Untersuchungen zum subklinischen Verlauf einer Lawsonia
Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik und Institut für Pathologie ______________________________________________________ Untersuchungen zum subklinischen Verlauf einer Lawsonia-intracellularis-Infektion bei Schweinen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) Vorgelegt von Daniel Brandt aus Soltau Hannover 2008 I Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Wendt Univ.-Prof. Dr. W. Baumgärtner, Ph.D. 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Wendt 2. Gutachter: PD Dr. E. große Beilage Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2008 II Meiner Familie III IV Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung......................................................................................................1 2 Literaturübersicht ........................................................................................2 2.1 Lawsonia intracellularis .......................................................................... 3 2.1.1 Morphologie........................................................................................ 3 2.1.2 Übertragungswege ............................................................................. 6 2.1.3 Epidemiologie..................................................................................... 7 2.1.4 Pathogenese ...................................................................................... 9 2.1.5 Eindringen in die Wirtszelle .............................................................. 11 2.1.6 Intrazelluläre Vermehrung ................................................................ 11 2.1.7 Zellproliferation................................................................................. 12 2.2 Krankheitsbilder ................................................................................... 13 2.2.1 Porzine intestinale Adenomatose ..................................................... 13 2.2.2 Subklinische Ileitis ............................................................................ 15 2.2.3 Nekrotisierende Enteritis .................................................................. 15 2.2.4 Regionale Ileitis ................................................................................ 15 2.2.5 Porzine hämorrhagische Enteropathie ............................................. 16 2.3 Immunität ............................................................................................. 19 2.4 Diagnostik ............................................................................................ 22 2.4.1 Klinik................................................................................................. 22 2.4.2 Pathologie ........................................................................................ 22 2.4.2.1 2.4.3 2.4.3.1 Makroskopische Untersuchung 23 Labordiagnostische Verfahren.......................................................... 23 Indirect Immunoflourescent Antibody Test (IFAT) und Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA) 23 2.4.3.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 24 2.4.3.3 Polymerase Chain Reaktion (PCR) 24 2.4.3.4 Histologie 25 2.4.3.5 Immunomagnetic beads und ATP Biolumineszenz 26 2.5 Kontroll- und Prophylaxe-Maßnahmen................................................ 28 2.5.1 Desinfektion...................................................................................... 28 2.5.2 Fütterung .......................................................................................... 28 2.5.3 Antibiotische Behandlung ................................................................. 30 V Inhaltsverzeichnis 2.5.4 Vakzine............................................................................................. 31 Material und Methoden ..............................................................................33 3 3.1 Bestand und Versuchsgruppe ............................................................. 33 3.2 Klinische Untersuchung ...................................................................... 35 3.2.1 Probenentnahme .............................................................................. 36 3.3 PCR .................................................................................................... 37 3.3.1 DNA-Extraktion aus Kotproben ........................................................ 37 3.3.2 Protokoll ........................................................................................... 37 3.3.3 Replikation der DNA mittels PCR ..................................................... 38 3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese.............................................................. 39 3.3.5 Auswertung der Gele........................................................................ 39 Serologie ............................................................................................. 40 3.4 3.4.1 Kompetitiver Enzyme Linked Immunsorbent Assay.......................... 40 3.5 Pathomorphologische Untersuchungen .............................................. 41 3.5.1 Sektion ............................................................................................. 41 3.5.2 Gewebeproben für die lichtmikroskopische Untersuchung............... 43 3.5.3 Mikroskopische Beurteilung der HE-gefärbten Schnitte ................... 44 3.6 Immunhistologische Untersuchung ...................................................... 47 3.6.1 Protokoll der Immunhistologie (ABC-Methode) für Paraffinschnitte.. 47 3.7 Sonstige Untersuchungen und Behandlungen der Versuchstiere ........ 51 3.7.1 Diagnostische Untersuchungen zum Ausschluss weiterer Erreger von Darmerkrankungen .................................................................... 51 3.8 Verdaulichkeitsanalyse ........................................................................ 55 3.8.1 Chymusgewinnung ........................................................................... 55 3.8.2 Chemische Analysen........................................................................ 55 3.8.2.1 Weender Rohnährstoffe 55 3.8.2.2 Mineralstoffanalytik 56 3.8.2.3 Brennwert 56 3.8.3 3.9 4 Berechnungen .................................................................................. 56 Statistische Auswertung...................................................................... 57 Ergebnisse..................................................................................................58 4.1 Nachweis der Lawsonia-intracellularis-Infektion.................................. 58 4.2 Pathomorphologische Untersuchungen .............................................. 72 4.3 Immunhistologische Untersuchungen auf Lawsonia-intracellularis 94 VI Inhaltsverzeichnis 4.4 5 Verdaulichkeitsanalyse ...................................................................... 102 Diskussion................................................................................................104 5.1 Klinische Befunde .............................................................................. 104 5.2 Erregerausscheidung und Serologie .................................................. 105 5.3 Makroskopische Untersuchungen ...................................................... 109 5.4 Histologische Befunde ....................................................................... 110 5.5 Immunhistologische Untersuchung .................................................... 114 5.6 Mastleistung und präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen.............. 115 5.7 Schlussfolgerungen 117 6 Zusammenfassung ..................................................................................120 7 Summary 8 Schrifttumsverzeichnis............................................................................125 9 Anhang......................................................................................................149 123 9.1 Ergebnisse für die einzelnen Versuchstiere 149 9.2 Bezugsquellen von Geräten und Verbrauchsmaterialien ..................... 156 9.3 Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Antikörper .............. 159 9.4 Lösungen und Puffer............................................................................ 161 9.4.1 Immunhistologie 161 9.4.2 Histologie........................................................................................ 162 9.4.3 Sektion ........................................................................................... 162 9.4.4 PCR................................................................................................ 163 VII Tabellen und Abbildungsverzeichnis Tabellen und Abbildungsverzeichnis Tabelle 1: Nachweis von LI bei verschiedenen Tierspezies mit proliferativer Enteropathie (LAWSON u. GEBHART 2000). ............................................................ 5 Tabelle 2: Vergleich der makroskopischen und histologischen Veränderungen bei Infektion des Darms mit LI oder PCV2 (JENSEN et al. 2006b). ............................... 18 Tabelle 3: Übersicht zu den diagnostischen Möglichkeiten zum Nachweis von LI und spezifischer Antikörper beim Schwein (nach KROLL et al. 2005b).................... 27 Tabelle 4: Wirkung verschiedener Desinfektionsmittel gegen LI (COLLINS et al. 2000a). ............................................................................................................ 28 Tabelle 5: Minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentrationen für LI (WATTANAPHANSAK et al. 2007)........................................................................... 31 Tabelle 6: Zeitplan für die Untersuchung und Probenentnahme......................... 35 Tabelle 7: Probenplan für die Sektion. ................................................................ 43 Tabelle 8: Scoring-System für die histologische Beurteilung des Darmes in einer HE-Färbung. ............................................................................................................ 45 Tabelle 9: Scores zur immunhistologischen Beurteilung einzelner Darmabschnitte und Lymphknoten. .................................................................................................... 50 Tabelle 10: Ergebnisse kultureller Untersuchungen von Kotproben auf bakterielle Durchfallerreger während des Versuchsverlaufes. ................................................... 53 Tabelle 11: Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen auf Brachyspira (B.) hyodysenteriae und B. pilosicoli (PCR) während des Versuchsverlaufes. ......... 54 Tabelle 12: Ergebnisse der parasitologischen Kotuntersuchungen von sechs Versuchstieren.......................................................................................................... 54 Tabelle 13: Kotkonsistenz während der Untersuchungsperiode (n=60 Schweine) 61 Tabelle 14: Vergleich zwischen PCR- und ELISA-Ergebnissen (n=60 Schweine, + = positiv, - = negativ, ? = fraglich)............................................................................. 61 Tabelle 15: Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung von Tieren (n=21), bei denen mittels PCR keine LI-Ausscheidung im Kot nachgewiesen werden konnte, im Vergleich zur Serologie (+ = positiv, - = negativ, ? = fraglich).............................. 62 Tabelle 16: Ergebnisse der Kotuntersuchung auf LI mittels PCR zu den festgelegten Untersuchungszeitpunkten................................................................... 66 Tabelle 17: Ergebnisse der serologischen Untersuchungen auf Antikörper gegen LI mittels Blocking-ELISA zu den festgelegten Untersuchungszeitpunkten.............. 70 VIII Tabellen und Abbildungsverzeichnis Tabelle 18: Durchschnittliches Körpergewicht zum Absetzen (4 Wo) und mittlere tägliche Gewichtszunahme bis zur 8. Lebenswoche bei LI infizierten und LI-negativen Tieren (unterschiedliche Buchstaben: p<0,05). ........................................................ 72 Tabelle 19: Korrelation zwischen den Score-Werten für histologische Läsionen am Darm an metrisch zuvor festgelegten und an frei wählbaren Lokalisationen (Korrelationskoeffizient r, Signifikanz p). .................................................................. 74 Tabelle 20: Ergebnisse der histologischen Beurteilung bei Versuchs- (n=51) und Kontrolltieren (K, n=5). Neben der pathologischen Diagnose wird der Gesamtscore für 9 untersuchte Darmlokalisationen angegeben. ................................................... 78 Tabelle 21: Ergebnis der immunhistologischen Untersuchungen von Darm und Lymphknoten auf LI in Abhängigkeit vom Sektionszeitpunkt.................................... 98 Tabelle 22: Durchschnittliche IH-Scores (x±s) für die untersuchten Darmabschnitte in Gruppe 2 unter Berücksichtigung des zeitlichen Abstands zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR / ELISA) und Sektion (unterschiedliche Buchstaben p<0,05). Tabelle 23: 101 Korrelationen zwischen Histologie-Score und Immunhistologie-Score für die 4 untersuchten Darmabschnitte innerhalb der Gruppen 1-3 (r= Spearman´s Rang Korrelationskoeffizient, Gruppe 2: Ileum, Papilla ilealis n=22, Caecum, Colon 102 ascendens n=21. Tabelle 24: Präzäkale Verdaulichkeiten für verschiedene Futterparameter bei einem LI-negativen Tier sowie Gruppe 2 (Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor Sektion) und Gruppe 3 (Nachweis der LI-Infektion > 3 Wo vor Sektion) im Vergleich (unterschiedliche Buchstaben p<0,05). .................................................................. 103 Tabelle 25: Übersicht der Einzeltierbefunde (Körpermasse, Kotkosistenz, PCR, ELISA, Histo-Score und Immunhisto-Score). Abbildung 1: Serologischer Nachweis 149 von Antikörpern gegen LI in Schweinebetrieben (Herden=400, Proben=13520) aus Spanien (Herdenprävalenz und durchschnittliche Prävalenz innerhalb der Schweineherden) (LAPUENTE et al. 2006). Abbildung 2: 8 Serologische Untersuchung auf (Herdenscreening in 694 Betrieben, (WENDT et al. 2006b). Antikörper gegen LI 9 IX Tabellen und Abbildungsverzeichnis Abbildung 3: Differenzierung der verschiedenen Formen der durch LI ausgelösten porzinen proliferativen Enteropathie (nach SIMS u. GLASTONBURY 1996; POHLENZ 2005). 19 Abbildung 4: Belegungsplan im Flatdeckabteil des Versuchsbetriebes. 34 Abbildung 5: Verteilung der erstmalig positiven Nachweise einer LI-Infektion (PCR, ELISA oder Immunhistologie) zwischen der 6. und 10. Lebenswoche (LW) der Versuchstiere innerhalb der einzelnen Boxen (1-6) im Flatdeck (p>0,05). Abbildung 6: 59 Anteil der bis zur jeweiligen Lebenswoche mittels PCR, ELISA oder Immunhistologie als LI-infiziert erkannten Tiere pro Flatdeckbox (6. bis 10. Lebenswoche). Abbildung 7: 60 Zeitpunkte des erstmalig positiven PCR Nachweises im Kot mittels PCR (n=39 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen. 62 Abbildung 8: Dauer der LI-Ausscheidung (n=39). 63 Abbildung 9: Anteil der Erreger ausscheidenden Tiere innerhalb der Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 16 zu entnehmen. Abbildung 10: 64 Anteil der insgesamt per PCR als LI-Ausscheider erkannten Schweine an der gesamten Gruppe (n=60) zur jeweiligen Lebenswoche. Abbildung 11: 65 Zeitpunkte der mittels ELISA festgestellten Serokonversion (n=49 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 18 zu entnehmen. Abbildung 12: 67 Anteil serologisch positiver Schweine innerhalb der Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen. Abbildung 13: Anteil der insgesamt gegen LI serokonvertierten Schweine an der gesamten Gruppe (n=60, vgl. Tab. 17) zur jeweiligen Lebenswoche. Abbildung 14: 68 Vergleich zwischen dem Zeitpunkt der ersten feststellbaren Erregerausscheidung mittels PCR und dem der Serokonversion (n=39). Abbildung 15: 68 69 Gesamtanteil aller als LI-infiziert erkannten Schweine unter Berücksichtigung aller verwendeten diagnostischen Verfahren (PCR, ELISA, Immunhistologie) zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Abbildung 16: 71 Ileozäkaler Übergang mit geringgradigen Hyperämien und geringgradig verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 63). 75 X Tabellen und Abbildungsverzeichnis Abbildung 17: Ileum mit geringgradigen Hyperämien und geringgradig 76 verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 45). Abbildung 18: Caecum, gering- bis mittelgradig proliferierte Krypten (Tier 7). 80 Abbildung 19: Ileum, hochgradig proliferative Ileitis (Tier 17). Abbildung 20: Ileum, hochgradig proliferierte Krypten mit Zelldetritus (Tier 19). 81 82 Abbildung 21: Ileum, hochgradig proliferierte Krypte (Tier 19). 83 Abbildung 22: Caecum, hochgradige fibrinös-ulzerative und proliferative Veränderungen (Tier 49). Abbildung 23: 84 Caecum, normales Krypepithel mit vermehrten Becherzellen und apoptotischen Körperchen (Tier 50). Abbildung 24: 85 Ileum, stark vermehrte Becherzellen und deutlich in der Länge reduzierte Darmzotten (Tier 23). Abbildung 25: 86 Caecum, immunhistologische Darstellung von LI spezifischem Antigen in Krypten und Rundzellen (Tier 19). Abbildung 26: 87 Caecum, immunhistologischer Nachweis von LI spezifischem Antigen in einer Krypte (Tier 19). Abbildung 27: 88 Elektronenmikroskopische Aufnahme einer mit LI infizierten Darmepithelzelle. (Tier 49). Vergrößerung x 12.500 Abbildung 28: 89 Durchschnittliche Ausprägung der histologischen Veränderungen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer Gesamtscore für neun Darmlokalisationen: 252); unterschiedliche Buchstaben: p<0,05. Abbildung 29: Korrelation zwischen dem Grad 91 der histologischen Veränderungen (Gesamtscore für neun Darmlokalisationen) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder ELISA, n=44) und der Sektion (y= -4,3985x+35,598; r= -0,5753, p<0,001). Abbildung 30: 92 Grad der histologischen Veränderungen an den einzelnen untersuchten Darmlokalisationen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer Score 28); unterschiedliche Buchstaben p<0,05. Abbildung 31: 93 Immunhistologische Befunde der Untersuchung auf LI (IH positiv (+) oder negativ (-)) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR und/oder ELISA) und dem Zeitpunkt der Sektion. 95 XI Tabellen und Abbildungsverzeichnis Abbildung 32: Vergleich aller immunhistologischen Ergebnisse in Abhängigkeit von der untersuchten Lokalisation (Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion. Abbildung 33: Vergleich der immunhistologisch positiven 96 Ergebnisse in Abhängigkeit von den einzelnen untersuchten Lokalisationen (Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion. Abbildung 34: Vergleich 97 der Häufigkeit des LI-Nachweises mittels Immunhistologie für die untersuchten Lokalisationen an Darm (max. IH-Score pro Darmabschnitt: 6) und Lymphknoten (max. IH-Score pro Ln: 3) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion (unterschiedliche Buchstaben p<0,05). Abbildung 35: 99 Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung des LI- Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen (Gesamt-IH-Score max. 24) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion (n=45, y=-1,2522x + 9,5387; r= -0,6878, p<0,001). Abbildung 36: 100 Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung des LI- Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen sowie in den untersuchten Lymphknoten (Gesamt-IH-Score max. 30) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion (n=45, y=-1,0248x + 11,225; r= -0,6320, p<0,001). 101 XII Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen A Ampere Abb. Abbildung ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex App Actinobacillus pleuropneumoniae B. Brachyspira Betr. Betrieb BHZP Bundeshybridzuchtprogramm bp Basenpaare BSA Bovines Serumalbumin DAB 3´3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid DNA Desoxyribonukleinsäure DMSO Dimethylsulfoxid °C Grad Celsius C. Campylobacter CD Cluster of differentiation cm Zentimeter DE Deutsches Edelschwein DL Deutsche Landrasse E. coli Escherichia coli EBE Essigsäure-N-butylester ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay F Fimbrientyp FA Firma g Gramm GE Brennwert ggr. geringgradig Gr. Gruppe h Stunde HE Hämatoxylin-Eosin-Färbung hgr. hochgradig Ig Immunglobulin IFAT immunofluorescence antibody test IH immunhistologisch XIII Verzeichnis der Abkürzungen kDa kiloDalton kg Kilogramm KGW Körpergewicht kl. klinisch LI Lawsonia intracellularis Lnn. Lymphknoten LPS Lipopolysaccharid LsaA Lawsonia surface Antigen A LW Lebenswoche M-Zellen microfold Zellen MIC minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentration min Minuten mg Milligramm mgr. mittelgradig mm Millimeter ml Milliliter Mo Monat n Anzahl der Tiere nm Nanometer NE nekrotisierende Enteritis NL Niederlande OD optische Dichte OM Ohrmarke p Signifikanzniveau PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion PCV2 porzines Circovirus Typ 2 pc VQ präzäkale Verdaulichkeit PHE porzine hämorrhagische Enteropathie PI Prozentsatz der Inhibition p.i. post infectionem PIA porzine intestinale Adenomatose pos positiv PPE porzine proliferative Enteropathie XIV Verzeichnis der Abkürzungen ppm parts per million r Korrelationskoeffizient r-DNA ribosomale DNA RI Regionale Ileitis RNA Ribonukleinsäure s Standardabweichung S. Salmonella SAS Statistical Analysis System serol. serologisch ssp. Subspezies Tab. Tabelle Tierabh. Tierabholung TAE Tris-Acetat, EDTA µl Mikroliter U/min Umdrehungen pro Minute USA United States of America V Volt VDLUFA Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten W Wochen WS Warthin-Starry XV XVI Einleitung 1 Einleitung Während das klinische Krankheitsbild der porzinen proliferativen Enteropathie (Ileitis, porzine intestinale Adenomatose (PIA)) schon länger bekannt ist (BIESTER u. SCHWARTE 1931), wurde Lawsonia intracellularis (LI) erst vor wenigen Jahren, nachdem es in Zellkultur gezüchtet und vermehrt werden konnte, als ihr Erreger beschrieben (LAWSON et al. 1993, McOrist et. al. 1995a). Der Erreger ist weltweit verbreitet und führt Schweineproduktion. zu Nach erheblichen einer neueren wirtschaftlichen Studie Verlusten zeigen in in der 93-97 % aller europäischen Schweineherden Tiere eine seropositive Reaktion auf LI (HARDGE et al. 2006). Bei dieser Erkrankung handelt es sich um einen Krankheitskomplex, der einen unterschiedlichen Krankheitsverlauf nehmen kann. Die Mehrzahl der Infektionen mit LI verläuft subklinisch. Eine Infektion kann jedoch auch eine klinisch apparente Durchfallerkrankung hervorrufen, Tierverluste beziehen sich dabei eher auf Einzeltiere und spielen eine untergeordnete Rolle. Wirtschaftliche Schäden werden hauptsächlich durch die Herabsetzung der Mastleistung und eine ungleiche Entwicklung der Mastgruppen verursacht. Das Ziel dieser Studie war es, den subklinischen Verlauf einer Feldinfektion mit LI über den Zeitraum einer Aufzucht- und Mastperiode zu charakterisieren und mögliche pathologische Veränderungen im Darmbereich zu beschreiben. Zur Darstellung des Verlaufs der Infektion wurden die Tiere wöchentlich klinisch untersucht, Kotproben mittels PCR auf die Ausscheidung von LI hin überprüft und Blutproben mittels ELISA auf das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern gegen LI kontrolliert. Anhand der Ergebnisse der PCR und der serologischen Untersuchung wurden wöchentlich 5 Tiere selektiert und pathologisch-anatomisch, mit speziellem Augenmerk auf mögliche pathologische Veränderungen des Darms, untersucht. Außerdem wurden die Proben histologisch untersucht und LI-Antigen immunhistologisch nachgewiesen. Um mögliche Auswirkungen von Darmveränderungen auf die Futterverwertung feststellen zu können, wurden die Tiere mit einem Marker versetzten Futter gefüttert, und die Auswirkungen auf die Verdaulichkeit untersucht. 1 Literaturübersicht 2 2.1 Literaturübersicht Lawsonia intracellularis Der erste Fallbericht einer porzinen intestinalen Adenomatose wurde 1931 veröffentlicht, zu dieser Zeit war die Identität des Erregers noch unklar (BIESTER u. SCHWARTE 1931). Erst ab 1974 wurden Anstrengungen unternommen, den Erreger zu identifizieren (GEBHART et al. 1983). Aufgrund dieser Studien wurde Campylobacter (Vibrio) sputorum ssp. mucosalis als möglicher Erreger angesehen. Andere Autoren vermuteten aufgrund ihrer Untersuchungen Campylobacter (C.) coli, C. jejuni, C. hyointestinales oder C. mucosalis als Ursache (LAWSON et al. 1985). Durch diese uneinheitliche Klassifizierung wurde der im Darmepithel erkrankter Schweine gefundene Erreger auch als „Ileal symbiont intracellularis“ oder „Campylobacter-like bacterium“ bezeichnet (GEBHART et al. 1990). Allerdings konnten experimentell durch keine der genannten Campylobacter-Arten die charakteristischen Läsionen induziert werden (GEBHART et al. 1991). Die fehlende Nachweisbarkeit von Campylobacter bei einigen Feldinfektionen ließ vermuten, dass die intestinale Adenomatose durch einen anderen Erreger hervorgerufen wird (GEBHART et al. 1993). Aufgrund der Annahme, es mit einem völlig neuen Erreger zu tun zu haben, wurden für diesen Erreger spezifische DNA-Sonden hergestellt (MCORIST et al. 1995a). Durch Sequenzvergleiche der 16 sRNA konnte gezeigt werden, dass es sich um ein neues Genus und eine neue Spezies in der Klasse der Proteobakterien handelt (GEBHART et al. 1993). Der Erreger zeigt eine 91 %ige Übereinstimmung in der RNA-Sequenz mit dem Sulfat reduzierenden Proteobakterium Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774. Als neue Spezies wurde das Bakterium das erste Mal 1995 als LI klassifiziert und beschrieben, nachdem seine Kultivierung in einer Rattenenterozyten-Zelllinie gelang und eine Reproduktion der Erkrankung mit diesem Keim durchgeführt werden konnte (LAWSON et al. 1993; MCORIST u. LAWSON 1993; MCORIST et al. 1995a) 2 Literaturübersicht 2.1.1 Morphologie Der Erreger LI ist ein Gram-negatives, gebogenes bis sigmoides Stäbchen mit zugespitzten Enden. Die Größe beträgt 1,25-1,75 µm x 0,5-1,5 µm. Das Bakterium ist unpigmentiert, nicht sporenbildend, kapsellos mit einem einzelnen langen unipolaren Flagellum. Die Bakterienwand wird durch eine dreischichtige Umhüllung gebildet, welche von der zytoplasmatischen Membran getrennt ist (GEBHART et al. 1993). In infizierten intestinalen Zellen befindet sich der Erreger frei im apikalen Zytoplasma. Die Vermehrung erfolgt über eine äquatoriale Zellteilung (LAWSON et al. 1993). Eine Eigenbeweglichkeit des Bakteriums konnte in Kulturversuchen nachgewiesen werden. Damit ist der Erreger in der Lage, chemotaktischen Reizen folgend seine Zielzellen aktiv aufzusuchen und Darmzellen in hoher Anzahl zu infizieren und für LI typische Läsionen im Darmgewebe hervorzurufen (LAWSON u. GEBHART 2000). Die Ausbildung des Flagellums scheint stark reguliert zu sein und wurde bisher lediglich extrazellulär beschrieben, nicht aber in infizierten Zellen. Bei extrazellulär liegenden Bakterien sind zytoplasmatische Vakuolen oder zumindest ähnlich große elektronendichte Körperchen im Zytoplasma beschrieben worden, diese Strukturen fehlen bei intrazellulär liegenden Lawsonien. Eventuell handelt es sich bei diesen Strukturen um Energiereserven für das Leben außerhalb von Wirtszellen (MCORIST et al. 1993). Kultivierungsversuche in zellfreien Medien gelangen nicht (LAWSON u. GEBHART 2000), LI zeigt ein obligat intrazellulares Wachstum. Eine Kultivierung des Erregers erfolgt unter mikroaerophilen Bedingungen bei 5-18 % O2 und einer Zellschichtdicke von 2-5 mm (JENSEN et al. 2000; GUEDES u. GEBHART 2003b). Eine Kultivierung in embryonierten Hühnereiern wurde von JONES et al. (1993d) durchgeführt. Nach 4-5 Tagen Bebrütung konnten Schweine mit diesen Eiern infiziert werden, sie wiesen 10 bis 29 Tage post infectionem die für die porzine proliferative Enteropathie typischen Läsionen am Darm auf. Die unreifen Enterozyten scheinen die wichtigsten Zielzellen der Lawsonien zu sein. Weiter konnten Lawsonien in Makrophagen und in den Krypten von Tonsillen nachgewiesen werden (LAWSON u. GEBHART 2000). Infizierte Makrophagen sind in der Lamina propria betroffener Darmabschnitte und Lymphknoten zu finden. Abgesehen vom Schwein konnten LI-Infektionen bei vielen anderen Tierspezies nachgewiesen werden (DROLET et al. 1996) Die durch LI hervorgerufenen Läsionen variieren bei den verschiedenen Spezies bezüglich Lokalisation und histologischen 3 Literaturübersicht Details, allen betroffenen Tierspezies ist aber eine intrazelluläre Ansiedlung der Bakterien und eine Proliferation der Enterozyten gemein (LEBLANC et al. 1993). Das breite Wirtsspektrum (Tab. 1) von LI birgt ein zooanthroponotisches Gefährdungspotential, eine Infektion des Menschen konnte allerdings bis jetzt nicht nachgewiesen werden (MICHALSKI et al. 2006; JACOBSON et al. 2007). 4 Literaturübersicht Tabelle 1: Nachweis von LI bei verschiedenen Tierspezies mit proliferativer Enteropathie (LAWSON u. GEBHART 2000) Spezies Charakteristika der Referenz intrazellulären Bakterien Blaufuchs IO ERIKSEN et al. 1990 (Alopex lagopus) Weißwedelhirsch 27 k ea, 16 S rDNA; COOPER et al. 1996 (Odocoileus virginianus) Gewebe-PCR DROLET et al. 1996 Hund 27 k ea LEBLANC et al. 1993 Emu 27 k ea; 16 S rDNA LEMARCHAND et al. (Dromaius 1997 novaehollandiae) Meerschweinchen IO ELWELL et al. 1981 Hamster 27 k ea; Kultur; MCORIST et al. 1987 (Mesocricetus 16 S rDNA STILLS 1991 auratus) PEACE et al. 1994 Pferd Gewebe-PCR; 27 k ea WILLIAMS et al. 1996 Rhesusaffe 27 k ea KLEIN et al. 1999 27 k ea; 16 S rDNA; MCORIST et al. 1989 Kultur GEBHART et al. 1993 (Macaca mulata) Schwein LAWSON et al. 1993 Strauß 16 S rDNA COOPER et al. 1996 27 k ea; 16 S rDNA SCHOEB u. FOX 1990 IO VANDENBERGHE et (Struthio camelus) Kaninchen (Oryctolagus caniculus) Ratte al. 1985 Abkürzungen: 27 k ea = 25-27 kDa Hüllenantigen von LI nachgewiesen durch Immunhistochemie; Kultur = Wachstum von LI in vitro; 16 S rDNA = Sequenzen der 5 Literaturübersicht 16 S RNA zeigen eine Übereinstimmung mit dem im Schwein nachgewiesenen intrazellulärem Erreger >96 %; Gewebs-PCR = aus Gewebsläsionen extrahierte DNA zeigt gleiche Sequenzen wie LI; IO = intrazellulär vorliegende Bakterien nur durch Silber-Färbung oder im Elektronenmikroskop nachgewiesen 2.1.2 Übertragungswege In frühen Berichten konnte bereits eine Schwein-zu-Schwein-Übertragung in Fällen von akuter porziner hämorrhagischer Enteropathie (PHE) in Zuchtbetrieben nachgewiesen werden (ROWLAND u. ROWNTREE 1972; LOVE et al. 1977a). Eine Erregerübertragung von Schwein zu Schwein erfolgt über einen fäkal-oralen Weg. Der ausgeschiedene Kot muss für eine Übertragung auf andere Schweine große Mengen des Erregers beinhalten (MCORIST et al. 2003). In einer Infektionsstudie konnten auch Versuchstiere infiziert werden, wenn sie mit Schweinen, die mit einer nur geringen Dosis von LI infiziert wurden, in Kontakt gebracht wurden (JORDAN et al. 2004). Dies bestätigte die Annahme, dass Kot die Hauptquelle neuer Infektionen darstellt (GUEDES 2004). Mechanische Faktoren wie Stiefel und Kleidung sowie der Eintrag über biologische Faktoren wie Nager und Vögel können als mögliche Vektoren nicht ausgeschlossen werden (GUEDES 2004). Neuere Studien haben gezeigt, dass bei Nagern Lawsonien im Darm vorkommen können (COLLINS et al. 1999; BEDNAR 2006). Vermutlich dient die Maus als Reservoir für LI, und spielt bei der Verbreitung des Erregers eine entscheidende Rolle (BEDNAR 2006). LI kann in Fäzes unter üblichen landwirtschaftlichen Bedingungen bis zu 2 Wochen bei 5-15°C infektiös bleiben (COLLINS et al. 2000a) . In einer dänischen Studie zur Infektionsdynamik von LI in dänischen Schweineherden (5 Herden) konnte die erste Ausscheidung von LI bei Tieren vier Wochen nach dem Absetzen, bei einem mittlerem Gewicht von 18 kg gezeigt werden. Die Ausscheidung konnte mit drei Untersuchungen bei einzelnen Tieren für einen Zeitraum von bis zu 6 Wochen nachgewiesen werden. Die Ausscheidung erreichte ihren Höhepunkt innerhalb der fünf untersuchten Herden etwa 8 Wochen nach dem Absetzen bei einem durchschnittlichen Gewicht von 29 kg. Bei einem Gewicht von 63 kg im Alter von 14 Wochen nach dem Absetzen konnte keine Ausscheidung mehr nachgewiesen werden. In einigen Herden dieser Studie konnte 6 Literaturübersicht bei einzelnen Tieren nach dem Absetzen ein positiver Antikörpertiter festgestellt werden. Diese Tiere waren jedoch 2-4 Wochen später negativ. Die erste Serokonversion konnte 6 Wochen nach dem Absetzen gezeigt werden. Im Durchschnitt serokonvertierten alle untersuchten Tiere (n=100) zwischen der 8. und 14. Woche nach dem Absetzen. Die Serokonversion lag bei den meisten Tieren etwa 2 Wochen nach der ersten Erregerausscheidung. Abgesehen von einem Tier blieben alle Tiere nach der Serokonversion bis zum Ende der Studie in Lebenswoche 22 positiv (VESTERGAARD et al. 2004). JONES et al. (1993d) konnten LI eine Woche nach experimenteller Infektion im Kot mittels PCR nachweisen. Die Ausscheidung nahm in der 2. Woche nach der Infektion ab, hielt aber bis zu 4 Wochen an. In einer anderen Infektionsstudie, in der nicht infiziertes Darmgewebe, sondern kulturell gewonnene Lawsonien zur Infektion genutzt wurden, zeigte sich ein stärker variierendes Ergebnis. Die Ausscheidung des Erregers war unregelmäßig und hielt länger an. Bei 2 Tieren hielt die Ausscheidung bis Woche 8-10 nach Infektion an. Bei der Sektion dieser beiden Tiere 3 Wochen nach der letzten Ausscheidung zeigten sich noch Veränderungen im Darm, die auf einen Abheilungsprozess der LIspezifischen Veränderungen hindeuteten. Ein Nachweis im Darmgewebe mittels Immunfluoreszenz gelang zu diesem Zeitpunkt nicht (SMITH u. MCORIST 1997). Bei einer Infektionsstudie (GUEDES u. GEBHART 2003c) wurde der Erreger für einen Zeitraum von bis zu 12 Wochen intermittierend ausgeschieden. Hieraus wird ersichtlich, warum in vielen Schweine haltenden Betrieben eine stark mit LI belastete Umwelt vorliegt, welche Reinfektionen und Infektionen in verschiedenen Altersgruppen ermöglicht (MCORIST et al. 2003). 2.1.3 Epidemiologie Verfolgt man die Literatur ist eine Zunahme der Verbreitung von LI in Schweineherden in den letzten Jahren festzustellen. In einer Studie zur Seroprävalenz in Spanien konnte ein deutlicher Anstieg seropositiver Schweinefarmen, wie auch positiver Tiere pro Farm im Zeitraum von 2001 bis 2004 festgestellt werden (LAPUENTE et al. 2006, Abb. 1). 7 Literaturübersicht 100% 90% Prävalenz (%) 80% 70% 60% 50% 40% pos. Herden pos. Tiere 30% 20% 10% 0% 2001 (n=2124) 2002 (n=1779) 2003 (n=4468) 2004 (n=5149) Jahr Abbildung 1: Serologischer Nachweis von Antikörpern gegen LI in Schweinebetrieben (Herdenprävalenz (Herden=400, und Proben=13520) durchschnittliche Prävalenz aus Spanien innerhalb der Schweineherden) (LAPUENTE et al. 2006) Zwischen den Jahren 2001 und 2004 stieg die Prävalenz der seropositiven Schweinefarmen von 65,4 % auf 98,9 %. Die seropositiven Tiere pro Farm stiegen von 24,6 % im Jahr 2001 auf 72,1 % im Jahr 2004. Für diese Studie wurden 400 spanische Schweinefarmen untersucht. Als ein möglicher Grund für die starke Ausbreitung von LI-Infektionen wird das Verbot antimikrobieller Wachstumsförderer diskutiert (LAPUENTE et al. 2006). Eine Studie zum Vorkommen von LI-Infektionen in deutschen Schweinebeständen zeigte eine den spanischen Ergebnissen ähnlich hohe Prävalenz. Von 694 untersuchten, über das gesamte Bundesgebiet verteilten Betrieben waren im Schnitt 81,3 % der Betriebe seropositiv. Die Verteilung über das Bundesgebiet zeigt gewisse regionale Unterschiede. Die Schwankungsbreite liegt zwischen 66,6 % in Hessen und 100 % positiv getesteten Betrieben in Sachsen (WENDT et al. 2006b). Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Altersabhängigkeit (Abb. 2). HARTGE et. al. (2006) konnten noch einen höheren Anteil positiver Betriebe in Deutschland beschreiben. Eine Verbreitung von LI wird in dieser europaweit angelegten Studie für Deutschland in 94 % aller untersuchten Mastbetriebe und 99 % aller Zuchtbetriebe angegeben. In Spanien wurden in dieser Studie in 92 % der 8 Literaturübersicht Mastbetriebe und 98 % der Zuchtbetriebe Seroreagenten gefunden. Europaweit waren 93 % aller Schweine mästenden Betriebe seropositiv bzw. 97 % aller Zuchtbetriebe. Dieser Studie zufolge weist europaweit bereits jedes 4. Schwein im Alter von 13 Lebenswochen Antikörper gegen LI auf. gesamt (n=7546) Saugferkel (n=61) Tiergruppen Absetzferkel <15 kg (n=487) Absetzferkel <30 kg (n=1384) Mast <50 kg (n=2129) Mast >50 kg (n=1947) Jungsauen (n=826) Altsauen (n=704) Eber (n=8) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 seropositiv (%) Abbildung 2: Serologische Untersuchung auf Antikörper gegen LI (Herdenscreening in 694 Betrieben, (WENDT et al. 2006b) 2.1.4 Pathogenese Die Infektion mit LI verursacht verschiedene Krankheitsbilder, aufgrund des lange unbekannten Erregers wurde einige Zeit angenommen, dass es sich um unterschiedliche Erkrankungen handele. Heute wird die LI-Infektion nach den unterschiedlichen Verlaufsformen in subklinisch, akut und chronisch unterschieden. Die Dosis der aufgenommenen Bakterien und das sich entwickelnde Krankheitsbild stehen in Zusammenhang. So konnte gezeigt werden, dass die klinischen und pathologischen Erscheinungen sowie deren Dauer mit der Menge der aufgenommenen Bakterien positiv korrelieren (COLLINS u. LOVE 2007). Allen Krankheitsbildern ist eine Proliferation unreifer Enterozyten der Kryptepithelien des Darms gemeinsam. Diese Proliferationen können als pathognomonisch für die porzine intestinale Adenomatose betrachtet werden (POHLENZ 2005). Die von diesen Veränderungen am stärksten betroffenen Bereiche des Darms sind Ileum und Colon ascendens (MCORIST u. GEBHART 1999). Den Verlauf der Infektion konnte 9 Literaturübersicht GUEDES u. GEBHART (2004) in einer Untersuchung, in der die Versuchstiere zu unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion untersucht wurden, darstellen. Jejunum und Ileum waren die ersten Lokalisationen, in denen LI nachgewiesen werden konnte. Die nachfolgenden Darmabschnitte werden anscheinend durch die Ausschleusung von Bakterien aus Jejunum und Ileum infiziert. Später sezierte Tiere, welche bereits länger infiziert waren, zeigten histologische Veränderungen in den dahinter gelegenen Darmabschnitten, nicht aber in Jejunum und Ileum (GUEDES 2004). In einer neueren Untersuchung zeigen BOUTHRUP et al. (2006) eine andere Verteilung des Erregers über den Darm. Der Erreger war in der Lage, einen weiten Bereich des gesamten Darms zu infizieren, allerdings gab es eine Präferenz für die aboralen Bereiche des Dünndarms. Das Kryptepithelium wurde nicht selektiv befallen, sondern Darmepithelzellen in allen Bereichen des Darms. Die Ausbreitung im Verlauf der Infektion schien weniger auf einer Ausschleusung der Bakterien, als auf einer aktiven Krypt-zu-Krypt Verbreitung zu beruhen (BOUTHRUP et al. 2006). In welchem Bereich LI die Darmbarriere durchbricht, ist bislang nicht geklärt. Erste Läsionen zeigen sich jedoch immer im Bereich der Peyerschen Platten. Ob die so genannten „microfold cells“ (M-Zellen) bei der Überwindung der Darmbarriere eine entscheidende Rolle spielen, ist derzeit noch unklar (POHLENZ 2005). Außerhalb des Darms sind bislang Antigenfunde in lokalen Lymphknoten und den Tonsillen bekannt (JENSEN et al. 2000; GUEDES u. GEBHART 2004). Im Darm ist die Infektion auf Enterozyten und Makrophagen limitiert (GUEDES 2002; GUEDES u. GEBHART 2003a, b). Eine Infektion mit LI scheint stark abhängig von der vorliegenden intestinalen Flora zu sein. In Infektionsversuchen mit keimfreien Schweinen gelang es nicht, diese Tiere mit in Reinkultur vorliegenden Lawsonien zu infizieren. Diese Tiere zeigten keine intrazelluläre Infektion oder extrazelluläre Besiedlung. Immunologische Reaktionen konnten ebenfalls nicht festgestellt werden. (MCORIST et al. 1993). Hingegen konnte in keimfrei aufgezogenen Schweinen über mit Lawsonien infizierte Darmteile, die noch eine für Schweine typische unspezifizische Darmflora enthielten, eine Infektion hervorgerufen werden (MCORIST et al. 1989). Nach diesen Versuchsergebnissen wird vermutet, dass die intestinale Flora einen Einfluss hat auf die Fähigkeit von LI, in Darmzellen einzudringen. Ohne das Vorhandensein von kommensalen Bakterien ist eine Infektion nicht möglich (SMITH u. LAWSON 2001). 10 Literaturübersicht 2.1.5 Über Eindringen in die Wirtszelle das Eindringen von LI in seine Zielzellen ist wenig bekannt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Lawsonien auf der Oberfläche Ihrer Zielzellen stammen von Versuchen mit Hamstern (MCORIST et al. 1989; JASNI et al. 1994). Diese Aufnahmen zeigen Bakterien mit ähnlicher Morphologie wie intrazellulär vorkommende Lawsonien. Allerdings gelang es nicht, die extrazellulär liegenden Bakterien mit für LI spezifischen immunologischen Techniken zu markieren. Es wurde deshalb vermutet, dass LI Phasen mit variablen Antigenstrukturen ausbildet (MCORIST u. LAWSON 1989). Die Morphologie der Zielzellen änderte sich nach einer Infektion nur unwesentlich. Es konnte ein Verlust der Mikrovillistruktur sowie eine Verdickung und ein Aufreißen der den Bakterien zugewandten Zellwände beobachtet werden. In Zellkulturen konnten erste intrazelluläre Bakterien bereits 10 Minuten nach dem Start des Infektions-Experiments nachgewiesen werden (LAWSON et al. 1995; MCORIST et al. 1995b). Das Bakterium lagert sich an die Zielzelle an und wird über membrangebundene Vakuolen eingeschlossen und in deren Zytoplasma transportiert. Die Vakuole wird wenige Zeit nach dem Eintritt in die Zelle aufgebrochen, bereits 3 Stunden danach befindet sich die Mehrzahl der eingedrungenen Bakterien frei im Zellzytoplasma (MCORIST et al. 1995b). 2.1.6 Intrazelluläre Vermehrung Bereits 48 Stunden nach Infektion können erste Zellteilungen der Bakterien beobachtet werden (BOUTHRUP et al. 2006). Vorhandene Erkenntnisse aus Zellkulturversuchen lassen vermuten, dass die bakterielle Replikation von LI stark an die der Wirtszelle gekoppelt ist. LI besitzt einen Tropismus für Kryptzellen. Diese Zellen teilen sich und migrieren in das Epithel, um dieses zu bilden. (SMITH u. LAWSON 2001). SMITH und LAWSON (2001) konnten keine Bakterien auf den Zelloberflächen oder einen Transfer zwischen oder aus den infizierten Zellen beobachten. Hieraus schlossen sie, dass die Verteilung der Bakterien über den Darm ausschließlich über Teilung und Migration von infizierten Wirtszellen vonstatten geht. JENSEN et al. 11 Literaturübersicht (2006a) hingegen beobachteten, dass einige Zellen eine Karyorrhexis und Ruptur der Zellmembran zeigten und dass durch diesen Riss große Mengen des Erregers ausgeschieden wurden. Diese Bakterien lagen frei in der Lamina propria oder wurden von umliegenden Makrophagen phagozytiert. Eine Verbreitung der Lawsonien zwischen den einzelnen Enterozyten konnte auch hier nur über eine Mitose der Zellen aufgezeigt werden. LOMAX und GLOCK (1982) konnten in elektronenmikroskopischen Aufnahmen Zellteilungen von Lawsonien in infizierten Makrophagen nachweisen. 2.1.7 Zellproliferation Eine Epithelzellproliferation bei der PPE kommt ausschließlich durch infizierte Zellen zustande (MCORIST et al. 1996). Die Zellproliferation beginnt an der Basis der Krypten. Die unreifen Zellen liegen in bis zu 5 Lagen übereinander und bilden nur einen schwachen Bürstensaum aus (POHLENZ 2005). Die Zellproliferation beginnt bereits 12 bis 36 Stunden nach Infektion (BOUTHRUP et al. 2006). Infizierte Zellen scheinen unmittelbar nach einer Infektion eine stark gesteigerte Zellteilungsrate zu erlangen. Die gesteigerte Zahl von Mitosen bewirkt eine dreimal höhere Zellpopulation als im normalen Gewebe. Dieser stimulative Effekt auf die Zellteilung der Wirtszelle ist von begrenzter Dauer und endet trotz einer länger bestehenden Infektion der Zellen (SMITH u. LAWSON 2001). 2.2 Krankheitsbilder Die PPE bildet einen Krankheitskomplex. Sie unterteilt sich in eine akute Form, die porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE), sowie subakute bis chronische Formen (Abb. 3). Dieses sind die porzine intestinale Adenomatose (PIA), die nekrotisierende Enteritis (NE) sowie die regionale Ileitis (RI). Sie sind wahrscheinlich eine Folge der Sequenz der Ereignisse, die sich im hinteren Dünndarm, Caecum und Colon abspielen (POHLENZ 2005). Oft verläuft die Infektion aber auch subklinisch. Makroskopische und mikroskopische Veränderungen durch eine Infektion mit LI sind in Tabelle 2 zusammengefasst. 12 Literaturübersicht 2.2.1 Porzine intestinale Adenomatose Die PIA ist die häufigste subakute bis chronische Form der PPE und geht der NE und RI regelmäßig voraus. Zumeist tritt sie im Alter zwischen 6-14 Wochen auf. Diese Form ist durch zwei Hauptsymptome gekennzeichnet, zum einen durch eine verringerte Gewichtszunahme und eine starke Variation der Körpergewichte innerhalb der einzelnen Mastgruppen, zum anderen durch eine Diarrhoe. Der Durchfall kann intermittierend und dünnbreiig bis wässrig sein, gelegentliche Blutbeimengungen sind möglich (POHLENZ 2005). Die makroskopischen Veränderungen stellen sich im Allgemeinen als Verdickung der Darmschleimhaut dar. Diese Verdickungen können fokal sein und treten oft als kleine umschriebene proliferierte Bezirke auf, umgeben von ansonsten unauffälligem Darmgewebe (SMITH u. LAWSON 2001). Die verdickte Mukosa formt irreguläre longitudinale oder transversale Faltungen. Diese werden als hirnwindungsartig beschrieben. Im Mesenterium sind die Blut- und Lymphgefäße gestaut. Hiermit geht ein subseröses Ödem einher, und die regionären Lymphknoten sind stark vergrößert und ödematös (BROWN et al. 2007). Bei der mikroskopischen Untersuchung steht die Proliferation unreifer Zellen in den Krypten im Vordergrund. Die Zotten der Darmschleimhaut sind verkürzt und in den Krypten sind bis zu fünffach verdickte Zelllagen zu beobachten. Becherzellen fehlen Veränderungen fast werden vollständig begleitet von (POHLENZ einer 2005). Infiltration Die von proliferativen Lymphozyten, Neutrophilen und Histiozyten in der Lamina propria, sowie den Kryptlumina (LOMAX u. GLOCK 1982). Proliferierte und normale Krypten können in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander gefunden werden (MCORIST et al. 1993).In vielen Fällen gibt es keine Anhaltspunkte für Entzündliche Reaktionen (MCORIST u. GEBHART 1999). Bei den proliferativen Veränderungen kann die Darmmukosa vollständig durch eine Adenomähnliche Mukosa ersetzt werden. Die Krypten sind vergrößert und verzweigen sich drüsenartig (MCORIST u. LAWSON 1993). Die mukosale Oberfläche der Darmschleimhaut flacht mit zunehmender Verlängerung der Krypten ab. Dies kann dazu führen, dass die Kryptlumina an einer vollständig zottenfreien Oberfläche offen liegen (LOMAX u. GLOCK 1982). Die proliferierten Kryptepithelzellen nehmen eine leicht kuboidale und leicht vergrößerte Form an (JENSEN et al. 2006a). Die proliferierten unreifen Zellen zeigen im Lichtmikroskop ein basophiles Zytoplasma mit großem, oval bis länglich 13 Literaturübersicht erscheinendem, hyperchromatinen Zellkern. Ihnen fehlt ein prominenter Mikrovillisaum (LOMAX u. GLOCK 1982). Weiter können kugelförmige, stark mit LI gefüllte Epithelzellen gefunden werden. Diese Zellen zeigen Karyorrhexis und einen Riss der Zellmembran. Durch diesen Riss werden große Mengen des Erregers aus dem Zytoplasma ausgeschleust (JENSEN et al. 2006a). Eine Hyperplasie der Enterozyten und eine Reduktion der Becherzellen können frühestens 11 Tage nach Infektionsbeginn beobachtet werden (GUEDES u. GEBHART 2004). Beobachtungen von multinukleären Riesenzellen in mit LI infiziertem Gewebe sind selten (LOMAX u. GLOCK 1982; SEGALES et al. 2001). JENSEN et al. (2006b) hingegen warnen, multinukleäre Riesenzellen LI-Infektionen zuzuordnen und verweisen auf SIGURDARDOTTIR et al. (1994), wonach eher eine mykobakterielle Infektion für das Auftreten von Riesenzellen verantwortlich zu sein scheint. Weiterhin sind multinukleäre Riesenzellen auch bei PCV2-Infektionen zu finden (Tab. 2) (JENSEN et al. 2006b). Während der so genannten “Erholungsphase” 7-9 Wochen p.i. sind neben den proliferierten Epithelzellen, Makrophagen, wieder auftretende Becherzellen und unveränderte Krypten zu erkennen. Viele der Kryptepithelzellen beinhalten zahlreiche apoptotische Körperchen. Im histologischen Bild erscheinen diese Körperchen als eosinophile Einschlüsse in basalen Kryptzellen. Epitheliale Zellgruppen mit apoptotischen Körperchen beinhalten keine sichtbaren Bakterien (MCORIST et al. 1996). MCINTYRE et al. (2003) beschrieben, dass es innerhalb dieser Erholungsphasen zu einem Wiederauftreten von Becherzellen in normalen Krypten mit einer anschließenden Phase der Becherzellhyperplasie kommt. In den Ileozäkal-Lymphknoten konnten LOMAX et al. (1982) das Vorkommen von multifokalen granulomatösen Lymphadenitiden aufzeigen. Bei einem Tier wurde eine Epithelzellmetastase im Lymphknoten gefunden. Diese Epithelzellen waren unreif und bildeten irreguläre Kryptstrukturen, welche intraluminal Zelldetritus enthielten. Diese metastatischen Zellen wiesen jedoch kein LI-Antigen auf (LOMAX et al. 1982). Die Ähnlichkeiten zwischen einer PCV2- und einer LI-Infektion machen eine differentialdiagnostische Untersuchung notwendig. Eine Zusammenfassung der makroskopischen und mikroskopischen Veränderungen (Tab. 2) von LI- und PCV2Infektionen zeigen JENSEN et al. (2006b). 14 Literaturübersicht 2.2.2 Subklinische Ileitis Am häufigsten kommt die subklinische Ileitis vor. Zumeist sind Ferkel im Alter ab 6 Wochen betroffen (POHLENZ 2005). Diese Form der Infektion ist definiert durch eine LI-Besiedelung des Darms mit dem Auftreten von mikroskopischen und seltener makroskopischen Läsionen sowie durch verringerte Tagesgewichtszunahmen und schlechtere Futterverwertung, ohne dass klinische Symptome zu erkennen sind (KROLL et al. 2005b). Während einige Tiere in der Gruppe ein normales Wachstum zeigen, bleiben andere deutlich in ihrer Gewichtsentwicklung zurück (MCORIST u. GEBHART 1999). Erfahrungen aus Sektionen zeigten, dass im hinteren Ileum, im Bereich der Papilla ilealis sowie im vorderen Colon auf LI hinweisende Schleimhautalterationen zu finden sind (MCORIST u. GEBHART 1999). Histologisch sind Zellproliferationen in unterschiedlichsten Ausprägungen im Bereich der Krypten zu finden. Der Erreger kann in solchen Fällen nicht immer nachgewiesen werden. Es kommt vor, dass zwar eine Kolonisation mit LI vorliegt, diese aber nicht schwer genug ist, um eine nachweisbare Erregerausscheidung zu erzeugen bzw. um eine Serokonversion herbeizuführen (GUEDES 2004). 2.2.3 Nekrotisierende Enteritis Die nekrotisierende Enteritis ist gekennzeichnet durch hochgradige entzündliche bis nekrotisierende Vorgänge im Darm der betroffenen Tiere. Klinisch zeigen diese Tiere ein hochgradiges Kümmern und dünnbreiigen bis wässrigen, gelb-braunen Kotabsatz (LAWSON u. GEBHART 2000). Es treten Fibrinauflagerungen und oberflächliche Läsionen der Darmschleimhaut auf. Weiter können fokal bis großflächig gelb-braune Verkäsungen oder blutig-nekrotische Veränderungen auf der Darmschleimhaut des distalen Ileums und proximalem Colons auftreten. Die nekrotisierende Enteritis ist vermutlich die Folge der durch die PIA verursachten Läsionen und nachfolgender Besiedlung mit einer pathogenen anaeroben Dickdarm-Flora (BROWN et al. 2007). 2.2.4 Regionale Ileitis Eine regionale Ileitis scheinen Tiere als Endstadium zu entwickeln, welche die chronische Form überlebt haben. Das Ileum erscheint verdickt und steif, 15 Literaturübersicht entsprechend wird diese Form auch als „Garden-hose-gut“ (Gartenschlauch-Darm) bezeichnet. Bei gelegentlich auftretenden Todesfällen, wird das hypertrophe Ileum perforiert, die betroffenen Tiere verenden schließlich an einer daraus resultierenden Peritonitis (LOVE et al. 1977b). Beim Eröffnen des Darmlumens werden meist lineare Ulzerationen sichtbar, die in ein Granulationsgewebe eingebettet sind. Diese Granulationen sind wandseitig von hypertropher Muskulatur umgeben. Im Granulationsgewebe finden sich Inseln von teils proliferierender, teils atrophischer Schleimhaut. Diese Form der Lawsonien-Infektion wird heute nur noch selten gesehen. Die Tiere weisen eine stark eingeschränkte Ingestapassage auf und kümmern dementsprechend stark. Derart zurückgebliebene Tiere verlassen die Betriebe meist vorzeitig, und erscheinen nicht oder nur selten im Untersuchungsgut (POHLENZ 2005). 2.2.5 Porzine hämorrhagische Enteropathie Die akut verlaufende porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE) kommt meist bei Tieren im Alter zwischen 4-12 Monaten vor (LAWSON et al. 1977; BROWN et al. 2007). Am häufigsten sind Tiere aus Herden mit einem hohen Hygienestatus betroffen, wenn diese naiven Tiere im Rahmen einer Remontierung in eine infizierte Herde eingeführt werden (MCORIST u. GEBHART 1999). Die Körpertemperatur der betroffenen Tiere kann von subnormal bis erhöht variieren (POHLENZ 2005). Klinisch zeigt sich in den meisten Fällen ein schwarzer, teerähnlicher Kot mit nachfolgendem Durchfall. Die erkrankten Tiere kommen nach einer kurzen Episode blutigen Durchfalls und Anämie zum Festliegen und verenden aufgrund eines hypovolämischen Schocks. Plötzliche Todesfälle ohne auffälligen Kotbefund sind aber ebenfalls möglich. Die Hälfte der an PHE erkrankten und anämischen Tiere stirbt, die Überlebenden erholen sich zumeist nach kurzer Zeit (MACINTYRE et al. 2003). Es wird diskutiert, dass die PHE wie eine Hypersensibilitätsreaktion mit massiver Erregerausschüttung abläuft (LAWSON et al. 1977; BROWN et al. 2007). Bei der Sektion ist das Darmlumen mit Blutkoagula gefüllt. Die Schleimhäute sind verdickt und mit einem dünnen Fibrinfilm in Ileum, Colon oder Caecum bedeckt (WINKELMANN 1996). 16 Literaturübersicht In der Schleimhaut finden sich zahlreiche Diapedesen. Histologisch liegt das typische Bild der PPE im frühen Stadium vor, ein Zellzerfall mit Blutungen im Bereich der proliferierten Krypten dominiert (MCORIST u. GEBHART 1999). In fortgeschrittenen Fällen konnten Proliferationen auf einer Länge von bis zu 4,90 Meter vor der Papilla ilealis beobachtet werden (RÜDIGER-BÖSCH et al. 1986). 17 Literaturübersicht Tabelle 2: Vergleich der makroskopischen und histologischen Veränderungen bei Infektion des Darms mit LI oder PCV2 (JENSEN et al. 2006b) Pathologische Veränderungen LI PCV2 Nekrotisierende Ileitis und Kolitis + + Verdickung der Darmschleimhaut + + Verdickung der Darmmuskulatur + + Hämorrhagische Enteritis + + Ödem im Mesocolon - + Zottenatrophie + + Koagulationsnekrose + + verlängerte Krypten + + unreife proliferierte Enterozyten + - fehlende Becherzellen + - Histiozytose in der Lamina propria + + Histiozytose in lymphoidem Gewebe - + multinukleäre Riesenzellen + + lymphozytäre Depletion in lymphoidem + + Nekrose in lymphoidem Gewebe + + verzweigte Krypten + - Zytoplasmatische Einschlusskörperchen - + Makroskopisch Mikroskopisch Gewebe Legende: + Veränderung kommt bei dieser Infektion vor - Veränderung kommt bei dieser Infektion nicht vor 18 Literaturübersicht PPE Porzine Proliferative Enteropathie klinisch subklinisch akut subakut / chronisch Subklinische Ileitis PIA Porzine intestinale Adenomatose Krypthyperplasie epitheliale Hyperplasie PHE Porzine hämorrhagische Enteropathie NE Nekrotisierende Enteritis Hämorrhagie Nekrose epitheliale Hyperplasie Nekrose Fibrinauflagerungen epitheliale Hyperplasie RI Regionale Ileitis Granulationsgewebe Muskelhypertrophie epitheliale Hyperplasie Abbildung 3: ausgelösten Differenzierung der verschiedenen Formen der durch LI porzinen proliferativen Enteropathie (nach SIMS u. GLASTONBURY 1996; POHLENZ 2005) 2.3 Immunität Die PPE ist eine Schleimhautinfektion und somit sind die lokalen, sich an der Intestinalschleimhaut abspielenden Prozesse wahrscheinlich für das Bestimmung der Abwehrgeschehen von größter Relevanz (POHLENZ 2005). In immunhistochemischen Untersuchungen zur Lymphozytenpopulation mit der Sequenz von 3, 7, 14, 21, 28, 35 und 42 Tagen nach erfolgter experimenteller Infektion zeigten sich einerseits eine Reduktion von T- und B- Zellen, andererseits eine erhöhte Anzahl an aktivierten Makrophagen in der Darmschleimhaut. Im Einzelnen konnte im Vergleich von Tag 14 (maximale Läsionen) mit Tag 42 p.i. (abgeheilte Läsionen) zum erstgenannten Termin eine Reduktion der CD3-positiven Zellen (Lamina propria, Zotten), der CD8-positiven 19 Literaturübersicht Zellen (nur Zotten) und der B-Zellen festgestellt werden, während die Anzahl der CD4-positiven T-Zellen unverändert blieb. Am Tag drei waren erste neutrophile Granulozyten in den histologischen Schnitten zu erkennen. Aus diesen Ergebnissen wurde abgeleitet, dass bei einer Inokulation sieben Wochen alter Tiere mit Zellkulturerregern offensichtlich eine immunsuppressive „downregulation“ der adaptiven Immunantwort erfolgt. Die erhöhte Aktivität von Makrophagen und die damit potentiell verbundene exzessive Freisetzung von Zytokinen sehen die Autoren als mögliche Ursache für Endothelschäden und erhöhte vaskuläre Permeabilität bei der akuten, hämorrhagischen Verlaufsform der Erkrankung (MACINTYRE et al. 2003). LI scheint die immunologische Antwort aktiv zu beeinflussen. Infizierte Enterozyten exprimieren weniger major-histocompatibility-complex-II-Strukturen im Vergleich zu normalem Darmgewebe (MCORIST et al. 1992). Bei schweren Infektionen fehlt eine Reaktion von CD3-positiven Lymphozyten. Hierfür scheint eine Immunsuppression verantwortlich zu sein (SMITH u. LAWSON 2001). Basierend auf Erkenntnissen aus Infektions- und Feldversuchen liegen 1-2 Wochen zwischen Infektion und erster fäkaler Erregerausscheidung und 1-2 Wochen zwischen erstem Nachweis im Kot und Serokonversion (GUEDES u. GEBHART 2003b; VESTERGAARD et al. 2004). Der Serumtiter fällt fortschreitend nach Erreichen eines Maximums ab. Entsprechend stehen die Dauer des möglichen Antikörpernachweises und die Höhe des Titers in einem Zusammenhang zueinander (GUEDES 2004). Nach einer Infektionsstudie waren Tiere, welche eine LI Infektion durchgemacht hatten, bis zum Ende der Studie 10 Wochen später vor einer Reinfektion mit LI geschützt, es konnten nach erneutem Challenge keine klinischen Anzeichen oder eine Ausscheidung von LI mittels PCR nachgewiesen werden (COLLINS u. LOVE 2007). In einer Feldstudie zur Etablierung eines ELISAs zeigte sich, dass in den untersuchten Herden, welche einer natürlichen Infektion ausgesetzt waren, der Antikörpertiter kurz nach Beendigung der Erregerausscheidung am höchsten war. Der Titer konnte bei Tieren bis zu 22 Wochen nach dem Absetzen nachgewiesen werden. Bei den Herden kam es zu einem zweitem deutlichen Titeranstieg der LIspezifischen Antikörper zum Ende des Versuchs. Die Autoren hielten diesen Anstieg für einen Boosterungseffekt nach Zweitkontakt mit dem Erreger (BOESEN et al. 20 Literaturübersicht 2005b). Zu diesem Zeitpunkt konnte bei keinem dieser Tiere, eine Erregerausscheidung gefunden werden. Die Autoren schlossen hieraus, dass die Tiere nach einer Erstinfektion vor einer Reinfektion geschützt waren (BOESEN et al. 2005b). Zwischen der Höhe des Serumtiters und der Ausprägung von pathologischen Veränderungen konnte in einem Versuch bei Tieren 3 Wochen nach experimenteller Infektion kein statistischer Zusammenhang gefunden werden (GUEDES et al. 2002b). In einer Studie zur Evaluierung einer Vakzine mit einem lebenden, attenuierten Isolat von LI konnte gezeigt werden, dass eine protektive Immunantwort gegen LI nicht von einer humoralen Immunantwort abhängig ist (KROLL et al. 2004b). In dieser Untersuchung waren Tiere nach Vakzination gegen eine LI Infektion geschützt, obwohl bis fünf Wochen nach Vakzination keine LI-spezifischen IgG-Antikörper mittels IFAT nachgewiesen werden konnten. In einer späteren Untersuchung mit einem LPS-ELISA der Selben Seren konnten drei Wochen nach Vakzination Antikörper gegen LI in 53% der untersuchten Tiere nachgewiesen werden (Kroll et al. 2005a). In einem Experiment zu Evaluierung des IFAT (KNITTEL et al. 1998) konnten maternale Antikörper gegen LI bis zur sechsten Lebenswoche der Ferkel nachgewiesen werden. KROLL et al. (2005c) konnte in einer Infektionsstudie zeigen, dass maternale IgG Antikörper, welche im IFAT nachweisbar waren, einen Schutz für Ferkel bis zu einem Alter von sechs Wochen gegen eine Infektion mit LI boten. MAUCH und BILKEI (2004) untersuchten die LI-Infektionsrate von Ferkeln in Abhängigkeit von Alter und der Anzahl der vorangegangenen Geburten der Muttersauen. Nachkommen von seropositiven Jungsauen zeigten häufiger und länger positive Serotiter in Aufzucht und Mast (5.-26. Lebenswoche (LW), Maximum 84% zur 11. LW) als Nachkommen von seropositiven Altsauen (3.-5. Wurf, Maximum 32% zur 11. LW). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen scheinen Altsauen entweder nicht in ausreichender Menge Erreger auszuscheiden, oder ihre Nachkommen sind über maternale Antikörper besser passiv geschützt (BRONSVOORT et al. 2001; BARNA u. BILKEI 2003). 21 Literaturübersicht 2.4 Diagnostik 2.4.1 Klinik Eine variable aber generell kleine Gruppe von Tieren ist klinisch auffällig (Lawson et al. 1980). Viele Darmerkrankungen zeigen ähnliche Symptome wie die verschiedenen Formen einer LI-Infektion, entsprechend ist eine Diagnose immer durch eine pathologische- oder Labordiagnostische-Untersuchung abzusichern (LAWSON u. GEBHART 2000). Bei der RI können gelegentliche Todesfälle auftreten, das hypertrophe Ileum kann perforieren und die betroffenen Tiere verenden an einer daraus resultierenden Peritonitis (LOVE et al. 1977b). Im Verlauf der NE kann es zu hochgradigem Kümmern und dünnbreiigem bis wässrigem, gelb-braunen Kotabsatz kommen (LAWSON u. GEBHART 2000). In einem Infektionsversuch war es nur möglich, bei 75 % der Versuchstiere ein Durchfallgeschehen zu provozieren. Der überwiegende Anteil dieser Tiere zeigte unspezifischen, dünnbreiigen oder wässrigen Kotabsatz. Nur einzelne Tiere wiesen Blutbeimengungen im Kot auf. Der Durchfall begann etwa eine Woche nach der Infektion der Tiere und nahm seinen Höhepunkt zur dritten Woche post infectionem (p.i.). Bereits 28 Tage p.i. erholten sich die Tiere. Unter Feldbedingungen sind milde Durchfallgeschehen schwer zu erkennen (GUEDES et al. 2002b). Eine hyperplastische oder hypertrophe Enteritis kann auch ultrasonographisch diagnostiziert werden. Die Wandstärken im gesunden Dünndarm liegen bei 0,270,36 cm und im Dickdarm zwischen 0,21 und 0,23 cm, während bei einer chronischen Hypertrophie oder Hyperplasie des Darms die Wandstärken zwischen 0,28-0,70 cm im Ileum und 0,30 und 0,65 cm im Dickdarm liegen (BERMÚDEZ et al. 2000). 2.4.2 Pathologie Eine Infektion mit LI steht im direkten Zusammenhang mit einer hyperplastischen Zellproliferation der Epithelzellen (FRISK u. WAGNER 1977; ROBERTS et al. 1977; MCORIST et al. 1989; STILLS et al. 1991; MCORIST et al. 1993). 22 Literaturübersicht 2.4.2.1 Makroskopische Untersuchung Die makroskopische Untersuchung allein ist oft unergiebig und erlaubt nur eine Verdachtsdiagnose. Die Sensitivität und Spezifität makroskopischer Läsionen liegt bei 67 % bzw. 50 %. Eine makroskopische Untersuchung des Darms verlangt eine Bestätigung durch weitergehende diagnostische Methoden (HOLYOAKE et al. 1994; HUERTA et al. 2003). Aufgrund der schnellen Regeneration innerhalb von vier bis sechs Wochen sind zum Schlachtzeitpunkt nur noch selten Veränderungen zu finden. Für die Untersuchung an Schlachthöfen schlagen HARDGE et al. (2004) die Untersuchung durch zwei geschulte Untersucher vor. Für diese Sichtkontrolle ist die Zeit zwischen Tötung und Untersuchung von Bedeutung. Der Untersuchungszeitraum sollte zwischen der 30. bis 45. Minute post mortem liegen, um eine Verwechslung von hyperplastischer Schleimhaut mit einer postmortalen Kontraktion der Darmmuskulatur zu vermeiden. 2.4.3 Für Labordiagnostische Verfahren die diagnostische Absicherung einer LI-Infektion stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung. Derzeit kommen Antikörpernachweis im Serum, PCR in Kot und Gewebe und immunhistologische Untersuchungen in Gewebsschnitten zum Einsatz (Tab. 3). Die verschiedenen Tests können unterschiedliche epidemiologische Aspekte klären. Ein serologisch positiver Befund zeigt einen vorangegangenen Kontakt mit LI an, während Nachweise wie PCR oder Immunhistochemie eine derzeitig bestehende Infektion belegen (GUEDES 2004). 2.4.3.1 Indirect Immunofluorescent Antibody Test (IFAT) und Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA) Der erste serologische Test zum Nachweis von LI war ein indirekter Immunfluoreszenztest (immunofluorescence antibody test (IFAT)) (LAWSON et al. 1988). Dieser dient dem Nachweis von IgM- und IgG-Antikörpern. In verschiedenen Experimenten zeigte sich beim Nachweis einer Infektion eine höhere Sensitivität (90 %) und Spezifität (96 %) im Vergleich zur PCR. Maternale Antikörper konnten in diesen Experimenten für eine Dauer von bis zu 6 Wochen nachgewiesen werden 23 Literaturübersicht (BAKKER et al. 2000; DÜNSER et al. 2000; FOURCHON et al. 2000; MORTIMER et al. 2000; JUST et al. 2001; GUEDES et al. 2002b). Die Sensitivität und Spezifität wurden für den IPMA mit 89 % und 100 % angegeben (KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002a). Der IFAT reagierte nicht bei Tests mit Seren von Schweinen, die mit Brachyspira (B.) pilosicoli, B. innocens, B. hyodysenteriae, Salmonella (S.) Typhimurium, S. cholerasuis, Campylobacter (C.) mucosalis, und C. hyointestinalis infiziert waren. Ebenso zeigte auch der IPMA keine Kreuzreaktionen in Tests mit B. pilosicoli, B. hyodysenteriae, Escherichia coli (K88), C. mucosalis, C. jejuni, und C. coli (KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002a). 2.4.3.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Verschiedene ELISAs wurden untersucht und validiert. Ein Ganzzell-ELISA gewährleistet eine Sensitivität von 98 % und eine Spezifität von 99,3 % (BOESEN et al. 2005b). Als Antigen wurde LI, ID # 15540 (Boehringer Ingelheim) verwendet BOESEN et al. 2005b). KROLL et al. (2005a) entwickelten einen LPS-ELISA dieser zeigte in einer Infektionsstudie eine hohe Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 99,5%. Das Antigen für diesen ELISA wurde ebenfalls aus einer Kultur von ID # 15540 aufgereinigt. Desweiteren existiert ein Blocking-ELISA welcher eine Sensitivität und Spezifität von 96,46 % resp. 98,68 % gewährleistet (KELLER et al. 2006). Seit 2006 ist der Blocking-ELISA unter der Bezeichnung Enterisol®IleitisELISA (bioScreen, Münster/Svanova Biotech AB, Uppsala, Schweden) kommerziell erhältlich. Mit diesem Testkit kann der LI-Antikörpertiter sowohl im Serum als auch im Plasma bestimmt werden (KELLER et al. 2006). 2.4.3.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) Die Spezifität der PCR zum Nachweis von LI in Kotproben liegt bei nahezu 100 % (JONES et al. 1993c). Die Sensitivität dieser Technik liegt zwischen 39 und 72 % bei experimentell infizierten Tieren (KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002b). Die PCR kann verwendet werden, um Erreger ausscheidende Tiere, zu identifizieren. Allerdings ist es nicht möglich, mit LI infizierte Tiere welche den Erreger nicht ausscheiden, zu erkennen (JORDAN et al. 1999). Für ein positives PCR-Ergebnis wird eine Menge von mindestens 10³ Bakterien pro Gramm Kot benötigt (JONES et 24 Literaturübersicht al. 1993a, b, c). Die Probennahme ist entscheidend für die PCR-Diagnose. Kotproben von 0,1 g zeigten in einer Studie deutlich mehr positive Ergebnisse (21 %) als bei einer entsprechenden Probennahme mit Rektaltupfern (11 %) (JACOBSON et al. 2006). In experimentellen und Feldstudien wurde gezeigt, dass die Tiere 1-2 Wochen, bevor sie serokonvertierten, den Erreger ausschieden (GUEDES et al. 2002b; GUEDES u. GEBHART 2003b). Nach JENSEN et al. (2005) kann zwischen Erregerausscheidung und Serokonversion sogar ein Zeitraum von 2-6 Wochen liegen. Der Erreger wird etwa 7 Tage nach einer Erstinfektion erstmalig ausgeschieden und ab der 4. Infektionswoche findet nur noch eine intermittierende Ausscheidung statt (POHLENZ 2005). Diese intermittierende Ausscheidung bei subklinisch und chronisch infizierten Tieren kann zu falsch negativen Ergebnissen führen (KNITTEL et al. 1997; JORDAN et al.1999). Einige natürlicherweise im Kot vorkommende Substanzen können durch ihre inhibierende Wirkung auf die PCR ebenfalls zu falsch negativen Ergebnissen führen (LANTZ et al. 2000; JACOBSON et al. 2003). Eine Ausscheidung des Erregers kann auch ohne klinische oder mikroskopische Veränderungen nachgewiesen werden (KNITTEL et al. 1997; JORDAN et al. 1999). Im Falle einer subklinischen Lawsonien-Infektion besteht die Möglichkeit, dass eine Besiedelung des Darms stattgefunden hat, diese aber nicht umfangreich genug ist, um eine Diagnose mittels PCR oder Serologie stellen zu können (GUEDES 2004). Mit der Multiplex-PCR können simultan neben LI noch andere Darmpathogene wie Brachyspira (B.) hyodysenteriae, B. pilosicoli und Salmonella sp. nachgewiesen werden (ELDER et al. 1997; SUH u. SONG 2005; LA et al. 2006; NATHUES 2007). Zur schnellen Untersuchung großer Probenmengen steht eine real-time-PCR zur Verfügung. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei einer LI Zelle pro PCR tube, was einer fäkalen Ausscheidung von 4 x 104 LI Zellen pro Gramm Kot entspricht (LINDECRONA et al. 2002). 2.4.3.4 Histologie Die Anwendbarkeit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung ist auf Fälle, die erkennbare Proliferationen zeigen, beschränkt (GUEDES et al. 2002b). Eine pathohistologische Untersuchung von Sektionsmaterial mittels Hämatoxilin-Eosin-Färbung (HE) zeigt viele falsch negative Ergebnisse (55,6 %) und eine nur mäßige Übereinstimmung mit 25 Literaturübersicht PCR-Ergebnissen (53 %). Sie sollte daher nicht als alleiniges diagnostisches Mittel eingesetzt werden (HUERTA et al. 2003). Die Warthin-Starry-Färbung (WS) ist eine nicht für LI spezifische Färbemethode. Für eine sichere Diagnose müssen hier die Erreger im apikalen Zytoplasma von proliferierten Enterozyten gefunden werden (GUEDES et al. 2002b). JENSEN et al. (1997) halten die WS-Färbung nur für verlässlich, wenn Bakterien in eindeutig proliferierten Enterozyten gefunden werden. Mit einer modifizierten Ziehl-Neelsen-Färbung lassen sich Lawsonien in Darmteilen als Ziehl-Neelsen-positives, gebogenes und säurefestes Stäbchen darstellen. Die Ziehl-Neelsen-Färbung erreicht im Vergleich zur PCR lediglich eine Sensitivität von 55% (DÜNSER et al. 2003). Beide Färbemethoden sind aber nicht spezifisch und erlauben keine sichere Diagnose (ROWLAND 1978) Mit der Immunhistochemie hingegen ist es möglich, durch spezifisch bindende Antikörper Lawsonien sogar in Fällen starker Nekrosen, wenn die Mukosa vollständig zerstört ist, oder in Fällen, in welchen die Erreger nur noch im Zytoplasma mononukleärer Zellen in der Lamina propria zu finden sind, nachzuweisen (GUEDES et al. 2002b). Bereits 5 Tage nach einer Infektion kann LI mittels Immunhistochemie nachgewiesen werden (GUEDES u. GEBHART 2004).Die Immunhistochemie zeigt im Vergleich zur Warthin-Starry-Silberfärbung eine Sensitivität von 87 % (GUEDES et al. 2002b). In einer Studie von GUEDES und GEBHART (2004) waren von LI verursachte histologische Veränderungen nur zwischen dem 11. und 29. Tag p.i. zu finden. Bei drei Tieren, die 35 Tage nach Infektion untersucht wurden, waren keine histologischen Veränderungen mehr zu finden. Ebenso ist eine IH-Untersuchung dieser Tiere zu diesem Zeitpunkt negativ verlaufen (GUEDES u. GEBHART 2004). Entsprechende Ergebnisse lieferten JENSEN et al. (2005), in deren Studie Tiere, die noch 2-6 Wochen vor einer Sektion Erreger ausschieden, zum Zeitpunkt der Sektion keine auf LI hinweisenden pathologischen Veränderungen im Darm zeigten. 2.4.3.5 Immunomagnetic beads und ATP-Biolumineszenz Eine weitere immunologische Methode ist die Verwendung von spezifischen „immunomagnetic beads“ und ATP-Biolumineszenz. Hierfür werden sogenannte „magnetic beads“ mit LI-spezifischen Antikörpern (Lsa A) beschichtet, um damit Antigen in Kotproben zu binden. Die Auswertung erfolgt über eine 26 Literaturübersicht immunomagnetische Separation und ATP-Biolumineszenz. Diese Untersuchungen wurden am Kaninchen durchgeführt. (WATARAI et al. 2005). Tabelle 3: Übersicht zu den diagnostischen Möglichkeiten zum Nachweis von LI und spezifischer Antikörper beim Schwein (nach KROLL et al. 2005b) Technik HE WS-SilberFärbung IH / IFAT PCR Nachweis Vorteile Nachteile Referenz Krypthyperplasie, Nachweis von Zellveränderungen Zellveränderungen post- mortem-Diagnose Nachweis intrazellulärer Bakterien WARD und WINKELMAN (1990), nicht spezifisch; ROWLAND und post-mortem-Diagnose LAWSON (1992), JENSEN et al. (1997) schneller Nachweis von Bakterien im Gewebe Lawsonia intracellularis spezifisch; hoch sensitiv und Immunfluoreszenzspezifisch oder ImmunperoxidaseFärbung ante-mortemDiagnose; hoch spezifisch, Nachweis bestehender Infektion Lawsoniaund Ausscheidung, intracellulars-DNA- Nachweis Sequenz verschiedener Pathogene möglich, quantitativer Nachweis (real-time PCR) ROWLAND (1978) MCORIST et al. (1987), KNITTEL post-mortem-Diagnose, et al. (1997), monoklonale GUEDES u. Antikörper erforderlich GEBHART (2003c) geringe Sensitivität, mögliche Inhibition, mögliche Kreuzkontamination, mögliche falsch negative Proben GEBHART et al. (1991,1993), JONES et al. (1993c), COOPER (1996), COOPER et al. (1997), ELDER et al (1997), LINDECRONA et al. (2002), NATHUES (2007) IFAT Serum-IgG ante-mortemmanuelle Bestimmung KNITTEL et al. Diagnose; hoch nötig (1998) sensitiv und spezifisch IPMA Serum-IgG ante-mortemmanuelle Bestimmung GUEDES et al. Diagnose, hoch nötig (2002a) sensitiv und spezifisch Serum-IgG ante-mortemDiagnose, hoch sensitiv und spezifisch, automatische Bestätigung der Ergebnisse , hoher Materialdurchsatz ELISA Imunomagnetic Beads und ATP Antigen Biolumineszenz schnelle Methode für hohe Probenzahlen BOESEN et al. (2005b), KELLER et al. (2004), KROLL et al. (2005a) Methode noch nicht etabliert WATARAI et al. (2005) 27 Literaturübersicht Legende Tabelle 3 HE = Haematoxylin-Eosin-Färbung, WS = Warthin Starry, IH/IFAT = Immunhistochemie und Immunofluorescence Antibody Test, PCR = Polymerase Chain Reaction, IPMA = Immunoperoxidase Monolayer Assay, ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay 2.5 2.5.1 Kontroll- und Prophylaxe-Maßnahmen Desinfektion COLLINS et al. (2000a) konnten mit In-vitro- und Infektionsversuchen nachweisen, dass LI unter Feldbedingungen für einen Zeitraum von mehr als 2 Wochen infektiös bleiben kann. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Verunreinigungen mit Kot im Stall und auf Gerätschaften eine Quelle zur Neuinfektion frisch eingestallter Tiere darstellen. In In-vitro-Versuchen zeigten Desinfektionsmittel unterschiedliche Wirkungen auf LI (COLLINS et al. 2000a) (Tab. 4). Tabelle 4: Wirkung verschiedener Desinfektionsmittel gegen LI (COLLINS et al. 2000a). Leider Wirkstoff Wirkungseffektivität gegen LI Quarternäre Ammonium-Verbindung 3% Pyrovidone-Jodid 1% Kalium-Peroxymonosulfat 1% Phenolderivate 0,33% hoch wirksam mäßig wirksam nicht wirksam nicht wirksam gibt es keine Studie zur Wirkungsaktivität dieser oder anderer Desinfektionsmittel gegen LI unter Feldbedingungen (KROLL et al. 2005b). 2.5.2 Fütterung BOESEN et al. (2004) haben den Einfluss der Fütterung auf eine LI-Infektion untersucht. Es wurden die Effekte des Ansäuerns mit Milchsäure und des Fermentierens des Futters auf eine Besiedlung des Darms mit LI nach experimenteller Infektion geprüft. Die mittlere fäkale Erregerausscheidungsdauer war 28 Literaturübersicht bei Tieren, welche eine fermentierte Standardfütterung erhielten, signifikant geringer als bei Tieren, welche mit einer nicht fermentierten Standardfuttermischung gefüttert wurden. Die Autoren schlossen aus ihren Ergebnissen außerdem, dass ein fermentiertes Futter die erste Ausscheidung von LI auch verzögert. Die Tiere, deren Futter mit 2,4 % Milchsäure behandelt wurde, zeigten vier Wochen nach experimenteller Infektion weniger pathologische Veränderungen als die Kontrollgruppe, deren Futter mit 1,8 % Ameisensäure versetzt wurde (BOESEN et al. 2004). Der Einfluss der Konfektionierung des Futters auf die Prävalenz von LI im Darm von infizierten Schweinen wurde in verschiedenen Studien getestet. STEGE et al. (2001) konnten nachweisen, dass nicht pelletiertes Futter die Prävalenz von LI im Darm infizierter Schweine senken kann. In einem ähnlichen Versuch untersuchten MØLBAK et al. (2008), wie eine Pelletierung des Futters die Mikroflora des Darms beeinflusst. Zu diesem Zweck wurde die Mikroflora des Darms mit einer Real-time-PCR und in-situ-Hybridisation quantitativ bestimmt. Im Vergleich zur pelletierten Fütterung reduzierte die nicht pelletierte Fütterung scheinbar die Menge von LI relativ zur Gesamtmikroflora des Darms. Die Anzahl der Tiere, die LI ausschieden, blieb allerdings gleich. Inwieweit hierfür Veränderungen des intestinalen Milieus wie z.B. verringerter pH-Wert, unterschiedliche Morphologie der Darmschleimhaut und/oder ein veränderte Mikroflora verantwortlich sind, konnte hier nicht geklärt werden (MØLBAK et al. 2008). Bei fünf Tieren mit einer schweren LI-Infektion zeigten sich andere Restriktionsfragmente als bei Tieren mit einer milden Infektion. Hieraus schlossen die Autoren, dass eine LI-Infektion einen Einfluss auf die intestinale Flora hat (MØLBAK et al. 2008). WHITNEY et al. (2006b) untersuchten den Effekt einer Mais-Soja-Fütterung mit einem 10%igem Zusatz von getrockneter Getreideschlempe. Hierbei zeigte sich eine signifikante Verringerung der Schwere und Ausdehnung der pathologischen Veränderungen durch LI im Ileum und Colon im Vergleich zu einer herkömmlichen Mais-Soja Fütterung. Dieses Ergebnis konnte jedoch nicht reproduziert werden (WHITNEY et al. 2006a, c). Weiterhin konnte kein positiver Effekt auf durch LI verursachte pathologische Sojabohnenhülsen bzw. Veränderungen mit einem durch polyklonalem die Fütterung Antikörper von besprühte 29 Literaturübersicht Sojabohnenhülsen nachgewiesen werden. Tiere, welche mit Sojabohnenhülsen mit polyklonalem Antikörper gefüttert wurden, zeigten mehr ileale Veränderungen als die mit 10%igem Zusatz getrockneter Getreideschlempe gefütterte Tierguppe (WHITNEY et al. 2006c). 2.5.3 Antibiotische Behandlung Bei der Evaluation minimal inhibierender bzw. bakterizider Wirkstoffkonzentrationen in in-vitro-Versuchen konnte eine breite Wirksamkeit verschiedener antibiotisch wirksamer Medikamente gegen LI gezeigt werden. Diese Liste beinhaltet Makrolide, Tetracyclin, Pleuromutilin (Tiamulin), Penicillin und Fluoroquinolone. Keine Wirkung auf LI haben Aminoglykoside (Gentamicin, Neomycin und Apramycin) (MCORIST u. GEBHART 1995; MCORIST et al. 1995c). Unterschiede zwischen den einzelnen anzuwendenden Medikamenten bestehen in der Effizienz der intrazellulären Anreicherung des jeweiligen Arzneimittels. Wirkstoffe mit einem schmalen Wirkspektrum sind gegenüber Breitspektrumantibiotika im Grundsatz zu bevorzugen, da somit eine geringere Beeinflussung der physiologischen Keimflora und ein geringerer Selektionsdruck auf kommensale Keime erfolgt (BODE et al. 2000). Eine antibiotische Behandlung kann durch ihre Dosierung und die zeitnahe Anwendung zum Infektionszeitpunkt die immunologische Reaktion, die Dauer und Stärke der Erregerausscheidung sowie die Ausprägung der LI-spezifischen Läsionen beeinflussen. (WALTER et al. 2001). In Bezug auf eine Serokonversion unter Behandlung mit gegen LI wirksamen Antibiotika gibt es kontroverse Beschreibungen. Während einige Autoren ein Ausbleiben der Immunreaktion unter antibiotischer Behandlung beobachteten (COLLINS et al. 2000b; GUEDES et al. 2002b), konnten RITZMANN et al. (2004) eine Serokonversion bei einer Behandlung mit Tiamulin und NATHUES (2007) eine Serokonversion unter Behandlung mit Tylosin aufzeigen. In Deutschland sind derzeit mehrere Medikamente mit bakteriostatischem Wirkprinzip zur Behandlung der Ileitis beim Schwein zugelassen, welche die folgenden Wirkstoffe enthalten: Acetylisovaleryltylosin, ein Kombinationspräparat mit Lincomycin und Spectinomycin, Tiamulin, Tylosin und Valnemulin (Stand 04.06.2007) (UNGEMACH et al. 2007). 30 Literaturübersicht In einer aktuellen Studie wurden minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentrationen (MIC) für LI ermittelt (WATTANAPHANSAK et al. 2007). Die MIC wurde hier definiert als die Wirkstoffmenge, mit der 99 % der proliferativen Veränderungen in einer Zellkultur im Vergleich zur wirkstofffreien Kontrolle verhindert werden konnten. Tabelle 5: Minimale inhibitorische Wirkstoffkonzentrationen für LI (WATTANAPHANSAK et al. 2007) Antimikrobieller Wirkstoff Carbadox Chlortetracyclin Lincomycin Tiamulin Tylosin Valnemulin 2.5.4 europäische Lawsonia-intracellularis Isolate (n=4) intrazellulär MIC extrazellulär MIC (µg/ml) (µg/ml) 0,125 1 bis 4 0,25 bis 16 16 bis 64 8 bis 64 32 bis 128 0,125 1 bis 4 0,5 bis 2 2 bis 16 0,125 0,125 bis 0,25 Vakzine Eine effektive Vakzine muss gegen verschiedene Stämme des Erregers wirksam sein. Im Fall von LI wird derzeit angenommen, dass es sich bei diesem Erreger um einen einzelnen, monotypen Bakterienstamm ohne wesentliche genotypische Variation handelt (MCORIST et al. 2003). Western-Blots von sechs verschiedenen antigenwirksamen äußeren Membranproteinen von 77, 69, 54, 42, 36, und 18 kDa reagierten immer gleich auf monoklonale Antikörper und konvaleszentes Serum von Schweinen, die vorher Kontakt zu LI hatten (MCORIST et al. 1987; GUEDES u. GEBHART 2003c). Monoklonale Antikörper gegen Oberflächen-Antigen von LI werden in histologischen Tests angewendet. Mit diesen konnten bisher erfolgreich verschiedene Feldisolate von infiziertem Darmgewebe verschiedener Tierarten nachgewiesen werden (SMITH 2001; BOESEN et al. 2005a). Japanische Forscher konnten bei der Prüfung drei verschiedener Genfragmente eines japanischen LI-Isolates jeweils eine Homologität von mehr als 99 % mit einem Typstamm (NCTC 12656T) feststellen (KOYAMA et al. 2004). Diese Ergebnisse lassen eine sehr hohe genetische Ähnlichkeit erkennen. 31 Literaturübersicht Derzeit ist ein avirulenter Lebendimpfstoff (Enterisol®Ileitis, Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., Ingelheim) kommerziell verfügbar. Dieser Impfstoff dient der Anwendung bei Ferkeln, die mindestens drei Wochen alt sind, um sie gegen durch LI verursachte Krankheitserscheinungen zu schützen (KROLL et al. 2004b). Dieser Impfstoff stimuliert die zellvermittelte Immunität beim Schwein (KNITTEL u. ROOF 1999; KROLL et al. 2004b). Die Verabreichung erfolgt über das Trinkwasser oder direkte orale Gabe mittels Drenchen. Die Prävalenz und der Schweregrad von makroskopischen und mikroskopischen Veränderungen, die Besiedlung des Gewebes und die fäkale Ausscheidung von LI konnten signifikant vermindert werden. Außerdem zeigten geimpfte Tiere im Vergleich zu ungeimpften Tieren in einem Infektionsversuch eine signifikant verbesserte tägliche Zunahme (KROLL et al. 2004b). Der Impfschutz beginnt 3-4 Wochen nach Impfung und hält für mindestens 22 Wochen an (KROLL et al. 2004a). Nach einer aktuellen Feldstudie konnte bei Zuchttieren ein Impfschutz über die Dauer von mindestens 3,5 Jahren nachgewiesen werden (SANDFORD 2006). Verschiedene Studien haben die Wirksamkeit des Impfstoffes und einen signifikanten Nutzen für Wachstumsleistung und Reduktion der Mortalitätsrate gegenüber einer natürlichen Infektion mit LI nachgewiesen (HAYES u. KOLB 2002; KEÏTA et al. 2004; KOLB et al. 2004). Die Sicherheit des Impfstoffes konnte bei tragenden Sauen (KROLL et al. 2005c), bei Mehrfach-Impfungen von Schweinen und Überdosierungen bei Ferkeln im Alter von einer Woche belegt werden (KROLL et al. 2004a). 32 Material und Methoden 3 3.1 Material und Methoden Bestand und Versuchsgruppe Als Versuchsbetrieb wurde ein landwirtschaftlicher Betrieb ausgewählt, bei dem es sich um einen Jungsauenvermehrerbetrieb (BHZP, DLxDE) handelt, in dem außerdem die kastrierten männlichen Ferkel als Mastschweine aufgezogen wurden. Die Diagnose einer Infektion mit LI wurde durch den behandelnden Bestandstierarzt gestellt und durch eine serologische Untersuchung mittels Blocking-ELISA (bioScreen European Veterinary Disease Management Center GmbH, Münster) bestätigt. Hierfür wurden 5 Jungsauen, 5 Altsauen, 5 Tiere 3-4 LW, 10 Tiere 8-10 LW, 10 Tiere 13 LW, 10 Tiere 18 LW und 5 Tiere 24 LW untersucht. Bei dieser Untersuchung der verschiedenen Altersgruppen wurde eine Serokonversion zur 13. LW innerhalb des Versuchsbetriebs festgestellt. Die LI-Infektion im Betrieb zeigte eine subklinische Verlaufsform. Klinische Symptome waren dem Betriebsleiter, abgesehen von unspezifischem Auseinanderwachsen bei einzelnen Tieren, nicht aufgefallen. Dies wurde durch einen Bestandsbesuch vor Beginn der Studie bestätigt. Zu dem Projekt liegt eine Genehmigung zur Durchführung von Tierversuchen von der Bezirksregierung Detmold vor (AZ 50.05 03.1.1 (I/05)). Parallel zum Versuchsbeginn (30.05.05) wurde im Betrieb eine Impfung gegen LI eingeführt (Enterisol®Ileitis, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Inc., Ingelheim 2 ml/Tier). Die Versuchstiere blieben hiervon unberührt. Alle Tiere im Betrieb wurden beim Absetzen gegen Mycoplasma hyopneumoniae geimpft (Ingelvac M.hyo®, Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., Ingelheim, 2 ml/Tier), eine Impfung gegen PRRSV (Ingelvac® PRRS MLV, Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., Ingelheim, 2 ml/Tier) wurde bei allen Tieren zur 9. Lebenswoche vorgenommen. Aus einer am 30.05.05 abgesetzten Gruppe von 120 kastrierten Ferkeln im Alter von 28 Tagen wurden 60 Tiere nach dem Zufallsprinzip für die Versuchsgruppe ausgewählt. Nach klinischer Untersuchung und individueller Markierung mit Ohrmarken wurden die Schweine gewogen und in 6 Boxen zu je 10 Tieren im Flatdeck (MIK-Kunststoffroste, Abb. 4) aufgestallt. Die Probenentnahme fand immer 33 Material und Methoden in gleich bleibender Reihenfolge, beginnend mit Box eins und endend mit Box sechs statt. Die restlichen Buchten dieses Stallabteils waren mit gegen LI geimpften Tieren, welche nicht am Versuch teilnahmen, belegt. Als Kontrolltiere für die pathohistologischen Untersuchungen dienten 5 gesunde Schweine aus dem Sektionsgut des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, die keine darmpathogenen Erreger aufwiesen. Abbildung 4: Belegungsplan im Flatdeckabteil des Versuchsbetriebes Box 3 Box 2 Box 1 OM 23-36 OM 13-22 OM 1-12 geimpft PIA geimpft PIA geimpft PIA geimpft PIA geimpft PIA Stallgasse Box 4 Box 5 Box 6 OM 37-47 OM 48-57 OM 58-70 geimpft PIA Legende: geimpft PIA = gleichaltrige gegen LI geimpfte Schweine, 10 Tiere je Box; OM = Ohrmarke (einzelne Marken fehlten in numerischer Reihenfolge) Alle Versuchstiere wurden unter gleichen Bedingungen aufgestallt und gefüttert. Am 12.07.05 wurden die Tiere in den Mastbereich umgestallt und gemeinsam in eine Großbucht (Betonspaltenboden) verbracht. Die Tiere wurden bis 14 Tage nach dem Absetzen mit einem handelsüblichen Ferkelaufzuchtfutter (Fa. Agravis Raiffeisen AG, Paderborn-Kernstadt) ad libitum über den Trog gefüttert. Daran anschließend wurde ein mit Titandioxid (1 g Titandioxid je kg Futter) markiertes Ferkelaufzuchtfutter entsprechend eingesetzt (Fa. De Heus-Sondag Voeders, NL). Mit der Umstallung am 12.07.05 wurde auf ein ebenfalls mit Titandioxid (1 g Titandioxid pro kg Futter) markiertes Mastfutter (Fa. De Heus-Sondag Voeders, NL) umgestellt, die Tiere wurden wiederum ad libitum gefüttert. Das Titandioxid wurde als Marker für eine parallel verlaufende Untersuchung zur Verdaulichkeit genutzt (Institut für Ernährungswissenschaften der Martin Luther Universität Halle-Wittenberg, Prof. Dr. M. Rodehutscort). 34 Material und Methoden 3.2 Klinische Untersuchung Die Versuchsgruppe wurde zwischen der 6. und 16. Lebenswoche (LW) wöchentlich sowie zur 20., 26. und 27. Lebenswoche klinisch untersucht (Tab. 6). Bei der klinischen Untersuchung wurde das Allgemeinbefinden Verhalten der Tiere, Ernährungszustand, Futter-/Wasseraufnahme, Haut, Haarkleid, Körpertemperatur, Bewegungsapparat Untersucht. Die Kotkonsistenz wurde während der Entnahme bei jedem Tier kontrolliert. Bei Verdacht auf eine Erkrankung wurden Einzeltiere ggf. einer speziellen Untersuchung unterzogen. Außerdem wurde die Umgebung der Tiere geprüft (Stallklima, Durchfallkot, Fütterungs- und Tränketechnik). Datum Tiertrans- port Datum Sektion x 6 60 x x x 15.06. 7 60 x x x 22.06. 8 60 x x x 5 29.06. 01.07. 04.07. 9 55 x x x 5 06.07. 08.07. 11.07. 10 49* x x x 5 13.07. 15.07. 18.07. 11 44 x x x 5 20.07. 22.07. 25.07. 12 38** x x x 6 27.07. 29.07. 01.08. 13 33 x x x 5 03.08. 05.08. 08.08. 14 28 x x x 5 10.08. 12.08. 15.08. 15 23 x x x 5 17.08. 19.08. 22.08. 16 18 x x x 5 24.08. 26.08. 29.08. 20 13 x x x 21.09. 26 13 x x x 02.11. 27 13 x 11.11. 14.11. 28 8 x x x x Datum Bestandsuntersuchung Probenentnahme x Sektion Anzahl der Tiere (n) Wiegung 60 ELISA Serologie klinische Kontrolle 4 PCR (LI Nachw. im Kot) Anzahl der Tiere (n) Zeitplan für die Untersuchung und Probenentnahme Alter in Wochen Tabelle 6: 30.05.05 5 x 25.11. Schlach -tung 494 494 51 Legende: * 1 Schwein mit Gliedmaßenfraktur euthanasiert (keine Sektion) ** 1 Schwein aufgrund eines Mastdarmvorfalls euthanasiert (Sektion) 35 Material und Methoden 3.2.1 Probenentnahme Die Tiere wurden einzeln fixiert, hierzu wurde entweder ein Blutentnahme-Bock oder eine Drahtschlinge verwendet. Die Kotproben wurden mittels Einmalhandschuh rektal entnommen und in ein verschließbares Kunststoffgefäß überführt und mit der entsprechenden Tiernummer versehen. War bei einzelnen Tieren nicht ausreichen Kot zu entnehmen wurden diese markiert, und zu einem späteren Zeitpunkt im Verlauf der Untersuchung wiederholt beprobt. Auf diese Weise konnte in dieser Untersuchnung immer ausreichend Probenmaterial gewonnen werden. Nach Beendigung der Probenentnahme wurden die gesammelten Kotproben bei einer Temperatur von 4°C für den Transport gelagert. Der Zeitraum für den Transport der Proben bis in die Tierärztliche Hochschule Hannover betrug zwischen 3 und 4,5 Stunden. Die folgenden Beurteilungen der Kotkonsistenz waren möglich: 0 = unauffällig, 1 = dickbreiig, 2 = dünnbreiig und 3 = wässrig. Im Labor wurde der Kot mit einem Einmalholzspatel in ein Eppendorfgefäß (Eppendorf AG, Hamburg) überführt und bei -20 °C bi s zur Untersuchung eingefroren. Um eine Kreuzkontamination der Proben untereinander zu vermeiden, wurde die Überführung unter einer Abzugshaube durchgeführt, hierbei wurden Einmalhandschuhe getragen, welche immer im Falle einer Verschmutzung, jedoch mindestens nach 5 Proben gewechselt wurden. Entsprechend wurde eine Zwischenreinigung mit Zellstofftüchern mit einer anschließenden Desinfektion mit 70 %igem Alkohol des Arbeitsplatzes vorgenommen. Die Proben wurden bei -20 °C bis zur Untersuchung gelagert. Alle Blutproben wurden mittels einer sterilen Serummonovette (Fa. Sarstedt AG, Nümbrecht) aus der Vena jugularis externa oder Vena cava cranialis entnommen, bei 4 °C gekühlt transportiert und bei 5000 U/min (2000 g) für 15 Minuten zentrifugiert. Das Serum wurde anschließend unter Verwendung von Einmal-Pipettenspitzen (Eppendorf Ag, Hamburg) in Reaktionsgefäße überführt und bei -20 °C bis zur Untersuchung gelagert. In festgelegten Abständen, die dem Besuchsprotokoll (s. Tab. 6) zu entnehmen sind, wurden die Tiere gewogen. 36 Material und Methoden 3.3 PCR 3.3.1 DNA-Extraktion aus Kotproben Zur DNA-Extraktion aus den Kotproben wurde ein „QIAamp DNA Stool Mini kit“ gemäß Herstellerangaben benutzt (Fa. Qiagen GmbH, Hilden). Die Extraktion wurde in einem eigens für diesen Zweck eingerichteten Raum durchgeführt. Für jeden einzelnen Arbeitschritt wurden neue, nicht sterile Einmalhandschuhe verwendet, die vor Benutzung mit 70 %igem Alkohol desinfiziert wurden. Alle für die Durchführung der Extraktion notwendigen Gefäße wurden vor Benutzung sterilisiert. Die Extraktion der Proben wurde auf mehrere Durchgänge von jeweils bis zu 20 Proben aufgeteilt. Bei jeder Extraktion wurde jeweils eine Positiv- und NegativKontrolle mitgeführt. Als Positiv-Kontrolle wurden nur solche Proben mitgeführt, die vorher dreimal mittels einer separaten PCR ein positives Ergebnis geliefert hatten. Nach Durchführung der Extraktion wurde die PCR unmittelbar im Anschluss durchgeführt. Anschließend wurden die DNA-Proben bei -20 °C eingelagert. 3.3.2 Protokoll • Abwiegen der Proben (180 – 220 mg Kot), Zwischenlagerung auf Eis • Lysieren in 1,4 ml ASL-Puffer, eine Minute vortexen • Zur Inkubation für 5 Minuten bei 70 °C im Wasserba d erwärmen, 15 Sekunden vortexen, zentrifugieren für eine Minute bei 20.000 g, 1,2 ml des Überstands abpipettieren und Pellet verwerfen • Zum Absorbieren von inhibitorisch wirkenden Stoffen eine InhibitEx-Tablette hinzufügen und vollständig suspendieren, eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren • Zum Entfernen von Inhibitoren, zentrifugieren bei 20.000 g für 3 Minuten, Überstand abpipettieren, Pellet verwerfen, Überstand in neues Gefäß überführen und ein weiteres mal zentrifugieren • Denaturierung der Proteine, 15 µl Proteinkinase K, vortexen für 5 Sekunden, 200 µl Al-Puffer hinzufügen, 15 Sekunden vortexen, inkubieren bei 70 °C im Wasserbad für 10 Minuten 37 Material und Methoden • Ausfällen und Binden der DNA an Kieselgelmembran der QIAmp spin column, 200 µl Ethanol (96-100 %) hinzufügen und für 15 Sekunden vortexen, Lysat in QIAmp spin column überführen • Waschen der DNA und Entfernen von Fremdstoffen an der Kieselgelmembran der QIAmp spin column, 500 µl AW1-Puffer hinzufügen und bei 20.000 g für eine Minute zentrifugieren • Zweiter Waschschritt, 500 µl AW2-Puffer hinzufügen und für 3 Minuten bei 20.000 g zentrifugieren • Eluieren der DNA, 200 µl AE-Puffer hinzugeben, eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend bei 20.000 g für eine Minute zentrifugieren 3.3.3 Replikation der DNA mittels PCR Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µl pro Probe angesetzt. Es wurden die Primer A (5’-TAT GGC TGT CAA ACA CTC CG-3’) und B (5’-TGA AGG TAT TGG TAT TCT CC-3’) (Fa. Carl Roth, Karlsruhe) aus einem bp-Segment des LIspezifischen p78-DNA-Klons gewählt. Sie entsprechen den Nukleotiden 5-24 und 304-323 (GEBHART et al. 1991). Die Sequenz ist in der Genbank unter der Nummer L08049 zu finden. Der Mastermix wurde in einem speziellen Raum unter einer Hera-SafeSicherheitswerkbank (Fa. Kendro Laboratory Products GmbH, Hilden) angemischt. Beim Ansetzen des Mastermixes wurde zusätzlich eine Negativ-Kontrolle mitgeführt. Die Sterilbank wurde in regelmäßigen Abständen für 30 Minuten mit UV-Licht bestrahlt, um Kontaminationen mit Nukleasen und Fremd-DNA zu vermeiden. Für den Mastermix wurden je Probe 2,5 µl 10xPuffer MgCl² 15 mMol, 1 µl MgCl² 25 mMol, 1 µl Primer A 10 mMol, 1 µl Primer B 10 mMol, 1 µl DNTP (Fa. Finnzymes Oy Espoo, Finnland) 10 mMol, 0,1 µl HotStarTaq® (Fa.Qiagen GmbH, Hilden) sowie H2O ad 22,5 µl benutzt. In den Mastermix kamen 2,5 µl der DNA-Probe, dieses wurde wieder in einem anderen Raum durchgeführt. Für die PCR wurde ein Eppendorf-Mastercycler (Fa. Eppendorf AG, Hamburg) verwendet. Es wurden folgende Schritte durchgeführt: Denaturierung 10 Minuten bei 94 °C 38 Material und Methoden 35 Zyklen aus folgenden 3 Schritten: 40 s bei 94 °C 40 s bei 55 °C 40 s bei 72 °C Nach Beendigung der Zyklen folgten 7 Minuten bei 72 °C zur Elongation der noch unvollständigen Stränge. Anschließend wurden die Proben bis zur Entnahme aus dem Cycler auf 4 °C heruntergekühlt. 3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese Für die Agarose-Gelanalyse der DNA-Banden wurden Horizontalgele mit einer Konzentration von 2 % Agarose verwendet. Das Agarose-TAE-Puffergemisch wurde im Mikrowellenherd bis zum Kochen erhitzt und nach Abkühlung auf 50 °C mit 16,5 µl Gel-Star (Nucleic Acid Gel Star 10.000 x Konzentration in DMSO, Fa. Carbex Bio Science Rockland Inc. Rockland, ME USA) durchmischt und in die gereinigten Kammern gegossen. Nach der Polymerisierung des Gels wurden die Kämme herausgezogen, und das Gel mit 1 x TAE-Puffer übergossen. Die Proben wurden mit 2 µl Blaumarker versetzt und vor Eingabe in die Geltaschen gründlich durchmischt. Die Elektrophorese lief 90 Minuten mit 4-5 Volt pro Zentimeter Lauflänge. 3.3.5 Das Auswertung der Gele 319 bp große Blaulichttransilluminator DNA-Fragment war nach Anregung mit einem (Flu-o-blu, Fa. Biozym Scientific GmbH, Hessisch- Oldendorf) als orangerote Bande sichtbar und wurde mit einer Digitalkamera dokumentiert. Die Banden traten immer einzeln und in der zu erwartenden Länge auf, lediglich die Signalstärke variierte und ließ sich nicht immer mit der Kamera darstellen. Zur Auswertung kamen ausschließlich Gele, bei denen die positiven Kontrollen eindeutig auszuwerten waren. Proben, deren Banden eine Länge von 319 bp aufwiesen, wurden positiv, und Proben, welche keine Banden aufwiesen, negativ beurteilt. 39 Material und Methoden 3.4 Serologie 3.4.1 Kompetitiver Enzyme Linked Immunsorbent Assay Für die Antikörperbestimmung im Blutserum wurde der kommerziell erhältliche Enterisol®Ileitis-ELISA (Fa. bioScreen, Münster/Svanova Biotech AB, Uppsala, Schweden) verwendet. Hierbei handelt es sich um einen Blocking-ELISA. Die benötigten Versuchskits wurden bei 5 °C bis zu ihre r Verwendung gelagert. Der Versuchsansatz wurde bei 37 °C für 60 Minuten in ei nem Inkubator behandelt. Nach dem Auftauen wurden die Proben für wenige Sekunden anzentrifugiert, um vorzubeugen, dass eventuelle korpuskuläre Bestandteile die Versuchsreaktion stören. Alle Befüllungs- und Waschschritte dieses Versuchs fanden immer in gleich bleibender Reihenfolge statt. Nach Befüllung, der mit einem inaktivierten Antigen beschichteten Mikrotiterplatte mit je 90 µl Proben-/Konjugat-Verdünnungspuffer, wurden je 10 µl des Probenserums, sowie des Positiv- und Negativ-Kontrollserums (im Doppelansatz), in die entsprechenden Vertiefungen gegeben. Um nachträgliche Kontaminationen zu vermeiden, wurde die Mikrotiterplatte mit einem durchsichtigen Klebestreifen versiegelt. Eine gründliche Vermischung wurde mit einem Schüttler für 15 Sekunden bei 300 Bewegungen pro Minute hergestellt. Der Versuchsansatz wurde bei 37 °C für 60 Minuten in einem Inkubator behandelt. Nach der Inkubation wurden die Reaktionsvertiefungen mit einem Multi-Reagent-Washer (MRX, Fa. Dynatech Med. Prod. Ltd., Guernsey, Channel Island, Great Britain) dreimal mit dem beigefügtem PBS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) gespült und die Flüssigkeit jedes Mal gründlich entfernt. Anschließend wurde in jede Reaktionsvertiefung 100 µl anti-LI-mAb-HRP-Konjugat gegeben und wieder für eine Stunde bei 36 °C inkubi ert. Die vorangegangenen Waschschritte wurden wiederholt und 100 µl Substratlösung (Tetramethylbenzidin) in die Reaktionsvertiefungen gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde mit der Substratlösung für 10 Minuten bei 22 °C inkubiert, hierbei fand eine Blaufärbung der Reagenzien in der Mikrotiterplatte statt. Mit der Befüllung der ersten Reaktionsvertiefung begann die Zeitmessung. Nach 10 Minuten wurden 50 µl Stopplösung (Schwefelsäure 2 Mol) beigefügt, es erfolgte ein sofortiger Farbumschlag von blau nach gelb. 40 Material und Methoden Die Messung der Extinktionswerte fand unmittelbar nach Zufügen der Stopplösung statt. Hierzu wurde ein Microplate Reader (MRX, FA. Dynex Tech. Inc., Denkendorf) bei 450 nm verwendet. Zur Berechnung der Inhibition in Prozent (PI) wurden die Extinktionswerte (optische Dichte, OD) gemessen und nach folgender Formel verrechnet: PIProbe = (ODNegativ-Kontrolle – ODProbe) x 100 / ODNegativ-Kontrolle Der PI-Wert der positiven Kontrolle wurde entsprechend des OD-Wertes der Probe berechnet: PIPositiv-Kontrolle = (ODNegativ-Kontrolle – ODPositiv-Kontrolle ) x 100 / ODNegativ-Kontrolle Zur Kontrolle der korrekten Testdurchführung wurden folgende Werte überprüft: positives Kontrollserum: PI-Wert > 40 negatives Kontrollserum: OD-Wert > 0,5 Die Ergebnisse wurden wie folgt beurteilt: PI ≥ 30 % Probe ist positiv PI < 30 % Probe ist negativ Probe ist fraglich, wenn PI zwischen ≥ 20% und < 30 % liegt. Für die Beurteilung der Testergebnisse wurden fragliche Ergebnisse als negativ angesehen. 3.5 Pathomorphologische Untersuchungen 3.5.1 Sektion Wöchentlich wurden im Anschluss an die Labordiagnostischen Untersuchungen 5 Tiere, per Losverfahren, für die Sektion bestimmt. Die Tiere wurden durch die Klinik für kleine Klauentiere freitags abgeholt und bis zum jeweiligen Montag in der Klinik in einer separaten Bucht eingestallt. Die Tiere wurden in dieser Zeit strohlos auf planbefestigtem Betonboden gehalten. Die Fütterung erfolgte ausschließlich mit dem durch Titandioxid markierten Futter, welches wöchentlich aus dem Betrieb mitgebracht wurde, um einen Futterwechsel zu vermeiden. Mit der Einstallung wurden die Tiere einer Allgemeinuntersuchung unterzogen, hierbei wurden das Verhalten der Tiere, Ernährungszustand, 41 Material und Methoden Futter-/Wasseraufnahme, Haut, Haarkleid, Körpertemperatur, Bewegungsapparat, Herz-Kreislauf und Atmungsapparat, sowie ggf. Kot- und Harnabsatz beurteilt. Montags wurden die Tiere nach der morgendlichen Fütterung in das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover transportiert. Die Tiere wurden einzeln vom Transportanhänger getrieben und erst unmittelbar vor der Sektion mittels Elektrozange betäubt und anschließend durch Kopf-KörperDurchströmung ein Herzstillstand herbeigeführt. Auf diese Weise wurde bei allen Versuchstieren gewährleistet, dass die Gewebeproben innerhalb einer Stunde nach dem Tod des Tieres entnommen und in 5 %igem Formalin fixiert werden konnten. Nach einer äußeren Besichtigung des Tierkörpers wurde die Bauchhöhle paramedian eröffnet, sowie auf abnormalen Inhalt und Abweichungen hinsichtlich Lage und Aussehen der Organe beurteilt. Nach Eröffnung des Tierkörpers wurde vom terminalen Ileum nach kranial 1-2 Meter abgebunden, die Länge richtete sich nach der Füllung des Jejunums. Pro Probe wurden mindestens 100 g Ingesta für die Verdaulichkeitsbestimmungen entnommen. Die Ingestaproben wurden bei -20 °C gelagert. Stichprobenweise wurden Kotproben zur parasitologischen Untersuchung entnommen (Tab. 13). Bei der eingehenden makroskopischen Besichtigung der gesamten Darmschleimhaut wurden folgende Parameter für jeden Darmabschnitt bezüglich morphologischen Veränderung, deren Verteilungsmuster und Ausprägungsgrad untersucht: -Konsistenz des Darminhalts bzw. Kotkonsistenz -blutiger Darminhalt -Verdickungen der Mukosa -Qualität der Veränderungen der Mukosa (fibrinös, nekrotisch, proliferativ, ödematös) Nach eingehender Untersuchung wurden Proben (Tab. 7) entnommen und unmittelbar in 10 %igem, nicht gepuffertem Formalin (Fa. CVH Chemie Vertrieb, Hannover) fixiert. 42 Material und Methoden Tabelle 7: Probenplan für die Sektion Jejunum 3 Proben über das gesamte Jejunum verteilt Ileum 10 cm vor der Papilla ilealis Ileum Lokalisation mit ggf. makroskopisch auffälligen Veränderungen Caecum 5 cm nach der Papilla ilealis Caecum Lokalisation mit ggf. makroskopisch auffälligen Veränderungen Lnn. jejunales u. Tonsilla veli jeweils eine Probe palatini Colon ascendens 10 cm nach der Papilla ilealis Colon ascendens Lokalisation mit ggf. makroskopisch auffälligen Veränderungen 3 Proben über das gesamte Colon descendens Colon descendens verteilt Papilla ilealis und Lnn. jeweils eine Probe Ileocolici Außerdem wurde der gesamte Tierkörper makroskopisch auf pathologische Veränderungen untersucht. 3.5.2 Gewebeproben für die lichtmikroskopische Untersuchung Eine Fixation der Gewebeproben zur nachfolgenden Herstellung von Paraffinblöcken fand in 10 %igem, nichtgepufferten Formalin statt. Nach einer Fixationszeit von 24 Stunden wurden die Gewebeproben makroskopisch begutachtet und entsprechend dem vorgegebenen Probenplan (Tab. 7) geschnitten. Die Entwässerung und Einbettung der fixierten Gewebeproben erfolgte nach einem standardisierten Laborprotokoll mit Hilfe eines (Pathcentre, Cooperation, Fa. Thermo Electron Gewebeeinbettungsautomaten Dreieich) in Paraffinwachs (Histokomb Plus®, Fa. Vogel, Gießen). Die Lagerung fand bei Raumtemperatur statt. 43 Material und Methoden Aus den Paraffinblöcken wurden mit einem Schlittenmikrotom (Fa. Microm, Heidelberg) 4 µm dicke Schnitte angefertigt, in einem Wasserbad bei 55 °C gestreckt, auf Glasobjektträger (Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000, Fa. MEDITE, Burgdorf) aufgezogen und bei 37 °C im Wärmeschrank getrocknet. Nach der Entparaffinierung in einer absteigenden Alkoholreihe wurden die Präparate mit der Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung in einem Färbeautomaten (Fa. Leica Microsystems, Nussloch GmbH, Nussloch) gefärbt. 3.5.3 Mikroskopische Beurteilung der HE-gefärbten Schnitte Zur Quantifizierung der durch LI verursachten pathohistologischen Veränderungen wurde ein Scoring-System etabliert (Tab. 8). Die Beurteilung wurde abschnitts- und parameterweise durchgeführt. Jeder der 10 Beurteilungsparameter wurde zuerst für eine Lokalisation beurteilt, bevor ein neuer Parameter begutachtet wurde. Für die Bewertung des jeweiligen Scores wurden pro Parameter 5 zufällig ausgewählte Bildausschnitte beurteilt und anschließend der Mittelwert bestimmt. Die Beurteilung erfolgte über das gesamte Gesichtsfeld in der vorgegebenen Vergrößerung (Tab. 8). Die Score-Werte für die 10 Parameter wurden für jede untersuchte Darmlokalisation aufaddiert. Für einen Darmabschnitt konnten damit theoretisch maximal 28 ScorePunkte vergeben werden. Für jedes Schwein wurde außerdem ein Gesamtscore für 9 histologisch beurteilte Darmabschnitte (Jejunum, 2x Ileum, Papilla ilealis, 2x Caecum, 2x Colon ascendens, Colon descendens) durch Addition der Einzelscores für jede Darmlokalisation erstellt. Für den Gesamtscore war damit theoretisch eine Punktezahl von maximal 252 erreichbar. 44 Material und Methoden Tabelle 8: Scoring-System für die histologische Beurteilung des Darmes in einer HE-Färbung Kryptabszess Vergrößerung 100fach 0 Keine 1 1 bis 3 Kryptabszesse 2 3 bis 10 Kryptabszesse 3 > 10 Kryptabszesse Maximalwert 3 Entzündungszellen Gezählt wurden 4x4 Felder eines Zählfeldokkulars mit einer Fläche von jeweils 0,0025 mm². Um einen Wert von 1 zu erreichen, mussten alle drei Kriterien erfüllt sein. Vergrößerung 400fach neutrophile Makrophagen Granulozyten Lymphozyten 0 0 bis 10 0 bis 1 0 bis 30 1 > 10 >1 > 30 Maximalwert 1 verminderte Becherzellen Vergrößerung 400fach 0 7-15 Becherzellen je Krypte, bzw. eine auf 2 Kryptepithelzellen 1 4 bis 6 Becherzellen je Krypte 2 1 bis 3 Becherzellen je Krypte 3 Keine Maximalwert 3 Krypthyperplasie Vergrößerung 100fach 0 Physiologisch max. 2 Epithelzellen übereinander 1 Unausgereifte Enterozyten 2 2 bis 3fach übereinanderliegende Zelllagen der Kryptepithelien 3 4 bis 5fach übereinanderliegende Zelllagen der Kryptepithelien Maximalwert 3 Gefäßstauung Vergrößerung 400fach 0 bis zu 3 Gefäße pro Gesichtsfeld 1 4 bis 5 Gefäße pro Gesichtsfeld 2 6 bis 7 Gefäße pro Gesichtsfeld 3 mehr als 7 Gefäße pro Gesichtsfeld Maximalwert 3 45 Material und Methoden noch Tabelle 8: Verteilung der Krypthyperplasien Anzahl der Gesichtsfelder, die hyperplastische Veränderungen der Krypten zeigen Vergrößerung 40fach 0 keine erkennbaren Veränderungen 1 1 bis 4 Lokalisationen weisen hyperplastische Veränderungen auf 2 5 bis 8 Lokalisationen weisen hyperplastische Veränderungen auf 3 mehr als 8 Lokalisationen weisen hyperplastische Veränderungen auf Maximalwert 3 Ulzerationen Vergrößerung 40fach 0 Keine 1 maximal ein ulzerativer Herd, dessen Abmessung ¼ des Gesichtsfeldes nicht Überschreitet 2 2 bis 3 ulzerative Herde mit einer Ausdehnung von jeweils weniger als ¼ des Gesichtsfeldes, oder ein einzelner Herd mit einer Ausdehnung von mehr als ¼ bis zu ½ des Gesichtsfeldes 3 mehr als 3 ulzerative Herde, oder ein Herd mit einer Ausdehnung von mehr als ½ des Gesichtsfeldes Maximalwert 3 Fibrinauflagerungen Vergrößerung 40fach 0 Keine 1 ein einzelner fibrinöser Herd über eine Fläche von maximal ¼ des Gesichtsfeldes 2 2-3 fibrinöse Herde, mit einer Ausdehnung von jeweils nicht mehr als ¼ des Gesichtsfelds, oder ein einzelner Herd mit einer Ausdehnung von mehr als ¼ bis zu ½ des Gesichtsfeldes 3 mehr als 3 fibrinöse Herde, mit einer Ausdehnung von jeweils nicht mehr als ¼ des Gesichtsfeldes, bzw. ein einzelner Herd mit einer Ausdehnung von mehr als ½ des Gesichtsfeldes Maximalwert 3 46 Material und Methoden noch Tabelle 8: Zottenverkürzung Vergrößerung 40fach 0 keine Veränderungen der physiologischen Zottenstruktur, das Längenverhältnis zwischen Zotten und Krypten erscheint größer als 3:1; die Krypten in diesem Bereich sind nicht hyperplastisch verändert 1 das Verhältnis zwischen Zotten und Krypten erscheint kleiner als 3:1; die Krypten in diesem Bereich sind hyperplastisch verändert 2 das Verhältnis zwischen Zotten und Krypten erscheint kleiner als 2:1; die Krypten in diesem Bereich sind hyperplastisch verändert 3 keine Zottenstruktur mehr erkennbar; die Krypten in diesem Bereich sind hyperplastisch verändert Maximalwert 3 Hämorrhagie Es wurde jeweils 1 cm² Gewebe je Schnitt mäanderförmig untersucht. Vergrößerung 40fach 0 keine 1 1 bis 2 Lokalisationen mit erkennbarer Hämorrhagie 2 3 bis 4 Lokalisationen mit erkennbarer Hämorrhagie 3 mehr als 4 Lokalisationen mit erkennbarer Hämorrhagie, bzw. eine Hämorrhagie, welche den gesamten Untersuchungsbereich umfasst Maximalwert 3 Maximaler Gesamtscore für einen Darmabschnitt 3.6 3.6.1 28 Immunhistologische Untersuchung Protokoll der Immunhistologie (ABC-Methode) für Paraffinschnitte Der immunhistologische Nachweis von LI-Antigen wurde mittels einer von HSU et al. (1981) beschriebenen Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Methode durchgeführt: 1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf Superfrost® plus-Objektträger (Fa. Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig) und anschließendes Trocknen im Wärmeschrank bei 57° C für mindestens 3 0 min; 2. Entparaffinierung der Schnitte in Rotihistol® (Fa. Carl Roth, Karlsruhe) zweimal für 5 min, in Isopropanol und 96%igem Ethanol für je 3 min; 47 Material und Methoden 3. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml Methanol (reinst) + 3 ml frisch zugesetztem 30%igem H2O2 (entspricht in endgültiger Lösung 0,5%igem H2O2) für 30 min unter langsamem Rühren; 4. Spülen der Schnitte dreimal für 5 min in PBS ; 5. Einsetzen der Schnitte in Coverplates® (Immunfärbecenter Sequenza, Fa. Shandon, Frankfurt a. M.); 6. Überschichten mit je 100 µl 1:5 in PBS verdünntem Ziegen-Normalserum für 20 min bei Zimmertemperatur zur Unterdrückung unspezifischer Hintergrundfärbungen; 7. Auftragen von je 100 µl polyklonalem Kaninchen-Antiserum (gegen LI ∗, 1:30000 verdünnt in PBS mit 1%igem bovinen Serumalbumin) bzw. entsprechend verdünntem Kontrollserum (Kaninchenserum, 1:10000); Inkubation über Nacht bei 4 °C; 8. Erwärmen der Schnitte auf Zimmertemperatur (mind. 30 min), dann dreimal für 5 min Spülen in PBS; 9. Überschichten mit je 100 µl Konjugat (biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG, 1:200 verdünnt in PBS); Inkubation für 30 min. bei Zimmertemperatur; 10. Spülen der Schnitte dreimal für 5 min in PBS; 11. Auftragen von je 100 µl ABC-Komplex und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 min vor Gebrauch); 12. Spülen der Schnitte dreimal für 5 min in PBS; anschließend Verbringen der Schnitte in eine mit PBS gefüllte Glasküvette; 13. Auftauen des DAB (3,3`-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid) “stock solution aliquot“ (0,1 g DAB in 50 ml PBS auflösen, Einfrieren und Aufbewahren bei –20 °C) in Dunkelheit, Verdünnen mit 150 ml PBS, Filtration durch zwei unsterile Faltfilter (Fa. Sartorius, Göttingen), Zugabe von 2 ml 3%igem H2O2 zur DAB-Lösung und Inkubation der Schnitte unter Rühren für 5 min bei Raumtemperatur; 14. Spülen der Schnitte zweimal für 5 min in PBS, anschließend Verbringen der Schnitte in fließendes, kaltes Leitungswasser für 5 min; 15. Gegenfärbung der Schnitte mit Hämalaun nach Meyer (ROMEIS 1989) für 15 s; ∗An dieser Stelle sei Connie Gebhart, (Veterinary and Biomedical Sciences University of Minnesota, St Paul, Minnesota, USA) für die Bereitstellung des polyklonalem Antiserums gegen LI gedankt. 48 Material und Methoden 16. Bläuen der Schnitte in fließendem, kalten Leitungswasser für 10 min; 17. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für je 2 bis 3 min in 50%igem, 70%igem und 96%igem Alkohol, für je 5 min in Isopropanol und zweimal 5 min in EBE; 18. Eindecken der Schnitte mit Hilfe des Folieneindeckautomaten Tissue-Tek® (Fa. Vogel GmbH & Co. KG, Gießen); Für die einzelnen Darmabschnitte wurde ein immunhistologischer Score (maximaler Score 6) vergeben, der sich aus der Beurteilung der Befunde an Krypten (maximaler Score 3) und Rundzellen (maximaler Score 3) zusammensetzt. Für die Beurteilung der Lymphknoten wurde jeweils ein einfacher Score (maximaler Score 3) vergeben (Tab. 10). 49 Material und Methoden Tabelle 9: Scores zur immunhistologischen Beurteilung einzelner Darmabschnitte und Lymphknoten Immunhistologisch positive Krypten in Prozent je Gesichtsfeld (Darm) Vergrößerung 100fach, Mittelwert aus 5 Gesichtsfeldern 0 0% 1 1-20% 2 21-50% 3 >50% Immunhistologisch positive Rundzellen in Zahlen je Gesichtsfeld (Darm) Vergrößerung 100fach, Mittelwert aus 5 Gesichtsfeldern 0 0 1 1-20 2 21-50 3 >50 maximaler Score für einen Darmabschnitt = 6 Immunhistologisch positive Rundzellen im Lymphknoten Vergrößerung 100fach, Mittelwert aus 5 Gesichtsfeldern 0 Keine 1 1 – 20 2 20 – 200 3 > 200 maximaler Score für Ln. = 3 50 Material und Methoden 3.7 Sonstige Untersuchungen und Behandlungen der Versuchstiere Am 3.6.05 wurden die Versuchstiere 23 - 36 aufgrund des Verdachts auf ColiEnterotoxämie mit Danofloxacin (Advocit®, Fa. Pfizer, Karlsruhe, 1,25 mg/kg KGW) vom Haustierarzt behandelt. Durch das Ausbrechen einer Actinobacillus- pleuropneumoniae (App)-Infektion ab dem 12.07.05 (Diagnose bestätigt durch das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover am 26.07.05) kam es zu klinischen Symptomen (Husten, Dyspnoe, Fieber bis 41,1 °C) bei zahlreichen Tieren im Bestand. Die Versuchstiere wurden mit Amoxicillin (Duphamox®, Fa. Ford Dodge, Würselen, 15 mg/kg KGW/48 h) gegen App über 10 Tage behandelt. Versuchstier Nummer 18 schied am 12.07.05 aufgrund einer Mittelfußfraktur aus dem Versuch aus. Tier Nummer 28 wurde am 28.07.05 wegen eines Mastdarmvorfalls euthanasiert und wurde 6 Stunden nach der Euthanasie seziert. Aufgrund der fortgeschrittenen Autolyseerscheinungen in der Darmschleimhaut konnten nicht alle vorgesehenen Proben für die Histologie genommen werden. Die verwertbaren Gewebeschnitte sind in die Versuchsauswertung einbezogen worden. 3.7.1 Diagnostische Untersuchungen zum Ausschluss weiterer Erreger von Darmerkrankungen Vor Beginn der Studie wurden insgesamt 31 zufällig ausgewählte, klinisch unauffällige Tiere aus dem Aufzuchtbereich des Versuchsbetriebs auf Brachyspira spp., Salmonella spp., hämolysierende Escherichia (E.) coli und Clostridium perfringens untersucht. Lediglich bei 2 Tieren konnte ein mittelgradiger Keimgehalt an hämolysierenden E. coli (Gene für Fimbrientyp (F) F4 und Enterotoxine LTI und STII) nachgewiesen werden, bei 7 Tieren lag ein mittel- bis hochgradiger Keimgehalt an B. innocens vor. Zusätzlich zu den Eingangsuntersuchungen wurden am Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zufällig ausgewählte Kotproben von Versuchtieren kulturell auf Salmonellen, Brachyspiren, Clostridium perfringens und E. coli untersucht (Tab. 10). Eine Differenzierung war aufgrund des spärlichen 51 Material und Methoden Wachstums nicht in allen Fällen möglich. Es wurde zweimal B. intermedia differenziert, und in fünf Fällen war eine Differenzierung nicht möglich (Tab. 10). Nur in einem Fall (Tier Nummer 49) wurde mittels PCR ausgeschlossen (Tab. 11) das es sich nicht um Brachyspira hyodysenteriae oder pilosicoli handelte. Die molekulargenetische Untersuchung auf erregerspezifische Genomabschnitte von Brachyspira hyodysenteriae und pilosicoli wurde durch die Gesellschaft für innovative Veterinärdiagnostik GmbH, Heisterbergallee 12, 30453 Hannover vorgenommen (Tab. 11). Die Proben wurden im Rahmen der Bestandsuntersuchung entnommen. Bei der Sektion wurde stichprobenweise Kot für parasitologische Untersuchungen entnommen. Eine parasitäre Infektion konnte nicht nachgewiesen werden. (Tab. 12). 52 Material und Methoden Tabelle 10: Ergebnisse kultureller Untersuchungen von Kotproben auf bakterielle Durchfallerreger während des Versuchsverlaufes Tier- Datum der nummer Probenentnahme Befund Institut für Mikrobiologie Kulturell konnten Salmonellen und hämolysierende E. coli nicht nachgewiesen werden. Kulturell 48 13.06.2005 hochgradig Brachyspira intermedia nachweisbar. Kulturell konnten Salmonellen und hämolysierende E. coli nicht nachgewiesen werden. Kulturell 51 13.06.2005 hochgradig Brachyspira intermedia nachweisbar. Kulturell mittelgradiger Keimgehalt an hämolysierenden E. coli (F4 Enterotoxine LTI und STII), kulturell geringgradiger Gehalt an Brachyspiren nachweisbar (eine Differenzierung 49, 52 13.06.2005 war nicht möglich), Salmonellen nicht nachweisbar. Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen 6, 22, 39, 46 13.06.2005 werden. Kulturell konnten Salmonellen und hämolysierende E. coli nicht nachgewiesen werden. Kulturell geringgradiger nachweisbar 11, 24, 43 13.06.2005 Gehalt (eine an Differenzierung Brachyspiren war nicht möglich). Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen 7, 24 29.06.2005 werden Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen 41, 61 03.08.2005 werden. Kulturell konnten Salmonellen, hämolysierende E. coli und Brachyspiren nicht nachgewiesen 20, 39 02.11.2005 werden. 53 Material und Methoden Tabelle 11: Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen auf Brachyspira (B.) hyodysenteriae und B. pilosicoli (PCR) während des Versuchsverlaufes Datum der Befund (Fa. Innovative Veterinär Diagnostik Tiernummer Probenentnahme GmbH) 8, 10, 19, kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von 49, 53 B. hyodysenteriae und B. pilosicoli 29.06.2005 kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von 21, 22 B. hyodysenteriae und B. pilosicoli 12.07.2005 kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von 7, 22 B. hyodysenteriae und B. pilosicoli 20.07.2005 kein Nachweis spezifischer DNA-Fragmente von 36, 37, 52 B. hyodysenteriae und B. pilosicoli 29.06.2005 Tabelle 12: Ergebnisse der parasitologischen Kotuntersuchungen von Kokzidien Nematodirus Trichuris Capillaria Strongyloides Ascaris 60 x x x x x x x 63 x x x x x x x 19 x x x x x x x 42 x x x x x x x 53 x x x x x x x 21 x x x x x x x 29.07.05 03.08.05 strongyliden Tiernummer 22.01.05 Magendarm- Datum sechs Versuchstieren Legende: X = kein positiver Nachweis in der untersuchten Probe 54 Material und Methoden 3.8 Die Verdaulichkeitsanalyse Messung der präzäkalen Verdaulichkeit von Nährstoffen bei den Versuchsschweinen wurde von der Martin-Luther-Universität, Halle Wittenberg unter der Leitung von Prof. Dr. M. Rodehutscord und Mitarbeit von Dr. H. Kluth durchgeführt. 3.8.1 Chymusgewinnung Unmittelbar nach der Tötung wurden die Tierkörper zügig eröffnet und der Dünndarm freigelegt. Zur Probennahme wurde nach vorangegangener Vermessung der Gesamtlänge nur der Darminhalt aus der terminalen Hälfte des Dünndarmes verwendet (s.o.). Dabei wurde der Inhalt 30 cm vor der Papilla ileocaecalis von der Beprobung ausgeschlossen, um eine mikrobielle Kontamination aus den nachgelagerten Verdauungsabschnitten und somit den Eintrag von mikrobiellem Protein weitgehend zu vermeiden. Nach Überführung in Plastikgefäße wurde der Chymus unmittelbar tiefgefroren. Zur weiteren Analyse erfolgte eine Gefriertrocknung sowie eine Vermahlung über eine Zentrifugalmühle (Pulverisette, Typ 14.702, Fa. Fritsch, Idar-Oberstein) mit einem 0,5 mm-Sieb. 3.8.2 3.8.2.1 Chemische Analysen Weender Rohnährstoffe Die Analyse der Weender Rohnährstoffe Rohasche, Rohprotein und Rohfett in den Futter- und gefriergetrockneten Chymusproben wurde nach den Vorschriften des Verbandes Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA); (NAUMANN u. BASSLER 1976) durchgeführt. Die Rohproteinbestimmung erfolgte über die Bestimmung des N-Gehaltes nach Kjeldahl (N×6,25). Das Rohfett wurde durch Petroletherextraktion mittels SoxlethApparatur ermittelt. Die im Zuge der Mineralstoffanalytik erforderliche Veraschung erfolgte bei 550 °C. 55 Material und Methoden 3.8.2.2 Mineralstoffanalytik Nach Veraschung und Eindampfen mit 6 N HCl in verdünnter HNO3 erfolgte die Herstellung einer definierten Aschelösung. Die Konzentrationen an Calcium und Phosphor in dieser Aschelösung wurden an einem optischen Emissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES, JY 24, Fa. Jobin Yvon GmbH, München) gemessen (RODEHUTSCORD u. DIECKMANN 2005). 3.8.2.3 Brennwert Die Bestimmung des Brennwertes (GE) erfolgte mit einem Bombenkalorimeter mit isoperibolem Messprinzip (IKA C7000, Fa. IKA Werke GmbH, Staufen). Titandioxid Die Konzentrationen des Markers TiO2 wurden photometrisch nach BRANDT und ALLAM (1987) bestimmt. 3.8.3 Berechnungen Die präzäkale Verdaulichkeit (pc VQ) der Rohnährstoffe, der Mineralstoffe und der Bruttoenergie wurde unter Verwendung der analysierten Gehalte an Nährstoffen und Marker in Futter und Chymus mit der Formel wie folgt berechnet: pc VQ (%) = 100 - [(NährstoffChymus × TiO2Futter) / (NährstoffFutter × TiO2Chymus) × 100] TiO2Futter ; TiO2Chymus: Konzentrationen an TiO2 in Futter bzw. Chymus NährstoffChymus; NährstoffFutter: Konzentrationen des Nährstoffs in Chymus bzw. Futter 56 Material und Methoden 3.9 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der histologischen und immunhistologischen Daten erfolgte mittels des Statistikprogrammes „Statistical Analysis System“ (SAS) für Windows, Version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, USA, im Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Hierbei wurden die ermittelten Datenwerte zunächst einer Untersuchung auf Normalverteilung unterzogen. Anschließend wurde der Kruskal-Wallis-Test als Globaltest zum Gruppenvergleich herangezogen. Für den paarweisen Gruppenvergleich wurde der Wilcoxon-Test als nicht-parametrische Ein-WegVarianzanalyse gewählt, da die Daten überwiegend nicht normal verteilt waren. Um etwaige Korrelationen zwischen bestimmten Parametern darzustellen, wurde der Rang-Korrelationskoeffizient nach Spearman (rS) genutzt. Für die Auswertungen wurden die per Sektion untersuchten Tiere in 4 Gruppen unterteilt: Gruppe 0: Negativ-Kontrollgruppe (n=5, Tiere nicht aus dem Versuchsbetrieb) Gruppe 1: Tiere, bei denen der erste Nachweis einer LI-Infektion erst bei der Sektion mittels Immunhistochemie geführt werden konnte (n=5) Gruppe 2: Tiere, bei denen der erste Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder ELISA) innerhalb von 1-3 Wochen vor der Sektion geführt werden konnte (n=21/22) Gruppe 3: Tiere, bei denen der erste Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder ELISA) früher als 3 Wochen vor der Sektion geführt werden konnte (n=23). Ein Tier konnte nicht zeitgerecht seziert werden, weil es außerplanmäßig im Betrieb eingeschläfert werden musste. Die histologischen Befunde für dieses Tier waren deshalb nicht vollständig auswertbar (Gruppe 2). Bei einem Tier, das in der zehnten Lebenswoche seziert wurde, konnte mittels keiner der verwendeten Methoden eine LI-Infektion festgestellt werden. Dieses Tier wurde keiner der Gruppen zugeordnet. Für statistisch zu belegende Unterschiede werden folgende Signifikanzgrenzen angegeben: schwach signifikant p<0,05, signifikant p<0,01, hoch signifikant p<0,001. 57 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Nachweis der Lawsonia-intracellularis-Infektion Eine Zusammenfassung der Einzeltieruntersuchungen sind dem Anhang (Kapitel 9.1 Tab. 25) zu entnehmen. Die Versuchstiere waren bis zur zehnten Lebenswoche in Gruppen von zehn Tieren im Flatdeck aufgestallt. Die ersten LI-Befunde (PCR, ELISA oder Immunhistologie) wurden in der sechsten Lebenswoche in Box vier und fünf festgestellt. In Woche sieben zeigten sich auch erste Infektionen in Box zwei. In Box drei zeigten sich erst ab der neunten Lebenswoche erste Infektionen (Abb.5, 6). In der Box drei infizierten sich bis zur 10. Lebenswoche nur drei der eingestallten Tiere (n=10). In Box eins waren in diesem Zeitraum fünf von zehn Tieren infiziert, während in den restlichen Boxen sieben bis neun Tiere infiziert waren (Abb. 5, 6). 58 Lebensalter (Wochen) Ergebnisse + Mittelwert box Infizierte Tiere zwischen der 6. und 10. Lebenswoche n=5 n=8 n=3 n=6 n=9 n=8 Abbildung 5: Verteilung der erstmalig positiven Nachweise einer LI- Infektion (PCR, ELISA oder Immunhistologie) zwischen der 6. und 10. Lebenswoche (LW) der Versuchstiere (n=10 pro Box) innerhalb der einzelnen Boxen (1-6) im Flatdeck (p>0,05) Legende: box = Stallplatz 59 Anteil infizierter Tiere (%) Anteil gesamt insgesamt Infizieter Tiere % Ergebnisse 100 90 80 70 Lebenswoche 6 60 Lebenswoche 7 50 Lebenswoche 8 40 Lebenswoche 9 30 Lebenswoche 10 20 10 0 Box1 Abbildung 6: Box2 Box3 Box4 Box5 Box6 Anteil der bis zur jeweiligen Lebenswoche mittels PCR, ELISA oder Immunhistologie als LI-infiziert erkannten Tiere pro Flatdeckbox (6. bis 10. Lebenswoche) Von 60 Tieren der Versuchsgruppe blieben die meisten Schweine bezüglich der Kotkonsistenz völlig unauffällig, nur 24 hatten während der Beobachtungszeit mindestens zu einem Untersuchungszeitpunkt einen Kotkonsistenz-Score von mehr als 0. Von diesen Tieren wiesen lediglich acht wiederholt einen Scorewert über 0 auf. Zumeist zeigten auffällige Schweine nur dickbreiigen Kot (n=16), klinisch manifester Durchfall konnte nur in wenigen Fällen nachgewiesen werden (n=8). Ein Tier davon zeigte zu einem einzelnen Zeitpunkt wässrigen Durchfall, davor mehrfach dickbreiige Kotkonsistenz. Bei diesem Tier lag jedoch eine Mischinfektion mit E. coli (F4, Enterotoxine LTI und STII) vor. Sieben dieser Tiere wiesen mindestens zu einem Zeitpunkt einen dünnbreiigen Kotabsatz auf, von diesen sieben Tieren hatten drei mehrfach einen Score von mehr als 0 (überwiegend dickbreiige Konsistenz, nur ein Tier an zwei Untersuchungsterminen mit dünnbreiiger Kotkonsistenz) (Tab. 13). 60 Ergebnisse Tabelle 13: Kotkonsistenz während der Untersuchungsperiode (n=60 Schweine) maximal festgestellter Score 0 (ohne Befund) 1 (dickbreiig) 2 (dünnbreiig) 3 (wässrig) Tiere (n) 36 16 7 1 Anzahl der Tiere (n), die wiederholt einen Score > 0 hatten 4 von 16 3 von 7 1 von 1 Mittels PCR-Untersuchungen wurde bei insgesamt 39 Tieren (65 %) eine fäkale Erregerausscheidung festgestellt. Lediglich fünf Schweine davon wiesen keine für LI spezifischen Antikörper auf, von diesen fünf Tieren zeigte eines ein fragliches Ergebnis in der ELISA-Untersuchung. Insgesamt konnten bei 49 Tieren (81,7 %) Antikörper gegen LI nachgewiesen werden. Von den 21 Schweinen, bei denen keine Erregerausscheidung im Kot festgestellt wurde, zeigten 15 Tiere ein serologisch positives Ergebnis (Tab. 14). Tabelle 14: Vergleich zwischen PCR- und ELISA-Ergebnissen (n=60 Schweine, + = positiv, - = negativ, ? = fraglich) ELISA + ELISA ? ELISA total (n) total (%) PCR + (n) 34 1 4 39 65 PCR- (n) 15 2 4 21 35 total (n) 49 3 8 60 total (%) 81,7 5 13,3 100 Bei der immunhistologischen Untersuchung des Darmes konnte bei diesen 15 Tieren LI-Antigen nachgewiesen werden. Bei den übrigen 6 PCR-negativen Tieren wurde bei beiden ELISA-fraglichen Tieren und bei drei der ELISA-negativen Tiere ebenfalls immunhistologisch LI-Antigen gefunden (Tab. 15). Nur bei einem Tier der gesamten Versuchsgruppe konnte zu keinem Zeitpunkt in keiner der Untersuchungen auf Antigen oder Antikörper eine LI-Infektion bestätigt werden. 61 Ergebnisse Tabelle 15: Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung von Tieren (n=21), bei denen mittels PCR keine LI-Ausscheidung im Kot nachgewiesen werden konnte, im Vergleich zur Serologie (+ = positiv, - = negativ, ? = fraglich). IH + (n) IH - (n) total (n) ELISA + 15 0 15 ELISA ? 2 0 2 ELISA - 3 1 4 total 20 1 21 Der erste Nachweis von LI spezifischen Genomfragmenten mittels PCR im Kot der Versuchstiere gelang bereits in der 6. Lebenswoche bei drei Tieren. Der Schwerpunkt der erstmalig beobachteten Erregerausscheidung lag in der 9. (12 Tiere) und 10. (7 Tiere) Lebenswoche der Tiere. In der 13. Lebenswoche wurden die letzten Erstausscheidungen gefunden. Nach diesem Zeitpunkt zeigte sich kein neuer Erstausscheider unter den Versuchstieren (Abb. 7, Tab. 16). 14 12 Tiere (n) 10 8 6 4 2 0 6 LW 7 LW 8 LW 9 LW 10 LW 11 LW 12 LW 13 LW 14 LW 15 LW 16 LW 26LW Lebensalter (Wochen) Lebenswochen Abbildung 7: Zeitpunkte des erstmalig positiven PCR Nachweises im Kot mittels PCR (n=39 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen. 62 Ergebnisse Von 39 Tieren, bei welchen in der PCR eine Erregerausscheidung im Kot festgestellt wurde, konnte bei 18 nur einmalig ein Nachweis registriert werden. Die Dauer der Ausscheidung hatte eine Spannbreite von einer bis zu acht Wochen, wobei Unterbrechungen im Einzelfall vorkamen (Abb. 8). Die längste regelmäßige Nachweisfolge ohne Unterbrechung gelang bei einem Tier über 7 Wochen. Insgesamt zeigten 21 Tiere eine Ausscheidung zu mindestens 2 Untersuchungszeitpunkten. Die Tiere, deren Erregerausscheidung durch eine unmittelbar auf die letzte Untersuchung folgende Sektion eventuell abgebrochen wurde, sind in Abb. 8 gesondert markiert. 20 18 16 Tiere (n) 14 12 10 Tiere, deren Sektion unmittelbar auf das letzte positive PCRErgebnis folgte 8 6 4 Tiere, deren Sektion nicht unmittelbar auf das letzten positive PCR-Ergebnis folgte 2 0 1W 2W 3W 4W 5W 6W 7W 8W Dauer der Erregerausscheidung (Wochen) Abbildung 8: Dauer der LI-Ausscheidung (n=39). Es wurde die jeweils erste und letzte Erregerausscheidung berücksichtigt, ungeachtet davon, ob die Erregerausscheidung durchgehend erfolgte oder eine Unterbrechung vorlag. 63 Ergebnisse Der größte Anteil der Erreger ausscheidenden Tiere wurde während der Untersuchungsperiode zwischen der 9. und 11. Lebenswoche gefunden. In diesem Zeitraum schieden zwischen 22 und 27 % der Versuchstiere den Erreger fäkal aus 26 LW LW 16 LW 15 14 LW LW 13 LW 12 LW 11 LW 10 LW 9 LW 8 7 6 LW 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 LW Anteil Erreger ausscheidender Tiere (%) (Abb. 9, Tab. 16). Lebensalter (Wochen) Abbildung 9: Anteil der Erreger ausscheidenden Tiere innerhalb der Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 16 zu entnehmen. 64 Ergebnisse Werden alle erkannten Erregerausscheider aufsummiert, zeigte sich für den Zeitraum zwischen der 8. und der 9. Lebenswoche die größte Zunahme an in der PCR positiv erkannten Tiere (ca. 20 %). Das Maximum wurde bereits zur 13. Lebenswoche erreicht. Zu diesem Zeitpunkt hatten 65 % der Tiere zu mindestens einem Zeitpunkt LI in ihrem Kot ausgeschieden (Abb. 10, Tab. 16). 100 90 Anteil Tiere (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6 LW 7 LW 8 LW 9 LW 10 LW 11 LW 12 LW 13 LW 14 LW 15 LW 16 LW 26LW Lebensalter (Wochen) Abbildung 10: Anteil der insgesamt per PCR als LI-Ausscheider erkannten Schweine an der gesamten Gruppe (n=60) zur jeweiligen Lebenswoche. 65 Ergebnisse Tabelle 16: Ergebnisse der Kotuntersuchung auf LI mittels PCR zu den festgelegten Untersuchungszeitpunkten 7. LW 8. LW 9. LW 10. LW 11. LW 12. LW 13. LW 14. LW 15. LW 16. LW 26. LW PCR ges. pos. (n) 6. LW n PCR erstmalig pos. (n) 60 60 60 55 49 44 38 33 28 23 18 13 3 4 4 12 7 4 2 3 0 0 0 0 3 7 10 15 11 10 5 8 1 0 0 0 11 23 30 34 36 39 39 39 39 39 6,7 21,8 14,3 9,1 5,3 9,1 PCR total pos. (n) PCR erstmalig pos. (%) 3 7 5,0 6,7 0,0 0,0 0,0 0,0 PCR ges. pos. (%) 5,0 11,7 16,7 27,3 22,5 22,7 13,2 24,2 3,6 0,0 0,0 0,0 PCR total pos. (%) 5,0 11,7 18,3 38,3 50,0 56,7 60,0 65,0 65,0 65,0 65,0 65,0 Legende: erstmalig pos. = Anzahl der zu diesem Untersuchungszeitpunkt erstmalig positiv reagierenden Tiere ges. pos. = Anzahl aller zu diesem Untersuchungszeitpunkt positiv reagierender Tiere total pos. = Anzahl aller bis zu diesem Untersuchungszeitpunkt mindestens einmal positiv beurteilter Tiere 66 Ergebnisse Der erste Antikörpernachweis konnte in der Versuchsgruppe mit Beginn der Untersuchungen in der 6. Lebenswoche bei einem Tier geführt werden. Eine erste deutliche Zunahme an serokonvertierten Tieren zeigte sich in der 8. Lebenswoche mit 11 Tieren, gefolgt von einem zweiten Anstieg in der 10. Lebenswoche mit 16 Tieren. Die späteste Serokonversion konnte bei einem Tier in der 26. Lebenswoche belegt werden. Bei den Schweinen, die eine späte Serokonversion erkennen ließen (14.-26. Woche), lagen zu früheren Untersuchungszeitpunkten bereits fragliche Ergebnisse vor (Abb. 11). Der Anteil an seropositiven Tieren zu den Untersuchungszeitpunkten stieg ab der 8. Lebenswoche von 20 % auf bis maximal 73 % in der 11. Lebenswoche. Nach der 11. Lebenswoche war der Anteil der Seroreagenten wieder rückläufig bis auf ca. 30 % in der 26. Lebenswoche (Abb. 12). Der Gesamtanteil an serokonvertierten Tieren stieg ab der Lebenswoche 8 kontinuierlich bis zu einem Maximum von 81,7 % in Lebenswoche 26 an. Bereits ab LW 26 LW 16 LW 15 LW 14 LW 13 LW 12 LW 11 LW 10 LW 9 LW 8 7 6 LW 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 LW Anzahl Tiere (n) Lebenswoche 10 waren mehr als 50 % der Versuchstiere seropositiv (Abb. 12). Lebensalter (Wochen) Abbildung 11: Zeitpunkte der mittels ELISA festgestellten Serokonversion (n=49 von 60 Schweinen). Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen. 67 Ergebnisse 80 Anteil pos Tiere (%) 70 60 50 40 30 20 10 26 LW LW LW 16 14 15 LW LW 13 LW 12 11 10 LW LW LW 9 LW LW 8 6 7 LW 0 Lebensalter (Wochen) Abbildung 12: Anteil serologisch positiver Schweine innerhalb der Versuchsgruppe zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt. Die Anzahl der jeweilig untersuchten Tiere ist aus Tab. 17 zu entnehmen. 90 Anteil Tiere (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 LW 26 LW 16 LW 15 14 LW LW 13 LW 12 LW 11 LW 10 LW 9 LW 8 7 6 LW LW 0 Lebensalter (Wochen) Abbildung 13: Anteil der insgesamt gegen LI serokonvertierten Schweine an der gesamten Gruppe (n=60, vgl. Tab.17) zur jeweiligen Lebenswoche. Die Serokonversion konnte bei 41,0 % der Tiere gleichzeitig mit der ersten feststellbaren Erregerausscheidung nachgewiesen werden. Bei 35,1 % der 68 Ergebnisse Versuchsgruppe erfolgte die Serokonversion ein bis zwei Wochen und bei 2,6 % drei Wochen nach dem ersten PCR Nachweis. Keine Serokonversion zeigten 12,8 % der Tiere. 7,7 % der Schweine zeigten schon ein bis zwei Wochen vor erstem PCR Nachweis ein positives ELISA-Ergebnis (Abb. 14). Serokonvertierte Tiere (%) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 keine 2 Wochen 1 Woche Serokonversion früher früher gleichzeitig 1 Woche später 2 Wochen 3 Wochen später später Abstand zwischen Serokonversion und erster Erregerausscheidung (Wochen) Abbildung 14: Vergleich zwischen dem Zeitpunkt der ersten feststellbaren Erregerausscheidung mittels PCR und dem der Serokonversion (n=39). 69 Ergebnisse Tabelle 17: Antikörper Ergebnisse gegen LI der mittels serologischen Untersuchungen Blocking-ELISA zu den auf festgelegten Untersuchungszeitpunkten 6. LW 7. LW 8. LW 9. LW 10. LW 11. LW 12. LW 13. LW 14. LW 15. LW 16. LW 26. LW 60 60 60 55 49 44 38 33 28 23 18 13 1 0 11 6 16 7 4 0 1 0 2 1 ELISA ges. pos. (n) 1 1 12 11 27 32 25 20 12 11 8 4 ELISA ges. fragl. (n) 1 3 10 13 7 2 9 9 12 6 6 6 1 1 12 18 34 41 45 45 46 46 48 49 3,6 0,0 11,1 7,7 Anzahl untersuchter Tiere (n) ELISA erstmalig pos. (n) ELISA total pos. (n) ELISA erstmalig pos. (%) 1,7 0,0 18,3 10,1 32,7 15,9 10,5 0,0 ELISA ges. pos. (%) 1,7 1,7 20,0 20,0 55,1 72,7 64,8 60,6 42,9 47,8 44,4 30,8 ELISA ges. fragl. (%) 1,7 5,0 16,7 23,6 14,3 4,6 23,7 27,3 42,9 26,1 33,3 46,2 ELISA total pos. (%) 1,7 1,7 20,0 30,0 56,7 68,3 75,0 75,0 76,7 76,7 80,0 81,7 Legende: erstmalig pos. = Anzahl/Anteil der zu diesem Untersuchungszeitpunkt erstmalig positiv reagierenden Tiere ges. pos./fragl. = Anzahl/Anteil aller zu diesem Untersuchungszeitpunkt positiv/fraglich reagierender Tiere total pos. = Anzahl/Anteil aller bis zu diesem Untersuchungszeitpunkt mindestens einmal positiv beurteilter Tiere 70 LW 26 LW 16 LW 15 LW 14 LW 13 LW 12 LW 11 10 LW LW LW 9 7 6 8 LW 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 LW Anteit Tiere (%) Ergebnisse Lebensalter (Wochen) Abbildung 15: Gesamtanteil aller als LI-infiziert erkannten Schweine unter Berücksichtigung aller verwendeten diagnostischen Verfahren (PCR, ELISA, Immunhistologie) zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt Unter Berücksichtigung aller verwendeten diagnostischen Verfahren (PCR, ELISA und Immunhistologie) wiesen 98,3 % der Versuchsgruppe (n=59 von 60) bis zur 27. Lebenswoche zu mindestens einem Untersuchungszeitpunkt Befund auf (Abb. 15). Der erste positive Untersuchungsnachweis konnte mittels Serologie bereits in der 6. Lebenswoche geführt werden. Die stärkste Zunahme als LI-infiziert erkannter Tiere war von der 8. Lebenswoche bis zur 12. Lebenswoche zu erkennen. Innerhalb dieses Zeitraums stieg der Anteil positiv reagierender Tiere von 23,3 % auf 91,7 %. Die tägliche Gewichtszunahme bei als mit LI infiziert bzw. nicht infiziert erkannten Schweine wurde nur bis zur Lebenswoche 8 ausgewertet, da zur 10. Lebenswoche eine Actinobacillus-pleuropneumoniae-Infektion auftrat, die eine weitere Auswertung nicht sinnvoll erscheinen ließ. Zum Absetzen entsprach das durchschnittliche Körpergewicht der zur 8. Lebenswoche LI infizierten Tiere (n=14) annähernd dem der zu diesem Zeitpunkt LInegativen Schweine (n=46, p>0,05). Im Mittel nahmen die LI-negativen Tiere bis zur 8. Lebenswoche zwar täglich um 50 g mehr zu als die schon infizierten Schweine, jedoch konnte dieser Unterschied nicht statistisch gesichert werden. (Tab. 18) 71 Ergebnisse Tabelle 18: Durchschnittliches Körpergewicht zum Absetzen (4 Wo) und mittlere tägliche Gewichtszunahme bis zur 8. Lebenswoche bei LI infizierten und LI-negativen Tieren (unterschiedliche Buchstaben: p<0,05) Tiere (n) Körpergewicht tägliche beim Absetzen mit Gewichtszunahme 4 Wo (x+s, kg) in den Lebenswochen 4-8 (x+s, kg) bis zur 8. 46 7,51 ±1,21a 0,394 ±85a 14 7,69 ±0,88a 0,344 ±92a Lebenswoche LI-negative Tiere zur 8. Lebenswoche LI-positive Tiere 72 Ergebnisse 4.2 Pathomorphologische Untersuchungen Für diese Studie wurden 51 Tiere aus der Versuchsgruppe und fünf LI-negative Kontrolltiere seziert. Ein Versuchstier wurde aufgrund eines Mastdarmvorfalls vorzeitig seziert, wegen fortgeschrittener Autolyse konnten bei diesem Tier nicht alle Darmabschnitte untersucht werden. Bei der Sektion der Versuchtiere konnten makroskopische, durch LI verursachte Veränderungen nur bei einem Schwein gefunden werden. In diesem Fall zeigten sich deutliche fibrinöse Auflagerungen und Ulzerationen, die sich vom Ende des Jejunums bis ins mittlere Colon erstreckten. Bei diesem Tier wurde eine nekrotisierende Enteritis diagnostiziert (NE, Tier Nr. 49). Bei anderen Tieren wurden lediglich mikroskopisch typische Veränderungen einer PPE an der Darmschleimhaut festgestellt. Makroskopisch leicht verdickt erscheinende Bereiche der Darmschleimhaut konnten regelmäßig sowohl bei den Versuchstieren als auch bei nicht mit LI infizierten Kontrolltieren beobachtet werden und wurden auf postmortale Kontraktionen des Darms zurückgeführt (Abb.16, 17). Andere makroskopische Veränderungen am Darm waren Hyperämien (Abb. 16) und mussten in der Regel als unspezifisch angesehen werden. Dies wird auch belegt durch die vergleichende histologische Untersuchung von zuvor im Versuchsplan metrisch festgelegten Lokalisationen zur Probenentnahme (ohne Berücksichtigung von möglichen makroskopischen Veränderungen) mit frei wählbaren, ggf. makroskopisch auffälligen Probenentnahmestellen am selben Darmabschnitt (s. Kap. 3.5.1). Trotz makroskopisch bei einigen Tieren scheinbar vorhandener Unterschiede zeigte sich nach histologischer Beurteilung eine hochsignifikante Korrelation (p<0,001) zwischen den Score-Werten zu den im Vorfeld determinierten Stellen von Ileum, Caecum und Colon und den Score-Werten für die entsprechenden frei wählbaren Lokalisationen (Tab. 19). 73 Ergebnisse Tabelle 19: Korrelation zwischen den Score-Werten für histologische Läsionen am Darm an metrisch zuvor festgelegten und an frei wählbaren Lokalisationen (Korrelationskoeffizient r, Signifikanz p). Ileum Caecum Colon r 0,89440 0,91730 0,8074 p <0,001 <0,001 <0,001 74 Ergebnisse Abbildung 16: Ileozäkaler Übergang mit geringgradigen Hyperämien und geringgradig verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 63). Hier dargestellt ist ein häufig beobachtetes Sektionsbild vom Ileum und der Papilla ilealis. Es zeigen sich makroskopisch herdförmig verteilte Hyperämien. Die Schleimhaut ist gefaltet. Die Sektion fand in der 14. Lebenswoche statt. Bis zu diesem Zeitpunkt konnte keine LI-Ausscheidung per PCR nachgewiesen werden. Das Tier zeigte von der 8. Lebenswoche bis zur 12. Lebenswoche ein positives ELISA-Ergebnis, mit einen fraglichen Ergebnis zur 9. Lebenswoche. In den Lebenswochen 13 und 14 war der ELISA fraglich. Histologisch lagen eine geringgradige (ggr.) epitheliale Hyperplasie sowie ggr. Kryptabszesse an der Papilla ilealis vor. Im Bereich des Ileums wurden keine auf eine LI-Infektion hinweisenden histologischen Veränderungen gefunden. Legende: Hyperämie Faltenbildung der Darmschleimhaut 75 Ergebnisse Abbildung 17: Ileum mit geringgradigen Hyperämien und geringgradig verdickter und gefalteter Mukosa (Tier 45). Die verdickte Mukosa des Ileums zeigt irreguläre, erhabene transversal und longitudinal verlaufende Falten sowie geringgradige herdförmige Hyperämien auf. Eine LI-Ausscheidung im Kot konnte bei Tier 45 nur in der 8. Lebenswoche registriert werden, das Schwein war über einen Zeitraum von vier Wochen serologisch positiv (8.-11. LW). Zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 12 zeigte sich ein fragliches ELISA-Ergebnis. Histologisch wurde eine ggr. epitheliale Hyperplasie nur in einem von fünf untersuchten Gesichtsfeldern gefunden. Legende: longitudinal und transversal verlaufende Falten der Mukosa ggr. Hyperämie 76 Ergebnisse Pathohistologisch zeigten insgesamt 28 der 51 untersuchten Tiere auf eine porzine proliferative Enteropathie hinweisende Veränderungen. Dabei wurde bei 23 Schweinen eine reine proliferative Darmentzündung festgestellt (Abb. 18, 19). Bei 3 Tieren konnten zusätzlich ulzerative und bei 2 Tieren fibrinös-ulzerative Läsionen (Abb. 22) nachgewiesen werden (Tab. 20). Die proliferativen Veränderungen verteilten sich wie folgt auf die verschiedenen Darmabschnitte: 10 Tiere zeigten in nur einem Darmabschnitt proliferative Erscheinungen, davon 9 Tiere im Ileum und ein Tier im Colon ascendens. Sieben Tiere hatten Proliferationen sowohl im Ileum als auch im Caecum und Colon ascendens. Drei Tieren zeigten gleichzeitig Proliferationen in Ileum und Caecum, ebenfalls drei Tiere zeigten Proliferationen im Ileum und im Colon ascendens. Bei vier Tieren beschränkten sich die proliferativen Veränderungen auf Caecum und Colon ascendens. Es konnten weder an den untersuchten Lokalisationen im Jejunum noch im Colon descendens proliferative Alterationen beobachtet werden. Die 5 Kontrolltiere blieben bis auf minimale unspezifische Veränderungen pathohistologisch unauffällig. Bei den proliferativen Veränderungen waren unreife Zellen in den Kryptepithelien zu erkennen, diese lagen in bis zu fünf übereinander liegenden Schichten. Die Becherzellen waren innerhalb der proliferierten Krypten nur noch einzeln oder gar nicht mehr vorhanden (Abb. 21). Zwischen den proliferierten Zellen waren im Vergleich zu unveränderten Krypten vermehrte Mitosen und Infiltrationen von Lymphozyten und Makrophagen zu erkennen. Die Mukosa stellte sich in schweren Fällen als Adenom ähnlich mit stark verzweigten Krypten, welche teilweise zum Darmlumen geöffneten waren, dar. Die Darmzotten waren in der Länge teilweise deutlich reduziert, oder nicht mehr zu erkennen (Abb. 19). Bei Tieren, die keine proliferativen Veränderungen aufwiesen, waren z.T. blasse geschwollene oder geschrumpfte degenerierte Enterozyten zu beobachten. In diesem Stadium konnten vermehrt apoptotische Körperchen in den Zellen gefunden werden. Zusätzlich bestanden Becherzellhyperplasien, die Zotten waren z.T. etwas kürzer als bei gesunden Kontrolltieren (Abb. 23, 24). 77 Ergebnisse Tabelle 20: Ergebnisse der histologischen Beurteilung bei Versuchs- (n=51) und Kontrolltieren (K, n=5). Neben der pathologischen Diagnose wird der Gesamtscore für 9 untersuchte Darmlokalisationen angegeben. Tier Nr. Lebenswoche 16 8 49 8 42 8 19 8 53 8 52 70 54 36 37 47 31 59 9 9 9 9 9 10 10 10 30 10 8 22 40 10 11 11 7 11 32 6 28 45 4 1 14 48 11 11 12 12 12 12 12 12 Diagnose mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und Colitis mgr. fibrinös-ulzerative und proliferative Ileitis, Typhlitis und Colitis ggr. fibrinös-ulzerative und proliferative Ileitis mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und Colitis ggr.-mgr. proliferative Ileitis,Typhlitis und Colitis mgr. ulzerativ-proliferative Ileitis, ggr. proliferative Typhlitis und Colitis, ggr. proliferative Typhlitis und Colitis, ohne besonderen Befund mgr. proliferative Ileitis mgr. proliferative Ileitis und Colitis ggr. proliferative Ileitis und Colitis ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und Colitis ggr. ulzerativ-proliferative Ileitis, ggr. proliferative Typhlitis ggr. proliferative Ileitis ggr. proliferative Ileitis und Colitis mgr. proliferative Ileitis, Typhlitis und Colitis ggr.-mgr. proliferative Ileitis und Typhlitis ggr. proliferative Typhlitis und Colitis ggr. proliferative Ileitis ggr. proliferative Ileitis ggr. proliferative Colitis ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund histologischer Gesamtscore für 9 DarmGruppeneinteilung abschnitte 59 2 74,4 2 5,4 2 66 2 39,4 2 60,2 22,8 1,6 17,2 31,6 13,4 6,4 1,2 2 2 2 1 1 2 0 1 55 2 26,6 12,4 17 2 2 2 62,4 2 22 8,6 5,4 3,2 6 0,2 3,8 3,2 1 3 2 3 1 2 2 3 78 Ergebnisse noch Tabelle 20 Tier Nr. Lebenswoche 10 13 21 43 11 46 63 24 17 26 62 38 41 50 5 15 12 56 65 67 23 9 33 64 60 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 15 15 15 15 15 16 16 16 16 16 27 27 27 27 27 K1080 K1079 K1078 K1077 K216 Läufer, 25 kg Läufer, 25 kg Läufer, 25 kg Läufer, 25 kg Läufer, 25 kg Diagnose ggr. proliferative Ileitis, Typhlitis und Colitis ggr. ulzerativ-proliferative Ileitis, ggr. proliferative Typhlitis und Colitis ggr. proliferative Ileitis ggr. proliferative Typhlitis und Colitis ohne besonderen Befund ggr. proliferative Ileitis ggr. proliferative Ileitis und Typhlitis ggr. proliferative Ileitis ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ggr. proliferative Ileitis ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund ohne besonderen Befund histologischer Gesamtscore für 9 Darmabschnitte Gruppeneinteilung 31,2 2 25 6,2 17,4 3,8 6,6 6,6 4,4 5,4 3 6,6 2,6 1,8 1,4 1,4 2,4 1,2 3,4 4,6 12,4 1,8 3,6 4,2 3 3,2 2 3 2 2 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 0,8 0,4 0,2 0 Kontrolle Kontrolle Kontrolle Kontrolle Kontrolle 79 Ergebnisse Abbildung 18: Caecum, gering bis mittelgradig proliferierte Krypten (Tier 7) Das Bild zeigt eine gering bis mittelgradige proliferative Typhlitis mit Hyperplasie von Krypten (Vergrößerung x40, Färbung HE). Das Tier wurde in der 11. Lebenswoche seziert. In dieser Woche konnte bei dem Schwein erstmalig eine LI-Ausscheidung im Kot gefunden sowie Antikörper gegen LI (ELISA) nachgewiesen werden. Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen. Legende: proliferierte Krypten mit unregelmäßigem Erscheinungsbild 80 Ergebnisse Abbildung 19: Ileum, hochgradig proliferative Ileitis (Tier 17) Das Bild zeigt eine hgr. proliferative Ileitis mit Hyperplasie des Kryptepithels und Zottenverlust (Vergrößerung x40, Färbung HE). Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen. Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden. Legende: verzweigte Krypten, welche zum Darmlumen geöffnet sind, keine Zottenstruktur mehr erkennbar Zelldetritus im Kryptlumen proliferierte Krypten (Krypthyperplasie, Becherzellreduktion) 81 Ergebnisse Abbildung 20: Ileum, hochgradig proliferierte Krypten mit Zelldtritus (Tier 19) Das Bild zeigt eine hgr. proliferative Ileitis (Vergrößerung x100, Färbung HE) mit adenomatös veränderten Krypten mit Proliferationen von Epithelzellen. Im Kryptlumen befindet sich zum Teil Zelldetritus. Es ist eine hochgradige Reduktion der Becherzellen zu erkennen. Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden. Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen. Legende: vereinzelte Becherzellen in den Krypten unregelmäßig erscheinende Krypten mit mehrschichtigem Kryptzellepithel und Zelldetritus 82 Ergebnisse Abbildung 21: Ileum, hochgradig proliferierte Krypte (Tier 19) Das Bild zeigt eine hochgradig proliferierte Krypte des Ileums. Die Epithelzellen sind unreif und zeigen vesikuläre Zellkerne. In der Krypte befinden sich vermehrt Mitosefigur (Vergrößerung x 400, Färbung HE). Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden. Legende: Mitosefiguren unreife Epithelzellen 83 Ergebnisse Abbildung 22: Caecum, hochgradige fibrinös-ulzerative und proliferative Veränderungen (Tier 49) Das Bild zeigt eine hgr. fibrinös-ulzerative und proliferative Typhlitis. Makroskopisch waren vom Jejunum bis ins Colon reichende Ulzerationen mit Fibrinauflagerungen zu erkennen (Vergrößerung x40, Färbung HE). Das Tier schied bereits in der 6. Lebenswoche Erreger mit dem Kot aus. In der 8. Lebenswoche fand die Serokonversion und auch die Sektion statt. Zum Zeitpunkt der Sektion hatte dieses Tier einen wässrigen Durchfall. Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen. Legende: Entzündungszellen hgr. Ulzeration mit großflächiger Fibrinauflagerung mgr.-hgr. proliferierte Krypten, teilweise mit Kryptabszessen 84 Ergebnisse Abbildung 23: Caecum, normales Krypepithel mit vermehrten Becherzellen und apoptotischen Körperchen (Tier 50) Das Bild zeigt ein weitgehend normales Kryptepithel, in dem vermehrt Becherzellen und vereinzelt apoptotische Körperchen erkennbar sind (Vergrößerung x100, Färbung HE). Das Tier schied von der 7 bis zur 14 Lebenswoche Erreger aus (eine Unterbrechung in der 10. LW). Die Serokonversion fand in der 9. LW statt. Der positive Titer hielt bis zur Sektion in der 15. LW an. Die Kotkonstistenz war einmalig in der 11. LW dünnbreiig. In der Immunhistologie konnte LI-Antigen nur in Rundzellen gefunden werden, nicht aber im Kryptepithel. Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen. Legende: Becherzellhyperplasie Apoptotische Körperchen 85 Ergebnisse Abbildung 24: Ileum, stark vermehrte Becherzellen und deutlich in der Länge reduzierte Darmzotten (Tier 23) Das Bild zeigt stark vermehrte Becherzellen und eine deutlich reduzierte Länge der Zotten. Aufgrund der reduzierten Zottenlänge und der vorangegangenen positiven Infektionsnachweise kann angenommen werden, dass sich dieses Tier in einem Rekonvaleszensstadium befand. In der HE-Färbung waren keine proliferativen Veränderungen zu erkennen (Vergrößerung x40, Färbung HE). Das Tier serokonvertierte in der 12. Lebenswoche und war einmalig in der 13. Lebenswoche PCR-positiv. Der ELISA-Titer war nur in der 12. und 13. Lebenswoche positiv, und fraglich in den Wochen 14 und 15. Zum Zeitpunkt der Sektion, in der beginnenden 17. Lebenswoche, war das Tier in ELISA und PCR negativ. Immunhistologisch war LI nicht nachzuweisen. Der Gesamtbefund des Tieres ist Tabelle 20 zu entnehmen. Legende: Becherzellenhyperplasie / stark verkürzte Zottenlänge 86 Ergebnisse Abbildung 25: Caecum, immunhistologische Darstellung von LI- spezifischem Antigen in Krypten und Rundzellen (Tier 19) Immunhistologisch ist ein hgr. Gehalt an LI-Antigen darstellbar (Vergrößerung x40, ABC-Methode). Positive Reaktion im luminalen Kryptepithel und vereinzelten Rundzellen der Lamina propria. Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden. Legende: LI-infizierte Rundzellen in der Lamina propria braun markiertes LI-Antigen in infizierten Kryptepithelzellen 87 Ergebnisse Abbildung 26: Caecum, immunhistologischer Nachweis von LI- spezifischem Antigen in einer Krypte (Tier 19) Lawsonien (braun gefärbt) befinden sich im zytoplasmatischen Bereich der Kryptenterozyten (Vergrößerung x400, ABC Methode). Das Tier war LI-positiv (PCR) in Lebenswoche 7 und 8, Antikörper gegen LI (ELISA) konnten zum Zeitpunkt der Sektion in Lebenswoche 8 nachgewiesen werden. Legende: braun markiertes LI-Antigen in infizierten Kryptepithelzellen 88 Ergebnisse Abbildung 27: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer mit LI infizierten Zelle. (Tier 49). Vergrößerung x 12.500 Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule, Hannover; Dr. B. Jacobsen LI im apikalem Bereich der Epithelzelle (Bakterienzellen im Anschnitt) Zellkern 89 Ergebnisse Die sezierten und histologisch untersuchten 51 Versuchstiere wurden in Abhängigkeit vom Zeitpunkt des ersten Infektionsnachweises und dem Zeitpunkt der Sektion in Gruppen eingeteilt (s. Kap. 3.9) und anhand des histologischen Gesamtscores für 9 Darmlokalisationen (maximal möglicher Wert 252) mit der Kontrollgruppe (n=5) verglichen. In der Negativ-Kontrollgruppe wurde ein mittlerer histologischer Score-Wert von 0,28+0,33 gefunden und ein signifikanter Unterschied (p<0,05) zu allen anderen Gruppen festgestellt. Das einzelne LI-negative Versuchstier hatte einen Score-Wert von 6,4. Dieses Tier wurde in den statistischen Vergleich nicht einbezogen. Bei den Tieren, deren erster Nachweis einer LI-Infektion erst durch die immunhistologische Untersuchung bei der Sektion gefunden wurde (Gruppe 1), konnte der Infektionszeitpunkt nicht näher eingegrenzt werden. Die Schweine hatten einen durchschnittlichen Score-Wert von 15,6+12,24. Diese Gruppe unterschied sich signifikant von der Kontrollgruppe, nicht aber von Gruppe 2 und 3. Die Tiere der Gruppe 2 (Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor Sektion) wiesen den höchsten mittleren Score-Wert mit 28,77+24,51 auf. Diese Gruppe unterschied sich signifikant (p<0,05) von der Kontrollgruppe und von der Gruppe 3 (Nachweis der LIInfektion > 3 Wo vor Sektion), bei der ein Score-Wert von 3,39+2,05 ermittelt werden konnte (Abb. 28). 90 Ergebnisse Negativ-Kontrolle 60 b Histologischer Gesamtscore 50 neg. Versuchstier 40 bc erster Infektionsnachweis zeitgleich zur Sektion (Gruppe 1) 30 erster infektionsnachweis 1-3 Wochen vor Sektion (Gruppe 2) 20 c 10 erster Infektionsnachweis >3 Wochen vor Sektion (Gruppe 3) a 0 n=5 Abbildung 28: n=1 n=5 Durchschnittliche n=21 n=23 Ausprägung der histologischen Veränderungen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer Gesamtscore für 9 Darmlokalisationen: 252); unterschiedliche Buchstaben: p<0,05 91 Ergebnisse Histologischer Gesamtscore 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 Abbildung 29: 2 4 6 8 10 Abstand zwischen erstem Nachweis und Sektion (Wochen) Korrelation zwischen dem Grad der 12 histologischen Veränderungen (Gesamtscore für 9 Darmlokalisationen) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Nachweis einer LI-Infektion (PCR und/oder ELISA, n=44) und der Sektion (y= -4,3985x+35,598; r= -0,5753, p<0,001) Es konnte eine hochsignifikante negative Korrelation zwischen dem Grad der histologischen Läsionen (Gesamtscore für 9 Darmlokalisationen) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Nachweis einer LI-Infektion (PCR, ELISA, n=44) und der Sektion nachgewiesen werden (r= -0,5753, p<0,001). Die Einzelwerte für den Gesamtscore lagen in einem Bereich von 0 bis maximal 74,4. Deutlicher ausgeprägte histologische Veränderungen (Score>10) waren nur innerhalb der ersten 3 Wochen nach Infektionsnachweis auffindbar. Zu späteren Zeitpunkten lagen nur noch geringgradige Läsionen vor (Score <10) (Abb. 29). 92 Ergebnisse In Abb. 30 wird die histologische Beurteilung der einzelnen Darmabschnitte für die Kontrollgruppe und die Gruppen 2 und 3 dargestellt. Innerhalb der NegativKontrollgruppe unterschieden sich die Bewertungen für die einzelnen Darmabschnitte nicht von einander. Die Gruppe 2 (Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor Sektion) zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe deutliche Veränderungen an fast allen untersuchten Darmlokalisationen (p<0,05) außer im Bereich von Jejunum und Colon descendens. Die Bereiche mit ausgeprägten Läsionen unterschieden sich vom Grad her jedoch statistisch untereinander nicht. Die Gruppe 3 zeigte nur in einzelnen Lokalisationen Befunde, die sich signifikant von der Kontrollgruppe unterschieden (p<0,05, Papilla ilealis, frei wählbare Lokalisation am Colon ascendens), der Grad der Läsionen hier war aber immer noch wesentlich geringer als bei der Gruppe 2 (p<0,05). In den übrigen Bereichen waren nur minimale Veränderungen wie bei den Negativ-Kontrolltieren auffindbar. 12 b Negativ Kontrolle n =5 b b b 8 b 6 b b c 4 a Abbildung 30: Darmabschnitte d a a i de sc en de ns a a on a as c. fre a a C ol on a C ol on i fre Ile um Ile um Je j un um Ü be rs i ch t 0 a C ol a fr e i a a m a C ae cu a C ae cu a ile al is a Pa pi lla 2 m Histologischer Score 10 a erster Infektionsnachweis 1-3 Wochen vor Sektion n=21 (Gruppe 2) erster Infektionsnachweis >3 Wochen vor Sektion n=23 (Gruppe 3) Grad der histologischen Veränderungen an den einzelnen untersuchten Darmlokalisationen in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR, ELISA oder IH) und der Sektion (max. erreichbarer Score 28); unterschiedliche Buchstaben p<0,05 93 Ergebnisse 4.3 Immunhistologische Untersuchungen auf Lawsonia intracellularis Bei der immunhistologischen Untersuchung wurden für jedes Tier 4 Darmlokalisationen (Ileum, Papilla ilealis, Caecum und Colon ascendens) sowie zwei Darmlymphknoten (Lnn. jejunales, Lnn. ileocolici) kontrolliert. Das LI-spezifische Antigen konnte mit der ABC-Methode intrazytoplasmatisch im luminalen Kryptepithel sowie in Rundzellen nachgewiesen werden (Abb. 25, 26). Bei einem Tier konnte keinerlei positiver Nachweis für eine LI-Infektion geführt werden (PCR, ELISA, IH). Fünf der Versuchstiere blieben bis zur Sektion negativ (PCR, ELISA), den ersten positiven Nachweis stellte die immunhistologische Untersuchung des Darmes bei der Sektion dar (Gruppe 1). Bei den Schweinen der Gruppe 2, bei denen ein Abstand von 1-3 Wochen zwischen dem ersten positiven LINachweis (PCR, ELISA) und der Sektion lag, waren 19 von 22 Tieren in mindestens einer der immunhistologisch untersuchten Lokalisationen positiv (81,8 %), bei drei Tieren konnte LI weder im Darm noch in den Lymphknoten gefunden werden. War der Abstand zwischen Infektionsnachweis und Sektion größer als drei Wochen (Gruppe 3), konnte nur noch bei 11 von 23 Tieren (47,8 %) mindestens ein positiver IH-Nachweis geführt werden, 12 von 23 Tieren blieben negativ bei der IHUntersuchung (Abb. 31). 94 Ergebnisse 20 18 16 Tiere (n) 14 12 10 8 6 4 2 0 IH erster Infektionsnachweis (Gruppe 1, n = 5) erster Infektionsnachweis 1-3 erster Infektionsnachweis >3 Wochen vor Sektion Wochen vor Sektion (Gruppe 2, n = 22) (Gruppe 3, n = 23) Abstand zwischen erstem pos Befund (PCR, ELISA, IH) und Sektion Abbildung 31: IH + IH - Immunhistologische Befunde der Untersuchung auf LI (IH positiv (+) oder negativ (-)) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR und/oder ELISA) und dem Zeitpunkt der Sektion Betrachtet man die Lokalisationen, an denen mittels IH LI nachgewiesen wurde, so zeigt sich in Gruppe 1, dass LI bei allen 5 Schweinen im Ileum zu finden war, während die übrigen Darmbereiche weniger häufig einen Nachweis erbrachten. Nur ein Tier wies einen positiven Befund im Lymphknoten auf (Abb. 32, 33). Bei kurz zurückliegendem Infektionszeitpunkt (Gruppe 2, n=22) wurde LI bei insgesamt 19 Schweinen nachgewiesen. Der Erreger war bei der Mehrzahl der Tiere in allen untersuchten Darmabschnitten zu beobachten (bei allen 19 im Darm als positiv erkannten Tieren an der Papilla ilealis, jeweils bei 16 der Tiere im Ileum bzw. im Caecum, bei 14 der Tiere im Colon ascendens). Bei 13 dieser Schweine befand sich der Erreger gleichzeitig im Darm und in Lymphknoten. Nur bei einem Tier war LI ausschließlich in einem Lymphknoten zu finden. Insgesamt waren die Lnn. ileocolici bei 14 Tieren und die Lnn. jejunales bei 10 Tieren LI-positiv. Lediglich bei 3 Schweinen (13,6 %) konnte LI an keiner der untersuchten Lokalisationen gefunden werden (Abb. 32, 33). Bei schon länger zurückliegendem Infektionszeitpunkt (Gruppe 3, n=23) gelang bei 12 Tieren (52,2 %) kein LI-Nachweis. Bei dem überwiegenden Teil der als positiv erkannten Tiere (n=11) war nur noch ein positiver Befund in einem Lymphknoten 95 Ergebnisse nachzuweisen (n=7). Nur ein Tier wies LI sowohl im Darmbereich als auch in einem Lymphknoten auf. Bei 3 Schweinen wurde LI lediglich im Darm gefunden (1x gleichzeitig in Ileum und Caecum, 2x gleichzeitig in der Papilla ilealis und im Colon). Bei den Lymphknoten waren hier acht Tiere in den Lnn. ileocolici und drei in den Lnn. jejunales positiv (Abb. 32, 33). 14 kein Nachweis 12 10 Ausschließlich Darm pos. Tiere (n) 8 6 4 Darm und Lymphknoten pos. 2 0 kein Infektionsnachweis (n = 1) IH erster Infektionsnachweis (Gruppe 1, n = 5) erster erster Infektionsnachweis 1- Infektionsnachweis >3 3 Wochen vor Sektion Wochen vor Sektion (Gruppe 2, n = 22) (Gruppe 3, n = 23) nur Lymphknoten pos. Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR und / oder ELISA) und Sektion Abbildung 32: Vergleich aller immunhistologischen Ergebnisse in Abhängigkeit von der untersuchten Lokalisation (Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion 96 Tiere (n) Ergebnisse Ileum 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Papila ilealis Caecum Colon kein Infektionsnachweis (n=1) Abbildung 33: Abhängigkeit IH erster Infektionsnachweis (Gruppe 1, n = 5) erster erster Infektionsnachweis 1-3 Infektionsnachweis >3 Wochen vor Sektion Wochen vor Sektion (Gruppe (Gruppe 3, n = 23) (Gruppe 2, 2, Ileum, Ileum, Papillailealis ilealis n = 22; 22; Papilla Caecum, Colon Colonnn==21) 21) Caecum, Lnn. ileocolici Lnn. jejunales Vergleich der immunhistologisch positiven Ergebnisse in von den einzelnen untersuchten Lokalisationen (Darm/Lymphknoten) und vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion Aus Tab. 21 wird ersichtlich, dass bei den Tieren, die im Alter zwischen 8 und 13 Wochen zur Sektion gelangten, LI mittels IH fast immer nachgewiesen werden konnte. Ab einem Alter von 14 Wochen nimmt die Nachweisrate deutlich ab, zum letzten Untersuchungszeitpunkt in Woche 27 konnte bei keinem Tier mehr LI gefunden werden. 97 Ergebnisse Tabelle 21: Ergebnis der immunhistologischen Untersuchungen von Darm und Lymphknoten auf LI in Abhängigkeit vom Sektionszeitpunkt Sektion in 8 9 10 11 12 13 14 15 16 27 Summe Prozent 5 5 5 5 6 5 5 5 5 5 51 100 5 5 4 5 5 4 3 3 1 0 35 68,6 0 0 1 0 1 1 2 2 4 5 16 31,4 Lebenswoche Anzahl untersuchter Tiere (n) davon LIpositiv (n) davon LInegativ (n) Für die immunhistologische Untersuchung wurde auch eine semiquantitative Befundung vorgenommen (IH-Score für einzelne untersuchte Lokalisationen, s. Tab. 9). Wie auch bei den histologischen Veränderungen ergab sich, dass das Vorhandensein und die Menge des Erregers im Darm stark abhängig von dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis und der Sektion war (r = 0,6878, p<0,001). Je länger der Infektionszeitpunkt zurücklag, desto geringer war die Erregermenge, die in den einzelnen Darmabschnitten beobachtet werden konnte (Abb. 35). Bei dem Vergleich der einzelnen Darmlokalisationen wurde für die Gruppe 1 (Nachweis der LI-Infektion zeitgleich zur Sektion) und Gruppe 2 (Nachweis der LIInfektion 1-3 Wo vor Sektion) in allen untersuchten Bereichen ein deutlich höherer Gehalt an LI gefunden (p<0,05) als in Gruppe 3 (Nachweis der LI-Infektion > 3 Wo vor Sektion). Innerhalb der Gruppen konnte für die kontrollierten Lokalisationen zwar tendenziell unterschiedlicher Erregergehalt beobachtet werden, diese Differenzen waren jedoch statistisch nicht signifikant (Abb. 34). Im Gegensatz zu den Darmlokalisationen zeigten die untersuchten Darmlymphknoten auch noch nach einem Zeitraum von mehr als drei Wochen zwischen ersten positiven Nachweis und Sektion (Gruppe 3) ähnlich starke LI- 98 Ergebnisse Konzentrationen wie die Schweine der Gruppe 2, die deutlich früher nach Infektionsbeginn zur Sektion kamen (Abb. 34). 5,00 IH erster Infektionsnachweis (Gruppe 1, n = 5) a a 4,50 4,00 a IH-Score 3,50 a 3,00 a 2,50 a a 2,00 a a 1,50 a 1,00 b b b 0,50 a a b b c erster Infektionsnachweis >3 Wochen vor Sektion (Gruppe 3, n = 23) Ln . Il e oc ol ic i je un al es Ln . C ol on C ae cu m Pa pi lla ile al is 0,00 Il e um erster Infektionsnachweis 1-3 Wochen vor Sektion (Gruppe2,2,Ileum, Ileum, Papilla (Gruppe ilealis n = 22; Papilla ilealis n Caecum, = 22; Colon n =Colon 21) n =21) Caecum, Darmabschnitt Abbildung 34: Vergleich der Häufigkeit des LI-Nachweises mittels Immunhistologie für die untersuchten Lokalisationen an Darm (max. IH-Score pro Darmabschnitt: 6) und Lymphknoten (max. IH-Score pro Lnn.: 3) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zwischen erstem positiven LI-Befund (PCR und/oder ELISA) und der Sektion (unterschiedliche Buchstaben p<0,05)(Gruppe 2: Ileum, Papilla ilealis n = 22; Caecum, Colon n = 21). Für die Korrelationsberechnung zwischen der Erregerhäufigkeit und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion wurde sowohl ein Gesamtscore für alle 4 untersuchten Darmabschnitte ohne Berücksichtigung der Lymphknotenbefunde (Gesamt-IH-Score max. 24) als auch mit Berücksichtigung der Lymphknotenbefunde (Gesamt-IH-Score max. 30) erstellt (Abb. 35, 36). Dabei ließ sich jeweils eine hochsignifikante, negative Korrelation feststellen (p<0,01), die bei Einbeziehung der Lymphknotenbefunde etwas schwächer ausfiel als bei der Betrachtung der Darmbefunde allein (r= -0,6320 bzw. r= -0,6878). 99 Ergebnisse Für die Tiere aus der Gruppe 2 wurde außerdem der LI-Befall der einzelnen Darmabschnitte für die einzelnen Zeitabschnitte (Woche 1-3 nach erstem Infektionsnachweis) betrachtet (Tab. 23). Dabei ist zu erkennen, dass schon in der ersten Woche LI in allen untersuchten Darmabschnitten zu finden ist, wobei das Caecum einen etwas geringeren Befall aufwies. LI war sowohl in Kryptzellen als auch in Rundzellen zu beobachten. Zur dritten Woche nahm der LI-Gehalt in allen Lokalisationen tendenziell ab. Die Unterschiede zwischen den Untersuchungs- IH-Score aller Darmabschnitte ohne Lymphknoten zeitpunkten bzw. Lokalisationen waren jedoch nicht signifikant (p>0,05) 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Wochen zwischen erstem Infektionsnachweis und Sektion Abbildung 35: Korrelation zwischen der semiquantitaiven Bestimmung des LI Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen (Gesamt-IH-Score max. 24) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion (n = 45, y = -1,2522x + 9,5387; r = -0,6878, p>0,001) 100 IH-Score aller Darmabschnitte und Lymphknoten Ergebnisse 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Wochen zwischen erstem Infektionsnachweis und Sektion Abbildung 36: Korrelation zwischen der semiquantitativen Bestimmung des LI-Gehalts in den untersuchten Darmlokalisationen sowie in den untersuchten Lymphknoten (Gesamt-IH-Score max. 30) und dem zeitlichen Abstand zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und der Sektion (n = 45, y = -1,3888x + 11,225; r = -0,6320, p<0,001) Tabelle 22: Durchschnittliche IH-Scores (x+s) für die untersuchten Darmabschnitte in Gruppe 2 unter Berücksichtigung des zeitlichen Abstands zwischen erstem Infektionsnachweis (PCR/ELISA) und Sektion (unterschiedliche Buchstaben p<0,05) Wochen zwischen erstem Infektionsnachweis und Sektion Lokalisation Krypten Ileum Rundzellen Krypten Papilla ilealis Rundzellen Krypten Caecum Rundzellen Krypten Colon Rundzellen Tiere (n) x±s x±s x±s x±s x±s x±s x±s x±s 1 2 3 1,6 ± 1,52 a 1,44 ± 1,19 a 1,4 ± 1,24 a 1 ± 0,58 a 0,46 ± 0,57 a 0,76 ± 0,36 a 1,32 ± 1,24 a 0,8 ± 0,68 a 5 0,95 ± 1,08 a 1,63 ± 1,18 a 1,5 ± 1,12 a 1,48 ± 0,79 a 0,58 ± 0,91 a 0,75 ± 0,81 a 0,95 ± 1,25 a 1,05 ± 1,01 a 8 0,69 ± 1,01 a 0,78 ± 0,94 a 0,76 ± 0,61 a 0,76 ± 0,61 a 0,53 ± 0,95 a 0,53 ± 0,62 a 0,38 ± 0,57 a 0,49 ± 0,60 a 9 Signifikante positive Korrelationen zwischen dem Ausmaß der histologischen Veränderungen (Histologie-Score) und der Häufigkeit des Erregers (IH-Score) in den 101 Ergebnisse jeweiligen Darmabschnitten konnten nur für die Gruppe 2 nachgewiesen werden (p<0,001). In den Gruppen 1 und 3 bestand dieser Zusammenhang nicht (Tab. 23). Tabelle 23: Korrelationen zwischen Histologie-Score und Immunhistologie-Score für die 4 untersuchten Darmabschnitte innerhalb der Gruppen 1-3 (r= Spearman´s Rang Korrelationskoeffizient, Gruppe 2: Ileum, Papilla ilealis n=22, Caecum, Colon ascendens n=21) Gruppe 1 (n=5) Gruppe 2 (n=21/22) Gruppe 3 (n=23) r p-Wert r p-Wert r p-Wert Ileum 0,6669 0,2189 0,7932 <0,0001 -0,1788 0,4145 Papilla ilealis 0,9167 0,0285 0,6761 0,0006 0,3807 0,0731 Caecum 0,5000 0,3910 0,7533 <0,0001 0,1839 0,4008 Colon ascendens 0,7632 0,1333 0,8583 <0,0001 0,0797 0,7177 4.4 Verdaulichkeitsanalyse In Tabelle 24 sind die ermittelten präzäkalen Verdaulichkeiten für die verschiedenen untersuchten Parameter dargestellt. Dabei wird wiederum zwischen den frisch infizierten Tieren (Gruppe 2, Nachweis der LI-Infektion 1-3 Wo vor Sektion) und den Tieren, bei denen der Infektionszeitpunkt schon länger zurücklag (Gruppe 3, Nachweis der LI-Infektion > 3 Wochen vor Sektion) verglichen. Vergleichsweise werden die Werte für das LI-negative Tier mit angeführt. Statistische Unterschiede hinsichtlich der präzäkalen Verdaulichkeit bestanden nur für das Rohprotein, das für die Gruppe 2 eine höhere Verdaulichkeit aufwies (p<0,05), und für das Kalzium, bei dem in der Gruppe 2 eine geringere Verdaulichkeit als in Gruppe 3 vorlag (p<0,05). 102 Ergebnisse Tabelle 24: Präzäkale Verdaulichkeiten für verschiedene Futterparameter bei einem LI-negativen Tier sowie Gruppe 2 (Nachweis der LIInfektion 1-3 Wo vor Sektion) und Gruppe 3 (Nachweis der LI-Infektion > 3 Wo vor Sektion) im Vergleich (unterschiedliche Buchstaben p<0,05). LI Präzäkale Nachweis der LI- negatives Infektion 1-3 Wo vor Verdaulichkeit Nachweis der LIInfektion > 3 Wo vor Tier Sektion (Gr. 2) Sektion (Gr. 3) x+s 68 56,79+10,14a 47,73+16,80a n 1 19 15 x+s 73 49,37+29,16a 19,67+40,80b n 1 19 15 x+s 48 40,59+27,71a 37,58+27,12a n 1 17 12 65 52,32+12,54a 36,20+23,44a n 1 19 15 x+s 73 62,89+17,06a 79,00+14,32b n 1 19 15 x+s 47 41,21+18,37a 48,40+18,00a n 1 19 15 Organische Substanz (%) Rohprotein (%) Rohfett (%) Bruttoenergie (%) x+s Ca (%) P (%) 103 Diskussion 5 Diskussion In der vorliegenden Arbeit sollten zeitliche Zusammenhänge zwischen fäkaler Erregerausscheidung, klinischen und pathologischen Symptomen und der Serokonversion im Fall einer subklinischen LI-Infektion untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde eine Gruppe von 60 gleichaltrigen Tieren in einem Betrieb, in welchem vorberichtlich eine subklinische Infektion mit LI vorlag, als Versuchsgruppe zusammengestellt, um den Verlauf der Infektion näher zu beschreiben. Diese Tiere wurden gemäß einem Probenplan wöchentlich untersucht. Versuchsbeginn war die 6. Lebenswoche der Tiere. Im Rahmen der wöchentlichen Untersuchungstermine wurden Blutproben zur serologischen Diagnostik und Kotproben zum PCR Nachweis entnommen. Zusätzlich wurde die Gewichtszunahme der Tiere erfasst (Tab. 6). Zwischen der 8. und 16. Lebenswoche und zur 27. Woche wurden wöchentlich fünf Tiere seziert. Nach makroskopischer Untersuchung wurden Proben gemäß Tabelle 7 entnommen und in Formalin fixiert. Diese Proben wurden nach Hämatoxilin-EosinFärbung und nach immunhistologischer Färbung histologisch untersucht. 5.1 Klinische Befunde Bei dem Infektionsgeschehen im Versuchsbetrieb handelte es sich eindeutig um einen subklinischen Verlauf der porzinen proliferativen Enteropathie (PPE). Kurzzeitiger wässriger Durchfall trat nur bei einem von 60 Tieren auf, eine Beteiligung einer E.-coli-Infektion bei diesem Tier kann nicht ausgeschlossen werden. Bei sieben Schweinen konnte lediglich an ein oder zwei Untersuchungszeitpunkten dünnbreiiger Kotabsatz beobachtet werden (Tab. 13). Die klinische Beurteilung der Kotkonsistenz erfolgte gemäß einer Score-Einteilung von null bis drei. Die subjektive Beurteilung der Kotkonsistenz macht eine Vergleichbarkeit mit Scores anderer Arbeitsgruppen schwierig (KYRIAKIS et al. 2002a; KYRIAKIS et al. 2002b; KROLL et al. 2004a; ALEXOPOULOS et al. 2006). Eine objektive Vergleichbarkeit für die Bewertung der Kotkonsistenz hinsichtlich 104 Diskussion eines Durchfallgeschehens kann nur erreicht werden, wenn eine Trockensubstanzbestimmung vorgenommen wird. 5.2 Erregerausscheidung und Serologie Der direkte oder indirekte Erregernachweis gilt als beweisend für eine Infektion mit dem Erreger. Um einen Zusammenhang zu möglichen klinischen Krankheitssymptomen der PPE belegen zu können, sollten darüber hinaus weitere pathomorphologische und pathohistologische Untersuchungen durchgeführt werden (MCORIST u. GEBHART 1999; LAWSON u. GEBHART 2000; KROLL et al. 2005b; JENSEN et al. 2006b) Die Versuchsgruppe wurde nach dem Absetzen in einen Flatdeck-Stall verbracht und in Boxen zu jeweils zehn Tieren aufgeteilt. Neben den Versuchstieren waren in diesem Stallabteil vier Boxen mit gegen LI geimpften (Enterisol®ileitis, Boehringer Ingelheim, Ingelheim) Altersgenossen besetzt (Abb. 4). Die Infektionsrate der Versuchstiere, die am Ende der Flatdeckphase bei 70 % lag, wurde durch die Anwesenheit der geimpften Tiere nicht wesentlich beeinflusst. Eine Auswirkung auf den klinischen Krankheitsverlauf bei den Versuchstieren durch eine Senkung des Erregerdruckes im Stall infolge der Impfung der Stallgenossen kann nicht ausgeschlossen werden (KROLL et al. 2004a). Auch ein Einfluss durch die Entfernung von Erregerausscheidenden Versuchstieren zu den wöchentlichen Sektionen ist möglich. Die 6. Lebenswoche wurde als Beginn der Untersuchungen gewählt. Es zeigte sich, dass bereits zu diesem Zeitpunkt die ersten Tiere LI ausschieden (n=3, Abb. 7). Um zu belegen, dass die Ferkel eventuell bereits im Abferkelbereich infiziert wurden, hätte eine Untersuchung direkt beim Absetzen erfolgen müssen. Aufgrund einer im Vorfeld des Versuches im Betrieb abgelaufenen serologischen Screening- Untersuchung wurde jedoch mit einem solch frühen Infektionszeitpunkt nicht gerechnet. Ein erstes Antikörper-positives Tier wurde ebenfalls in der 6. Lebenswoche nachgewiesen (Abb. 11). KNITTEL et al. (1998) konnten maternale Antikörper bis zur 6. Lebenswoche nachweisen. Im vorliegenden Fall spricht jedoch der positive Antikörpertiter, der fortlaufend bis zur 12. Lebenswoche anhielt, für eine frühe 105 Diskussion Infektion des Tieres. Um den Titerverlauf der maternalen Antikörper darstellen zu können, hätte als Studienbeginn der Zeitpunkt der Geburt gewählt werden müssen. Als Infektionsquelle für die Absetzferkel kommen die Muttersauen, ältere Aufzuchtund Mastschweine im Betrieb, eventuell kontaminierte Stalleinrichtungen, Arbeitsgeräte sowie Schadnager in Frage (COLLINS et al. 2000a; GUEDES 2004; MAUCH u. BILKEI 2004; CESAR et al. 2005). Trotz der räumlichen Trennung in Gruppen zu jeweils zehn Tieren zu Beginn der Studie breitete sich die Infektion zeitversetzt in allen Buchten aus. Die Infektionsrate am Ende der Flatdeckphase in der 10.Woche lag zwischen 30 und 90 % pro Bucht (Abb. 5, 6). Nach den Ergebnissen von BRONSVOORT et al. (2001) sowie BARNA und BILKEI (2003) hatte die Parität der Sauen einen deutlichen Einfluss auf das Infektionsgeschehen bei den Nachkommen. In dieser Studie blieben das Alter der Sauen und die Anzahl ihrer Würfe unberücksichtigt. Eine mögliche Einflussnahme konnte in dieser Studie nicht geprüft werden. Werden die Ergebnisse aller Untersuchungsmethoden zum direkten und indirekten Nachweis der LI-Infektion gemeinsam betrachtet, so kann damit belegt werden, dass sich bis auf ein Tier alle Versuchstiere mit dem Erreger infizierten (Tab. 16 und 17). Dieses Tier wurde jedoch bereits in der 10. Lebenswoche seziert. Da noch deutlich später Erstinfektionen nachgewiesen wurden (Abb. 7, 11), wäre bei diesem Tier eine Infektion noch zu einem späteren Zeitpunkt möglich gewesen. Diese hohe Durchseuchungsrate entstand trotz der Entfernung Erregerausscheidender Tiere durch die wöchentliche Sektion. Die Nachweisrate bei den einzelnen diagnostischen Verfahren war jedoch unterschiedlich hoch. Bei der Untersuchung auf eine fäkale Ausscheidung wurden nur 65 % der Versuchstiere als LI-positiv erkannt, während eine Serokonverversion bei 81,7% der Tiere nachgewiesen werden konnte (Tab. 14). Mittels Immunhistologie konnte der Erreger bei 68,6 % der sezierten Tiere entdeckt werden (Tab. 21). Dabei müssen jedoch die unterschiedlichen Sektionszeitpunkte berücksichtigt werden, zu denen im Einzelfall auch Tiere herangezogen wurden, bei denen entweder noch kein Infektionsnachweis vorlag oder bei denen die Infektion schon abgeklungen war. 106 Diskussion Ähnliche Nachweisraten zeigte eine Verlaufsstudie aus Dänemark. Hier konnte unter den Bedingungen einer natürlichen Infektion der Erreger während Aufzucht und Mast bei 57 % der Schweine (n=30) im Kot gefunden werden, eine Serokonversion am Ende der Mast wiesen dagegen 90 % der Tiere auf. Mittels Immunhistologie konnte LI zur Schlachtung nur im Darm von 30 % der Tiere nachgewiesen werden (JENSEN et al. 2005). Ein erstmalig positiver PCR Befund konnte bei den hier untersuchten Schweinen am häufigsten zur 9. und 10. Lebenswoche gefunden werden und weist hier übereinstimmend mit den zumeist bis zur 12. Woche erfolgten Serokonversionen auf das Hauptinfektionsgeschehen hin. Nach der 13. Woche wurden keine Neuausscheider mehr gefunden, nach der 14. Lebenswoche konnte bei keinem Tier ein positiver PCR Befund im Kot geführt werden. Die PCR Nachweise im Kot waren zumeist nur auf ein kurzes Zeitfenster von ein bis zwei Wochen beschränkt. In dem vorliegenden Versuch schieden 31 von 39 Tieren LI für diesen Zeitraum fäkal aus. Nur bei acht Tieren wurde eine länger andauernde Erregerausscheidung festgestellt (Abb. 8). Hier muss allerdings berücksichtigt werden, dass bei einigen Tieren eine möglicherweise länger andauernde Erregerausscheidung durch die Sektion der Tiere unterbrochen wurde. Die bei der PCR im Vergleich zur Serologie geringere Nachweisrate für eine Infektion könnte im Zusammenhang mit dem subklinischen Verlauf stehen. Für eine latente Infektion sind geringere Erregermengen notwendig als für einen klinischen Verlauf (GUEDES 2004). Im Falle einer subklinischen LI-Infektion besteht deshalb die Möglichkeit, dass die Erregerzahl aufgrund einer schwachen Darmbesiedelung unterhalb der Nachweisgrenze für die verwendete PCR liegen kann. Eine nestedPCR mit höherer Sensitivität wäre in diesem Falle zu empfehlen (JONES 1993a, NATHUES 2007). Darüber hinaus muss eine mögliche intermittierende Erregerausscheidung berücksichtigt werden. Bei kürzeren Untersuchungsintervallen wäre möglicherweise die Anzahl der PCR-positiven Tiere höher gewesen. Das Maximum der PCR Nachweise lag zwischen der 9. und 13. Lebenswoche. In diesem Zeitraum zeigten zwischen 22 und 27 % der Tiere einen LI spezifischen PCR Befund (Abb. 9). Da zu keinem Zeitpunkt mehr als ein Drittel der gesamten Gruppe PCR positiv war, ist es ratsam, bei der Bestandsdiagnostik stets eine dieser Prävalenz angemessene Anzahl an Proben zu untersuchen. Der notwendige Stichprobenumfang richtet sich dabei nach der vermuteten Prävalenz, der 107 Diskussion Gruppengröße und der Sicherheit, mit der bei mindestens einem Tier der Erreger nachgewiesen respektive für die Gruppe eine wahre Prävalenz ermittelt werden soll. Nach CANNON und ROE (1982) wären zum Nachweis der Infektion bei einer geschätzten Prävalenz von 30 % und einer Sicherheit von 95 % bei einer Gruppe von zehn Tieren sechs Proben erforderlich, ab 100 Tieren müssten neun Proben entnommen werden. Die serologische Untersuchung lieferte in dieser Studie zwar häufiger einen Nachweis für die LI-Infektion als der PCR Nachweis im Kot, jedoch konnte bei zehn Tieren eine Infektion mittels PCR und/oder IH nachgewiesen werden, ohne dass eine Antikörperbildung vorlag. Bei diesen kann davon ausgegangen werden, dass entweder die Sektion kurz nach erfolgter Infektion stattfand und damit keine messbare Immunreaktion mehr stattfinden konnte, oder die Erregerdosis nicht ausreichte, um eine nachweisbare humorale Immunantwort zu erzeugen (GUEDES et al. 2002a). Der Schwerpunkt der Serokonversionen lag zwischen der 8. und 11. Lebenswoche der Tiere. Es konnte bereits zur 10. Lebenswoche bei mehr als der Hälfte der Tiere (57 %), bzw. zur 11. Lebenswoche bei 68 % eine Serokonversion nachgewiesen werden (Tab. 17). Die letzte nachweisbare Serokonversion wurde in der 26. Lebenswoche beobachtet (Tab. 17). Darüber, ob das Tier schon früher unentdeckt infiziert war, kann nur spekuliert werden da dieses Tier (Nr. 51, Tab. 25) geschlachtet und nicht seziert wurde. In diesem Fall kam es zumindest nicht zur Ausbildung einer porzinen hämorrhagischen Enteritis (PHE), die oft bei noch nicht immunen Endmastschweinen oder Jungsauen auftritt (MCORIST u. GEBHART 1999). Wird der Anteil seropositiver Tiere zu den einzelnen Untersuchungszeitpunkten betrachtet, zeigt sich zur 11. Lebenswoche mit 72 % der höchste Anteil an seropositiven Schweinen (Abb. 12). Mit zunehmendem Alter der Tiere sank der Prozentsatz jedoch kontinuierlich ab. Zum Mastende waren noch 31 % der zu diesem Zeitpunkt untersuchten Schweine seropositiv, bei einer Reihe von weiteren Tieren lagen nur noch fragliche Titer vor. Gründe für das Absinken der Titer bei der Mehrzahl der Tiere bis zum Schlachtzeitpunkt könnten die schon sehr frühzeitig erfolgte LI-Infektion sowie der latente Infektionsverlauf mit vermutlich schwächeren Immunreaktionen sein (JENSEN et al. 2005). Auch die Entfernung LI infizierter Tiere, 108 Diskussion könnte einen Einfluss gehabt haben. GUEDES et al. (2002a) fanden mittels IPMA positive Antikörpertiter über einen Zeitraum von 3 bis 13 Wochen p.i. in Abhängigkeit vom Verlauf und der Schwere der Erkrankung. Serumtiter fielen nach Erreichen des Peaks kontinuierlich ab, je höher der Peak, desto länger waren Antikörper nachweisbar (GUEDES 2004). Die Serokonversion konnte bei einem Großteil der Tiere gleichzeitig mit der ersten feststellbaren Erregerausscheidung bzw. eine Woche später ermittelt werden (Abb. 14). In experimentellen sowie in Feldstudien wurde gezeigt, dass die Tiere schon ein bis zwei Wochen, bevor sie serokonvertierten, den Erreger ausschieden (GUEDES et al. 2002b; GUEDES u. GEBHART 2003b). Berücksichtigt man den wöchentlichen Abstand bei der Beprobung, so passt der Befund ins Bild. Eventuell konnte jedoch auch eine frühere Erregerausscheidung aufgrund eines zunächst zu geringen Keimgehaltes im Kot nicht registriert werden. Nach JENSEN et al. (2005) kann zwischen Erregerausscheidung und Serokonversion sogar ein Zeitraum von zwei bis sechs Wochen liegen. 5.3 Makroskopische Untersuchungen Während der Sektion wurden alle Därme der Sektionstiere einer eingehenden makroskopischen Untersuchung unterzogen. Nach der makroskopischen Untersuchung wurden Teile des Darms an festgelegten Lokalisationen aus Jejunum, Ileum, Caecum, Colon ascendens und Colon descendens entnommen. Zusätzlich zu den festgelegten Lokalisationen wurden in Ileum, Caecum und Colon noch frei wählbare Lokalisationen, welche aufgrund möglichst ausgeprägter makroskopischer Veränderungen gewählt werden sollten, beprobt. Nur in einem Fall (Tiernummer 49, Tab. 25) konnten deutliche makroskopische Veränderungen, die auf eine PPE hinwiesen, festgestellt werden. Bei diesem Schwein zeigte sich eine nekrotisierende Enteritis mit fibrinösen Auflagerungen und Ulzerationen, die sich vom Ende des Jejunums über das Caecum bis zu einem Meter ins Colon ascendens erstreckte. Diese makroskopischen Befunde ließen sich histologisch bestätigen (Abb. 22). Dies Tier wurde in der 8. Lebenswoche seziert. Es war über einen Zeitraum von drei Wochen PCR-positiv und zeigte erst zum Zeitpunkt 109 Diskussion der Sektion eine Serokonversion. Bei diesem Tier handelte es sich um das einzige Tier mit einem deutlichen Durchfallgeschehen. Bei den übrigen Tieren war der Darm in der Regel pathomorphologisch wenig auffällig. Durch die makroskopische Auswahl von Darmlokalisationen konnte die Trefferquote für histologisch nachweisbare proliferative Veränderungen nicht erhöht werden. Eine deutliche Faltenbildung mit Verdickung der Darmwand, die als ein typisches Bild für die intestinale Adenomatose beschrieben wird (SMITH u. LAWSON 2001), wurde zwar häufiger beobachtet, stellte sich aber oft als postmortale Kontraktion des frischen Sektionsgutes dar, ohne dass histologisch proliferative Veränderungen gefunden wurden (vgl. Abb. 16 und 17). Ein Vergleich zwischen den im Vorfeld festgelegten Lokalisationen und den nach augenscheinlicher Betrachtung ausgewählten Darmproben Darmabschnitte zeigte durchgehend hohe für die histologische positive Korrelationen Beurteilung zwischen der diesen Lokalisationen (Tab. 19). Hieraus wird ersichtlich, dass allein nach makroskopischer Betrachtung PPE-typische Darmveränderungen besonders bei subklinischem Krankheitsverlauf nicht sicher erkannt werden können. Dieser Sachverhalt wurde bereits in der Literatur beschrieben. Verschiedene Autoren stellten eine Sensitivität und Spezifität makroskopischer Läsionen von 67 % bzw. 50 % fest und halten es für unbedingt notwendig, eine makroskopische Untersuchung des Darms immer durch weitere diagnostische Methoden abzusichern (HOLYOAKE et al. 1994; HUERTA et al. 2003). 5.4 Trotz Histologische Befunde des größtenteils Versuchstieren, zeigten subklinischen sich bei Verlaufes 27 der Schweinen LI-Infektion in bei Abhängigkeit den vom Sektionszeitpunkt deutliche mikroskopische Veränderungen der Darmschleimhaut im Sinne einer porzinen intestinalen Adenomatose. In allen Fällen waren proliferative Veränderungen des Kryptepithels bei gleichzeitiger Verminderung der Anzahl von Becherzellen zu erkennen. In Abhängigkeit der Ausprägung und der Fläche, über die sich die proliferativen Veränderungen erstreckten, kam es zu Verkürzungen der Darmzotten. In einzelnen Fällen (n=5) waren darüber hinaus ulzerative 110 Diskussion Veränderungen, z.T. auch mit fibrinösem Charakter, ohne Erhalt der Zottenstruktur zu beobachten (Tab. 20). Bemerkenswerterweise konnte aber trotz dieser teils ausgeprägten histologischen Veränderungen des Darmepithels nur bei einem Tier ein deutliches Durchfallgeschehen beobachtet werden. Bei diesem Tier lag allerdings eine Mischinfektion mit einem pathogenen E.-coli-Stamm vor. Die eigenen Fälle mit fibrinös-ulzerativen Schleimhautveränderungen lassen sich von PCV2-assoziierten Enteritiden, die makroskopisch ein gleiches Bild zeigen, unterscheiden, da zusätzlich eine Proliferation der Kryptenterozyten vorlag, dagegen aber keine Histiozytose (JENSEN et al. 2006b). Weitere bakterielle Infektionen (Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira piloscoli, Salmonella sp., Clostridium perfringens) konnten differentialdiagnostisch durch mikrobiologische Untersuchungen ausgeschlossen werden. Als Kontrollgruppe mussten versuchsexterne gesunde Läuferschweine zum Vergleich der histologischen Befunde herangezogen werden. Im Vergleich zwischen Kontrollen und Versuchstieren zeigte sich erwartungsgemäß, dass einige der histologischen Veränderungen nicht ausschließlich auf eine LI-Infektion zurückzuführen waren. Als unspezifische Reaktionen müssen Kryptabszesse, Gefäßstauungen und Entzündungszellinfiltration gewertet werden. Diese Parameter ließen sich in dieser Studie sowohl in Fällen einer subklinischen PPE als auch vereinzelt bei den Kontrolltieren finden. In der Negativ-Kontrollgruppe wurde ein mittlerer Score-Wert für die histologischen Veränderungen von 0,28 gemessen, jedoch ein signifikanter Unterschied zu den anderen Gruppen der mit LI-infizierten Tieren festgestellt. Das einzelne LI-negative Versuchstier hatte einen Score-Wert von 6,4 (Abb. 28, Tiernummer 31, Tab. 20, 25). Histologische Befunde im Sinne einer Muskelhypertrophie, welche auf eine chronisch verlaufende regionale Ileitis hinweisen würde, oder auch Hämorrhagien, die auf eine porzine hämorrhagische Enteropathie gedeutet hätten, wurden nicht gefunden. Die histologische Untersuchung zeigte deutlich einen Zusammenhang zwischen der Infektionsdauer und dem Ausmaß der histologischen Veränderungen. Dabei wurde die Infektionsdauer näherungsweise als Zeitraum zwischen dem ersten direkten und/oder indirekten LI-Nachweis und dem Sektionszeitpunkt definiert. Es muss dabei berücksichtigt werden, dass aufgrund der Zeitspanne zwischen Infektionszeitpunkt und erster Ausscheidung im Kot und aufgrund des wöchentlichen 111 Diskussion Untersuchungsintervalls der tatsächliche Infektionszeitpunkt wahrscheinlich einige Tage früher gelegen haben dürfte. Je dichter der erste Infektionsnachweis und die Sektion zeitlich zusammen lagen, umso deutlicher waren die histologischen Veränderungen ausgeprägt (Abb. 29). Der Zeitraum, in dem sich die stärksten histologischen Veränderungen zeigten, lag zwischen einer und drei Wochen nach erstem Infektionsnachweis (Gruppe 2). Lag der erste Infektionsnachweis länger als drei Wochen zurück (Gruppe 3), zeigten sich nur noch in wenigen Fällen Anzeichen proliferativer Veränderungen, und dann mit geringradigem Ausmaß. Hier wurden als Veränderungen zumeist gestaute Gefäße und Kryptabszesse gefunden, welche auch bei den Kontrolltieren zu finden waren. In dieser Gruppe waren weiterhin auf eine Erneuerung des Darmepithels hinweisende Befunde wie Becherzellhyperplasien und apoptotische Körperchen in normalen Krypten zu finden. Insgesamt wurden die Befunde dieser Gruppe als in Abheilung befindliche oder abgeheilte Stadien bewertet (vgl. Abb. 23 und 24). Diese Histologischen Auffälligkeiten wurden in der Vorliegenden Untersuchung nicht gesondert beurteilt. Der zeitliche Zusammenhang zwischen Infektionszeitpunkt und Ausprägung der pathologischen Veränderungen entspricht Ergebnissen aus der Literatur. GUEDES und GEBHART (2004) konnten belegen, dass 11 Tage nach experimenteller LIInfektion erste makroskopische und histologische Veränderungen (Epithelhyperplasie, Becherzellreduktion) auftraten. Spätestens nach 5 Wochen waren keine Läsionen am Darm mehr feststellbar. SMITH und MCORIST (1997) fanden drei Wochen nach Challenge-Infektion Befunde am Darm, die sie als abheilende Läsionen interpretierten (durch unreife Enterozyten verlängerte Krypten, Becherzellen an der Basis der Krypten). JENSEN et al. (2005) konnten bei Schweinen, die 2-6 Wochen nach letzter Erregerausscheidung geschlachtet wurden, keine für LI spezifische pathologischen Veränderungen mehr auffinden. MCORIST et al. (1996) und MCINTYRE et al. (2003) beschrieben, dass sieben bis neun Wochen nach LI-Infektion die Darmmukosa sich in einem Stadium der Regeneration befand. Die von den Autoren beschriebenen Befunde (blasse geschwollene und geschrumpfete degenerierte Epithelzellen, apoptotische Körperchen und Becherzellhyperplasie) konnten auch in den eigenen Versuchen beobachtet werden. Es handelte sich dabei um Schweine, bei denen der Infektionsbeginn schon länger zurücklag, so dass die Befunde als Hinweis auf eine Regeneration der Darmschleimhaut gewertet werden können. Inwieweit 112 Diskussion immunologische Reaktionen aufgetreten sind, ohne nenneswerte pathologische Veränderungen zu erzeugen konnte hier nicht geklärt werden. Die Korrelation zwischen der Dauer der Infektion und den histologischen Veränderungen (Abb. 29) belegt das rasche Auftreten von PPE-typischen Veränderungen sowie die schnelle Regenerationsfähigkeit der Darmschleimhaut bei unkompliziertem Verlauf der Infektion. Auch die histologischen Untersuchungen unterstreichen, dass das Infektionsgeschehen bei den Versuchstieren mit der 14. Lebenswoche weitgehend abgeschlossen war. Während vor diesem Zeitpunkt bei etwa 77 % der sezierten Tiere PPE-typische proliferative Veränderungen diagnostiziert wurden, gelang dies danach nur noch bei einem sezierten Tier. Die histologischen Befunde dieser Tiere schwankten stark in ihrer Ausprägung. Eine zum Zeitpunkt der Sektion nachgewiesene Erregerausscheidung über den Kot korrelierte stark mit typischen histologischen Befunden. Bei 19 zur Sektion PCR-positiven Tieren konnte in 17 Fällen histologisch eine Proliferation der Enterozyten festgestellt werden. In 17 der Fälle konnte auch immunhistologisch ein Infektionsnachweis geführt werden. Aus den histologischen Befunden kann geschlossen werden, dass auch im Falle eines subklinischen Infektionsverlaufes in der Regel eine Schädigung der Darmschleimhaut vorliegt. Es war jedoch nicht möglich, einen Zusammenhang zwischen der serologisch ermittelten Titerhöhe und den histologischen Befunden herzustellen. GUEDES u. GEBHART (2004) beschreiben nach einer experimentellen Infektion eine Ausbreitung des Erregers vom Ileum als Prädilektionsstelle zu den kaudaler gelegenen Darmabschnitten bis ins Rektum. Während 29 Tage p.i. noch histologische Veränderungen im Dickdarm vorlagen, waren im Dünndarm keine Läsionen mehr vorhanden. Eine solche Ausbreitung konnte anhand der eigenen Untersuchungen nicht nachvollzogen werden. Häufig waren schon kurz nach erstem positivem PCR Nachweis wie auch zu späteren Untersuchungszeitpunkten unterschiedliche Dünn- und Dickdarmabschnitte gleichzeitig betroffen (Tab. 20, Abb. 30 und 33). 113 Diskussion 5.5 Immunhistologische Untersuchung Durch die Immunhistologie war es möglich, in fünf Fällen, in welchen weder PCR noch ELISA einen positiven Nachweis erbrachten, eine LI-Infektion zu bestätigen (Tab. 15). Aufgrund des fehlenden Infektionsnachweises am lebenden Tier konnte allerdings der Infektionszeitpunkt nicht näher bestimmt werden (Gruppe 1). Parallel zu den histologischen Veränderungen zeigte es sich, dass der Erreger in den ersten 3 Wochen nach Infektionsnachweis bei dem Großteil der Tiere (82 %) in der Darmschleimhaut des Ileums und der untersuchten Dickdarmabschnitte immunhistologisch zu finden war, und zwar im apikalen Zytoplasma des Kryptepithels und in mononukleären Zellen. Häufig wurde der Erreger auch gleichzeitig in den Darmlymphknoten beobachtet (Gruppe 2) (Abb. 32). Zu späteren Untersuchungszeitpunkten war LI trotz der weitgehend abgeklungenen histologischen Veränderungen immerhin noch bei 48 % der Schweine detektierbar, befand sich jedoch nur noch selten in der Darmschleimhaut, sondern zumeist in mononukleären Zellen der regionalen Darmlymphknoten (Gruppe 3) (Abb. 32 und 32). In Gruppe 2 war eine gleichmäßige Verteilung der Lawsonien über die untersuchten Darmabschnitte zu erkennen. Die Schwere der histologischen Veränderungen war eng mit der dort vorgefundenen, semiquantitativ ermittelten Erregermenge (IH- Score) korreliert. In der Gruppe 3 war eine solche Korrelation nicht mehr zu ermitteln (Tab. 22, 23). Während die Darmschleimhaut wieder weitgehend frei von LIspezifischem Antigen war, fanden sich immer noch Lawsonien, jedoch bevorzugt in den Lymphknoten (Abb. 32, 33). Rekonvaleszenzstadien, in welchen LI ausschließlich in mononukleären Zellen im Darmepithel zu finden ist, wie von GUEDES et. al. (2002) beschrieben, zeigten sich nur in wenigen Fällen (n = 3). Anhand der IH-Befunde zu den Sektionszeitpunkten konnte gezeigt werden, dass der Anteil LI-positiver Tiere nach der 14. Lebenswoche kontinuierlich abnahm, zum letzten Untersuchungszeitpunkt kurz vor der Schlachtung (27. LW) konnte bei keinem der fünf untersuchten Schweine noch LI mittels der IH nachgewiesen werden. 114 Diskussion 5.6 Mastleistung und präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen Eine LI-bedingte schlechtere Gewichtsentwicklung der Tiere war in den ersten vier Wochen der Beobachtungszeit tendenziell vorhanden. Im Mittel war die tägliche Zunahme von der 4. bis zur 8. Lebenswoche für die bis zu diesem Zeitpunkt infizierten Tiere im Vergleich zu den nicht infizierten Tieren um 50 g geringer (344 g ±92 vs. 394 g ±85; Tab. 18). Aufgrund der starken Streuung handelte es sich aber nicht um einen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen. Der untersuchte Zeitraum lag jedoch noch vor dem Hauptinfektionsgeschehen mit LI. Möglicherweise wäre der Leistungsunterschied im Zeitraum der Hauptinfektion noch höher ausgefallen. Nach dieser Untersuchungsperiode waren die täglichen Zunahmen der Versuchstiere jedoch aufgrund einer aufgetretenen Actinobacilluspleuropneumoniae-Erkrankung im Bestand hinsichtlich eines reinen LI-Einflusses nicht mehr sicher zu beurteilen, zumal auch bei der Schlachtung noch Lungenveränderungen bei den Versuchstieren beobachtet wurden. Außerdem waren bis zur 12. Lebenswoche schon die meisten Tiere mit LI infiziert, so dass kein Vergleich innerhalb der Versuchsgruppe mehr möglich war. Die porzine proliferative Enteropathie beeinflusst die tägliche Gewichtszunahme insbesondere bei klinischem Krankheitsverlauf negativ (LAWSON u. GEBHART 2000a; HARDGE et al. 2004; STEGE et al. 2004; KROLL et al. 2005b; KROLL et al. 2005c). Bei subklinischem Verlauf konnte festgestellt werden, dass durch eine frühzeitige Impfung im Betrieb die Mastleistung gegenüber ungeimpften Tieren deutlich verbessert werden konnte (HARTGE et al. 2004). Dies kann als Beleg dafür gewertet werden, dass auch bei subklinischem Verlauf ein negativer Einfluss auf die Leistung der Schweine vorliegt. Die präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen wurde bestimmt, um zu untersuchen, ob die ggf. bei subklinischem Verlauf einer LI-Infektion vorhandenen Darmläsionen einen Einfluss auf die Verdaulichkeitsparameter und damit auf die Mastleistung haben. Zu diesem Zweck wurden die Versuchstiere mit Titandioxid markiertem Futter gefüttert. Nur der Darminhalt aus der kaudalen Hälfte des Dünndarmes wurde untersucht. Dabei wurde der Inhalt 30 cm cranial der Papilla ilealis von der Beprobung ausgeschlossen, um eine mikrobielle Kontamination aus den nachgelagerten Verdauungsabschnitten und somit den Eintrag von mikrobiellem Protein weitgehend zu vermeiden. 115 Diskussion Bei der Untersuchung der Verdaulichkeiten fehlte in diesem Versuch aufgrund der hohen Durchseuchung eine ausreichend große Negativ-Kontrollgruppe. Deshalb wurden die Verdaulichkeiten der Futterinhaltsstoffe nur zwischen der kurz infizierten und der über einen längeren Zeitraum infizierten Gruppe (Gr. 2 und 3) verglichen. Es zeigte sich nur für das Kalzium eine herabgesetzte Verdaulichkeit für Tiere der Gruppe 2, in der auffällige histologische Läsionen am Darm dominierten, gegenüber der Gruppe 3. Dagegen wurde für die Gruppe 3 unerwartet eine signifikant niedrigere Verdaulichkeit von Rohprotein ermittelt. Alle anderen Parameter unterschieden sich statistisch nicht voneinander (Tab.24). Als ein möglicher Grund für die geringen Differenzen bei der Verdaulichkeit ist die Entnahmestelle der untersuchten Ingesta anzusehen. Das zu untersuchende Material wurde hier zunächst aus dem Bereich des vorderen Ileums entnommen. Da in diesem Bereich oft nicht ausreichend Material zu gewinnen war, wurde dann zusätzlich auch Ingesta aus dem davor befindlichen Teil des Jejunums entnommen. Bei der Auswertung muss bedacht werden, dass im Jejunum aber keine typischen histologischen Veränderungen im Sinne einer proliferativen Enteropathie gefunden wurden. 116 Schlussfolgerungen 5.7 Schlussfolgerungen Klinik In der durchgeführten Feldstudie lag bei den meisten Schweinen der Versuchsgruppe eine subklinische Verlaufsform der LI-Infektion vor, wie es in Schweine haltenden Betrieben weit verbreitet ist. Nur nach intensiver klinischer Untersuchung konnten vereinzelt Tiere mit kurzzeitig veränderter Kotkonsistenz festgestellt werden. Solche Symptome werden im Betrieb vom Landwirt häufig übersehen. Aufgrund einer im Verlauf des Versuches auftretenden App-Infektion konnte nicht sicher beurteilt werden, ob die Mastleistung durch die LI-Infektion beeinträchtigt wurde. Erregerausscheidung und Antikörperentwicklung Der Hauptinfektionszeitpunkt in der Versuchsgruppe lag zwischen der 8. und 10. Lebenswoche und damit im Vergleich zu anderen Beständen recht früh. Die Gruppe durchseuchte bis auf ein Tier vollständig. Bei etwa 90 % der Schweine konnte die Infektion entweder durch den PCR-Nachweis im Kot oder einen Antikörpernachweis festgestellt werden. Aufgrund dieser Befunde muss auch in der Praxis selbst bei subklinischem Verlauf von einer schnellen Verbreitung des Erregers in Stallabteilen ausgegangen werden. PCR-Nachweise im Kot waren in dieser Untersuchung bei überwiegend subklinischem Verlauf zumeist nur von kurzer Dauer (1-2 Wochen). Positive PCRBefunde konnten im Zusammenhang mit einem akuten Infektionsgeschehen festgestellt werden. Aufgrund der positiven Korrelation zwischen positiven PCRErgebnissen und pathologischen Veränderungen kann im Falle eines positiven PCRBefundes auch bei subklinischen Verläufen mit Schädigungen der Darmschleimhaut gerechnet werden. Die relativ geringe Nachweisrate im Kot muss bei der Bestimmung einer diagnostisch relevanten Probenzahl berücksichtigt werden. Bei einzelnene Tieren wurde eine Serokonversion nachgewiesen, ohne dass während der Untersuchungsperiode ein Erregernachweis im Kot gelang. Der insgesamt hohe Anteil von seropositiven Tieren (82 %) steht im Gegensatz zum 117 Schlussfolgerungen Vorkommen LI typischer Darmläsionen bei 53 % der untersuchten Schweine. Dies ist jedoch im Zusammenhang mit dem Zeitpunkt der Sektion zu diskutieren, die oft erst Wochen nach Infektionsbeginn erfolgte. Ob bei Tieren ohne pathologische Veränderungen eine Ausheilung erfolgte, oder überhaupt keine Läsionen entstanden, konnte im Einzelfall nicht geklärt werden. Die serologische Untersuchung mittels ELISA kann zur Einschätzung des Infektionszeitpunktes dienen, wenn Tiere zur Feststellung der serokonversion mehrfach untersucht wurden oder unterschiedliche Altersgruppen im Betrieb gleichzeitig beprobt werden. Eine Serokonversion erfolgte oft gleichzeitig mit oder eine Woche nach dem ersten PCR-Nachweis. Nur ein Drittel der zum Mastende untersuchten Schweine wies noch positive Titer auf. Dies muss im Zusammenhang mit der frühen Infektion und dem subklinischen Verlauf der Infektion diskutiert werden und kann zu einer falschen Einschätzung der Herdensituation führen, wenn bei einer Untersuchung nur ältere Masttiere beprobt werden. Makroskopische Untersuchung des Sektionsguts Bei der pathologisch-anatomischen Diagnostik bestätigten sich die Erfahrungen aus früheren Untersuchungen anderer Autoren, dass bei subklinischem Verlauf typische makroskopische Veränderungen am Darm in der Regel fehlen. Weiterführende histologische Untersuchungsmethoden sind daher für die Diagnosestellung unverzichtbar. Histologische Untersuchung Aufgrund der vorliegenden Untersuchungsbefunde muss davon ausgegangen werden, dass auch bei subklinischem Verlauf regelmäßig histologisch nachweisbare, für LI typische proliferative Veränderungen an der Darmschleimhaut bei Schweinen entstehen. Die Läsionen waren umso stärker ausgeprägt je dichter Infektionszeitpunkt und Sektion beieinander lagen und korrelierten mit der Erregermenge im Darmgewebe. War der Zeitraum zwischen erstem Nachweis der Infektion und der Sektion größer als 3 Wochen, konnten nur noch geringgradige oder gar keine auf eine LI-Infektion hinweisende Läsionen gefunden werden. Dies spricht für ein zügiges Ausheilen der Veränderungen. Inwieweit immunologische Reaktionen aufgetreten sind, ohne 118 Schlussfolgerungen nenneswerte pathologische Veränderungen zu erzeugen konnte hier nicht geklärt werden. In vielen Fällen konnte jedoch immunhistologisch noch Antigen, insbesondere in den untersuchten regionalen Lymphknoten, nachgewiesen werden. Die Lymphknoten scheinen die Möglichkeit zu bieten, einen LI-Nachweis noch dann führen zu können, wenn sich in der Darmschleimhaut bereits kein Antigen mehr nachweisen lässt. Untersuchung der präzäkalen Verdaulichkeiten Dass eine Infektion mit LI die Entwicklung betroffener Schweine negativ beeinflussen kann, ist bereits mehrfach in der Literatur beschrieben worden. Bei subklinischem Verlauf ist ein vergleichbarer Zusammenhang anzunehmen. Zum Einfluss der Infektion auf die präzäkale Verdaulichkeit von Nährstoffen konnte in der vorliegenden Studie kann keine sichere Aussage getroffen werden. Es bleibt deshalb die Frage zu klären, in welchem Grad die auch bei subklinischem Verlauf auftretenden Veränderungen an der Darmschleimhaut zu Verdauungsstörungen führen, welche die Mastleistung negativ beeinflussen. 119 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Daniel Brandt „Untersuchungen zum subklinischen Verlauf einer LI-Infektion bei Schweinen.“ Die porzine proliferative Enteropathie wird durch LI hervorgerufen und ist eine weltweit in Schweinbeständen verbreite Durchfallerkrankung, die sehr häufig auch subklinisch auftritt. In der vorliegenden Studie sollte der Verlauf einer subklinischen LI-Infektion anhand von Erregerausscheidung, klinischen Symptomen und serologischer Kontrolle sowie pathologische Veränderungen unter Feldbedingungen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde in einem Bestand, in dem im Vorfeld eine subklinische LIInfektion diagnostiziert wurde, eine Gruppe von 60 gleichaltrigen, männlichen kastrierten Ferkeln vom Absetzen bis zum Mastende kontrolliert. Diese Tiere wurden ab der 4. Lebenswoche wöchentlich klinisch untersucht. Von der 6. bis zur 16. Lebenswoche wurde wöchentlich eine Kotprobenentnahme zum PCR Nachweis sowie eine durchgeführt. Lebenswoche. Blutprobenentnahme zur Weiterhin Probenentnahmen Ab der erfolgten 8. Woche Antikörperbestimmung wurden zu zur mittels 20. den und ELISA zur 26. entsprechenden Untersuchungszeitpunkten jeweils fünf Schweine aus dieser Gruppe seziert (insges. n = 51) und Proben von verschiedenen Darmlokalisationen für eine weiterführende histologische und immunhistologische Untersuchung sowie Ingestaproben zur Bestimmung der präzäkalen Verdaulichkeit verschiedener Futterinhaltsstoffe entnommen. Die LI-Infektion verlief innerhalb der Versuchsgruppe von 60 Läuferschweinen weitestgehend subklinisch, nur ein Tier zeigte wässrigen Durchfall. Bei sieben Schweinen wurde während der Versuchsperiode kurzzeitig eine dünnbreiige Kotkonsistenz festgestellt. Eine erste Erregerausscheidung wurde bei drei Tieren bereits in der 6. Lebenswoche festgestellt. Nach der 14. Lebenswoche war LI bei keinem Tier mehr in den Fäzes nachzuweisen. Zu keinem Zeitpunkt konnte bei mehr als einem Drittel der Tiergruppe gleichzeitig ein PCR Nachweis geführt werden. Die Ausscheidung bei den einzelnen Tieren dauerte zumeist nur eine bis zwei Wochen. Eine erste Serokonversion wurde 120 Zusammenfassung ebenfalls in der 6. Lebenswoche registriert, die Serokonversion folgte der ersten Erregerausscheidung im Mittel eine Woche später. Die meisten Serokonversionen traten zwischen der Woche 8 und 11 auf, der größte Anteil an seropositiven Tieren lag in der 12. Lebenswoche mit ca. 70 % der untersuchten Schweine vor und nahm dann kontinuierlich ab. Am Ende der Untersuchungsperiode waren nur noch 31 % der untersuchten Tiere seropositiv (ELISA). Mittels PCR wurden 65 % (39 Tiere), mittels serologischer Kontrolle insgesamt 82 % (49 Tiere) der Schweine als infiziert erkannt. Bezieht man die immunhistologischen Ergebnisse mit ein, konnte bei insgesamt 98 % (59 Tiere) der Tiere eine LI-Infektion diagnostiziert werden. Ein Tier blieb negativ. Während makroskopsiche Veränderungen am Darm sehr selten waren, wurde in der lichtmikroskopischen Betrachtung des Sektionsmaterial bei 28 von 51 untersuchten Schweinen eine für LI typische epitheliale Hyperplasie mit Reduktion der Becherzellen an der Darmschleimhaut gefunden. Bei fünf Tieren lagen zusätzlich ulzerative oder fibrinös-ulzerative Läsionen vor. Bei 16 von 18 Schweinen, die zum Zeitpunkt der Sektion einen positiven PCR Befund über den Kot zeigten, konnten typische Läsionen am Darm beobachtet werden. Die Läsionen waren umso stärker ausgeprägt, je dichter der erste Infektionsnachweis und die Sektion beieinander lagen, und korrelierten mit der Erregermenge im Darmgewebe. Lag der Nachweis der Infektion länger als drei Wochen zurück, war regelmäßig eine Ausheilung der Darmläsionen zu beobachten. Die immunhistologische Untersuchung zeigte, dass LI in den ersten drei Wochen nach Infektionsnachweis bei den meisten Tieren (82 %) in Darmschleimhaut und Lymphknoten aufzufinden war. Zu späteren Untersuchungszeitpunkten konnte der Erreger noch bei 48 % der Tiere nachgewiesen werden, dabei häufig nur noch in den regionalen Lymphknoten. Bis zur 8. Lebenswoche mit LI infizierte Schweine zeigten tendenziell ein verringertes Wachstum, eine weitere Auswertung der Gewichtsentwicklung war aufgrund einer Actinobacillus-pleuropneumonie-Infektion in der 10. Woche nicht möglich. 121 Zusammenfassung Die vorliegenden Ergebnisse zur subklinischen LI-Infektion ergaben eine hohe Infektionsrate und belegen, dass auch bei latentem Verlauf regelmäßig histologisch nachweisbare, für LI typischen Veränderungen an der Darmschleimhaut entstehen. 122 Summary 7 Summary Daniel Brandt “Clinical research describing the course of subclinical LI-infection in pigs:” Porcine proliferative enteropathy is caused by infection with Lawsonia intracellularis (LI). The disease is endemic among pig populations throughout the world, and in many cases subclinical. The present study followed the course of subclinical LI infection in a cohort of 60 barrows on a commercial farm from weaning at 4 weeks of age to slaughter. For this purpose, fecal shedding of LI, clinical and serological responses were monitored at regular times. Monitoring of clinical signs started at weaning and was continued on a weekly base until slaughter. From 6 to 16 weeks of age, rectal fecal samples and blood samples were collected weekly from every pig to be examined by PCR and ELISA, respectively. This was repeated at 20 and 26 weeks of age. At corresponding times starting at 8 weeks of age, five pigs were randomly selected for necropsy (n = 51 in total). Intestinal tissues from determined locations were examined via histologic and immuno-histologic methods. Intestinal contents were also taken to determine precaecal digestibility. Infection with LI showed a mainly subclinical course in this group of 60 barrows. Only one pig had watery diarrhea, seven pigs were observed to have soft, loose stools for a few days. Shedding of LI was seen in three pigs already at 6 weeks of age and persisted in the group until 14 weeks of age. During the whole study, no more than one third of the animals were shedding the agent simultaneously. Excretion of LI in single pigs lasted only for one to two weeks. A first seroconversion was also found at 6 weeks of age, seroconversion followed excretion of LI mainly one week. On average, seroconversions occurred between 8 and 11 weeks of age. By 12 weeks of age, the highest rate (70 %) of seropositive pigs was observed and decreased steadily from than on. At slaughter, 31 % of animals were still found positive in the LI-ELISA. Confirmation of LI infection among pigs varied according to the techniques used. Of the 60 barrows 39 were found positive by PCR in fecal samples (65 %), 49 animals were found positive by serology (82 %), 59 pigs, thus all but one, were found to be infected via immuno-histology (98 %). 123 Summary Macroscopic changes of the intestine were rarely observed at necropsy. Light microscopy, however, revealed characteristic lesions of LI-infection, namely epithelial hyperplasia and reduction of goblet cell numbers in 28 of 51 necropsied pigs. Five animals additionally had ulcerative or fibrinous-ulcerative defects. From 18 pigs shedding LI at time of necropsy, 16 of these showed typical alterations. The severity of lesions was dependent on the time interval between first proof of LI-infection and the time of necropsy, being more severe the closer both occurred and correlating with the quantity of LI in the gut epithelium. Healing of lesions was observed as early as three weeks after proof of infection. Immuno-histology detected LI antigen in epithelial tissue and lymph nodes within the first three weeks of infection in most of the pigs (82 %). Later on, detection of LI decreased to 48 %, very often being restricted to regional lymph nodes. Pigs being infected within the first 8 weeks of life tended to show a reduction in growth. Further evaluation of this parameter, however, interfered with Actinobacillus pleuropneumoniae infection at week 10. Results of this study demonstrate a high LI infection rate, and further prove that subclinical infections are associated regularly with characteristic histological alterations of intestinal mucous membranes. 124 Schrifttumsverzeichnis 8 Schrifttumsverzeichnis ALEXOPOULOS, C., P. D. TASSIS, C. S. KYRIAKIS, E. D. TZIKA, V. PAPATSIROS u. S. C. KYRIAKIS (2006): First experience on the effect of In-feed Lincomycin for the control of proliferative enteropathy in growing pigs. J. Vet. Med. 53, 157-162 BAKKER, J., H. M. J. F. VAN DER HEIJDEN, M. 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Mai OM 1 4 5 6 7 8 Übersicht der Einzeltierbefunde (Körpermasse, Kotkonsistenz, PCR, ELISA, Histo-Score und ImmunhistoScore) PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht 6 LW 15. Jun 0 14 0 7 LW 22. Jun 0 10,6 0 0 19,3 0 0 -7,3 0 0 16 0 0 10,5 0 0 12,3 0 0 -0,1 0 0 5 0 0 8 0 0 19,8 0 0 8,1 0 6,4 11,5 7,1 7,5 7,9 5,7 8 LW 29. Jun 0 12,8 0 14,3 0 0 0 18 0 12,4 0 21,7 1 41,1 0 14,2 0 -1,5 0 21,2 0 19,9 0 14,2 9 LW 06. Jul 0 7,2 0 10 LW 13. Jul 0 21,8 0 11 LW 20. Jul 0 18,8 0 0 13,7 0 0 9,1 0 0 17,9 0 0 3,8 0 1 36,5 1 1 34,5 0 0 5,4 0 1 30,1 1 0 31,9 0 0 5,5 0 0 19,8 0 1 56,9 0 1 4,5 0 1 22,9 0 18. Jul 24,3 12 LW 27. Jul 0 45,95 0 24 0 20 0 32 0 38,8 2 28 25. Jul 13 LW 03. Aug 01. Aug 14 LW 10. Aug 15 LW 17. Aug 16 LW 24. Aug 26LW 21. Sep HistoScore IH-Score 0,20 0,6 6,00 2 1,40 2 23,5 25. Jul 8,60 1 34 62,40 11,2 26,60 10,2 24 01. Aug 35 0 32,3 2 0 48,7 1 0 29,6 1 02. Nov 22. Aug 46 149 Anhang noch Tabelle 25 4 LW 30. Mai OM 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht 6 LW 15. Jun 0 5,3 0 7 LW 22. Jun 0 7 0 0 7,6 0 0 8,2 0 0 18,2 0 0 6,6 0 0 16,5 0 0 5,3 0 0 12,4 0 0 11,3 0 0 11 0 0 10,7 0 0 11,6 0 0 8,3 0 0 5,2 0 1 13,6 0 0 18,6 0 0 7,6 0 0 0 0 0 4,1 0 9 8,5 6,8 7,3 8,1 6,1 7,1 8 6,7 7,3 8 LW 29. Jun 0 25,5 0 21,2 0 17,5 0 24,5 0 16,7 0 15,5 0 19,4 0 15,8 0 17 0 19,8 0 26,2 0 13,1 1 34,4 0 18,5 1 34,7 0 18 0 14,3 0 18,2 0 15,5 0 16,5 9 LW 06. Jul 0 21,1 0 10 LW 13. Jul 0 33,3 0 11 LW 20. Jul 0 33,8 0 0 8,8 0 0 19,6 0 0 3,69 0 0 2,9 0 0 11,2 0 0 46,9 0 0 20,9 0 0 43,5 0 0 39,6 0 1 13,2 0 0 35,8 0 0 43,6 0 0 27,5 0 1 43,7 0 0 38,8 0 0 33,5 0 0 39,7 0 0 47,8 0 12 LW 27. Jul 0 25,1 0 35 1 45,2 0 31 0 52 0 30 0 42,4 0 32 0 25,5 0 34 0 40,05 0 21 0 40,5 0 27 13 LW 03. Aug 0 26,9 0 14 LW 10. Aug 0 23,7 0 1 31,9 0 08. Aug 1 50,9 0 15 LW 17. Aug 0 29,8 0 16 LW 24. Aug 0 31,6 0 62 26LW 21. Sep 0 27,1 0 122 02. Nov 14. Nov 130,5 31 08. Aug 0 36,7 0 35,5 0 33,1 1 0 37,9 0 0 40,3 0 0 43,4 0 0 32,5 0 0 24,6 0 58 0 45,1 0 58 HistoScore IH-Score 1,80 0 31,20 11,2 17,40 6,6 2,40 0 3,20 0 3,80 0 1,40 0 59,00 17,4 4,40 0,2 29. Aug 60 0 33,9 0 122 14. Nov 128 01. Aug 21,1 0 38,4 0 0 41,8 0 0 30,4 0 22. Aug 42 04. Jul 18,8 0 13,1 0 1 51,2 0 1 31,4 0 1 45,5 0 0 50,3 0 35 0 36,1 0 0 29,2 0 15. Aug 48 MittelfußFraktur 150 Anhang noch Tabelle 25 4 LW 30. Mai OM 19 20 22 23 24 25 26 28 30 31 PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht 6 LW 15. Jun 0 17,9 0 7 LW 22. Jun 1 8,9 0 0 16,7 0 0 6,6 0 0 17,5 0 0 13,3 0 0 17,1 0 0 5,8 0 0 10,9 0 0 2,5 0 0 8,9 0 0 11,2 0 0 15 0 0 9,4 0 0 2 0 0 8 0 0 10 0 0 6,3 0 0 5,7 0 0 9,8 0 7,6 9,1 8,1 8,3 8,7 7,3 8,9 7,8 8,3 9,1 8 LW 29. Jun 1 45,1 1 16,5 0 19,4 0 22 0 9,2 0 17,8 0 18,7 0 21,5 0 0,65 0 22 0 20,5 0 18,5 0 16,4 0 17,5 0 15,2 0 18,5 0 29,5 0 18,5 0 14,3 0 22,4 9 LW 06. Jul 04. Jul 10 LW 13. Jul 11 LW 20. Jul 12 LW 27. Jul 13 LW 03. Aug 14 LW 10. Aug 15 LW 17. Aug 16 LW 24. Aug 26LW 21. Sep 16,6 0 13,3 0 0 53,2 0 0 48,4 0 0 26,1 0 0 14,1 0 0 31,3 0 0 36,05 0 63 0 17,1 0 123 0 5,9 0 1 31 0 1 58,8 0 0 24,9 2 37 25. Jul 0 9,3 0 0 19,5 0 0 8,5 0 0 19,2 0 65 29. Aug 0 -2,3 0 0 16,6 0 1 37,9 0 0 29,1 0 0 20,25 0 0 34,7 0 0 24,9 0 42 0 29,3 1 94 0 8,1 0 0 17,9 0 1 17,9 0 0 -14,1 0 1 17,5 0 1 49 0 0 23,4 0 1 17 0 18. Jul 0 10 0 0 13 0 HistoScore IH-Score 66,00 22 12,40 8,6 0,20 0 6,60 1 1,40 4 5,40 2,8 23 18. Jul 55,00 15,2 0 34,5 6,40 33,9 0 33,4 0 40 0 53,5 0 38 0 36,9 0 33 1 83,3 0 31 0 33,4 1 35 1 39,3 0 0 27,1 0 0 22,5 0 0 30,45 0 0 39,1 0 15. Aug 0 26 0 0 24,6 0 0 66,6 0 0 46,4 0 47 0 11,7 0 02. Nov 25. Nov 154 64,5 25. Nov 110 15. Aug 41,2 29. Jul Mastdarmvorfall 29,6 151 Anhang noch Tabelle 25 4 LW 30. Mai OM 32 33 36 37 38 39 40 41 42 43 PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht 6 LW 15. Jun 0 12,6 0 7 LW 22. Jun 0 1,7 0 0 0,5 0 0 -3,4 0 0 5,4 0 0 3,3 0 0 4,2 0 0 8,5 0 0 6,5 0 0 5,8 0 0 -2,3 0 0 13,8 0 0 3,2 0 0 3 0 0 36,1 0 0 47,9 0 1 12,5 0 1 4 0 0 11 0 0 13,3 0 9 5,1 6,9 7 6,9 5,5 7 8,6 7,2 7,7 8 LW 29. Jun 0 10,5 0 20,5 0 19,2 0 15,3 0 18,7 0 18 0 4,3 0 17,2 0 17 0 15 0 10,7 0 16 0 14,4 0 20,5 0 59 0 22,5 1 38,8 0 22,5 0 30,8 0 21 9 LW 06. Jul 0 -0,1 0 10 LW 13. Jul 0 13,7 0 11 LW 20. Jul 0 10,6 0 0 12 0 0 18,8 0 0 47,7 0 0 8,9 0 11. Jul 0 6 0 12 LW 27. Jul 25. Jul 32,8 0 49,9 1 27,5 13 LW 03. Aug 14 LW 10. Aug 15 LW 17. Aug 16 LW 24. Aug 26LW 21. Sep 0 22,3 1 0 24,2 0 0 23,3 0 0 21,4 0 45 0 39 1 100 02. Nov HistoScore 22,00 14. Nov 126 0 3,60 4 27,7 11. Jul 17,20 9,2 0 6,1 1 20,7 0 16,8 0 0 5,4 0 0 6,2 0 0 22,7 0 0 13,2 0 1 20,21 0 0 40,6 0 1 34,7 2 0 37,5 0 0 45,9 0 0 44,5 0 31,60 0 12,4 0 24,5 0 29,9 0 25 25. Jul 32,5 0 39,3 1 44 1 19,6 2 0 55,3 0 0 44,1 0 0 27,7 0 0 28 0 0 18,3 0 22. Aug 41,2 0 31,3 0 42 0 6,60 0 24,2 0 109 25. Nov 126 5,6 17,00 0 24,7 0 0 13 0 0 18,8 0 22. Aug 65 2 2,60 04. Jul 22,6 1 59,1 0 IH-Score 3,6 1 5,40 0 37,3 0 0 49 0 0 54,9 0 35 1 55,8 0 08. Aug 41 3 6,20 152 Anhang noch Tabelle 25 4 LW 30. Mai OM 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht 6 LW 15. Jun 0 29,6 0 7 LW 22. Jun 0 26,2 0 0 8,7 0 0 8,7 0 0 2,9 1 0 10,1 0 0 7,2 0 1 13,8 0 1 -0,3 1 1 20,9 1 0 17,7 0 1 14,2 0 0 16,8 0 0 17,6 0 0 11,6 0 0 -2 0 1 14,2 1 1 20,9 0 0 12,1 0 0 -6,8 0 7,7 8 5,7 6,5 9,2 6,5 7,1 8,5 7,1 7 8 LW 29. Jun 1 34,8 0 16,1 0 19,3 0 24 0 18,9 0 16 1 29,1 0 15,1 1 39,3 3 23 1 29,1 1 14,8 0 19 0 18,1 0 7,1 0 21 0 50,5 1 17 0 11,5 0 19,1 9 LW 06. Jul 0 66,3 0 10 LW 13. Jul 0 39,2 0 11 LW 20. Jul 0 33,1 0 0 19,1 0 0 14,1 0 0 26,6 0 1 53,4 1 1 55 0 18. Jul 1 25,8 1 1 42,7 0 25 0 58,1 0 12 LW 27. Jul 0 22,4 0 33 1 19,5 0 36 13 LW 03. Aug 01. Aug 35 1 14,9 0 14 LW 10. Aug 15 LW 17. Aug 16 LW 24. Aug 26LW 21. Sep 02. Nov HistoScore 3,20 08. Aug 0 40 3,80 8,6 13,40 0 26,3 0 32 01. Aug 1 33 3,20 04. Jul 22,6 23 1 33,8 1 0 52,4 0 1 51 2 0 11,5 0 0 24,6 0 0 3,9 0 1 27,7 0 11. Jul 74,40 26,7 1 76,3 1 21 0 9,2 0 34 1 72,7 0 1 65,3 1 0 53,2 0 0 15,1 0 0 21,4 0 0 18 0 22. Aug 32 0 18,4 0 55 6 1,80 0 30,9 0 122 25. Nov 140 22 60,20 04. Jul 18,5 1 1,5 0 IH-Score 2 12,6 39,40 11. Jul 26,6 6,4 1,60 153 Anhang noch Tabelle 25 4 LW 30. Mai OM 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht 6 LW 15. Jun 0 6,6 0 7 LW 22. Jun 0 6,4 0 0 8,2 0 0 1,7 0 0 14,5 0 0 14,5 0 0 12,2 0 0 -1,5 0 0 1,3 0 0 12 0 0 9,7 0 0 1,6 0 0 9,9 0 0 7,7 0 0 8,6 0 0 14,4 0 0 0 0 0 17,9 0 0 -0,1 0 14 0 6,1 7,5 5,7 6,2 7,2 9 8,2 8,1 7,5 7,4 8 LW 29. Jun 0 25 0 18,2 0 7,7 0 21,1 0 24,1 0 16,5 0 11,2 0 20 0 11,3 0 23 0 6,1 0 26 0 12,8 0 23,7 0 29,9 0 23,2 0 43,1 0 16,5 0 4,1 0 16,5 9 LW 06. Jul 0 12,8 0 10 LW 13. Jul 0 50,7 0 11 LW 20. Jul 0 50,56 2 1 24,7 0 0 46 0 0 31,7 2 1 29,1 0 0 41,4 0 0 34,7 0 0 18,9 0 0 18,2 0 0 15,5 0 0 21,5 0 0 26,1 0 18. Jul 0 2,8 0 0 30,5 0 28 0 28,1 0 0 34,2 0 0 36,9 0 0 35,8 0 0 33,5 0 0 44,9 0 0 51,8 0 0 29,6 0 0 44 1 0 56,4 0 1 26,6 0 0 33 0 0 30,2 0 12 LW 27. Jul 0 18,9 0 35 0 43,7 0 40 0 41,1 0 35 0 18,1 0 33 13 LW 03. Aug 0 31,8 0 14 LW 10. Aug 0 28 0 15 LW 17. Aug 0 30,8 0 0 40,2 0 0 31,5 0 0 30,6 0 0 37,3 0 0 40,2 0 0 33,9 1 0 22,9 0 0 12,7 1 0 21,2 0 16 LW 24. Aug 0 17,9 0 59 0 39,4 0 65 0 28,7 0 59 0 32,4 0 60 26LW 21. Sep 0 16,2 1 124 29. Aug 65 0 30,9 0 123 0 20,4 0 124 02. Nov 25. Nov HistoScore IH-Score 140 2 1,20 25. Nov 140 25. Nov 136 0,6 1,20 0 40,8 1 41 0 25,2 1 39 0 33,1 0 34 0 30,4 1 33 0 29,2 0 27 0 39,3 0 0 20,4 0 0 16,6 0 0 31 0 0 25,7 0 0 32,9 0 0 36 0 0 27,8 1 15. Aug 0 25,1 0 0 26,2 0 0 15,6 0 0 35,1 0 0 15,3 0 66 0 30,13 0 55 0 24,4 0 122 0 29,2 0 112 14. Nov 131 25. Nov 3,00 126 0 45 15. Aug 45 0 18,8 0 0 3,00 0 6,60 0 23,5 0 39 0 10,3 0 96 14. Nov 102,56 0 4,20 154 Anhang noch Tabelle 25 4 LW 30. Mai OM 65 67 70 PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht PCR ELISA KOT Gewicht 6 LW 15. Jun 0 8,4 1 7 LW 22. Jun 0 0,9 0 0 -1,1 0 0 5,2 0 0 12,3 0 0 12 0 8,1 7,1 9,4 8 LW 29. Jun 0 29,1 0 21 0 -0,5 0 16,5 1 37,5 0 16,5 9 LW 06. Jul 0 10,1 0 10 LW 13. Jul 1 46,7 0 11 LW 20. Jul 0 44,2 0 1 33,7 0 0 46 0 0 44,7 0 1 30,9 0 11. Jul 12 LW 27. Jul 0 48,3 0 31 0 38,5 0 31 13 LW 03. Aug 0 46 0 14 LW 10. Aug 0 16,7 0 15 LW 17. Aug 0 21,9 0 0 28 0 0 32,1 0 0 30,3 0 16 LW 24. Aug 0 39,8 0 41 0 28,8 0 53 26LW 21. Sep 26. Sep 02. Nov HistoScore 41,8 25. Sep 3,40 52,5 4,60 IH-Score 0 0 3,8 30,3 22,80 Legende: PCR 0 1 negativ positiv ELISA PI-Wert < 20% ? 20%- < 30% > 30% KOT Konsistenz negativ 0 unauffällig fraglich 1 dickbreiig positiv 2 dünnbreiig 3 flüssig Gewicht in kg Sektionstermin Datum 155 Anhang 9.2 Bezugsquellen von Geräten und Verbrauchsmaterialien Biometra, Biozym, Hess. Oldendorf Stromversorgungsgerät, für Elektrophorese bioScreen, Münster / Svanova Biotech AB, Uppsala, Schweden Enterisol®Ileitis-ELISA Biozym, Hess. Oldendorf Digitalkamera, Donpisha 3 CCD Elektrophoresekammer, horizontal, ComPhor mini/maxi Thermal Cycler, MJ Research PTC-200, Peltier Thermal Cycler, Transilluminator, Flu-o-blu Bornstead, Dubuque, Iowa, USA Reinstwassererzeuger, EASYpure RF compact ultrapure water system Brinkmann, Hannover Mikrowellengerät, Bauknecht EMWS 2818 Carl Zeiss, Göttingen Mikroskop Axiostar plus Dynex Technologies, Denkendorf Microplate Reader, Dynex-MRX Analyseprogramm, Revelation G32 Eppendorf AG, Hamburg Pipetten und Pipettenspitzen 10 µl, 20 µl, 100 µl, 500 µl, 1000 µl Mehrkanalpipette, Eppendorf Acura 853 Reaktionsgefäße 1,5 ml, 2,0 ml 0030.120.086 Zentrifugalmühle (Fritsch, Pulverisette, Typ 14.702 156 Anhang Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig Objektträger, SuperFrost®Plus, 041300 Heraeus/ Kendro, Omnilab, Hannover Sterilwerkbank, HERA Safe IKA Labortechnik Staufen, Staufen Schüttler, IKA-Schüttler-MTS4 Bombenkalorimeter mit isoperibolem Messprinzip (IKA C7000, IKA Werke GmbH, Staufen). W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig Deckgläser (24 x 50 mm) Landgraf, Hannover Polypropylenröhrchen, Whitecaps, 15 ml Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch Medite Medizintechnik, Burgdorf Färbeautomat Leica St 4040 Mikrotom Reichert Jung 2030 Medite Medizintechnik, Burgdorf Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM2000 Memmert GmbH & Co KG, Schwabach Inkubator, SM-400 Microm, Heidelberg Microm HM500 Olympus Deutschland GmbH, Hamburg Digitalfotoapparat Olympus U-CMAD3 Mikroskop Bx41 157 Anhang Omnilab, Hannover Vortexer, Mixomat, Qiagen GmbH, Hilden QIAamp DNA Stool Mini Kit Satorius, Omnilab, Hannover Analysenwaage, OL-1500-P Thermolife Science, Engelsbach Entwässerung Paraffin-Einbettung Shandon Pathcentre Sarstedt AG, Nümbrecht Sarstedt Serummonovetten® Kendro Laboratory Products GmbH, Hannover Zentrifugen, Heraeus Biofuge pico und Labofuge AL Vogel, Giessen Ausgießstation Tissue Tec Tec TM 5 WTW Mess- und Analysegeräte GmbH, Wien, Österreich PH-Meter Inolab pH Level 2 158 Anhang 9.3 Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Antikörper Biozym, Hess. Oldendorf Gelstar Nucleic Acid Gel S Seakam LE Agarose Finnzymes, Espoo, Finnland dNTP Mix F-560Ltar Boehringer Ingelheim, Ingelheim DNA-Weight-Marker VIII Merck, Darmstadt Ethanol, 96 % [v/v], Xylenzyanol Connie Gebhart, Veterinary and Biomedical Sciences University of Minnesota, St Paul, Minnesota Polyklonale Antikörper gegen LI (Kaninchen-Antiserum) Perkin Elmer, Weiterstadt DNTP´s (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Taq Polymerase Puffer, (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2 0,01 % [w/v] Gelatine) Qiagen, Hilden MgCl² 25 mM Q-Solution PCR Buffer (15 mM MgCl²) 159 Anhang Carl Roth, Karlsruhe Primer, A: 5´- TAT GGC TGT CAA ACA CTC CG- 3´, B: 5´- TGA AGG TAT TGG TAT TCT CC- 3´ DNA Marker 100 bp DNA Leiter, equalised ® Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7 Ethanol Rotipuran 9065.2 Ethanol, vergällt, K928.2 Hämalaunlösung sauer nach Mayer, T865.2 Natriumhypochlorit-Lösung, ® 9062.1 2-Propanol Rotipuran (Isopropanol), ® 6752.2 Roti -Histol (Xylol-Ersatz) ® 6640.2 Roti -Histokitt II, T160.1 Roti®-Plast, Gewebeeinbettungsmedium, 6642.6 Natriumchlorid (NaCl), P029.2 Formalin 10 % Bohrsäure Tris Puffer diNaEDTA (Trinatriumkomplex III) Serva, Heidelberg Bromphenolblau, reinst. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen Bovines Serumalbumin (BSA), A-3059 Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA, über Biologo, Kronshagen Biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, BA 1000 Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100 VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt) Formaldehydlösung, mind. 37 %., 1.03999.2500 Emissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES, JY 24, Jobin Yvon GmbH) 160 Anhang 9.4 Lösungen und Puffer 9.4.1 Immunhistologie DAB-Lösung 100 mg DAB in 200 ml PBS, pH 7,1 lösen und mischen (Magnetrührer), anschließend filtrieren und 200 µl H O (30 %) zugeben 2 2 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 40 g NaCl und 8,97 g NaH PO in 5 2 4 Litern Aqua dest. auflösen und mit 1 M NaOH auf pH 7,1 einstellen Pronase 0,1 g Pronase E auf 200 ml vorgewärmten PBS Puffer, 0,2 g CaCl² pH 7,4 Anitkörper Lawsonia 1:30000 in PBS/BSA 161 Anhang 9.4.2 Histologie Durchführung HE-Färbung Automatisierte HE Färbung (Leica ST 40440) Tauchlösungen und Verweildauern Roticlear 2 Minuten Ethanol 96 % 2 Minuten Ethanol 70 % 2 Minuten Ethanol 50 % 2 Minuten Aqua dest. 2 Minuten Hämalaun 6 Minuten Leitungswasser 8 Minuten Auqua dest. 2 Minuten Eosin 2 Minuten AquaDest. 4 Minuten Ethanol 70 % 2 Minuten Ethanol 96 % 4 Minuten Isopropanol 4 Minuten Essigsäurebutylester 2 Minuten 9.4.3 Sektion 10 %iges Formalin 10 ml 36 %iges Formaldehyd 90 ml Aqua dest. 162 Anhang 9.4.4 PCR Mastermix eine Probe Probe DNA (2,5 µl) 10 x Puffer MGCl² 2,5 µl 15 mMol) MGCl² 25 mMol 1 µl Primer A 10 mMOl 1 µl Primer B 10 mMol 1 µl DNTP 10 mMol 1 µl Taq 5 u/µl 0,1 µl H²O ad 25 µl 15,9 µl Ansetzen des Agarosegels 2% 10x TBE Tris (Mol Gewicht 121,1 g) Borsäure (Mol Gewicht 61,84 g) diNaEDTA (Mol Gewicht 372,24 g) demineralisiertes Wasser 108 g 55 g 9,3 g ad1000 g pH 8,3 10xTBE Puffer Gewichtsmarker (Größen Bestimmung DNA VIII) 319 Basenpaare Farbmarker Blau 10xTBE auf 1xTBE verdünnen 165 ml 1xTBE + 3,3 g Agarose Gelstar 16,5 µl Elektrophorese Gel mit 1xTAE Puffer übergießen Elektrophorese ca. 90 Min. bei 4-5 Volt pro cm Lauflänge 163 Anhang Danksagung Hiermit möchte ich mich ganz herzlich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. M. Wendt, danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, seine intensive Betreuung, die freundliche Zusammenarbeit, seine Geduld und die ständige Ansprechbarkeit. Dem Landwirt Hugo danke ich besonders für seine tatkräftige Unterstützung. Herrn Prof. Dr. W. Baumgärtner, Ph.D. und Frau Dr. U. Kaim danke ich für die freundliche Betreuung und Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und die konstruktive Kritik. Herrn Prof. Dr. M. Rodehutscord und Dr. H. Kluth der Martin Luther Universität in Halle danke ich für Ihre freundliche Unterstützung. Ich danke dem gesamten Team der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Herzlichen Dank auch an die Tierarztpraxis Fraune für die kollegiale Hilfe. Bei allen Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bedanke ich mich für die geduldige Beantwortung meiner Fragen und für die tatkräftige Unterstützung. Meinen Mitstreitern sei für die schönen Stunden gedankt. Meiner Familie, die mich zu jeder Zeit und in jeder Hinsicht unterstützt hat, danke ich besonders. 164
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