Chymusgewinnung ........................................................................... 55
3.8.2
Chemische Analysen........................................................................ 55
3.8.2.1
Weender Rohnährstoffe
55
3.8.2.2
Mineralstoffanalytik
56
3.8.2.3
Brennwert
56
3.8.3
3.9
4
Berechnungen .................................................................................. 56
Statistische Auswertung...................................................................... 57
Ergebnisse..................................................................................................58
4.1
Nachweis der Lawsonia-intracellularis-Infektion.................................. 58
4.2
Pathomorphologische Untersuchungen .............................................. 72
4.3
Immunhistologische Untersuchungen auf Lawsonia-intracellularis
94
VI
Inhaltsverzeichnis
4.4
5
Verdaulichkeitsanalyse ...................................................................... 102
Diskussion................................................................................................104
5.1
Klinische Befunde .............................................................................. 104
5.2
Erregerausscheidung und Serologie .................................................. 105
5.3
Makroskopische Untersuchungen ...................................................... 109
5.4
Histologische Befunde ....................................................................... 110
5.5
Immunhistologische Untersuchung .................................................... 114
5.6
Mastleistung und präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen.............. 115
5.7
Schlussfolgerungen
117
6
Zusammenfassung ..................................................................................120
7
Summary
8
Schrifttumsverzeichnis............................................................................125
9
Anhang......................................................................................................149
123
9.1
Ergebnisse für die einzelnen Versuchstiere
149
9.2
Bezugsquellen von Geräten und Verbrauchsmaterialien ..................... 156
9.3
Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Antikörper .............. 159
9.4
Lösungen und Puffer............................................................................ 161
9.4.1
Immunhistologie
161
9.4.2
Histologie........................................................................................ 162
9.4.3
Sektion ........................................................................................... 162
9.4.4
PCR................................................................................................ 163
VII
Tabellen und Abbildungsverzeichnis
Tabellen und Abbildungsverzeichnis
Tabelle 1:
Nachweis von LI bei verschiedenen Tierspezies mit proliferativer
Enteropathie (LAWSON u. GEBHART 2000). ............................................................ 5
Tabelle 2:
Vergleich der makroskopischen und histologischen Veränderungen bei
Infektion des Darms mit LI oder PCV2 (JENSEN et al. 2006b). ............................... 18
Tabelle 3:
Übersicht zu den diagnostischen Möglichkeiten zum Nachweis von LI
und spezifischer Antikörper beim Schwein (nach KROLL et al. 2005b).................... 27
Tabelle 4:
Wirkung verschiedener Desinfektionsmittel gegen LI (COLLINS et al.
2000a).
............................................................................................................ 28
Tabelle 5:
Minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentrationen für LI
(WATTANAPHANSAK et al. 2007)........................................................................... 31
Tabelle 6:
Zeitplan für die Untersuchung und Probenentnahme......................... 35
Tabelle 7:
Probenplan für die Sektion. ................................................................ 43
Tabelle 8:
Scoring-System für die histologische Beurteilung des Darmes in einer
HE-Färbung. ............................................................................................................ 45
Tabelle 9:
Scores zur immunhistologischen Beurteilung einzelner Darmabschnitte
und Lymphknoten. .................................................................................................... 50
Tabelle 10:
Ergebnisse kultureller Untersuchungen von Kotproben auf bakterielle
Durchfallerreger während des Versuchsverlaufes. ................................................... 53
Tabelle 11:
Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen auf Brachyspira
(B.) hyodysenteriae und B. pilosicoli (PCR) während des Versuchsverlaufes. ......... 54
Tabelle 12:
Ergebnisse der parasitologischen Kotuntersuchungen von sechs
Versuchstieren.......................................................................................................... 54
Tabelle 13:
Kotkonsistenz während der Untersuchungsperiode (n=60 Schweine) 61
Tabelle 14:
Vergleich zwischen PCR- und ELISA-Ergebnissen (n=60 Schweine, +
= positiv, - = negativ, ? = fraglich)............................................................................. 61
Tabelle 15:
Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung von Tieren (n=21),
bei denen mittels PCR keine LI-Ausscheidung im Kot nachgewiesen werden konnte,
im Vergleich zur Serologie (+ = positiv, - = negativ, ? = fraglich).............................. 62
Tabelle 16:
Ergebnisse der Kotuntersuchung auf LI mittels PCR zu den
festgelegten Untersuchungszeitpunkten................................................................... 66
Tabelle 17:
Ergebnisse der serologischen Untersuchungen auf Antikörper gegen
LI mittels Blocking-ELISA zu den festgelegten Untersuchungszeitpunkten.............. 70
VIII
Tabellen und Abbildungsverzeichnis
Tabelle 18:
Durchschnittliches Körpergewicht zum Absetzen (4 Wo) und mittlere
tägliche Gewichtszunahme bis zur 8. Lebenswoche bei LI infizierten und LI-negativen
Tieren (unterschiedliche Buchstaben: p<0,05). ........................................................ 72
Tabelle 19:
Korrelation zwischen den Score-Werten für histologische Läsionen am
Darm an metrisch zuvor festgelegten und an frei wählbaren Lokalisationen
(Korrelationskoeffizient r, Signifikanz p). .................................................................. 74
Tabelle 20:
Ergebnisse der histologischen Beurteilung bei Versuchs- (n=51) und
Kontrolltieren (K, n=5). Neben der pathologischen Diagnose wird der Gesamtscore
für 9 untersuchte Darmlokalisationen angegeben. ................................................... 78
Tabelle 21:
Ergebnis der immunhistologischen Untersuchungen von Darm und
Lymphknoten auf LI in Abhängigkeit vom Sektionszeitpunkt.................................... 98
Tabelle 22:
Durchschnittliche IH-Scores (x±s) für die untersuchten Darmabschnitte
in Gruppe 2 unter Berücksichtigung des zeitlichen Abstands zwischen erstem
Infektionsnachweis (PCR / ELISA) und Sektion (unterschiedliche Buchstaben
p<0,05).
Tabelle 23:
101
Korrelationen zwischen Histologie-Score und Immunhistologie-Score
für die 4 untersuchten Darmabschnitte innerhalb der Gruppen 1-3 (r= Spearman´s
Rang Korrelationskoeffizient, Gruppe 2: Ileum, Papilla ilealis n=22, Caecum, Colon
102
ascendens n=21.
Tabelle 24:
Präzäkale Verdaulichkeiten für verschiedene Futterparameter bei
einem LI-negativen Tier sowie Gruppe 2 (Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor
Sektion) und Gruppe 3 (Nachweis der LI-Infektion > 3 Wo vor Sektion) im Vergleich
(unterschiedliche Buchstaben p<0,05). .................................................................. 103
Tabelle 25: Übersicht der Einzeltierbefunde (Körpermasse, Kotkosistenz, PCR,
ELISA, Histo-Score und Immunhisto-Score).
Abbildung 1:
Serologischer
Nachweis
149
von
Antikörpern
gegen
LI
in
Schweinebetrieben (Herden=400, Proben=13520) aus Spanien (Herdenprävalenz
und durchschnittliche Prävalenz innerhalb der Schweineherden) (LAPUENTE et al.
2006).
Abbildung 2:
8
Serologische
Untersuchung
auf
(Herdenscreening in 694 Betrieben, (WENDT et al. 2006b).
Antikörper
gegen
LI
9
IX
Tabellen und Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3:
Differenzierung der verschiedenen
Formen
der durch
LI
ausgelösten porzinen proliferativen Enteropathie (nach SIMS u. GLASTONBURY
1996; POHLENZ 2005).
19
Abbildung 4:
Belegungsplan im Flatdeckabteil des Versuchsbetriebes.
34
Abbildung 5:
Verteilung der erstmalig positiven Nachweise einer LI-Infektion
(PCR, ELISA oder Immunhistologie) zwischen der 6. und 10. Lebenswoche (LW) der
Versuchstiere innerhalb der einzelnen Boxen (1-6) im Flatdeck (p>0,05).
Abbildung 6:
59
Anteil der bis zur jeweiligen Lebenswoche mittels PCR, ELISA
oder Immunhistologie als LI-infiziert erkannten Tiere pro Flatdeckbox (6. bis 10.
Lebenswoche).
Abbildung 7:
60
Zeitpunkte des erstmalig positiven PCR Nachweises im Kot
mittels PCR (n=39 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist
aus Tab. 17 zu entnehmen.
62
Abbildung 8:
Dauer der LI-Ausscheidung (n=39).
63
Abbildung 9:
Anteil der Erreger ausscheidenden Tiere innerhalb der
Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig
untersuchten Tiere ist aus Tab. 16 zu entnehmen.
Abbildung 10:
64
Anteil der insgesamt per PCR als LI-Ausscheider erkannten
Schweine an der gesamten Gruppe (n=60) zur jeweiligen Lebenswoche.
Abbildung 11:
65
Zeitpunkte der mittels ELISA festgestellten Serokonversion (n=49
von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 18 zu
entnehmen.
Abbildung 12:
67
Anteil
serologisch
positiver
Schweine
innerhalb
der
Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig
untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen.
Abbildung 13:
Anteil der insgesamt gegen LI serokonvertierten Schweine an
der gesamten Gruppe (n=60, vgl. Tab. 17) zur jeweiligen Lebenswoche.
Abbildung 14:
68
Vergleich zwischen dem Zeitpunkt der ersten feststellbaren
Erregerausscheidung mittels PCR und dem der Serokonversion (n=39).
Abbildung 15:
68
69
Gesamtanteil aller als LI-infiziert erkannten Schweine unter
Berücksichtigung aller verwendeten diagnostischen Verfahren (PCR, ELISA,
Immunhistologie) zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt.
Abbildung 16:
71
Ileozäkaler Übergang mit geringgradigen Hyperämien und
geringgradig verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 63).
75
X
Tabellen und Abbildungsverzeichnis
Abbildung 17:
Ileum mit geringgradigen Hyperämien und geringgradig
76
verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 45).
Abbildung 18:
Caecum, gering- bis mittelgradig proliferierte Krypten (Tier 7). 80
Abbildung 19:
Ileum, hochgradig proliferative Ileitis (Tier 17).
Abbildung 20:
Ileum, hochgradig proliferierte Krypten mit Zelldetritus (Tier 19).
81
82
Abbildung 21:
Ileum, hochgradig proliferierte Krypte (Tier 19).
83
Abbildung 22:
Caecum, hochgradige fibrinös-ulzerative und proliferative
Veränderungen (Tier 49).
Abbildung 23:
84
Caecum, normales Krypepithel mit vermehrten Becherzellen und
apoptotischen Körperchen (Tier 50).
Abbildung 24:
85
Ileum, stark vermehrte Becherzellen und deutlich in der Länge
reduzierte Darmzotten (Tier 23).
Abbildung 25:
86
Caecum, immunhistologische Darstellung von LI spezifischem
Antigen in Krypten und Rundzellen (Tier 19).
Abbildung 26:
87
Caecum, immunhistologischer Nachweis von LI spezifischem
Antigen in einer Krypte (Tier 19).
Abbildung 27:
88
Elektronenmikroskopische Aufnahme einer mit LI infizierten
Darmepithelzelle. (Tier 49). Vergrößerung x 12.500
Abbildung 28:
89
Durchschnittliche Ausprägung der histologischen Veränderungen
in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR,
ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer Gesamtscore für neun
Darmlokalisationen: 252); unterschiedliche Buchstaben: p<0,05.
Abbildung 29:
Korrelation
zwischen
dem
Grad
91
der
histologischen
Veränderungen (Gesamtscore für neun Darmlokalisationen) und dem zeitlichen
Abstand zwischen erstem Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder ELISA, n=44)
und der Sektion (y= -4,3985x+35,598; r= -0,5753, p<0,001).
Abbildung 30:
92
Grad der histologischen Veränderungen an den einzelnen
untersuchten Darmlokalisationen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen
erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer
Score 28); unterschiedliche Buchstaben p<0,05.
Abbildung 31:
93
Immunhistologische Befunde der Untersuchung auf LI (IH positiv
(+) oder negativ (-)) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem
Infektionsnachweis (PCR und/oder ELISA) und dem Zeitpunkt der Sektion.
95
XI
Tabellen und Abbildungsverzeichnis
Abbildung 32:
Vergleich aller immunhistologischen Ergebnisse in Abhängigkeit
von der untersuchten Lokalisation (Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand
zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion.
Abbildung 33:
Vergleich
der
immunhistologisch
positiven
96
Ergebnisse
in
Abhängigkeit von den einzelnen untersuchten Lokalisationen (Darm/Lymphknoten)
und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder
ELISA) und der Sektion.
Abbildung 34:
Vergleich
97
der
Häufigkeit
des
LI-Nachweises
mittels
Immunhistologie für die untersuchten Lokalisationen an Darm (max. IH-Score pro
Darmabschnitt: 6) und Lymphknoten (max. IH-Score pro Ln: 3) in Abhängigkeit vom
zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und
der Sektion (unterschiedliche Buchstaben p<0,05).
Abbildung 35:
99
Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung des LI-
Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen (Gesamt-IH-Score max. 24) und
dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der
Sektion (n=45, y=-1,2522x + 9,5387; r= -0,6878, p<0,001).
Abbildung 36:
100
Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung des LI-
Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen sowie in den untersuchten
Lymphknoten (Gesamt-IH-Score max. 30) und dem zeitlichen Abstand zwischen
erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion (n=45, y=-1,0248x +
11,225; r= -0,6320, p<0,001).
101
XII
Verzeichnis der Abkürzungen
Verzeichnis der Abkürzungen
A
Ampere
Abb.
Abbildung
ABC
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
App
Actinobacillus pleuropneumoniae
B.
Brachyspira
Betr.
Betrieb
BHZP
Bundeshybridzuchtprogramm
bp
Basenpaare
BSA
Bovines Serumalbumin
DAB
3´3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DMSO
Dimethylsulfoxid
°C
Grad Celsius
C.
Campylobacter
CD
Cluster of differentiation
cm
Zentimeter
DE
Deutsches Edelschwein
DL
Deutsche Landrasse
E. coli
Escherichia coli
EBE
Essigsäure-N-butylester
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
F
Fimbrientyp
FA
Firma
g
Gramm
GE
Brennwert
ggr.
geringgradig
Gr.
Gruppe
h
Stunde
HE
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
hgr.
hochgradig
Ig
Immunglobulin
IFAT
immunofluorescence antibody test
IH
immunhistologisch
XIII
Verzeichnis der Abkürzungen
kDa
kiloDalton
kg
Kilogramm
KGW
Körpergewicht
kl.
klinisch
LI
Lawsonia intracellularis
Lnn.
Lymphknoten
LPS
Lipopolysaccharid
LsaA
Lawsonia surface Antigen A
LW
Lebenswoche
M-Zellen
microfold Zellen
MIC
minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentration
min
Minuten
mg
Milligramm
mgr.
mittelgradig
mm
Millimeter
ml
Milliliter
Mo
Monat
n
Anzahl der Tiere
nm
Nanometer
NE
nekrotisierende Enteritis
NL
Niederlande
OD
optische Dichte
OM
Ohrmarke
p
Signifikanzniveau
PBS
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PCV2
porzines Circovirus Typ 2
pc VQ
präzäkale Verdaulichkeit
PHE
porzine hämorrhagische Enteropathie
PI
Prozentsatz der Inhibition
p.i.
post infectionem
PIA
porzine intestinale Adenomatose
pos
positiv
PPE
porzine proliferative Enteropathie
XIV
Verzeichnis der Abkürzungen
ppm
parts per million
r
Korrelationskoeffizient
r-DNA
ribosomale DNA
RI
Regionale Ileitis
RNA
Ribonukleinsäure
s
Standardabweichung
S.
Salmonella
SAS
Statistical Analysis System
serol.
serologisch
ssp.
Subspezies
Tab.
Tabelle
Tierabh.
Tierabholung
TAE
Tris-Acetat, EDTA
µl
Mikroliter
U/min
Umdrehungen pro Minute
USA
United States of America
V
Volt
VDLUFA
Verband
Deutscher
Landwirtschaftlicher
Untersuchungs-
und
Forschungsanstalten
W
Wochen
WS
Warthin-Starry
XV
XVI
Einleitung
1
Einleitung
Während das klinische Krankheitsbild der porzinen proliferativen Enteropathie (Ileitis,
porzine intestinale Adenomatose (PIA)) schon länger bekannt ist (BIESTER u.
SCHWARTE 1931), wurde Lawsonia intracellularis (LI) erst vor wenigen Jahren,
nachdem es in Zellkultur gezüchtet und vermehrt werden konnte, als ihr Erreger
beschrieben (LAWSON et al. 1993, McOrist et. al. 1995a). Der Erreger ist weltweit
verbreitet
und
führt
Schweineproduktion.
zu
Nach
erheblichen
einer
neueren
wirtschaftlichen
Studie
Verlusten
zeigen
in
in
der
93-97 %
aller
europäischen Schweineherden Tiere eine seropositive Reaktion auf LI (HARDGE et
al. 2006).
Bei dieser Erkrankung handelt es sich um einen Krankheitskomplex, der einen
unterschiedlichen Krankheitsverlauf nehmen kann. Die Mehrzahl der Infektionen mit
LI verläuft subklinisch. Eine Infektion kann jedoch auch eine klinisch apparente
Durchfallerkrankung hervorrufen, Tierverluste beziehen sich dabei eher auf
Einzeltiere und spielen eine untergeordnete Rolle. Wirtschaftliche Schäden werden
hauptsächlich durch die Herabsetzung der Mastleistung und eine ungleiche
Entwicklung der Mastgruppen verursacht.
Das Ziel dieser Studie war es, den subklinischen Verlauf einer Feldinfektion mit LI
über den Zeitraum einer Aufzucht- und Mastperiode zu charakterisieren und
mögliche pathologische Veränderungen im Darmbereich zu beschreiben.
Zur Darstellung des Verlaufs der Infektion wurden die Tiere wöchentlich klinisch
untersucht, Kotproben mittels PCR auf die Ausscheidung von LI hin überprüft und
Blutproben mittels ELISA auf das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern
gegen LI kontrolliert.
Anhand der Ergebnisse der PCR und der serologischen Untersuchung wurden
wöchentlich 5 Tiere selektiert und pathologisch-anatomisch, mit speziellem
Augenmerk auf mögliche pathologische Veränderungen des Darms, untersucht.
Außerdem
wurden
die
Proben
histologisch
untersucht
und
LI-Antigen
immunhistologisch nachgewiesen.
Um mögliche Auswirkungen von Darmveränderungen auf die Futterverwertung
feststellen zu können, wurden die Tiere mit einem Marker versetzten Futter gefüttert,
und die Auswirkungen auf die Verdaulichkeit untersucht.
1
Literaturübersicht
2
2.1
Literaturübersicht
Lawsonia intracellularis
Der erste Fallbericht einer porzinen intestinalen Adenomatose wurde 1931
veröffentlicht, zu dieser Zeit war die Identität des Erregers noch unklar (BIESTER u.
SCHWARTE 1931). Erst ab 1974 wurden Anstrengungen unternommen, den Erreger
zu identifizieren (GEBHART et al. 1983). Aufgrund dieser Studien wurde
Campylobacter (Vibrio) sputorum ssp. mucosalis als möglicher Erreger angesehen.
Andere Autoren vermuteten aufgrund ihrer Untersuchungen Campylobacter (C.) coli,
C. jejuni, C. hyointestinales oder C. mucosalis als Ursache (LAWSON et al. 1985).
Durch diese uneinheitliche Klassifizierung wurde der im Darmepithel erkrankter
Schweine gefundene Erreger auch als „Ileal symbiont intracellularis“ oder
„Campylobacter-like bacterium“ bezeichnet (GEBHART et al. 1990). Allerdings
konnten experimentell durch keine der genannten Campylobacter-Arten die
charakteristischen Läsionen induziert werden (GEBHART et al. 1991). Die fehlende
Nachweisbarkeit von Campylobacter bei einigen Feldinfektionen ließ vermuten, dass
die intestinale Adenomatose durch einen anderen Erreger hervorgerufen wird
(GEBHART et al. 1993).
Aufgrund der Annahme, es mit einem völlig neuen Erreger zu tun zu haben, wurden
für diesen Erreger spezifische DNA-Sonden hergestellt (MCORIST et al. 1995a).
Durch Sequenzvergleiche der 16 sRNA konnte gezeigt werden, dass es sich um ein
neues Genus und eine neue Spezies in der Klasse der Proteobakterien handelt
(GEBHART et al. 1993). Der Erreger zeigt eine 91 %ige Übereinstimmung in der
RNA-Sequenz
mit
dem
Sulfat
reduzierenden
Proteobakterium
Desulfovibrio
desulfuricans ATCC 27774.
Als neue Spezies wurde das Bakterium das erste Mal 1995 als LI klassifiziert und
beschrieben, nachdem seine Kultivierung in einer Rattenenterozyten-Zelllinie gelang
und eine Reproduktion der Erkrankung mit diesem Keim durchgeführt werden konnte
(LAWSON et al. 1993; MCORIST u. LAWSON 1993; MCORIST et al. 1995a)
2
Literaturübersicht
2.1.1
Morphologie
Der Erreger LI ist ein Gram-negatives, gebogenes bis sigmoides Stäbchen mit
zugespitzten Enden. Die Größe beträgt 1,25-1,75 µm x 0,5-1,5 µm. Das Bakterium ist
unpigmentiert, nicht sporenbildend, kapsellos mit einem einzelnen langen unipolaren
Flagellum. Die Bakterienwand wird durch eine dreischichtige Umhüllung gebildet,
welche von der zytoplasmatischen Membran getrennt ist (GEBHART et al. 1993).
In infizierten intestinalen Zellen befindet sich der Erreger frei im apikalen Zytoplasma.
Die Vermehrung erfolgt über eine äquatoriale Zellteilung (LAWSON et al. 1993).
Eine Eigenbeweglichkeit des Bakteriums konnte in Kulturversuchen nachgewiesen
werden. Damit ist der Erreger in der Lage, chemotaktischen Reizen folgend seine
Zielzellen aktiv aufzusuchen und Darmzellen in hoher Anzahl zu infizieren und für LI
typische Läsionen im Darmgewebe hervorzurufen (LAWSON u. GEBHART 2000).
Die Ausbildung des Flagellums scheint stark reguliert zu sein und wurde bisher
lediglich extrazellulär beschrieben, nicht aber in infizierten Zellen. Bei extrazellulär
liegenden Bakterien sind zytoplasmatische Vakuolen oder zumindest ähnlich große
elektronendichte Körperchen im Zytoplasma beschrieben worden, diese Strukturen
fehlen bei intrazellulär liegenden Lawsonien. Eventuell handelt es sich bei diesen
Strukturen um Energiereserven für das Leben außerhalb von Wirtszellen (MCORIST
et al. 1993).
Kultivierungsversuche in zellfreien Medien gelangen nicht (LAWSON u. GEBHART
2000), LI zeigt ein obligat intrazellulares Wachstum. Eine Kultivierung des Erregers
erfolgt unter mikroaerophilen Bedingungen bei 5-18 % O2 und einer Zellschichtdicke
von 2-5 mm (JENSEN et al. 2000; GUEDES u. GEBHART 2003b).
Eine Kultivierung in embryonierten Hühnereiern wurde von JONES et al. (1993d)
durchgeführt. Nach 4-5 Tagen Bebrütung konnten Schweine mit diesen Eiern infiziert
werden, sie wiesen 10 bis 29 Tage post infectionem die für die porzine proliferative
Enteropathie typischen Läsionen am Darm auf.
Die unreifen Enterozyten scheinen die wichtigsten Zielzellen der Lawsonien zu sein.
Weiter konnten Lawsonien in Makrophagen und in den Krypten von Tonsillen
nachgewiesen werden (LAWSON u. GEBHART 2000). Infizierte Makrophagen sind
in der Lamina propria betroffener Darmabschnitte und Lymphknoten zu finden.
Abgesehen vom Schwein konnten LI-Infektionen bei vielen anderen Tierspezies
nachgewiesen werden (DROLET et al. 1996) Die durch LI hervorgerufenen Läsionen
variieren bei den verschiedenen Spezies bezüglich Lokalisation und histologischen
3
Literaturübersicht
Details, allen betroffenen Tierspezies ist aber eine intrazelluläre Ansiedlung der
Bakterien und eine Proliferation der Enterozyten gemein (LEBLANC et al. 1993).
Das breite Wirtsspektrum (Tab. 1) von LI birgt ein zooanthroponotisches
Gefährdungspotential, eine Infektion des Menschen konnte allerdings bis jetzt nicht
nachgewiesen werden (MICHALSKI et al. 2006; JACOBSON et al. 2007).
4
Literaturübersicht
Tabelle 1:
Nachweis
von
LI
bei
verschiedenen
Tierspezies
mit
proliferativer Enteropathie (LAWSON u. GEBHART 2000)
Spezies
Charakteristika der
Referenz
intrazellulären
Bakterien
Blaufuchs
IO
ERIKSEN et al. 1990
(Alopex lagopus)
Weißwedelhirsch
27 k ea, 16 S rDNA; COOPER et al. 1996
(Odocoileus virginianus)
Gewebe-PCR
DROLET et al. 1996
Hund
27 k ea
LEBLANC et al. 1993
Emu
27 k ea; 16 S rDNA
LEMARCHAND et al.
(Dromaius
1997
novaehollandiae)
Meerschweinchen
IO
ELWELL et al. 1981
Hamster
27 k ea; Kultur;
MCORIST et al. 1987
(Mesocricetus
16 S rDNA
STILLS 1991
auratus)
PEACE et al. 1994
Pferd
Gewebe-PCR; 27 k ea
WILLIAMS et al. 1996
Rhesusaffe
27 k ea
KLEIN et al. 1999
27 k ea; 16 S rDNA;
MCORIST et al. 1989
Kultur
GEBHART et al. 1993
(Macaca mulata)
Schwein
LAWSON et al. 1993
Strauß
16 S rDNA
COOPER et al. 1996
27 k ea; 16 S rDNA
SCHOEB u. FOX 1990
IO
VANDENBERGHE et
(Struthio camelus)
Kaninchen
(Oryctolagus caniculus)
Ratte
al. 1985
Abkürzungen: 27 k ea = 25-27 kDa Hüllenantigen von LI nachgewiesen durch
Immunhistochemie; Kultur = Wachstum von LI in vitro; 16 S rDNA = Sequenzen der
5
Literaturübersicht
16 S RNA zeigen eine Übereinstimmung mit dem im Schwein nachgewiesenen
intrazellulärem Erreger >96 %; Gewebs-PCR = aus Gewebsläsionen extrahierte DNA
zeigt gleiche Sequenzen wie LI; IO = intrazellulär vorliegende Bakterien nur durch
Silber-Färbung oder im Elektronenmikroskop nachgewiesen
2.1.2
Übertragungswege
In frühen Berichten konnte bereits eine Schwein-zu-Schwein-Übertragung in Fällen
von akuter porziner hämorrhagischer Enteropathie (PHE) in Zuchtbetrieben
nachgewiesen werden (ROWLAND u. ROWNTREE 1972; LOVE et al. 1977a). Eine
Erregerübertragung von Schwein zu Schwein erfolgt über einen fäkal-oralen Weg.
Der ausgeschiedene Kot muss für eine Übertragung auf andere Schweine große
Mengen des Erregers beinhalten (MCORIST et al. 2003).
In einer Infektionsstudie konnten auch Versuchstiere infiziert werden, wenn sie mit
Schweinen, die mit einer nur geringen Dosis von LI infiziert wurden, in Kontakt
gebracht wurden (JORDAN et al. 2004). Dies bestätigte die Annahme, dass Kot die
Hauptquelle neuer Infektionen darstellt (GUEDES 2004).
Mechanische Faktoren wie Stiefel und Kleidung sowie der Eintrag über biologische
Faktoren wie Nager und Vögel können als mögliche Vektoren nicht ausgeschlossen
werden (GUEDES 2004). Neuere Studien haben gezeigt, dass bei Nagern
Lawsonien im Darm vorkommen können (COLLINS et al. 1999; BEDNAR 2006).
Vermutlich dient die Maus als Reservoir für LI, und spielt bei der Verbreitung des
Erregers eine entscheidende Rolle (BEDNAR 2006).
LI kann in Fäzes unter üblichen landwirtschaftlichen Bedingungen bis zu 2 Wochen
bei 5-15°C infektiös bleiben (COLLINS et al. 2000a) .
In
einer
dänischen
Studie
zur
Infektionsdynamik
von
LI
in
dänischen
Schweineherden (5 Herden) konnte die erste Ausscheidung von LI bei Tieren vier
Wochen nach dem Absetzen, bei einem mittlerem Gewicht von 18 kg gezeigt
werden. Die Ausscheidung konnte mit drei Untersuchungen bei einzelnen Tieren für
einen Zeitraum von bis zu 6 Wochen nachgewiesen werden. Die Ausscheidung
erreichte ihren Höhepunkt innerhalb der fünf untersuchten Herden etwa 8 Wochen
nach dem Absetzen bei einem durchschnittlichen Gewicht von 29 kg. Bei einem
Gewicht von 63 kg im Alter von 14 Wochen nach dem Absetzen konnte keine
Ausscheidung mehr nachgewiesen werden. In einigen Herden dieser Studie konnte
6
Literaturübersicht
bei einzelnen Tieren nach dem Absetzen ein positiver Antikörpertiter festgestellt
werden. Diese Tiere waren jedoch 2-4 Wochen später negativ. Die erste
Serokonversion konnte 6 Wochen nach dem Absetzen gezeigt werden. Im
Durchschnitt serokonvertierten alle untersuchten Tiere (n=100) zwischen der 8. und
14. Woche nach dem Absetzen. Die Serokonversion lag bei den meisten Tieren etwa
2 Wochen nach der ersten Erregerausscheidung. Abgesehen von einem Tier blieben
alle Tiere nach der Serokonversion bis zum Ende der Studie in Lebenswoche 22
positiv (VESTERGAARD et al. 2004).
JONES et al. (1993d) konnten LI eine Woche nach experimenteller Infektion im Kot
mittels PCR nachweisen. Die Ausscheidung nahm in der 2. Woche nach der Infektion
ab, hielt aber bis zu 4 Wochen an.
In einer anderen Infektionsstudie, in der nicht infiziertes Darmgewebe, sondern
kulturell gewonnene Lawsonien zur Infektion genutzt wurden, zeigte sich ein stärker
variierendes Ergebnis. Die Ausscheidung des Erregers war unregelmäßig und hielt
länger an. Bei 2 Tieren hielt die Ausscheidung bis Woche 8-10 nach Infektion an. Bei
der Sektion dieser beiden Tiere 3 Wochen nach der letzten Ausscheidung zeigten
sich noch Veränderungen im Darm, die auf einen Abheilungsprozess der LIspezifischen Veränderungen hindeuteten. Ein Nachweis im Darmgewebe mittels
Immunfluoreszenz gelang zu diesem Zeitpunkt nicht (SMITH u. MCORIST 1997). Bei
einer Infektionsstudie (GUEDES u. GEBHART 2003c) wurde der Erreger für einen
Zeitraum von bis zu 12 Wochen intermittierend ausgeschieden. Hieraus wird
ersichtlich, warum in vielen Schweine haltenden Betrieben eine stark mit LI belastete
Umwelt
vorliegt,
welche
Reinfektionen
und
Infektionen
in
verschiedenen
Altersgruppen ermöglicht (MCORIST et al. 2003).
2.1.3
Epidemiologie
Verfolgt man die Literatur ist eine Zunahme der Verbreitung von LI in
Schweineherden in den letzten Jahren festzustellen.
In einer Studie zur Seroprävalenz in Spanien konnte ein deutlicher Anstieg
seropositiver Schweinefarmen, wie auch positiver Tiere pro Farm im Zeitraum von
2001 bis 2004 festgestellt werden (LAPUENTE et al. 2006, Abb. 1).
7
Literaturübersicht
100%
90%
Prävalenz (%)
80%
70%
60%
50%
40%
pos. Herden
pos. Tiere
30%
20%
10%
0%
2001 (n=2124)
2002 (n=1779)
2003 (n=4468)
2004 (n=5149)
Jahr
Abbildung 1:
Serologischer Nachweis von Antikörpern gegen LI in
Schweinebetrieben
(Herdenprävalenz
(Herden=400,
und
Proben=13520)
durchschnittliche
Prävalenz
aus
Spanien
innerhalb
der
Schweineherden) (LAPUENTE et al. 2006)
Zwischen den Jahren 2001 und 2004 stieg die Prävalenz der seropositiven
Schweinefarmen von 65,4 % auf 98,9 %. Die seropositiven Tiere pro Farm stiegen
von 24,6 % im Jahr 2001 auf 72,1 % im Jahr 2004. Für diese Studie wurden 400
spanische Schweinefarmen untersucht. Als ein möglicher Grund für die starke
Ausbreitung von LI-Infektionen wird das Verbot antimikrobieller Wachstumsförderer
diskutiert (LAPUENTE et al. 2006).
Eine Studie zum Vorkommen von LI-Infektionen in deutschen Schweinebeständen
zeigte eine den spanischen Ergebnissen ähnlich hohe Prävalenz. Von 694
untersuchten, über das gesamte Bundesgebiet verteilten Betrieben waren im Schnitt
81,3 % der Betriebe seropositiv. Die Verteilung über das Bundesgebiet zeigt gewisse
regionale Unterschiede. Die Schwankungsbreite liegt zwischen 66,6 % in Hessen
und 100 % positiv getesteten Betrieben in Sachsen (WENDT et al. 2006b). Die
Ergebnisse zeigten eine deutliche Altersabhängigkeit (Abb. 2).
HARTGE et. al. (2006) konnten noch einen höheren Anteil positiver Betriebe in
Deutschland beschreiben. Eine Verbreitung von LI wird in dieser europaweit
angelegten Studie für Deutschland in 94 % aller untersuchten Mastbetriebe und 99 %
aller Zuchtbetriebe angegeben. In Spanien wurden in dieser Studie in 92 % der
8
Literaturübersicht
Mastbetriebe und 98 % der Zuchtbetriebe Seroreagenten gefunden. Europaweit
waren 93 % aller Schweine mästenden Betriebe seropositiv bzw. 97 % aller
Zuchtbetriebe. Dieser Studie zufolge weist europaweit bereits jedes 4. Schwein im
Alter von 13 Lebenswochen Antikörper gegen LI auf.
gesamt (n=7546)
Saugferkel (n=61)
Tiergruppen
Absetzferkel <15 kg (n=487)
Absetzferkel <30 kg (n=1384)
Mast <50 kg (n=2129)
Mast >50 kg (n=1947)
Jungsauen (n=826)
Altsauen (n=704)
Eber (n=8)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
seropositiv (%)
Abbildung 2:
Serologische
Untersuchung
auf
Antikörper
gegen
LI
(Herdenscreening in 694 Betrieben, (WENDT et al. 2006b)
2.1.4
Pathogenese
Die Infektion mit LI verursacht verschiedene Krankheitsbilder, aufgrund des lange
unbekannten Erregers wurde einige Zeit angenommen, dass es sich um
unterschiedliche Erkrankungen handele. Heute wird die LI-Infektion nach den
unterschiedlichen Verlaufsformen in subklinisch, akut und chronisch unterschieden.
Die Dosis der aufgenommenen Bakterien und das sich entwickelnde Krankheitsbild
stehen in Zusammenhang. So konnte gezeigt werden, dass die klinischen und
pathologischen
Erscheinungen
sowie
deren
Dauer
mit
der
Menge
der
aufgenommenen Bakterien positiv korrelieren (COLLINS u. LOVE 2007).
Allen Krankheitsbildern ist eine Proliferation unreifer Enterozyten der Kryptepithelien
des Darms gemeinsam. Diese Proliferationen können als pathognomonisch für die
porzine intestinale Adenomatose betrachtet werden (POHLENZ 2005). Die von
diesen Veränderungen am stärksten betroffenen Bereiche des Darms sind Ileum und
Colon ascendens (MCORIST u. GEBHART 1999). Den Verlauf der Infektion konnte
9
Literaturübersicht
GUEDES u. GEBHART (2004) in einer Untersuchung, in der die Versuchstiere zu
unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion untersucht wurden, darstellen. Jejunum
und Ileum waren die ersten Lokalisationen, in denen LI nachgewiesen werden
konnte. Die nachfolgenden Darmabschnitte werden anscheinend durch die
Ausschleusung von Bakterien aus Jejunum und Ileum infiziert. Später sezierte Tiere,
welche bereits länger infiziert waren, zeigten histologische Veränderungen in den
dahinter gelegenen Darmabschnitten, nicht aber in Jejunum und Ileum (GUEDES
2004).
In einer neueren Untersuchung zeigen BOUTHRUP et al. (2006) eine andere
Verteilung des Erregers über den Darm. Der Erreger war in der Lage, einen weiten
Bereich des gesamten Darms zu infizieren, allerdings gab es eine Präferenz für die
aboralen Bereiche des Dünndarms. Das Kryptepithelium wurde nicht selektiv
befallen, sondern Darmepithelzellen in allen Bereichen des Darms. Die Ausbreitung
im Verlauf der Infektion schien weniger auf einer Ausschleusung der Bakterien, als
auf einer aktiven Krypt-zu-Krypt Verbreitung zu beruhen (BOUTHRUP et al. 2006).
In welchem Bereich LI die Darmbarriere durchbricht, ist bislang nicht geklärt. Erste
Läsionen zeigen sich jedoch immer im Bereich der Peyerschen Platten. Ob die so
genannten „microfold cells“ (M-Zellen) bei der Überwindung der Darmbarriere eine
entscheidende Rolle spielen, ist derzeit noch unklar (POHLENZ 2005).
Außerhalb des Darms sind bislang Antigenfunde in lokalen Lymphknoten und den
Tonsillen bekannt (JENSEN et al. 2000; GUEDES u. GEBHART 2004). Im Darm ist
die Infektion auf Enterozyten und Makrophagen limitiert (GUEDES 2002; GUEDES u.
GEBHART 2003a, b).
Eine Infektion mit LI scheint stark abhängig von der vorliegenden intestinalen Flora
zu sein. In Infektionsversuchen mit keimfreien Schweinen gelang es nicht, diese
Tiere mit in Reinkultur vorliegenden Lawsonien zu infizieren. Diese Tiere zeigten
keine intrazelluläre Infektion oder extrazelluläre Besiedlung. Immunologische
Reaktionen konnten ebenfalls nicht festgestellt werden. (MCORIST et al. 1993).
Hingegen konnte in keimfrei aufgezogenen Schweinen über mit Lawsonien infizierte
Darmteile, die noch eine für Schweine typische unspezifizische Darmflora enthielten,
eine Infektion hervorgerufen werden (MCORIST et al. 1989). Nach diesen
Versuchsergebnissen wird vermutet, dass die intestinale Flora einen Einfluss hat auf
die Fähigkeit von LI, in Darmzellen einzudringen. Ohne das Vorhandensein von
kommensalen Bakterien ist eine Infektion nicht möglich (SMITH u. LAWSON 2001).
10
Literaturübersicht
2.1.5
Über
Eindringen in die Wirtszelle
das
Eindringen
von
LI
in
seine
Zielzellen
ist
wenig
bekannt.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Lawsonien auf der Oberfläche Ihrer
Zielzellen stammen von Versuchen mit Hamstern (MCORIST et al. 1989; JASNI et al.
1994).
Diese Aufnahmen zeigen Bakterien mit ähnlicher Morphologie wie intrazellulär
vorkommende Lawsonien. Allerdings gelang es nicht, die extrazellulär liegenden
Bakterien mit für LI spezifischen immunologischen Techniken zu markieren. Es
wurde deshalb vermutet, dass LI Phasen mit variablen Antigenstrukturen ausbildet
(MCORIST u. LAWSON 1989).
Die Morphologie der Zielzellen änderte sich nach einer Infektion nur unwesentlich. Es
konnte ein Verlust der Mikrovillistruktur sowie eine Verdickung und ein Aufreißen der
den Bakterien zugewandten Zellwände beobachtet werden.
In Zellkulturen konnten erste intrazelluläre Bakterien bereits 10 Minuten nach dem
Start des Infektions-Experiments nachgewiesen werden (LAWSON et al. 1995;
MCORIST et al. 1995b).
Das Bakterium lagert sich an die Zielzelle an und wird über membrangebundene
Vakuolen eingeschlossen und in deren Zytoplasma transportiert. Die Vakuole wird
wenige Zeit nach dem Eintritt in die Zelle aufgebrochen, bereits 3 Stunden danach
befindet sich die Mehrzahl der eingedrungenen Bakterien frei im Zellzytoplasma
(MCORIST et al. 1995b).
2.1.6
Intrazelluläre Vermehrung
Bereits 48 Stunden nach Infektion können erste Zellteilungen der Bakterien
beobachtet werden (BOUTHRUP et al. 2006). Vorhandene Erkenntnisse aus
Zellkulturversuchen lassen vermuten, dass die bakterielle Replikation von LI stark an
die der Wirtszelle gekoppelt ist. LI besitzt einen Tropismus für Kryptzellen. Diese
Zellen teilen sich und migrieren in das Epithel, um dieses zu bilden. (SMITH u.
LAWSON 2001).
SMITH und LAWSON (2001) konnten keine Bakterien auf den Zelloberflächen oder
einen Transfer zwischen oder aus den infizierten Zellen beobachten. Hieraus
schlossen sie, dass die Verteilung der Bakterien über den Darm ausschließlich über
Teilung und Migration von infizierten Wirtszellen vonstatten geht. JENSEN et al.
11
Literaturübersicht
(2006a) hingegen beobachteten, dass einige Zellen eine Karyorrhexis und Ruptur
der Zellmembran zeigten und dass durch diesen Riss große Mengen des Erregers
ausgeschieden wurden. Diese Bakterien lagen frei in der Lamina propria oder
wurden von umliegenden Makrophagen phagozytiert. Eine Verbreitung der
Lawsonien zwischen den einzelnen Enterozyten konnte auch hier nur über eine
Mitose der Zellen aufgezeigt werden.
LOMAX und GLOCK (1982) konnten in elektronenmikroskopischen Aufnahmen
Zellteilungen von Lawsonien in infizierten Makrophagen nachweisen.
2.1.7
Zellproliferation
Eine Epithelzellproliferation bei der PPE kommt ausschließlich durch infizierte Zellen
zustande (MCORIST et al. 1996). Die Zellproliferation beginnt an der Basis der
Krypten. Die unreifen Zellen liegen in bis zu 5 Lagen übereinander und bilden nur
einen schwachen Bürstensaum aus (POHLENZ 2005). Die Zellproliferation beginnt
bereits 12 bis 36 Stunden nach Infektion (BOUTHRUP et al. 2006).
Infizierte Zellen scheinen unmittelbar nach einer Infektion eine stark gesteigerte
Zellteilungsrate zu erlangen. Die gesteigerte Zahl von Mitosen bewirkt eine dreimal
höhere Zellpopulation als im normalen Gewebe. Dieser stimulative Effekt auf die
Zellteilung der Wirtszelle ist von begrenzter Dauer und endet trotz einer länger
bestehenden Infektion der Zellen (SMITH u. LAWSON 2001).
2.2
Krankheitsbilder
Die PPE bildet einen Krankheitskomplex. Sie unterteilt sich in eine akute Form, die
porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE), sowie subakute bis chronische Formen
(Abb. 3). Dieses sind die porzine intestinale Adenomatose (PIA), die nekrotisierende
Enteritis (NE) sowie die regionale Ileitis (RI). Sie sind wahrscheinlich eine Folge der
Sequenz der Ereignisse, die sich im hinteren Dünndarm, Caecum und Colon
abspielen (POHLENZ 2005). Oft verläuft die Infektion aber auch subklinisch.
Makroskopische und mikroskopische Veränderungen durch eine Infektion mit LI sind
in Tabelle 2 zusammengefasst.
12
Literaturübersicht
2.2.1
Porzine intestinale Adenomatose
Die PIA ist die häufigste subakute bis chronische Form der PPE und geht der NE und
RI regelmäßig voraus. Zumeist tritt sie im Alter zwischen 6-14 Wochen auf. Diese
Form ist durch zwei Hauptsymptome gekennzeichnet, zum einen durch eine
verringerte Gewichtszunahme und eine starke Variation der Körpergewichte
innerhalb der einzelnen Mastgruppen, zum anderen durch eine Diarrhoe. Der
Durchfall kann intermittierend und dünnbreiig bis wässrig sein, gelegentliche
Blutbeimengungen
sind
möglich
(POHLENZ
2005).
Die
makroskopischen
Veränderungen stellen sich im Allgemeinen als Verdickung der Darmschleimhaut
dar. Diese Verdickungen können fokal sein und treten oft als kleine umschriebene
proliferierte Bezirke auf, umgeben von ansonsten unauffälligem Darmgewebe
(SMITH u. LAWSON 2001). Die verdickte Mukosa formt irreguläre longitudinale oder
transversale Faltungen. Diese werden als hirnwindungsartig beschrieben. Im
Mesenterium sind die Blut- und Lymphgefäße gestaut. Hiermit geht ein subseröses
Ödem einher, und die regionären Lymphknoten sind stark vergrößert und ödematös
(BROWN et al. 2007). Bei der mikroskopischen Untersuchung steht die Proliferation
unreifer Zellen in den Krypten im Vordergrund. Die Zotten der Darmschleimhaut sind
verkürzt und in den Krypten sind bis zu fünffach verdickte Zelllagen zu beobachten.
Becherzellen
fehlen
Veränderungen
fast
werden
vollständig
begleitet
von
(POHLENZ
einer
2005).
Infiltration
Die
von
proliferativen
Lymphozyten,
Neutrophilen und Histiozyten in der Lamina propria, sowie den Kryptlumina (LOMAX
u. GLOCK 1982). Proliferierte und normale Krypten können in unmittelbarer
Nachbarschaft zueinander gefunden werden (MCORIST et al. 1993).In vielen Fällen
gibt es keine Anhaltspunkte für Entzündliche Reaktionen (MCORIST u. GEBHART
1999).
Bei den proliferativen Veränderungen kann die Darmmukosa vollständig durch eine
Adenomähnliche Mukosa ersetzt werden. Die Krypten sind vergrößert und
verzweigen sich drüsenartig (MCORIST u. LAWSON 1993). Die mukosale
Oberfläche der Darmschleimhaut flacht mit zunehmender Verlängerung der Krypten
ab. Dies kann dazu führen, dass die Kryptlumina an einer vollständig zottenfreien
Oberfläche offen liegen (LOMAX u. GLOCK 1982).
Die proliferierten Kryptepithelzellen nehmen eine leicht kuboidale und leicht
vergrößerte Form an (JENSEN et al. 2006a). Die proliferierten unreifen Zellen zeigen
im Lichtmikroskop ein basophiles Zytoplasma mit großem, oval bis länglich
13
Literaturübersicht
erscheinendem, hyperchromatinen Zellkern. Ihnen fehlt ein prominenter Mikrovillisaum (LOMAX u. GLOCK 1982). Weiter können kugelförmige, stark mit LI gefüllte
Epithelzellen gefunden werden. Diese Zellen zeigen Karyorrhexis und einen Riss der
Zellmembran. Durch diesen Riss werden große Mengen des Erregers aus dem
Zytoplasma ausgeschleust (JENSEN et al. 2006a). Eine Hyperplasie der Enterozyten
und eine
Reduktion der Becherzellen können frühestens 11 Tage
nach
Infektionsbeginn beobachtet werden (GUEDES u. GEBHART 2004).
Beobachtungen von multinukleären Riesenzellen in mit LI infiziertem Gewebe sind
selten (LOMAX u. GLOCK 1982; SEGALES et al. 2001). JENSEN et al. (2006b)
hingegen warnen, multinukleäre Riesenzellen LI-Infektionen zuzuordnen und
verweisen auf SIGURDARDOTTIR et al. (1994), wonach eher eine mykobakterielle
Infektion für das Auftreten von Riesenzellen verantwortlich zu sein scheint. Weiterhin
sind multinukleäre Riesenzellen auch bei PCV2-Infektionen zu finden (Tab. 2)
(JENSEN et al. 2006b).
Während der so genannten “Erholungsphase” 7-9 Wochen p.i. sind neben den
proliferierten Epithelzellen, Makrophagen, wieder auftretende Becherzellen und
unveränderte Krypten zu erkennen. Viele der Kryptepithelzellen beinhalten
zahlreiche apoptotische Körperchen. Im histologischen Bild erscheinen diese
Körperchen als eosinophile Einschlüsse in basalen Kryptzellen. Epitheliale
Zellgruppen mit apoptotischen Körperchen beinhalten keine sichtbaren Bakterien
(MCORIST et al. 1996). MCINTYRE et al. (2003) beschrieben, dass es innerhalb
dieser Erholungsphasen zu einem Wiederauftreten von Becherzellen in normalen
Krypten mit einer anschließenden Phase der Becherzellhyperplasie kommt.
In den Ileozäkal-Lymphknoten konnten LOMAX et al. (1982) das Vorkommen von
multifokalen granulomatösen Lymphadenitiden aufzeigen. Bei einem Tier wurde eine
Epithelzellmetastase im Lymphknoten gefunden. Diese Epithelzellen waren unreif
und bildeten irreguläre Kryptstrukturen, welche intraluminal Zelldetritus enthielten.
Diese metastatischen Zellen wiesen jedoch kein LI-Antigen auf (LOMAX et al. 1982).
Die Ähnlichkeiten zwischen einer PCV2- und einer LI-Infektion machen eine
differentialdiagnostische Untersuchung notwendig. Eine Zusammenfassung der
makroskopischen und mikroskopischen Veränderungen (Tab. 2) von LI- und PCV2Infektionen zeigen JENSEN et al. (2006b).
14
Literaturübersicht
2.2.2
Subklinische Ileitis
Am häufigsten kommt die subklinische Ileitis vor. Zumeist sind Ferkel im Alter ab 6
Wochen betroffen (POHLENZ 2005).
Diese Form der Infektion ist definiert durch eine LI-Besiedelung des Darms mit dem
Auftreten von mikroskopischen und seltener makroskopischen Läsionen sowie durch
verringerte Tagesgewichtszunahmen und schlechtere Futterverwertung, ohne dass
klinische Symptome zu erkennen sind (KROLL et al. 2005b). Während einige Tiere in
der Gruppe ein normales Wachstum zeigen, bleiben andere deutlich in ihrer
Gewichtsentwicklung zurück (MCORIST u. GEBHART 1999).
Erfahrungen aus Sektionen zeigten, dass im hinteren Ileum, im Bereich der Papilla
ilealis sowie im vorderen Colon auf LI hinweisende Schleimhautalterationen zu finden
sind (MCORIST u. GEBHART 1999). Histologisch sind Zellproliferationen in
unterschiedlichsten Ausprägungen im Bereich der Krypten zu finden. Der Erreger
kann in solchen Fällen nicht immer nachgewiesen werden.
Es kommt vor, dass zwar eine Kolonisation mit LI vorliegt, diese aber nicht schwer
genug ist, um eine nachweisbare Erregerausscheidung zu erzeugen bzw. um eine
Serokonversion herbeizuführen (GUEDES 2004).
2.2.3
Nekrotisierende Enteritis
Die nekrotisierende Enteritis ist gekennzeichnet durch hochgradige entzündliche bis
nekrotisierende Vorgänge im Darm der betroffenen Tiere. Klinisch zeigen diese Tiere
ein hochgradiges Kümmern und dünnbreiigen bis wässrigen, gelb-braunen Kotabsatz
(LAWSON u. GEBHART 2000). Es treten Fibrinauflagerungen und oberflächliche
Läsionen der Darmschleimhaut auf. Weiter können fokal bis großflächig gelb-braune
Verkäsungen oder blutig-nekrotische Veränderungen auf der Darmschleimhaut des
distalen Ileums und proximalem Colons auftreten. Die nekrotisierende Enteritis ist
vermutlich die Folge der durch die PIA verursachten Läsionen und nachfolgender
Besiedlung mit einer pathogenen anaeroben Dickdarm-Flora (BROWN et al. 2007).
2.2.4
Regionale Ileitis
Eine regionale Ileitis scheinen Tiere als Endstadium zu entwickeln, welche die
chronische Form überlebt haben. Das Ileum erscheint verdickt und steif,
15
Literaturübersicht
entsprechend wird diese Form auch als „Garden-hose-gut“ (Gartenschlauch-Darm)
bezeichnet. Bei gelegentlich auftretenden Todesfällen, wird das hypertrophe Ileum
perforiert, die betroffenen Tiere verenden schließlich an einer daraus resultierenden
Peritonitis (LOVE et al. 1977b).
Beim Eröffnen des Darmlumens werden meist lineare Ulzerationen sichtbar, die in
ein Granulationsgewebe eingebettet sind. Diese Granulationen sind wandseitig von
hypertropher Muskulatur umgeben. Im Granulationsgewebe finden sich Inseln von
teils proliferierender, teils atrophischer Schleimhaut.
Diese Form der Lawsonien-Infektion wird heute nur noch selten gesehen. Die Tiere
weisen
eine
stark
eingeschränkte
Ingestapassage
auf
und
kümmern
dementsprechend stark. Derart zurückgebliebene Tiere verlassen die Betriebe meist
vorzeitig, und erscheinen nicht oder nur selten im Untersuchungsgut (POHLENZ
2005).
2.2.5 Porzine hämorrhagische Enteropathie
Die akut verlaufende porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE) kommt meist bei
Tieren im Alter zwischen 4-12 Monaten vor (LAWSON et al. 1977; BROWN et al.
2007). Am häufigsten sind Tiere aus Herden mit einem hohen Hygienestatus
betroffen, wenn diese naiven Tiere im Rahmen einer Remontierung in eine infizierte
Herde eingeführt werden (MCORIST u. GEBHART 1999).
Die Körpertemperatur der betroffenen Tiere kann von subnormal bis erhöht variieren
(POHLENZ 2005). Klinisch zeigt sich in den meisten Fällen ein schwarzer, teerähnlicher Kot mit nachfolgendem Durchfall.
Die erkrankten Tiere kommen nach einer kurzen Episode blutigen Durchfalls und
Anämie zum Festliegen und verenden aufgrund eines hypovolämischen Schocks.
Plötzliche Todesfälle ohne auffälligen Kotbefund sind aber ebenfalls möglich. Die
Hälfte der an PHE erkrankten und anämischen Tiere stirbt, die Überlebenden erholen
sich zumeist nach kurzer Zeit (MACINTYRE et al. 2003).
Es wird diskutiert, dass die PHE wie eine Hypersensibilitätsreaktion mit massiver
Erregerausschüttung abläuft (LAWSON et al. 1977; BROWN et al. 2007).
Bei der Sektion ist das Darmlumen mit Blutkoagula gefüllt. Die Schleimhäute sind
verdickt und mit einem dünnen Fibrinfilm in Ileum, Colon oder Caecum bedeckt
(WINKELMANN 1996).
16
Literaturübersicht
In der Schleimhaut finden sich zahlreiche Diapedesen. Histologisch liegt das typische
Bild der PPE im frühen Stadium vor, ein Zellzerfall mit Blutungen im Bereich der
proliferierten Krypten dominiert (MCORIST u. GEBHART 1999). In fortgeschrittenen
Fällen konnten Proliferationen auf einer Länge von bis zu 4,90 Meter vor der Papilla
ilealis beobachtet werden (RÜDIGER-BÖSCH et al. 1986).
17
Literaturübersicht
Tabelle 2:
Vergleich der makroskopischen und histologischen
Veränderungen bei Infektion des Darms mit LI oder PCV2 (JENSEN et al. 2006b)
Pathologische Veränderungen
LI
PCV2
Nekrotisierende Ileitis und Kolitis
+
+
Verdickung der Darmschleimhaut
+
+
Verdickung der Darmmuskulatur
+
+
Hämorrhagische Enteritis
+
+
Ödem im Mesocolon
-
+
Zottenatrophie
+
+
Koagulationsnekrose
+
+
verlängerte Krypten
+
+
unreife proliferierte Enterozyten
+
-
fehlende Becherzellen
+
-
Histiozytose in der Lamina propria
+
+
Histiozytose in lymphoidem Gewebe
-
+
multinukleäre Riesenzellen
+
+
lymphozytäre Depletion in lymphoidem
+
+
Nekrose in lymphoidem Gewebe
+
+
verzweigte Krypten
+
-
Zytoplasmatische Einschlusskörperchen
-
+
Makroskopisch
Mikroskopisch
Gewebe
Legende: + Veränderung kommt bei dieser Infektion vor
- Veränderung kommt bei dieser Infektion nicht vor
18
Literaturübersicht
PPE Porzine
Proliferative
Enteropathie
klinisch
subklinisch
akut
subakut / chronisch
Subklinische Ileitis
PIA Porzine
intestinale
Adenomatose
Krypthyperplasie
epitheliale Hyperplasie
PHE Porzine
hämorrhagische
Enteropathie
NE Nekrotisierende
Enteritis
Hämorrhagie
Nekrose
epitheliale Hyperplasie
Nekrose
Fibrinauflagerungen
epitheliale Hyperplasie
RI Regionale Ileitis
Granulationsgewebe
Muskelhypertrophie
epitheliale Hyperplasie
Abbildung 3:
ausgelösten
Differenzierung der verschiedenen Formen der durch LI
porzinen
proliferativen
Enteropathie
(nach
SIMS
u.
GLASTONBURY 1996; POHLENZ 2005)
2.3
Immunität
Die PPE ist eine Schleimhautinfektion und somit sind die lokalen, sich an der
Intestinalschleimhaut
abspielenden
Prozesse
wahrscheinlich
für
das
Bestimmung
der
Abwehrgeschehen von größter Relevanz (POHLENZ 2005).
In
immunhistochemischen
Untersuchungen
zur
Lymphozytenpopulation mit der Sequenz von 3, 7, 14, 21, 28, 35 und 42 Tagen nach
erfolgter experimenteller Infektion zeigten sich einerseits eine Reduktion von T- und
B- Zellen, andererseits eine erhöhte Anzahl an aktivierten Makrophagen in der
Darmschleimhaut. Im Einzelnen konnte im Vergleich von Tag 14 (maximale
Läsionen) mit Tag 42 p.i. (abgeheilte Läsionen) zum erstgenannten Termin eine
Reduktion der CD3-positiven Zellen (Lamina propria, Zotten), der CD8-positiven
19
Literaturübersicht
Zellen (nur Zotten) und der B-Zellen festgestellt werden, während die Anzahl der
CD4-positiven T-Zellen unverändert blieb. Am Tag drei waren erste neutrophile
Granulozyten in den histologischen Schnitten zu erkennen. Aus diesen Ergebnissen
wurde abgeleitet, dass bei einer Inokulation sieben Wochen alter Tiere mit
Zellkulturerregern
offensichtlich
eine
immunsuppressive
„downregulation“
der
adaptiven Immunantwort erfolgt. Die erhöhte Aktivität von Makrophagen und die
damit potentiell verbundene exzessive Freisetzung von Zytokinen sehen die Autoren
als mögliche Ursache für Endothelschäden und erhöhte vaskuläre Permeabilität bei
der akuten, hämorrhagischen Verlaufsform der Erkrankung (MACINTYRE et al.
2003).
LI scheint die immunologische Antwort aktiv zu beeinflussen. Infizierte Enterozyten
exprimieren weniger major-histocompatibility-complex-II-Strukturen im Vergleich zu
normalem Darmgewebe (MCORIST et al. 1992). Bei schweren Infektionen fehlt eine
Reaktion von CD3-positiven Lymphozyten. Hierfür scheint eine Immunsuppression
verantwortlich zu sein (SMITH u. LAWSON 2001).
Basierend auf Erkenntnissen aus Infektions- und Feldversuchen liegen 1-2 Wochen
zwischen Infektion und erster fäkaler Erregerausscheidung und 1-2 Wochen
zwischen erstem Nachweis im Kot und Serokonversion (GUEDES u. GEBHART
2003b; VESTERGAARD et al. 2004).
Der Serumtiter fällt fortschreitend nach Erreichen eines Maximums ab. Entsprechend
stehen die Dauer des möglichen Antikörpernachweises und die Höhe des Titers in
einem Zusammenhang zueinander (GUEDES 2004).
Nach einer Infektionsstudie waren Tiere, welche eine LI Infektion durchgemacht
hatten, bis zum Ende der Studie 10 Wochen später vor einer Reinfektion mit LI
geschützt, es konnten nach erneutem Challenge keine klinischen Anzeichen oder
eine Ausscheidung von LI mittels PCR nachgewiesen werden (COLLINS u. LOVE
2007).
In einer Feldstudie zur Etablierung eines ELISAs zeigte sich, dass in den
untersuchten Herden, welche einer natürlichen Infektion ausgesetzt waren, der
Antikörpertiter kurz nach Beendigung der Erregerausscheidung am höchsten war.
Der Titer konnte bei Tieren bis zu 22 Wochen nach dem Absetzen nachgewiesen
werden. Bei den Herden kam es zu einem zweitem deutlichen Titeranstieg der LIspezifischen Antikörper zum Ende des Versuchs. Die Autoren hielten diesen Anstieg
für einen Boosterungseffekt nach Zweitkontakt mit dem Erreger (BOESEN et al.
20
Literaturübersicht
2005b).
Zu
diesem
Zeitpunkt
konnte
bei
keinem
dieser
Tiere,
eine
Erregerausscheidung gefunden werden. Die Autoren schlossen hieraus, dass die
Tiere nach einer Erstinfektion vor einer Reinfektion geschützt waren (BOESEN et al.
2005b).
Zwischen der Höhe des Serumtiters und der Ausprägung von pathologischen
Veränderungen konnte in einem Versuch bei Tieren 3 Wochen nach experimenteller
Infektion kein statistischer Zusammenhang gefunden werden (GUEDES et al.
2002b).
In einer Studie zur Evaluierung einer Vakzine mit einem lebenden, attenuierten Isolat
von LI konnte gezeigt werden, dass eine protektive Immunantwort gegen LI nicht von
einer humoralen Immunantwort abhängig ist (KROLL et al. 2004b). In dieser
Untersuchung waren Tiere nach Vakzination gegen eine LI Infektion geschützt,
obwohl bis fünf Wochen nach Vakzination keine LI-spezifischen IgG-Antikörper
mittels IFAT nachgewiesen werden konnten. In einer späteren Untersuchung mit
einem LPS-ELISA der Selben Seren konnten drei Wochen nach Vakzination
Antikörper gegen LI in 53% der untersuchten Tiere nachgewiesen werden (Kroll et al.
2005a).
In einem Experiment zu Evaluierung des IFAT (KNITTEL et al. 1998) konnten
maternale Antikörper gegen LI bis zur sechsten Lebenswoche der Ferkel
nachgewiesen werden. KROLL et al. (2005c) konnte in einer Infektionsstudie zeigen,
dass maternale IgG Antikörper, welche im IFAT nachweisbar waren, einen Schutz für
Ferkel bis zu einem Alter von sechs Wochen gegen eine Infektion mit LI boten.
MAUCH und BILKEI (2004) untersuchten die LI-Infektionsrate von Ferkeln in
Abhängigkeit von Alter und der Anzahl der vorangegangenen Geburten der
Muttersauen. Nachkommen von seropositiven Jungsauen zeigten häufiger und
länger positive Serotiter in Aufzucht und Mast (5.-26. Lebenswoche (LW), Maximum
84% zur 11. LW) als Nachkommen von seropositiven Altsauen (3.-5. Wurf, Maximum
32% zur 11. LW). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen scheinen Altsauen
entweder nicht in ausreichender Menge Erreger auszuscheiden, oder ihre
Nachkommen
sind
über
maternale
Antikörper
besser
passiv
geschützt
(BRONSVOORT et al. 2001; BARNA u. BILKEI 2003).
21
Literaturübersicht
2.4
Diagnostik
2.4.1
Klinik
Eine variable aber generell kleine Gruppe von Tieren ist klinisch auffällig (Lawson et
al.
1980).
Viele
Darmerkrankungen
zeigen
ähnliche
Symptome
wie
die
verschiedenen Formen einer LI-Infektion, entsprechend ist eine Diagnose immer
durch eine pathologische- oder Labordiagnostische-Untersuchung abzusichern
(LAWSON u. GEBHART 2000).
Bei der RI können gelegentliche Todesfälle auftreten, das hypertrophe Ileum kann
perforieren und die betroffenen Tiere verenden an einer daraus resultierenden
Peritonitis (LOVE et al. 1977b).
Im Verlauf der NE kann es zu hochgradigem Kümmern und dünnbreiigem bis
wässrigem, gelb-braunen Kotabsatz kommen (LAWSON u. GEBHART 2000).
In einem Infektionsversuch war es nur möglich, bei 75 % der Versuchstiere ein
Durchfallgeschehen zu provozieren. Der überwiegende Anteil dieser Tiere zeigte
unspezifischen, dünnbreiigen oder wässrigen Kotabsatz. Nur einzelne Tiere wiesen
Blutbeimengungen im Kot auf. Der Durchfall begann etwa eine Woche nach der
Infektion der Tiere und nahm seinen Höhepunkt zur dritten Woche post infectionem
(p.i.). Bereits 28 Tage p.i. erholten sich die Tiere. Unter Feldbedingungen sind milde
Durchfallgeschehen schwer zu erkennen (GUEDES et al. 2002b).
Eine hyperplastische oder hypertrophe Enteritis kann auch ultrasonographisch
diagnostiziert werden. Die Wandstärken im gesunden Dünndarm liegen bei 0,270,36 cm und im Dickdarm zwischen 0,21 und 0,23 cm, während bei einer
chronischen Hypertrophie oder Hyperplasie des Darms die Wandstärken zwischen
0,28-0,70 cm im Ileum und 0,30 und 0,65 cm im Dickdarm liegen (BERMÚDEZ et al.
2000).
2.4.2
Pathologie
Eine Infektion mit LI steht im direkten Zusammenhang mit einer hyperplastischen
Zellproliferation der Epithelzellen (FRISK u. WAGNER 1977; ROBERTS et al. 1977;
MCORIST et al. 1989; STILLS et al. 1991; MCORIST et al. 1993).
22
Literaturübersicht
2.4.2.1
Makroskopische Untersuchung
Die makroskopische Untersuchung allein ist oft unergiebig und erlaubt nur eine
Verdachtsdiagnose.
Die Sensitivität und Spezifität makroskopischer Läsionen liegt bei 67 % bzw. 50 %.
Eine makroskopische Untersuchung des Darms verlangt eine Bestätigung durch
weitergehende diagnostische Methoden (HOLYOAKE et al. 1994; HUERTA et al.
2003). Aufgrund der schnellen Regeneration innerhalb von vier bis sechs Wochen
sind zum Schlachtzeitpunkt nur noch selten Veränderungen zu finden.
Für die Untersuchung an Schlachthöfen schlagen HARDGE et al. (2004) die
Untersuchung durch zwei geschulte Untersucher vor. Für diese Sichtkontrolle ist die
Zeit
zwischen
Tötung
und
Untersuchung
von
Bedeutung.
Der
Untersuchungszeitraum sollte zwischen der 30. bis 45. Minute post mortem liegen,
um eine Verwechslung von hyperplastischer Schleimhaut mit einer postmortalen
Kontraktion der Darmmuskulatur zu vermeiden.
2.4.3
Für
Labordiagnostische Verfahren
die
diagnostische
Absicherung
einer
LI-Infektion
stehen
verschiedene
Möglichkeiten zur Verfügung. Derzeit kommen Antikörpernachweis im Serum, PCR
in Kot und Gewebe und immunhistologische Untersuchungen in Gewebsschnitten
zum Einsatz (Tab. 3).
Die verschiedenen Tests können unterschiedliche epidemiologische Aspekte klären.
Ein serologisch positiver Befund zeigt einen vorangegangenen Kontakt mit LI an,
während Nachweise wie PCR oder Immunhistochemie eine derzeitig bestehende
Infektion belegen (GUEDES 2004).
2.4.3.1
Indirect
Immunofluorescent
Antibody
Test
(IFAT)
und
Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA)
Der
erste
serologische
Test
zum
Nachweis
von
LI
war
ein
indirekter
Immunfluoreszenztest (immunofluorescence antibody test (IFAT)) (LAWSON et al.
1988). Dieser dient dem Nachweis von IgM- und IgG-Antikörpern. In verschiedenen
Experimenten zeigte sich beim Nachweis einer Infektion eine höhere Sensitivität
(90 %) und Spezifität (96 %) im Vergleich zur PCR. Maternale Antikörper konnten in
diesen Experimenten für eine Dauer von bis zu 6 Wochen nachgewiesen werden
23
Literaturübersicht
(BAKKER et al. 2000; DÜNSER et al. 2000; FOURCHON et al. 2000; MORTIMER et
al. 2000; JUST et al. 2001; GUEDES et al. 2002b).
Die Sensitivität und Spezifität wurden für den IPMA mit 89 % und 100 % angegeben
(KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002a).
Der IFAT reagierte nicht bei Tests mit Seren von Schweinen, die mit Brachyspira (B.)
pilosicoli, B. innocens, B. hyodysenteriae, Salmonella (S.) Typhimurium, S.
cholerasuis, Campylobacter (C.) mucosalis, und C. hyointestinalis infiziert waren.
Ebenso zeigte auch der IPMA keine Kreuzreaktionen in Tests mit B. pilosicoli, B.
hyodysenteriae, Escherichia coli (K88), C. mucosalis, C. jejuni, und C. coli (KNITTEL
et al. 1998; GUEDES et al. 2002a).
2.4.3.2
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Verschiedene ELISAs wurden untersucht und validiert. Ein Ganzzell-ELISA
gewährleistet eine Sensitivität von 98 % und eine Spezifität von 99,3 % (BOESEN et
al. 2005b). Als Antigen wurde LI, ID # 15540 (Boehringer Ingelheim) verwendet
BOESEN et al. 2005b). KROLL et al. (2005a) entwickelten einen LPS-ELISA dieser
zeigte in einer Infektionsstudie eine hohe Spezifität von 100% und eine Sensitivität
von 99,5%. Das Antigen für diesen ELISA wurde ebenfalls aus einer Kultur von ID #
15540 aufgereinigt. Desweiteren existiert ein Blocking-ELISA welcher eine
Sensitivität und Spezifität von 96,46 % resp. 98,68 % gewährleistet (KELLER et al.
2006). Seit 2006 ist der Blocking-ELISA unter der Bezeichnung Enterisol®IleitisELISA (bioScreen, Münster/Svanova Biotech AB, Uppsala, Schweden) kommerziell
erhältlich. Mit diesem Testkit kann der LI-Antikörpertiter sowohl im Serum als auch im
Plasma bestimmt werden (KELLER et al. 2006).
2.4.3.3
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Die Spezifität der PCR zum Nachweis von LI in Kotproben liegt bei nahezu 100 %
(JONES et al. 1993c). Die Sensitivität dieser Technik liegt zwischen 39 und 72 % bei
experimentell infizierten Tieren (KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002b). Die
PCR kann verwendet werden, um Erreger ausscheidende Tiere, zu identifizieren.
Allerdings ist es nicht möglich, mit LI infizierte Tiere welche den Erreger nicht
ausscheiden, zu erkennen (JORDAN et al. 1999). Für ein positives PCR-Ergebnis
wird eine Menge von mindestens 10³ Bakterien pro Gramm Kot benötigt (JONES et
24
Literaturübersicht
al. 1993a, b, c). Die Probennahme ist entscheidend für die PCR-Diagnose.
Kotproben von 0,1 g zeigten in einer Studie deutlich mehr positive Ergebnisse (21 %)
als bei einer entsprechenden Probennahme mit Rektaltupfern (11 %) (JACOBSON et
al. 2006). In experimentellen und Feldstudien wurde gezeigt, dass die Tiere 1-2
Wochen, bevor sie serokonvertierten, den Erreger ausschieden (GUEDES et al.
2002b; GUEDES u. GEBHART 2003b). Nach JENSEN et al. (2005) kann zwischen
Erregerausscheidung und Serokonversion sogar ein Zeitraum von 2-6 Wochen
liegen. Der Erreger wird etwa 7 Tage nach einer Erstinfektion erstmalig
ausgeschieden und ab der 4. Infektionswoche findet nur noch eine intermittierende
Ausscheidung statt (POHLENZ 2005). Diese intermittierende Ausscheidung bei
subklinisch und chronisch infizierten Tieren kann zu falsch negativen Ergebnissen
führen (KNITTEL et al. 1997; JORDAN et al.1999). Einige natürlicherweise im Kot
vorkommende Substanzen können durch ihre inhibierende Wirkung auf die PCR
ebenfalls zu falsch negativen Ergebnissen führen (LANTZ et al. 2000; JACOBSON et
al. 2003). Eine Ausscheidung des Erregers kann auch ohne klinische oder
mikroskopische Veränderungen nachgewiesen werden (KNITTEL et al. 1997;
JORDAN et al. 1999).
Im Falle einer subklinischen Lawsonien-Infektion besteht die Möglichkeit, dass eine
Besiedelung des Darms stattgefunden hat, diese aber nicht umfangreich genug ist,
um eine Diagnose mittels PCR oder Serologie stellen zu können (GUEDES 2004).
Mit der Multiplex-PCR können simultan neben LI noch andere Darmpathogene wie
Brachyspira (B.) hyodysenteriae, B. pilosicoli und Salmonella sp. nachgewiesen
werden (ELDER et al. 1997; SUH u. SONG 2005; LA et al. 2006; NATHUES 2007).
Zur schnellen Untersuchung großer Probenmengen steht eine real-time-PCR zur
Verfügung. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei einer LI Zelle pro PCR
tube, was einer fäkalen Ausscheidung von 4 x 104 LI Zellen pro Gramm Kot
entspricht (LINDECRONA et al. 2002).
2.4.3.4
Histologie
Die Anwendbarkeit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung ist auf Fälle, die erkennbare
Proliferationen zeigen, beschränkt (GUEDES et al. 2002b). Eine pathohistologische
Untersuchung von Sektionsmaterial mittels Hämatoxilin-Eosin-Färbung (HE) zeigt
viele falsch negative Ergebnisse (55,6 %) und eine nur mäßige Übereinstimmung mit
25
Literaturübersicht
PCR-Ergebnissen (53 %). Sie sollte daher nicht als alleiniges diagnostisches Mittel
eingesetzt werden (HUERTA et al. 2003).
Die Warthin-Starry-Färbung (WS) ist eine nicht für LI spezifische Färbemethode. Für
eine sichere Diagnose müssen hier die Erreger im apikalen Zytoplasma von
proliferierten Enterozyten gefunden werden (GUEDES et al. 2002b). JENSEN et al.
(1997) halten die WS-Färbung nur für verlässlich, wenn Bakterien in eindeutig
proliferierten Enterozyten gefunden werden.
Mit einer modifizierten Ziehl-Neelsen-Färbung lassen sich Lawsonien in Darmteilen
als Ziehl-Neelsen-positives, gebogenes und säurefestes Stäbchen darstellen. Die
Ziehl-Neelsen-Färbung erreicht im Vergleich zur PCR lediglich eine Sensitivität von
55% (DÜNSER et al. 2003). Beide Färbemethoden sind aber nicht spezifisch und
erlauben keine sichere Diagnose (ROWLAND 1978)
Mit der Immunhistochemie hingegen ist es möglich, durch spezifisch bindende
Antikörper Lawsonien sogar in Fällen starker Nekrosen, wenn die Mukosa vollständig
zerstört ist, oder in Fällen, in welchen die Erreger nur noch im Zytoplasma
mononukleärer Zellen in der Lamina propria zu finden sind, nachzuweisen (GUEDES
et al. 2002b). Bereits 5 Tage nach einer Infektion kann LI mittels Immunhistochemie
nachgewiesen werden (GUEDES u. GEBHART 2004).Die Immunhistochemie zeigt
im Vergleich zur Warthin-Starry-Silberfärbung eine Sensitivität von 87 % (GUEDES
et al. 2002b).
In einer Studie von GUEDES und GEBHART (2004) waren von LI verursachte
histologische Veränderungen nur zwischen dem 11. und 29. Tag p.i. zu finden. Bei
drei Tieren, die 35 Tage nach Infektion untersucht wurden, waren keine
histologischen Veränderungen mehr zu finden. Ebenso ist eine IH-Untersuchung
dieser Tiere zu diesem Zeitpunkt negativ verlaufen (GUEDES u. GEBHART 2004).
Entsprechende Ergebnisse lieferten JENSEN et al. (2005), in deren Studie Tiere, die
noch 2-6 Wochen vor einer Sektion Erreger ausschieden, zum Zeitpunkt der Sektion
keine auf LI hinweisenden pathologischen Veränderungen im Darm zeigten.
2.4.3.5
Immunomagnetic beads und ATP-Biolumineszenz
Eine weitere immunologische Methode ist die Verwendung von spezifischen
„immunomagnetic beads“ und ATP-Biolumineszenz. Hierfür werden sogenannte
„magnetic beads“ mit LI-spezifischen Antikörpern (Lsa A) beschichtet, um damit
Antigen
in
Kotproben
zu
binden.
Die
Auswertung
erfolgt
über
eine
26
Literaturübersicht
immunomagnetische Separation und ATP-Biolumineszenz. Diese Untersuchungen
wurden am Kaninchen durchgeführt. (WATARAI et al. 2005).
Tabelle 3:
Übersicht
zu
den
diagnostischen
Möglichkeiten
zum
Nachweis von LI und spezifischer Antikörper beim Schwein (nach KROLL et al.
2005b)
Technik
HE
WS-SilberFärbung
IH / IFAT
PCR
Nachweis
Vorteile
Nachteile
Referenz
Krypthyperplasie, Nachweis von
Zellveränderungen Zellveränderungen
post- mortem-Diagnose
Nachweis
intrazellulärer
Bakterien
WARD und
WINKELMAN
(1990),
nicht spezifisch;
ROWLAND und
post-mortem-Diagnose
LAWSON (1992),
JENSEN et al.
(1997)
schneller Nachweis
von Bakterien im
Gewebe
Lawsonia
intracellularis
spezifisch;
hoch sensitiv und
Immunfluoreszenzspezifisch
oder
ImmunperoxidaseFärbung
ante-mortemDiagnose; hoch
spezifisch, Nachweis
bestehender Infektion
Lawsoniaund Ausscheidung,
intracellulars-DNA- Nachweis
Sequenz
verschiedener
Pathogene möglich,
quantitativer
Nachweis (real-time
PCR)
ROWLAND
(1978)
MCORIST et al.
(1987), KNITTEL
post-mortem-Diagnose,
et al. (1997),
monoklonale
GUEDES u.
Antikörper erforderlich
GEBHART
(2003c)
geringe Sensitivität,
mögliche Inhibition,
mögliche
Kreuzkontamination,
mögliche falsch
negative Proben
GEBHART et al.
(1991,1993),
JONES et al.
(1993c),
COOPER (1996),
COOPER et al.
(1997), ELDER et
al (1997),
LINDECRONA et
al. (2002),
NATHUES (2007)
IFAT
Serum-IgG
ante-mortemmanuelle Bestimmung KNITTEL et al.
Diagnose; hoch
nötig
(1998)
sensitiv und spezifisch
IPMA
Serum-IgG
ante-mortemmanuelle Bestimmung GUEDES et al.
Diagnose, hoch
nötig
(2002a)
sensitiv und spezifisch
Serum-IgG
ante-mortemDiagnose, hoch
sensitiv und
spezifisch,
automatische
Bestätigung der
Ergebnisse , hoher
Materialdurchsatz
ELISA
Imunomagnetic
Beads und ATP Antigen
Biolumineszenz
schnelle Methode für
hohe Probenzahlen
BOESEN et al.
(2005b), KELLER
et al. (2004),
KROLL et al.
(2005a)
Methode noch nicht
etabliert
WATARAI et al.
(2005)
27
Literaturübersicht
Legende Tabelle 3
HE
=
Haematoxylin-Eosin-Färbung,
WS
=
Warthin
Starry,
IH/IFAT
=
Immunhistochemie und Immunofluorescence Antibody Test, PCR = Polymerase
Chain Reaction, IPMA = Immunoperoxidase Monolayer Assay, ELISA = Enzyme
Linked Immunosorbent Assay
2.5
2.5.1
Kontroll- und Prophylaxe-Maßnahmen
Desinfektion
COLLINS et al. (2000a) konnten mit In-vitro- und Infektionsversuchen nachweisen,
dass LI unter Feldbedingungen für einen Zeitraum von mehr als 2 Wochen infektiös
bleiben kann. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Verunreinigungen mit Kot im
Stall und auf Gerätschaften eine Quelle zur Neuinfektion frisch eingestallter Tiere
darstellen.
In
In-vitro-Versuchen
zeigten
Desinfektionsmittel
unterschiedliche
Wirkungen auf LI (COLLINS et al. 2000a) (Tab. 4).
Tabelle 4:
Wirkung
verschiedener
Desinfektionsmittel
gegen
LI
(COLLINS et al. 2000a).
Leider
Wirkstoff
Wirkungseffektivität gegen LI
Quarternäre Ammonium-Verbindung 3%
Pyrovidone-Jodid 1%
Kalium-Peroxymonosulfat 1%
Phenolderivate 0,33%
hoch wirksam
mäßig wirksam
nicht wirksam
nicht wirksam
gibt
es
keine
Studie
zur
Wirkungsaktivität
dieser
oder
anderer
Desinfektionsmittel gegen LI unter Feldbedingungen (KROLL et al. 2005b).
2.5.2
Fütterung
BOESEN et al. (2004) haben den Einfluss der Fütterung auf eine LI-Infektion
untersucht. Es wurden die Effekte des Ansäuerns mit Milchsäure und des
Fermentierens des Futters auf eine Besiedlung des Darms mit LI nach
experimenteller Infektion geprüft. Die mittlere fäkale Erregerausscheidungsdauer war
28
Literaturübersicht
bei Tieren, welche eine fermentierte Standardfütterung erhielten, signifikant geringer
als bei Tieren, welche mit einer nicht fermentierten Standardfuttermischung gefüttert
wurden. Die Autoren schlossen aus ihren Ergebnissen außerdem, dass ein
fermentiertes Futter die erste Ausscheidung von LI auch verzögert. Die Tiere, deren
Futter mit 2,4 % Milchsäure behandelt wurde, zeigten vier Wochen nach
experimenteller
Infektion
weniger
pathologische
Veränderungen
als
die
Kontrollgruppe, deren Futter mit 1,8 % Ameisensäure versetzt wurde (BOESEN et al.
2004).
Der Einfluss der Konfektionierung des Futters auf die Prävalenz von LI im Darm von
infizierten Schweinen wurde in verschiedenen Studien getestet. STEGE et al. (2001)
konnten nachweisen, dass nicht pelletiertes Futter die Prävalenz von LI im Darm
infizierter Schweine senken kann.
In einem ähnlichen Versuch untersuchten MØLBAK et al. (2008), wie eine
Pelletierung des Futters die Mikroflora des Darms beeinflusst. Zu diesem Zweck
wurde die Mikroflora des Darms mit einer Real-time-PCR und in-situ-Hybridisation
quantitativ bestimmt. Im Vergleich zur pelletierten Fütterung reduzierte die nicht
pelletierte Fütterung scheinbar die Menge von LI relativ zur Gesamtmikroflora des
Darms. Die Anzahl der Tiere, die LI ausschieden, blieb allerdings gleich. Inwieweit
hierfür Veränderungen des intestinalen Milieus wie z.B. verringerter pH-Wert,
unterschiedliche Morphologie der Darmschleimhaut und/oder ein veränderte
Mikroflora verantwortlich sind, konnte hier nicht geklärt werden (MØLBAK et al.
2008).
Bei
fünf
Tieren
mit
einer
schweren
LI-Infektion
zeigten
sich
andere
Restriktionsfragmente als bei Tieren mit einer milden Infektion. Hieraus schlossen die
Autoren, dass eine LI-Infektion einen Einfluss auf die intestinale Flora hat (MØLBAK
et al. 2008).
WHITNEY et al. (2006b) untersuchten den Effekt einer Mais-Soja-Fütterung mit
einem 10%igem Zusatz von getrockneter Getreideschlempe. Hierbei zeigte sich eine
signifikante Verringerung der Schwere und Ausdehnung der pathologischen
Veränderungen durch LI im Ileum und Colon im Vergleich zu einer herkömmlichen
Mais-Soja Fütterung. Dieses Ergebnis konnte jedoch nicht reproduziert werden
(WHITNEY et al. 2006a, c). Weiterhin konnte kein positiver Effekt auf durch LI
verursachte
pathologische
Sojabohnenhülsen
bzw.
Veränderungen
mit
einem
durch
polyklonalem
die
Fütterung
Antikörper
von
besprühte
29
Literaturübersicht
Sojabohnenhülsen nachgewiesen werden. Tiere, welche mit Sojabohnenhülsen mit
polyklonalem Antikörper gefüttert wurden, zeigten mehr ileale Veränderungen als die
mit
10%igem
Zusatz
getrockneter
Getreideschlempe
gefütterte
Tierguppe
(WHITNEY et al. 2006c).
2.5.3
Antibiotische Behandlung
Bei der Evaluation minimal inhibierender bzw. bakterizider Wirkstoffkonzentrationen
in in-vitro-Versuchen konnte eine breite Wirksamkeit verschiedener antibiotisch
wirksamer Medikamente gegen LI gezeigt werden. Diese Liste beinhaltet Makrolide,
Tetracyclin, Pleuromutilin (Tiamulin), Penicillin und Fluoroquinolone. Keine Wirkung
auf LI haben Aminoglykoside (Gentamicin, Neomycin und Apramycin) (MCORIST u.
GEBHART 1995; MCORIST et al. 1995c).
Unterschiede zwischen den einzelnen anzuwendenden Medikamenten bestehen in
der Effizienz der intrazellulären Anreicherung des jeweiligen Arzneimittels. Wirkstoffe
mit einem schmalen Wirkspektrum sind gegenüber Breitspektrumantibiotika im
Grundsatz
zu
bevorzugen,
da
somit
eine
geringere
Beeinflussung
der
physiologischen Keimflora und ein geringerer Selektionsdruck auf kommensale
Keime erfolgt (BODE et al. 2000).
Eine antibiotische Behandlung kann durch ihre Dosierung und die zeitnahe
Anwendung zum Infektionszeitpunkt die immunologische Reaktion, die Dauer und
Stärke der Erregerausscheidung sowie die Ausprägung der LI-spezifischen Läsionen
beeinflussen. (WALTER et al. 2001).
In Bezug auf eine Serokonversion unter Behandlung mit gegen LI wirksamen
Antibiotika gibt es kontroverse Beschreibungen. Während einige Autoren ein
Ausbleiben der Immunreaktion unter antibiotischer Behandlung beobachteten
(COLLINS et al. 2000b; GUEDES et al. 2002b), konnten RITZMANN et al. (2004)
eine Serokonversion bei einer Behandlung mit Tiamulin und NATHUES (2007) eine
Serokonversion unter Behandlung mit Tylosin aufzeigen.
In
Deutschland
sind
derzeit
mehrere
Medikamente
mit
bakteriostatischem
Wirkprinzip zur Behandlung der Ileitis beim Schwein zugelassen, welche die
folgenden Wirkstoffe enthalten: Acetylisovaleryltylosin, ein Kombinationspräparat mit
Lincomycin
und
Spectinomycin,
Tiamulin,
Tylosin
und
Valnemulin
(Stand
04.06.2007) (UNGEMACH et al. 2007).
30
Literaturübersicht
In einer aktuellen Studie wurden minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentrationen
(MIC) für LI ermittelt (WATTANAPHANSAK et al. 2007). Die MIC wurde hier definiert
als die Wirkstoffmenge, mit der 99 % der proliferativen Veränderungen in einer
Zellkultur im Vergleich zur wirkstofffreien Kontrolle verhindert werden konnten.
Tabelle 5:
Minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentrationen für LI
(WATTANAPHANSAK et al. 2007)
Antimikrobieller
Wirkstoff
Carbadox
Chlortetracyclin
Lincomycin
Tiamulin
Tylosin
Valnemulin
2.5.4
europäische Lawsonia-intracellularis Isolate (n=4)
intrazellulär MIC extrazellulär MIC
(µg/ml)
(µg/ml)
0,125
1 bis 4
0,25 bis 16
16 bis 64
8 bis 64
32 bis 128
0,125
1 bis 4
0,5 bis 2
2 bis 16
0,125
0,125 bis 0,25
Vakzine
Eine effektive Vakzine muss gegen verschiedene Stämme des Erregers wirksam
sein. Im Fall von LI wird derzeit angenommen, dass es sich bei diesem Erreger um
einen einzelnen, monotypen Bakterienstamm ohne wesentliche genotypische
Variation handelt (MCORIST et al. 2003).
Western-Blots von sechs verschiedenen antigenwirksamen äußeren Membranproteinen von 77, 69, 54, 42, 36, und 18 kDa reagierten immer gleich auf
monoklonale Antikörper und konvaleszentes Serum von Schweinen, die vorher
Kontakt zu LI hatten (MCORIST et al. 1987; GUEDES u. GEBHART 2003c).
Monoklonale Antikörper gegen Oberflächen-Antigen von LI werden in histologischen
Tests angewendet. Mit diesen konnten bisher erfolgreich verschiedene Feldisolate
von infiziertem Darmgewebe verschiedener Tierarten nachgewiesen werden (SMITH
2001; BOESEN et al. 2005a).
Japanische Forscher konnten bei der Prüfung drei verschiedener Genfragmente
eines japanischen LI-Isolates jeweils eine Homologität von mehr als 99 % mit einem
Typstamm (NCTC 12656T) feststellen (KOYAMA et al. 2004). Diese Ergebnisse
lassen eine sehr hohe genetische Ähnlichkeit erkennen.
31
Literaturübersicht
Derzeit ist ein avirulenter Lebendimpfstoff (Enterisol®Ileitis, Boehringer Ingelheim
Vetmedica, Inc., Ingelheim) kommerziell verfügbar. Dieser Impfstoff dient der
Anwendung bei Ferkeln, die mindestens drei Wochen alt sind, um sie gegen durch LI
verursachte Krankheitserscheinungen zu schützen (KROLL et al. 2004b). Dieser
Impfstoff stimuliert die zellvermittelte Immunität beim Schwein (KNITTEL u. ROOF
1999; KROLL et al. 2004b). Die Verabreichung erfolgt über das Trinkwasser oder
direkte orale Gabe mittels Drenchen. Die Prävalenz und der Schweregrad von
makroskopischen und mikroskopischen Veränderungen, die Besiedlung des
Gewebes und die fäkale Ausscheidung von LI konnten signifikant vermindert werden.
Außerdem zeigten geimpfte Tiere im Vergleich zu ungeimpften Tieren in einem
Infektionsversuch eine signifikant verbesserte tägliche Zunahme (KROLL et al.
2004b).
Der Impfschutz beginnt 3-4 Wochen nach Impfung und hält für mindestens 22
Wochen an (KROLL et al. 2004a). Nach einer aktuellen Feldstudie konnte bei
Zuchttieren ein Impfschutz über die Dauer von mindestens 3,5 Jahren nachgewiesen
werden (SANDFORD 2006).
Verschiedene Studien haben die Wirksamkeit des Impfstoffes und einen signifikanten
Nutzen für Wachstumsleistung und Reduktion der Mortalitätsrate gegenüber einer
natürlichen Infektion mit LI nachgewiesen (HAYES u. KOLB 2002; KEÏTA et al. 2004;
KOLB et al. 2004).
Die Sicherheit des Impfstoffes konnte bei tragenden Sauen (KROLL et al. 2005c), bei
Mehrfach-Impfungen von Schweinen und Überdosierungen bei Ferkeln im Alter von
einer Woche belegt werden (KROLL et al. 2004a).
32
Material und Methoden
3
3.1
Material und Methoden
Bestand und Versuchsgruppe
Als Versuchsbetrieb wurde ein landwirtschaftlicher Betrieb ausgewählt, bei dem es
sich um einen Jungsauenvermehrerbetrieb (BHZP, DLxDE) handelt, in dem
außerdem die kastrierten männlichen Ferkel als Mastschweine aufgezogen wurden.
Die Diagnose einer Infektion mit LI wurde durch den behandelnden Bestandstierarzt
gestellt und durch eine serologische Untersuchung mittels Blocking-ELISA
(bioScreen European Veterinary Disease Management Center GmbH, Münster)
bestätigt. Hierfür wurden 5 Jungsauen, 5 Altsauen, 5 Tiere 3-4 LW, 10 Tiere 8-10
LW, 10 Tiere 13 LW, 10 Tiere 18 LW und 5 Tiere 24 LW untersucht. Bei dieser
Untersuchung der verschiedenen Altersgruppen wurde eine Serokonversion zur 13.
LW innerhalb des Versuchsbetriebs festgestellt.
Die LI-Infektion im Betrieb zeigte eine subklinische Verlaufsform. Klinische
Symptome
waren
dem
Betriebsleiter,
abgesehen
von
unspezifischem
Auseinanderwachsen bei einzelnen Tieren, nicht aufgefallen. Dies wurde durch einen
Bestandsbesuch vor Beginn der Studie bestätigt.
Zu dem Projekt liegt eine Genehmigung zur Durchführung von Tierversuchen von der
Bezirksregierung Detmold vor (AZ 50.05 03.1.1 (I/05)).
Parallel zum Versuchsbeginn (30.05.05) wurde im Betrieb eine Impfung gegen LI
eingeführt (Enterisol®Ileitis, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Inc., Ingelheim
2 ml/Tier). Die Versuchstiere blieben hiervon unberührt.
Alle Tiere im Betrieb wurden beim Absetzen gegen Mycoplasma hyopneumoniae
geimpft (Ingelvac M.hyo®, Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., Ingelheim,
2 ml/Tier), eine Impfung gegen PRRSV (Ingelvac® PRRS MLV, Boehringer
Ingelheim Vetmedica, Inc., Ingelheim, 2 ml/Tier) wurde bei allen Tieren zur 9.
Lebenswoche vorgenommen.
Aus einer am 30.05.05 abgesetzten Gruppe von 120 kastrierten Ferkeln im Alter von
28 Tagen wurden 60 Tiere nach dem Zufallsprinzip für die Versuchsgruppe
ausgewählt. Nach klinischer Untersuchung und individueller Markierung mit
Ohrmarken wurden die Schweine gewogen und in 6 Boxen zu je 10 Tieren im
Flatdeck (MIK-Kunststoffroste, Abb. 4) aufgestallt. Die Probenentnahme fand immer
33
Material und Methoden
in gleich bleibender Reihenfolge, beginnend mit Box eins und endend mit Box sechs
statt. Die restlichen Buchten dieses Stallabteils waren mit gegen LI geimpften Tieren,
welche nicht am Versuch teilnahmen, belegt.
Als Kontrolltiere für die pathohistologischen Untersuchungen dienten 5 gesunde
Schweine aus dem Sektionsgut des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover, die keine darmpathogenen Erreger aufwiesen.
Abbildung 4:
Belegungsplan im Flatdeckabteil des Versuchsbetriebes
Box 3
Box 2
Box 1
OM 23-36
OM 13-22
OM 1-12
geimpft PIA
geimpft PIA
geimpft PIA
geimpft PIA
geimpft PIA
Stallgasse
Box 4
Box 5
Box 6
OM 37-47
OM 48-57
OM 58-70
geimpft PIA
Legende: geimpft PIA = gleichaltrige gegen LI geimpfte Schweine, 10 Tiere je Box;
OM = Ohrmarke (einzelne Marken fehlten in numerischer Reihenfolge)
Alle Versuchstiere wurden unter gleichen Bedingungen aufgestallt und gefüttert. Am
12.07.05 wurden die Tiere in den Mastbereich umgestallt und gemeinsam in eine
Großbucht (Betonspaltenboden) verbracht.
Die Tiere wurden bis 14 Tage nach dem Absetzen mit einem handelsüblichen
Ferkelaufzuchtfutter (Fa. Agravis Raiffeisen AG, Paderborn-Kernstadt) ad libitum
über den Trog gefüttert. Daran anschließend wurde ein mit Titandioxid (1 g
Titandioxid je kg Futter) markiertes Ferkelaufzuchtfutter entsprechend eingesetzt (Fa.
De Heus-Sondag Voeders, NL). Mit der Umstallung am 12.07.05 wurde auf ein
ebenfalls mit Titandioxid (1 g Titandioxid pro kg Futter) markiertes Mastfutter (Fa. De
Heus-Sondag Voeders, NL) umgestellt, die Tiere wurden wiederum ad libitum
gefüttert.
Das Titandioxid wurde als Marker für eine parallel verlaufende Untersuchung zur
Verdaulichkeit genutzt (Institut für Ernährungswissenschaften der Martin Luther
Universität Halle-Wittenberg, Prof. Dr. M. Rodehutscort).
34
Material und Methoden
3.2
Klinische Untersuchung
Die Versuchsgruppe wurde zwischen der 6. und 16. Lebenswoche (LW) wöchentlich
sowie zur 20., 26. und 27. Lebenswoche klinisch untersucht (Tab. 6). Bei der
klinischen Untersuchung wurde das Allgemeinbefinden Verhalten der Tiere,
Ernährungszustand, Futter-/Wasseraufnahme, Haut, Haarkleid, Körpertemperatur,
Bewegungsapparat Untersucht. Die Kotkonsistenz wurde während der Entnahme bei
jedem Tier kontrolliert. Bei Verdacht auf eine Erkrankung wurden Einzeltiere ggf.
einer speziellen Untersuchung unterzogen. Außerdem wurde die Umgebung der
Tiere geprüft (Stallklima, Durchfallkot, Fütterungs- und Tränketechnik).
Datum
Tiertrans- port
Datum
Sektion
x
6
60
x
x
x
15.06.
7
60
x
x
x
22.06.
8
60
x
x
x
5
29.06.
01.07.
04.07.
9
55
x
x
x
5
06.07.
08.07.
11.07.
10
49*
x
x
x
5
13.07.
15.07.
18.07.
11
44
x
x
x
5
20.07.
22.07.
25.07.
12
38**
x
x
x
6
27.07.
29.07.
01.08.
13
33
x
x
x
5
03.08.
05.08.
08.08.
14
28
x
x
x
5
10.08.
12.08.
15.08.
15
23
x
x
x
5
17.08.
19.08.
22.08.
16
18
x
x
x
5
24.08.
26.08.
29.08.
20
13
x
x
x
21.09.
26
13
x
x
x
02.11.
27
13
x
11.11.
14.11.
28
8
x
x
x
x
Datum
Bestandsuntersuchung
Probenentnahme
x
Sektion
Anzahl der
Tiere (n)
Wiegung
60
ELISA
Serologie
klinische
Kontrolle
4
PCR
(LI Nachw. im
Kot)
Anzahl der
Tiere (n)
Zeitplan für die Untersuchung und Probenentnahme
Alter
in Wochen
Tabelle 6:
30.05.05
5
x
25.11.
Schlach
-tung
494
494
51
Legende: * 1 Schwein mit Gliedmaßenfraktur euthanasiert (keine Sektion)
** 1 Schwein aufgrund eines Mastdarmvorfalls euthanasiert (Sektion)
35
Material und Methoden
3.2.1
Probenentnahme
Die Tiere wurden einzeln fixiert, hierzu wurde entweder ein Blutentnahme-Bock oder
eine Drahtschlinge verwendet.
Die Kotproben wurden mittels Einmalhandschuh rektal entnommen und in ein
verschließbares Kunststoffgefäß überführt und mit der entsprechenden Tiernummer
versehen. War bei einzelnen Tieren nicht ausreichen Kot zu entnehmen wurden
diese markiert, und zu einem späteren Zeitpunkt im Verlauf der Untersuchung
wiederholt beprobt. Auf diese Weise konnte in dieser Untersuchnung immer
ausreichend
Probenmaterial
gewonnen
werden.
Nach
Beendigung
der
Probenentnahme wurden die gesammelten Kotproben bei einer Temperatur von 4°C
für den Transport gelagert. Der Zeitraum für den Transport der Proben bis in die
Tierärztliche Hochschule Hannover betrug zwischen 3 und 4,5 Stunden.
Die folgenden Beurteilungen der Kotkonsistenz waren möglich:
0 = unauffällig, 1 = dickbreiig, 2 = dünnbreiig und 3 = wässrig.
Im Labor wurde der Kot mit einem Einmalholzspatel in ein Eppendorfgefäß
(Eppendorf AG, Hamburg) überführt und bei -20 °C bi s zur Untersuchung
eingefroren. Um eine Kreuzkontamination der Proben untereinander zu vermeiden,
wurde die Überführung unter einer Abzugshaube durchgeführt, hierbei wurden
Einmalhandschuhe getragen, welche immer im Falle einer Verschmutzung, jedoch
mindestens nach 5 Proben gewechselt wurden. Entsprechend wurde eine
Zwischenreinigung mit Zellstofftüchern mit einer anschließenden Desinfektion mit
70 %igem Alkohol des Arbeitsplatzes vorgenommen. Die Proben wurden bei -20 °C
bis zur Untersuchung gelagert.
Alle Blutproben wurden mittels einer sterilen Serummonovette (Fa. Sarstedt AG,
Nümbrecht) aus der Vena jugularis externa oder Vena cava cranialis entnommen, bei
4 °C gekühlt transportiert und bei 5000 U/min (2000 g) für 15 Minuten zentrifugiert.
Das Serum wurde anschließend unter Verwendung von Einmal-Pipettenspitzen
(Eppendorf Ag, Hamburg) in Reaktionsgefäße überführt und bei -20 °C bis zur
Untersuchung gelagert.
In festgelegten Abständen, die dem Besuchsprotokoll (s. Tab. 6) zu entnehmen sind,
wurden die Tiere gewogen.
36
Material und Methoden
3.3 PCR
3.3.1
DNA-Extraktion aus Kotproben
Zur DNA-Extraktion aus den Kotproben wurde ein „QIAamp DNA Stool Mini kit“
gemäß Herstellerangaben benutzt (Fa. Qiagen GmbH, Hilden). Die Extraktion wurde
in einem eigens für diesen Zweck eingerichteten Raum durchgeführt. Für jeden
einzelnen Arbeitschritt wurden neue, nicht sterile Einmalhandschuhe verwendet, die
vor Benutzung mit 70 %igem Alkohol desinfiziert wurden. Alle für die Durchführung
der Extraktion notwendigen Gefäße wurden vor Benutzung sterilisiert.
Die Extraktion der Proben wurde auf mehrere Durchgänge von jeweils bis zu 20
Proben aufgeteilt. Bei jeder Extraktion wurde jeweils eine Positiv- und NegativKontrolle mitgeführt. Als Positiv-Kontrolle wurden nur solche Proben mitgeführt, die
vorher dreimal mittels einer separaten PCR ein positives Ergebnis geliefert hatten.
Nach Durchführung der Extraktion wurde die PCR unmittelbar im Anschluss
durchgeführt. Anschließend wurden die DNA-Proben bei -20 °C eingelagert.
3.3.2
Protokoll
•
Abwiegen der Proben (180 – 220 mg Kot), Zwischenlagerung auf Eis
•
Lysieren in 1,4 ml ASL-Puffer, eine Minute vortexen
•
Zur Inkubation für 5 Minuten bei 70 °C im Wasserba d erwärmen, 15 Sekunden
vortexen, zentrifugieren für eine Minute bei 20.000 g, 1,2 ml des Überstands
abpipettieren und Pellet verwerfen
•
Zum Absorbieren von inhibitorisch wirkenden Stoffen eine InhibitEx-Tablette
hinzufügen und vollständig suspendieren, eine Minute bei Raumtemperatur
inkubieren
•
Zum Entfernen von Inhibitoren, zentrifugieren bei 20.000 g für 3 Minuten,
Überstand abpipettieren, Pellet verwerfen, Überstand in neues Gefäß
überführen und ein weiteres mal zentrifugieren
•
Denaturierung der Proteine, 15 µl Proteinkinase K, vortexen für 5 Sekunden,
200 µl Al-Puffer hinzufügen, 15 Sekunden vortexen, inkubieren bei 70 °C im
Wasserbad für 10 Minuten
37
Material und Methoden
•
Ausfällen und Binden der DNA an Kieselgelmembran der QIAmp spin column,
200 µl Ethanol (96-100 %) hinzufügen und für 15 Sekunden vortexen, Lysat in
QIAmp spin column überführen
•
Waschen der DNA und Entfernen von Fremdstoffen an der Kieselgelmembran
der QIAmp spin column, 500 µl AW1-Puffer hinzufügen und bei 20.000 g für
eine Minute zentrifugieren
•
Zweiter Waschschritt, 500 µl AW2-Puffer hinzufügen und für 3 Minuten bei
20.000 g zentrifugieren
•
Eluieren
der
DNA,
200 µl
AE-Puffer
hinzugeben,
eine
Minute
bei
Raumtemperatur inkubieren und anschließend bei 20.000 g für eine Minute
zentrifugieren
3.3.3
Replikation der DNA mittels PCR
Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µl pro Probe angesetzt. Es wurden
die Primer A (5’-TAT GGC TGT CAA ACA CTC CG-3’) und B (5’-TGA AGG TAT
TGG TAT TCT CC-3’) (Fa. Carl Roth, Karlsruhe) aus einem bp-Segment des LIspezifischen p78-DNA-Klons gewählt. Sie entsprechen den Nukleotiden 5-24 und
304-323 (GEBHART et al. 1991). Die Sequenz ist in der Genbank unter der Nummer
L08049 zu finden.
Der Mastermix wurde in einem speziellen Raum unter einer Hera-SafeSicherheitswerkbank (Fa. Kendro Laboratory Products GmbH, Hilden) angemischt.
Beim Ansetzen des Mastermixes wurde zusätzlich eine Negativ-Kontrolle mitgeführt.
Die Sterilbank wurde in regelmäßigen Abständen für 30 Minuten mit UV-Licht
bestrahlt, um Kontaminationen mit Nukleasen und Fremd-DNA zu vermeiden. Für
den Mastermix wurden je Probe 2,5 µl 10xPuffer MgCl² 15 mMol, 1 µl MgCl²
25 mMol, 1 µl Primer A 10 mMol, 1 µl Primer B 10 mMol, 1 µl DNTP (Fa. Finnzymes
Oy Espoo, Finnland) 10 mMol, 0,1 µl HotStarTaq® (Fa.Qiagen GmbH, Hilden) sowie
H2O ad 22,5 µl benutzt.
In den Mastermix kamen 2,5 µl der DNA-Probe, dieses wurde wieder in einem
anderen Raum durchgeführt. Für die PCR wurde ein Eppendorf-Mastercycler (Fa.
Eppendorf AG, Hamburg) verwendet.
Es wurden folgende Schritte durchgeführt:
Denaturierung 10 Minuten bei 94 °C
38
Material und Methoden
35 Zyklen aus folgenden 3 Schritten:
40 s bei 94 °C
40 s bei 55 °C
40 s bei 72 °C
Nach Beendigung der Zyklen folgten 7 Minuten bei 72 °C zur Elongation der noch
unvollständigen Stränge. Anschließend wurden die Proben bis zur Entnahme aus
dem Cycler auf 4 °C heruntergekühlt.
3.3.4
Agarose-Gelelektrophorese
Für die Agarose-Gelanalyse der DNA-Banden wurden Horizontalgele mit einer
Konzentration von 2 % Agarose verwendet. Das Agarose-TAE-Puffergemisch wurde
im Mikrowellenherd bis zum Kochen erhitzt und nach Abkühlung auf 50 °C mit 16,5 µl
Gel-Star (Nucleic Acid Gel Star 10.000 x Konzentration in DMSO, Fa. Carbex Bio
Science Rockland Inc. Rockland, ME USA) durchmischt und in die gereinigten
Kammern gegossen. Nach der Polymerisierung des Gels wurden die Kämme
herausgezogen, und das Gel mit 1 x TAE-Puffer übergossen.
Die Proben wurden mit 2 µl Blaumarker versetzt und vor Eingabe in die Geltaschen
gründlich durchmischt.
Die Elektrophorese lief 90 Minuten mit 4-5 Volt pro Zentimeter Lauflänge.
3.3.5
Das
Auswertung der Gele
319 bp
große
Blaulichttransilluminator
DNA-Fragment
war
nach
Anregung
mit
einem
(Flu-o-blu, Fa. Biozym Scientific GmbH, Hessisch-
Oldendorf) als orangerote Bande sichtbar und wurde mit einer Digitalkamera
dokumentiert. Die Banden traten immer einzeln und in der zu erwartenden Länge
auf, lediglich die Signalstärke variierte und ließ sich nicht immer mit der Kamera
darstellen.
Zur Auswertung kamen ausschließlich Gele, bei denen die positiven Kontrollen
eindeutig auszuwerten waren. Proben, deren Banden eine Länge von 319 bp
aufwiesen, wurden positiv, und Proben, welche keine Banden aufwiesen, negativ
beurteilt.
39
Material und Methoden
3.4
Serologie
3.4.1
Kompetitiver Enzyme Linked Immunsorbent Assay
Für die Antikörperbestimmung im Blutserum wurde der kommerziell erhältliche
Enterisol®Ileitis-ELISA (Fa. bioScreen, Münster/Svanova Biotech AB, Uppsala,
Schweden) verwendet. Hierbei handelt es sich um einen Blocking-ELISA. Die
benötigten Versuchskits wurden bei 5 °C bis zu ihre r Verwendung gelagert. Der
Versuchsansatz wurde bei 37 °C für 60 Minuten in ei nem Inkubator behandelt. Nach
dem Auftauen wurden die Proben für wenige Sekunden anzentrifugiert, um
vorzubeugen, dass eventuelle korpuskuläre Bestandteile die Versuchsreaktion
stören.
Alle Befüllungs- und Waschschritte dieses Versuchs fanden immer in gleich
bleibender Reihenfolge statt.
Nach Befüllung, der mit einem inaktivierten Antigen beschichteten Mikrotiterplatte mit
je 90 µl Proben-/Konjugat-Verdünnungspuffer, wurden je 10 µl des Probenserums,
sowie
des
Positiv-
und
Negativ-Kontrollserums
(im
Doppelansatz),
in
die
entsprechenden Vertiefungen gegeben. Um nachträgliche Kontaminationen zu
vermeiden, wurde die Mikrotiterplatte mit einem durchsichtigen Klebestreifen
versiegelt. Eine gründliche Vermischung wurde mit einem Schüttler für 15 Sekunden
bei 300 Bewegungen pro Minute hergestellt. Der Versuchsansatz wurde bei 37 °C für
60 Minuten in einem Inkubator behandelt. Nach der Inkubation wurden die
Reaktionsvertiefungen mit einem Multi-Reagent-Washer (MRX, Fa. Dynatech Med.
Prod. Ltd., Guernsey, Channel Island, Great Britain) dreimal mit dem beigefügtem
PBS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) gespült und die Flüssigkeit jedes
Mal gründlich entfernt.
Anschließend wurde in jede Reaktionsvertiefung 100 µl anti-LI-mAb-HRP-Konjugat
gegeben und wieder für eine Stunde bei 36 °C inkubi ert. Die vorangegangenen
Waschschritte wurden wiederholt und 100 µl Substratlösung (Tetramethylbenzidin) in
die
Reaktionsvertiefungen
gegeben.
Die
Mikrotiterplatte
wurde
mit
der
Substratlösung für 10 Minuten bei 22 °C inkubiert, hierbei fand eine Blaufärbung der
Reagenzien
in
der
Mikrotiterplatte
statt.
Mit
der
Befüllung
der
ersten
Reaktionsvertiefung begann die Zeitmessung. Nach 10 Minuten wurden 50 µl
Stopplösung
(Schwefelsäure
2 Mol)
beigefügt,
es
erfolgte
ein
sofortiger
Farbumschlag von blau nach gelb.
40
Material und Methoden
Die Messung der Extinktionswerte fand unmittelbar nach Zufügen der Stopplösung
statt. Hierzu wurde ein Microplate Reader (MRX, FA. Dynex Tech. Inc., Denkendorf)
bei 450 nm verwendet.
Zur Berechnung der Inhibition in Prozent (PI) wurden die Extinktionswerte (optische
Dichte, OD) gemessen und nach folgender Formel verrechnet:
PIProbe = (ODNegativ-Kontrolle – ODProbe) x 100 / ODNegativ-Kontrolle
Der PI-Wert der positiven Kontrolle wurde entsprechend des OD-Wertes der Probe
berechnet:
PIPositiv-Kontrolle = (ODNegativ-Kontrolle – ODPositiv-Kontrolle ) x 100 / ODNegativ-Kontrolle
Zur Kontrolle der korrekten Testdurchführung wurden folgende Werte überprüft:
positives Kontrollserum: PI-Wert > 40
negatives Kontrollserum: OD-Wert > 0,5
Die Ergebnisse wurden wie folgt beurteilt:
PI ≥ 30 % Probe ist positiv
PI < 30 % Probe ist negativ
Probe ist fraglich, wenn PI zwischen ≥ 20% und < 30 % liegt.
Für die Beurteilung der Testergebnisse wurden fragliche Ergebnisse als negativ
angesehen.
3.5 Pathomorphologische Untersuchungen
3.5.1
Sektion
Wöchentlich wurden im Anschluss an die Labordiagnostischen Untersuchungen 5
Tiere, per Losverfahren, für die Sektion bestimmt. Die Tiere wurden durch die Klinik
für kleine Klauentiere freitags abgeholt und bis zum jeweiligen Montag in der Klinik in
einer separaten Bucht eingestallt. Die Tiere wurden in dieser Zeit strohlos auf
planbefestigtem Betonboden gehalten. Die Fütterung erfolgte ausschließlich mit dem
durch Titandioxid markierten Futter, welches wöchentlich aus dem Betrieb
mitgebracht wurde, um einen Futterwechsel zu vermeiden.
Mit der Einstallung wurden die Tiere einer Allgemeinuntersuchung unterzogen,
hierbei
wurden
das
Verhalten
der
Tiere,
Ernährungszustand,
41
Material und Methoden
Futter-/Wasseraufnahme, Haut, Haarkleid, Körpertemperatur, Bewegungsapparat,
Herz-Kreislauf und Atmungsapparat, sowie ggf. Kot- und Harnabsatz beurteilt.
Montags wurden die Tiere nach der morgendlichen Fütterung in das Institut für
Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover transportiert.
Die Tiere wurden einzeln vom Transportanhänger getrieben und erst unmittelbar vor
der Sektion mittels Elektrozange betäubt und anschließend durch Kopf-KörperDurchströmung ein Herzstillstand herbeigeführt. Auf diese Weise wurde bei allen
Versuchstieren gewährleistet, dass die Gewebeproben innerhalb einer Stunde nach
dem Tod des Tieres entnommen und in 5 %igem Formalin fixiert werden konnten.
Nach einer äußeren Besichtigung des Tierkörpers wurde die Bauchhöhle
paramedian eröffnet, sowie auf abnormalen Inhalt und Abweichungen hinsichtlich
Lage und Aussehen der Organe beurteilt.
Nach Eröffnung des Tierkörpers wurde vom terminalen Ileum nach kranial 1-2 Meter
abgebunden, die Länge richtete sich nach der Füllung des Jejunums. Pro Probe
wurden mindestens 100 g Ingesta für die Verdaulichkeitsbestimmungen entnommen.
Die Ingestaproben wurden bei -20 °C gelagert.
Stichprobenweise
wurden
Kotproben
zur
parasitologischen
Untersuchung
entnommen (Tab. 13).
Bei der eingehenden makroskopischen Besichtigung der gesamten Darmschleimhaut
wurden folgende Parameter für jeden Darmabschnitt bezüglich morphologischen
Veränderung, deren Verteilungsmuster und Ausprägungsgrad untersucht:
-Konsistenz des Darminhalts bzw. Kotkonsistenz
-blutiger Darminhalt
-Verdickungen der Mukosa
-Qualität der Veränderungen der Mukosa (fibrinös, nekrotisch, proliferativ, ödematös)
Nach eingehender Untersuchung wurden Proben (Tab. 7) entnommen und
unmittelbar in 10 %igem, nicht gepuffertem Formalin (Fa. CVH Chemie Vertrieb,
Hannover) fixiert.
42
Material und Methoden
Tabelle 7:
Probenplan für die Sektion
Jejunum
3 Proben über das gesamte Jejunum verteilt
Ileum
10 cm vor der Papilla ilealis
Ileum
Lokalisation mit ggf. makroskopisch auffälligen
Veränderungen
Caecum
5 cm nach der Papilla ilealis
Caecum
Lokalisation mit ggf. makroskopisch auffälligen
Veränderungen
Lnn. jejunales u. Tonsilla veli jeweils eine Probe
palatini
Colon ascendens
10 cm nach der Papilla ilealis
Colon ascendens
Lokalisation mit ggf. makroskopisch auffälligen
Veränderungen
3 Proben über das gesamte Colon descendens
Colon descendens
verteilt
Papilla
ilealis
und
Lnn. jeweils eine Probe
Ileocolici
Außerdem wurde der gesamte Tierkörper makroskopisch auf pathologische
Veränderungen untersucht.
3.5.2
Gewebeproben für die lichtmikroskopische Untersuchung
Eine Fixation der Gewebeproben zur nachfolgenden Herstellung von Paraffinblöcken
fand in 10 %igem, nichtgepufferten Formalin statt. Nach einer Fixationszeit von 24
Stunden wurden die Gewebeproben makroskopisch begutachtet und entsprechend
dem vorgegebenen Probenplan (Tab. 7) geschnitten.
Die Entwässerung und Einbettung der fixierten Gewebeproben erfolgte nach einem
standardisierten Laborprotokoll mit
Hilfe eines
(Pathcentre,
Cooperation,
Fa. Thermo
Electron
Gewebeeinbettungsautomaten
Dreieich) in
Paraffinwachs
(Histokomb Plus®, Fa. Vogel, Gießen). Die Lagerung fand bei Raumtemperatur statt.
43
Material und Methoden
Aus den Paraffinblöcken wurden mit einem Schlittenmikrotom (Fa. Microm,
Heidelberg) 4 µm dicke Schnitte angefertigt, in einem Wasserbad bei 55 °C
gestreckt, auf Glasobjektträger (Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM
2000, Fa. MEDITE, Burgdorf) aufgezogen und bei 37 °C im Wärmeschrank
getrocknet. Nach der Entparaffinierung in einer absteigenden Alkoholreihe wurden
die Präparate mit der Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung in einem Färbeautomaten
(Fa. Leica Microsystems, Nussloch GmbH, Nussloch) gefärbt.
3.5.3
Mikroskopische Beurteilung der HE-gefärbten Schnitte
Zur Quantifizierung der durch LI verursachten pathohistologischen Veränderungen
wurde ein Scoring-System etabliert (Tab. 8).
Die Beurteilung wurde abschnitts- und parameterweise durchgeführt. Jeder der 10
Beurteilungsparameter wurde zuerst für eine Lokalisation beurteilt, bevor ein neuer
Parameter begutachtet wurde. Für die Bewertung des jeweiligen Scores wurden pro
Parameter 5 zufällig ausgewählte Bildausschnitte beurteilt und anschließend der
Mittelwert bestimmt. Die Beurteilung erfolgte über das gesamte Gesichtsfeld in der
vorgegebenen Vergrößerung (Tab. 8).
Die Score-Werte für die 10 Parameter wurden für jede untersuchte Darmlokalisation
aufaddiert. Für einen Darmabschnitt konnten damit theoretisch maximal 28 ScorePunkte vergeben werden. Für jedes Schwein wurde außerdem ein Gesamtscore für
9 histologisch beurteilte Darmabschnitte (Jejunum, 2x Ileum, Papilla ilealis, 2x
Caecum, 2x Colon ascendens, Colon descendens) durch Addition der Einzelscores
für jede Darmlokalisation erstellt. Für den Gesamtscore war damit theoretisch eine
Punktezahl von maximal 252 erreichbar.
44
Material und Methoden
Tabelle 8:
Scoring-System für die histologische Beurteilung des
Darmes in einer HE-Färbung
Kryptabszess
Vergrößerung 100fach
0 Keine
1 1 bis 3 Kryptabszesse
2 3 bis 10 Kryptabszesse
3 > 10 Kryptabszesse
Maximalwert
3
Entzündungszellen
Gezählt wurden 4x4 Felder eines Zählfeldokkulars mit einer Fläche von jeweils
0,0025 mm².
Um einen Wert von 1 zu erreichen, mussten alle drei Kriterien erfüllt sein.
Vergrößerung 400fach
neutrophile
Makrophagen
Granulozyten Lymphozyten
0 0 bis 10
0 bis 1
0 bis 30
1 > 10
>1
> 30
Maximalwert
1
verminderte
Becherzellen
Vergrößerung 400fach
0 7-15 Becherzellen je Krypte, bzw. eine auf 2 Kryptepithelzellen
1 4 bis 6 Becherzellen je Krypte
2 1 bis 3 Becherzellen je Krypte
3 Keine
Maximalwert
3
Krypthyperplasie
Vergrößerung 100fach
0 Physiologisch max. 2 Epithelzellen übereinander
1 Unausgereifte Enterozyten
2 2 bis 3fach übereinanderliegende Zelllagen der Kryptepithelien
3 4 bis 5fach übereinanderliegende Zelllagen der Kryptepithelien
Maximalwert
3
Gefäßstauung
Vergrößerung 400fach
0 bis zu 3 Gefäße pro Gesichtsfeld
1 4 bis 5 Gefäße pro Gesichtsfeld
2 6 bis 7 Gefäße pro Gesichtsfeld
3 mehr als 7 Gefäße pro Gesichtsfeld
Maximalwert
3
45
Material und Methoden
noch Tabelle 8:
Verteilung der Krypthyperplasien
Anzahl der Gesichtsfelder, die hyperplastische Veränderungen der Krypten zeigen
Vergrößerung 40fach
0 keine erkennbaren Veränderungen
1 1 bis 4 Lokalisationen weisen hyperplastische Veränderungen auf
2 5 bis 8 Lokalisationen weisen hyperplastische Veränderungen auf
3 mehr als 8 Lokalisationen weisen hyperplastische Veränderungen auf
Maximalwert
3
Ulzerationen
Vergrößerung 40fach
0 Keine
1 maximal ein ulzerativer Herd, dessen Abmessung ¼ des Gesichtsfeldes nicht
Überschreitet
2 2 bis 3 ulzerative Herde mit einer Ausdehnung von jeweils weniger
als ¼ des Gesichtsfeldes, oder ein einzelner Herd mit einer
Ausdehnung von mehr als ¼ bis zu ½ des Gesichtsfeldes
3 mehr als 3 ulzerative Herde, oder ein Herd mit einer Ausdehnung von
mehr als ½ des Gesichtsfeldes
Maximalwert
3
Fibrinauflagerungen
Vergrößerung 40fach
0 Keine
1 ein einzelner fibrinöser Herd über eine Fläche von maximal ¼ des Gesichtsfeldes
2 2-3 fibrinöse Herde, mit einer Ausdehnung von jeweils nicht mehr
als ¼ des Gesichtsfelds, oder ein einzelner Herd mit einer
Ausdehnung von mehr als ¼ bis zu ½ des Gesichtsfeldes
3 mehr als 3 fibrinöse Herde, mit einer Ausdehnung von jeweils nicht
mehr als ¼ des Gesichtsfeldes, bzw. ein einzelner Herd mit einer
Ausdehnung von mehr als ½ des Gesichtsfeldes
Maximalwert
3
46
Material und Methoden
noch Tabelle 8:
Zottenverkürzung
Vergrößerung 40fach
0 keine Veränderungen der physiologischen Zottenstruktur, das
Längenverhältnis zwischen Zotten und Krypten erscheint größer als 3:1;
die Krypten in diesem Bereich sind nicht hyperplastisch verändert
1 das Verhältnis zwischen Zotten und Krypten erscheint kleiner als 3:1;
die Krypten in diesem Bereich sind hyperplastisch verändert
2 das Verhältnis zwischen Zotten und Krypten erscheint kleiner als 2:1;
die Krypten in diesem Bereich sind hyperplastisch verändert
3 keine Zottenstruktur mehr erkennbar; die Krypten in diesem Bereich sind
hyperplastisch verändert
Maximalwert
3
Hämorrhagie
Es wurde jeweils 1 cm² Gewebe je Schnitt mäanderförmig untersucht.
Vergrößerung 40fach
0 keine
1 1 bis 2 Lokalisationen mit erkennbarer Hämorrhagie
2 3 bis 4 Lokalisationen mit erkennbarer Hämorrhagie
3 mehr als 4 Lokalisationen mit erkennbarer Hämorrhagie, bzw. eine
Hämorrhagie, welche den gesamten Untersuchungsbereich umfasst
Maximalwert
3
Maximaler Gesamtscore für einen Darmabschnitt
3.6
3.6.1
28
Immunhistologische Untersuchung
Protokoll der Immunhistologie (ABC-Methode) für Paraffinschnitte
Der immunhistologische Nachweis von LI-Antigen wurde mittels einer von HSU et al.
(1981)
beschriebenen
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
(ABC)-Methode
durchgeführt:
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf Superfrost® plus-Objektträger (Fa. Gerhard
Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig) und anschließendes
Trocknen im Wärmeschrank bei 57° C für mindestens 3 0 min;
2. Entparaffinierung der Schnitte in Rotihistol® (Fa. Carl Roth, Karlsruhe) zweimal für
5 min, in Isopropanol und 96%igem Ethanol für je 3 min;
47
Material und Methoden
3. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml Methanol (reinst) + 3 ml
frisch zugesetztem 30%igem H2O2 (entspricht in endgültiger Lösung 0,5%igem H2O2)
für 30 min unter langsamem Rühren;
4. Spülen der Schnitte dreimal für 5 min in PBS ;
5. Einsetzen der Schnitte in Coverplates® (Immunfärbecenter Sequenza, Fa.
Shandon, Frankfurt a. M.);
6. Überschichten mit je 100 µl 1:5 in PBS verdünntem Ziegen-Normalserum für 20
min bei Zimmertemperatur zur Unterdrückung unspezifischer Hintergrundfärbungen;
7. Auftragen von je 100 µl polyklonalem Kaninchen-Antiserum (gegen LI ∗, 1:30000
verdünnt in PBS mit 1%igem bovinen Serumalbumin) bzw. entsprechend
verdünntem Kontrollserum (Kaninchenserum, 1:10000); Inkubation über Nacht bei
4 °C;
8. Erwärmen der Schnitte auf Zimmertemperatur (mind. 30 min), dann dreimal für 5
min Spülen in PBS;
9. Überschichten mit je 100 µl Konjugat (biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG,
1:200 verdünnt in PBS); Inkubation für 30 min. bei Zimmertemperatur;
10. Spülen der Schnitte dreimal für 5 min in PBS;
11. Auftragen von je 100 µl ABC-Komplex und Inkubation für 30 min bei
Raumtemperatur (Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 min vor
Gebrauch);
12. Spülen der Schnitte dreimal für 5 min in PBS; anschließend Verbringen der
Schnitte in eine mit PBS gefüllte Glasküvette;
13. Auftauen des DAB (3,3`-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid) “stock solution
aliquot“ (0,1 g DAB in 50 ml PBS auflösen, Einfrieren und Aufbewahren bei –20 °C)
in Dunkelheit, Verdünnen mit 150 ml PBS, Filtration durch zwei unsterile Faltfilter
(Fa. Sartorius, Göttingen), Zugabe von 2 ml 3%igem H2O2 zur DAB-Lösung und
Inkubation der Schnitte unter Rühren für 5 min bei Raumtemperatur;
14. Spülen der Schnitte zweimal für 5 min in PBS, anschließend Verbringen der
Schnitte in fließendes, kaltes Leitungswasser für 5 min;
15. Gegenfärbung der Schnitte mit Hämalaun nach Meyer (ROMEIS 1989) für 15 s;
∗An dieser Stelle sei Connie Gebhart, (Veterinary and Biomedical Sciences
University of Minnesota, St Paul, Minnesota, USA) für die Bereitstellung des
polyklonalem Antiserums gegen LI gedankt.
48
Material und Methoden
16. Bläuen der Schnitte in fließendem, kalten Leitungswasser für 10 min;
17. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für je 2 bis 3 min in
50%igem, 70%igem und 96%igem Alkohol, für je 5 min in Isopropanol und zweimal 5
min in EBE;
18. Eindecken der Schnitte mit Hilfe des Folieneindeckautomaten Tissue-Tek® (Fa.
Vogel GmbH & Co. KG, Gießen);
Für die einzelnen Darmabschnitte wurde ein immunhistologischer Score (maximaler
Score 6) vergeben, der sich aus der Beurteilung der Befunde an Krypten (maximaler
Score 3) und Rundzellen (maximaler Score 3) zusammensetzt. Für die Beurteilung
der Lymphknoten wurde jeweils ein einfacher Score (maximaler Score 3) vergeben
(Tab. 10).
49
Material und Methoden
Tabelle 9:
Scores zur immunhistologischen Beurteilung einzelner
Darmabschnitte und Lymphknoten
Immunhistologisch positive Krypten in Prozent je Gesichtsfeld (Darm)
Vergrößerung 100fach, Mittelwert aus 5 Gesichtsfeldern
0
0%
1
1-20%
2
21-50%
3
>50%
Immunhistologisch positive Rundzellen in Zahlen je Gesichtsfeld (Darm)
Vergrößerung 100fach, Mittelwert aus 5 Gesichtsfeldern
0
0
1
1-20
2
21-50
3
>50
maximaler Score für einen
Darmabschnitt = 6
Immunhistologisch positive Rundzellen im Lymphknoten
Vergrößerung 100fach, Mittelwert aus 5 Gesichtsfeldern
0
Keine
1
1 – 20
2
20 – 200
3
> 200
maximaler Score für Ln. = 3
50
Material und Methoden
3.7
Sonstige Untersuchungen und Behandlungen der
Versuchstiere
Am 3.6.05 wurden die Versuchstiere 23 - 36 aufgrund des Verdachts auf ColiEnterotoxämie mit Danofloxacin (Advocit®, Fa. Pfizer, Karlsruhe, 1,25 mg/kg KGW)
vom
Haustierarzt
behandelt.
Durch
das
Ausbrechen
einer
Actinobacillus-
pleuropneumoniae (App)-Infektion ab dem 12.07.05 (Diagnose bestätigt durch das
Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover am
26.07.05) kam es zu klinischen Symptomen (Husten, Dyspnoe, Fieber bis 41,1 °C)
bei zahlreichen Tieren im Bestand. Die Versuchstiere wurden mit Amoxicillin
(Duphamox®, Fa. Ford Dodge, Würselen, 15 mg/kg KGW/48 h) gegen App über 10
Tage behandelt.
Versuchstier Nummer 18 schied am 12.07.05 aufgrund einer Mittelfußfraktur aus
dem Versuch aus.
Tier Nummer 28 wurde am 28.07.05 wegen eines Mastdarmvorfalls euthanasiert und
wurde 6 Stunden nach der Euthanasie seziert. Aufgrund der fortgeschrittenen
Autolyseerscheinungen in der Darmschleimhaut konnten nicht alle vorgesehenen
Proben für die Histologie genommen werden. Die verwertbaren Gewebeschnitte sind
in die Versuchsauswertung einbezogen worden.
3.7.1
Diagnostische Untersuchungen zum Ausschluss weiterer Erreger
von Darmerkrankungen
Vor Beginn der Studie wurden insgesamt 31 zufällig ausgewählte, klinisch
unauffällige Tiere aus dem Aufzuchtbereich des Versuchsbetriebs auf Brachyspira
spp., Salmonella spp., hämolysierende Escherichia (E.) coli und Clostridium
perfringens untersucht. Lediglich bei 2 Tieren konnte ein mittelgradiger Keimgehalt
an hämolysierenden E. coli (Gene für Fimbrientyp (F) F4 und Enterotoxine LTI und
STII) nachgewiesen werden, bei 7 Tieren lag ein mittel- bis hochgradiger Keimgehalt
an B. innocens vor.
Zusätzlich zu den Eingangsuntersuchungen wurden am Institut für Mikrobiologie der
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zufällig ausgewählte Kotproben von
Versuchtieren kulturell auf Salmonellen, Brachyspiren, Clostridium perfringens und E.
coli untersucht (Tab. 10). Eine Differenzierung war aufgrund des spärlichen
51
Material und Methoden
Wachstums nicht in allen Fällen möglich. Es wurde zweimal B. intermedia
differenziert, und in fünf Fällen war eine Differenzierung nicht möglich (Tab. 10). Nur
in einem Fall (Tier Nummer 49) wurde mittels PCR ausgeschlossen (Tab. 11) das es
sich nicht um Brachyspira hyodysenteriae oder pilosicoli handelte.
Die molekulargenetische Untersuchung auf erregerspezifische Genomabschnitte von
Brachyspira hyodysenteriae und pilosicoli wurde durch die Gesellschaft für innovative
Veterinärdiagnostik GmbH, Heisterbergallee 12, 30453 Hannover vorgenommen
(Tab. 11). Die Proben wurden im Rahmen der Bestandsuntersuchung entnommen.
Bei der Sektion wurde stichprobenweise Kot für parasitologische Untersuchungen
entnommen. Eine parasitäre Infektion konnte nicht nachgewiesen werden. (Tab. 12).
52
Material und Methoden
Tabelle 10:
Ergebnisse kultureller Untersuchungen von Kotproben auf
bakterielle Durchfallerreger während des Versuchsverlaufes
Tier-
Datum der
nummer
Probenentnahme Befund Institut für Mikrobiologie
Kulturell konnten Salmonellen und hämolysierende
E. coli nicht nachgewiesen werden. Kulturell
48
13.06.2005
hochgradig Brachyspira intermedia nachweisbar.
Kulturell konnten Salmonellen und hämolysierende
E. coli nicht nachgewiesen werden. Kulturell
51
13.06.2005
hochgradig Brachyspira intermedia nachweisbar.
Kulturell
mittelgradiger
Keimgehalt
an
hämolysierenden E. coli (F4 Enterotoxine LTI und
STII),
kulturell
geringgradiger
Gehalt
an
Brachyspiren nachweisbar (eine Differenzierung
49, 52
13.06.2005
war nicht möglich), Salmonellen nicht nachweisbar.
Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende
E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen
6, 22, 39,
46
13.06.2005
werden.
Kulturell konnten Salmonellen und hämolysierende
E. coli nicht nachgewiesen werden. Kulturell
geringgradiger
nachweisbar
11, 24, 43
13.06.2005
Gehalt
(eine
an
Differenzierung
Brachyspiren
war
nicht
möglich).
Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende
E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen
7, 24
29.06.2005
werden
Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende
E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen
41, 61
03.08.2005
werden.
Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende
E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen
20, 39
02.11.2005
werden.
53
Material und Methoden
Tabelle 11:
Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen auf
Brachyspira (B.) hyodysenteriae und B. pilosicoli (PCR) während des
Versuchsverlaufes
Datum der
Befund (Fa. Innovative Veterinär Diagnostik
Tiernummer Probenentnahme GmbH)
8,
10,
19,
kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von
49, 53
B. hyodysenteriae und B. pilosicoli
29.06.2005
kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von
21, 22
B. hyodysenteriae und B. pilosicoli
12.07.2005
kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von
7, 22
B. hyodysenteriae und B. pilosicoli
20.07.2005
kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von
36, 37, 52
B. hyodysenteriae und B. pilosicoli
29.06.2005
Tabelle 12:
Ergebnisse der parasitologischen Kotuntersuchungen von
Kokzidien
Nematodirus
Trichuris
Capillaria
Strongyloides
Ascaris
60
x
x
x
x
x
x
x
63
x
x
x
x
x
x
x
19
x
x
x
x
x
x
x
42
x
x
x
x
x
x
x
53
x
x
x
x
x
x
x
21
x
x
x
x
x
x
x
29.07.05
03.08.05
strongyliden
Tiernummer
22.01.05
Magendarm-
Datum
sechs Versuchstieren
Legende: X = kein positiver Nachweis in der untersuchten Probe
54
Material und Methoden
3.8
Die
Verdaulichkeitsanalyse
Messung
der
präzäkalen
Verdaulichkeit
von
Nährstoffen
bei
den
Versuchsschweinen wurde von der Martin-Luther-Universität, Halle Wittenberg unter
der Leitung von Prof. Dr. M. Rodehutscord und Mitarbeit von Dr. H. Kluth
durchgeführt.
3.8.1
Chymusgewinnung
Unmittelbar nach der Tötung wurden die Tierkörper zügig eröffnet und der Dünndarm
freigelegt. Zur Probennahme wurde nach vorangegangener Vermessung der
Gesamtlänge nur der Darminhalt aus der terminalen Hälfte des Dünndarmes
verwendet (s.o.). Dabei wurde der Inhalt 30 cm vor der Papilla ileocaecalis von der
Beprobung
ausgeschlossen,
um
eine
mikrobielle
Kontamination
aus
den
nachgelagerten Verdauungsabschnitten und somit den Eintrag von mikrobiellem
Protein weitgehend zu vermeiden. Nach Überführung in Plastikgefäße wurde der
Chymus unmittelbar tiefgefroren. Zur weiteren Analyse erfolgte eine Gefriertrocknung
sowie eine Vermahlung über eine Zentrifugalmühle (Pulverisette, Typ 14.702, Fa.
Fritsch, Idar-Oberstein) mit einem 0,5 mm-Sieb.
3.8.2
3.8.2.1
Chemische Analysen
Weender Rohnährstoffe
Die Analyse der Weender Rohnährstoffe Rohasche, Rohprotein und Rohfett in den
Futter- und gefriergetrockneten Chymusproben wurde nach den Vorschriften des
Verbandes Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten
(VDLUFA); (NAUMANN u. BASSLER 1976) durchgeführt.
Die Rohproteinbestimmung erfolgte über die Bestimmung des N-Gehaltes nach
Kjeldahl (N×6,25). Das Rohfett wurde durch Petroletherextraktion mittels SoxlethApparatur ermittelt. Die im Zuge der Mineralstoffanalytik erforderliche Veraschung
erfolgte bei 550 °C.
55
Material und Methoden
3.8.2.2
Mineralstoffanalytik
Nach Veraschung und Eindampfen mit 6 N HCl in verdünnter HNO3 erfolgte die
Herstellung einer definierten Aschelösung. Die Konzentrationen an Calcium und
Phosphor in dieser Aschelösung wurden an einem optischen Emissionsspektrometer
mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES, JY 24, Fa. Jobin Yvon GmbH,
München) gemessen (RODEHUTSCORD u. DIECKMANN 2005).
3.8.2.3
Brennwert
Die Bestimmung des Brennwertes (GE) erfolgte mit einem Bombenkalorimeter mit
isoperibolem Messprinzip (IKA C7000, Fa. IKA Werke GmbH, Staufen).
Titandioxid
Die Konzentrationen des Markers TiO2 wurden photometrisch nach BRANDT und
ALLAM (1987) bestimmt.
3.8.3
Berechnungen
Die präzäkale Verdaulichkeit (pc VQ) der Rohnährstoffe, der Mineralstoffe und der
Bruttoenergie wurde unter Verwendung der analysierten Gehalte an Nährstoffen und
Marker in Futter und Chymus mit der Formel wie folgt berechnet:
pc VQ (%) = 100 - [(NährstoffChymus × TiO2Futter) / (NährstoffFutter × TiO2Chymus) × 100]
TiO2Futter ; TiO2Chymus: Konzentrationen an TiO2 in Futter bzw. Chymus
NährstoffChymus; NährstoffFutter: Konzentrationen des Nährstoffs in Chymus bzw. Futter
56
Material und Methoden
3.9
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der histologischen und immunhistologischen Daten
erfolgte mittels des Statistikprogrammes „Statistical Analysis System“ (SAS) für
Windows, Version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, USA, im Institut für Biometrie,
Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover.
Hierbei wurden die ermittelten Datenwerte zunächst einer Untersuchung auf
Normalverteilung unterzogen. Anschließend wurde der Kruskal-Wallis-Test als
Globaltest
zum
Gruppenvergleich
herangezogen.
Für
den
paarweisen
Gruppenvergleich wurde der Wilcoxon-Test als nicht-parametrische Ein-WegVarianzanalyse gewählt, da die Daten überwiegend nicht normal verteilt waren. Um
etwaige Korrelationen zwischen bestimmten Parametern darzustellen, wurde der
Rang-Korrelationskoeffizient nach Spearman (rS) genutzt.
Für die Auswertungen wurden die per Sektion untersuchten Tiere in 4 Gruppen
unterteilt:
Gruppe 0: Negativ-Kontrollgruppe (n=5, Tiere nicht aus dem Versuchsbetrieb)
Gruppe 1: Tiere, bei denen der erste Nachweis einer LI-Infektion erst bei der Sektion
mittels Immunhistochemie geführt werden konnte (n=5)
Gruppe 2: Tiere, bei denen der erste Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder
ELISA) innerhalb von 1-3 Wochen vor der Sektion geführt werden konnte (n=21/22)
Gruppe 3: Tiere, bei denen der erste Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder
ELISA) früher als 3 Wochen vor der Sektion geführt werden konnte (n=23).
Ein Tier konnte nicht zeitgerecht seziert werden, weil es außerplanmäßig im Betrieb
eingeschläfert werden musste. Die histologischen Befunde für dieses Tier waren
deshalb nicht vollständig auswertbar (Gruppe 2). Bei einem Tier, das in der zehnten
Lebenswoche seziert wurde, konnte mittels keiner der verwendeten Methoden eine
LI-Infektion festgestellt werden. Dieses Tier wurde keiner der Gruppen zugeordnet.
Für statistisch zu belegende Unterschiede werden folgende Signifikanzgrenzen
angegeben: schwach signifikant p<0,05, signifikant p<0,01, hoch signifikant p<0,001.
57
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1
Nachweis der Lawsonia-intracellularis-Infektion
Eine Zusammenfassung der Einzeltieruntersuchungen sind dem Anhang (Kapitel 9.1
Tab. 25) zu entnehmen.
Die Versuchstiere waren bis zur zehnten Lebenswoche in Gruppen von zehn Tieren
im Flatdeck aufgestallt. Die ersten LI-Befunde (PCR, ELISA oder Immunhistologie)
wurden in der sechsten Lebenswoche in Box vier und fünf festgestellt. In Woche
sieben zeigten sich auch erste Infektionen in Box zwei. In Box drei zeigten sich erst
ab der neunten Lebenswoche erste Infektionen (Abb.5, 6). In der Box drei infizierten
sich bis zur 10. Lebenswoche nur drei der eingestallten Tiere (n=10). In Box eins
waren in diesem Zeitraum fünf von zehn Tieren infiziert, während in den restlichen
Boxen sieben bis neun Tiere infiziert waren (Abb. 5, 6).
58
Lebensalter (Wochen)
Ergebnisse
+
Mittelwert
box
Infizierte Tiere zwischen der 6. und 10. Lebenswoche
n=5
n=8
n=3
n=6
n=9
n=8
Abbildung 5:
Verteilung der erstmalig positiven Nachweise einer LI-
Infektion (PCR, ELISA oder Immunhistologie) zwischen der 6. und 10.
Lebenswoche (LW) der Versuchstiere (n=10 pro Box) innerhalb der einzelnen
Boxen (1-6) im Flatdeck (p>0,05)
Legende:
box = Stallplatz
59
Anteil
infizierter
Tiere
(%)
Anteil gesamt
insgesamt
Infizieter
Tiere
%
Ergebnisse
100
90
80
70
Lebenswoche 6
60
Lebenswoche 7
50
Lebenswoche 8
40
Lebenswoche 9
30
Lebenswoche 10
20
10
0
Box1
Abbildung 6:
Box2
Box3
Box4
Box5
Box6
Anteil der bis zur jeweiligen Lebenswoche mittels PCR,
ELISA oder Immunhistologie als LI-infiziert erkannten Tiere pro Flatdeckbox (6.
bis 10. Lebenswoche)
Von 60 Tieren der Versuchsgruppe blieben die meisten Schweine bezüglich der
Kotkonsistenz völlig unauffällig, nur 24 hatten während der Beobachtungszeit
mindestens zu einem Untersuchungszeitpunkt einen Kotkonsistenz-Score von mehr
als 0. Von diesen Tieren wiesen lediglich acht wiederholt einen Scorewert über 0 auf.
Zumeist zeigten auffällige Schweine nur dickbreiigen Kot (n=16), klinisch manifester
Durchfall konnte nur in wenigen Fällen nachgewiesen werden (n=8). Ein Tier davon
zeigte zu einem einzelnen Zeitpunkt wässrigen Durchfall, davor mehrfach dickbreiige
Kotkonsistenz. Bei diesem Tier lag jedoch eine Mischinfektion mit E. coli (F4,
Enterotoxine LTI und STII) vor. Sieben dieser Tiere wiesen mindestens zu einem
Zeitpunkt einen dünnbreiigen Kotabsatz auf, von diesen sieben Tieren hatten drei
mehrfach einen Score von mehr als 0 (überwiegend dickbreiige Konsistenz, nur ein
Tier an zwei Untersuchungsterminen mit dünnbreiiger Kotkonsistenz) (Tab. 13).
60
Ergebnisse
Tabelle 13:
Kotkonsistenz während der Untersuchungsperiode (n=60
Schweine)
maximal festgestellter Score
0 (ohne Befund)
1 (dickbreiig)
2 (dünnbreiig)
3 (wässrig)
Tiere (n)
36
16
7
1
Anzahl der Tiere (n), die
wiederholt einen Score > 0 hatten
4 von 16
3 von 7
1 von 1
Mittels PCR-Untersuchungen wurde bei insgesamt 39 Tieren (65 %) eine fäkale
Erregerausscheidung festgestellt. Lediglich fünf Schweine davon wiesen keine für LI
spezifischen Antikörper auf, von diesen fünf Tieren zeigte eines ein fragliches
Ergebnis in der ELISA-Untersuchung.
Insgesamt konnten bei 49 Tieren (81,7 %) Antikörper gegen LI nachgewiesen
werden. Von den 21 Schweinen, bei denen keine Erregerausscheidung im Kot
festgestellt wurde, zeigten 15 Tiere ein serologisch positives Ergebnis (Tab. 14).
Tabelle 14:
Vergleich zwischen PCR- und ELISA-Ergebnissen (n=60
Schweine, + = positiv, - = negativ, ? = fraglich)
ELISA +
ELISA ?
ELISA total (n)
total (%)
PCR + (n)
34
1
4
39
65
PCR- (n)
15
2
4
21
35
total (n)
49
3
8
60
total (%)
81,7
5
13,3
100
Bei der immunhistologischen Untersuchung des Darmes konnte bei diesen 15 Tieren
LI-Antigen nachgewiesen werden. Bei den übrigen 6 PCR-negativen Tieren wurde
bei beiden ELISA-fraglichen Tieren und bei drei der ELISA-negativen Tiere ebenfalls
immunhistologisch LI-Antigen gefunden (Tab. 15).
Nur bei einem Tier der gesamten Versuchsgruppe konnte zu keinem Zeitpunkt in
keiner der Untersuchungen auf Antigen oder Antikörper eine LI-Infektion bestätigt
werden.
61
Ergebnisse
Tabelle 15:
Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung von
Tieren (n=21), bei denen mittels PCR keine LI-Ausscheidung im Kot
nachgewiesen werden konnte, im Vergleich zur Serologie (+ = positiv,
- = negativ, ? = fraglich).
IH + (n)
IH - (n)
total (n)
ELISA +
15
0
15
ELISA ?
2
0
2
ELISA -
3
1
4
total
20
1
21
Der erste Nachweis von LI spezifischen Genomfragmenten mittels PCR im Kot der
Versuchstiere gelang bereits in der 6. Lebenswoche bei drei Tieren. Der
Schwerpunkt der erstmalig beobachteten Erregerausscheidung lag in der 9. (12
Tiere) und 10. (7 Tiere) Lebenswoche der Tiere. In der 13. Lebenswoche wurden die
letzten Erstausscheidungen gefunden. Nach diesem Zeitpunkt zeigte sich kein neuer
Erstausscheider unter den Versuchstieren (Abb. 7, Tab. 16).
14
12
Tiere (n)
10
8
6
4
2
0
6 LW 7 LW 8 LW 9 LW 10 LW 11 LW 12 LW 13 LW 14 LW 15 LW 16 LW 26LW
Lebensalter
(Wochen)
Lebenswochen
Abbildung 7:
Zeitpunkte des erstmalig positiven PCR Nachweises im Kot
mittels PCR (n=39 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten
Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen.
62
Ergebnisse
Von 39 Tieren, bei welchen in der PCR eine Erregerausscheidung im Kot festgestellt
wurde, konnte bei 18 nur einmalig ein Nachweis registriert werden. Die Dauer der
Ausscheidung hatte eine Spannbreite von einer bis zu acht Wochen, wobei
Unterbrechungen im Einzelfall vorkamen (Abb. 8). Die längste regelmäßige
Nachweisfolge ohne Unterbrechung gelang bei einem Tier über 7 Wochen.
Insgesamt
zeigten
21
Tiere
eine
Ausscheidung
zu
mindestens
2
Untersuchungszeitpunkten. Die Tiere, deren Erregerausscheidung durch eine
unmittelbar auf die letzte Untersuchung folgende Sektion eventuell abgebrochen
wurde, sind in Abb. 8 gesondert markiert.
20
18
16
Tiere (n)
14
12
10
Tiere, deren Sektion unmittelbar
auf das letzte positive PCRErgebnis folgte
8
6
4
Tiere, deren Sektion nicht
unmittelbar auf das letzten
positive PCR-Ergebnis folgte
2
0
1W
2W
3W
4W
5W
6W
7W
8W
Dauer der Erregerausscheidung (Wochen)
Abbildung 8:
Dauer der LI-Ausscheidung (n=39).
Es wurde die jeweils erste und letzte Erregerausscheidung berücksichtigt,
ungeachtet davon, ob die Erregerausscheidung durchgehend erfolgte oder
eine Unterbrechung vorlag.
63
Ergebnisse
Der größte Anteil der Erreger ausscheidenden Tiere wurde während der
Untersuchungsperiode zwischen der 9. und 11. Lebenswoche gefunden. In diesem
Zeitraum schieden zwischen 22 und 27 % der Versuchstiere den Erreger fäkal aus
26
LW
LW
16
LW
15
14
LW
LW
13
LW
12
LW
11
LW
10
LW
9
LW
8
7
6
LW
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
LW
Anteil Erreger ausscheidender
Tiere (%)
(Abb. 9, Tab. 16).
Lebensalter (Wochen)
Abbildung 9:
Anteil der Erreger ausscheidenden Tiere innerhalb der
Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der
jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 16 zu entnehmen.
64
Ergebnisse
Werden alle erkannten Erregerausscheider aufsummiert, zeigte sich für den Zeitraum
zwischen der 8. und der 9. Lebenswoche die größte Zunahme an in der PCR positiv
erkannten Tiere (ca. 20 %). Das Maximum wurde bereits zur 13. Lebenswoche
erreicht. Zu diesem Zeitpunkt hatten 65 % der Tiere zu mindestens einem Zeitpunkt
LI in ihrem Kot ausgeschieden (Abb. 10, Tab. 16).
100
90
Anteil Tiere (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6 LW
7 LW
8 LW
9 LW
10 LW
11 LW
12 LW
13 LW
14 LW
15 LW
16 LW
26LW
Lebensalter (Wochen)
Abbildung 10:
Anteil der insgesamt per PCR als LI-Ausscheider erkannten
Schweine an der gesamten Gruppe (n=60) zur jeweiligen Lebenswoche.
65
Ergebnisse
Tabelle 16:
Ergebnisse der Kotuntersuchung auf LI mittels PCR zu den
festgelegten Untersuchungszeitpunkten
7. LW
8. LW
9. LW
10. LW
11. LW
12. LW
13. LW
14. LW
15. LW
16. LW
26. LW
PCR ges.
pos. (n)
6. LW
n
PCR
erstmalig
pos. (n)
60
60
60
55
49
44
38
33
28
23
18
13
3
4
4
12
7
4
2
3
0
0
0
0
3
7
10
15
11
10
5
8
1
0
0
0
11
23
30
34
36
39
39
39
39
39
6,7 21,8 14,3 9,1
5,3
9,1
PCR total
pos. (n)
PCR
erstmalig
pos. (%)
3
7
5,0
6,7
0,0
0,0
0,0
0,0
PCR ges.
pos. (%)
5,0 11,7 16,7 27,3 22,5 22,7 13,2 24,2 3,6
0,0
0,0
0,0
PCR total
pos. (%)
5,0 11,7 18,3 38,3 50,0 56,7 60,0 65,0 65,0 65,0 65,0 65,0
Legende:
erstmalig pos. = Anzahl der zu diesem Untersuchungszeitpunkt erstmalig positiv
reagierenden Tiere
ges. pos. = Anzahl aller zu diesem Untersuchungszeitpunkt positiv reagierender
Tiere
total pos. = Anzahl aller bis zu diesem Untersuchungszeitpunkt mindestens einmal
positiv beurteilter Tiere
66
Ergebnisse
Der erste Antikörpernachweis konnte in der Versuchsgruppe mit Beginn der
Untersuchungen in der 6. Lebenswoche bei einem Tier geführt werden. Eine erste
deutliche Zunahme an serokonvertierten Tieren zeigte sich in der 8. Lebenswoche
mit 11 Tieren, gefolgt von einem zweiten Anstieg in der 10. Lebenswoche mit 16
Tieren. Die späteste Serokonversion konnte bei einem Tier in der 26. Lebenswoche
belegt werden. Bei den Schweinen, die eine späte Serokonversion erkennen ließen
(14.-26. Woche), lagen zu früheren Untersuchungszeitpunkten bereits fragliche
Ergebnisse vor (Abb. 11).
Der Anteil an seropositiven Tieren zu den Untersuchungszeitpunkten stieg ab der 8.
Lebenswoche von 20 % auf bis maximal 73 % in der 11. Lebenswoche. Nach der 11.
Lebenswoche war der Anteil der Seroreagenten wieder rückläufig bis auf ca. 30 % in
der 26. Lebenswoche (Abb. 12).
Der Gesamtanteil an serokonvertierten Tieren stieg ab der Lebenswoche 8
kontinuierlich bis zu einem Maximum von 81,7 % in Lebenswoche 26 an. Bereits ab
LW
26
LW
16
LW
15
LW
14
LW
13
LW
12
LW
11
LW
10
LW
9
LW
8
7
6
LW
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
LW
Anzahl Tiere (n)
Lebenswoche 10 waren mehr als 50 % der Versuchstiere seropositiv (Abb. 12).
Lebensalter (Wochen)
Abbildung 11:
Zeitpunkte der mittels ELISA festgestellten Serokonversion
(n=49 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus
Tab. 17 zu entnehmen.
67
Ergebnisse
80
Anteil pos Tiere (%)
70
60
50
40
30
20
10
26
LW
LW
LW
16
14
15
LW
LW
13
LW
12
11
10
LW
LW
LW
9
LW
LW
8
6
7
LW
0
Lebensalter (Wochen)
Abbildung 12:
Anteil
serologisch
positiver
Schweine
innerhalb
der
Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der
jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen.
90
Anteil Tiere (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
LW
26
LW
16
LW
15
14
LW
LW
13
LW
12
LW
11
LW
10
LW
9
LW
8
7
6
LW
LW
0
Lebensalter (Wochen)
Abbildung 13:
Anteil der insgesamt gegen LI serokonvertierten Schweine
an der gesamten Gruppe (n=60, vgl. Tab.17) zur jeweiligen Lebenswoche.
Die Serokonversion konnte bei 41,0 % der Tiere gleichzeitig mit der ersten
feststellbaren Erregerausscheidung nachgewiesen werden. Bei 35,1 % der
68
Ergebnisse
Versuchsgruppe erfolgte die Serokonversion ein bis zwei Wochen und bei 2,6 % drei
Wochen nach dem ersten PCR Nachweis. Keine Serokonversion zeigten 12,8 % der
Tiere. 7,7 % der Schweine zeigten schon ein bis zwei Wochen vor erstem PCR
Nachweis ein positives ELISA-Ergebnis (Abb. 14).
Serokonvertierte Tiere (%)
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
keine
2 Wochen 1 Woche
Serokonversion früher
früher
gleichzeitig 1 Woche
später
2 Wochen 3 Wochen
später
später
Abstand zwischen Serokonversion und erster Erregerausscheidung (Wochen)
Abbildung 14:
Vergleich zwischen dem Zeitpunkt der ersten feststellbaren
Erregerausscheidung mittels PCR und dem der Serokonversion (n=39).
69
Ergebnisse
Tabelle 17:
Antikörper
Ergebnisse
gegen
LI
der
mittels
serologischen
Untersuchungen
Blocking-ELISA
zu
den
auf
festgelegten
Untersuchungszeitpunkten
6. LW
7. LW
8. LW
9. LW
10. LW
11. LW
12. LW
13. LW
14. LW
15. LW
16. LW
26. LW
60
60
60
55
49
44
38
33
28
23
18
13
1
0
11
6
16
7
4
0
1
0
2
1
ELISA ges.
pos. (n)
1
1
12
11
27
32
25
20
12
11
8
4
ELISA ges.
fragl. (n)
1
3
10
13
7
2
9
9
12
6
6
6
1
1
12
18
34
41
45
45
46
46
48
49
3,6
0,0 11,1 7,7
Anzahl
untersuchter
Tiere (n)
ELISA
erstmalig
pos. (n)
ELISA total
pos. (n)
ELISA
erstmalig
pos. (%)
1,7
0,0 18,3 10,1 32,7 15,9 10,5 0,0
ELISA ges.
pos. (%)
1,7
1,7 20,0 20,0 55,1 72,7 64,8 60,6 42,9 47,8 44,4 30,8
ELISA ges.
fragl. (%)
1,7
5,0 16,7 23,6 14,3 4,6 23,7 27,3 42,9 26,1 33,3 46,2
ELISA total
pos. (%)
1,7
1,7 20,0 30,0 56,7 68,3 75,0 75,0 76,7 76,7 80,0 81,7
Legende:
erstmalig pos. = Anzahl/Anteil der zu diesem Untersuchungszeitpunkt erstmalig
positiv reagierenden Tiere
ges.
pos./fragl.
=
Anzahl/Anteil
aller
zu
diesem
Untersuchungszeitpunkt
positiv/fraglich reagierender Tiere
total pos. = Anzahl/Anteil aller bis zu diesem Untersuchungszeitpunkt mindestens
einmal positiv beurteilter Tiere
70
LW
26
LW
16
LW
15
LW
14
LW
13
LW
12
LW
11
10
LW
LW
LW
9
7
6
8
LW
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
LW
Anteit Tiere (%)
Ergebnisse
Lebensalter (Wochen)
Abbildung 15:
Gesamtanteil aller als LI-infiziert erkannten Schweine unter
Berücksichtigung aller verwendeten diagnostischen Verfahren (PCR, ELISA,
Immunhistologie) zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt
Unter Berücksichtigung aller verwendeten diagnostischen Verfahren (PCR, ELISA
und Immunhistologie) wiesen 98,3 % der Versuchsgruppe (n=59 von 60) bis zur 27.
Lebenswoche zu mindestens einem Untersuchungszeitpunkt Befund auf (Abb. 15).
Der erste positive Untersuchungsnachweis konnte mittels Serologie bereits in der 6.
Lebenswoche geführt werden. Die stärkste Zunahme als LI-infiziert erkannter Tiere
war von der 8. Lebenswoche bis zur 12. Lebenswoche zu erkennen. Innerhalb
dieses Zeitraums stieg der Anteil positiv reagierender Tiere von 23,3 % auf 91,7 %.
Die tägliche Gewichtszunahme bei als mit LI infiziert bzw. nicht infiziert erkannten
Schweine wurde nur bis zur Lebenswoche 8 ausgewertet, da zur 10. Lebenswoche
eine Actinobacillus-pleuropneumoniae-Infektion auftrat, die eine weitere Auswertung
nicht sinnvoll erscheinen ließ.
Zum
Absetzen
entsprach
das
durchschnittliche
Körpergewicht
der
zur
8.
Lebenswoche LI infizierten Tiere (n=14) annähernd dem der zu diesem Zeitpunkt LInegativen Schweine (n=46, p>0,05). Im Mittel nahmen die LI-negativen Tiere bis zur
8. Lebenswoche zwar täglich um 50 g mehr zu als die schon infizierten Schweine,
jedoch konnte dieser Unterschied nicht statistisch gesichert werden. (Tab. 18)
71
Ergebnisse
Tabelle 18:
Durchschnittliches Körpergewicht zum Absetzen (4 Wo) und
mittlere tägliche Gewichtszunahme bis zur 8. Lebenswoche bei LI infizierten
und LI-negativen Tieren (unterschiedliche Buchstaben: p<0,05)
Tiere (n)
Körpergewicht
tägliche
beim Absetzen mit
Gewichtszunahme
4 Wo (x+s, kg)
in den Lebenswochen 4-8
(x+s, kg)
bis zur 8.
46
7,51 ±1,21a
0,394 ±85a
14
7,69 ±0,88a
0,344 ±92a
Lebenswoche
LI-negative Tiere
zur 8. Lebenswoche
LI-positive Tiere
72
Ergebnisse
4.2
Pathomorphologische Untersuchungen
Für diese Studie wurden 51 Tiere aus der Versuchsgruppe und fünf LI-negative
Kontrolltiere seziert. Ein Versuchstier wurde aufgrund eines Mastdarmvorfalls
vorzeitig seziert, wegen fortgeschrittener Autolyse konnten bei diesem Tier nicht alle
Darmabschnitte untersucht werden.
Bei der Sektion der Versuchtiere konnten makroskopische, durch LI verursachte
Veränderungen nur bei einem Schwein gefunden werden. In diesem Fall zeigten sich
deutliche fibrinöse Auflagerungen und Ulzerationen, die sich vom Ende des
Jejunums bis ins mittlere Colon erstreckten. Bei diesem Tier wurde eine
nekrotisierende Enteritis diagnostiziert (NE, Tier Nr. 49). Bei anderen Tieren wurden
lediglich mikroskopisch typische Veränderungen einer PPE an der Darmschleimhaut
festgestellt.
Makroskopisch leicht verdickt erscheinende Bereiche der Darmschleimhaut konnten
regelmäßig sowohl bei den Versuchstieren als auch bei nicht mit LI infizierten
Kontrolltieren beobachtet werden und wurden auf postmortale Kontraktionen des
Darms zurückgeführt (Abb.16, 17).
Andere makroskopische Veränderungen am Darm waren Hyperämien (Abb. 16) und
mussten in der Regel als unspezifisch angesehen werden. Dies wird auch belegt
durch die vergleichende histologische Untersuchung von zuvor im Versuchsplan
metrisch festgelegten Lokalisationen zur Probenentnahme (ohne Berücksichtigung
von
möglichen
makroskopischen
Veränderungen)
mit
frei
wählbaren,
ggf.
makroskopisch auffälligen Probenentnahmestellen am selben Darmabschnitt (s. Kap.
3.5.1). Trotz makroskopisch bei einigen Tieren scheinbar vorhandener Unterschiede
zeigte sich nach histologischer Beurteilung eine hochsignifikante Korrelation
(p<0,001) zwischen den Score-Werten zu den im Vorfeld determinierten Stellen von
Ileum, Caecum und Colon und den Score-Werten für die entsprechenden frei
wählbaren Lokalisationen (Tab. 19).
73
Ergebnisse
Tabelle 19:
Korrelation zwischen den Score-Werten für histologische
Läsionen am Darm an metrisch zuvor festgelegten und an frei wählbaren
Lokalisationen (Korrelationskoeffizient r, Signifikanz p).
Ileum
Caecum
Colon
r
0,89440
0,91730
0,8074
p
<0,001
<0,001
<0,001
74
Ergebnisse
Abbildung 16:
Ileozäkaler Übergang mit geringgradigen Hyperämien und
geringgradig verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 63).
Hier dargestellt ist ein häufig beobachtetes Sektionsbild vom Ileum und der Papilla
ilealis. Es zeigen sich makroskopisch herdförmig verteilte Hyperämien. Die
Schleimhaut ist gefaltet.
Die Sektion fand in der 14. Lebenswoche statt. Bis zu diesem Zeitpunkt konnte keine
LI-Ausscheidung per PCR nachgewiesen werden. Das Tier zeigte von der 8.
Lebenswoche bis zur 12. Lebenswoche ein positives ELISA-Ergebnis, mit einen
fraglichen Ergebnis zur 9. Lebenswoche. In den Lebenswochen 13 und 14 war der
ELISA fraglich. Histologisch lagen eine geringgradige (ggr.) epitheliale Hyperplasie
sowie ggr. Kryptabszesse an der Papilla ilealis vor. Im Bereich des Ileums wurden
keine auf eine LI-Infektion hinweisenden histologischen Veränderungen gefunden.
Legende:
Hyperämie
Faltenbildung der Darmschleimhaut
75
Ergebnisse
Abbildung 17:
Ileum mit geringgradigen Hyperämien und geringgradig
verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 45).
Die verdickte Mukosa des Ileums zeigt irreguläre, erhabene transversal und
longitudinal verlaufende Falten sowie geringgradige herdförmige Hyperämien auf.
Eine LI-Ausscheidung im Kot konnte bei Tier 45 nur in der 8. Lebenswoche registriert
werden, das Schwein war über einen Zeitraum von vier Wochen serologisch positiv
(8.-11. LW). Zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 12 zeigte sich ein fragliches
ELISA-Ergebnis. Histologisch wurde eine ggr. epitheliale Hyperplasie nur in einem
von fünf untersuchten Gesichtsfeldern gefunden.
Legende:
longitudinal und transversal verlaufende Falten der Mukosa
ggr. Hyperämie
76
Ergebnisse
Pathohistologisch zeigten insgesamt 28 der 51 untersuchten Tiere auf eine porzine
proliferative Enteropathie hinweisende Veränderungen. Dabei wurde bei 23
Schweinen eine reine proliferative Darmentzündung festgestellt (Abb. 18, 19). Bei 3
Tieren konnten zusätzlich ulzerative und bei 2 Tieren fibrinös-ulzerative Läsionen
(Abb. 22) nachgewiesen werden (Tab. 20).
Die proliferativen Veränderungen verteilten sich wie folgt auf die verschiedenen
Darmabschnitte: 10 Tiere zeigten in nur einem Darmabschnitt proliferative
Erscheinungen, davon 9 Tiere im Ileum und ein Tier im Colon ascendens. Sieben
Tiere hatten Proliferationen sowohl im Ileum als auch im Caecum und Colon
ascendens. Drei Tieren zeigten gleichzeitig Proliferationen in Ileum und Caecum,
ebenfalls drei Tiere zeigten Proliferationen im Ileum und im Colon ascendens. Bei
vier Tieren beschränkten sich die proliferativen Veränderungen auf Caecum und
Colon ascendens. Es konnten weder an den untersuchten Lokalisationen im Jejunum
noch im Colon descendens proliferative Alterationen beobachtet werden.
Die 5 Kontrolltiere blieben bis auf minimale unspezifische Veränderungen
pathohistologisch unauffällig.
Bei den proliferativen Veränderungen waren unreife Zellen in den Kryptepithelien zu
erkennen, diese lagen in bis zu fünf übereinander liegenden Schichten. Die
Becherzellen waren innerhalb der proliferierten Krypten nur noch einzeln oder gar
nicht mehr vorhanden (Abb. 21). Zwischen den proliferierten Zellen waren im
Vergleich zu unveränderten Krypten vermehrte Mitosen und Infiltrationen von
Lymphozyten und Makrophagen zu erkennen. Die Mukosa stellte sich in schweren
Fällen als Adenom ähnlich mit stark verzweigten Krypten, welche teilweise zum
Darmlumen geöffneten waren, dar. Die Darmzotten waren in der Länge teilweise
deutlich reduziert, oder nicht mehr zu erkennen (Abb. 19).
Bei Tieren, die keine proliferativen Veränderungen aufwiesen, waren z.T. blasse
geschwollene oder geschrumpfte degenerierte Enterozyten zu beobachten. In
diesem Stadium konnten vermehrt apoptotische Körperchen in den Zellen gefunden
werden. Zusätzlich bestanden Becherzellhyperplasien, die Zotten waren z.T. etwas
kürzer als bei gesunden Kontrolltieren (Abb. 23, 24).
77
Ergebnisse
Tabelle 20:
Ergebnisse der histologischen Beurteilung bei Versuchs-
(n=51) und Kontrolltieren (K, n=5). Neben der pathologischen Diagnose wird
der Gesamtscore für 9 untersuchte Darmlokalisationen angegeben.
Tier Nr.
Lebenswoche
16
8
49
8
42
8
19
8
53
8
52
70
54
36
37
47
31
59
9
9
9
9
9
10
10
10
30
10
8
22
40
10
11
11
7
11
32
6
28
45
4
1
14
48
11
11
12
12
12
12
12
12
Diagnose
mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und
Colitis
mgr. fibrinös-ulzerative und
proliferative Ileitis, Typhlitis und Colitis
ggr. fibrinös-ulzerative und
proliferative Ileitis
mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und
Colitis
ggr.-mgr. proliferative Ileitis,Typhlitis
und Colitis
mgr. ulzerativ-proliferative Ileitis, ggr.
proliferative Typhlitis und Colitis,
ggr. proliferative Typhlitis und Colitis,
ohne besonderen Befund
mgr. proliferative Ileitis
mgr. proliferative Ileitis und Colitis
ggr. proliferative Ileitis und Colitis
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und
Colitis
ggr. ulzerativ-proliferative Ileitis, ggr.
proliferative Typhlitis
ggr. proliferative Ileitis
ggr. proliferative Ileitis und Colitis
mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und
Colitis
ggr.-mgr. proliferative Ileitis und
Typhlitis
ggr. proliferative Typhlitis und Colitis
ggr. proliferative Ileitis
ggr. proliferative Ileitis
ggr. proliferative Colitis
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
histologischer
Gesamtscore
für 9 DarmGruppeneinteilung
abschnitte
59
2
74,4
2
5,4
2
66
2
39,4
2
60,2
22,8
1,6
17,2
31,6
13,4
6,4
1,2
2
2
2
1
1
2
0
1
55
2
26,6
12,4
17
2
2
2
62,4
2
22
8,6
5,4
3,2
6
0,2
3,8
3,2
1
3
2
3
1
2
2
3
78
Ergebnisse
noch Tabelle 20
Tier Nr.
Lebenswoche
10
13
21
43
11
46
63
24
17
26
62
38
41
50
5
15
12
56
65
67
23
9
33
64
60
13
13
13
13
13
14
14
14
14
14
15
15
15
15
15
16
16
16
16
16
27
27
27
27
27
K1080
K1079
K1078
K1077
K216
Läufer, 25 kg
Läufer, 25 kg
Läufer, 25 kg
Läufer, 25 kg
Läufer, 25 kg
Diagnose
ggr. proliferative Ileitis, Typhlitis und
Colitis
ggr. ulzerativ-proliferative Ileitis, ggr.
proliferative Typhlitis und Colitis
ggr. proliferative Ileitis
ggr. proliferative Typhlitis und Colitis
ohne besonderen Befund
ggr. proliferative Ileitis
ggr. proliferative Ileitis und Typhlitis
ggr. proliferative Ileitis
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ggr. proliferative Ileitis
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
ohne besonderen Befund
histologischer
Gesamtscore
für 9 Darmabschnitte
Gruppeneinteilung
31,2
2
25
6,2
17,4
3,8
6,6
6,6
4,4
5,4
3
6,6
2,6
1,8
1,4
1,4
2,4
1,2
3,4
4,6
12,4
1,8
3,6
4,2
3
3,2
2
3
2
2
3
3
3
3
3
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0
0,8
0,4
0,2
0
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
79
Ergebnisse
Abbildung 18:
Caecum, gering bis mittelgradig proliferierte Krypten (Tier 7)
Das Bild zeigt eine gering bis mittelgradige proliferative Typhlitis mit Hyperplasie von
Krypten (Vergrößerung x40, Färbung HE). Das Tier wurde in der 11. Lebenswoche
seziert. In dieser Woche konnte bei dem Schwein erstmalig eine LI-Ausscheidung im
Kot gefunden sowie Antikörper gegen LI (ELISA) nachgewiesen werden. Der
Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen.
Legende:
proliferierte Krypten mit unregelmäßigem Erscheinungsbild
80
Ergebnisse
Abbildung 19:
Ileum, hochgradig proliferative Ileitis (Tier 17)
Das Bild zeigt eine hgr. proliferative Ileitis mit Hyperplasie des Kryptepithels und
Zottenverlust (Vergrößerung x40, Färbung HE). Der Gesamtbefund des Tieres ist
Tabelle 20 zu entnehmen. Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8,
Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8
nachgewiesen werden.
Legende:
verzweigte Krypten, welche zum Darmlumen geöffnet sind, keine Zottenstruktur
mehr erkennbar
Zelldetritus im Kryptlumen
proliferierte Krypten (Krypthyperplasie, Becherzellreduktion)
81
Ergebnisse
Abbildung 20:
Ileum, hochgradig proliferierte Krypten mit Zelldtritus (Tier
19)
Das Bild zeigt eine hgr. proliferative Ileitis (Vergrößerung x100, Färbung HE) mit
adenomatös
veränderten
Krypten
mit
Proliferationen
von
Epithelzellen.
Im
Kryptlumen befindet sich zum Teil Zelldetritus. Es ist eine hochgradige Reduktion der
Becherzellen zu erkennen. Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8,
Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8
nachgewiesen werden. Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen.
Legende:
vereinzelte Becherzellen in den Krypten
unregelmäßig erscheinende Krypten mit mehrschichtigem Kryptzellepithel und
Zelldetritus
82
Ergebnisse
Abbildung 21:
Ileum, hochgradig proliferierte Krypte (Tier 19)
Das Bild zeigt eine hochgradig proliferierte Krypte des Ileums. Die Epithelzellen sind
unreif und zeigen vesikuläre Zellkerne. In der Krypte befinden sich vermehrt
Mitosefigur (Vergrößerung x 400, Färbung HE). Das Tier war LI-positiv (PCR) in
Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der
Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden.
Legende:
Mitosefiguren
unreife Epithelzellen
83
Ergebnisse
Abbildung 22:
Caecum, hochgradige fibrinös-ulzerative und proliferative
Veränderungen (Tier 49)
Das Bild zeigt eine hgr. fibrinös-ulzerative und proliferative Typhlitis. Makroskopisch
waren vom Jejunum bis ins Colon reichende Ulzerationen mit Fibrinauflagerungen zu
erkennen (Vergrößerung x40, Färbung HE). Das Tier schied bereits in der 6.
Lebenswoche Erreger mit dem Kot aus. In der 8. Lebenswoche fand die
Serokonversion und auch die Sektion statt. Zum Zeitpunkt der Sektion hatte dieses
Tier einen wässrigen Durchfall.
Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen.
Legende:
Entzündungszellen
hgr. Ulzeration mit großflächiger Fibrinauflagerung
mgr.-hgr. proliferierte Krypten, teilweise mit Kryptabszessen
84
Ergebnisse
Abbildung 23:
Caecum, normales Krypepithel mit vermehrten Becherzellen
und apoptotischen Körperchen (Tier 50)
Das Bild zeigt ein weitgehend normales Kryptepithel, in dem vermehrt Becherzellen
und vereinzelt apoptotische Körperchen erkennbar sind (Vergrößerung x100,
Färbung HE). Das Tier schied von der 7 bis zur 14 Lebenswoche Erreger aus (eine
Unterbrechung in der 10. LW). Die Serokonversion fand in der 9. LW statt. Der
positive Titer hielt bis zur Sektion in der 15. LW an. Die Kotkonstistenz war einmalig
in der 11. LW dünnbreiig. In der Immunhistologie konnte LI-Antigen nur in Rundzellen
gefunden werden, nicht aber im Kryptepithel. Der Gesamtbefund des Tieres ist
Tabelle 20 zu entnehmen. Legende:
Becherzellhyperplasie
Apoptotische Körperchen
85
Ergebnisse
Abbildung 24:
Ileum, stark vermehrte Becherzellen und deutlich in der
Länge reduzierte Darmzotten (Tier 23)
Das Bild zeigt stark vermehrte Becherzellen und eine deutlich reduzierte Länge der
Zotten. Aufgrund der reduzierten Zottenlänge und der vorangegangenen positiven
Infektionsnachweise kann angenommen werden, dass sich dieses Tier in einem
Rekonvaleszensstadium befand. In der HE-Färbung waren keine proliferativen
Veränderungen
zu
erkennen
(Vergrößerung
x40,
Färbung
HE).
Das
Tier
serokonvertierte in der 12. Lebenswoche und war einmalig in der 13. Lebenswoche
PCR-positiv. Der ELISA-Titer war nur in der 12. und 13. Lebenswoche positiv, und
fraglich in den Wochen 14 und 15. Zum Zeitpunkt der Sektion, in der beginnenden
17. Lebenswoche, war das Tier in ELISA und PCR negativ. Immunhistologisch war LI
nicht nachzuweisen. Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen.
Legende:
Becherzellenhyperplasie /
stark verkürzte Zottenlänge
86
Ergebnisse
Abbildung 25:
Caecum, immunhistologische Darstellung von LI-
spezifischem Antigen in Krypten und Rundzellen (Tier 19)
Immunhistologisch ist ein hgr. Gehalt an LI-Antigen darstellbar (Vergrößerung x40,
ABC-Methode).
Positive Reaktion im luminalen Kryptepithel und vereinzelten Rundzellen der Lamina
propria.
Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA)
konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden.
Legende:
LI-infizierte Rundzellen in der Lamina propria
braun markiertes LI-Antigen in infizierten Kryptepithelzellen
87
Ergebnisse
Abbildung 26:
Caecum, immunhistologischer Nachweis von LI-
spezifischem Antigen in einer Krypte (Tier 19)
Lawsonien (braun gefärbt) befinden sich im zytoplasmatischen Bereich der
Kryptenterozyten (Vergrößerung x400, ABC Methode). Das Tier war LI-positiv (PCR)
in Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der
Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden.
Legende:
braun markiertes LI-Antigen in infizierten Kryptepithelzellen
88
Ergebnisse
Abbildung 27:
Elektronenmikroskopische Aufnahme einer mit LI infizierten
Zelle. (Tier 49). Vergrößerung x 12.500
Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule, Hannover; Dr. B.
Jacobsen
LI im apikalem Bereich der Epithelzelle (Bakterienzellen im Anschnitt)
Zellkern
89
Ergebnisse
Die
sezierten
und
histologisch
untersuchten
51
Versuchstiere
wurden
in
Abhängigkeit vom Zeitpunkt des ersten Infektionsnachweises und dem Zeitpunkt der
Sektion in Gruppen eingeteilt (s. Kap. 3.9) und anhand des histologischen
Gesamtscores für 9 Darmlokalisationen (maximal möglicher Wert 252) mit der
Kontrollgruppe (n=5) verglichen.
In der Negativ-Kontrollgruppe wurde ein mittlerer histologischer Score-Wert von
0,28+0,33 gefunden und ein signifikanter Unterschied (p<0,05) zu allen anderen
Gruppen festgestellt. Das einzelne LI-negative Versuchstier hatte einen Score-Wert
von 6,4. Dieses Tier wurde in den statistischen Vergleich nicht einbezogen.
Bei den Tieren, deren erster Nachweis einer LI-Infektion erst durch die
immunhistologische Untersuchung bei der Sektion gefunden wurde (Gruppe 1),
konnte der Infektionszeitpunkt nicht näher eingegrenzt werden. Die Schweine hatten
einen durchschnittlichen Score-Wert von 15,6+12,24. Diese Gruppe unterschied sich
signifikant von der Kontrollgruppe, nicht aber von Gruppe 2 und 3.
Die Tiere der Gruppe 2 (Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor Sektion) wiesen den
höchsten mittleren Score-Wert mit 28,77+24,51 auf. Diese Gruppe unterschied sich
signifikant (p<0,05) von der Kontrollgruppe und von der Gruppe 3 (Nachweis der LIInfektion > 3 Wo vor Sektion), bei der ein Score-Wert von 3,39+2,05 ermittelt werden
konnte (Abb. 28).
90
Ergebnisse
Negativ-Kontrolle
60
b
Histologischer Gesamtscore
50
neg. Versuchstier
40
bc
erster
Infektionsnachweis
zeitgleich zur Sektion
(Gruppe 1)
30
erster
infektionsnachweis 1-3
Wochen vor Sektion
(Gruppe 2)
20
c
10
erster
Infektionsnachweis >3
Wochen vor Sektion
(Gruppe 3)
a
0
n=5
Abbildung 28:
n=1
n=5
Durchschnittliche
n=21
n=23
Ausprägung
der
histologischen
Veränderungen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem
positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer
Gesamtscore für 9 Darmlokalisationen: 252); unterschiedliche Buchstaben:
p<0,05
91
Ergebnisse
Histologischer Gesamtscore
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
Abbildung 29:
2
4
6
8
10
Abstand zwischen erstem Nachweis und Sektion (Wochen)
Korrelation
zwischen
dem
Grad
der
12
histologischen
Veränderungen (Gesamtscore für 9 Darmlokalisationen) und dem zeitlichen
Abstand zwischen erstem Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder ELISA,
n=44) und der Sektion (y= -4,3985x+35,598; r= -0,5753, p<0,001)
Es konnte eine hochsignifikante negative Korrelation zwischen dem Grad der
histologischen Läsionen (Gesamtscore für 9 Darmlokalisationen) und dem zeitlichen
Abstand zwischen erstem Nachweis einer LI-Infektion (PCR, ELISA, n=44) und der
Sektion nachgewiesen werden (r= -0,5753, p<0,001). Die Einzelwerte für den
Gesamtscore lagen in einem Bereich von 0 bis maximal 74,4.
Deutlicher ausgeprägte histologische Veränderungen (Score>10) waren nur
innerhalb der ersten 3 Wochen nach Infektionsnachweis auffindbar. Zu späteren
Zeitpunkten lagen nur noch geringgradige Läsionen vor (Score <10) (Abb. 29).
92
Ergebnisse
In Abb. 30 wird die histologische Beurteilung der einzelnen Darmabschnitte für die
Kontrollgruppe und die Gruppen 2 und 3 dargestellt. Innerhalb der NegativKontrollgruppe
unterschieden
sich
die
Bewertungen
für
die
einzelnen
Darmabschnitte nicht von einander. Die Gruppe 2 (Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo
vor Sektion) zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe deutliche Veränderungen an fast
allen untersuchten Darmlokalisationen (p<0,05) außer im Bereich von Jejunum und
Colon descendens. Die Bereiche mit ausgeprägten Läsionen unterschieden sich vom
Grad her jedoch statistisch untereinander nicht.
Die Gruppe 3 zeigte nur in einzelnen Lokalisationen Befunde, die sich signifikant von
der Kontrollgruppe unterschieden (p<0,05, Papilla ilealis, frei wählbare Lokalisation
am Colon ascendens), der Grad der Läsionen hier war aber immer noch wesentlich
geringer als
bei der Gruppe 2 (p<0,05). In den übrigen Bereichen waren nur
minimale Veränderungen wie bei den Negativ-Kontrolltieren auffindbar.
12
b
Negativ Kontrolle
n =5
b
b
b
8
b
6
b
b
c
4
a
Abbildung 30:
Darmabschnitte
d
a
a
i
de
sc
en
de
ns
a
a
on
a
as
c.
fre
a
a
C
ol
on
a
C
ol
on
i
fre
Ile
um
Ile
um
Je
j
un
um
Ü
be
rs
i
ch
t
0
a
C
ol
a
fr e
i
a
a
m
a
C
ae
cu
a
C
ae
cu
a
ile
al
is
a
Pa
pi
lla
2
m
Histologischer Score
10
a
erster
Infektionsnachweis
1-3 Wochen vor
Sektion n=21
(Gruppe 2)
erster
Infektionsnachweis
>3 Wochen vor
Sektion n=23
(Gruppe 3)
Grad der histologischen Veränderungen an den einzelnen
untersuchten Darmlokalisationen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand
zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion
(max. erreichbarer Score 28); unterschiedliche Buchstaben p<0,05
93
Ergebnisse
4.3
Immunhistologische Untersuchungen auf Lawsonia
intracellularis
Bei
der
immunhistologischen
Untersuchung
wurden
für
jedes
Tier
4
Darmlokalisationen (Ileum, Papilla ilealis, Caecum und Colon ascendens) sowie zwei
Darmlymphknoten (Lnn. jejunales, Lnn. ileocolici) kontrolliert. Das LI-spezifische
Antigen konnte mit der ABC-Methode intrazytoplasmatisch im luminalen Kryptepithel
sowie in Rundzellen nachgewiesen werden (Abb. 25, 26).
Bei einem Tier konnte keinerlei positiver Nachweis für eine LI-Infektion geführt
werden (PCR, ELISA, IH). Fünf der Versuchstiere blieben bis zur Sektion negativ
(PCR, ELISA), den ersten positiven Nachweis stellte die immunhistologische
Untersuchung des Darmes bei der Sektion dar (Gruppe 1). Bei den Schweinen der
Gruppe 2, bei denen ein Abstand von 1-3 Wochen zwischen dem ersten positiven LINachweis (PCR, ELISA) und der Sektion lag, waren 19 von 22 Tieren in mindestens
einer der immunhistologisch untersuchten Lokalisationen positiv (81,8 %), bei drei
Tieren konnte LI weder im Darm noch in den Lymphknoten gefunden werden. War
der Abstand zwischen Infektionsnachweis und Sektion größer als drei Wochen
(Gruppe 3), konnte nur noch bei 11 von 23 Tieren (47,8 %) mindestens ein positiver
IH-Nachweis geführt werden, 12 von 23 Tieren blieben negativ bei der IHUntersuchung (Abb. 31).
94
Ergebnisse
20
18
16
Tiere (n)
14
12
10
8
6
4
2
0
IH erster Infektionsnachweis
(Gruppe 1, n = 5)
erster Infektionsnachweis 1-3
erster Infektionsnachweis >3
Wochen vor Sektion
Wochen vor Sektion
(Gruppe 2, n = 22)
(Gruppe 3, n = 23)
Abstand zwischen erstem pos Befund (PCR, ELISA, IH) und Sektion
Abbildung 31:
IH +
IH -
Immunhistologische Befunde der Untersuchung auf LI (IH
positiv (+) oder negativ (-)) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen
erstem Infektionsnachweis (PCR und/oder ELISA) und dem Zeitpunkt der
Sektion
Betrachtet man die Lokalisationen, an denen mittels IH LI nachgewiesen wurde, so
zeigt sich in Gruppe 1, dass LI bei allen 5 Schweinen im Ileum zu finden war,
während die übrigen Darmbereiche weniger häufig einen Nachweis erbrachten. Nur
ein Tier wies einen positiven Befund im Lymphknoten auf (Abb. 32, 33).
Bei kurz zurückliegendem Infektionszeitpunkt (Gruppe 2, n=22) wurde LI bei
insgesamt 19 Schweinen nachgewiesen. Der Erreger war bei der Mehrzahl der Tiere
in allen untersuchten Darmabschnitten zu beobachten (bei allen 19 im Darm als
positiv erkannten Tieren an der Papilla ilealis, jeweils bei 16 der Tiere im Ileum bzw.
im Caecum, bei 14 der Tiere im Colon ascendens). Bei 13 dieser Schweine befand
sich der Erreger gleichzeitig im Darm und in Lymphknoten. Nur bei einem Tier war LI
ausschließlich in einem Lymphknoten zu finden. Insgesamt waren die Lnn. ileocolici
bei 14 Tieren und die Lnn. jejunales bei 10 Tieren LI-positiv. Lediglich bei 3
Schweinen (13,6 %) konnte LI an keiner der untersuchten Lokalisationen gefunden
werden (Abb. 32, 33).
Bei schon länger zurückliegendem Infektionszeitpunkt (Gruppe 3, n=23) gelang bei
12 Tieren (52,2 %) kein LI-Nachweis. Bei dem überwiegenden Teil der als positiv
erkannten Tiere (n=11) war nur noch ein positiver Befund in einem Lymphknoten
95
Ergebnisse
nachzuweisen (n=7). Nur ein Tier wies LI sowohl im Darmbereich als auch in einem
Lymphknoten auf. Bei 3 Schweinen wurde LI lediglich im Darm gefunden (1x
gleichzeitig in Ileum und Caecum, 2x gleichzeitig in der Papilla ilealis und im Colon).
Bei den Lymphknoten waren hier acht Tiere in den Lnn. ileocolici und drei in den Lnn.
jejunales positiv (Abb. 32, 33).
14
kein Nachweis
12
10
Ausschließlich
Darm pos.
Tiere (n)
8
6
4
Darm und
Lymphknoten
pos.
2
0
kein
Infektionsnachweis
(n = 1)
IH erster
Infektionsnachweis
(Gruppe 1, n = 5)
erster
erster
Infektionsnachweis 1- Infektionsnachweis >3
3 Wochen vor Sektion Wochen vor Sektion
(Gruppe 2, n = 22) (Gruppe 3, n = 23)
nur
Lymphknoten
pos.
Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis
(PCR und / oder ELISA) und Sektion
Abbildung 32:
Vergleich
aller
immunhistologischen
Ergebnisse
in
Abhängigkeit von der untersuchten Lokalisation (Darm/Lymphknoten) und vom
zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA)
und der Sektion
96
Tiere (n)
Ergebnisse
Ileum
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Papila
ilealis
Caecum
Colon
kein Infektionsnachweis
(n=1)
Abbildung 33:
Abhängigkeit
IH erster
Infektionsnachweis
(Gruppe 1, n = 5)
erster
erster
Infektionsnachweis 1-3 Infektionsnachweis >3
Wochen vor Sektion
Wochen vor Sektion
(Gruppe
(Gruppe 3, n = 23)
(Gruppe 2,
2, Ileum,
Ileum,
Papillailealis
ilealis n = 22;
22;
Papilla
Caecum, Colon
Colonnn==21)
21)
Caecum,
Lnn.
ileocolici
Lnn.
jejunales
Vergleich der immunhistologisch positiven Ergebnisse in
von
den
einzelnen
untersuchten
Lokalisationen
(Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven
LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion
Aus Tab. 21 wird ersichtlich, dass bei den Tieren, die im Alter zwischen 8 und 13
Wochen zur Sektion gelangten, LI mittels IH fast immer nachgewiesen werden
konnte. Ab einem Alter von 14 Wochen nimmt die Nachweisrate deutlich ab, zum
letzten Untersuchungszeitpunkt in Woche 27 konnte bei keinem Tier mehr LI
gefunden werden.
97
Ergebnisse
Tabelle 21:
Ergebnis der immunhistologischen Untersuchungen von
Darm und Lymphknoten auf LI in Abhängigkeit vom Sektionszeitpunkt
Sektion in
8
9
10
11
12
13
14
15
16
27
Summe
Prozent
5
5
5
5
6
5
5
5
5
5
51
100
5
5
4
5
5
4
3
3
1
0
35
68,6
0
0
1
0
1
1
2
2
4
5
16
31,4
Lebenswoche
Anzahl
untersuchter
Tiere (n)
davon LIpositiv (n)
davon LInegativ (n)
Für die immunhistologische Untersuchung wurde auch eine semiquantitative
Befundung vorgenommen (IH-Score für einzelne untersuchte Lokalisationen, s. Tab.
9).
Wie
auch
bei
den
histologischen
Veränderungen
ergab
sich,
dass
das
Vorhandensein und die Menge des Erregers im Darm stark abhängig von dem
zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis und der Sektion war (r = 0,6878, p<0,001). Je länger der Infektionszeitpunkt zurücklag, desto geringer war die
Erregermenge, die in den einzelnen Darmabschnitten beobachtet werden konnte
(Abb. 35).
Bei dem Vergleich der einzelnen Darmlokalisationen wurde für die Gruppe 1
(Nachweis der LI-Infektion zeitgleich zur Sektion) und Gruppe 2 (Nachweis der LIInfektion 1-3 Wo vor Sektion) in allen untersuchten Bereichen ein deutlich höherer
Gehalt an LI gefunden (p<0,05) als in Gruppe 3 (Nachweis der LI-Infektion > 3 Wo
vor Sektion). Innerhalb der Gruppen konnte für die kontrollierten Lokalisationen zwar
tendenziell unterschiedlicher Erregergehalt beobachtet werden, diese Differenzen
waren jedoch statistisch nicht signifikant (Abb. 34).
Im
Gegensatz
zu
den
Darmlokalisationen
zeigten
die
untersuchten
Darmlymphknoten auch noch nach einem Zeitraum von mehr als drei Wochen
zwischen ersten positiven Nachweis und Sektion (Gruppe 3) ähnlich starke LI-
98
Ergebnisse
Konzentrationen wie die Schweine der Gruppe 2, die deutlich früher nach
Infektionsbeginn zur Sektion kamen (Abb. 34).
5,00
IH erster
Infektionsnachweis
(Gruppe 1, n = 5)
a
a
4,50
4,00
a
IH-Score
3,50
a
3,00
a
2,50
a
a
2,00
a
a
1,50
a
1,00
b
b
b
0,50
a
a
b
b
c
erster Infektionsnachweis
>3 Wochen vor Sektion
(Gruppe 3, n = 23)
Ln
.
Il e
oc
ol
ic
i
je
un
al
es
Ln
.
C
ol
on
C
ae
cu
m
Pa
pi
lla
ile
al
is
0,00
Il e
um
erster Infektionsnachweis
1-3 Wochen vor Sektion
(Gruppe2,2,Ileum,
Ileum, Papilla
(Gruppe
ilealis
n
=
22;
Papilla ilealis n Caecum,
= 22;
Colon n =Colon
21) n =21)
Caecum,
Darmabschnitt
Abbildung 34:
Vergleich
der
Häufigkeit
des
LI-Nachweises
mittels
Immunhistologie für die untersuchten Lokalisationen an Darm (max. IH-Score
pro Darmabschnitt: 6) und Lymphknoten (max. IH-Score pro Lnn.: 3) in
Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund
(PCR und/oder ELISA) und der Sektion (unterschiedliche Buchstaben
p<0,05)(Gruppe 2: Ileum, Papilla ilealis n = 22; Caecum, Colon n = 21).
Für die Korrelationsberechnung zwischen der Erregerhäufigkeit und dem zeitlichen
Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion wurde
sowohl
ein
Gesamtscore
für
alle
4
untersuchten
Darmabschnitte
ohne
Berücksichtigung der Lymphknotenbefunde (Gesamt-IH-Score max. 24) als auch mit
Berücksichtigung der Lymphknotenbefunde (Gesamt-IH-Score max. 30) erstellt (Abb.
35, 36). Dabei ließ sich jeweils eine hochsignifikante, negative Korrelation feststellen
(p<0,01), die bei Einbeziehung der Lymphknotenbefunde etwas schwächer ausfiel
als bei der Betrachtung der Darmbefunde allein (r= -0,6320 bzw. r= -0,6878).
99
Ergebnisse
Für die Tiere aus der Gruppe 2 wurde außerdem der LI-Befall der einzelnen
Darmabschnitte für die einzelnen Zeitabschnitte (Woche 1-3 nach erstem
Infektionsnachweis) betrachtet (Tab. 23). Dabei ist zu erkennen, dass schon in der
ersten Woche LI in allen untersuchten Darmabschnitten zu finden ist, wobei das
Caecum einen etwas geringeren Befall aufwies. LI war sowohl in Kryptzellen als
auch in Rundzellen zu beobachten. Zur dritten Woche nahm der LI-Gehalt in allen
Lokalisationen tendenziell ab. Die Unterschiede zwischen den Untersuchungs-
IH-Score aller Darmabschnitte ohne
Lymphknoten
zeitpunkten bzw. Lokalisationen waren jedoch nicht signifikant (p>0,05)
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
Wochen zwischen erstem Infektionsnachweis und Sektion
Abbildung 35:
Korrelation zwischen der semiquantitaiven Bestimmung des
LI Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen (Gesamt-IH-Score max. 24)
und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA)
und der Sektion (n = 45, y = -1,2522x + 9,5387; r = -0,6878, p>0,001)
100
IH-Score aller Darmabschnitte und
Lymphknoten
Ergebnisse
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
Wochen zwischen erstem Infektionsnachweis und Sektion
Abbildung 36:
Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung
des LI-Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen sowie in den
untersuchten Lymphknoten (Gesamt-IH-Score max. 30) und dem zeitlichen
Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion
(n = 45, y = -1,3888x + 11,225; r = -0,6320, p<0,001)
Tabelle 22:
Durchschnittliche IH-Scores (x+s) für die untersuchten
Darmabschnitte in Gruppe 2 unter Berücksichtigung des zeitlichen Abstands
zwischen
erstem
Infektionsnachweis
(PCR/ELISA)
und
Sektion
(unterschiedliche Buchstaben p<0,05)
Wochen zwischen erstem Infektionsnachweis und Sektion
Lokalisation
Krypten
Ileum
Rundzellen
Krypten
Papilla ilealis Rundzellen
Krypten
Caecum
Rundzellen
Krypten
Colon
Rundzellen
Tiere (n)
x±s
x±s
x±s
x±s
x±s
x±s
x±s
x±s
1
2
3
1,6 ± 1,52 a
1,44 ± 1,19 a
1,4 ± 1,24 a
1 ± 0,58 a
0,46 ± 0,57 a
0,76 ± 0,36 a
1,32 ± 1,24 a
0,8 ± 0,68 a
5
0,95 ± 1,08 a
1,63 ± 1,18 a
1,5 ± 1,12 a
1,48 ± 0,79 a
0,58 ± 0,91 a
0,75 ± 0,81 a
0,95 ± 1,25 a
1,05 ± 1,01 a
8
0,69 ± 1,01 a
0,78 ± 0,94 a
0,76 ± 0,61 a
0,76 ± 0,61 a
0,53 ± 0,95 a
0,53 ± 0,62 a
0,38 ± 0,57 a
0,49 ± 0,60 a
9
Signifikante positive Korrelationen zwischen dem Ausmaß der histologischen
Veränderungen (Histologie-Score) und der Häufigkeit des Erregers (IH-Score) in den
101
Ergebnisse
jeweiligen Darmabschnitten konnten nur für die Gruppe 2 nachgewiesen werden
(p<0,001). In den Gruppen 1 und 3 bestand dieser Zusammenhang nicht (Tab. 23).
Tabelle 23:
Korrelationen
zwischen
Histologie-Score
und
Immunhistologie-Score für die 4 untersuchten Darmabschnitte innerhalb der
Gruppen 1-3 (r= Spearman´s Rang Korrelationskoeffizient, Gruppe 2: Ileum,
Papilla ilealis n=22, Caecum, Colon ascendens n=21)
Gruppe 1 (n=5) Gruppe 2 (n=21/22) Gruppe 3 (n=23)
r
p-Wert
r
p-Wert
r
p-Wert
Ileum
0,6669 0,2189
0,7932
<0,0001
-0,1788
0,4145
Papilla ilealis
0,9167 0,0285
0,6761
0,0006
0,3807
0,0731
Caecum
0,5000 0,3910
0,7533
<0,0001
0,1839
0,4008
Colon ascendens 0,7632 0,1333
0,8583
<0,0001
0,0797
0,7177
4.4
Verdaulichkeitsanalyse
In Tabelle 24 sind die ermittelten präzäkalen Verdaulichkeiten für die verschiedenen
untersuchten Parameter dargestellt. Dabei wird wiederum zwischen den frisch
infizierten Tieren (Gruppe 2, Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor Sektion) und den
Tieren, bei denen der Infektionszeitpunkt schon länger zurücklag (Gruppe 3,
Nachweis der LI-Infektion > 3 Wochen vor Sektion) verglichen. Vergleichsweise
werden die Werte für das LI-negative Tier mit angeführt.
Statistische Unterschiede hinsichtlich der präzäkalen Verdaulichkeit bestanden nur
für das Rohprotein, das für die Gruppe 2 eine höhere Verdaulichkeit aufwies
(p<0,05), und für das Kalzium, bei dem in der Gruppe 2 eine geringere Verdaulichkeit
als in Gruppe 3 vorlag (p<0,05).
102
Ergebnisse
Tabelle 24:
Präzäkale
Verdaulichkeiten
für
verschiedene
Futterparameter bei einem LI-negativen Tier sowie Gruppe 2 (Nachweis der LIInfektion 1-3 Wo vor Sektion) und Gruppe 3 (Nachweis der LI-Infektion > 3 Wo
vor Sektion) im Vergleich (unterschiedliche Buchstaben p<0,05).
LI
Präzäkale
Nachweis der LI-
negatives Infektion 1-3 Wo vor
Verdaulichkeit
Nachweis der LIInfektion > 3 Wo vor
Tier
Sektion (Gr. 2)
Sektion (Gr. 3)
x+s
68
56,79+10,14a
47,73+16,80a
n
1
19
15
x+s
73
49,37+29,16a
19,67+40,80b
n
1
19
15
x+s
48
40,59+27,71a
37,58+27,12a
n
1
17
12
65
52,32+12,54a
36,20+23,44a
n
1
19
15
x+s
73
62,89+17,06a
79,00+14,32b
n
1
19
15
x+s
47
41,21+18,37a
48,40+18,00a
n
1
19
15
Organische
Substanz (%)
Rohprotein (%)
Rohfett (%)
Bruttoenergie (%) x+s
Ca (%)
P (%)
103
Diskussion
5
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit sollten zeitliche Zusammenhänge zwischen fäkaler
Erregerausscheidung,
klinischen
und
pathologischen
Symptomen
und
der
Serokonversion im Fall einer subklinischen LI-Infektion untersucht werden.
Zu diesem Zweck wurde eine Gruppe von 60 gleichaltrigen Tieren in einem Betrieb,
in
welchem
vorberichtlich
eine
subklinische
Infektion
mit
LI
vorlag,
als
Versuchsgruppe zusammengestellt, um den Verlauf der Infektion näher zu
beschreiben.
Diese
Tiere
wurden
gemäß
einem
Probenplan
wöchentlich
untersucht.
Versuchsbeginn war die 6. Lebenswoche der Tiere. Im Rahmen der wöchentlichen
Untersuchungstermine wurden Blutproben zur serologischen Diagnostik und
Kotproben zum PCR Nachweis entnommen. Zusätzlich wurde die Gewichtszunahme
der Tiere erfasst (Tab. 6).
Zwischen der 8. und 16. Lebenswoche und zur 27. Woche wurden wöchentlich fünf
Tiere seziert. Nach makroskopischer Untersuchung wurden Proben gemäß Tabelle 7
entnommen und in Formalin fixiert. Diese Proben wurden nach Hämatoxilin-EosinFärbung und nach immunhistologischer Färbung histologisch untersucht.
5.1
Klinische Befunde
Bei dem Infektionsgeschehen im Versuchsbetrieb handelte es sich eindeutig um
einen subklinischen Verlauf der porzinen proliferativen Enteropathie (PPE).
Kurzzeitiger wässriger Durchfall trat nur bei einem von 60 Tieren auf, eine
Beteiligung einer E.-coli-Infektion bei diesem Tier kann nicht ausgeschlossen
werden.
Bei
sieben
Schweinen
konnte
lediglich
an
ein
oder
zwei
Untersuchungszeitpunkten dünnbreiiger Kotabsatz beobachtet werden (Tab. 13).
Die klinische Beurteilung der Kotkonsistenz erfolgte gemäß einer Score-Einteilung
von null bis drei. Die subjektive Beurteilung der Kotkonsistenz macht eine
Vergleichbarkeit mit Scores anderer Arbeitsgruppen schwierig (KYRIAKIS et al.
2002a; KYRIAKIS et al. 2002b; KROLL et al. 2004a; ALEXOPOULOS et al. 2006).
Eine objektive Vergleichbarkeit für die Bewertung der Kotkonsistenz hinsichtlich
104
Diskussion
eines
Durchfallgeschehens
kann
nur
erreicht
werden,
wenn
eine
Trockensubstanzbestimmung vorgenommen wird.
5.2
Erregerausscheidung und Serologie
Der direkte oder indirekte Erregernachweis gilt als beweisend für eine Infektion mit
dem
Erreger.
Um
einen
Zusammenhang
zu
möglichen
klinischen
Krankheitssymptomen der PPE belegen zu können, sollten darüber hinaus weitere
pathomorphologische und pathohistologische Untersuchungen durchgeführt werden
(MCORIST u. GEBHART 1999; LAWSON u. GEBHART 2000; KROLL et al. 2005b;
JENSEN et al. 2006b)
Die Versuchsgruppe wurde nach dem Absetzen in einen Flatdeck-Stall verbracht und
in Boxen zu jeweils zehn Tieren aufgeteilt. Neben den Versuchstieren waren in
diesem Stallabteil vier Boxen mit gegen LI geimpften (Enterisol®ileitis, Boehringer
Ingelheim, Ingelheim) Altersgenossen besetzt (Abb. 4). Die Infektionsrate der
Versuchstiere, die am Ende der Flatdeckphase bei 70 % lag, wurde durch die
Anwesenheit der geimpften Tiere nicht wesentlich beeinflusst. Eine Auswirkung auf
den klinischen Krankheitsverlauf bei den Versuchstieren durch eine Senkung des
Erregerdruckes im Stall infolge der Impfung der Stallgenossen kann nicht
ausgeschlossen werden (KROLL et al. 2004a). Auch ein Einfluss durch die
Entfernung von Erregerausscheidenden Versuchstieren zu den wöchentlichen
Sektionen ist möglich.
Die 6. Lebenswoche wurde als Beginn der Untersuchungen gewählt. Es zeigte sich,
dass bereits zu diesem Zeitpunkt die ersten Tiere LI ausschieden (n=3, Abb. 7). Um
zu belegen, dass die Ferkel eventuell bereits im Abferkelbereich infiziert wurden,
hätte eine Untersuchung direkt beim Absetzen erfolgen müssen. Aufgrund einer im
Vorfeld des
Versuches
im Betrieb abgelaufenen
serologischen Screening-
Untersuchung wurde jedoch mit einem solch frühen Infektionszeitpunkt nicht
gerechnet.
Ein erstes Antikörper-positives Tier wurde ebenfalls in der 6. Lebenswoche
nachgewiesen (Abb. 11). KNITTEL et al. (1998) konnten maternale Antikörper bis zur
6. Lebenswoche nachweisen. Im vorliegenden Fall spricht jedoch der positive
Antikörpertiter, der fortlaufend bis zur 12. Lebenswoche anhielt, für eine frühe
105
Diskussion
Infektion des Tieres. Um den Titerverlauf der maternalen Antikörper darstellen zu
können, hätte als Studienbeginn der Zeitpunkt der Geburt gewählt werden müssen.
Als Infektionsquelle für die Absetzferkel kommen die Muttersauen, ältere Aufzuchtund
Mastschweine
im
Betrieb,
eventuell
kontaminierte
Stalleinrichtungen,
Arbeitsgeräte sowie Schadnager in Frage (COLLINS et al. 2000a; GUEDES 2004;
MAUCH u. BILKEI 2004; CESAR et al. 2005).
Trotz der räumlichen Trennung in Gruppen zu jeweils zehn Tieren zu Beginn der
Studie breitete sich die Infektion zeitversetzt in allen Buchten aus. Die Infektionsrate
am Ende der Flatdeckphase in der 10.Woche lag zwischen 30 und 90 % pro Bucht
(Abb. 5, 6).
Nach den Ergebnissen von BRONSVOORT et al. (2001) sowie BARNA und BILKEI
(2003)
hatte
die
Parität
der
Sauen
einen
deutlichen
Einfluss
auf
das
Infektionsgeschehen bei den Nachkommen. In dieser Studie blieben das Alter der
Sauen und die Anzahl ihrer Würfe unberücksichtigt. Eine mögliche Einflussnahme
konnte in dieser Studie nicht geprüft werden.
Werden die Ergebnisse aller Untersuchungsmethoden zum direkten und indirekten
Nachweis der LI-Infektion gemeinsam betrachtet, so kann damit belegt werden, dass
sich bis auf ein Tier alle Versuchstiere mit dem Erreger infizierten (Tab. 16 und 17).
Dieses Tier wurde jedoch bereits in der 10. Lebenswoche seziert. Da noch deutlich
später Erstinfektionen nachgewiesen wurden (Abb. 7, 11), wäre bei diesem Tier eine
Infektion noch zu einem späteren Zeitpunkt möglich gewesen. Diese hohe
Durchseuchungsrate entstand trotz der Entfernung Erregerausscheidender Tiere
durch die wöchentliche Sektion.
Die Nachweisrate bei den einzelnen diagnostischen Verfahren war jedoch
unterschiedlich hoch. Bei der Untersuchung auf eine fäkale Ausscheidung wurden
nur 65 % der Versuchstiere als LI-positiv erkannt, während eine Serokonverversion
bei 81,7% der Tiere nachgewiesen werden konnte (Tab. 14). Mittels Immunhistologie
konnte der Erreger bei 68,6 % der sezierten Tiere entdeckt werden (Tab. 21). Dabei
müssen jedoch die unterschiedlichen Sektionszeitpunkte berücksichtigt werden, zu
denen im Einzelfall auch Tiere herangezogen wurden, bei denen entweder noch kein
Infektionsnachweis vorlag oder bei denen die Infektion schon abgeklungen war.
106
Diskussion
Ähnliche Nachweisraten zeigte eine Verlaufsstudie aus Dänemark. Hier konnte unter
den Bedingungen einer natürlichen Infektion der Erreger während Aufzucht und Mast
bei 57 % der Schweine (n=30) im Kot gefunden werden, eine Serokonversion am
Ende der Mast wiesen dagegen 90 % der Tiere auf. Mittels Immunhistologie konnte
LI zur Schlachtung nur im Darm von 30 % der Tiere nachgewiesen werden (JENSEN
et al. 2005).
Ein erstmalig positiver PCR Befund konnte bei den hier untersuchten Schweinen am
häufigsten zur 9. und 10. Lebenswoche gefunden werden und weist hier
übereinstimmend mit den zumeist bis zur 12. Woche erfolgten Serokonversionen auf
das
Hauptinfektionsgeschehen
hin.
Nach
der
13.
Woche
wurden
keine
Neuausscheider mehr gefunden, nach der 14. Lebenswoche konnte bei keinem Tier
ein positiver PCR Befund im Kot geführt werden.
Die PCR Nachweise im Kot waren zumeist nur auf ein kurzes Zeitfenster von ein bis
zwei Wochen beschränkt. In dem vorliegenden Versuch schieden 31 von 39 Tieren
LI für diesen Zeitraum fäkal aus. Nur bei acht Tieren wurde eine länger andauernde
Erregerausscheidung festgestellt (Abb. 8). Hier muss allerdings berücksichtigt
werden, dass bei einigen Tieren eine möglicherweise länger andauernde
Erregerausscheidung durch die Sektion der Tiere unterbrochen wurde.
Die bei der PCR im Vergleich zur Serologie geringere Nachweisrate für eine Infektion
könnte im Zusammenhang mit dem subklinischen Verlauf stehen. Für eine latente
Infektion sind geringere Erregermengen notwendig als für einen klinischen Verlauf
(GUEDES 2004). Im Falle einer subklinischen LI-Infektion besteht deshalb die
Möglichkeit, dass die Erregerzahl aufgrund einer schwachen Darmbesiedelung
unterhalb der Nachweisgrenze für die verwendete PCR liegen kann. Eine nestedPCR mit höherer Sensitivität wäre in diesem Falle zu empfehlen (JONES 1993a,
NATHUES
2007).
Darüber
hinaus
muss
eine
mögliche
intermittierende
Erregerausscheidung berücksichtigt werden. Bei kürzeren Untersuchungsintervallen
wäre möglicherweise die Anzahl der PCR-positiven Tiere höher gewesen.
Das Maximum der PCR Nachweise lag zwischen der 9. und 13. Lebenswoche. In
diesem Zeitraum zeigten zwischen 22 und 27 % der Tiere einen LI spezifischen PCR
Befund (Abb. 9). Da zu keinem Zeitpunkt mehr als ein Drittel der gesamten Gruppe
PCR positiv war, ist es ratsam, bei der Bestandsdiagnostik stets eine dieser
Prävalenz angemessene Anzahl an Proben zu untersuchen. Der notwendige
Stichprobenumfang richtet sich dabei nach der vermuteten Prävalenz, der
107
Diskussion
Gruppengröße und der Sicherheit, mit der bei mindestens einem Tier der Erreger
nachgewiesen respektive für die Gruppe eine wahre Prävalenz ermittelt werden soll.
Nach CANNON und ROE (1982) wären zum Nachweis der Infektion bei einer
geschätzten Prävalenz von 30 % und einer Sicherheit von 95 % bei einer Gruppe
von zehn Tieren sechs Proben erforderlich, ab 100 Tieren müssten neun Proben
entnommen werden.
Die serologische Untersuchung lieferte in dieser Studie zwar häufiger einen
Nachweis für die LI-Infektion als der PCR Nachweis im Kot, jedoch konnte bei zehn
Tieren eine Infektion mittels PCR und/oder IH nachgewiesen werden, ohne dass eine
Antikörperbildung vorlag. Bei diesen kann davon ausgegangen werden, dass
entweder die Sektion kurz nach erfolgter Infektion stattfand und damit keine
messbare Immunreaktion mehr stattfinden konnte, oder die Erregerdosis nicht
ausreichte, um eine nachweisbare humorale Immunantwort zu erzeugen (GUEDES
et al. 2002a).
Der Schwerpunkt der Serokonversionen lag zwischen der 8. und 11. Lebenswoche
der Tiere. Es konnte bereits zur 10. Lebenswoche bei mehr als der Hälfte der Tiere
(57 %), bzw. zur 11. Lebenswoche bei 68 % eine Serokonversion nachgewiesen
werden (Tab. 17). Die letzte nachweisbare Serokonversion wurde in der 26.
Lebenswoche beobachtet (Tab. 17). Darüber, ob das Tier schon früher unentdeckt
infiziert war, kann nur spekuliert werden da dieses Tier (Nr. 51, Tab. 25) geschlachtet
und nicht seziert wurde. In diesem Fall kam es zumindest nicht zur Ausbildung einer
porzinen hämorrhagischen Enteritis (PHE), die oft bei noch nicht immunen
Endmastschweinen oder Jungsauen auftritt (MCORIST u. GEBHART 1999).
Wird der Anteil seropositiver Tiere zu den einzelnen Untersuchungszeitpunkten
betrachtet, zeigt sich zur 11. Lebenswoche mit 72 % der höchste Anteil an
seropositiven Schweinen (Abb. 12). Mit zunehmendem Alter der Tiere sank der
Prozentsatz jedoch kontinuierlich ab. Zum Mastende waren noch 31 % der zu
diesem Zeitpunkt untersuchten Schweine seropositiv, bei einer Reihe von weiteren
Tieren lagen nur noch fragliche Titer vor. Gründe für das Absinken der Titer bei der
Mehrzahl der Tiere bis zum Schlachtzeitpunkt könnten die schon sehr frühzeitig
erfolgte LI-Infektion sowie der latente Infektionsverlauf mit vermutlich schwächeren
Immunreaktionen sein (JENSEN et al. 2005). Auch die Entfernung LI infizierter Tiere,
108
Diskussion
könnte einen Einfluss gehabt haben. GUEDES et al. (2002a) fanden mittels IPMA
positive Antikörpertiter über einen Zeitraum von 3 bis 13 Wochen p.i. in Abhängigkeit
vom Verlauf und der Schwere der Erkrankung. Serumtiter fielen nach Erreichen des
Peaks kontinuierlich ab, je höher der Peak, desto länger waren Antikörper
nachweisbar (GUEDES 2004).
Die Serokonversion konnte bei einem Großteil der Tiere gleichzeitig mit der ersten
feststellbaren Erregerausscheidung bzw. eine Woche später ermittelt werden (Abb.
14). In experimentellen sowie in Feldstudien wurde gezeigt, dass die Tiere schon ein
bis zwei Wochen, bevor sie serokonvertierten, den Erreger ausschieden (GUEDES
et al. 2002b; GUEDES u. GEBHART 2003b). Berücksichtigt man den wöchentlichen
Abstand bei der Beprobung, so passt der Befund ins Bild. Eventuell konnte jedoch
auch eine frühere Erregerausscheidung aufgrund eines zunächst zu geringen
Keimgehaltes im Kot nicht registriert werden. Nach JENSEN et al. (2005) kann
zwischen Erregerausscheidung und Serokonversion sogar ein Zeitraum von zwei bis
sechs Wochen liegen.
5.3
Makroskopische Untersuchungen
Während der Sektion wurden alle Därme der Sektionstiere einer eingehenden
makroskopischen
Untersuchung
unterzogen.
Nach
der
makroskopischen
Untersuchung wurden Teile des Darms an festgelegten Lokalisationen aus Jejunum,
Ileum, Caecum, Colon ascendens und Colon descendens entnommen. Zusätzlich zu
den festgelegten Lokalisationen wurden in Ileum, Caecum und Colon noch frei
wählbare Lokalisationen, welche aufgrund möglichst ausgeprägter makroskopischer
Veränderungen gewählt werden sollten, beprobt.
Nur in einem Fall (Tiernummer 49, Tab. 25) konnten deutliche makroskopische
Veränderungen, die auf eine PPE hinwiesen, festgestellt werden. Bei diesem
Schwein zeigte sich eine nekrotisierende Enteritis mit fibrinösen Auflagerungen und
Ulzerationen, die sich vom Ende des Jejunums über das Caecum bis zu einem Meter
ins Colon ascendens erstreckte. Diese makroskopischen Befunde ließen sich
histologisch bestätigen (Abb. 22). Dies Tier wurde in der 8. Lebenswoche seziert. Es
war über einen Zeitraum von drei Wochen PCR-positiv und zeigte erst zum Zeitpunkt
109
Diskussion
der Sektion eine Serokonversion. Bei diesem Tier handelte es sich um das einzige
Tier mit einem deutlichen Durchfallgeschehen.
Bei den übrigen Tieren war der Darm in der Regel pathomorphologisch wenig
auffällig. Durch die makroskopische Auswahl von Darmlokalisationen konnte die
Trefferquote für histologisch nachweisbare proliferative Veränderungen nicht erhöht
werden. Eine deutliche Faltenbildung mit Verdickung der Darmwand, die als ein
typisches Bild für die intestinale Adenomatose beschrieben wird (SMITH u. LAWSON
2001), wurde zwar häufiger beobachtet, stellte sich aber oft als postmortale
Kontraktion des frischen Sektionsgutes dar, ohne dass histologisch proliferative
Veränderungen gefunden wurden (vgl. Abb. 16 und 17). Ein Vergleich zwischen den
im Vorfeld festgelegten Lokalisationen und den nach augenscheinlicher Betrachtung
ausgewählten
Darmproben
Darmabschnitte
zeigte
durchgehend
hohe
für
die
histologische
positive
Korrelationen
Beurteilung
zwischen
der
diesen
Lokalisationen (Tab. 19). Hieraus wird ersichtlich, dass allein nach makroskopischer
Betrachtung PPE-typische Darmveränderungen besonders bei subklinischem
Krankheitsverlauf nicht sicher erkannt werden können. Dieser Sachverhalt wurde
bereits in der Literatur beschrieben. Verschiedene Autoren stellten eine Sensitivität
und Spezifität makroskopischer Läsionen von 67 % bzw. 50 % fest und halten es für
unbedingt notwendig, eine makroskopische Untersuchung des Darms immer durch
weitere diagnostische Methoden abzusichern (HOLYOAKE et al. 1994; HUERTA et
al. 2003).
5.4
Trotz
Histologische Befunde
des
größtenteils
Versuchstieren,
zeigten
subklinischen
sich
bei
Verlaufes
27
der
Schweinen
LI-Infektion
in
bei
Abhängigkeit
den
vom
Sektionszeitpunkt deutliche mikroskopische Veränderungen der Darmschleimhaut im
Sinne einer porzinen intestinalen Adenomatose. In allen Fällen waren proliferative
Veränderungen des Kryptepithels bei gleichzeitiger Verminderung der Anzahl von
Becherzellen zu erkennen. In Abhängigkeit der Ausprägung und der Fläche, über die
sich die proliferativen Veränderungen erstreckten, kam es zu Verkürzungen der
Darmzotten.
In
einzelnen
Fällen
(n=5)
waren
darüber
hinaus
ulzerative
110
Diskussion
Veränderungen, z.T. auch mit fibrinösem Charakter, ohne Erhalt der Zottenstruktur
zu beobachten (Tab. 20). Bemerkenswerterweise konnte aber trotz dieser teils
ausgeprägten histologischen Veränderungen des Darmepithels nur bei einem Tier
ein deutliches Durchfallgeschehen beobachtet werden. Bei diesem Tier lag allerdings
eine Mischinfektion mit einem pathogenen E.-coli-Stamm vor. Die eigenen Fälle mit
fibrinös-ulzerativen Schleimhautveränderungen lassen sich von PCV2-assoziierten
Enteritiden, die makroskopisch ein gleiches Bild zeigen, unterscheiden, da zusätzlich
eine Proliferation der Kryptenterozyten vorlag, dagegen aber keine Histiozytose
(JENSEN et al. 2006b). Weitere bakterielle Infektionen (Brachyspira hyodysenteriae,
Brachyspira
piloscoli,
Salmonella
sp.,
Clostridium
perfringens)
konnten
differentialdiagnostisch durch mikrobiologische Untersuchungen ausgeschlossen
werden.
Als
Kontrollgruppe
mussten
versuchsexterne
gesunde
Läuferschweine
zum
Vergleich der histologischen Befunde herangezogen werden. Im Vergleich zwischen
Kontrollen und Versuchstieren zeigte sich erwartungsgemäß, dass einige der
histologischen
Veränderungen
nicht
ausschließlich
auf
eine
LI-Infektion
zurückzuführen waren. Als unspezifische Reaktionen müssen Kryptabszesse,
Gefäßstauungen und Entzündungszellinfiltration gewertet werden. Diese Parameter
ließen sich in dieser Studie sowohl in Fällen einer subklinischen PPE als auch
vereinzelt bei den Kontrolltieren finden. In der Negativ-Kontrollgruppe wurde ein
mittlerer Score-Wert für die histologischen Veränderungen von 0,28 gemessen,
jedoch ein signifikanter Unterschied zu den anderen Gruppen der mit LI-infizierten
Tieren festgestellt. Das einzelne LI-negative Versuchstier hatte einen Score-Wert von
6,4 (Abb. 28, Tiernummer 31, Tab. 20, 25).
Histologische Befunde im Sinne einer Muskelhypertrophie, welche auf eine chronisch
verlaufende regionale Ileitis hinweisen würde, oder auch Hämorrhagien, die auf eine
porzine hämorrhagische Enteropathie gedeutet hätten, wurden nicht gefunden.
Die histologische Untersuchung zeigte deutlich einen Zusammenhang zwischen der
Infektionsdauer und dem Ausmaß der histologischen Veränderungen. Dabei wurde
die Infektionsdauer näherungsweise als Zeitraum zwischen dem ersten direkten
und/oder indirekten LI-Nachweis und dem Sektionszeitpunkt definiert. Es muss dabei
berücksichtigt werden, dass aufgrund der Zeitspanne zwischen Infektionszeitpunkt
und
erster
Ausscheidung
im
Kot
und
aufgrund
des
wöchentlichen
111
Diskussion
Untersuchungsintervalls der tatsächliche Infektionszeitpunkt wahrscheinlich einige
Tage früher gelegen haben dürfte. Je dichter der erste Infektionsnachweis und die
Sektion zeitlich zusammen lagen, umso deutlicher waren die histologischen
Veränderungen ausgeprägt (Abb. 29). Der Zeitraum, in dem sich die stärksten
histologischen Veränderungen zeigten, lag zwischen einer und drei Wochen nach
erstem Infektionsnachweis (Gruppe 2). Lag der erste Infektionsnachweis länger als
drei Wochen zurück (Gruppe 3), zeigten sich nur noch in wenigen Fällen Anzeichen
proliferativer Veränderungen, und dann mit geringradigem Ausmaß. Hier wurden als
Veränderungen zumeist gestaute Gefäße und Kryptabszesse gefunden, welche auch
bei den Kontrolltieren zu finden waren. In dieser Gruppe waren weiterhin auf eine
Erneuerung des Darmepithels hinweisende Befunde wie Becherzellhyperplasien und
apoptotische Körperchen in normalen Krypten zu finden. Insgesamt wurden die
Befunde dieser Gruppe als in Abheilung befindliche oder abgeheilte Stadien bewertet
(vgl. Abb. 23 und 24). Diese Histologischen Auffälligkeiten wurden in der
Vorliegenden Untersuchung nicht gesondert beurteilt.
Der zeitliche Zusammenhang zwischen Infektionszeitpunkt und Ausprägung der
pathologischen Veränderungen entspricht Ergebnissen aus der Literatur. GUEDES
und GEBHART (2004) konnten belegen, dass 11 Tage nach experimenteller LIInfektion
erste
makroskopische
und
histologische
Veränderungen
(Epithelhyperplasie, Becherzellreduktion) auftraten. Spätestens nach 5 Wochen
waren keine Läsionen am Darm mehr feststellbar.
SMITH und MCORIST (1997) fanden drei Wochen nach Challenge-Infektion Befunde
am Darm, die sie als abheilende Läsionen interpretierten (durch unreife Enterozyten
verlängerte Krypten, Becherzellen an der Basis der Krypten). JENSEN et al. (2005)
konnten bei Schweinen, die 2-6 Wochen nach letzter Erregerausscheidung
geschlachtet wurden, keine für LI spezifische pathologischen Veränderungen mehr
auffinden. MCORIST et al. (1996) und MCINTYRE et al. (2003) beschrieben, dass
sieben bis neun Wochen nach LI-Infektion die Darmmukosa sich in einem Stadium
der Regeneration befand. Die von den Autoren beschriebenen Befunde (blasse
geschwollene
und
geschrumpfete
degenerierte
Epithelzellen,
apoptotische
Körperchen und Becherzellhyperplasie) konnten auch in den eigenen Versuchen
beobachtet werden. Es handelte sich dabei um Schweine, bei denen der
Infektionsbeginn schon länger zurücklag, so dass die Befunde als Hinweis auf eine
Regeneration
der
Darmschleimhaut
gewertet
werden
können.
Inwieweit
112
Diskussion
immunologische Reaktionen aufgetreten sind, ohne nenneswerte pathologische
Veränderungen zu erzeugen konnte hier nicht geklärt werden.
Die Korrelation zwischen der Dauer der Infektion und den histologischen
Veränderungen (Abb. 29) belegt das rasche Auftreten von PPE-typischen
Veränderungen sowie die schnelle Regenerationsfähigkeit der Darmschleimhaut bei
unkompliziertem Verlauf der Infektion.
Auch
die
histologischen
Untersuchungen
unterstreichen,
dass
das
Infektionsgeschehen bei den Versuchstieren mit der 14. Lebenswoche weitgehend
abgeschlossen war. Während vor diesem Zeitpunkt bei etwa 77 % der sezierten
Tiere PPE-typische proliferative Veränderungen diagnostiziert wurden, gelang dies
danach nur noch bei einem sezierten Tier. Die histologischen Befunde dieser Tiere
schwankten
stark
in
ihrer
Ausprägung.
Eine
zum
Zeitpunkt
der
Sektion
nachgewiesene Erregerausscheidung über den Kot korrelierte stark mit typischen
histologischen Befunden. Bei 19 zur Sektion PCR-positiven Tieren konnte in 17
Fällen histologisch eine Proliferation der Enterozyten festgestellt werden. In 17 der
Fälle konnte auch immunhistologisch ein Infektionsnachweis geführt werden.
Aus den histologischen Befunden kann geschlossen werden, dass auch im Falle
eines subklinischen Infektionsverlaufes in der Regel eine Schädigung der
Darmschleimhaut vorliegt. Es war jedoch nicht möglich, einen Zusammenhang
zwischen der serologisch ermittelten Titerhöhe und den histologischen Befunden
herzustellen.
GUEDES u. GEBHART (2004) beschreiben nach einer experimentellen Infektion
eine Ausbreitung des Erregers vom Ileum als Prädilektionsstelle zu den kaudaler
gelegenen Darmabschnitten bis ins Rektum. Während 29 Tage p.i. noch
histologische Veränderungen im Dickdarm vorlagen, waren im Dünndarm keine
Läsionen mehr vorhanden. Eine solche Ausbreitung konnte anhand der eigenen
Untersuchungen nicht nachvollzogen werden. Häufig waren schon kurz nach erstem
positivem PCR Nachweis wie auch zu späteren Untersuchungszeitpunkten
unterschiedliche Dünn- und Dickdarmabschnitte gleichzeitig betroffen (Tab. 20, Abb.
30 und 33).
113
Diskussion
5.5
Immunhistologische Untersuchung
Durch die Immunhistologie war es möglich, in fünf Fällen, in welchen weder PCR
noch ELISA einen positiven Nachweis erbrachten, eine LI-Infektion zu bestätigen
(Tab. 15). Aufgrund des fehlenden Infektionsnachweises am lebenden Tier konnte
allerdings der Infektionszeitpunkt nicht näher bestimmt werden (Gruppe 1).
Parallel zu den histologischen Veränderungen zeigte es sich, dass der Erreger in den
ersten 3 Wochen nach Infektionsnachweis bei dem Großteil der Tiere (82 %) in der
Darmschleimhaut
des
Ileums
und
der
untersuchten
Dickdarmabschnitte
immunhistologisch zu finden war, und zwar im apikalen Zytoplasma des
Kryptepithels und in mononukleären Zellen. Häufig wurde der Erreger auch
gleichzeitig in den Darmlymphknoten beobachtet (Gruppe 2) (Abb. 32). Zu späteren
Untersuchungszeitpunkten
war
LI
trotz
der
weitgehend
abgeklungenen
histologischen Veränderungen immerhin noch bei 48 % der Schweine detektierbar,
befand sich jedoch nur noch selten in der Darmschleimhaut, sondern zumeist in
mononukleären Zellen der regionalen Darmlymphknoten (Gruppe 3) (Abb. 32 und
32).
In Gruppe 2 war eine gleichmäßige Verteilung der Lawsonien über die untersuchten
Darmabschnitte zu erkennen. Die Schwere der histologischen Veränderungen war
eng mit der dort vorgefundenen, semiquantitativ ermittelten Erregermenge
(IH-
Score) korreliert. In der Gruppe 3 war eine solche Korrelation nicht mehr zu ermitteln
(Tab. 22, 23). Während die Darmschleimhaut wieder weitgehend frei von LIspezifischem Antigen war, fanden sich immer noch Lawsonien, jedoch bevorzugt in
den Lymphknoten (Abb. 32, 33).
Rekonvaleszenzstadien, in welchen LI ausschließlich in mononukleären Zellen im
Darmepithel zu finden ist, wie von GUEDES et. al. (2002) beschrieben, zeigten sich
nur in wenigen Fällen (n = 3).
Anhand der IH-Befunde zu den Sektionszeitpunkten konnte gezeigt werden, dass der
Anteil LI-positiver Tiere nach der 14. Lebenswoche kontinuierlich abnahm, zum
letzten Untersuchungszeitpunkt kurz vor der Schlachtung (27. LW) konnte bei
keinem der fünf untersuchten Schweine noch LI mittels der IH nachgewiesen
werden.
114
Diskussion
5.6
Mastleistung und präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen
Eine LI-bedingte schlechtere Gewichtsentwicklung der Tiere war in den ersten vier
Wochen der Beobachtungszeit tendenziell vorhanden. Im Mittel war die tägliche
Zunahme von der 4. bis zur 8. Lebenswoche für die bis zu diesem Zeitpunkt
infizierten Tiere im Vergleich zu den nicht infizierten Tieren um 50 g geringer (344 g
±92 vs. 394 g ±85; Tab. 18). Aufgrund der starken Streuung handelte es sich aber
nicht um einen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen. Der
untersuchte Zeitraum lag jedoch noch vor dem Hauptinfektionsgeschehen mit LI.
Möglicherweise wäre der Leistungsunterschied im Zeitraum der Hauptinfektion noch
höher ausgefallen. Nach dieser Untersuchungsperiode waren die täglichen
Zunahmen der Versuchstiere jedoch aufgrund einer aufgetretenen Actinobacilluspleuropneumoniae-Erkrankung im Bestand hinsichtlich eines reinen LI-Einflusses
nicht mehr sicher zu beurteilen, zumal auch bei der Schlachtung noch
Lungenveränderungen bei den Versuchstieren beobachtet wurden. Außerdem waren
bis zur 12. Lebenswoche schon die meisten Tiere mit LI infiziert, so dass kein
Vergleich innerhalb der Versuchsgruppe mehr möglich war.
Die porzine proliferative Enteropathie beeinflusst die tägliche Gewichtszunahme
insbesondere bei klinischem Krankheitsverlauf negativ (LAWSON u. GEBHART
2000a; HARDGE et al. 2004; STEGE et al. 2004; KROLL et al. 2005b; KROLL et al.
2005c). Bei subklinischem Verlauf konnte festgestellt werden, dass durch eine
frühzeitige Impfung im Betrieb die Mastleistung gegenüber ungeimpften Tieren
deutlich verbessert werden konnte (HARTGE et al. 2004). Dies kann als Beleg dafür
gewertet werden, dass auch bei subklinischem Verlauf ein negativer Einfluss auf die
Leistung der Schweine vorliegt.
Die präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen wurde bestimmt, um zu untersuchen,
ob die ggf. bei subklinischem Verlauf einer LI-Infektion vorhandenen Darmläsionen
einen Einfluss auf die Verdaulichkeitsparameter und damit auf die Mastleistung
haben. Zu diesem Zweck wurden die Versuchstiere mit Titandioxid markiertem Futter
gefüttert. Nur der Darminhalt aus der kaudalen Hälfte des Dünndarmes wurde
untersucht. Dabei wurde der Inhalt 30 cm cranial der Papilla ilealis von der
Beprobung
ausgeschlossen,
um
eine
mikrobielle
Kontamination
aus
den
nachgelagerten Verdauungsabschnitten und somit den Eintrag von mikrobiellem
Protein weitgehend zu vermeiden.
115
Diskussion
Bei der Untersuchung der Verdaulichkeiten fehlte in diesem Versuch aufgrund der
hohen Durchseuchung eine ausreichend große Negativ-Kontrollgruppe. Deshalb
wurden die Verdaulichkeiten der Futterinhaltsstoffe nur zwischen der kurz infizierten
und der über einen längeren Zeitraum infizierten Gruppe (Gr. 2 und 3) verglichen.
Es zeigte sich nur für das Kalzium eine herabgesetzte Verdaulichkeit für Tiere der
Gruppe 2, in der auffällige histologische Läsionen am Darm dominierten, gegenüber
der Gruppe 3. Dagegen wurde für die Gruppe 3 unerwartet eine signifikant niedrigere
Verdaulichkeit von Rohprotein ermittelt. Alle anderen Parameter unterschieden sich
statistisch nicht voneinander (Tab.24).
Als ein möglicher Grund für die geringen Differenzen bei der Verdaulichkeit ist die
Entnahmestelle der untersuchten Ingesta anzusehen. Das zu untersuchende
Material wurde hier zunächst aus dem Bereich des vorderen Ileums entnommen. Da
in diesem Bereich oft nicht ausreichend Material zu gewinnen war, wurde dann
zusätzlich auch Ingesta aus dem davor befindlichen Teil des Jejunums entnommen.
Bei der Auswertung muss bedacht werden, dass im Jejunum aber keine typischen
histologischen Veränderungen im Sinne einer proliferativen Enteropathie gefunden
wurden.
116
Schlussfolgerungen
5.7 Schlussfolgerungen
Klinik
In
der
durchgeführten
Feldstudie
lag
bei
den
meisten
Schweinen
der
Versuchsgruppe eine subklinische Verlaufsform der LI-Infektion vor, wie es in
Schweine haltenden Betrieben weit verbreitet ist. Nur nach intensiver klinischer
Untersuchung konnten vereinzelt Tiere mit kurzzeitig veränderter Kotkonsistenz
festgestellt werden. Solche Symptome werden im Betrieb vom Landwirt häufig
übersehen.
Aufgrund einer im Verlauf des Versuches auftretenden App-Infektion konnte nicht
sicher beurteilt werden, ob die Mastleistung durch die LI-Infektion beeinträchtigt
wurde.
Erregerausscheidung und Antikörperentwicklung
Der Hauptinfektionszeitpunkt in der Versuchsgruppe lag zwischen der 8. und 10.
Lebenswoche und damit im Vergleich zu anderen Beständen recht früh. Die Gruppe
durchseuchte bis auf ein Tier vollständig. Bei etwa 90 % der Schweine konnte die
Infektion entweder durch den PCR-Nachweis im Kot oder einen Antikörpernachweis
festgestellt werden. Aufgrund dieser Befunde muss auch in der Praxis selbst bei
subklinischem Verlauf von einer schnellen Verbreitung des Erregers in Stallabteilen
ausgegangen werden.
PCR-Nachweise
im
Kot
waren
in
dieser
Untersuchung
bei
überwiegend
subklinischem Verlauf zumeist nur von kurzer Dauer (1-2 Wochen). Positive PCRBefunde konnten im Zusammenhang mit einem akuten Infektionsgeschehen
festgestellt werden. Aufgrund der positiven Korrelation zwischen positiven PCRErgebnissen und pathologischen Veränderungen kann im Falle eines positiven PCRBefundes auch bei subklinischen Verläufen mit Schädigungen der Darmschleimhaut
gerechnet werden.
Die relativ geringe Nachweisrate im Kot muss bei der Bestimmung einer diagnostisch
relevanten Probenzahl berücksichtigt werden.
Bei einzelnene Tieren wurde eine Serokonversion nachgewiesen, ohne dass
während der Untersuchungsperiode ein Erregernachweis im Kot gelang. Der
insgesamt hohe Anteil von seropositiven Tieren (82 %) steht im Gegensatz zum
117
Schlussfolgerungen
Vorkommen LI typischer Darmläsionen bei 53 % der untersuchten Schweine. Dies ist
jedoch im Zusammenhang mit dem Zeitpunkt der Sektion zu diskutieren, die oft erst
Wochen nach Infektionsbeginn erfolgte. Ob bei Tieren ohne pathologische
Veränderungen eine Ausheilung erfolgte, oder überhaupt keine Läsionen entstanden,
konnte im Einzelfall nicht geklärt werden. Die serologische Untersuchung mittels
ELISA kann zur Einschätzung des Infektionszeitpunktes dienen, wenn Tiere zur
Feststellung der serokonversion mehrfach untersucht wurden oder unterschiedliche
Altersgruppen im Betrieb gleichzeitig beprobt werden.
Eine Serokonversion erfolgte oft gleichzeitig mit oder eine Woche nach dem ersten
PCR-Nachweis. Nur ein Drittel der zum Mastende untersuchten Schweine wies noch
positive Titer auf. Dies muss im Zusammenhang mit der frühen Infektion und dem
subklinischen Verlauf der Infektion diskutiert werden und kann zu einer falschen
Einschätzung der Herdensituation führen, wenn bei einer Untersuchung nur ältere
Masttiere beprobt werden.
Makroskopische Untersuchung des Sektionsguts
Bei der pathologisch-anatomischen Diagnostik bestätigten sich die Erfahrungen aus
früheren Untersuchungen anderer Autoren, dass bei subklinischem Verlauf typische
makroskopische Veränderungen am Darm in der Regel fehlen. Weiterführende
histologische
Untersuchungsmethoden
sind
daher
für
die
Diagnosestellung
unverzichtbar.
Histologische Untersuchung
Aufgrund der vorliegenden Untersuchungsbefunde muss davon ausgegangen
werden, dass auch bei subklinischem Verlauf regelmäßig histologisch nachweisbare,
für LI typische proliferative Veränderungen an der Darmschleimhaut bei Schweinen
entstehen.
Die
Läsionen
waren
umso
stärker
ausgeprägt
je
dichter
Infektionszeitpunkt und Sektion beieinander lagen und korrelierten mit der
Erregermenge im Darmgewebe.
War der Zeitraum zwischen erstem Nachweis der Infektion und der Sektion größer
als 3 Wochen, konnten nur noch geringgradige oder gar keine auf eine LI-Infektion
hinweisende Läsionen gefunden werden. Dies spricht für ein zügiges Ausheilen der
Veränderungen. Inwieweit immunologische Reaktionen aufgetreten sind, ohne
118
Schlussfolgerungen
nenneswerte pathologische Veränderungen zu erzeugen konnte hier nicht geklärt
werden.
In vielen Fällen konnte jedoch immunhistologisch noch Antigen, insbesondere in den
untersuchten regionalen Lymphknoten, nachgewiesen werden. Die Lymphknoten
scheinen die Möglichkeit zu bieten, einen LI-Nachweis noch dann führen zu können,
wenn sich in der Darmschleimhaut bereits kein Antigen mehr nachweisen lässt.
Untersuchung der präzäkalen Verdaulichkeiten
Dass eine Infektion mit LI die Entwicklung betroffener Schweine negativ beeinflussen
kann, ist bereits mehrfach in der Literatur beschrieben worden. Bei subklinischem
Verlauf ist ein vergleichbarer Zusammenhang anzunehmen. Zum Einfluss der
Infektion auf die präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen konnte in der vorliegenden
Studie kann keine sichere Aussage getroffen werden. Es bleibt deshalb die Frage zu
klären, in welchem Grad die auch bei subklinischem Verlauf auftretenden
Veränderungen an der Darmschleimhaut zu Verdauungsstörungen führen, welche
die Mastleistung negativ beeinflussen.
119
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Daniel Brandt
„Untersuchungen zum subklinischen Verlauf einer LI-Infektion bei Schweinen.“
Die porzine proliferative Enteropathie wird durch LI hervorgerufen und ist eine
weltweit in Schweinbeständen verbreite Durchfallerkrankung, die sehr häufig auch
subklinisch auftritt.
In der vorliegenden Studie sollte der Verlauf einer subklinischen LI-Infektion anhand
von Erregerausscheidung, klinischen Symptomen und serologischer Kontrolle sowie
pathologische Veränderungen unter Feldbedingungen untersucht werden.
Zu diesem Zweck wurde in einem Bestand, in dem im Vorfeld eine subklinische LIInfektion diagnostiziert wurde, eine Gruppe von 60 gleichaltrigen, männlichen
kastrierten Ferkeln vom Absetzen bis zum Mastende kontrolliert. Diese Tiere wurden
ab der 4. Lebenswoche wöchentlich klinisch untersucht. Von der 6. bis zur 16.
Lebenswoche wurde wöchentlich eine Kotprobenentnahme zum PCR Nachweis
sowie
eine
durchgeführt.
Lebenswoche.
Blutprobenentnahme
zur
Weiterhin
Probenentnahmen
Ab
der
erfolgten
8.
Woche
Antikörperbestimmung
wurden
zu
zur
mittels
20.
den
und
ELISA
zur
26.
entsprechenden
Untersuchungszeitpunkten jeweils fünf Schweine aus dieser Gruppe seziert (insges.
n = 51) und Proben von verschiedenen Darmlokalisationen für eine weiterführende
histologische und immunhistologische Untersuchung sowie Ingestaproben zur
Bestimmung
der
präzäkalen
Verdaulichkeit
verschiedener
Futterinhaltsstoffe
entnommen.
Die LI-Infektion verlief innerhalb der Versuchsgruppe von 60 Läuferschweinen
weitestgehend subklinisch, nur ein Tier zeigte wässrigen Durchfall. Bei sieben
Schweinen wurde während der Versuchsperiode kurzzeitig eine dünnbreiige
Kotkonsistenz festgestellt.
Eine erste Erregerausscheidung wurde bei drei Tieren bereits in der 6. Lebenswoche
festgestellt. Nach der 14. Lebenswoche war LI bei keinem Tier mehr in den Fäzes
nachzuweisen. Zu keinem Zeitpunkt konnte bei mehr als einem Drittel der Tiergruppe
gleichzeitig ein PCR Nachweis geführt werden. Die Ausscheidung bei den einzelnen
Tieren dauerte zumeist nur eine bis zwei Wochen. Eine erste Serokonversion wurde
120
Zusammenfassung
ebenfalls in der 6. Lebenswoche registriert, die Serokonversion folgte der ersten
Erregerausscheidung im Mittel eine Woche später. Die meisten Serokonversionen
traten zwischen der Woche 8 und 11 auf, der größte Anteil an seropositiven Tieren
lag in der 12. Lebenswoche mit ca. 70 % der untersuchten Schweine vor und nahm
dann kontinuierlich ab. Am Ende der Untersuchungsperiode waren nur noch 31 %
der untersuchten Tiere seropositiv (ELISA). Mittels PCR wurden 65 % (39 Tiere),
mittels serologischer Kontrolle insgesamt 82 % (49 Tiere) der Schweine als infiziert
erkannt. Bezieht man die immunhistologischen Ergebnisse mit ein, konnte bei
insgesamt 98 % (59 Tiere) der Tiere eine LI-Infektion diagnostiziert werden. Ein Tier
blieb negativ.
Während makroskopsiche Veränderungen am Darm sehr selten waren, wurde in der
lichtmikroskopischen Betrachtung des Sektionsmaterial bei 28 von 51 untersuchten
Schweinen eine für LI typische epitheliale Hyperplasie mit Reduktion der
Becherzellen an der Darmschleimhaut gefunden. Bei fünf Tieren lagen zusätzlich
ulzerative oder fibrinös-ulzerative Läsionen vor. Bei 16 von 18 Schweinen, die zum
Zeitpunkt der Sektion einen positiven PCR Befund über den Kot zeigten, konnten
typische Läsionen am Darm beobachtet werden. Die Läsionen waren umso stärker
ausgeprägt, je dichter der erste Infektionsnachweis und die Sektion beieinander
lagen, und korrelierten mit der Erregermenge im Darmgewebe. Lag der Nachweis
der Infektion länger als drei Wochen zurück, war regelmäßig eine Ausheilung der
Darmläsionen zu beobachten.
Die immunhistologische Untersuchung zeigte, dass LI in den ersten drei Wochen
nach Infektionsnachweis bei den meisten Tieren (82 %) in Darmschleimhaut und
Lymphknoten aufzufinden war. Zu späteren Untersuchungszeitpunkten konnte der
Erreger noch bei 48 % der Tiere nachgewiesen werden, dabei häufig nur noch in den
regionalen Lymphknoten.
Bis zur 8. Lebenswoche mit LI infizierte
Schweine zeigten tendenziell ein
verringertes Wachstum, eine weitere Auswertung der Gewichtsentwicklung war
aufgrund einer Actinobacillus-pleuropneumonie-Infektion in der 10. Woche nicht
möglich.
121
Zusammenfassung
Die vorliegenden Ergebnisse zur subklinischen LI-Infektion ergaben eine hohe
Infektionsrate und belegen, dass auch bei latentem Verlauf regelmäßig histologisch
nachweisbare, für LI typischen Veränderungen an der Darmschleimhaut entstehen.
122
Summary
7
Summary
Daniel Brandt
“Clinical research describing the course of subclinical LI-infection in pigs:”
Porcine proliferative enteropathy is caused by infection with Lawsonia intracellularis
(LI). The disease is endemic among pig populations throughout the world, and in
many cases subclinical. The present study followed the course of subclinical LI
infection in a cohort of 60 barrows on a commercial farm from weaning at 4 weeks of
age to slaughter. For this purpose, fecal shedding of LI, clinical and serological
responses were monitored at regular times.
Monitoring of clinical signs started at weaning and was continued on a weekly base
until slaughter. From 6 to 16 weeks of age, rectal fecal samples and blood samples
were collected weekly from every pig to be examined by PCR and ELISA,
respectively. This was repeated at 20 and 26 weeks of age. At corresponding times
starting at 8 weeks of age, five pigs were randomly selected for necropsy (n = 51 in
total). Intestinal tissues from determined locations were examined via histologic and
immuno-histologic methods. Intestinal contents were also taken to determine
precaecal digestibility.
Infection with LI showed a mainly subclinical course in this group of 60 barrows. Only
one pig had watery diarrhea, seven pigs were observed to have soft, loose stools for
a few days. Shedding of LI was seen in three pigs already at 6 weeks of age and
persisted in the group until 14 weeks of age. During the whole study, no more than
one third of the animals were shedding the agent simultaneously. Excretion of LI in
single pigs lasted only for one to two weeks.
A first seroconversion was also found at 6 weeks of age, seroconversion followed
excretion of LI mainly one week. On average, seroconversions occurred between 8
and 11 weeks of age. By 12 weeks of age, the highest rate (70 %) of seropositive
pigs was observed and decreased steadily from than on. At slaughter, 31 % of
animals were still found positive in the LI-ELISA.
Confirmation of LI infection among pigs varied according to the techniques used. Of
the 60 barrows 39 were found positive by PCR in fecal samples (65 %), 49 animals
were found positive by serology (82 %), 59 pigs, thus all but one, were found to be
infected via immuno-histology (98 %).
123
Summary
Macroscopic changes of the intestine were rarely observed at necropsy. Light
microscopy, however, revealed characteristic lesions of LI-infection, namely epithelial
hyperplasia and reduction of goblet cell numbers in 28 of 51 necropsied pigs. Five
animals additionally had ulcerative or fibrinous-ulcerative defects. From 18 pigs
shedding LI at time of necropsy, 16 of these showed typical alterations. The severity
of lesions was dependent on the time interval between first proof of LI-infection and
the time of necropsy, being more severe the closer both occurred and correlating
with the quantity of LI in the gut epithelium. Healing of lesions was observed as early
as three weeks after proof of infection.
Immuno-histology detected LI antigen in epithelial tissue and lymph nodes within the
first three weeks of infection in most of the pigs (82 %). Later on, detection of LI
decreased to 48 %, very often being restricted to regional lymph nodes.
Pigs being infected within the first 8 weeks of life tended to show a reduction in
growth. Further evaluation of this parameter, however, interfered with Actinobacillus
pleuropneumoniae infection at week 10.
Results of this study demonstrate a high LI infection rate, and further prove that
subclinical infections are associated regularly with characteristic histological
alterations of intestinal mucous membranes.
124
Schrifttumsverzeichnis
8
Schrifttumsverzeichnis
ALEXOPOULOS, C., P. D. TASSIS, C. S. KYRIAKIS, E. D. TZIKA, V. PAPATSIROS
u. S. C. KYRIAKIS (2006):
First experience on the effect of In-feed Lincomycin for the control of proliferative
enteropathy in growing pigs.
J. Vet. Med. 53, 157-162
BAKKER, J., H. M. J. F. VAN DER HEIJDEN, M. DE SMET u. J. VOS (2000):
Comparison of laboratory techniques for the diagnosis of porcine proliferative
enteropathy (PPE) in fattening pigs.
In: 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Melbourne, 2000, Proc., S. 25
BARNA, P., u. G. BILKEI (2003):
Effect of gilt seropositivity to Lawsonia intracellularis (LI) on their offspring ´s
seropositivity to LI and on diarrhoea after pure-culture challenge.
Prev. vet. med. 61, 71-78
BEDNAR, V. (2006):
Detection of Lawsonia intracellularis in mice captured in pig farms with the
occurrence of porcine proliferative enteropathy.
In: 19th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Copenhagen, 2006, Proc., Vol. 2, S. 180
BERMÚDEZ, V., L. ARÉVALO, E. KWIESCEN, D. ROSALES, H. AVILÁN u. E.
CARERRA (2000):
Ultrasonic study of the left abdominal region of the pig as a none invasive monitoring
of chronic hyperplastic enteropathies in swine (Ileitis).
In: 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Melbourne, 2000, Proc., S. 34
BIESTER, H. E., u. L. H. SCHWARTE (1931):
Intestinal adenoma in swine.
Am. J. Path. 7, 175-185
125
Schrifttumsverzeichnis
BODE, H., A. BÖTTNER, H. BOTTERMANN, L. GOOSEN, M. KIETZMANN, R.
KROKER, S. SCHÜLLER, K. SIMON, F. R. UNGEMACH, L. H. WIELER u. G.
WITTKOWSKI (2000):
Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antimikrobiell wirksamen
Tierarzeneimitteln.
Bundestierärztekammer (BTK), Arbeitsgemeinschaft der Leitenden Veterinärbeamten
(ArgeVET)
BOESEN, H. T., T. K. JENSEN, A. S. SCHMIDT, B. B. JENSEN, S. M. JENSEN u. K.
MØLLER (2004):
The influence of diet on Lawsonia intracellularis colonization in pigs upon
experimental challenge.
Vet. Microbiol. 103, 35-45
BOESEN, H. T., T. K. JENSEN, G. JUNGERSEN, U. RIBER, M. BOYE u. K.
MØLLER (2005 a):
Development, characterization and diagnostic application of a monoclonal antibody
specific for a proteinase K resistant Lawsonia intracellularis antigen.
Vet. Microbiol. 105, 199-206
BOESEN, H. T., T. K. JENSEN, K. MØLLER, L. H. NIELSEN u. G. JUNGERSEN
(2005 b):
Evaluation of a novel enzyme-linked immunosorbent assay for serological diagnosis
of porcine proliferative enteropathy.
Vet. Microbiol. 109, 105-112
BOUTHRUP, T. S., H. T. BOESEN, J. S. AGERHOLM u. T. K. JENSEN (2006):
Revision of the early pathogenesis in proliferative enteropathy.
In: 19th Int. Pig Vet. Soc. Congr, Copenhagen, 2006, Proc., Vol. 1, S. 73
BRANDT, M., u. S. M. ALLAM (1987):
Analytik von TiO² im Darminhalt und Kot nach Kjeldahlaufschluß.
Arch. Anim. Nutr. 37, 453-454
126
Schrifttumsverzeichnis
BRONSVOORT, M., B. NORBY, D. BANE u. I. GARDNER (2001):
Management factors associated with seropositivity to Lawsonia intracellularis in US
swine herds.
J. Swine Health Prod. 9, 285-290
BROWN, C. C., D. C. BAKER u. I. K. BARKER (2007):
Infectious and parasitic diseases of the alimentary tract.
In: M. GRANT MAXIE, (Hrsg.): Pathology of domestic animals.
4. Aufl.,Verlag Saunders Ltd., Philadelphia, Vol. 2, S. 206-209
CANNON, R., u. R. T. ROE (1982):
Livestock disease surveys: A field manual for veterinarians.
Australian Bureau of Animal Health, Canberra
CESAR, A., R. M. FRIENDSHIP, C. E. DEWEY u. T. BLACKWELL (2005):
Seroprevalence of Lawsonia intracellularis in Ontario swine herds.
J. Swine Health Prod. 13, 314-317
COLLINS, A. M., R. J. LOVE, S. JASNI u. S. MCORIST (1999):
Attempted infection of mice, rats and chickens by porcine strains of Lawsonia
intracellularis.
Austr. Vet. J. 77, 120-122
COLLINS, A., R. J. LOVE, J. POZO, S. H. SMITH u. S. MCORIST (2000 a):
Studies on the ex vivo survival of Lawsonia intracellularis.
J. Swine Health Prod. 8, 211-215
COLLINS, A. M., M. VAN DIJK, S. MCORIST u. R. J. LOVE (2000 b):
Strategic medication and development of immunity to Lawsonia intracellularis.
In: 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr. Melbourne, 2000, Proc., S. 30
COLLINS, A. M., u. R. J. LOVE (2007):
Re-challenge of pigs following recovery from proliferative enteropathy.
Vet. Microbiol. 120, 381-386
127
Schrifttumsverzeichnis
COOPER, D. (1996):
Proliferative enteritis in the hamster, horse, deer and ostrich: detection and
characterisation of Lawsonia intracellularis.
Minnesota, Univ., M. Sc. Thesis
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
COOPER, D., D. SWANSON u. C. J. GEBHART (1997):
Diagnosis of proliferative enteritis in frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded
tissues from a hamster, horse, deer and ostrich using a Lawsonia-specific multiplex
PCR assay.
Vet. Microbiol. 54, S. 47-62
zit. nach J. KROLL et al. (2005b)
DROLET, R., D. LAROCHELLE u. C. J. GEBHART (1996):
Proliferative enteritis associated with Lawsonia intracellularis (ileal symbiont
intracellularis) in white tailed deer.
J. Vet. Diagn. Invest. 8, 250-253
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
DÜNSER, M., M. UNTERSPERGER, H. SCHWEIGHARDT u. M. SCHUH (2000):
Comparative studies by PCR and indirect immunofluorescent antibody test on
occurrence of Lawsonia intracellularis in upper Austrian swine herds.
In: 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr. Melbourne, 2000, Proc., S. 59
DÜNSER, M., M. UNTERSPERGER, H. SCHWEIGHARDT, M. SCHUH u. M.
AWAD-MASALMEH (2003):
Diagnostik der porzinen proliferativen Enteropathien: Vergleich unterschiedlicher
Nachweismethoden zur Erfassung von Lawsonia intracelllularis.
Tierärztl. Prax. 31, 99-105
128
Schrifttumsverzeichnis
ELDER, R. O., G. E. DUHAMEL, M. R. MATHIESEN, E. D. ERICKSON, C. J.
GEBHART u. R. D. OBERST (1997):
Multiplex polymerase chain reaction for simultaneous detection of Lawsonia
intracellularis, Serpulina hyodysenteriae, and salmonellae in porcine intestinal
specimens.
J. Vet. Diagn. Invest. 9, 281-286
ELWELL, M. R., A. L. CHAPMANN u. J. K. FRENKEL (1981):
Duodenal hyperplasia in a guinea pig.
Vet. Pathol. 18, 136-139
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
ERIKSEN, K., T. LANDSVERK u. B. BRATBERG (1990):
Morphology and immunoperoxidase studies of intestinal adenomatosis in the blue
fox, Alopex lagopus.
J. Comp. Pathol. 102, 265-278
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
FOURCHON, P., u. S. CHOUET (2000):
Technical results of swine herds and serological results on pigs for Lawsonia
intracellularis.
In: 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr. Melbourne, 2000, Proc., S. 62
FRISK, C. S., u. J. E. WAGNER (1977):
Experimental hamster enteritis: an electron microscopic study.
Am. J. Vet. Res. 38, 1861-1868
GEBHART, C. J., G. E. WARD, K. CHANG u. H. J. KURTZ (1983):
Campylobacter hyointestinalis (new species) isolated from swine with lesions of
proliferative ileitis.
Am. J. Vet. Res. 44, 361-367
129
Schrifttumsverzeichnis
GEBHART, C. J., M. P. MURTAUGH, G. F. LIN u. G. E. WARD (1990):
Species-specific DNA probes for Campylobacter species isolated from pigs with
proliferative enteritis.
Vet. Microbiol. 24, 367-379
GEBHART, C. J., G. F. LIN, S. M. MCORIST, G. H. LAWSON u. M. P. MURTAUGH
(1991):
Cloned DNA probes specific for the intracellular Campylobacter-like organism of
porcine proliferative enteritis.
J. Clin. Microbiol. 29, 1011-1015
GEBHART, C. J., S. M. BARNS, S. MCORIST, G. F. LIN u. G. H. LAWSON (1993):
Ileal symbiont intracellularis, an obligate intracellular bacterium of porcine intestines
showing a relationship to Desulfovibrio species.
Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 533-538
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
GUEDES, R. M. (2002):
Porcine proliferative enteropathie: diagnosis, immune response and pathogenesis.
Minnesota, Univ., M. Sc. Thesis
GUEDES, R. M., C. J. GEBHART, J. DEEN u. N. L. WINKELMAN (2002 a):
Validation of an immunoperoxidase monolayer assay as a serologic test for porcine
proliferative enteropathy.
J. Vet. Diagn. Invest. 14, 528-530
zit. nach J. KROLL et al. (2005b)
GUEDES, R. M., C. J. GEBHART, N. L. WINKELMAN, R. A. MACKIE-NUSS, T. A.
MARSTELLER u. J. DEEN (2002 b):
Comparison of different methods for diagnosis of porcine proliferative enteropathy.
Can. J. Vet. Res. 66, 99-107
130
Schrifttumsverzeichnis
GUEDES, R. M., u. C. J. GEBHART (2003 a):
Comparison of intestinal mucosa homogenate and pure culture of the homologous
Lawsonia intracellularis isolate in reproducing proliferative enteropathy in swine.
Vet. Microbiol. 93, 159-166
GUEDES, R. M., u. C. J. GEBHART (2003 b):
Onset and duration of fecal shedding, cell-mediated and humoral immune responses
in pigs after challenge with a pathogenic isolate or attenuated vaccine strain of
Lawsonia intracellularis.
Vet. Microbiol. 91, 135-145
GUEDES, R. M., u. C. J. GEBHART (2003 c):
Preparation and characterization of polyclonal and monoclonal antibodies against
Lawsonia intracellularis.
J. Vet. Diagn. Invest. 15, 438-446
zit. nach J. KROLL et al. (2005b)
GUEDES, R. M. (2004):
Update on epidemiology and diagnosis of porcine proliferative enteropathy.
J. Swine Health Prod. 12, 134-138
GUEDES, R. M. u. C. J. GEBHART (2004):
Progression of Lawsonia intracelllularis infection and mucosa immune response in
pigs.
In: 35th Ann. Meeting Am. Assoc. Swine Vet., Des Moins, 2004, Proc., S. 439-440
HARDGE, T., E. NICKOLL, H. GRUNERT, K. ELBER, U. LANGBEIN, C. KELLER, T.
BLEIER, J. PHOLENZ, V. F. OHLINGER u. B. SCHROEDER (2004):
Prevention of porcine proliferative enteropathy (PPE) by vaccination - efficacy and
economics in European farms.
Pig J. 54, 17-34
131
Schrifttumsverzeichnis
HARDGE, T., C. KELLER, R. STEINHEUER, P. TESSIER, J. SALLERAS, P. RUBIO,
K. VESTERGAARD, G. CLUYDTS, V. CECCARELLI, M. BUGLIESI, R.
SCHIPPERS, K. JOHNSON, I. PAPATSAS, E. EICHING, J. RIGAT u. T. TRELA
(2006):
Serological prevalence of Lawsonia intracellularis across Euopean pig herds.
In: 19th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Copenhagen, 2006, Proc., Vol. 1, S. 77
HAYES, S. F., u. P. KOLB (2002):
Enterisol Ileitis vaccine; field efficacy evaluation.
In: 33th Ann. Meeting Am. Ass. Swine Vet., Kansas City, 2002, Proc., S. 161
HOLYOAKE, P. K., R. S. CUTLER u. I. W. CAPLE (1994):
A diagnostic dilemma: detecting proliferative enteritis in pigs at slaughter.
Austr. Vet. J. 71, 308-309
HSU, S.M., L. RAINE u. H. FONGER (1981):
Use of avidin-biotin-peroxidase-complex (ABC) in immunperoxidase techniques.
J. Histochem. Cytochem. 29, 577-580
HUERTA, B., A. ARENAS, L. CARRASCO, A. MALDONADO, C. TARRADAS, A.
CARBONERO u. A. PEREA (2003):
Comparison of diagnostic techniques for porcine proliferative enteropathy (Lawsonia
intracellularis infection).
J. Comp. Pathol. 129, 179-185
JACOBSON, M., S. ENGLUND u. A. BALLAGI-PORDNY (2003):
The use of a mimic to detect polymerase chain reaction-inhibitory factors in feces
examined for the presence of Lawsonia intracellularis.
J. Vet. Diagn. Invest. 15, 268-273
132
Schrifttumsverzeichnis
JACOBSON, M., S. WENNERBO, A. ASPAN, A. GUNNARSSON u. C. FELLSTRÖM
(2006):
The importance of fecal sampling techniques in the PCR diagnosis of Lawsonia
intracellularis.
In: 19th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Copenhagen, 2006, Proc., Vol. 2, S. 181
JACOBSON, M., T. RÅSBÄCK, H. FLÖISTRUP, M. BENZ, C. BRAUNFAHRLÄNDER, J. RIEDLER, D. SCHRAM-BIJKERK u. C. FELLSTROM (2007):
Survey on the occurrence of Brachyspira species and Lawsonia intracellularis in
children living on pig farms.
Epidemiol. Infect. 135, 1043-1045
JASNI, S., S. MCORIST u. G. H. LAWSON (1994):
Reproduction of proliferative enteritis in hamsters with a pure culture of porcine ileal
symbiont intracellularis.
Vet. Microbiol. 41, 1-9
JENSEN, T. K., K. MØLLER, T. D. LESER u. S. E. JORSAL (1997):
Comparison of histology, immunhistochemistry and polymerase chain reaction for
detection Lawsonia intracellularis in natural porcine proliferative enteropathy.
Eur. J. Vet. Pathol. 3, 115-123
zit. nach J. KROLL et al. (2005b)
JENSEN, T. K., K. MØLLER, R. LINDECRONA u. S. E. JORSAL (2000):
Detection of Lawsonia intracellularis in the tonsils of pigs with proliferative
enteropathy.
Res. Vet. Sci. 68, 23-26
JENSEN, T. K., H. VIGRE, V. SØRENSEN u. K. MØLLER (2005):
Naturally acquired Lawsonia intracellularis infection in pigs studied from weaning to
slaughter by indirect immunofluorescence antibody test and polymerase chain
reaction on faeces.
Res. Vet. Sci. 79, 93-98
133
Schrifttumsverzeichnis
JENSEN, T. K., B. B. CHRISTENSEN u. M. BOYE (2006 a):
Lawsonia intracellularis infection in the large intestines of pigs.
Acta Pathol. Micobiol. Immunol. 114, 255-264
JENSEN, T. K., H. VIGRE, B. SVENSMARK u. V. BILLE-HANSEN (2006 b):
Distinction between porcine circovirus type 2 enteritis and porcine proliferative
enteropathy caused by Lawsonia intracellularis.
J. Comp. Pathol. 135, 176-182
JONES, G. F., G. WARD, J. E. COLLINS u. C. J. GEBHART (1993 a):
Transmission of proliferative enteritis to swine by use of embryonating chicken eggs.
Am. J. Vet. Res. 54, 1256-1261
JONES, G., G. WARD, C. GEBHART, M. MURTAUGH u. J. COLLINS (1993 b):
Use of a DNA probe to detect the intracellular organism of proliferative enteritis in
swine faeces.
Am. J. Vet. Res. 54, 1585-1590
JONES, G., G. E. WARD, M. P. MURTAUGH, G. LIN u. C. J. GEBHART (1993 c):
Enhanced detection of intracellular organism of swine proliferative enteritis, ileal
symbiont intracellularis, in feces by polymerase chain reaction.
J. Clin. Microbiol. 31, 2611-2615
JONES, G., G. E. WARD, M. P. MURTAUGH, R. ROSE u. C. J. GEBHART (1993 d):
Relationship between ileal symbiont intracellularis and porcine proliferative enteritis.
Infect. Immun. 61, 5237-5244
JORDAN, D. M., J. P. KNITTEL, M. B. ROOF, K. J. SCHWARTZ, D. J. LARSON u. L.
J. HOFFMAN, (1999):
Detection of Lawsonia intracellularis in Iowa swine using polymerase chain reaction
methodology.
J. Vet. Diagn. Investig. 11, 45-49
134
Schrifttumsverzeichnis
JORDAN, D. M., J. P. KNITTEL, K. J. SCHWARTZ, M. B. ROOF u. L. J. HOFFMAN
(2004):
A Lawsonia intracellularis transmission study using a pure culture inoculated seederpig sentinel model.
Vet. Microbiol. 104, 3-90
JUST, S. D., C. O. THOEN, B. J. THACKER u. J. U. THOMSON (2001):
Monitoring of Lawsonia intracellularis by indirect serum immunofluorescence assay in
a commercial swine production system.
J. Swine Health Prod. 9, 57-61
KEÏTA, A., D. WESTHOFF, E. PAGOT, F. X. ORVEILLION u. P. POMMIER (2004):
Field study into safety of Enterisol Ileitis on a Lawsonia intracellularis positive French
farm.
In: 18th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Hamburg, 2004, Proc., Vol. 1, S. 273
KELLER, C.,V. F. OHLINGER, A. NORDENGRAHN u. M. MERZA (2004)
A blocking ELISA for the detection of antibodies against Lawsonia intracellularis.
In: 18th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Hamburg, 2004, S. 293
KELLER, C., H. SCHOEDER u. V. F. OHLINGER (2006):
Enterisol Ileitis ELISA provides accurate test results for the detection of antibodies
against L. intracellularis using plasma or serum.
In: 19th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Copenhagen, 2006, Proc., Vol. 2, S. 184
KLEIN, E. C., C. J. GEBHART u. G. E. DUHAMEL (1999):
Fatal outbreaks of proliferative enteritis caused by Lawsonia intracellularis in young
colony-raised rhesus macaques.
J. Med. Primatol. 28, 11-18
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
135
Schrifttumsverzeichnis
KNITTEL, J. P., M. B. ROOF, K. J. SCHWARTZ, S. MCORIST u. D. L. HARRIS
(1997):
Diagnosis of porcine proliferative enteritis.
Compend. con. Educ. Pract. Vet. 19, 26-29
KNITTEL, J. P., D. M. JORDAN, K. J. SCHWARTZ, B. H. JANKE, M. B. ROOF, S.
MCORIST u. D. L. HARRIS (1998):
Evaluation of antemortem polymerase chain reaction and serologic methods for
detection of Lawsonia intracellularis-exposed pigs.
Am. J. Vet. Res. 59, 722-726
KNITTEL, J. P., u. M. B. ROOF (1999):
United States patent for Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia
intracellularis vaccines and diagnostic agents.
PATENT, U. S.
zit. nach J. KROLL et. al. (2005 b)
KOLB, J., F. SICK u. D. WALTER (2004):
Efficacy of an avirulent live Lawsonia intracellularis vaccine in pigs.
In: 18th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Hamburg, 2004, Proc., Vol. 1, S. 437
KOYAMA, T., T. HIRIA u. S. NAGAI (2004):
In vitro cultivation and partial characterization of Lawsonia intracellularis from a
Japanese field case of porcine proliferative enteropathy.
In: 18th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Hamburg, 2004, Proc., Vol. 1, S. 307
KROLL, J., M. B. ROOF, K. ELBERS, D. WALTER u. P. UTLEY (2004 a):
Enterisol Ileitis: induction of immunity to control ileitis in swine.
In: 18th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Hamburg, 2004, Proc., Vol. 2, S. 832
KROLL, J., M. B. ROOF u. S. MCORIST (2004 b):
Evaluation of protective immunity in pigs following oral administration of an avirulent
live vaccine of Lawsonia intracellularis.
Am. J. Vet. Res. 65, 559-565
136
Schrifttumsverzeichnis
KROLL, J., M. A. EICHMEYER, M. L. SCHAEFFER, S. MCORIST, D. L. HARRIS u.
M. B. ROOF (2005 a):
Lipopolysaccharide-based enzyme-linked immunosorbent assay for experimental use
in detection of antibodies to Lawsonia intracellularis in pigs.
Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12, 693-699
KROLL, J., M. B. ROOF, L. J. HOFFMAN, J. S. DICKSON u. D. L. HARRIS (2005 b):
Proliferative enteropathy: a global enteric disease of pigs caused by Lawsonia
intracellularis.
Anim. Health Res. Rev. 6, 173-197
KROLL, J., M. B. ROOF u. S. MCORIST (2005 c):
Maternal antibody exposure and vaccination with oral avirulent live Lawsonia
intracellularis vaccine (Enterisol Ileitis) in pigs.
Res. Vet. Sci., submitted, May 2005.
zit. nach J. KROLL et al. (2005 b)
KYRIAKIS, S. C., C. ALEXOPOULOS, K. SAOULIDIS, S. LEKKAS, C. C. MILIOTIS
u. B. SAUVEROCHE (2002 a):
The effect of Josamycine on the control of ileitis in weaned piglets under field
conditions.
J. Vet. Pharmacol. Ther. 25, 279-284
KYRIAKIS, S. C., E. BOURTZI-HATZOPOULOU, C. ALEXOPOULOS, S. K. KRITAS,
Z. POLYZOPOULOU, S. LEKKAS u. L. GARDEY (2002 b):
Field evaluation of the effect of in-feed Doxycycline for the control of ileitis in weaned
piglets.
J. Vet. Med. 49, 317-321
LA, T., A. M. COLLINS, N. D. PHILLIPS, A. OKSA u. D. J. HAMPSON (2006):
Development of a multiplex-PCR for rapid detection of the enteric pathogens
Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae, and Brachyspira pilosicoli in
porcine faeces.
Appl. Microbiol. 42, 284-288
137
Schrifttumsverzeichnis
LANTZ, P. G., W. ABU-AL-SOUD, R. KNUTSSON, B. HAHN-HAGERDAL u. P.
RADSTROM (2000):
Biotechnical use of polymerase chain reaction for microbiological analysis of
biological samples.
Biotechnol. Annu. Rev. 5, 87-130
LAPUENTE, S., C. ROSELL u. I. LANZA (2006):
Retrospective study of serological prevalence of Lawsonia intracellularis in Spanish
swine farms.
In: 19th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Copenhagen, 2006, Proc., Vol. 1, S. 78
LAWSON, G. H., A. C. ROWLAND u. L. ROBERTS (1977):
The surface antigens of Campylobacter sputorum subspecies mucosalis.
Res. Vet. Sci. 23, 378-382
LAWSON, G. H., K. ROWLAND, A. C. SMITH, W. J. ROBERTS, L. LUNNY u. D.
LUNNY (1980)
Immunisation of pigs with Campylobacter sputorum subspecies mucosalis vaccine.
Veterinary Record, 107, 424-425
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
LAWSON, G. H., A. C. ROWLAND u. N. MACINTYRE (1985):
Demonstration of a new intracellular antigen in porcine intestinal adenomatosis and
hamster proliferative ileitis.
Vet. Microbiol. 10, 303-313
LAWSON, G. H., S. MCORIST, A. C. ROWLAND, E. MCCARTNEY u. L. ROBERTS
(1988):
Serological diagnosis of the porcine proliferative enteropathies: implications for
aetiology and epidemiology.
Vet. Rec. 122, 554-557
138
Schrifttumsverzeichnis
LAWSON, G. H., S. MCORIST, S. JASNI u. R. A. MACKIE (1993):
Intracellular bacteria of porcine proliferative enteropathy: cultivation and maintenance
in vitro.
J. Clin. Microbiol. 31, 1136-1142
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
LAWSON, G. H. , R. A. MACKIE, D. G. E. SMITH u. S. MCORIST (1995):
Infection of cultured rat enterocytes by ileal symbiont intracellularis depends on host
cell function and actin polymerisation.
Vet. Microbiol. 45, 339-350
LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000):
Proliferative enteropathy.
J. Comp. Pathol. 122, 77-100
LEBLANC, B., J. G. FOX, J. L. LENET, M. T. MASSON u. A. PICARD (1993):
Hyperplastic gastritis with intraepithelial Campylobacter-like organisms in a Beagle
dog.
Vet. Pathol. 30, 391-394
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
LEMARCHAND, T. X., T. N. TULLY, S. M. SHANE u. D. E. DUNCAN (1997)
Intracellular Campylobakter-like organisms associated with rectal prolapse and
proliferaive enteroproctitis in emus (Dromaius novaehollandiae).
Vet. Pathol. 34, 152-156
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
LINDECRONA, R. H., T. K. JENSEN, P. H. ANDRESEN u. K. MØLLER (2002):
Application of a 5`nuclease assay for detection of Lawsonia intracellularis in faecal
samples from pigs.
J. Clin. Microbiol. 40, S. 984-987
139
Schrifttumsverzeichnis
LOMAX, L. G., u. R. D. GLOCK (1982):
Naturally occurring porcine proliferative enteritis: pathologic and bacteriologic
findings.
Am. J. Vet. Res. 43, 1608-1614
LOMAX, L. G., R. D. GLOCK u. J. E. HOGAN (1982):
Experimentally induced porcine proliferative enteritis in specific-pathogen-free pigs.
Am. J. Vet. Res. 43, 1615-1621
LOVE, D., R. LOVE u. M. BAILEY (1977 a):
Comparison of Campylobacter sputorum subspecies mucosalis strains in PIA, and
PHE.
Vet. Rec. 101, 473
LOVE, R. J., D. LOVE u. M. J. EDWARDS (1977 b):
Proliferative haemorrhagic enteropathy in pigs.
Vet. Rec. 100, 65-68
MACINTYRE, N., D. G. E. SMITH, D. J. SHAW, J. R. THOMSON u. S. M. RHIND
(2003):
Immunopathogenesis of experimentally induced proliferative enteropathy in pigs.
Vet. Pathol. 40, 421-432
MAUCH, C. H. Y., u. G. BILKEI (2004):
Effect of sow parity on the transmission of Lawsonia intracellularis to piglets.
Vet. Rec. 155, 532
MCORIST, S., R. BOID, G. H. LAWSON u. L. MCCONNELL (1987):
Monoclonal antibodies to intracellular Campylobacter-like organisms of the porcine
proliferative enteropathies.
Vet. Rec. 121, 421-422
140
Schrifttumsverzeichnis
MCORIST, S., u. G. H. LAWSON (1989):
Reproduction of proliferative enteritis in gnotobiotic pigs.
Res. Vet. Sci. 46, 27-33
MCORIST, S., G. H. LAWSON, A. C. ROWLAND u. N. MACINTYRE (1989):
Early lesions of proliferative enteritis in pigs and hamsters.
Vet. Pathol. 26, 260-264
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
MCORIST, S., N. MACINTYRE, C. R. STOKES u. G. H. LAWSON (1992):
Immunocytological response in porcine proliferative enteropathies.
Infect. Immun. 60, 4184-4191
MCORIST, S., u. G. H. LAWSON (1993):
Porcine proliferative enteropathy.
Vet. Rec. 132, 368
MCORIST, S., S. JASNI, R. A. MACKIE, N. MACINTYRE, N. NEEF u. G. H.
LAWSON (1993):
Reproduction of porcine proliferative enteropathy with pure cultures of ileal symbiont
intracellularis.
Infect. immun. 61, 4286-4292
MC ORIST S., u. C. J. GEBHART (1995):
In vitro testing of antimicrobial agents for proliferative enteropathy (ileitis).
J. Swine Health Prod. 3, 146-149
MCORIST, S., C. J. GEBHART, R. BOID u. S. M. BARNS (1995 a):
Characterization of Lawsonia intracellularis gen. nov., sp. nov., the obligately
intracellular bacterium of porcine proliferative enteropathy.
Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 820-825
141
Schrifttumsverzeichnis
MCORIST, S., S. JASNI, R. A. MACKIE, H. M. BERSCHNEIDER, A. C. ROWLAND
u. G. H. LAWSON (1995 b):
Entry of the bacterium ileal symbiont intracellularis into cultured enterocytes and its
subsequent release.
Res. Vet. Sci. 59, 255-260
MCORIST, S., R. A. MACKIE u. G. H. LAWSON (1995 c):
Antimicrobial susceptibility of ileal symbiont intracellularis isolated from pigs with
proliferative enteropathy.
J. Clin. Microbiol. 33, 1314-1317
MCORIST, S., L. ROBERTS, S. JASNI, A. C. ROWLAND, G. H. LAWSON, C. J.
GEBHART u. B. BOSWORTH (1996):
Developed and resolving lesions in porcine proliferative enteropathy: possible
pathogenetic mechanisms.
J. Comp. Pathol. 115, 5-45
MCORIST, S., u. C. J. GEBHART (1999):
Porcine proliferative enteropathies.
In: B. E. STRAW, S. D´ALLAIRE, W. L. MENGELING u. D. J. TAYLOR (Hrsg.):
Diseases of Swine.
8. Aufl., Blackwell Science, Ames, S. 521-534
MCORIST, S., D. BARCELLOS u. R. J. WILSON (2003):
Global patterns of porcine proliferative enteropathy.
Pig J. 51, 26-35
MICHALSKI, C. W., F. FRANCESCO DI MOLA, K. KÜMMEL, M. WENDT, J. S.
KÖNINGER, T. GIESE, N. A. GIESE u. H. FRIESS (2006):
Human inflammatory bowel disease does not associate with Lawsonia intracellularis
infection.
BMC Microbiol. 6, 81
142
Schrifttumsverzeichnis
MØLBAK, L., K. JOHNSEN, M. BOYE, T. K. JENSEN, M. JOHANSEN, K. MØLLER
u. T. D. LESER (2008):
The microbiota of pigs influenced by diet texture and severity of Lawsonia
intracellularis infection.
Vet. Microbiol. 128, 96-107
MORTIMER, I., H. M. J. F. VAN DER HEIJDEN, L. E. HENDERSON,
J. R. THOMSON u. K. LAWRENCE (2000):
Proficiency testing among European laboratories using an immuno-fluorescent
antibody test (IFAT) for the detection of antibodies against Lawsonia intracellularis in
pigs.
In: 16th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Melbourne, 2000, Proc., S. 77
NATHUES, H. (2007):
Untersuchung zur Ausscheidung von Lawsonia intracellularis mittels
molekularbiologischer Untersuchungsverfahren.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.
NAUMANN, C., u. R. BASSLER (1976):
Die chemische Untersuchung von Futtermitteln.
Bd 3, Ergänzungen
Verlag VDLUFA, Darmstadt
PEACE, T. A., K. V. BROCK u. H. F. STILLS (1994):
Comparative analysis of the 16S rRNA gene sequence of the putative agent of
proliferative ileitis of hamsters.
Int. J. Syst. Bacteriol., 44, 832-835
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
POHLENZ, J. (2005):
Die Infektion mit Lawsonia intracellularis beim Schwein - eine stets neue
Herausforderung für Praxis und Forschung.
Dtsch. tierärztl. Wochenschr. 112, 163-173
143
Schrifttumsverzeichnis
RITZMANN, M., A. PALZER, M. WENDT u. K. HEINRITZI (2004):
Serological results of a field trial on treatment of Lawsonia intracellularis infection.
In: 18th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Hamburg, 2004, Proc., Vol. 1, S. 274
ROBERTS, L., G. H. LAWSON u. A. C. ROWLAND (1977):
Porcine intestinal adenomatosis associated with serologically distinct Campylobacter
sputorum subspecies mucosalis.
Res. Vet. Sci. 23, 257-8
RODEHUTSCORD, M., u. M. A. DIECKMANN (2005):
Comparative studies with three-week-old chickens, turkeys, and quails on the
response in phosphorus utilization to the supplementation of monobasic calcium
phosphate.
Poult. Sci. 84, 1252-1260
ROMEIS, B. (1989)
Mikroskopische Technik.
17. Aufl., Verlag Urban & Schwarzenberg, München
ROWLAND, A. C., u. P. G. ROWNTREE (1972):
A haemorrhagic bowel syndrome associated with intestinal adenomatosis in the pig.
Vet. Rec. 91, 235-241
ROWLAND, A. C. (1978):
Necrotic enteritis and regional ileitis in pigs at slaughter.
Vet. Rec. 100, 338-339
ROWLAND, A. C., u. G. H. LAWSON (1992):
Porcine proliferative enteropathies.
In: B. E. STRAW, S. D´ALLAIRE, W. L. MENGELING u. D. J. TAYLOR (Hrsg.):
Diseases of Swine.
7. Aufl., Blackwell Science, Ames, S. 560-569
144
Schrifttumsverzeichnis
RÜDIGER-BÖSCH, B., U. SCHMIDT, J. MUMME, H. NIENHOFF u. F. -J. KAUP
(1986):
Über das Auftreten des Adenomatose-Komplexes beim Schwein.
Dtsch. tierärztl. Wochenschr. 99, 109-118
SANDFORD, S. (2006):
Field observation of duration of immunity in Enterisol Ileitis vaccinated replacement
gilts.
In: 19th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Copenhagen, 2006, Proc., Vol. 2, S. 195
SEGALES, J., J. M. FERNANDEZ-SALGUERO, G. FRUCTUOSO, J. QUINTANA, C.
ROSELL, J. POZO, M. L. DE ARRIBA, P. RUBIO u. M. DOMINGO (2001):
Granulomatous enteritis and lymphadenitis in Iberian pigs naturally infected with
Lawsonia intracelllularis.
Vet. Pathol. 38, 343-346
SCHOEB, T. R., u. J. G. FOX (1990):
Enterocolitis associated with intraepithelial Campylobacter-like bacteria in rabbits
(Oryctolagis cuniculus).
Vet. Pathol. 27, 73-80
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
SIGURDOTTIR, O.G., K.NORDSTOGA, B.BAUSTAD u. F.SAXEGAARD (1994):
Granulomatous enteritis in a pig caused by Mycobacterium avium.
Vet. Pathol. 31, 274-276
SIMS, L. D., u. J. R. W. GLASTONBURY (1996):
Pathology of the pig a diagnostic guide.
The Pig Research and Development Corporation, Barton, Australia
145
Schrifttumsverzeichnis
SMITH, D. G. E. (2001):
Characteristics of Lawsonia intracellularis pathogenesis: recent research and
potential benefits.
Pig J. 47, 98-104
zit. nach J. KROLL et al. (2005 b)
SMITH, S. H., u. G. H. LAWSON (2001):
Lawsonia intracellularis: getting inside the pathogenesis of proliferative enteropathy.
Vet. Microbiol. 82, 331-345
SMITH, S. H., u. S. MCORIST (1997):
Development of persistent intestinal infection and excretion of Lawsonia
intracellularis by piglets.
Res. Vet. Sci. 62, 6-10
STEGE, H., T. K. JENSEN, K. MØLLER, P. BÆKBO u. S. E. JORSAL (2001):
Risk factors for intestinal pathogens in Danish finishing pig herds.
Prev. Vet. Med. 50, 153-164
STEGE, H., T. K. JENSEN, K. MØLLER, K. VESTERGAARD, P. BAEKBO u. S. E.
JORSAL (2004):
Infection dynamics of Lawsonia intracellularis in pig herds.
Vet. Microbiol. 104, 197-206
STILLS, H. R., J. G. FOX, B. J. PASTER u. P. DEWHIRST (1991):
A new Chlamydia sp. strain SFPD isolated from transmissible ileitis in hamsters.
Microbiol. Ecol. Health Dis. 4, 99
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
SUH, D. K., u. J. C. SONG (2005):
Simultaneous detection of Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae and
Salmonella spp. in swine intestinal specimens by multiplex polymerase chain
reaction.
J. Vet. Sci. 6, 231-237
146
Schrifttumsverzeichnis
UNGEMACH F.R., J. PREUß, P. HAJEK u. H. OTTILIE (2007):
Veterinärmedizinischer Informationsdienst für Arzneimittelanwendung, Toxikologie
und Arzneimittelrecht.
[Internet: URL: http://www.vetidata.de]
VANDENBERGHE, J., A. VERHEYEN, S. LAUWERS u. K. GEBOES (1985):
Spontaneous adenocarcinoma of the ascending colon in Wistar rats: the
intracytoplasmic presence of the Campylobacter-like bacteria.
J. Comp. Pathol., 95, 45-55
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
VESTERGAARD, K., H. STEGE, P. BAEKBO, T. K. JENSEN, S. E. JORSAL u. K.
MØLLER (2004):
Infection dynamics of Lawsonia intracellularis in Danish pig herds.
In: 18th Int. Pig Vet. Soc. Congr., Hamburg, 2004, Proc., Vol.1, S. 292
WALTER, D., J. KNITTEL, K. SCHWARTZ, J. KROLL u. M. ROOF (2001):
Treatment and control of porcine proliferative enteropathy using different Tiamulin
delivery methods.
J. Swine Health Prod. 9, 109-115
WARD, G. E., u. N. L. WINKELMAN (1990):
Recognizing the three forms of proliferative enteritis in swine.
Vet. Med. 85, 197-203
zit. nach J. KROLL et al. (2005b)
WATARAI, M., S. KIM, J. YAMAMOTO, K. MIYAHARA, M. KAZAMA, S.
MATSUOKA, S. CHIMURA u. H. SUZUKI (2005):
Detection of Lawsonia intracellularis using immunomagnetic beads and ATP
bioluminescence.
J. Vet. Med. Sci. 67, 449-551
147
Schrifttumsverzeichnis
WATTANAPHANSAK, S., C. GEBHART, R. SINGER u. D. DAU (2007):
In vitro testing of antimicrobial agents for Lawsonia intracellularis.
In: 38th Ann. Meeting Am. Ass. Swine Vet., Orlando, 2007, Proc., S. 255-256
WENDT, M., R. SCHULZE u. J. VERSPOHL (2006 b):
Epidemiologische Untersuchungen zum Vorkommen von Lawsonia-intracellularisInfektionen in Schweinebeständen.
Tierärztl. Prax. 34 (G), 230-239
WHITNEY, M. H., G. C. SHURSON u. R. C. GUEDES (2006 a):
Effect of dietary inclusion of distillers dried grains with solubles on the ability of
growing pigs to resist a Lawsonia intracellularis challenge.
J. Anim. Sci. 84, 1860-1869
WHITNEY, M. H., G. C. SHURSON u. R. C. GUEDES (2006 b):
Effect of including distillers dried grains with solubles in the diet, with or without
antimicrobial regime, on the ability of growing pigs to resist a Lawsonia intracellularis
challenge.
J. Anim. Sci. 84, 1870-1879
WHITNEY, M. H., G. C. SHURSON u. R. C. GUEDES (2006 c):
Effect of dietary inclusion of distillers dried grains with solubles, soybean hulls, or a
polyclonal antibody product on the ability of growing pigs to resist a Lawsonia
intracellularis challenge.
J. Anim. Sci. 84, 1880-1889
WILLIAMS, N. M., L. R. HARRISON u. C. J. GEBHART (1996):
Proliferative enteropathy in a foal caused by Lawsonia intracellularis-like bacterium.
J. Vet. Diagn. Invest. 8, 254-256
zit. nach LAWSON, G. H., u. C. J. GEBHART (2000)
WINKELMAN, N. L. (1996):
Ileitis: an update.
Con. Educ. Pract. Vet. Compend. 19, 519-525
148
Anhang
9
Anhang
9.1
Ergebnisse für die einzelnen Versuchstiere
Tabelle 25:
4 LW
30. Mai
OM
1
4
5
6
7
8
Übersicht der Einzeltierbefunde (Körpermasse, Kotkonsistenz, PCR, ELISA, Histo-Score und ImmunhistoScore)
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
6 LW
15. Jun
0
14
0
7 LW
22. Jun
0
10,6
0
0
19,3
0
0
-7,3
0
0
16
0
0
10,5
0
0
12,3
0
0
-0,1
0
0
5
0
0
8
0
0
19,8
0
0
8,1
0
6,4
11,5
7,1
7,5
7,9
5,7
8 LW
29. Jun
0
12,8
0
14,3
0
0
0
18
0
12,4
0
21,7
1
41,1
0
14,2
0
-1,5
0
21,2
0
19,9
0
14,2
9 LW
06. Jul
0
7,2
0
10 LW
13. Jul
0
21,8
0
11 LW
20. Jul
0
18,8
0
0
13,7
0
0
9,1
0
0
17,9
0
0
3,8
0
1
36,5
1
1
34,5
0
0
5,4
0
1
30,1
1
0
31,9
0
0
5,5
0
0
19,8
0
1
56,9
0
1
4,5
0
1
22,9
0
18. Jul
24,3
12 LW
27. Jul
0
45,95
0
24
0
20
0
32
0
38,8
2
28
25. Jul
13 LW
03. Aug
01. Aug
14 LW
10. Aug
15 LW
17. Aug
16 LW
24. Aug
26LW
21. Sep
HistoScore
IH-Score
0,20
0,6
6,00
2
1,40
2
23,5
25. Jul
8,60
1
34
62,40
11,2
26,60
10,2
24
01. Aug
35
0
32,3
2
0
48,7
1
0
29,6
1
02. Nov
22. Aug
46
149
Anhang
noch Tabelle 25
4 LW
30. Mai
OM
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
6 LW
15. Jun
0
5,3
0
7 LW
22. Jun
0
7
0
0
7,6
0
0
8,2
0
0
18,2
0
0
6,6
0
0
16,5
0
0
5,3
0
0
12,4
0
0
11,3
0
0
11
0
0
10,7
0
0
11,6
0
0
8,3
0
0
5,2
0
1
13,6
0
0
18,6
0
0
7,6
0
0
0
0
0
4,1
0
9
8,5
6,8
7,3
8,1
6,1
7,1
8
6,7
7,3
8 LW
29. Jun
0
25,5
0
21,2
0
17,5
0
24,5
0
16,7
0
15,5
0
19,4
0
15,8
0
17
0
19,8
0
26,2
0
13,1
1
34,4
0
18,5
1
34,7
0
18
0
14,3
0
18,2
0
15,5
0
16,5
9 LW
06. Jul
0
21,1
0
10 LW
13. Jul
0
33,3
0
11 LW
20. Jul
0
33,8
0
0
8,8
0
0
19,6
0
0
3,69
0
0
2,9
0
0
11,2
0
0
46,9
0
0
20,9
0
0
43,5
0
0
39,6
0
1
13,2
0
0
35,8
0
0
43,6
0
0
27,5
0
1
43,7
0
0
38,8
0
0
33,5
0
0
39,7
0
0
47,8
0
12 LW
27. Jul
0
25,1
0
35
1
45,2
0
31
0
52
0
30
0
42,4
0
32
0
25,5
0
34
0
40,05
0
21
0
40,5
0
27
13 LW
03. Aug
0
26,9
0
14 LW
10. Aug
0
23,7
0
1
31,9
0
08. Aug
1
50,9
0
15 LW
17. Aug
0
29,8
0
16 LW
24. Aug
0
31,6
0
62
26LW
21. Sep
0
27,1
0
122
02. Nov
14. Nov
130,5
31
08. Aug
0
36,7
0
35,5
0
33,1
1
0
37,9
0
0
40,3
0
0
43,4
0
0
32,5
0
0
24,6
0
58
0
45,1
0
58
HistoScore
IH-Score
1,80
0
31,20
11,2
17,40
6,6
2,40
0
3,20
0
3,80
0
1,40
0
59,00
17,4
4,40
0,2
29. Aug
60
0
33,9
0
122
14. Nov
128
01. Aug
21,1
0
38,4
0
0
41,8
0
0
30,4
0
22. Aug
42
04. Jul
18,8
0
13,1
0
1
51,2
0
1
31,4
0
1
45,5
0
0
50,3
0
35
0
36,1
0
0
29,2
0
15. Aug
48
MittelfußFraktur
150
Anhang
noch Tabelle 25
4 LW
30. Mai
OM
19
20
22
23
24
25
26
28
30
31
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
6 LW
15. Jun
0
17,9
0
7 LW
22. Jun
1
8,9
0
0
16,7
0
0
6,6
0
0
17,5
0
0
13,3
0
0
17,1
0
0
5,8
0
0
10,9
0
0
2,5
0
0
8,9
0
0
11,2
0
0
15
0
0
9,4
0
0
2
0
0
8
0
0
10
0
0
6,3
0
0
5,7
0
0
9,8
0
7,6
9,1
8,1
8,3
8,7
7,3
8,9
7,8
8,3
9,1
8 LW
29. Jun
1
45,1
1
16,5
0
19,4
0
22
0
9,2
0
17,8
0
18,7
0
21,5
0
0,65
0
22
0
20,5
0
18,5
0
16,4
0
17,5
0
15,2
0
18,5
0
29,5
0
18,5
0
14,3
0
22,4
9 LW
06. Jul
04. Jul
10 LW
13. Jul
11 LW
20. Jul
12 LW
27. Jul
13 LW
03. Aug
14 LW
10. Aug
15 LW
17. Aug
16 LW
24. Aug
26LW
21. Sep
16,6
0
13,3
0
0
53,2
0
0
48,4
0
0
26,1
0
0
14,1
0
0
31,3
0
0
36,05
0
63
0
17,1
0
123
0
5,9
0
1
31
0
1
58,8
0
0
24,9
2
37
25. Jul
0
9,3
0
0
19,5
0
0
8,5
0
0
19,2
0
65
29. Aug
0
-2,3
0
0
16,6
0
1
37,9
0
0
29,1
0
0
20,25
0
0
34,7
0
0
24,9
0
42
0
29,3
1
94
0
8,1
0
0
17,9
0
1
17,9
0
0
-14,1
0
1
17,5
0
1
49
0
0
23,4
0
1
17
0
18. Jul
0
10
0
0
13
0
HistoScore
IH-Score
66,00
22
12,40
8,6
0,20
0
6,60
1
1,40
4
5,40
2,8
23
18. Jul
55,00
15,2
0
34,5
6,40
33,9
0
33,4
0
40
0
53,5
0
38
0
36,9
0
33
1
83,3
0
31
0
33,4
1
35
1
39,3
0
0
27,1
0
0
22,5
0
0
30,45
0
0
39,1
0
15. Aug
0
26
0
0
24,6
0
0
66,6
0
0
46,4
0
47
0
11,7
0
02. Nov
25. Nov
154
64,5
25. Nov
110
15. Aug
41,2
29. Jul
Mastdarmvorfall
29,6
151
Anhang
noch Tabelle 25
4 LW
30. Mai
OM
32
33
36
37
38
39
40
41
42
43
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
6 LW
15. Jun
0
12,6
0
7 LW
22. Jun
0
1,7
0
0
0,5
0
0
-3,4
0
0
5,4
0
0
3,3
0
0
4,2
0
0
8,5
0
0
6,5
0
0
5,8
0
0
-2,3
0
0
13,8
0
0
3,2
0
0
3
0
0
36,1
0
0
47,9
0
1
12,5
0
1
4
0
0
11
0
0
13,3
0
9
5,1
6,9
7
6,9
5,5
7
8,6
7,2
7,7
8 LW
29. Jun
0
10,5
0
20,5
0
19,2
0
15,3
0
18,7
0
18
0
4,3
0
17,2
0
17
0
15
0
10,7
0
16
0
14,4
0
20,5
0
59
0
22,5
1
38,8
0
22,5
0
30,8
0
21
9 LW
06. Jul
0
-0,1
0
10 LW
13. Jul
0
13,7
0
11 LW
20. Jul
0
10,6
0
0
12
0
0
18,8
0
0
47,7
0
0
8,9
0
11. Jul
0
6
0
12 LW
27. Jul
25. Jul
32,8
0
49,9
1
27,5
13 LW
03. Aug
14 LW
10. Aug
15 LW
17. Aug
16 LW
24. Aug
26LW
21. Sep
0
22,3
1
0
24,2
0
0
23,3
0
0
21,4
0
45
0
39
1
100
02. Nov
HistoScore
22,00
14. Nov
126
0
3,60
4
27,7
11. Jul
17,20
9,2
0
6,1
1
20,7
0
16,8
0
0
5,4
0
0
6,2
0
0
22,7
0
0
13,2
0
1
20,21
0
0
40,6
0
1
34,7
2
0
37,5
0
0
45,9
0
0
44,5
0
31,60
0
12,4
0
24,5
0
29,9
0
25
25. Jul
32,5
0
39,3
1
44
1
19,6
2
0
55,3
0
0
44,1
0
0
27,7
0
0
28
0
0
18,3
0
22. Aug
41,2
0
31,3
0
42
0
6,60
0
24,2
0
109
25. Nov
126
5,6
17,00
0
24,7
0
0
13
0
0
18,8
0
22. Aug
65
2
2,60
04. Jul
22,6
1
59,1
0
IH-Score
3,6
1
5,40
0
37,3
0
0
49
0
0
54,9
0
35
1
55,8
0
08. Aug
41
3
6,20
152
Anhang
noch Tabelle 25
4 LW
30. Mai
OM
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
6 LW
15. Jun
0
29,6
0
7 LW
22. Jun
0
26,2
0
0
8,7
0
0
8,7
0
0
2,9
1
0
10,1
0
0
7,2
0
1
13,8
0
1
-0,3
1
1
20,9
1
0
17,7
0
1
14,2
0
0
16,8
0
0
17,6
0
0
11,6
0
0
-2
0
1
14,2
1
1
20,9
0
0
12,1
0
0
-6,8
0
7,7
8
5,7
6,5
9,2
6,5
7,1
8,5
7,1
7
8 LW
29. Jun
1
34,8
0
16,1
0
19,3
0
24
0
18,9
0
16
1
29,1
0
15,1
1
39,3
3
23
1
29,1
1
14,8
0
19
0
18,1
0
7,1
0
21
0
50,5
1
17
0
11,5
0
19,1
9 LW
06. Jul
0
66,3
0
10 LW
13. Jul
0
39,2
0
11 LW
20. Jul
0
33,1
0
0
19,1
0
0
14,1
0
0
26,6
0
1
53,4
1
1
55
0
18. Jul
1
25,8
1
1
42,7
0
25
0
58,1
0
12 LW
27. Jul
0
22,4
0
33
1
19,5
0
36
13 LW
03. Aug
01. Aug
35
1
14,9
0
14 LW
10. Aug
15 LW
17. Aug
16 LW
24. Aug
26LW
21. Sep
02. Nov
HistoScore
3,20
08. Aug
0
40
3,80
8,6
13,40
0
26,3
0
32
01. Aug
1
33
3,20
04. Jul
22,6
23
1
33,8
1
0
52,4
0
1
51
2
0
11,5
0
0
24,6
0
0
3,9
0
1
27,7
0
11. Jul
74,40
26,7
1
76,3
1
21
0
9,2
0
34
1
72,7
0
1
65,3
1
0
53,2
0
0
15,1
0
0
21,4
0
0
18
0
22. Aug
32
0
18,4
0
55
6
1,80
0
30,9
0
122
25. Nov
140
22
60,20
04. Jul
18,5
1
1,5
0
IH-Score
2
12,6
39,40
11. Jul
26,6
6,4
1,60
153
Anhang
noch Tabelle 25
4 LW
30. Mai
OM
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
6 LW
15. Jun
0
6,6
0
7 LW
22. Jun
0
6,4
0
0
8,2
0
0
1,7
0
0
14,5
0
0
14,5
0
0
12,2
0
0
-1,5
0
0
1,3
0
0
12
0
0
9,7
0
0
1,6
0
0
9,9
0
0
7,7
0
0
8,6
0
0
14,4
0
0
0
0
0
17,9
0
0
-0,1
0
14
0
6,1
7,5
5,7
6,2
7,2
9
8,2
8,1
7,5
7,4
8 LW
29. Jun
0
25
0
18,2
0
7,7
0
21,1
0
24,1
0
16,5
0
11,2
0
20
0
11,3
0
23
0
6,1
0
26
0
12,8
0
23,7
0
29,9
0
23,2
0
43,1
0
16,5
0
4,1
0
16,5
9 LW
06. Jul
0
12,8
0
10 LW
13. Jul
0
50,7
0
11 LW
20. Jul
0
50,56
2
1
24,7
0
0
46
0
0
31,7
2
1
29,1
0
0
41,4
0
0
34,7
0
0
18,9
0
0
18,2
0
0
15,5
0
0
21,5
0
0
26,1
0
18. Jul
0
2,8
0
0
30,5
0
28
0
28,1
0
0
34,2
0
0
36,9
0
0
35,8
0
0
33,5
0
0
44,9
0
0
51,8
0
0
29,6
0
0
44
1
0
56,4
0
1
26,6
0
0
33
0
0
30,2
0
12 LW
27. Jul
0
18,9
0
35
0
43,7
0
40
0
41,1
0
35
0
18,1
0
33
13 LW
03. Aug
0
31,8
0
14 LW
10. Aug
0
28
0
15 LW
17. Aug
0
30,8
0
0
40,2
0
0
31,5
0
0
30,6
0
0
37,3
0
0
40,2
0
0
33,9
1
0
22,9
0
0
12,7
1
0
21,2
0
16 LW
24. Aug
0
17,9
0
59
0
39,4
0
65
0
28,7
0
59
0
32,4
0
60
26LW
21. Sep
0
16,2
1
124
29. Aug
65
0
30,9
0
123
0
20,4
0
124
02. Nov
25. Nov
HistoScore
IH-Score
140
2
1,20
25. Nov
140
25. Nov
136
0,6
1,20
0
40,8
1
41
0
25,2
1
39
0
33,1
0
34
0
30,4
1
33
0
29,2
0
27
0
39,3
0
0
20,4
0
0
16,6
0
0
31
0
0
25,7
0
0
32,9
0
0
36
0
0
27,8
1
15. Aug
0
25,1
0
0
26,2
0
0
15,6
0
0
35,1
0
0
15,3
0
66
0
30,13
0
55
0
24,4
0
122
0
29,2
0
112
14. Nov
131
25. Nov
3,00
126
0
45
15. Aug
45
0
18,8
0
0
3,00
0
6,60
0
23,5
0
39
0
10,3
0
96
14. Nov
102,56
0
4,20
154
Anhang
noch Tabelle 25
4 LW
30. Mai
OM
65
67
70
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
PCR
ELISA
KOT
Gewicht
6 LW
15. Jun
0
8,4
1
7 LW
22. Jun
0
0,9
0
0
-1,1
0
0
5,2
0
0
12,3
0
0
12
0
8,1
7,1
9,4
8 LW
29. Jun
0
29,1
0
21
0
-0,5
0
16,5
1
37,5
0
16,5
9 LW
06. Jul
0
10,1
0
10 LW
13. Jul
1
46,7
0
11 LW
20. Jul
0
44,2
0
1
33,7
0
0
46
0
0
44,7
0
1
30,9
0
11. Jul
12 LW
27. Jul
0
48,3
0
31
0
38,5
0
31
13 LW
03. Aug
0
46
0
14 LW
10. Aug
0
16,7
0
15 LW
17. Aug
0
21,9
0
0
28
0
0
32,1
0
0
30,3
0
16 LW
24. Aug
0
39,8
0
41
0
28,8
0
53
26LW
21. Sep
26. Sep
02. Nov
HistoScore
41,8
25. Sep
3,40
52,5
4,60
IH-Score
0
0
3,8
30,3
22,80
Legende:
PCR
0
1
negativ
positiv
ELISA PI-Wert
< 20%
? 20%- < 30%
> 30%
KOT Konsistenz
negativ
0
unauffällig
fraglich
1
dickbreiig
positiv
2
dünnbreiig
3
flüssig
Gewicht
in kg
Sektionstermin
Datum
155
Anhang
9.2
Bezugsquellen von Geräten und Verbrauchsmaterialien
Biometra, Biozym, Hess. Oldendorf
Stromversorgungsgerät, für Elektrophorese
bioScreen, Münster / Svanova Biotech AB, Uppsala, Schweden
Enterisol®Ileitis-ELISA
Biozym, Hess. Oldendorf
Digitalkamera, Donpisha 3 CCD
Elektrophoresekammer, horizontal, ComPhor mini/maxi
Thermal Cycler, MJ Research PTC-200, Peltier Thermal Cycler,
Transilluminator, Flu-o-blu
Bornstead, Dubuque, Iowa, USA
Reinstwassererzeuger, EASYpure RF compact ultrapure water system
Brinkmann, Hannover
Mikrowellengerät, Bauknecht EMWS 2818
Carl Zeiss, Göttingen
Mikroskop Axiostar plus
Dynex Technologies, Denkendorf
Microplate Reader, Dynex-MRX
Analyseprogramm, Revelation G32
Eppendorf AG, Hamburg
Pipetten und Pipettenspitzen 10 µl, 20 µl, 100 µl, 500 µl, 1000 µl
Mehrkanalpipette, Eppendorf Acura 853
Reaktionsgefäße 1,5 ml, 2,0 ml 0030.120.086
Zentrifugalmühle (Fritsch, Pulverisette, Typ 14.702
156
Anhang
Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig
Objektträger, SuperFrost®Plus, 041300
Heraeus/ Kendro, Omnilab, Hannover
Sterilwerkbank, HERA Safe
IKA Labortechnik Staufen, Staufen
Schüttler, IKA-Schüttler-MTS4
Bombenkalorimeter mit isoperibolem Messprinzip (IKA C7000, IKA Werke GmbH,
Staufen).
W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig
Deckgläser (24 x 50 mm)
Landgraf, Hannover
Polypropylenröhrchen, Whitecaps, 15 ml
Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch Medite Medizintechnik,
Burgdorf
Färbeautomat Leica St 4040
Mikrotom Reichert Jung 2030
Medite Medizintechnik, Burgdorf
Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM2000
Memmert GmbH & Co KG, Schwabach
Inkubator, SM-400
Microm, Heidelberg
Microm HM500
Olympus Deutschland GmbH, Hamburg
Digitalfotoapparat Olympus U-CMAD3
Mikroskop Bx41
157
Anhang
Omnilab, Hannover
Vortexer, Mixomat,
Qiagen GmbH, Hilden
QIAamp DNA Stool Mini Kit
Satorius, Omnilab, Hannover
Analysenwaage, OL-1500-P
Thermolife Science, Engelsbach
Entwässerung Paraffin-Einbettung Shandon Pathcentre
Sarstedt AG, Nümbrecht
Sarstedt Serummonovetten®
Kendro Laboratory Products GmbH, Hannover
Zentrifugen, Heraeus Biofuge pico und Labofuge AL
Vogel, Giessen
Ausgießstation Tissue Tec Tec TM 5
WTW Mess- und Analysegeräte GmbH, Wien, Österreich
PH-Meter Inolab pH Level 2
158
Anhang
9.3
Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Antikörper
Biozym, Hess. Oldendorf
Gelstar Nucleic Acid Gel S
Seakam LE Agarose
Finnzymes, Espoo, Finnland
dNTP Mix F-560Ltar
Boehringer Ingelheim, Ingelheim
DNA-Weight-Marker VIII
Merck, Darmstadt
Ethanol, 96 % [v/v],
Xylenzyanol
Connie Gebhart, Veterinary and Biomedical Sciences University of Minnesota,
St Paul, Minnesota
Polyklonale Antikörper gegen LI (Kaninchen-Antiserum)
Perkin Elmer, Weiterstadt
DNTP´s (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
Taq Polymerase Puffer, (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2
0,01 % [w/v] Gelatine)
Qiagen, Hilden
MgCl² 25 mM
Q-Solution
PCR Buffer (15 mM MgCl²)
159
Anhang
Carl Roth, Karlsruhe
Primer, A: 5´- TAT GGC TGT CAA ACA CTC CG- 3´,
B: 5´- TGA AGG TAT TGG TAT TCT CC- 3´
DNA Marker 100 bp DNA Leiter, equalised
®
Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7 Ethanol Rotipuran
9065.2 Ethanol, vergällt, K928.2
Hämalaunlösung sauer nach Mayer,
T865.2 Natriumhypochlorit-Lösung,
®
9062.1 2-Propanol Rotipuran (Isopropanol),
®
6752.2 Roti -Histol (Xylol-Ersatz)
®
6640.2 Roti -Histokitt II, T160.1
Roti®-Plast, Gewebeeinbettungsmedium, 6642.6
Natriumchlorid (NaCl), P029.2
Formalin 10 %
Bohrsäure
Tris Puffer
diNaEDTA (Trinatriumkomplex III)
Serva, Heidelberg
Bromphenolblau, reinst.
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Bovines Serumalbumin (BSA), A-3059
Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA, über Biologo, Kronshagen
Biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, BA 1000
Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100
VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt)
Formaldehydlösung, mind. 37 %., 1.03999.2500
Emissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES, JY 24, Jobin
Yvon GmbH)
160
Anhang
9.4
Lösungen und Puffer
9.4.1
Immunhistologie
DAB-Lösung 100 mg DAB in 200 ml PBS, pH 7,1 lösen und mischen
(Magnetrührer), anschließend filtrieren und 200 µl H O (30 %) zugeben
2
2
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 40 g NaCl und 8,97 g NaH PO in 5
2
4
Litern Aqua dest. auflösen und mit 1 M NaOH auf pH 7,1 einstellen
Pronase 0,1 g Pronase E auf 200 ml vorgewärmten PBS Puffer, 0,2 g CaCl² pH 7,4
Anitkörper Lawsonia 1:30000 in PBS/BSA
161
Anhang
9.4.2 Histologie
Durchführung HE-Färbung
Automatisierte HE Färbung (Leica ST 40440)
Tauchlösungen und Verweildauern
Roticlear
2 Minuten
Ethanol 96 %
2 Minuten
Ethanol 70 %
2 Minuten
Ethanol 50 %
2 Minuten
Aqua dest.
2 Minuten
Hämalaun
6 Minuten
Leitungswasser
8 Minuten
Auqua dest.
2 Minuten
Eosin
2 Minuten
AquaDest.
4 Minuten
Ethanol 70 %
2 Minuten
Ethanol 96 %
4 Minuten
Isopropanol
4 Minuten
Essigsäurebutylester
2 Minuten
9.4.3
Sektion
10 %iges Formalin
10 ml 36 %iges Formaldehyd
90 ml Aqua dest.
162
Anhang
9.4.4
PCR
Mastermix
eine Probe
Probe DNA
(2,5 µl)
10 x Puffer MGCl²
2,5 µl
15 mMol)
MGCl² 25 mMol
1 µl
Primer A 10 mMOl
1 µl
Primer B 10 mMol
1 µl
DNTP 10 mMol
1 µl
Taq 5 u/µl
0,1 µl
H²O ad 25 µl
15,9 µl
Ansetzen des Agarosegels 2%
10x TBE
Tris (Mol Gewicht 121,1 g)
Borsäure (Mol Gewicht 61,84 g)
diNaEDTA (Mol Gewicht 372,24 g)
demineralisiertes Wasser
108 g
55 g
9,3 g
ad1000 g
pH 8,3
10xTBE Puffer
Gewichtsmarker (Größen Bestimmung DNA VIII) 319 Basenpaare
Farbmarker Blau
10xTBE auf 1xTBE verdünnen
165 ml 1xTBE + 3,3 g Agarose
Gelstar 16,5 µl
Elektrophorese
Gel mit 1xTAE Puffer übergießen
Elektrophorese ca. 90 Min. bei 4-5 Volt pro cm Lauflänge
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Anhang
Danksagung
Hiermit möchte ich mich ganz herzlich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben.
Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. M. Wendt, danke ich für die Überlassung des
interessanten Themas, seine intensive Betreuung, die freundliche Zusammenarbeit,
seine Geduld und die ständige Ansprechbarkeit.
Dem Landwirt Hugo danke ich besonders für seine tatkräftige Unterstützung.
Herrn Prof. Dr. W. Baumgärtner, Ph.D. und Frau Dr. U. Kaim danke ich für die
freundliche Betreuung und Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und die
konstruktive Kritik.
Herrn Prof. Dr. M. Rodehutscord und Dr. H. Kluth der Martin Luther Universität in
Halle danke ich für Ihre freundliche Unterstützung.
Ich danke dem gesamten Team der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Herzlichen Dank auch an die Tierarztpraxis Fraune für die kollegiale Hilfe.
Bei allen Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover bedanke ich mich für die geduldige Beantwortung meiner
Fragen und für die tatkräftige Unterstützung.
Meinen Mitstreitern sei für die schönen Stunden gedankt.
Meiner Familie, die mich zu jeder Zeit und in jeder Hinsicht unterstützt hat, danke ich
besonders.
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