1. No category

Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
Laboratorio de habilidades Nº 4
Antimicrobianos
Durante el ciclo diagnostico estudiamos los distintos procesos de diagnóstico directos e indirectos
del examen microbiológico. Comenzamos con el diagnostico directo y la investigación del
microorganismo causal del proceso infeccioso que incluye la toma de muestra, el aumento de la
biomasa microbiana por medio de distintos cultivos y conocimos las distintas formas de
identificarlos en familia, género, especie, etc. En la práctica médica ¿Que hacemos una vez
identificado el microorganismo?
Sabemos que nuestro organismo está preparado con un complejo sistema inmunológico que nos
protege contra diversas noxas. ¿Pero qué sucede cuando esas defensas no son suficientes para
frenar un proceso infeccioso? Nos introducimos así al concepto de antimicrobianos (AMB)
Reseña histórica
Si bien la historia de los AMB comienza formalmente en el siglo XX, existen registros de culturas
antiguas que utilizaban compuestos para combatir enfermedades infecciosas, como el extracto de
plantas o algunos mohos.
En 1910 comienza a comercializarse un producto derivado de compuestos orgánicos del arsénico
llamado Arsfenamina (Salvarsan), conocido como “bala mágica”, que parecía tener cierta
efectividad en el tratamiento de la sífilis.
En 1935 aparece la primera sulfonamida, el Prontosil. Este era utilizado originariamente como
método de tinción en laboratorios pero pronto se observó que protegía a las ratas de laboratorio
frente diversas infecciones estreptocócicas. Funcionaba como una prodroga, ya que el fármaco se
metabolizaba en el organismo para convertirse en sulfanilamida, así, se considera a las sulfas
dentro de los primeros AMB de amplio espectro.
Años antes, en 1928 se produce un acontecimiento que revolucionaria la historia de la medicina.
Un científico llamado Fleming descubre en su laboratorio que sus placas de cultivo bacteriano
habían sido contaminadas por unas colonias de un hongo llamado Penicillium y podía observarse
que en la periferia de esta colonia fúngica el crecimiento bacteriano estaba inhibido. Sin embargo
no fue sino hasta 1945 que dos científicos, Florey y Chain logran producir extractos purificados
para producir la Penicilina. Fue el primer AMB descubierto y a partir del cual se comenzará a
invertir recursos en el desarrollo de estas sustancias. Fleming, Florey y Chain ganan en 1945 el
Premio Nobel de Medicina. De allí en más se sucedieron varios descubrimientos de AMB tanto de
origen natural como sintéticos.
Definición y clasificación
Los AMB son sustancias de distinto origen (natural o sintéticas) utilizadas para dar muerte
(bactericida) a los microorganismos o inhibir su crecimiento (bacteriostático).
Tratando sobre manera, ser lo mas selectivo posible con las células microbianas causando la
mínima expresión de toxicidad sobre las células del hospedero.
Según el origen de su estructura química podemos hablar de 3 tipos de sustancias



Antibióticos (anti-vida) Son sustancias naturales desarrolladas por seres vivos que suprimen
o inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Por ejemplo la penicilina es una sustancia
producida por hongos del genero Penicillium.
Quimioantibióticos: Son antibióticos modificados en el laboratorio con la finalidad de
expandir su espectro. Por ejemplo las aminopenicilinas.
Quimioterápicos: Son sustancias completamente sintéticas elaboradas por el hombre. Por
ejemplo las sulfamidas.
1
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
Según la diana sobre la que se dirigen los agentes microbianos pueden ser




Antibacterianos
Antivirales
Antifúngicos
Antiparasitarios
Para entender como actúan los antimicrobianos es imprescindible conocer la estructura de los
microorganismos. Podemos resumirlo en el siguiente cuadro:
Clasificación según mecanismo de acción
Betalactámicos Inhibición de la pared bacteriana Otros grupos Unión a ribosoma 30s Inhibición de la síntesis proteica Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos Antimetabolitos Unión a ribosoma 50s Inhiben la replicación de ADN Penicilinas Cefalosporinas Carbapenems Vancomicina Daptomicina Isoniacida Etambutol Aminoglucósidos Tetraciclinas Macrólidos Lincosamidas Estreptograminas Quinolonas Metronidazol Inhiben la síntesis de ARN Rifampicina Inhiben la síntesis de ácido fólico Sulfonamidas Trimetoprima 2
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
La elección de un AMB debe estar basada en las propiedades farmacocinéticas, toxicidad,
enfermedad clínica, enfermedad de base, vías de administración, etc.
Se recomienda utilizar combinaciones de AMB en el caso de ampliar empíricamente el tratamiento
polimicrobiano de una infección, prevenir emergencia de organismos multiresistentes durante la
terapia y producir un efecto bactericida sinérgico.
Mecanismos de resistencia antimicrobianos
La Resistencia (R) a los AMB es la capacidad natural o adquirida por parte de una bacteria de
permanecer refractaria a los efectos bactericidas o bacteriostáticos de un AMB.
Esto obliga al profesional medico a utilizar otros AMB. Cuando se lanza al mercado un nuevo
fármaco se debe especificar el espectro de acción sobre el cual es eficaz. Este va cambiando a
medida que la droga es utilizada clínicamente llegando un momento que es inutilizada y cae en
desuso. Miremos en la figura de abajo la línea de tiempo. En la parte superior el año en que el
AMB comenzó a utilizarse en los tratamientos infecciosos y abajo los años en que se detectaron
las primeras resistencias, que como podemos observar no fueron mucho tiempo después.
Esto pudo deberse a:
- Presencia de mecanismos de resistencia (R)
- Uso indiscriminado de ellos
- Uso de AMB de amplio espectro
- Tratamiento inútiles prolongados
- Tratamientos incompletos ó no adecuados para el aislamiento microbiano causante
de la infección.
- Falta de exámenes microbiológicos antes del tratamiento.
3
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
Tipos de resistencia

Natural ó intrínseca
Son propias del microorganismo. Se demostró con el aislamiento de bacterias estimadas en
2000 años atrás (en las profundidades de los glaciares) con R a AMB de esta era.
Todas las bacterias de la misma especie son R a alguna familia de AMB

Adquirida
Se produce a través de:
- Mutaciones
Cambios en la secuencia de bases del cromosoma que codifican el modo de acción del
AMB y se trasmite de generación en generación.
Ejemplo: Enterobacterias resistentes a las fluorquinolonas por modificación de la ADN
girasa
-
Transmisión de material genético extracromosómico ( de otras bacterias)
- Plásmidos
- Integrones
- Transposones
Mecanismos de resistencia

Eflujo
Un AMB penetra en la bacteria y es expulsado de la misma por un transporte activo, una
especie de bomba expulsora que utilizan las bacterias para la excreción de productos
residuales o tóxicos.
Ejemplo: Staphylococus aureus resistentes a las tetraciclinas

Disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana
Puede realizarla la bacteria por pérdida o modificación de los canales de entrada (porinas)
Ejemplo: Pseudomonas aeruginosa resistente a imipenem (carbapenem)

Modificación del sitio de acción
Hay AMB que se unen a proteínas que son esenciales para la sobrevida de la bacteria. La R de
éstas radica en que ella modifica la proteína diana y cambia su función.
Ejemplo: Staphylococcus aureus resistente a la Meticilina por alteración de las PBP (Penicillin
Binding Proteins)

Producción de enzimas inactivantes del AMB
Las bacterias producen enzimas que inactivan o destruyen los AMB. Es oportuno citar las
enzimas cloranfenicol acetil transferasa sobre el cloranfenicol y las betalactamasas que tiene la
función de destruir el anillo beta-lactámico de los AMB de ese grupo.
No hace mucho tiempo fueron creadas en la industria farmacéutica moléculas de
“antibetalactamasa” (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam) para proteger a los AMB del
efecto destructor de la enzima.
Citaremos ejemplos:
-
AmpC cromosómicas inducibles: Se producen a bajos niveles de manera natural y aumentan
su síntesis en presencia de inductores (betalactámicos). Como se mencionó anteriormente,
pueden derreprimirse, perdiendo así la característica de inducción.
Ejemplos: Enterobacter spp., M. morganii, Providencia spp. P. aeruginosa
-
AmpC cromosómicas no inducibles (constitutivas): Su expresión es a niveles muy bajos sin
mostrar resistencia. Cuando se encuentran hiperproducidas pueden conferir resistencia a todos
los betalactámicos a excepción de cefalosporinas de 4ta generación y carbapenémicos.
Ejemplo: Escherichia coli.
4
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
-
AmpC plasmídicas inducibles y AmpC plasmídicas constitutivas: La evidencia molecular sugiere
que los genes que codifican a estas enzimas, derivan de los genes ampC cromosómicos que
naturalmente poseen las enterobacterias arriba mencionadas. Estos genes han sido integrados
en elementos genéticos transferibles facilitando la diseminación a diferentes microorganismos.
Ejemplo: Los genes ampC mediados por plásmidos han sido encontrados en bacterias como
Salmonella spp., K. pneumoniae y Proteus mirabilis que naturalmente no poseen estos genes.
Hasta el presente se han descrito más de 20 familias de AmpC plasmídicas. Al igual que las
betalactamasas AmpC cromosómicas hiperproductoras, las enzimas AmpC plasmídicas
confieren resistencia a un amplio espectro de betalactámicos incluyendo penicilinas,
oxyminocefalosporinas, cefamicinas, etc.
-
Betalactamasa de espectro extendido
-
Carbapenemasa
Control de la resistencia (según el CDC)
- Uso prudente de los AMB
- Educación a los agentes de salud
- Involucrarlos en el problema
- Rápida identificación de los microorganismos multiresistentes o productores de resistencia
plasmídica transferible
- Estricto aislamiento de contacto
- Lavados de manos ¡!!!!!
Aspectos que no deben olvidarse:
- Trabajar en equipo - Realizar exámenes microbiológicos confiables - Tener toda la información sobre el paciente 5
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
Pruebas de sensibilidad antimicrobiana (PSA)
Objetivos
Que el alumno sea capaz de:

Conocer las distintas técnicas que permiten establecer el perfil de sensibilidad antimicrobiana
de los microorganismos involucrados en procesos infecciosos

Comprender las distintas pruebas in Vitro para obtener el perfil de sensibilidad

Interpretar los resultados y resolver situaciones practicas

Justificar la utilización de cada técnica en particular
Estas pruebas son de particular importancia para instaurar un correcto tratamiento antimicrobiano
individual, monitorear la evolución de la resistencia antimicrobiana (epidemiología local, nacional,
etc.) y/o actualizar estrategias para el tratamiento empírico de la infecciones.
Se realizan a fin de orientar al profesional medico a formular un adecuado y oportuno tratamiento
antimicrobiano (AMB).
Según cuál fuera el microorganismo en cuestión (bacterias, hongos, parásitos o virus), la
metodología y necesidad de realización varían.
Mapa conceptual
Punto de partida
Estas pruebas se basan en la disminución o inhibición del crecimiento de un
microorganismo en un medio en presencia de cantidades conocidas de AMB. Se
efectúan desafiando una suspensión de microorganismos estandarizada con una o
diferentes concentraciones o tipos de AMB, comprobando si tiene lugar o no la
inhibición del crecimiento bacteriano.
6
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
Todas son técnicas rigurosamente controladas y estandarizadas. Por ejemplo: en pureza y
densidad del inóculo, composición del medio, reactivos, condiciones de incubación, métodos de
lectura, criterios clínicos e interpretación de resultados.
El microbiólogo clínico se ajusta a las recomendaciones emanadas por la Sección antimicrobianos
del Instituto de epidemiología Dr. Carlos Malbrán y el CLSI (Status Clinical and Laboratory
Standards Institute) que llegan en forma de guías metodológicas y tablas de interpretación.
La rápida evolución de la adquisición de los mecanismos de resistencia por las bacterias
clínicamente significativas justifica sobremanera la realización de estos análisis de expresión
fenotípica y nos induce a la realización de otros adicionales en la mayoría de los casos.
La sensibilidad (S) in Vitro es un prerrequisito para inferir la eficacia de un tratamiento AMB, o sea
que orienta para la decisión del AMB a utilizar en el tratamiento adaptado a cada paciente.
En algunas bacterias a veces su resistencia (R) a los AMB puede ser predicha porque tienen un
espectro natural de actividad o de R natural y la mas de las veces nos orientan en su tipificación.
Ejemplos: Proteus mirabilis R natural a colistin, Klebsiella pneumoniae a ampicilina, Pseudomonas
aeruginosa a nitrofuranos, cefalosporinas de 1ª y 2ª generación, etc.
También hay algunas que son naturalmente S pero adquieren R o sea que su antibiotipo ha sido
modificado por mutación o adquisición de genes. Esta evolución de la R esta íntimamente
ligada al uso de AMB. Es por esto que la detección de la S por pruebas fenotípicas o
genotípicas es esencial.
R natural : predecible R adquirida: impredecible ( justifica necesidad de PSA) Técnicas para determinar la sensibilidad antimicrobiana in vitro
Bacterias
Cabe aclarar que estas pruebas son para bacterias de rápido crecimiento, no son tampoco
exigentes de en cuanto a requerimientos nutricionales por cultivo, aerobias o
anaerobias facultativas, pH óptimo alrededor de 7 y temperatura de crecimiento 3537 ºC.
Es por esta razón que en el laboratorio de microbiología, no se realiza habitualmente la
investigación de la sensibilidad a los AMB de las bacterias anaerobias, (aparente patrón estable de
sensibilidad). Esto mismo se aplica también para Espiroquetas, micoplasmas, clamidias y
rickettsias. En el caso de las micobacterias, las pruebas de sensibilidad AMB se realizan en
laboratorios especializados y por técnicas diferentes (feno y genotípicas).
Existen distintas técnicas para realizar las PSA, estas pueden ser por DILUCION y/o
DIFUSION, o bien técnicas que combinan ambos métodos. SIEMPRE deben realizarse con
cultivo bacteriano puro, y que no sea parte de la microbiota colonizante habitual en el
sitio infeccioso o un contaminante.
- ¿Cuáles y cuántos AMB ensayamos?
En las PSA lo conveniente es probar varios AMB pero NO todos los existentes en el mercado sino:
- Uno de cada grupo y que su actividad sea equivalente al ensayado. In vivo tendrá la misma
actividad que él. Ejemplo: Se ensaya cefalotina y su actividad in vitro se hace extensiva para
todas las cefalosporinas de 1º generación (cefadroxilo, cefalexina, cefazolina, etc).
- Todo aquel AMB de interés terapéutico, que llegue activo y en concentración necesaria en el
sitio de la infección.
7
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
- Aquellos AMB que se constituyen en “marcadores terapéuticos”. Son más amigables para la
detección de los mecanismos de R. Ejemplo: Se ensaya cefoxitina como marcador de la
meticilino resistencia en Staphylococcus aureus y predice la actividad a todos los
betalactámicos.
- Espectro clínico de los AMB
Esta integrado por la R natural del microorganismo, frecuencia de adquisición de la R,
farmacocinética y datos clínicos.
El espectro clínico es regularmente revisado.
La eficacia clínica no solo es suficiente con una correcta realización de las PSA sino de una
apropiada indicación clínica profesional.
- Categorización de los microorganismos frente a la actividad de los AMB
S (sensibles): los AMB inhiben la multiplicación bacteriana ocasionando su muerte o inhibición
de su multiplicación.
I (S intermedia- moderada actividad in Vitro): Puede no haber respuesta clínica
satisfactoria, se utilizan en situaciones donde el AMB concentra en el sitio de infección. Ejemplo:
Cefalotina ó Fluorquinolonas de S intermedia en infección urinaria).
R (resistentes): Los AMB son inhibibles por los microorganismos y la eficacia clínica no ha sido
segura en estudios. Ejemplo: Klebsiella pneumoniae productora de betalactamasa de espectro
extendido. Esta enzima rompe el anillo betalactamico de los AMB de este grupo invalidando su
actividad.
a) Técnicas de dilución
Se realiza la técnica en macrodilucion con una serie de tubos que poseen la misma cantidad de
un caldo de cultivo adecuado para el crecimiento de la bacteria que estamos estudiando; en cada
uno de ellos se coloca una cantidad decreciente de un AMB (la mitad que en el tubo anterior),
dejando siempre un tubo control sin antibiótico. Finalmente se colocan en todos los tubos la
misma cantidad de una suspensión estandarizada de las bacterias en cuestión. Estos tubos se
incuban por 18-24 hs. en estufa a 35-37 ºC.
Pasado ese lapso de tiempo se observa en cuáles tubos hubo crecimiento bacteriano y en cuáles
no. Se identifican por la turbidez que adquiere el medio. El tubo con menor cantidad de AMB de
los que no presentan crecimiento (el medio permanece transparente como lo era originalmente)
es el que indica la mínima concentración de antimicrobiano o CIM, (expresada en
microgramos por mililitro) que se requiere para inhibir el crecimiento de la bacteria que
estamos estudiando. De esto se deduce que cuanto menor es la cantidad que se necesita de un
AMB para que este inhiba a un microorganismo, mayor es la actividad de él frente al
microorganismo y viceversa, Esta técnica también puede realizarse en pequeños pocillos
contenidos en placas de poliestireno fondo en U, técnica denominada MICRODILUCION, en la
cual el crecimiento bacteriano se observa como un botón turbio en el fondo del pocillo.
8
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
La
desventaja
de
las
técnicas de dilución es que
sólo permite probar un
antibiótico por vez, lo cual
resulta un tanto engorroso y
costoso.
Esta
desventaja
puede solucionarse en parte
con
las
técnicas
de
microdilución, ya que las
placas (de 96 pocillos en U)
permiten probar diferentes
AMB en cada columna.
9
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
b) Técnica de difusión (Método de Kirby-Bauer)
Se basa en la utilización de una placa de
Petri que posee un medio de cultivo sólido
(Agar Mueller-Hinton) en la cual se siembra
una suspensión de la bacteria que estamos
estudiando
en
solución
fisiológica
(correspondiente a una concentración igual
a la turbiedad del tubo 0.5 de la escala de
Mc Farland). Esta siembra se realiza en tres
direcciones diferentes con el fin de que se
consiga una distribución lo más homogénea
posible de las bacterias sobre el medio de
la placa. Posteriormente se colocan sobre la
misma una serie de monodiscos de papel o
tabletas impregnados con una cantidad
determinada de AMB. Estos difunden
radialmente desde el disco al agar
sembrado con bacterias, estableciéndose
un gradiente de concentración a su alrededor (la mayor concentración de antibiótico está a su
alrededor del monodisco y va disminuyendo hacia la periferia). Estas placas se dejan incubando
en la estufa por 18-24 hs. a 35-37 ºC. Al cabo de este tiempo se puede observar un crecimiento
homogéneo en la superficie, con halos de inhibición alrededor de los discos que tengan
antibióticos activos frente a la bacteria sembrada. El diámetro de estos halos expresados en mm
se mide con un calibre o regla. Los mm que resultan de la lectura de la ausencia de crecimiento
se comparan con una tabla que expresa, para cada AMB el diámetro que indica S,I ó R. El
diámetro de S se aproxima a la CIM de la bacteria para ese AMB.
c) Técnica mixta (método epsilométrico ó por gradiente de concentración AMB)
Años atrás se la conocía como E-Test. Combina las técnicas de difusión y dilución. Se realiza de
igual forma que para la técnica de difusión pero en vez de colocar los monodiscos o tabletas se
colocan tiras plásticas que poseen a su largo una concentración decreciente de un determinado
AMB. Tras la incubación de la placa durante 18-24 hs. a 37 ºC, podemos observar un halo de
inhibición elipsoidal alrededor de la tira. El punto de la tira en la cual termina este halo, es decir,
donde comienza el crecimiento bacteriano, corresponde a la CIM de ese AMB.
d) Detección de mecanismos de resistencia a los AMB.
Tanto con el método de Kirby-Bauer o el epsilométrico, se pueden detectar mecanismos de
resistencia a determinados AMB. Citaremos algunos ejemplos:
10
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
-
Producción de enzimas betalactamasa de espectro extendido (BLEE) -
Amp C. -
Disminución de la sensibilidad de fluoroquinolonas -
Meticilino resistencia de Staphylococcus aureus -
Resistencia inducible de lincosaminas -
Resistencia a glucopéptidos, etc -
Portación de microorganismos multiresistentes para evitar su difusión e) Interacción antimicrobiana: sinergia – Indiferencia – antagonismo
El uso de AMB combinados en un mismo tratamiento infeccioso en la actualidad es habitual
empleándose con mayor frecuencia de lo que se justifica. La aparición de nuevos AMB,
conjuntamente con las especificidades del hospedero y la resistencia que desarrollan las bacterias,
han obligado a modificar la estrategia a seguir en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
Es importante reconocer que este proceder por parte de los profesionales médicos puede
aumentar en grado significativo la incidencia de efectos adversos, incrementar el costo del
tratamiento y, en ocasiones, disminuir la eficacia clínica por obstaculizar la actividad de un
fármaco con la presencia de un segundo. Cuando empleamos 2 AMB en un tratamiento podemos
lograr entre ellos:

Sinergia: se refiere a la propiedad de ciertas combinaciones de AMB capaces de producir un
efecto bactericida superior al ejercido por cada uno de ellos por separado.

Antagonismo: propiedad de ciertas combinaciones de AMB de ejercer un efecto bactericida
inferior al de cada uno de ellos por separado

Indiferencia: propiedad de ciertas combinaciones de AMB de ejercer un efecto bactericida
igual al de sólo uno de ellos.
Antagonismo
Indiferencia
Sinergia
11
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
Bacterias especiales: Micobacterias
La sensibilidad a los fármacos antituberculosos en Mycobacterium tuberculosis y otras de
crecimiento lento se realiza por:
a) Método de las proporciones
En un medio sólido (Lowenstein Jensen) sin antimicobacteriano se siembra un inóculo de
micobacterias determinado correspondiente al 100% del crecimiento y luego se siembran otros
tubos conteniendo el mismo medio con diferentes fármacos a ensayar.
Se incuba en aerobiosis a 37 ºC y al cabo de 15-20 días se cuentan las colonias en todos los
tubos y se evalúa la proporción de desarrollo obtenida frente a la control (100%)
También se puede realizar en medio líquido (Middlebrook) incubándose en estufas que registran
la gráfica de la curva de crecimiento. Si las curvas del control con las de los frascos que tienen
antimicobacterianos son similares, implica que hay 1% o más de micobacterias resistentes. Es un
sistema automatizado cuyos resultados se pueden leer entre 4 a 14 días (media 6 días).
b) Diagnóstico molecular genómico
La resistencia a la rifampicina está asociada a resistencia a otros fármacos antituberculosos. Se
investiga simultáneamente por técnicas genéticas directamente de muestras clínicas la presencia
de micobacterias y mutaciones en el gen rpoB (RNA polimerasa subunidad B) asociada a la
resistencia a la rifampicina.
Los resultados pueden informarse a las 2 hs.
La presencia del gen de resistencia a la rifampicina implica la necesidad del estudio de
sensibilidad a todas las drogas de 1era. y 2da. línea de tratamiento.
12
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
Colomb. Med. [online]. 2006, vol.37, n.4 , pp. 275‐286 Hongos
NO se realizan de rutina en la práctica diaria del laboratorio de micología clínica. Se denomina
ANTIFUNGIGRAMA. El patrón de sensibilidad es estable en la mayoría de las infecciones fúngicas.
Debido al aumento de las infecciones micóticas fundamentalmente en inmunodeprimidos y al
aumento de los tratamientos empíricos que se realizan, han aparecido aislamientos R que hacen
que a veces sea necesario el estudio de sensibilidad antifúngica.
Para las levaduras las técnicas son similares a las de bacterias: dilución, microdilución,
difusión y por gradiente de concentración.
Para los hongos filamentosos son muy complejas y difíciles de estandarizar. Se efectúan en
centros especializados de micología.
Parásitos
Las pruebas de sensibilidad antiparasitarias de protozoos y helmintos son muy complejas y NO se
realizan de rutina en la práctica diaria del laboratorio de parasitología clínica humana. Poseen
patrón de sensibilidad constante frente a los antiparasitarios.
En ciertas ocasiones en los laboratorios de microbiología clínica veterinaria se emplean para los
enteroparásitos, por ejemplo: el test de disminución de conteo de huevos (TRCH) o test de
eficacia en las heces de los animales.
Virus
NO se realiza de rutina en el laboratorio de virología clínica humana. Los tratamientos se
realizan en forma empírica y pueden necesitarse estas pruebas ante fallas en los tratamientos
antirretrovirales (ARV). Fundamentalmente estas pruebas de sensibilidad se practican a los fines
de investigación y epidemiológicos.
Los estudios de sensibilidad pueden efectuarse al virus herpes simple, varicela zoster, hepatitis B
e inmunodeficiencia humana (VIH).
13
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
En el VIH la resistencia aparece cuando este es capaz de cambiar lo suficiente en sus genes y así
evitar la acción de los ARV que llevaría al profesional medico a replantear el tratamiento. Este
virus muta fácilmente y se reproduce muy rápido, por tanto una persona puede tener circulando
varias cepas (cuasiespecies) en su organismo al cabo de un tiempo de la infección. En los
pacientes que tienen una adecuada adherencia al tratamiento, las mutaciones tardan algunos
años en aparecer.
Existen dos grandes grupos de técnicas para la detección de resistencias del VIH al
tratamiento antirretroviral: genotípicas y fenotípicas. Las pruebas de resistencia a los ARV se
realizan con sangre entera del paciente como muestra biológica. Las pruebas genotípicas se
basan en el análisis del genoma y por tanto detectan la presencia de mutaciones) numero y lugar
donde se encuentran). Pueden realizarse por secuenciación directa del ARN retroviral o
hibridación (Laboratorio de Habilidades Nº 4). Son las más difundidas por su menor costo. Las
pruebas fenotípicas miden la cantidad de ARV necesario para impedir la replicación viral in vitro.
Un virus resistente necesitará mayor cantidad de ARV para detener su multiplicación. Esta técnica
es más simple pero requiere más tiempo y por tanto son más costosas. Fueron suplantadas por
las técnicas de virus recombinantes que determinan la concentración de ARV que inhibe el 50%
de la infectividad
Para tener en cuenta Cualquier prueba de sensibilidad antimicrobiana correctamente realizada e interpretada indica en la mayoría de los casos que ese microorganismo in vitro es sensible a un AMB y, si se lo administra habrá un 90% de respuesta clínica eficaz al tratamiento. Si por el contrario se lo informa como resistente puede haber 50‐60% de respuesta clínica. Esta paradoja puede deberse a diversos factores propio del: 
Paciente: estado inmunitario, adherencia al tratamiento, localización de la infección, presencia de catéteres, sonda vesical, respiradores, gravedad de la infección, etc. 
Microorganismo: CIM, mecanismos de resistencia, formación de biopelículas, concentración microbiana en el sitio de infección, etc. 
Antimicrobiano: farmacocinética, farmacodinamia, dosis suministrada, actividad microbicida o microstático, interacciones con otros fármacos, etc. Los antimicrobianos por sí solos “no hacen milagros ni son mágicos”, simplemente son COLABORADORES en el tratamiento de un proceso infeccioso. ¡PUEDEN DEJAR DE CURAR!!!
Actividad práctica
El docente le entregará a cada grupo:
- 1 gradilla
- 1 suspensión de microorganismos con una concentración según la escala 0.5 Mc Farland
- 1 hisopo estéril
- 1 Placa de Müeller Hinton elaboradas según normas de la CLSI 2015
- 1 pinza
- 1 juego de monodiscos de AMB
- 1 recipiente bolsa roja para descartar hisopo
- 1 placa ya desarrollada con 18-24 hs de incubación a 37 ºC
- 1 regla milimetrada
- 1 tabla de interpretación de halos
14
Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Laboratorio de Habilidades 4 - 2015
a) Realice una prueba de sensibilidad antimicrobiana por la técnica de difusión en agar con
monodiscos según la metodología de kirby Bauer.
b) Efectúe la lectura de los halos de inhibición
c) Interprete dichos halos y elabore el informe con los datos aportados por el docente.
Apellido /Nombre:
Fecha:
DNI:
Material:
Ubicación:
Pruebas de sensibilidad antimicrobiana (Método Kirby Bauer)
Microorganismo ensayado:
Amicacina
Clindamicina
Nitrofurantoina
Amoxicilina/Clauvulánico
Cloranfenicol
Norfloxacina
Ampicilina
Colistina/Polimixina
Ofloxacina
Ampicilina/Sulbactama
Eritromicina
Meticilina
Cefalotina
Ertapenem
Penicilina G
Cefepime
Estreptomicina (alta carga)
Piperacilina
Ceftazidina
Fosfomicina
Piperacilina + Tazobactama
Cefotaxima
Gentamicina
Quinupristin -Dalfopristin
Cefoxitina
Gentamicina (alta carga)
Rifampicina
Ceftriaxona
Imipenem
Teicoplanina
Cefuroxima
Levofloxacina
Tetraciclinas
Ciprofloxacina
Linezolid
Tigeciclina
Meropenem
Trimetoprima/Sulfametoxazol
Minociclina
Vancomicina
………………………………………………………………
15