1. No category

‫דד‬
‫זיהוי ואפיון אנזימים בקרום ה ת א ש ‪7‬‬
‫‪ACHOLEPLASMA — 1 MYCOPLASMA‬‬
‫)‪6‬‬
‫‪y‬‬
‫^‬
‫‪o‬‬
‫‪c‬‬
‫חיבור ל ש ם ק ב ל ת ה ת ו א ר‬
‫לפילוסופיה‬
‫דוקטור‬
‫‪H‬‬
‫מאת‬
‫‪-s‬־״‪/‬‬
‫‪I‬‬
‫מ ר י ת פכט )‪7‬נדאו(‬
‫הוגש ל מ ו ע צ ה ה מ ד ע י ת ש ל מ כ ו ן ויצמן ל מ ד ע‬
‫רחובות‬
‫אלול תשל״ז‬
‫םפטמבר‬
‫‪!977‬‬
‫יהוי ואפיון אנזימים בקרו• ה ת א ש ל‬
‫‪ACHOLEPLASMA — 1 MYCOPLASMA‬‬
‫חיבור ל ש ם ק ב ל ת ה ת ו א ר‬
‫דוקטור‬
‫לפילוסופיה‬
‫מאת‬
‫מרית פכס‬
‫)לנדאו(‬
‫הוגש ל מ ו ע צ ה ה מ ד ע י ת ש ל מכון ויצמן ל מ ד ע‬
‫רחובות‬
‫אלול‬
‫תשל״ז‬
‫ס פ ט מ ב ר ‪1977‬‬
‫עבודה‬
‫ז ו ב ו צ ע ה ב ה ד ר כ ת ו של‬
‫פרופ'‬
‫אפרים קציר‪,‬‬
‫במחלקה‬
‫מכון‬
‫לביופיםיקה‪,‬‬
‫ויצמן למדע‪,‬‬
‫רחובות‬
‫לזכרו‬
‫טל א ח י דן‬
‫לנדאו‬
‫אשר נ פ ל כ ע ת מ י ל ו י ת פ ק י ד ו‬
‫בכ״א א ל ו ל תטכ״ז‬
‫להורי‬
‫ו ה ו א בן ‪. 2 0‬‬
‫היקרים יבדל״א ‪.‬‬
‫תודתי‬
‫העמוקה נ ת ו נ ה ל מ ד ר י כ י‬
‫פרופ'‬
‫אפרים קציר‪,‬‬
‫אשר ה א י ר את ד ר כ י ב נ ב כ י המדע‬
‫במשך כ ל ש נ ו ת ע ב ו ד ת י ע מ ו ו א ף ה ת פ נ ה‬
‫מתפקידו‬
‫הרם ל ס י י ע ל י‬
‫בעריכת‬
‫עבודה ז ו ‪.‬‬
‫תודותי‬
‫נ ת ו נ ו ת גם לעמיתי‬
‫דייר י ו ס ף י ר י ב ודייר א ל ד ד ג י ב ר ת ן‬
‫על ש י ת ו ף ה פ ע ו ל ה ה נ א מ ן ‪,‬‬
‫ולפרופי‬
‫שמואל ר ז י ו על ק ר י א ת‬
‫כתב היד וההערות ה מ ו ע י ל ו ת ‪.‬‬
‫ל מ ר ישראל י ע ק ו ב ם ו ו א ו ד ה על‬
‫העזרה המסורה ב ם י נ ת י ז ו ת ה פ פ ט י ד י ם ‪,‬‬
‫לגבי‬
‫י ו ל י א נ ה ק ו ב ו על ב י צ ו ע‬
‫אנליזות‬
‫החומצות האמיניות‪.‬‬
‫תודה לנעמי עותמי‬
‫ו צ י פ ו ר ה שיר‬
‫על מ ה י ר ו ת ו ב ה ד פ ס ה ה נ א ה של ע ב ו ד ה ז ו ‪.‬‬
‫תוכן‬
‫עמוד‬
‫הענינים‬
‫ת מ צ י ת‬
‫‪.1‬‬
‫‪1‬‬
‫מבוא‬
‫‪6‬‬
‫‪ 1.1‬ת כ ו נ ו ת של אנזימים הקשורים בממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת‬
‫‪6‬‬
‫‪ 1.2‬מיקופלםמה ‪ -‬ת כ ו נ ו ת ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם השלם וקרום התא שלו‬
‫‪10‬‬
‫‪1.2.1‬‬
‫קרום התא של מיקופלסמה‬
‫‪12‬‬
‫א‪ .‬ב י ד ו ד הממברנה הפלסמטית והרכבה‬
‫‪12‬‬
‫ב‪ .‬פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות בממברנה‬
‫‪13‬‬
‫ג ‪ .‬המסה ו ב י ד ו ד של ח ל ב ו נ י הממברנה‬
‫‪14‬‬
‫ד‪ .‬שומני הממברנה‬
‫‪15‬‬
‫ה‪ .‬א ר ג ו ן החלבונים והשומנים בממברנה‬
‫‪17‬‬
‫ו ‪ .‬מ נ ג נ ו נ י טרנספורט‬
‫‪18‬‬
‫ז ‪ .‬דרישות ת ז ו נ ת י ו ת ו י כ ו ל ת ביוםינתטית‬
‫‪18‬‬
‫ח‪ .‬מ נ ג נ ו ן מעבר האלקטרונים‬
‫‪19‬‬
‫‪ .2‬מטרת העבודה‬
‫‪21‬‬
‫‪r^ .3‬ל‪ p‬נ ם י ו נ י‬
‫‪22‬‬
‫‪ 3.1‬מיקופלםמה ‪ -‬תנאי ג י ד ו ל והכנת התאים ל נ י ס ו י‬
‫‪ 3.2‬קביעת הפעילות האמידטית של מיקופלסמה‬
‫‪22‬‬
‫)‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ 3.3‬םינתיזה של םובסטרטים פפטידיים‬
‫‪23‬‬
‫‪ 3.4‬קביעת פעילות מיקופלסמה ב ה י ד ר ו ל י ז ה של פפטידים‬
‫‪25‬‬
‫‪26‬‬
‫)‪Amidase‬‬
‫)‬
‫‪4‬‬
‫‪Peptidase) 2‬‬
‫‪L-Alanine‬‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫‪ 3.7‬הכנת תכשיר קרומי של מיקופלסמה‬
‫‪28‬‬
‫‪ 3.8‬קביעת פוספט א י א ו ר ג נ י ו א ו ר ג נ י‬
‫‪29‬‬
‫‪ 3.9‬קביעת פעילות ‪ NADH Oxidase‬הקשורה לממברנה של‬
‫‪29‬‬
‫‪Acholeplasma‬‬
‫‪laidlawii‬‬
‫‪ 3.10‬ז י ה ו י ח ל ב ו נ י ם בתכשיר קרומי של ‪ Acholeplasma laidlawii‬ע ל ‪ -‬י ד י‬
‫‪30‬‬
‫‪gel electrophoresis‬‬
‫‪SDS-Polyacrylamide‬‬
‫תוכן העני נים ‪ -‬המשך‬
‫עמוד‬
‫תוצאות ו ד י ו ן‬
‫פעילות‬
‫‪31‬‬
‫‪4.‬‬
‫אמידטית של מיקופלסמה‬
‫מידטית של‬
‫‪4.1.1‬‬
‫מידטית של‬
‫‪4.1.2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪31‬‬
‫‪Mycoplasma fermentans‬‬
‫‪31‬‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫‪1‬‬
‫‪.‬‬
‫‪.‬‬
‫‪pH -‬‬
‫‪4‬‬
‫של‬
‫רות‬
‫‪4.2.2‬‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫פטידטית של‬
‫‪4.3.2‬‬
‫אקטיבציה‬
‫שינויים בריכוז‬
‫‪41‬‬
‫פפטידטית של מיקופלםמה‬
‫פטידטית של‬
‫‪45‬‬
‫‪Mycoplasma fermentans‬‬
‫של הפעילות האמידטית על ידי קטיונים חד ערכיים‬
‫‪ NaCl‬במדיום‬
‫אנזימים על הפעילות האמידטית של‬
‫ריפםין‬
‫ליפז‬
‫‪4.5.2‬‬
‫פעילות אמידטית של‬
‫בחומצה מתאי‬
‫‪4.4‬‬
‫‪4.4.2‬‬
‫‪4.5‬‬
‫‪65‬‬
‫‪65‬‬
‫‪C‬‬
‫‪4.5.2.1‬‬
‫‪66‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫‪66‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫‪4.5.2.2‬‬
‫עקב טיפול בפוםפוליפז ‪C‬‬
‫פעילות‬
‫‪59‬‬
‫‪62‬‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫‪4.5.1‬‬
‫‪48‬‬
‫‪59‬‬
‫ש י נ ו י י ס ו ג הקטיון החד ערכי במדיום‬
‫השפעת‬
‫‪4.3‬‬
‫‪45‬‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫‪4.4.1‬‬
‫השפעת‬
‫‪38‬‬
‫‪38‬‬
‫להיסטידין‬
‫‪4.3.1‬‬
‫‪4.2‬‬
‫‪Mycoplasma fermentans‬‬
‫על ידי ריאגנטי אלקילציה‬
‫פעילות‬
‫‪32‬‬
‫‪34‬‬
‫ריאגנטים מעכבים על הפעילות האמידטית של‬
‫השפעת‬
‫‪ Mycoplasma fermentans‬כלפי ‪L-Histidyl-3-naphthylamide‬‬
‫ועל כושר קליטת היםטידין‬
‫‪4.2.1‬‬
‫‪4.1‬‬
‫ויציבות הפפטידז )אמידז( בתכשיר קרומי‬
‫‪67‬‬
‫‪70‬‬
‫‪4.6‬‬
‫תוכן הענינים ‪ -‬המטר‬
‫חדירות תאי ‪4.7‬‬
‫עמוד‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫נפח האינולין‬
‫‪4.8‬‬
‫בממברנה‬
‫‪NADH Oxidase‬‬
‫לאלנין וקביעת‬
‫‪72‬‬
‫טל‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫‪ A‬ו ‪ C -‬על ממברנה‬
‫‪4.8.1‬‬
‫השפעת‬
‫‪77 A. laidlawii‬‬
‫המסה סלקטיבית של תממברנה באמצעות הדטרגנט‬
‫‪ Tween 20‬על פעילות ‪NADH Oxidase‬‬
‫מיצוי‬
‫רופוריזה‬
‫קטיבציה של פעילות‬
‫‪4.8.2.3‬‬
‫טרגנט על פעילות‬
‫‪4.8.2.4‬‬
‫‪ SDS-PAGE‬של ממברנה‬
‫‪4.8.2.1‬‬
‫‪81‬‬
‫לאחר‬
‫מיצוי עם ‪Tween 20‬‬
‫‪83‬‬
‫‪NADH Oxidase‬‬
‫בממברנה שטופלה בדטרגנט‪ ,‬בהשוואה לממברנה‬
‫רגילה‬
‫‪85‬‬
‫‪NADH Oxidase‬‬
‫בתנאי ‪ pH‬שונים‬
‫‪4.8.3‬‬
‫‪88‬‬
‫‪ NADH‬בממברנת‬
‫‪laidlawii‬‬
‫טידים מחומצנים‬
‫‪4.8.2‬‬
‫‪80‬‬
‫סלקטיבי של חלבונים ופוםפוליפידים‬
‫באמצעות ‪Tween 20‬‬
‫‪4.8.2.2‬‬
‫מצון‬
‫‪75‬‬
‫‪Acholeplasma‬‬
‫‪4.8.3.1‬‬
‫הטפעת‬
‫‪91‬‬
‫‪92‬‬
‫פירידין נוקליאוטידים מחןמצנים על‬
‫פעילןת‬
‫‪NADH Oxidase‬‬
‫‪ ^ ^ - N A D H‬לתכשיר קרומי‬
‫אינטראקציה בין ‪4.8.3.3‬‬
‫מ‪Acholeplasma laidlawii -‬‬
‫‪4.8.3.2‬‬
‫‪92‬‬
‫‪92‬‬
‫דיון מםבם‬
‫‪98‬‬
‫רשימת ספרות‬
‫‪110‬‬
‫תמצית באנגלית‬
‫‪I‬‬
‫‪1‬‬
‫ת מ צ י ת‬
‫נחקרו פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות לקרום התא של‬
‫ו־‬
‫‪Mycoplasma‬‬
‫‪ Acholeplasma‬במטרה להבהיר את ה ת כ ו נ ו ת ה מ י ו ח ד ו ת של ח ל ב ו נ י ם בעלי‬
‫פ ע י ל ו ת ס פ צ י פ י ת המשולבים במבנה ק ר ו ם התא‪ .‬המיקופלםמה ואכולפלםמה משפחת‬
‫‪ Mycoplasmataceae‬למחלקת ה ‪-‬‬
‫‪ , Mollicutes‬נבחרו כמערכת מתאימה ב י ו ת ר‬
‫ה י ו ת והתא חסר ד ו פ ן פ פ ט י ד ו ג ל י ק ן צפיד והמעטפת ה ח י צ ו נ י ת היא הקרום ה י ח י ד‬
‫בתא‪.‬‬
‫ה פ ע י ל ו י ו ת ה א נ ז י מ ט י ו ת שנבדקו ו א ו פ י י נ ו ת כ ו נ ו ת י ה ן ‪:‬‬
‫אמידז ו פ פ ט י ד ז ב ‪ Mycoplasma fermentans -‬ו ב ‪-‬‬
‫א‪.‬‬
‫‪Acholeplasma‬‬
‫‪» laidlawii‬‬
‫ב‪.‬‬
‫‪ NADH‬א ו ק ם י ד ז ב ‪-‬‬
‫אמידז‬
‫ופפטידז ב‪-‬‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫‪Acholeplasma l a i d l a w i i ^ Mycoplasma fermentans‬‬
‫פ ע י ל ו ת א מ י ד ז ‪ ,‬המתבטאת ב פ י ר ו ק ‪ - 3‬נ פ ת י ל א מ י ן מ‪ - 3 -‬נ פ ת י ל א מ י ד י ם של‬
‫‪ . M. fermentans‬ה א נ ז י ם‬
‫חומצות א מ י נ י ו ת ‪ ,‬נמצאה לראשונה על י ד י נ ו ב ‪-‬‬
‫הקשור לקרום התא מגלה ס פ צ י פ י ו ת ב ב י ק ו ע נ פ ת י ל א מ י ד י ם של החומצות ה א מ י נ י ו ת‬
‫הבסיסיות‪:‬‬
‫נפתילאמיד‬
‫ריםטידין‪ ,‬ארגינין‬
‫) ‪- 2 5 . K m = l‬‬
‫ו ל י ז י ן ‪ .‬הזיקה החזקה ב י ו ת ר של ה א נ ז י ם הזה‬
‫״ה(‪0M‬‬
‫ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם נמצא בתחום‬
‫‪9.5-10‬‬
‫‪1‬‬
‫‪x‬‬
‫‪H‬‬
‫‪ p‬האופטימלי ל פ י ר ו ק‬
‫ו פ ר ו פ י ל ה‪ pH -‬של פ ע י ל ו ת הקרום המבןדד‬
‫דומה ב י ו ת ר ל ז ה של פ ע י ל ו ת תאים שלמים‪ ,‬ממצא המרמז על כך שהאנזים בתא‬
‫השלם ו ב ק ר ו ם חשופים ל א ו ת ו ‪ pH‬״ ה פ ע י ל ו ת האמידטית דורשת קבוצה ג>‪-‬אמינית‬
‫חופשית של החומצה ה א מ י נ י ת ‪ ,‬כך שניתן להגדירה כ א מ י נ ו פ פ ט י ד ז ‪ .‬פ ע י ל ו ת דומה‬
‫של א מ י ד ז ‪ ,‬אך בעלת תחום ס פ צ י פ י ו ת שונה‪ ,‬נמצאה ב ‪ .A. laidlawii -‬האמידז‬
‫של ‪ A. laidlawii‬הקשןר גם כן בקרום ג י ל ה ס פ צ י פ י ו ת ב פ י ר ו ק א ל נ י ל נ פ ת י ל‬
‫‪4‬‬
‫אמיד‪ ,Km=6xlO~ M ,‬בעןד שההידרןליזה של שאר ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם שנבדקו היתה‬
‫מועטת‪ .‬ה‪ pH -‬האופטימלי ל פ ע י ל ו ת האמידז של ‪ A. laidlawii‬נמצא בתחום‬
‫‪2‬‬
‫‪ 8-9pH‬וגם פעילות זו היא מסוג אמינופפטידזהנפתיל אמידז שזוהה ואופיין‪.‬‬
‫במיקופלסמה דומה בתכונותיו לארילאמידזות שנמצאו בחיידקים אך שונה במיקומו‬
‫הבלעדי בקרום התא‪.‬‬
‫הפעילות האמידטית של‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫עוכבה כאשר התאים טופלו‬
‫ביודואצטט ב‪ ;7>,pH5 -‬ניתן להגן על האמידז מפני עיכוב זה באמצעות היםטידין‪.‬‬
‫עיכוב האמידז שהינו כנראה תוצאה של התמרת ציםטאינים‬
‫המתרחשת על שטח פני‬
‫התא‪ ,‬מתרחש בשני שלבים ‪ -‬שלב מהיר בו מושג עיכוב של ‪ 50%‬מהפעילות ההתחלתית‬
‫ושלב איטי שאינו מביא לעיכוב מלא‪ ,‬מה שמעיד על שינויים אפשריים במזומנות‬
‫של קבוצות ‪ SH‬החיוניים לפעילות‪(TLCK) .‬‬
‫‪,Tosyl lysine chloromethylketone‬‬
‫בהיותו ריאגנט התמרה דמוי םובסטרט‪ ,‬לא פעל כמעכב בעל זיקה חזקה יותר‬
‫מיודואצטט בתחום הריכוזים הנבדק‪ .‬נמצא כי גם כושר ההחדרה של‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫להיסטידין ניפגם עד כדי ‪ 90%‬לאחר שהתאים טופלו ביודואצטט‪.‬‬
‫הממצא של עיכוב דומה של פעילויות קטליטיות שונות‪ ,‬בעלות ספציפיות לאותו‬
‫סובםטרט‪ ,‬הקשורות לקרום מהווה תמיכה בהשערה של ‪ Crane‬בדבר קיום קשר‬
‫תיפקודי בין האנזים למערכת טרנספורט של םובסטרט מסויים‪.‬‬
‫פעילות פפטידטית של‬
‫‪ M. fermentans‬נמצאה לגבי די וטרי פפטידים‬
‫סינטטיים המכילים )‪ (L‬חומצות אמיניות הבסיסיות היסטידין וליזין‪ ,‬א ר לא‬
‫אורניטין‪ .‬תוצרי פעילות הפפטידז אשר זוהו בכרומטוגרפיה הראו כי הביקוע‬
‫מתרחש מהקצה האמיני של הפפטיד ודורש קבוצה ‪-0‬אמינית טרמינלית חופשית‪.‬‬
‫הספציפיות של ההידרוליזה והן ה‪ pH -‬האופטימלי דומים בשתי הפעילויות ‪-‬‬
‫פפטידז ואמידז‪ .‬הפפטידז של ‪ , A. laidlawii‬בדומה לאמידז‪ ,‬מפרק בעיקר‬
‫_‪-1‬אלנין‬
‫מהקצה ה‪-^ -‬טרמינלי של פפטידים המכילים מ‪ 2 -‬ועד ‪ 9‬שיירים‪.‬‬
‫הסטראוםפציפיות טל האנזים‪ ,‬במקרה והפפטיד מכיל ם־חומצה אמינית‪ ,‬דורשת‬
‫•‪4‬‬
‫רצף מוגדר ‪ , LLD‬כאשר שייר ‪D‬‬
‫במרחק שני שיירים מהקשר הנבקע‪ .‬מהכנת סדרת‬
‫אלנין אוליגופפטידים מוגדרת ‪ H L(LD) OH‬למדנו כי הפפטידז הינו אמינופפטידז‬
‫‪3‬‬
‫כמו כ ן ‪ ,‬מהירות ה פ י ר ו ק י ו ר ד ת עם עלית אורך ׳הפפטיד‪ ,‬מה שמצביע על אתר‬
‫קישור מ ו ג ב ל בגדלו או על התלות של מהירות ה פ י ר ו ק ב ד י פ ו ז י ה של הםובסטרס‬
‫באם האתר מצוי בעומק מ ם ו י י ם בממברנה‪ .‬פ ע י ל ו ת ה פ פ ט י ד ז ‪ ,‬כמו האמידז קשורה‬
‫גם כן ל ק ר ו ם התא ו ה י ת ר ו ן ב מ י ק ו ם זה הוא באפשרות של המיקופלסמה והאכולפלסמה‬
‫שהם פ ר ז י ט י ם ובעלי כושר ב י ו ם י נ ט ט י מ ו ג ב ל ‪ ,‬לקלוט חומצות א מ י נ י ו ת מן המוכן‬
‫כאשר קצב הקליטה מבוקר על י ד י ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת ‪.‬‬
‫ל א ל נ י ן מצאתי כ י כאשר התאים מורחפים‬
‫בבדיקת חדירות ‪A. laidalwii‬‬
‫בתמיסת בופר א י ז ו ט ו נ י ת ‪ ,‬ד ה י י נ ו בתנאים בהם נבדקו פ ע י ל ו ת הפפטידז ו ה א מ י ד ז ‪,‬‬
‫הם א י נ ם ח ד י ר י ם ל א ל נ י ן ‪ ,‬אשר ממלא את נפח ה א י נ ן ל י ן )הנפח ה ב י ן ‪ -‬ת א י ( ‪ .‬חדירה‬
‫של א ל נ י ן לתוך התא מתרחשת כאשר התאים ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל שלהם‪ .‬תוצאה ז ו‬
‫מצביעה על מ י ק ו ם הפפטידז בעברה ה ח י צ ו נ י של הממברנה‪ ,‬הבא במגע עם המדיום‪.‬‬
‫למלחים של ק ט י ו נ י ם חד ע ר כ י י ם יש השפעה בהגברת ה פ ע י ל ו ת האמידטית של‬
‫‪ . A. laidlawii‬מחסום החדירות טל התאים החשופים זמן קצר ל ר י כ ו ז ג ב ו ה של‬
‫מלח א י נ ו נ פ ג ע ואף ה פ ע י ל ו ת האמידטית א י נ ה י ו ר ד ת לתמיסה‪ .‬הן ל ר י כ ו ז עולה‬
‫של המלח והן ל ס ו ג הקטיון יש השפעה מגבירת פ ע י ל ו ת שהינה מ י ר ב י ת ב נ ו כ ח ו ת‬
‫נ י אשלגן ) ‪1 . 6 7‬‬
‫‪M‬‬
‫( ‪ .‬ידועה השפעת המסוך של מטענים ש ל י ל י י ם על פ נ י‬
‫הממברנה ב נ ו כ ח ו ת ק ט י ו נ י ם ח ד ‪ -‬ע ר כ י י ם ‪ ,‬ו כ ן השפעתם על י י צ ו ב המצב ה ״ נ ו ז ל י "‬
‫של הממברנה‪ .‬יתכן ו פ ע י ל ו ת ה י ד ר ו ל י ט י ת מהירה י ו ת ר מושגת כאשר ממברנת‬
‫המיקופלםמה במצב " נ ו ז ל י " ‪.‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת האמידטית של ‪A. laidlawii‬‬
‫א י נ ה מושפעת ‪ in situ‬מחשיפת התאים‬
‫לפעולת טריפםין או פ ו ס פ ו ל י פ ז ‪.C‬‬
‫הפפטידז‬
‫והאמידז המגלים י צ י ב ו ת בתא השלם‪ ,‬מאבדים פ ע י ל ו ת ם במעבר מהרמה‬
‫התאית לתכשיר ק ר ו מ י ‪ .‬תכשירים ק ר ו מ י י ם שהוכנו מ‪-‬‬
‫‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫‪,‬‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫בשיטות ש ו נ ו ת ב ק ר ו ר ל ‪ C0° -‬ו ב נ ו כ ח ו ת מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ‪ ,‬א י ב ד ו‬
‫במהירות את פ ע י ל ו ת ם ‪ .‬רגישות מ י ו ח ד ת הראה התכשיר הקרומי מ‪A. laidlawii -‬‬
‫‪/‬‬
‫‪4‬‬
‫אשר איבד כמעט את כל פעילותו תוך זמן קצר‪ .‬אי‪-‬לכך‪ ,‬לא היה באפשרותי‬
‫לבדוק את התכונות של האמידז והפפטידז בתכשיר הקרומי‪.‬‬
‫‪ NADH‬אוקםידז ב‪A. laidlawii -‬‬
‫‪ NADH‬אוקםידז ב‪ A. laidlawii -‬הינו חלבון קרומי המהווה חלק משרשרת‬
‫הנשימה המסתיימת בפלבין‪.‬אפיינתי מספר תכונות של אנזים זה הקשורות במיקומו‬
‫בקרום התא‪.‬‬
‫הראיתי כי ניתן להןציא את פעילןת האןקםידז לתסנין על ידי עיכול‬
‫הקרום עם פוםפוליפזות ‪A‬‬
‫ו ‪ , C -‬החופשיות מפעילות פרוטאןליטית‪ .‬התכשיר‬
‫המסים יכול לשמש כמוצא ל נ י ק ו י נוסף של האנזים בעל הפעילות בהעברת‬
‫אלקטרןנים אל חמצן כאקספטור‪ .‬עיכול הפוםפוליפידים בד בבד עם שמירת‬
‫פעילות האוקםידז מאשר‬
‫ממצאים קודמים כי ליפידים אינם ח י ו נ י י ם לפעילות‬
‫אנזים זה‪.‬‬
‫מאידך‪ ,‬האוקסידז הנשאר קשור בקרום שהושרו בו ש י נ ו י י ארגון מגלה מספר‬
‫תכונות המשקפות שינויים אלה בסביבתו הקרובה‪ .‬למשל‪ ,‬הדטרגנט הלא י ו נ י‬
‫‪ Tween 20‬ממיס באןפן מבוקר את מרכיבי הקרןם כך שמשתנה יחס החלבןן לליפיד‬
‫מ‪2:1 -‬‬
‫ל‪ , 4.5:1 -‬כלומר העשרה ניכרת בחלבון‪ .‬תוצאת השינןי הזה התבטאה‬
‫בשינוי בנדידת החלבונים ב‪SDS -‬‬
‫גל אלקטרופוריזה‪ NADH .‬אוקסידז שנשאר‬
‫קשור בקרום המטופל גילה פעילות גבוהה יותר‪ ,‬אף בהעדר מרקפטואתנול‪ .‬זאת‬
‫ב נ י ג ו ד לתכשיר הקרומי המקורי אשר א י נ ו‬
‫מגלה את מלוא פעילותו בהעדר‬
‫מרקפטואתנול‪ .‬השינוי בסביבה המקומית של האנזים התבטא גם בתזוזה של‬
‫פרופיל ה־ ‪pH‬‬
‫לערכי ‪ pH‬גבוהים יותר‪.‬‬
‫ניסיתי לבודד את האוקםידז מהקדום על ידי סימונו בשלב ראשון עם מעכב‬
‫זיקה ובשלב שני המסת הקרום בדטרגנט י ו נ י והפרדת הקומפלכס האנזימטי‪ .‬אכן‪,‬‬
‫מצאתי כי ‪ NADH‬די‪-‬אלדהיד אשר הוכן על ידי חימצון במטפריודט‪ ,‬מתאים לשמש‬
‫כמעכב זיקה של האנזים בהיותו מעכב את רוב הפעילות בריכוז נמוך‪ .‬נראה כי‬
‫‪5‬‬
‫ר‪-‬זרחש אמנם קישור ‪ NADH‬די‪-‬אלדהיד‪ ,‬כנראה תוך יצירת בסיס שיף עם קבוצות‬
‫א מ י נ י ו ת בקרום שאינן ה י ו נ י ו ת לפעילות האוקםידז‪ .‬אך השינוי הכימי גרם‬
‫ליצירת אגרגטים גבה מ ו ל ק ו ל ר י י ם של ח ל ב ו נ י ם ממברנליים כפי שנראה ב‪SDS -‬‬
‫גל‬
‫אלקטרופוריזה ובתופעת החלבון המסומן בנפח ה פ נ ו י של עמודת ספרוז ‪4B‬‬
‫ב נ ו כ ח ו ת דטרגנטים‪.‬‬
‫‪6‬‬
‫מ ב ו א‬
‫‪.1‬‬
‫בעבודה ז ו א נ י מתארת ת כ ו נ ו ת מספר א נ ז י מ י ם הקשורים בממברנר• של שני‬
‫ס ו ג י מיקופלםמה‪:‬‬
‫‪ Acholeplasma laidawii‬ו ־ ‪. Mycoplasma fermentans‬‬
‫בחרתי במיקופלסמה משום ש ב מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם זה י כ ו ל ת ה ב י ו ם י נ ת י ז ה מ ו ג ב ל ת ‪,‬‬
‫התא חסר ד ו פ ו צפיד‪ ,‬והממברנה ה ח י צ ו נ י ת שהיא היחידה בתא נ י ת נ ת להפקה‬
‫ה א נ ז י מ י ם שבחנתי ה י ו ‪ :‬האמידזות ה פ פ ט י ד ז ו ת ו ה ‪-‬‬
‫בקלות‪.‬‬
‫באיפיוו‬
‫‪. NADH oxidase‬‬
‫ה ת כ ו נ ו ת של א נ ז י מ י ם ממברנלים אלה ה ת כ ו ו נ ת י להכיר את השפעת‬
‫הממברנה על ת כ ו נ ו ת ה א נ ז י ם ‪ .‬כדי להרחיב י ד י ע ו ת י על ממברנת המיקופלסמה‬
‫חקרתי גם ח ד י ר ו ת ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם לחומצות א מ י נ י ו ת והשפעתם של חמרים מעכבי‬
‫ח ד י ר ו ת על החדירות ועל ה א נ ז י מ י ם הקשורים בממברנה‪.‬‬
‫להלו אסקור את ה ת כ ו נ ו ת ה מ א פ י י נ ו ת א נ ז י מ י ם הקשורים לממברנות‬
‫ב י ו ל ו ג י ו ת ו כ ו מערכות טרנספורט הקשורות ב פ ע י ל ו ת א נ ז י מ ט י ת ‪ .‬כן אסקור את‬
‫המבנה‬
‫ו ה פ י ס י ו ל ו ג י ה של מיקופלסמה ואפרט את ה י ד ו ע על ההרכב ו ה ת כ ו נ ו ת של‬
‫הממברנה של מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם זה‪.‬‬
‫הבנה מעמיקה של התהליכים ה ס פ צ י פ י י ם ה י ו צ א י ם לפועל בממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת‬
‫תתכו אך ורק ת ו ך הכרת ה ק ו נ פ ו ר מ צ י ה של ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם המרכיבים את‬
‫הממברנה‪,‬‬
‫ידיעה של ס ו ג י הקשרים האחראים לאינטראקציה שביו מ ר כ י ב י הממברנה‬
‫ו מ ו ל י כ י ם למבנה המרחבי המיוחד שלה‪ .‬אולם מו הראוי ל צ י י ו שעל אף המחקר‬
‫המקיף ת ו ך שימוש בשיטות פ י ס י ק ל י ו ת ו כ י מ י ו ת טרם הוברר הארגוו של מ ר כ י ב י‬
‫הממברנה ברמה ה מ ו ל ק ו ל ר י ת ‪.‬‬
‫‪1.1‬‬
‫ה ת כ ו נ ו ת של א נ ז י מ י ם הקשורים לממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת‬
‫א נ ז י ם הקשור לממברנה נמצא בסביבה מיוחדת‬
‫‪Microenvironment‬‬
‫ה מ א ו פ י י נ ת על י ד י מבנה הממברנה ו א ו פ י מ ר כ י ב י ה ‪ .‬פ ע י ל ו ת ו של א נ ז י ם‬
‫הקשור לממברנה י כ ו ל ה לשמש כמדד רגיש ל ש י נ ו י י ם במרכיבי הממברנה או‬
‫באירגונם‪.‬‬
‫ש י נ ו י מזערי במולקולה חלבוו או ל י פ י ד ממברנלי שקשה ל ג ל ו ת ו‬
‫‪7‬‬
‫בשיטות פיסיקליות עלול להשתקף בשינוי מתאים בפעילות האנזים‬
‫הניתנת למדידה‪ .‬ההשפעה המיוחדת של הסביבה המקומית על תכונות אנזים‬
‫נבדקה במערכות מודל של אנזימים הקשורים לממברנה סינטתית )‪.(1‬נמצא‬
‫שהמטען החשמלי של הממברנה וגם הרכבה וכן עובי שכבת הדיפו ז יה‬
‫המפרידה בין האנזים הממןקם בממברנה לבין הסובסטרט במדיום קובעים‬
‫את הפרמטרים הקינטיים כמו תלות הפעילות בריכוז הסובסטרט וב‪ pH -‬״‬
‫השוואת פעילות אנזים ממברנלי לפעילותו בתמיסה מצביעה על רגישות שונה‬
‫בשני המצבים למעכבים ולטמפרטורה‪ .‬תופעה זו אשר נבדקה לגבי )‪(Fj‬‬
‫‪ ATPase‬המיטוכונדריאלי הוגדרה על ידי‪ ( R a c k e r(2‬כאלוטופיה‪ .‬תופעה‬
‫דומה נמצאה גם ב‪ ATPase -‬בקטריאלי ) ‪ . ( 3‬אנזים חלקיקי מגלה שוני‪,‬‬
‫בהשוואה לאנזים המסים‪ ,‬בתכונות כמו ‪ pH‬אופטימלי‪ ,Km ,‬ספציפיות‬
‫לםובםטרט‪ ,‬יציבות לטמפרטורה‪ ,‬פוטנציאל חיזור וכדי ‪.‬‬
‫התכונות המיוחדות שהממברנה מקנה לאנזים קשור הן‪:‬‬
‫א(‬
‫‪ - Compartmentation‬המיקום המרחבי של האנזים בא לידי ביטוי‬
‫באפשרות טל היווצרות ריכוז מקומי גבוה של סובסטרט‪ ,‬בהפרדה‬
‫מרחבית של תהליכים מתחרים או ביצירת שרשרת תהליכים רציפים‪.‬‬
‫ב( פזה ליפידית ‪ -‬פאזה זו מאפשרת קיום למוצרי ביניים הנהרסים‬
‫על נקלה״בפאזה מימית‪.‬‬
‫הדבר נכון למשל לגבי אנזימים ממברנליים הקשורים במטבוליזם‬
‫של שומנים או בהעברת אלקטרונים‪.‬‬
‫חשיבות מבנה הממברנה לפעילויות אנזימטיות ולגבי מערכות טרנספורט‬
‫מוכחת מכך שפעילויות אלה נעלמות תוך כדי הרחקת הליפידים הממברנליים‪.‬‬
‫איבוד הפעילות הקטליטית עקב הפעלת דטרגנטים‪ ,‬ממסים אורגנים או‬
‫פוספוליפזות על הממברנות‪ ,‬אינה הוכחה בלעדית לתלות האנזים בליפיד‪.‬‬
‫‪8‬‬
‫אינאקטיבציה יכולה להיות תוצאה של‪:‬‬
‫בליפידים;‬
‫א( דנטורציה שאינה קשורה‬
‫ב( פעולה מעכבת של תוצרי המודיפיקציה;‬
‫ג( פעולה מעכבת‬
‫ישירה של הריאגנט או חמרי לוואי כמו אנזימים פרוטאוליטים‪ .‬תאום בין‬
‫ריאקטיבציה של הפעילות וקישור עם ליפידים מהווה מבחן עיקרי לתלות‬
‫אנזים בליפידים לצורך פעילות תקינה‪ .‬נמצא כי רב האנזימים הממברנלים‬
‫הדורשים ליפידים לפעילותם‪ ,‬דהיינו תלויים בקיום המבנה הספציפי של‬
‫הממברנה‪ ,‬הינם אנזימים הפעילים בהעברת אלקטרונים‪ ,‬במטבוליזם של שומנים‬
‫וכו חלבונים הקשורים בטרנספורט ובהעברת אינפורמציה‪.‬‬
‫רוב האנזימים הממברנליים שהומסו באמצעים שאינם גורמים לדנטורציה‬
‫כמו ‪ 90%‬אצטוו בטמפרטורה נמוכה או על ידי הפעלת פוספוליפזות‪ ,‬יכולים‬
‫לעבור ריאקטיבציה בנוכחות תערובת של פוספוליפידים ממברנליים‪ ,‬או‬
‫אפילו עם דטרגנטים לא‪-‬יאונים‪ ,‬גליצרידים וחומצות שומניות )‪ .(4‬לגבי‬
‫אנזימים כאלה מהוים הליפידים מדיום להמסת םובםטרט ליפידי כמו למשל‬
‫במערכת ‪ ,(UDP-hexosyltransferase (5‬או לאינטראקציה עם אלקטרוו‬
‫אקםפטור המסיס בשומן‪ .(NADH-Cytochrome C reductase(6‬מאידך‪ ,‬ישנם‬
‫אנזימים ממברנלים המגלים תלות מוחלטת בפוספוליפיד מםויים )‪ ,(7‬כמו‬
‫למשל פוםפטידיל כולין באנזימים ממקור אנימלי‬
‫‪g-hydroxybutyrate‬‬
‫‪ dehydrogenase‬ו‪,GTP-dependent acyl-CoA synthetase -‬פוםפטידיל‬
‫גליצרול באנזים הבקטריאלי‬
‫‪Phospho-enolpyruvate phosphotransferase‬‬
‫וקרדיוליפיו באנזים בקטריאלי ‪dehydrogenase.‬‬
‫אנזימים המוגדרים כקשורים ברפיון‬
‫‪•FAD-dependent malate‬‬
‫)‪ ,(loosely bound‬הניתנים לניתוק‬
‫מהממברנה על ידי םוניקציה קצרה או חשיפה לתמיסת מלח מרוכזת בנוכחות‬
‫‪ , EDTA‬מראים ספציפיות בקיטורם החוזר לממברנה‪ .‬למשל קישורם של‬
‫‪ Monoamine Oxidase‬לממברנה החיצונית של מיטוכונדריה ו‪ ATPase -‬לממברנה‬
‫הפנימית מראה קינטיקת רוויוו המעידה על קיום אתרי קישור ספציפיים‬
‫לחלבונים אלה על הממברנה )‪. (8‬‬
‫‪9‬‬
‫כ י ש י נ ו י י ק ו נ פ ו ר מ צ י ה א ו א פ ש ר ו ת תנוער‪ .‬של ח ל ב ו נ י ם ב מ ד י ו ם‬
‫צפוי‬
‫ה ה י ד ר ו פ ו ב י של ה ‪-‬‬
‫‪bilayer‬‬
‫י ת ר ח ש ו עם א נ ר ג י ת א ק ט י ב צ י ה נ מ ו כ ה י ו ת ר‬
‫כאשר ה ל י פ י ד י ם במצב נ ו ז ל י ל ע ו מ ת מצב ג ב י ש י ‪ ,‬מאחר ו א י נ ט ר א ק צ י ו ת‬
‫ליפיד‪-‬חלבון‬
‫)‪(9‬‬
‫חלשות י ו ת ר ב ס ב י ב ה נ ו ז ל י ת ‪ .‬א כ ן נמצא על י ד י ר ו ת ם ו ח ב ר י ו‬
‫כ י המעבר של ה מ מ ב ר נ ה של ז ן‬
‫גבישי‬
‫‪ M. mycoides‬ה ע נ י ב כ ו ל ס ט ר ו ל ‪ ,‬ל מ צ ב‬
‫מ ל ו ו ה ב ע ל י ה ב א נ ר ג י ת ה א ק ט י ב צ י ה של ת ה ל י ך ה ט ר נ ס פ ו ר ט של‬
‫מ‪-‬מתילגלוקוזיד‪.‬‬
‫התבטאו‬
‫במקרה ז ה ‪,‬‬
‫שינויים בארגון‬
‫ה א י ז ו ר ה ל י פ י ד י של ה מ מ ב ר נ ה‬
‫ב ק י נ ט י ק ה של ת ה ל י ך ה ה ח ד ר ה ‪.‬‬
‫כי ה ל י פ י ד י ם הממברנלים חשובים ל פ ע י ל ו י ו ת קטליטיות הממוקמות‬
‫ראינו‬
‫ב מ מ ב ר נ ה מעצם ה י ו ת ם מ ד י ו ם ה י ד ר ו פ ו ב י ל ר י א ק צ י ה ה ק ט ל י ט י ת ‪,‬‬
‫מתאימה‪,‬‬
‫החלבון‬
‫ג(‬
‫בצמיגות‬
‫א ו ד ר ו ש י ם ב א ו פ ן ס פ צ י פ י כ נ ר א ה ל י י צ ו ב ק ו נ פ ו ר מ צ י ה מ ס ו י י מ ת טל‬
‫הפעיל ה ח י ו נ י ת ל פ ע י ל ו ת ו הקטליטית‪.‬‬
‫מ י ק ו ם ח ו ץ א ו פ נ י ם ‪ -‬אתר פ ע י ל ב מ מ ב ר נ ה ה פ ל ם מ ט י ת מ ע ו ר ר את השאלה‬
‫לגבי‬
‫מ י ק ו מ ו ב י ח ס ל ח ו ץ א ו פ נ י ם התא‪ .‬ב ע י ה ז ו קשורה ג ם ב ד ר י ש ו ת‬
‫ה ת ז ו נ ת י ו ת של התא ו ב א פ ש ר ו ת טל ק י ו ם קטר פ ו נ ק צ י ו נ ל י ביו ת ה ל י כ י ם‬
‫אנזימטיים‬
‫כי‬
‫ו ת ה ל י כ י החדרה ד ר ך ה מ מ ב ר נ ה ‪ .‬א פ ש ר ו ת אחת שהועלתה למשל ה י א‬
‫ה א נ ז י ם עצמו מ ס ו ג ל ל ק ש ו ר ו ל ה ע ב י ר ם ו ב ס ט ר ט י ם ב י ן ת ו ץ ל פ נ י ם ה ו ד ו ת‬
‫לשינויי‬
‫עברי‬
‫ק ו נ פ ו ר מ צ י ר ‪ .‬ב מ ו ל ק ו ל ה ה מ ת ב ט א י ם ב ז י ק ה ש ו נ ה של אתר ה ק י ש ו ר מ ש נ י‬
‫הממברנה‬
‫)‪ .(10‬ת ו פ ע ה אחרת ה י א א י נ ט ר א ק צ י ה של ה ו ר מ ו ו עם אתר‬
‫ספציפי‬
‫ב ע ב ר ה ח י צ ו נ י של ה מ מ ב ר נ ה ה ג ו ר מ ת לשרשרת ת ה ל י כ י ם ש ס ו פ ם ה פ ע ל ת‬
‫האנזים‬
‫א ד נ י ל צ י ק ל ז בתא‪.‬‬
‫קיימת‬
‫הבחנה א ו פ ר ט י ב י ת ב י ו‬
‫חלבונים פריפרליים ואינטריםיים‬
‫ז א ת על פ י מ ה ו ת ו ח ו ז ק ה ק ש ר י ם של ח ל ב ו נ י ם אלה ל מ מ ב ר נ ה ‪.‬‬
‫טכניים‪,‬‬
‫שינויי‬
‫)‪,(11‬‬
‫ה ק ר י ט ר י ו נ י ם הם‬
‫כ ל ו מ ר שימוש ב ש י ט ו ת ש ו נ ו ת ל ה פ ר ד ה ‪ .‬א מ צ ע י ם ה נ ח ש ב י ם ע ד י נ י ם כ מ ו‬
‫העצמה ה י ו נ י ת ) ב ת ו ס פ ת ‪ (EDTA‬מ ש פ י ע י ם ב ע י ק ר על ק ש ר י ם א ל ק ט ר ו ם ט ט י ם ‪.‬‬
‫‪10‬‬
‫אמצעים דרםטים כמו דטרגנטים או חמרים כאוטרופיים מוציאים את החלבון‬
‫בדרך כלל‪ ,‬בצורה דנטורטיבית‪ ,‬בצורת קומפלכס עם הדטרגנט או עם ליפידים‪.‬‬
‫בבדיקת פעילות אנזימים הקשורים לממברנה מתעוררים קשיים‬
‫אנליטיים מהיותם חלקיקיים‪ .‬בקטליזה הטרוגנית תלויה מהירות הריאקציה‬
‫בדיפוזיה של הםובסטרט אל האתר הפעיל והיא מושפעת גם משינויים מקומיים‬
‫ב‪ pH -‬או בקבוע הדיאלקטרי‪ .‬גם השיטות השונות של הכנת פרפרטים ממברנלים‬
‫אינן אמינות ותלויות בתנאי ההכנה ובסוג הממברנה‪ .‬לעיתים קרובות מוצאים‬
‫היפוך חוץ‪-‬פנים או אגרגציות של חלקיקים קטנים וכתוצאה מכך אובדות‬
‫לעיתים פעילויות קיימות או נחשפים אתרים אשר באופן טבעי אינם באים‬
‫לידי ביטוי כנראה עקב מחסום החדירות‪.‬‬
‫‪1.2‬‬
‫מיקופלסמה ‪ -‬תכונות המיקרואןרגניזם השלם ןקרום התא שלו‬
‫המיקרואורגניזמים הנמנים על קבוצת המיקופלסמה הם האורגניזמים‬
‫הקטנים ביותר המסוגלים לגדול אוטונומית‪ .‬מבחינה מורפולוגית תא‬
‫המיקופלסמה תינו שק מוקף קרום פלסמטי‪ ,‬המכיל ריבוזומים וחומר גרעיני‬
‫המאורגן בדומה לתאים פרוקריוטים דהיינו ללא קרום גרעין‪ .‬מיון‬
‫המיקופלסמה למשפחות ה‪-‬‬
‫‪ Mycoplasmataceae‬ו‪Acholeplasmataceae -‬‬
‫מושתת על הדרישה או העדר הדרישה לכולסטרול וסטרולים אחרים כפקטורים‬
‫לגידול‪ .‬המיקופלםמטצה נזקקים לםטרולים‪ ,‬בעוד שהאכולפלסמטצה אינם‬
‫זקוקים לסטרולים ) ‪ . ( 1 2‬אכולפלסמה נחשבו תחילה כםפרופיטים היות ובודדו‬
‫לראשונה מאדמה ומביוב‪ .‬אך הדרישות התזונתיות ורגישותם האוםמוטית‬
‫מעמידים בספק היותם םפרופיטים אמיתיים בתנאים אקולוגים משתנים ‪.‬‬
‫המיקןפלסמה חסרים את דופן הפפטידוגליקן הצפיד המאפייו חיידקים‪ .‬עובדה‬
‫זו מתבטאת בפלסטיות של התא‪ ,‬המסוגל בהשפעת לחץ לחדור מבעד לנקבים‬
‫טרו‬
‫)‬
‫(‬
‫)‪ .(pm0.2-0.313‬תכונות נוספות הנובעות מהעדר הדופן‬
‫הן עיכוב הגידול על ידי נוגדנים ספציפיים לקרום התא וכן יציבות מוחלטת‬
‫‪11‬‬
‫הצורה ה מ ו ר פ ו ל ו ג י ת ה ב ס י ס י ת ה י א הצורה ה כ ד ו ר י ת ‪ ,‬ה ק ו ק י ת ‪,‬‬
‫לפניצילין‪.‬‬
‫אולם ק י י מ י ם תנאי‬
‫ג י ד ו ל ב ה ם מ ו צ א י ם ג י ד ו ל י ם פ י ל מ נ ט י י ם )‪ .(14‬ק ר ו ם התא‬
‫נ ר א ה בחתך כ‪ "unit membrane"-‬א ו פ י י נ י ב ע ו ב י של‪ . ( O n m . 8 . 0 - 1 1(15‬א י ן‬
‫ע ד ו ת ל ק י ו מ ו של מ מ ב ר נ ו ת ת ו ך ‪ -‬ת א י ו ת ‪ .‬ה ת ר ב ו ת ה מ י ק ו פ ל ס מ ה נ ע ש י ת ב ד ו מ ה‬
‫לאורגניזמים‬
‫בהתפצלות‬
‫פ ר ו ק ר י ו ט י י ם אחרים‪,‬‬
‫ב י נ ר י ת )‪.(16‬‬
‫ב מ י ק ו פ ל ס מ ה שלא כאשר ב ח י ד ק י ם ב ע ל י ד ו פ ו ‪ ,‬א י ו‬
‫למצוא תמיד ס י נ כ ו ר ו נ י ז צ י ה‬
‫הציטופלסמה‪.‬‬
‫יותר‪.‬‬
‫מלאה ביו‬
‫רפליקצית הגנום‬
‫לביו‬
‫חלוקת‬
‫ל ע ת י ם נ ו צ ר י ם פ י ל מ נ ט י ם ר ב ‪ -‬ג ר ע י נ י י ם ה מ ת פ ר ק י ם בשלב מ א ו ח ר‬
‫ה נ צ ה ה נ ר א י ת ל ע י ת י ם ק ר ו ב ו ת ב ת ר ב י ו ת מ י ק ו פ ל ס מ ה ה י נ ה למעשה ג ם כו‬
‫התפצלות‬
‫ב י נ ר י ת בה ח ל ו ק ת ה צ י ט ו פ ל ס מ ה א י נ ה ש ו ו ה ‪ .‬ה ח ו מ ר ה ג נ ט י של‬
‫מיקרפלסמה‬
‫המוכפל‬
‫ד ה י י נ ו ר פ ל י ק צ י ה של ה ג נ ו ם ה מ ל ו ו ה‬
‫ב ד ו מ ה ל ח י י ד ק י ם ה ו א כ ר ו מ ו ז ו ם מ ע ג ל י מ ר כ ב מ ‪ DNA -‬ד ו ‪ -‬ג ד י ל י‬
‫ב צ ו ר ה ס מ י ק ו נ ס ר ב ט י ב י ת ח ד ‪ -‬כ ו ו נ י ת מאתר ג ד י ל ה י ח י ד )‪.(17‬‬
‫סווג‬
‫ה א כ ו ל פ ל ס מ ה כמשפחה נ פ ר ד ת מ ב ו ס ס ב מ י ד ה ר ב ה על ג ו ד ל ה ג נ ו ם ‪-‬‬
‫‪Q‬‬
‫ו ג ד ו ל פ י שניים‪E. coli‬המתקרב ב ג ו ד ל ו ל ג נ ו ם של‬
‫ל ע ר ך מ ג נ ו ם של מ י ק ו פ ל ס מ ה ‪.‬‬
‫ציסטרונים‪.‬‬
‫ה מ י י ח ד את ג נ ו ם ה מ י ק ו פ ל ס מ ה מ ח י י ד ק י ם ה ו א ה ת כ ו ל ה ה נ מ ו כ ה‬
‫של ‪ , GC‬כ ‪.23-35% -‬‬
‫אינפורמציה‬
‫ג נ ו ם ב ג ו ד ל זר‪ .‬מ כ י ל א י נ פ ו ר מ צ י ה ל ‪1200-1300 -‬‬
‫עובדה ז ו‬
‫י כ ו ל ה ל ה ס ב י ר את ה כ מ ו ת המצומצמת של‬
‫ל ת ר ג ו ם ה י ו ת ו א י ו א פ ש ר ו ת ל ד ג נ ר צ י ה של ה צ ו פ ו ‪ .‬ל מ ר ו ת ג ו ד ל ו‬
‫ה מ צ ו מ צ ם של ה ג נ ו ם ו ל כ א ו ר ה פשטות ה מ ב נ ה ‪ ,‬ל א ב ו צ ע מ י פ ו י ו עד כ ה ‪ .‬אחת‬
‫הסיבות‬
‫ה ע ק ר י ו ת ל כ ך ט מ ו נ ה בקושי הרב לקבל מ ו ט נ ט י ם החסרים ת כ ו נ ו ת‬
‫ביוכימיות‬
‫מסויימות‪,‬‬
‫ו ז א ת ע ק ב ה מ ד י ו ם העשיר ו ה ב ל ת י מ ו ג ד ר הדרוש ל ג י ד ו ל‬
‫ר ו ב מ י נ י ה מ י ק ו פ ל ם מ ה ‪ .‬עד עתה נ כ ש ל ו כ ל ה נ ס י ו נ ו ת ל מ י ק ו ם ס מ נ י ם ג נ ט י י ם‬
‫על ה כ ר ו מ ו ז ו מ י ם של מ ו ט נ ט י ם ה ר ג י ש י ם ל ט מ פ ר ט ו ר ה ‪.‬‬
‫ב‪-‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫לביטוי‬
‫יצירת‬
‫‪a-glucosidase‬‬
‫בהשראת מ ל ט ו ז מ ה ו ו ה ה ו כ ח ה ר א ש ו נ ה ל ק י ו ם מ נ ג נ ו ו בקרה‬
‫ה ג נ ט י ב מ י ק ו פ ל ם מ ה )‪.(18‬‬
‫‪12‬‬
‫ם י נ ת י ז ת ה ח ל ב ו נ י ם במיקופלםמה נעשית כנראה על פ י המתכונת שנמצאה‬
‫ב א ו ר ג נ י ז מ י ם ה פ ר ו ק ר י ו ט י ם ‪ ,‬והיא מעוכבת על י ד י כ ל ו ר א מ פ נ י ק ו ל ‪ ,‬מעכב‬
‫ספציפי טל ם י נ ת י ז ת ח ל ב ו נ י ם על ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫‪70‬‬
‫‪S‬‬
‫בקטריאליים‪ .‬ה ר י ב ו ז ו מ י ם‬
‫של מיקופלסמה ד ו מ י ם י ו ת ר ל ר י ב ו ז ו מ י ם בקטריאלים מאשר ל א נ י מ ל י ם הן במבנה‬
‫והן ב פ ו נ ק צ י ה ‪ .‬הם מ כ י ל י ם יחס ‪ RNA‬לחלבון ‪ 60:40‬בהשוואה ליחס של ‪40:60‬‬
‫ב ר י ב ו ז ו מ י ם ה א א ו ק ר י ו ט י ם ‪ .‬ה מ י ג ו ו ן של ‪ tRNA‬מצומצם‪ ,‬ונמצאה כמות העתקים‬
‫מ י ז ע ר י ת המתאימה ב ד י ו ק למערכת החומצות ה א מ י נ י ו ת ‪ .‬מציאות‬
‫‪et‬‬
‫™‪tRNA‬‬
‫מראה ש פ ו ר מ י ל מ ת י ו נ י ן מעורב ב א י נ י א צ י ה של ס י נ ת י ז ת השרשרת ה פ ו ל י פ פ ט י ד י ת ‪.‬‬
‫הידע על ו ו י ס ו ת ובקרה של ם י נ ת י ז ת מ א ק ר ו מ ו ל ק ו ל ו ת במיקופלסמה מ ו ג ב ל ‪.‬‬
‫ל ג ב י מיקופלםמה בעלי ג נ ו ם קטן )‬
‫‪3-4‬‬
‫ד ל ט ו ן ‪ ( x 1 0‬נמצא חוסר ק ו א ו ר ד י נ צ י ה‬
‫ב י ן ס י נ ת י ז ת ח ל ב ו ן ו ־ ‪ RNA‬לקצב ם י נ ת י ז ת ‪ ,DNA‬ו מ ב ח י נ ה א ב ו ל ו צ י ו נ י ת נ י ת ן‬
‫לכך הסבר ב א ו פ י ה פ ר ז י ט י של אותם מיקופלםמה ה ג ד ל י ם בסביבה מבוקרת של‬
‫הפונדקאי‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬באכולפלםמה נמצאה התאמה מ ם ו י י מ ת ב י ן קצב ם י נ ת י ז ת‬
‫‪ DNA‬ו ח ל ב ו ן‬
‫)‪ .(19‬יש לצפות אמנם כי ב ג נ ו ם ה ג ד ו ל י ו ת ר של אכולפלםמה‬
‫תהיה א י נ פ ו ר מ צ י ה גם ל מ נ ג נ ו נ י ו ו י ס ו ת ובקרה של ס י נ ת י ז ה ‪.‬‬
‫‪1.2.1‬‬
‫ק ר ו ם התא של מיקופלסמה‬
‫א‪.‬‬
‫ב י ד ו ד הממברנה הפלםמטית והרכבה‬
‫העדר ד ו פ ן פ פ ט י ד ו ג ל י ק ן ‪ ,‬ו כ ן ההעדר של ממברנות‬
‫צ י ט ו פ ל ס מ ט י ו ת ת ו ך ‪ -‬ת א י ו ת ‪ ,‬גרמו לכך שחוקרים רבים ר ו א י ם‬
‫במיקופלםמה מערכת נאותה לחקר ההיבטים השונים של מבנה‬
‫ו ת י פ ק ו ד הממברנה הפלסמטית של התא‪ .‬ל י ז י ס א ו ם מ ו ט י ‪ ,‬השיטה‬
‫העדינה ב י ו ת ר ל ב י ד ו ד מ מ ב ר נ ו ת ‪ ,‬מתאימה להפרדת ממברנות של‬
‫אכולפלםמה הרגישים ב מ י ו ח ד לשוק אוםמוטי )‪ .(20‬שיטות‬
‫אחרות כמו ם ו נ י ק צ י ה ‪ ,‬הפשרה והקפאה ל ס י ר ו ג י ן ‪ ,‬דרושות‬
‫ל ב י ד ו ד ממברנות ממיקופלםמה‪ ,‬דורשי הםטרול‪ ,‬העמידים בתחום‬
‫רחב למדי של עצמה י ו נ י ת ‪ .‬המגרעת של השיטות האלו בכך שהן‬
‫‪13‬‬
‫ג ו ר מ ו ת לשבירת הממברנות ל ח ל ק י ק י ם ק ט נ י ם שאינם נ י ת נ י ם להשקעה‬
‫ב ‪xg-C21)4 0 , 0 0 0‬‬
‫)‪.(22‬‬
‫ואף א י נ ן ג ו ר מ ו ת לשבירה מלאה של כל התאים‬
‫ה י צ י ב ו ת האוסמוטית הרבה של מיקופלסמה במשך ר ו ב שלבי‬
‫התרבותם א י נ ה ברורה‪ .‬הסבר אפשרי מתבסס על היחס הגבוה של שטח‬
‫פ נ י ם לנפח המאפשר שיחדור מהיר של מומסים ת ו ך ‪ -‬ת א י י ם בזמן‬
‫העברה ל מ ד י ו ם ה י פ ו ט ו נ י ‪ ,‬והקטנה מהירה של הלחץ האוסמוטי ה פ נ י מ י ‪.‬‬
‫בהקשר ז ה ‪ ,‬ידועה העובדה שמיקופלסמה ה י נ ם ‪ leaky‬בתמיסות שאינן‬
‫תזונתיות‪.‬‬
‫מ ע נ י ן ל צ י י ן שממברנת מיקופלםמה יציבה בהרבה‬
‫ל ם ו נ י ק צ י ה מהממברנה של פ ר ו ט ו פ ל ם ט י ם בקטריאלים‪.‬האם יש קשר‬
‫ל י צ י ב ו ת ז ו עם התכולה הגבוהה של כ ו ל ס ט ר ו ל בממברנה )‪ (23‬לא‬
‫הובהר ע ד י י ן ‪ .‬היחס של חלבון ל ל י פ י ד בממברנה הוא ‪60:40‬‬
‫באכולפלםמה ובמיקופלםמה )‪ .(23‬יחם זה ע ל ו ל להשתנות בממברנות‬
‫מ ב ו ד ד ו ת עקב נ ו כ ח ו ת פ פ ט י ד ז ו ת ו פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ‪ ,‬ויש על כן לשמור‬
‫את הפרפרטים הממברנליים בטמפרטורה נ מ ו כ ה ‪ .‬הכמות הקטנה של‬
‫פחמימות בממברנה זוהתה כ ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם ‪ .‬א י ן עדות ל נ ו כ ח ו ת‬
‫ג ל י ק ו פ ר ו ט א י נ י ם שהם מ ר כ י ב י ם ע י ק ר י י ם בממברנה הפלסמטית של‬
‫‪ A. laidlawii‬מ כ י ל ו ת ג ל ו ק ו ז א מ י ן‬
‫אאוקריוטים‪.‬‬
‫ממברנות של‬
‫וקלקטוזאמין‬
‫ה נ י ת נ י ם ל מ י צ ו י באצטון מימי ו א י נ ם קשורים‬
‫ל ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם כמוכח מהנדידה השונה ב א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ‪ .‬כנראה‬
‫שחומרים אלה מ ו פ י ע י ם בצורה טבעית כ פ ו ל י מ ר הקשור או םפוח בצורה‬
‫רופפת ל ק ר ו ם התא )‪.(24‬‬
‫ב‪.‬‬
‫פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות בממברנה‬
‫ז ו ה ו כתריסר פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות בממברנר‪ ,‬של‬
‫מיקופלםמה )‪ ,(25‬אך הידע על מ י ק ו ם פ ע י ל ו י ו ת אלה מצומצם ב י ו ת ר ‪.‬‬
‫נמצא כ י ‪ ATPase‬קשור בממברנה‪ ,‬כנראה בצידה ה פ נ י ם ‪ -‬ת א י ‪ .‬פ ע י ל ו ת‬
‫‪ NADH Oxidase‬קשורה בממברנה נמצאה ב ‪-‬‬
‫‪ ,A. laidlawii‬מאידך‬
‫‪14‬‬
‫הפעילות‬
‫מםיסה‬
‫ג‪.‬‬
‫ה א נ ז י מ ט י ת ט ל א ו ק ם י ד ז ה ז ו ב מ י ק ו פ ל ם מ ה נמצאה ב צ ו ר ה‬
‫בציטופלסמה‬
‫המסה‬
‫)‪.(26‬‬
‫ו ב י ד ו ד טל ח ל ב ו נ י ה מ מ ב ר נ ה‬
‫ר ו ב השיטות ה ק י י מ ו ת להפרדה‬
‫מותאמות‬
‫ו ל פ ר ק צ י ו נ צ י ה של ח ל ב ו נ י ם‬
‫ל ח ל ב ו נ י ם ה י ד ר ו פ י ל י י ם ב ת מ י ס ה וקשה ב י ו ת ר ל ר ת א י מ ן‬
‫לחלבונים‬
‫ממברנלי‬
‫חלקיקיים הידרופוביים‪.‬‬
‫ה נ ס י ו נ ו ת ל פ ר ק צ י ו נ צ י ה של ח ו מ ר‬
‫מ מ י ק ו פ ל ס מ ה ‪ ,‬שהומס על י ד י ד ט ר ג נ ט י ם ‪ ,‬על ע מ ו ד ו ת ס פ ד ק ם‬
‫או ס פ ר ו ז בהעדר ד ט ר ג נ ט י ם נכשלו ה י ו ת‬
‫בעת האלוציר‪.‬‬
‫להפריד‬
‫)‪.(27‬‬
‫ב נ ו כ ח ו ת ד ט ר ג נ ט ב ב ו פ ר ההפרדה נ י ת ו ה י ה‬
‫ח ל ב ו נ י ם מ ל י פ י ד י ם ו א ף ל ק ב ל מ י ד ה מ ם ו י י מ ת של פ ע י ל ו ת‬
‫‪ NADH Oxidase‬אשר ה ו פ י ע ה ב ‪-‬‬
‫כלומר‬
‫ו ה ח ל ב ו נ י ם עברו אגרגציה‬
‫‪ void volume‬של ‪,Sephadex G-200‬‬
‫ב צ ו ר ת ח ל ב ו ו ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י כ נ ר א ה במצב א ג ר ג ט י ב י ‪.‬‬
‫הואיל‬
‫ואיבוד‬
‫ו ה פ ר ד ת ם של א נ ז י מ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם מ מ י ק ו פ ל ס מ ה ‪ ,‬ל ל א ד נ ט ו ר צ י ה‬
‫פ ע י ל ו ת ‪ ,‬כה קשה‪ ,‬ל א א ו פ י י נ ו ה פ ע י ל ו י ו ת ה ש ו נ ו ת ‪ .‬ה ־ ‪ ATPase‬טל‬
‫‪ laidlawii‬״‪ A‬ר ג י ש ב י ו ת ר ל ד ט ר ג נ ט י ם ‪,‬‬
‫ואיו הוא נ י ת ו‬
‫על י ד י ה ק ט נ ת ה ע ו צ מ ה ה י ו נ י ת ב נ ו כ ח ו ת ‪EDTA‬‬
‫לבידוד‬
‫או ם ו נ י ק צ י ה קצרה‪,‬‬
‫ת נ א י ם אשר ה ו פ ע ל ו בהצלחה ב ש ח ר ו ר א נ ז י מ י ם ד ו מ י ם מ ח י י ד ק י ם ‪ .‬ל מ ר ו ת‬
‫היותו‬
‫כנראה א נ ז י ם א י נ ט ג ר ל י במבנה הממברנה ה ו א דומה ל א נ ז י מ י ם‬
‫ה ב ק ט ר י א ל י ם ב ז ה ש א י נ ו דורש ל פ ע י ל ו ת ו‬
‫יוני‬
‫בתרו‬
‫ואשלגו‬
‫ואינו‬
‫מ ע ו כ ב על י ד י‪ . ( O u a b a i n(28‬ל א ב ר ו ר האם ה ־ ‪ATPase‬‬
‫ו ‪phosphatase -‬‬
‫‪ nitrophenyl‬־‪ p‬מ ב ט א י ם פ ע י ל ו ת של ח ל ב ו ו א ח ד א ו‬
‫ה י נ ם שני א נ ז י מ י ם ש ו נ י ם ‪.‬‬
‫אורגניים‬
‫ו ל פ ר ו נ ז מ ע י ד ה שכנראה א י ו ז ה א נ ז י ם א ח ד ‪.‬‬
‫‪ NADH Oxidase‬ע מ י ד ה ל מ ד י‬
‫משוחזרות‬
‫בנוכחות‬
‫הרגישות השונה ל ד ט ר ג נ ט י ם ‪ ,‬לממיםים‬
‫פעילות‬
‫ב נ ו כ ח ו ת דטרגנטים וזוהתה גם בממברנות‬
‫)‪ .(29‬כ פ י ש צ ו י י ו‬
‫לעיל‪,‬‬
‫ניתו‬
‫להפריד את ה א ו ק ם י ד ז‬
‫ד ט ר ג נ ט מ ל י פ י ד י ם מ מ ב ר נ ל י ם שכנראה א י נ ם ד ר ו ש י ם ל ב י ט ו י‬
‫‪15‬‬
‫תקין טל ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת נ‪.(30‬‬
‫א נ ל י ז ת החומצות ה א מ י נ י ו ת טל ממברנות‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫אינה‬
‫מראה תכולה גבוהה ב מ י ו ח ד טל חומצות א מ י נ ו ה י ד ר ו פ ו ב י ו ת )‪.(24‬‬
‫ממצא זה נ ו ג ד את הדיעה ש ה ה י ד ר ו פ ו ב י ו ת טל ח ל ב ו נ י הממברנה ת ל ו י ה‬
‫בהעטרתם בחומצות א מ י נ י ו ת ה י ד ר ו פ ו ב י ו ת ‪ .‬בדומה לממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת‬
‫אחרות‪ ,‬תכולת הציסטאין והציםטין בממברנת‬
‫‪ A. laidlawii‬נמוכה‬
‫ב י ו ת ר )‪ .(31 ,32‬העדר קשרים ד י ‪ -‬ם ו ל פ י ד י י ם א ו פ י י נ י ל ח ל ב ו נ י ם‬
‫הקטורים עם ל י פ י ד י ם בממברנות ו ג ם בקומפלכםים ל י פ ו פ ר ו ט א י נ י ם‬
‫בתמיסה‪ .‬הטרשרות ה פ ו ל י פ פ ט י ד י ו ת טאין בהן גשרי ב י נ י י ם ח ו פ ט י ו ת‬
‫לתנועה‪,‬‬
‫ומשום כך מ ס ו ג ל ו ת השרשרות הפחמתיות של ט ו מ נ י הממברנה‬
‫להשתלב ב א ז ו ר י ם ה ה י ד ר ו פ ו ב י י ם של החלבון )‪ .(33‬ק ב ו צ ו ת ה ‪SH -‬‬
‫מ צ ו י ו ת כנראה באתרים החשובים ל פ ע י ל ו ת ה ב י ו ל ו ג י ת של הממברנה ואכן‬
‫נמצאה רגישות גבוהה של‪ ( A T P a s e(28‬ושל מערכות טרנספורט )‪(34‬‬
‫ל ר י א ג נ ט י ‪ SH‬״‬
‫מיגוון‬
‫ה ח ל ב ו נ י ם הממברנלים הנראה ב א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ב ג ל של‬
‫פוליאקרילאמיד‪,‬‬
‫המכיל דטרגנט ‪ ,SDS‬מ ג י ע ל ‪ 15-30 -‬פסים הנצבעים‬
‫בצביעה ספציפית )מספר הפסים ת ל ו י בשיטת ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ( ‪ .‬משקלם‬
‫ה מ ו ל ק ו ל ר י של ה ח ל ב ו נ י ם הוא בתחום ‪ . 9,000-70,000‬ת מ ו נ ת‬
‫ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה בתנאים מ ו ג ד ר י ם ספציפית למין של המיקופלסמה‪,‬‬
‫יתכן א י פ ו א להשתמש בה ב ז י ה ו י ו מ י ו ן מיקופלסמה )‪.(35‬‬
‫ד‪.‬‬
‫שומני הממברנה‬
‫בסקירה ז ו נעמוד אך בקצרה על הרכב השומנים ותפקידם במבנה‬
‫ממברנת המיקופלםמה‪ .‬י ד ו ע כ י כל השומנים של מיקופלםמה ממוקמים‬
‫בממברנה והרכבם ב ר ו ב ו שומנים פ ו ל ר י י ם‬
‫)פוםפו‪-‬וגליקוליפידים(‪,‬‬
‫ו מ י ע ו ט ו כ ו ל ס ט ר ו ל ו ק ר ו ט נ ו א י ד י ם )‪ .(25‬כל המיקופלסמה שנבדקו‬
‫‪16‬‬
‫דורשים חומצות ש ו מ נ י ו ת א ר ו כ ו ת שרשרת ל ג י ד ו ל ם ‪ ,‬וחלקם אף דורש‬
‫גליצרול‪.‬‬
‫תלות ז ו של ה ג י ד ו ל ב פ ר ק ו ר ס ו ר י ם של שומנים מאפשרת‪,‬‬
‫ב ג ב ו ל ו ת מ ס ו י י מ י ם ‪ ,‬ל ו ו ס ת באופן מלאכותי כמות של מרכיב מ ם ו י י ם‬
‫ו ל ב ד ו ק השפעת ה ש י נ ו י שנגרם על ת כ ו נ ו ת הממברנה‪ .‬כך למשל הראו‬
‫)‪ (36‬כ י עליה בתכולת חומצה א ו ל א י ת מ ל ו ו ה בעליה נ י כ ר ת במספר‬
‫התאים ו י צ י ב ו ת ם האוסמוטית ו כ ן בנטיתם לצמוח בצורת פ י ל מ נ ט י ם ‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬מתן חומצה סטארית עיכב את ה ג י ד ו ל ‪ ,‬התאים ה י ו נ פ ו ח י ם‬
‫ורגישים לשבירה‪ .‬השפעות אלו מ י ו ח ס ו ת ל ש י נ ו י י ם בארגון הממברנה‪,‬‬
‫דהיינו‬
‫ס י ד ו ר ט ו נ ה טל השרשרות הפחמתיות ב ‪-‬‬
‫המתבטאים ב ט י נ ו י י ם ב ח ד י ר ו ת ו ב פ ל ם ט י ו ת ‪ .‬ל ‪-‬‬
‫‪ bilayer‬ה ל י פ י ד י ‪,‬‬
‫‪ A. laidlawii‬יש‬
‫כנראה מ נ ג נ ו ן ל ו ו י ס ו ת ה נ ו ז ל י ו ת טל ה א ז ו ר י ם ה ל י פ י ד י י ם בממברנה‬
‫בתנאים פ י ס י ו ל ו ג י י ם משתנים‪ .‬הורדה נ י כ ר ת טל טמפרטורת ה ג י ד ו ל‬
‫התבטאה בעליה נ י כ ר ת של א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ת חומצה א ו ל א י ת והקטנה של‬
‫ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של כ ו ל ס ט ר ו ל ‪ .‬ה ש י נ ו י י ם ב נ ו ז ל י ו ת א ו ב ח נ ו בעזרת‬
‫חומצות ש ו מ נ י ו ת‬
‫‪ , spin-labeled‬ונראה כי בטמפרטורה נמוכה חופש‬
‫התנועה של החומצה השומנית המסומנת ג ב ו ה י ו ת ר מאשר בטמפרטורת‬
‫ה ג י ד ו ל האופטימלית‬
‫)‬
‫(‬
‫) ‪ . ( C 3 7 ° 3 7‬הדרישה ל כ ו ל ס ט ר ו ל היתה אחד‬
‫ה ק ר י ט ר י ו נ י ם המובהקים ל ס י ו ו ג המיקופלסמה בנפרד מ ה ח י י ד ק י ם‬
‫)‪.(38‬‬
‫תאי המיקופלסמה מ פ י ק י ם כ ו ל ס ט ר ו ל מהמדיום בצורתו החופשית )‪(39‬‬
‫בדומה לתאים א נ י מ ל י ם בתרבית‪ .‬תפקיד הכולסטרול בממברנה נחקר רבות‬
‫אך לא י ד ו ע ב ב י ר ו ר ‪ .‬יש ה ס ב ו ר י ם שתפקידו ם ט ר ו ק ט ו ר ל י ‪ ,‬ד ה י י נ ו‬
‫בארגון של ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם במבנה הדו‪-‬טכבתי כך שציר האורך של‬
‫השרשרות הפחמתיות נ י צ ב למישור הלמלרי‪ .‬יתכן ו כ ו ל ס ט ר ו ל דרוש‬
‫ל ג י ד ו ל המיקופלםמה משום תלותם המוחלטת באספקת חומצות ש ו מ נ י ו ת‬
‫וה‪-‬‬
‫‪ turn-over‬ה נ מ ו ך של ל י פ י ד י ם פ ו ל ר י י ם שאינו מאפשר ר ג ו ל צ י ה‬
‫של נ ו ז ל י ו ת ה א ז ו ר י ם ה ל י פ י ד י ם ‪ .‬א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה בממברנה של כ ו ל ס ט ר ו ל‬
‫‪17‬‬
‫שהופק מהמדיום מאפשרת ק י ו ם ר ג ו ל צ י ה כזאת‪ .‬תאי ה‪-‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫ה מ ס ו ג ל י ם לסנתז חומצות ש ו מ נ י ו ת ר ו ו י ו ת א ר ו כ ו ת שרשרת א י נ ם דורשים‬
‫כ ו ל ס ט ר ו ל ל ג י ד ו ל ם ‪ .‬יתר על כ ן ‪ ,‬הם מ ס נ ת ז י ם ק ר ו ט נ ו א י ד י ם שבהיותם‬
‫מ ו ל ק ו ל ו ת פחמתיות פ ל נ ר י ו ת י כ ו ל י ם להחליף כ ו ל ס ט ר ו ל בתפקיד של‬
‫י י צ ו ב מבנה ה‪.bilayer -‬‬
‫ה‪.‬‬
‫א ר ג ו ן ה ח ל ב ו נ י ם והשומנים בממברנה‬
‫שומני מהווה את המבנה ה י ס ו ד י של ממברנת מיקופלםמה‪.‬‬
‫‪bilayer‬‬
‫מסקנה ז ו נ ג ז ר ת מ ה נ ת ו נ י ם ה כ ר ו כ י ם במדידות‬
‫‪x-ray diffraction,‬‬
‫‪ Differential scanning calorimetry, capacitance‬ו ‪ESR -‬‬
‫של‬
‫חומצות ש ו מ נ י ו ת מ ס ו מ נ ו ת ‪ .‬בשיטות ה פ י ם י ק ל י ו ת הראו כי ה ל י פ י ד י ם‬
‫בממברנה מתנהגים בדיעבד כמו ל י פ י ד י ם במים‪ ,‬כלומר מ א ו ר ג נ י ם בצורת‬
‫דו‪-‬שכבה בה השרשרות הפחמתיות משולבות ז ו ב ז ו ולא ב ח ל ב ו נ י ם ‪ .‬י ח ד‬
‫עם זאת יש ל צ י י ן שהמדידות ה פ י ם י ק ל י ו ת דלעיל א י נ ן מ ו צ י א ו ת מכלל‬
‫אפשרות נ ו כ ח ו ת א ז ו ר י ם בהם ק י י מ ת אינטראקציה ספציפית ב י ן ל י פ י ד י ם‬
‫ל ח ל ב ו נ י ם ‪ .‬אי לכך לא נ י ת ן מהשיטות ה פ י ס י ק ל י ו ת בלבד ל ק ב ו ע בברור‬
‫א י ז ה חלק מ ה ל י פ י ד י ם מאורגן בצורת מבנה דו‪-‬שכבתי ומה מידת‬
‫האינטראקציה של ל י פ י ד י הממברנה עם ה ח ל ב ו נ י ם ‪.‬‬
‫הידע על א ר ג ו ן ה ח ל ב ו נ י ם בממברנה מצומצם‪ .‬ט י פ ו ל בממברנת‬
‫‪ laidlawii‬־‪A‬‬
‫המבנה ה‪-‬‬
‫באצטון מימי המאפשר מ י צ ו י ‪ 95%‬מ ה ל י פ י ד י ם ‪ ,‬שומר על‬
‫‪trilaminar‬‬
‫ה א ו פ י י נ י הנראה ב מ י ק ר ו ס ק ו פ ה א ל ק ט ר ו נ י ‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬על י ד י הפעלת‬
‫פ ר ו נ ז ו ע י כ ו ל כ ‪ 80% -‬מ ה ח ל ב ו נ י ם‬
‫הממברנליים י ו ר ד במידה נ י כ ר ת ע ו ב י הממברנה ונעלם המבנה‬
‫ה‪ . ( t r i l a m i n a r(24-‬ה ח ל ב ו נ י ם שאינם מ ע ו כ ל י ם על י ד י פ ר ו נ ז‬
‫משולבים לפי הנראה בתוך מבנה ה‪ bilayer -‬בצורה המונעת חשיפתם גם‬
‫‪125‬‬
‫ל ס י מ ו ן עם ‪I (40‬‬
‫(‬
‫‪ ,‬אך הרכבם מבחינת החומצות ה א מ י נ י ו ת א י נ ו‬
‫שונה משל שאר ח ל ב ו נ י הממברנה‪ .‬חלק נ י כ ר מ ה ח ל ב ו נ י ם מ א ו ר ג נ י ם‬
‫‪18‬‬
‫כנראה‬
‫על שטח‬
‫לאינטראקציה‬
‫ו‪.‬‬
‫מ י ק ו פ ל ס מ ה נמצאה מערכת ט ר נ ס פ ו ר ט ל ס ו ב ר י ם מ ס ו ג‬
‫‪phosphotransferase‬‬
‫‪ p h o s p h o - e n o l p y r u v a t e‬בדומה‬
‫למרות היותם פרמנטטיביים‬
‫חסרים מערכת ט ר נ ס פ ו ר ט י ע י ל ה‬
‫של‬
‫במנגנון‬
‫חומצות‬
‫הראו‬
‫על‬
‫ידי‬
‫ריאגנטי‬
‫תכונות‬
‫צבירת‬
‫‪SH‬‬
‫האשלגן‬
‫לאורגניזמים‬
‫ז‪.‬‬
‫‪M. f e r m e n t a n s‬‬
‫התהליך‬
‫בפעילות‬
‫ומעוכב‬
‫דורט אנרגיה‬
‫י ו נ י אשלגן‬
‫‪laidlawii‬‬
‫‪A.‬‬
‫‪ATPase‬בדומה‬
‫שלהם‪.‬‬
‫ויכולת‬
‫ביוסינתטית‬
‫לליפידים‬
‫ח ו מ צ ו ת ש ו מ נ י ו ת א ר ו כ ו ת שרשרת‪,‬‬
‫ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל בהרכב מ א ו ז ן ‪,‬‬
‫את ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ‪,‬‬
‫האנזים‬
‫בחיידקים‪.‬‬
‫החומצות‬
‫פרוקריוטים‪.‬‬
‫מוגבלת‪.‬‬
‫ב‪-‬‬
‫‪laidlawii‬‬
‫בצורתן‬
‫מ י ק ופלסמה‬
‫ע ו ב ד ה ה מ צ ב י ע ה על‬
‫‪A.‬‬
‫נמצאה‬
‫גלוטמט‪-‬דהידרוגנז‬
‫שהינו‬
‫החופשית‪,‬‬
‫ובלווית‬
‫דורשים עבור‬
‫יכולת‬
‫)‪.(44‬‬
‫א נ ז י ם מפתח ב י ן‬
‫ו מ ט ב ו ל י ז ם של פ ח מ י מ ו ת מ ע י ד ה ש י ש כ נ ר א ה‬
‫מוצא‬
‫י כ ו ל ת ל ם י נ ת י ז ה של‬
‫ה א ר ו מ ט י ו ת באמצעות מעבר החומצה ה ש י ק י מ י ת‬
‫)‪(45‬‬
‫וחומרי‬
‫י ח ד עם כ ו ל ס ט ר ו ל‬
‫מ נ ט ר ל על מ נ ת ל מ נ ו ע ל י ז י ם של ה ת א י ם ‪.‬‬
‫החומצות‬
‫ו‪-‬‬
‫‪,‬‬
‫הדרישה‬
‫ביוםינתטית‬
‫‪M. h o m i n i s‬‬
‫ו ב ק ב ו צ ו ת ‪ SH‬ח ו פ ש י ו ת נ מ צ א ה ב ‪-‬‬
‫ה ע י ק ר י ת של מ י ק ו פ ל ס מ ה ה י נ ה‬
‫גידולם‬
‫לגידולם‬
‫)‪,(43‬‬
‫ח ו ד ר י ם כ נ ר א ה לתא‬
‫) ‪ a‬מ ע ר כ ת פ ע י ל ה בהחדרת‬
‫אינה תלויה‬
‫לחיידקים‬
‫)‪.(42‬‬
‫מ ע ר כ ו ת ה ט ר נ ס פ ו ר ט ה פ ע י ל ו ת בהחדרת‬
‫דרישות‬
‫יש לספק‬
‫חנקן‬
‫ואלה‬
‫תזונתיות‬
‫לסינתיזה‬
‫חומר‬
‫לסוברים‪,‬‬
‫מצטברות במאגר התוך ת א י ‪,‬‬
‫באנרגיה‬
‫יוני‬
‫ב‪-‬‬
‫ודורשים סוכר‬
‫א ו פ י י נ י ו ת למערכות טרנספורט דומות‬
‫‪.(34‬‬
‫התלויה‬
‫)‪.(b34‬‬
‫ד י פ ו ז י ה מוחשת‪.‬‬
‫א מ י נ י ו ת שנמצאו‬
‫האמיניות‬
‫)‪.(41‬‬
‫טרנספורט‬
‫מיני‬
‫אכולפלםמה‪,‬‬
‫ב צ ו ר ה המאפשרת ג ם ח ט י פ ת‬
‫עם א נ ט י ם ר ו ם ס פ צ י פ י‬
‫מנגנוני‬
‫בכמה‬
‫פני‬
‫הממברנה‪,‬‬
‫הגליקוליפידים‬
‫מציאת‬
‫מ ט ב ו ל י ז ם של‬
‫ביכולת האורגניזם‬
‫‪19‬‬
‫דרישת ‪A. laidlawii‬‬
‫לםנתז חומצות א מ י נ י ו ת נ ו ס פ ו ת מחומצות ק ט ו ‪.‬‬
‫ל פ ר ק ו ר ס ו ר י ם של חומצות נ ו ק ל י א י ו ת )‪ (46‬מראה על העדר המעבר שביו‬
‫החומצה ה א ו ר ו ט י ת ל פ י ר י מ י ד י ן ‪ ,‬ו כ ן על העדר ה א נ ז י ם ת י מ י ד י ל ט ם י נ ת ט ז ‪.‬‬
‫לעומת זאת י כ ו ל י ם התאים לנצל א ו ר י ד י ן ולהפכו ל נ ג ז ר ת ה מ ו נ ו פ ו ם פ ט ‪.‬‬
‫ה ו ד ו ת ל פ ע י ל ו ת ה נ ו ק ל י א ו ל י ט י ת הקשורה לממברנר‪ (47) .‬י כ ו ל י ם‬
‫ו ‪ DNA -‬כמקור ל פ ר ק ו ר ם ו ר י ם‬
‫המיקופלסמה לנצל באופן ישיר ‪RNA‬‬
‫ל ם י נ ת י ז ה של חומצות ג ר ע י ן ‪.‬‬
‫ח‪.‬‬
‫מ נ ג נ ו ן מעבר ה א ל ק ט ר ו נ י ם‬
‫ב ר ו ב מ י נ י המיקופלםמה מסתיימת מערכת מעבר האלקטרונים ב פ ל ב י ן ‪,‬‬
‫לא נמצאו צ י ט ו כ ר ו מ י ם וקטלז‬
‫)‪ .(25‬הצטברות‬
‫^‪ H^Q‬נמצאה כמעט בכל‬
‫התרביות של מיקופלסמה‪ .‬נ ו כ ח ו ת פ ל ב י ן בממברנות‬
‫הוכחה באןפן ספקטרוסקןפי‬
‫האלקטרונים ב ‪-‬‬
‫)‪ .(24‬נ י ת ן לתאר באופן סכימטי את מעבר‬
‫‪:A. laidlawii‬‬
‫•<‬
‫‪^0‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫‪y Flavoprotein‬‬
‫פ ע י ל ו ת ‪NADH Oxidase‬‬
‫‪ NAD‬־<‬
‫‪AH‬‬
‫‪2‬‬
‫נמצאה קשורה לפרקציה הממברנלית של‬
‫‪ laidlawii‬״‪ , A‬אך לעומת זאת פ ע י ל ו ת דומה נמצאה בציטופלסמה של‬
‫מיקופלסמה אחרים )‪ .(26‬עובדה ז ו מראה שתהליכי מעבר האלקטרונים‬
‫א י נ ם בהכרח קשורים למבנה הממברנה‪ .‬פ ר י צ י א נ י ד ‪ ,‬ד י כ ל ו ר ו פ נ ו ל ‪-‬‬
‫אינדופנול‬
‫ו מ נ ד י א ו ן י כ ו ל י ם להחליף חמצן כאקםפטורים ל א ל ק ט ר ו נ י ם ‪.‬‬
‫פ ע י ל ו ת א נ ז י ם זה י ו ר ד ת עם הריסת התא עקב חשיפת ק ב ו צ ו ת ‪ SH‬ל ח י מ צ ו ן ‪,‬‬
‫ו נ י ת ן להשיבה במידה מ ם ו י י מ ת על י ד י ח י ז ו ר עם מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ‪ .‬מ י צ ו י‬
‫ממברנת‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫א ו ק ס י ד ז שעובר‬
‫הראו ‪Jinks‬‬
‫עם ‪SDS‬‬
‫ו‪-‬‬
‫‪ exclusion‬ב‪G(200-27-‬‬
‫‪ Sodium deoxycholate‬משחרר‬
‫‪ . ( S e p h a d e x‬לאחרונה‬
‫ו ‪ ( M a t z(48-‬כי על י ד י מ י צ ו י א ת נ ו ל י )‪ (9%‬נ י ת ן‬
‫להפריד מהממברנה‬
‫‪ , NADH dehydrogenase‬בעל פ ע י ל ו ת ספציפית גבוהה‬
‫‪20‬‬
‫פי ‪ 3-5‬מ ז ו של ה א נ ז י ם הממברנלי‪ .‬א נ ז י ם ז ה א י ג ד את הכושר להשתמש‬
‫בחמצן כבאקםפטור ולכן ה ו ג ד ר כ ד ה י ד ר ו ג נ ז ‪ .‬ה מ י צ ו י הכיל פ ל ב י נ י ם‬
‫מםוג ‪FAD‬‬
‫ו ‪ FMN -‬ו כ ן ‪ 30-40%‬ל י פ י ד י ם ‪ .‬התכולה הגבוהה של ל י פ י ד י ם‬
‫גרמה לאי שקיעת ה א נ ז י ם החלקיקי ב ‪-‬‬
‫‪100,000‬‬
‫‪g‬‬
‫‪x‬‬
‫‪ .‬מהתכונות הקיגטיות‬
‫נראה כ א י ל ו יש שני אתרים לפחות ל ח י ז ו ר פ ר י צ י א נ י ד וחמצן‪ ,‬בעלי‬
‫רגישות שונה ל ‪ . NADH -‬ה י ו ת ו ‪ A. laidlawii -‬הם אנאארובים‬
‫פ ק ו ל ט ט י ב י י ם ‪ ,‬יש י ת ר ו ן ל מ נ ג נ ו ן נשימה מ ס ו ג זה המאפשר‪ ,‬בהתאם‬
‫לתנאים‪,‬‬
‫נ י צ ו ל נ מ ו ך י ו ת ר של חמצן ומאידך ח י ז ו ר י ע י ל על רמה‬
‫םובסטרט‪ .‬חוסר הרגישות ל א ו ל י ג ו מ י צ י ן מצביע על כך שמערכת הנשימה‬
‫א י נ ה צמודה‪ ,‬או צמודה באופן ר ו פ ף ‪ ,‬למערכת יצירת ה א נ ר ג י ה ‪.‬‬
‫‪21‬‬
‫‪.2‬‬
‫מטרות העבודה‬
‫ה מ ט ר ו ת ש ה צ ב נ ו ל ע צ מ נ ו ב ע ב ו ד ה ז ו ‪ ,‬מ ת ו ך מחשבה ל ה ב ה י ר א ת ה ת כ ו נ ו ת‬
‫ה מ י ו ח ד ו ת של ח ל ב ו נ י ם ב ע ל י פ ע י ל ו ת ב י ו ל ו ג י ת ס פ צ י פ י ת ה מ ה ו ו י ם חלק‬
‫א י נ ט ג ר ט י ב י של מ ב נ ה ק ר ו ם התא‪ ,‬ה ו ‪:‬‬
‫א‪.‬‬
‫איפיוו‬
‫מיקופלסמה‬
‫כיצד‬
‫פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת ה ק ש ו ר ו ת ל מ מ ב ר נ ה ה פ ל ס מ ט י ת של‬
‫ו ב ד י ק ת השפעת ה ס ב י ב ה ה מ ק ו מ י ת על ה פ ע י ל ו ת ה ק ט ל י ט י ת ‪.‬‬
‫ש י נ ו י י ם ב מ ב נ ה ה מ מ ב ר נ ה כ מ ו חשיפה ל ס ב י ב ה‬
‫יונית‬
‫דהיינו‪,‬‬
‫ש ו נ ה ‪ ,‬הוצאה‬
‫ס ל ק ט י ב י ת של ח ל ב ו נ י ם א ו ל י פ י ד י ם ‪ ,‬מ ת ב ט א י ם ב פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ‪.‬‬
‫ב‪.‬‬
‫ק ב י ע ת מ י ק ו ם ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ב י ח ס לשטח פ נ י ה מ מ ב ר נ ה על י ד י‬
‫ב ד י ק ה של ה פ ע י ל ו ת ל ג ב י ם ו ב ם ט ר ט י ם ש א י נ ם ח ו ד ר י ם לתא ו ע ל י ד י ר י א ג נ ט י ם‬
‫ספציפיים‪.‬‬
‫‪22‬‬
‫חלק‬
‫נםיוני‬
‫‪3.1‬‬
‫מיקופלסמה ‪ -‬תנאי ג י ד ו ל ו ה כ נ ת התאים ל נ י ס ו י‬
‫‪ Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma fermentans‬נתקבלו ממעבדת‬
‫פ ר ו פ ׳ שמואל ר ז י ו ‪ ,‬המח׳‬
‫ירושלים‪.‬‬
‫ל מ י ק ר ו ב י ו ל ו ג י ה ק ל י נ י ת ‪ ,‬ה א ו נ י ב ר ס י ט ה העברית‪,‬‬
‫ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז מ י ם ג ו ד ל ו במצע‪ ( E d w a r d(49‬שהכיל )‪(v/v‬‬
‫םרום‬
‫( ו כ ו פ נ י צ י ל י ו‪G(300‬‬
‫‪0‬‬
‫‪.‬‬
‫י ח י ד ו ת ל מ י י ל ( ‪pH,‬ב־‪8‬‬
‫‪9‬‬
‫התאים נאספו לקראת ס ו ף הפאזה ה ל ו ג ר י ת מ י ת ‪ ,‬כ ש ר י כ ו ז ם ה ג י ע ל ‪ 2x10 -‬במייל‪,‬‬
‫אחר א י נ ק ו ב צ י ה של כ ‪-‬‬
‫‪6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪1‬‬
‫ב‪C37°‬‬
‫שעות‬
‫ללא ט י ל ט ו ל ‪ .‬א י ס ו ף התאים בוצע‬
‫משך ‪ 15‬דקות ב ‪ . C4° -‬התאים‬
‫על י ד י ס י ר כ ו ז ב ‪xg ,Sorvall14,000-‬‬
‫נשטפו ו ה ו ר ח פ ו בתמיסת מלח א י ז ו ט ו נ י ת )‪25 M NaCl‬־‪MMgCl0 01;0‬‬
‫בתמיסת ם ו כ ר ו ז‬
‫) ם ו כ ר ו ז ־‪MMgCl01;04M‬‬
‫‪2‬‬
‫ב ‪ 1 -‬מייל‪ .‬ספירת התאים נעשתה ב ‪-‬‬
‫(‬
‫‪2‬‬
‫( או‬
‫‪10‬‬
‫‪ 0‬־ ל ר י כ ו ז של כ ‪ x10 2 -‬ת א י ם‬
‫‪ , Camera‬ת ו ך שימוש ב מ י ק ר ו ס ק ו פ‬
‫נ י ג ו ד ה פ א ז ו ת ‪ .‬ח ל ב ו ן בתרחיף התאים נקבע בשיטת‪. ( L o w r y(50‬‬
‫‪3.2‬‬
‫קביעת ה פ ע י ל ו ת האמידטית של מיקופלסמה‬
‫פ ע י ל ו ת תאים שלמים בפרוק של ‪ 8‬־ נ פ ת י ל א מ י ד י ם )‪ (gNA‬של ח ו מ צ ו ת‬
‫אמיניות שונות‬
‫‪6‬־נפתילאמין‬
‫)‪ (Mann Research lab. N.Y.‬נקבעה בשיטה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת ‪.‬‬
‫המעוררב‪nm-335‬‬
‫מגלה פליטה חזקה ב ‪ . ( n m(41051-‬ל ע ו מ ת‬
‫זאת‪ - 6 ,‬נ פ ת י ל א מ י ד של חומצה א מ י נ י ת ‪ ,‬הםובםטרט במקרה ד נ ן ‪ ,‬ה מ ע ו ר ר‬
‫באורך‬
‫גל זה מגלה פליטה נמוכה ב י ו ת ר ‪ .‬ערכי הפליטה של ש ־ נ פ ת י ל א מ י ן מ ר א י ם ת ל ו ת‬
‫‪-7‬‬
‫‪5-‬‬
‫ל י נ א ר י ת ב ר י כ ו ז ו בתחום של ‪M‬‬
‫בםפקטרופלואורימטר‬
‫‪ ,Amino-Keiss‬תוצרת‬
‫ב מ נ ו ר ת ק ם נ ו ן ‪(w)150‬‬
‫‪,Paris) Graphispot‬‬
‫‪ 5x10‬עד ‪M‬‬
‫ו־‬
‫‪ 5x10‬״ המדידות בוצעו‬
‫‪ American Instruments‬מ צ ו י י ר‬
‫‪phototube21RCA IP‬המחובר לרשם זמן‬
‫‪ «(Sephram‬תערובת הריאקציה הסטנדרטית ) נ פ ח ס ו פ י‬
‫‪ 1‬מייל( הכילה ‪ 2.8 -‬מ י ק ר ו מ ו ל י ם ‪ - 6‬נ פ ת י ל א מ י ד של חומצה א מ י נ י ת מ ם ו י י מ ת ‪,‬‬
‫‪ 50‬מ י ק ר ו מ ו ל י ם ב ו פ ר ו ר ו נ ל ב ‪,8.pH,5 -‬ו‪ 0.5-‬מייל תרחיף מיקופלסמה בתמיסת‬
‫לכ‪-‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0.5x10 -‬‬
‫מ״ג ח ל ב ו ן או‬
‫‪10‬‬
‫‪10 lx0.3-0.6‬‬
‫תאים(‪.‬‬
‫‪23‬‬
‫תערובת הריאקציה הושמה בתא שהטמפרטורה בו מווסתת ל ‪-‬‬
‫‪25‬‬
‫‪C‬‬
‫על י ד י זרם‬
‫מ י ם מטרמוסטט ח י צ ו נ י ‪ .‬תאי ה ק ו ו ר ץ ה י ו מ ס ו ג ‪(Hellma, W. Germany) PS‬‬
‫עם דרך א ו ר של ‪ 10.20mm‬״‬
‫ה פ ע י ל ו ת האמידטית הספציפית מבוטאת ככמות )‪ (n moles‬טל ‪ - 3‬נ פ ת י ל א מ י ן‬
‫המשתחררת בדקה למ״ג אחד של ח ל ב ו ן התא‪ .‬קצב ה ה י ד ר ו ל י ז ה חושב מן המהירות‬
‫ההתחלתית‪.‬‬
‫‪ 3.3‬ם י נ ת י ז ה של םובסטרטים פ פ ט י ד י י ם‬
‫הפפטידים‬
‫‪2‬‬
‫‪L-Ala‬־‪L-Lys; L-Ala-L-Lys; L-Lys-L-Ala; L-His‬־‪;L-lys‬‬
‫)‪L-Phe-L-Ala; AcGly-L-Phe-L-Ala; L-Ala-(Gly‬־‪; Gly‬‬
‫‪L-Phe-L-Ala‬־ )‪L-(Ala‬‬
‫‪2‬‬
‫לביופיםיקה‪.‬‬
‫ה ו כ נ ו ‪ .‬על י ד י מר ישראל י ע ק ו ב ס ו ן ‪ ,‬המחלקה‬
‫הפפטידים של א ו ר נ י ט י ן‬
‫ן ל י ז י ן נתקבלו מדייר יהודה ל ו י ן ‪,‬‬
‫המחלקה ל ב י ו פ י ם י ק ה ‪ .‬כל ה פ פ ט י ד י ם ה י ו נ ק י י ם ל פ י בדיקה כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ת )‪.(52‬‬
‫א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של א ל נ י ן ה ו כ נ ו בשתי שיטות כדלקמן‪:‬‬
‫א‪.‬‬
‫א ו ל י ג ן פ פ ט י ד י ם של א ל נ י ן ב ק ו נ פ י ג ו ר צ י ה )‪ (L‬ה מ צ ו י י נ י ם ^ ) ‪( A l a‬‬
‫‪n‬‬
‫כאשר ‪ , n = 2;3;5;6‬ה ו כ נ ו על י ד י ק ו נ ד נ ם צ י ה של ב נ ז י ל א ו ק ם י ק ר ב ו נ י ל‬
‫‪ - ! .‬א ל נ י ן עם ק ־ נ י ט ר ו ב נ ז י ל א ס ט ר של החומצה ה א מ י נ י ת או הפפטיד המתאים‪,‬‬
‫ל פ י שכטר ו ב ר ג ר )‪ .(53‬א נ ה י ד ר י ד מעורב ה ו כ ן על י ד י הוספת א ק ו י ו ל נ ט‬
‫אחד של טריאתילאמין לתמיסת ‪ 10%‬של ב נ ז י ל א ו ק ס י ק ר ב ו נ י ל )‪-(1.‬אלנין‬
‫ב‪ D M F -‬ק ר ו ר ל‬
‫‪,‬‬
‫‪,-C8° -‬הוספת א ק ו י ו ל נ ט אחד של א י ז ו ב ו ט י ל כ ל ו ר ו פ ו ר מ ט‬
‫ו ק ר ו ר נ ו ס ף משך ‪ 20‬ד ק ו ת ‪ .‬תמיסת האסטר ה ו כ נ ה על י ד י נ י ט ר ו ל תמיסת‬
‫‪ ) 10%‬ב ‪ (DMF -‬טל ה‪ -‬ק ‪ -‬נ י ט ר ו ב נ ז י ל אסטר ה י ד ר ו ב ר ו מ י ד עם א ק ו י ו ל נ ט‬
‫אחד של ט ר י א ת י ל א מ י ן ‪ .‬כ מ ו י ו ת א ק ו י מ ו ל ר י ו ת של שתי התמיסות ע ו ר ב ב ו‬
‫והושארו משך ל י ל ה בטמפרטורת החדר‪ .‬ה ב נ ז י ל א ו ק ס י ק ר ב ו נ י ל פפטיד אסטר‬
‫המתקבל הושקע מתערובת הריאקציה על י ד י הוספת‬
‫נ פ ח י ם של‬
‫‪M0.0510‬‬
‫‪. .1HC‬המטקע נשטף במים עד נ י ט ר ל י ו ת ויובש ב ו א ק ו ם על חומצה ג פ ר י ת נ י ת‬
‫‪24‬‬
‫הפפטיד אסטר החפשי התקבל על ידי הורדת קבוצת הבנזילאוקסיקרבוניל‬
‫עם חומצה הידרוברומית בחומצת חומץ‪ .‬הפפטיד התופשי התקבל על ידי‬
‫חיזור של תמיסת פפטיד אםטר הידרוברומיד בחומצת חומץ עם פלדיום על‬
‫פוום‪ .‬הפפטיד החופשי השקע מהתמיסה המימית )אחרי ניטרול( עם אתנול‬
‫ואצטוו‪ .‬הפפטידים שהתקבלו היו מסיסים במים ונקיים לפי קריטריונים‬
‫של אלקטרופוריזה במתח גבוה ב‪4 -‬״‪ pHl‬או כרומטוגרפיה בשכבה דקה על‬
‫פלטות צלולוז )‪ (Riedel-DeHaen , AG.‬עם מערכת הממיטים ח‪-‬בוטנול‬
‫)‪ :(4‬חומצת חומץ )‪ :(1‬מים )‪ . v/v/v :(1‬אורך הפפטיד חושב מהיחס‬
‫שביו חנקו קבוצות האמינו שנקבע לפי‪ , ( V a n Slyke(54‬לחנקן כללי‬
‫שנקבע בשיטת מיקרו‪ . ( K j e l d a h l(55‬היחס שהתקבל באנליזות היה שווה‬
‫ליחס המצופה באופו תיאורטי‪.‬‬
‫ב‪ .‬אלניל אוליגופפטידים מורכבים משיירים בעלי קונפיגורציה )‪(L‬‬
‫ו‪ (D) -‬ברצף מסודר )‪ L(LD‬כאשר ‪ = 2;4;8‬ח‪ ,‬הוכנו על ידי צימוד‬
‫‪n‬‬
‫^הידרוקסיסוקצינאימיד אםטר של בנזילאוקסיקרבוניל ‪.‬ו־אלניו עם‬
‫ם־אלניו או עם פפטידים מסוג‬
‫‪a(D)] 1A‬־‪a(L)A1‬‬
‫‪n‬‬
‫[‪)56.‬ריאקציתהצימוד‬
‫(‬
‫נעשתה על ידי הוספת שני אקויולנטים של א‪-‬הידרוקסיםוקצינאימיד אסטר‬
‫של בנזילאוקםיקרבוניל ‪-!.‬אלניו בדיאוקםו‪ ,‬לתמיסה מימית שהכילה‬
‫אקויולנט אחד של הפפטיד ואקויולנט אחד של ביקרבונט‪ .‬הריאקציה נמשכה‬
‫כשעתיים בטמפרטורת החדר הפפטיד הושקע על ידי הוספת מים‪ ,‬החמצה‬
‫ו‬
‫ק‬
‫ר‬
‫ו‬
‫ר‬
‫‪2‬‬
‫‪ .‬הפפטידים גובשו‬
‫מ ח ד ש‬
‫חם‪ .‬אורך הפפטידים חושב באותה דרך כמצוייו בסעיף הקודם‪.‬‬
‫מאזילאצטט‬
‫ה פ פ ט י ד ל ם‬
‫עד לאורך של תשעה שיירי אלניו היו מסיסים במים בריכוז של ‪. 5CmM‬‬
‫‪ 3.4‬קביעת פעילות מיקופלסמה בהידרוליזה של פפטידים )‪(peptidase‬‬
‫הידרוליזה של די‪-‬ואוליגופפטידים אשר הוכנו כמתואר בפרק ‪ ,3.3‬בוצעה‬
‫בתמיסת מלחים איזוטונית שהרכבה כדלקמו‪ :‬בופר ורונל ‪;10mM MgClp ;50mM‬‬
‫‪25‬‬
‫‪, m M NaCl250‬‬
‫בכמות מתאימה ל כ ‪-‬‬
‫א י נ ק ו ב צ י ה מעיר‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪.‬‬
‫דקות‬
‫ב‪pH3 -‬״‪ , 8‬נפח ם ו פ י ‪ 0.5‬מ י י ל ת ע ר ו ב ת הריאקציה הכילה‪.‬‬
‫‬‫‪0‬‬
‫ב‬
‫מ״ג חלבון‬
‫‪3‬‬
‫פ פ ט י ד ‪ .‬לאחר‬
‫ו‪mM50‬‬
‫‪ C37° -‬ה ו פ ר ד ו התאים על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה‬
‫ו ת כ ו ל ת התסנין נבדקה בשתי שיטות‪:‬‬
‫א( ז י ה ו י א י כ ו ת י ‪ -‬כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה על משטח דק של ס י ל י ק ו ן‬
‫)‪W. Germany‬‬
‫טים‪:‬‬
‫ח ‪ -‬ב ו ט נ ו ל ‪ :‬ח ו מ צ ת חומץ‪:‬מים‬
‫אמיניות‬
‫‪ »(Riedel-DeHaen,‬ההפרדה נעשתה על י ד י מערכת‬
‫‪ . ( v / v / v ,‬חומצות‬
‫) ‪4 : 1 : 1‬‬
‫ו פ פ ט י ד י ם ח ו פ ש י י ם בקצה ה־ א ‪ -‬ט ר מ י נ ל י ז ו ה ו על י ד י ר י א ג נ ט‬
‫נינהידרין‬
‫)‪ , w/v ,0.5%‬ב ‪ 95% -‬אצטון המכיל ‪ 0.3%‬פ י ר י ד י ן ‪.(v/v‬‬
‫ב( קביעה כ מ ו ת י ת ‪ -‬הפרדת א ל נ י ן מ א ו ל י ג ו א ל נ י ן פ פ ט י ד י ם נעשתה‬
‫באמצעות‪ . ( A m i n o Acid Analyser(57‬השתמשנו בעמודה הסטנדרטית‬
‫ה‬
‫דה‬
‫י‬
‫ו‬
‫ם ציטרט ב ס ו ד י ו ם כ ל ו ר י ד‬
‫‪x‬‬
‫‪w‬‬
‫‪e‬‬
‫‪o‬‬
‫‪ :‬ם ו ד י ו ם ציטרט ‪M2‬־‪0‬‬
‫‪D‬‬
‫‪,‬‬
‫״‬
‫ל‪) 5 , 2 5 p H -‬‬
‫‪M102‬‬
‫יוליאנה ק ו נ ו ( ‪.‬‬
‫א נ ל י ז ו ת א ל ו נעשו ב ס י ו ע ה האדיב של ה ג ב '‬
‫‪ 3.5‬מדידת ח ד י ר ו ת מיקופלםמה ל ‪L-Alanine -‬‬
‫‪10‬‬
‫‪10‬‬
‫תרחיף מיקופלסמה‪)2x10 -31,‬מייל‬
‫‪M‬‬
‫ב(‪Veronal‬‬
‫ל תמיסת חומר‬
‫‪3‬‬
‫‪M‬‬
‫‪m‬‬
‫ר‬
‫‪( ,‬אינולין‬
‫)‬
‫‪3‬‬
‫‪0 xl‬‬
‫‪0‬‬
‫ד‬
‫‪ M‬־ ‪( 3 . 8‬‬
‫י‬
‫תאים( בתמיסת מלחים‬
‫‪5‬‬
‫ו‬
‫א‬
‫ק‬
‫א‬
‫ט‬
‫י‬
‫ו במצע ג י ד ו ל‬
‫ב‬
‫י‬
‫‪ x l 0‬א ו דקסטרן‬
‫‪1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪ :‬אלנין‬
‫‪3‬‬
‫) ‪M‬־‪-37°CxlO1.7‬ב‪(,‬‬
‫ד ו ג מ א ו ת של ‪ 0.2‬מייל נלקחו מתערובת הריאקציה ב ז מ נ י ם מ ם ו י י מ י ם לבדיקת‬
‫הרדיואקטיביות‪.‬‬
‫התאים ה ו פ ר ד ו מן התערובת בשיטת ההרחפה ה ד י פ ר נ צ י א ל י ת‬
‫)‪ (58‬כדלקמן‪ :‬הדוגמא שנפחה ‪ 0.2‬מייל הושמה במבנת פ ו ל י א ת י ל ן‬
‫מייל( שהכילה‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬
‫‪.‬‬
‫‪0‬‬
‫)‬
‫מייל שמן‬
‫‪xg , Eppendorf microfuge 10,000‬‬
‫)תכולה‬
‫צ פ י פ ו ת ‪ >,(l g/ml066‬צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה נעשתה‬
‫־‬
‫משך ‪ 2.5-3‬ד ק ו ת ‪ .‬ב ת נ א י ם אלה‬
‫עברו ‪ 80%‬מהתאים את שכבת השמן‪ .‬ח י ת ו ר המבחנה ק ר ו ב ככל האפשר למשקע‬
‫‪.‬‬
‫‪26‬‬
‫התאים‪ ,‬איפשר את הפרדתו מבלי לבוא במגע עם ה ת ם נ י ן ‪ .‬המשקע הורחף‬
‫ב י ס ו ד י ו ת ב ‪ 0.1 -‬מייל מ י ם ‪ .‬לדוגמא של ‪ 50‬מ י ק ר ו ל י ט ר מתרחיף זה ה ו ס פ ו‬
‫‪Bray‬‬
‫‪10‬‬
‫) ו ה ד ד י ו א ק ט י ב י ו ת נקבעה במכשיר‬
‫)‪59‬‬
‫‪ .Packard Tri-Carb Liquid Scintillation Spectrometer‬חדירת א ל נ י ך‬
‫לתאים באופן יחסי ל א י נ ו ל י ן או לדקםטרן נקבעה בתרחיף המכיל את שני‬
‫החומרים י ח ד ‪ ,‬אך מ ס ו מ נ י ם באופן שונה ‪ -‬האחד ב ‪( : -‬‬
‫‪14‬‬
‫‪3‬‬
‫והשני ב ‪. H -‬‬
‫ח ד י ר ו ת החומר הגבה מ ו ל ק ו ל ר י ל ‪ pellet -‬התאים משמשת למדידת נפח המים‬
‫הקביעה היחסית מאפשרת להבדיל ב י ן ח ד י ר ו ת חומר נמוך מ ו ל ק ו ל ר י‬
‫הבין‪-‬תאי‪.‬‬
‫לתוך התא לעומת המצאותו בנפח ה ב י ן ‪ -‬ת א י שב‪ .pellet -‬בתוצאות הספירות‬
‫של נ ם י ו נ ו ת הסימון הכפול נעשו ת י ק ו נ י ם עבור מעבר הקרינה מערוץ ‪C‬‬
‫ל‪-‬‬
‫‪3‬‬
‫‪H‬ולהיפך‬
‫‪1 4‬‬
‫‪.‬‬
‫חומרים ר ד י ו א ק ט י ב י י ם ‪:‬‬
‫‪14‬‬
‫‪( C ) Dextran; (Spec. Act. 0.46 yCi/mg),‬‬
‫‪14‬‬
‫משקל מ ו ל ק ו ל ר י ‪L - ( C ) Alanine; (Spec. Act. 14.2 mCi/mmole) ,28,700‬‬
‫‪3‬‬
‫)‪, L-( H) Alanine ; (Spec. Act. 167 mCi/mmole‬‬
‫נרכשו‬
‫מ‪Inulin; . Radiochemical Center, Amersham, England -‬‬
‫‪3‬‬
‫)‪(^C‬‬
‫‪3‬‬
‫)‪(Spec. Act. 6.6 Ci/mole) ,( H)Inulin (Spec. Act. 250yCi/ml,1.15xl0" M‬‬
‫‪ .‬נרכשו מ‪ New England Nuclear , U.S.A -‬־‬
‫השמנים מהם ה ו כ נ ו התערובות בעלות צ פ י פ ו י ו ת ש ו נ ו ת ‪:‬‬
‫‪Octoil-S (Rochester Div. Consolitated Electridynamics Corp.‬‬
‫‪Rochester, N.Y.) , di-N-Butyl Phthalate (Eastman Kodak Co.‬‬
‫‪Rochester N.Y.) .‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫‪3.6‬‬
‫משקע )‪ (pellet‬תאים שהתקבל על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה של תרחיף תאים‬
‫‪0‬‬
‫‪3.1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪,‬‬
‫‪7‬‬
‫‪Sorvall -‬‬
‫) ‪ C‬ה ו ר ח ף ב מ ד י ו ם ג י ד ו ל טרי ‪4°),‬‬
‫‪27‬‬
‫‪1‬‬
‫ב‬
‫‪18‬‬
‫‪C‬‬
‫‪,2H)1mMK‬‬
‫‪R‬‬
‫‪MNaCl135,mM‬‬
‫(‪-0.‬ב‪94°‬מועשרת־‬
‫‪m‬‬
‫ה פ ר ד ת ה ת א י ם מ ת ע ר ו ב ת ז ו נעשתה בשיטת ההרחפה ה ד י פ ר נ צ י א ל י ת‬
‫י‬
‫צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה משך ‪ 2 . 5‬ד ק ו ת ב ‪-‬‬
‫בת השמן‬
‫ו‬
‫‪xg‬‬
‫‪10,000‬‬
‫)סעיף ‪, ( 3 . 5‬‬
‫״ ח ת ו ך ה מ ב ח נ ו ת נעשה‬
‫‪ ( g / c c‬ה מ פ ר י ד ה ב י ן המשקע ל נ ו ז ל ה ע ל י ו ן ‪ .‬משקע‬
‫) ‪1 . 0 6 6‬‬
‫ה ת א י ם ה ו ר ח ף ב ‪ 0 . 1 0 -‬מייל ‪ .H 0‬ד ו ג מ א של ‪ 40‬מ י ק ר ו ל י ט ר מ ת ר ח י ף ז ה נ ל ק ח ה‬
‫‪2‬‬
‫‪Q‬‬
‫‪' I1 f f..‬‬
‫לקביעת היחס ה א י ז ו ט ו פ י ‪0 / 0‬‬
‫לקביעת היחס ה א י ז ו ט ו פ י ‪0‬‬
‫ל א י ז ו ט ו פ י ם של מ כ ו ן‬
‫‪0/‬‬
‫ויצמן‬
‫נ פ ח ה מ י ם של ה ‪-‬‬
‫ן‬
‫ב מ כ ש י ר ‪Mass Spectrometer‬‬
‫למדע‪.‬‬
‫‪,Pellet‬‬
‫)מייל( ‪,v‬‬
‫בעזרת‬
‫חושב מ ה ע ר ך ה נ מ ד ד ‪0 / 0‬‬
‫‪0‬‬
‫של ה ת ע ר ו ב ת ה מ ק ו ר י ת‬
‫המשוואה‬
‫) ב י ח י ד ה )‪60‬‬
‫‪8‬‬
‫(‬
‫‪1‬‬
‫‪/‬‬
‫‪R‬‬
‫של‬
‫(‬
‫‬‫‪RV‬‬
‫׳‪R‬‬
‫‪RV + 0.1‬‬
‫כאשר ‪ 0 . 1‬מייל ה ו א נ פ ח ה מ י ם ה מ ו ס ף ל ‪-‬‬
‫‪,,Pellet‬‬
‫מ ס פ ר ה ת א י ם ב ת ע ר ו ב ת ה א י נ ק ו ב צ י ה נ ק ב ע ‪ :‬א ( בתא ס פ י ר ה‬
‫ניגוד‪-‬הפאזות ;‬
‫מתמדת משך ש ב ו ע ‪.‬‬
‫ב(‬
‫במיקרוסקופ‬
‫בלחות‬
‫ס פ י ר ת מ ו ש ב ו ת ש ג ו ד ל ו ע ל פ ל ט ו ת א ג רב‪C-37°‬‬
‫ע ר כ י ם ד ו מ י ם ה ת ק ב ל ו בשתי ה ש י ט ו ת ‪.‬‬
‫נ פ ח המים הקשור בתא א ח ד ב ‪-‬‬
‫‪ Pellet‬חושב מ ה ע ר כ י ם ש נ ק ב ע ו‬
‫ונמצא‬
‫‪3‬‬
‫וח^‪ . 0.24±0.02‬ת ו צ א ה ז ו ה י א מ מ ו צ ע של א ר ב ע ה‬
‫העיקרית‬
‫נ ו ב ע ת משיטות ספירת התאים‪.‬‬
‫נ פ ח ה א י נ ו ל י ן של ה ‪-‬‬
‫כדלהלן‪:‬‬
‫והמכיל‬
‫תמיסה‬
‫‪5‬‬
‫נסיונות שונים‪.‬‬
‫השגיאה‬
‫‪, Pellet‬‬
‫ה מ ו ד ד את ה מ י ם ה ח ו ץ ‪ -‬ת א י י ם ‪,‬‬
‫לתרחיף תאים ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל המהול ביחס‬
‫‪x‬‬
‫מ י מ י ת של‬
‫‬‫‪inulin‬‬
‫‪10‬‬
‫ת א י םב ‪15110‬הוספו‪,‬‬
‫‪14‬‬
‫) ‪,pH7.6) ( c‬‬
‫ד ו ג מ א של ‪ 0.2‬מייל נ ל ק ח ה מ ת ע ר ו ב ת ז ו‬
‫)‬
‫‪1‬‬
‫‪:‬‬
‫נקבע‬
‫‪v/v)1‬עם‬
‫מייל‬
‫מיקרוליטר‬
‫‪.(174mg/ml,Spec. Act. 180yCi/ml‬‬
‫והתאים הושקעו על י ד י‬
‫צנטריפוגציה‬
‫‪28‬‬
‫בשיטת ההרחפה ה ד י פ ר נ צ י א ל י ת כמתואר ל ע י ל ‪ .‬ה‪-‬‬
‫‪ Pellet‬וזורווף ב ‪ 0.1 -‬מייל‬
‫‪ ^ 0‬והדדי ו א ק ט י ב י ו ת נקבעה בדוגמא של ‪ 20‬מ י ק ר ו ל י ט ר עם תמיסת ‪Bray‬‬
‫)‪ 10‬מייל(‪ .‬נקבעה גם ה ר ד י ו א ק ט י ב י ו ת בדוגמא של ‪ 10‬מ י ק ר ו ל י ט ר מתרחיף‬
‫התאים ה מ ק ו ר י ‪ .‬נפח ה א י נ ו ל י ן חושב מערכי הספירה‪ ,‬בהנחה שריכוז ה א י נ ו ל י ן‬
‫‪Pellet‬‬
‫במים החוץ‪-‬תאיים שב‪-‬‬
‫זהה ל ר י כ ו ז ו בתערובת ה א י נ ק ו ב צ י ה ‪ .‬נפח‬
‫‪3‬‬
‫ה א י נ ו ל י ן לתא ב ‪-‬‬
‫‪ Pellet‬נמצא‬
‫לתקן את נפח המים לתא‬
‫‪3.7‬‬
‫‪ .0 14pm‬קביעה ז ו נתנה את האפשרות‬
‫־‬
‫‪3‬‬
‫‪ A. laidlawii‬שהינו ל פ י כ ך‬
‫‪10±0ym02‬־״‪» 0‬‬
‫הכנת תכשיר ק ר ו מ י של מיקופלסמה‬
‫בהכנת‬
‫תכשיר קרומי‬
‫יש לבחור בשיטות ע ד י נ ו ת אשר במידה פחותה‬
‫כ כ ל האפשר תפגענה ב א ר ג ו ן הספציפי של ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם ‪ .‬דטרגנטים‬
‫או ממיסים משנים את מבנה הממברנה על י ד י מ י צ ו י סלקטיבי של מ ר כ י ב י ה ‪.‬‬
‫ג ל י ם א ו ל ט ר ה ‪ -‬ם ו נ י י ם שוברים את הממברנה ל פ ר ג מ נ ט י ם ק ט נ י ם ה נ ו ט י ם לעבור‬
‫ר י א ג ר ג צ י ה בלתי ס פ צ י פ י ת ‪ .‬השיטה העדינה ב י ו ת ר היא ל י ז י ם א ו ם מ ו ט י ;‬
‫על י ד י חשיפת התאים לתנאים ה י פ ו ט ו נ י י ם משתחרר ת ו כ נ ם והממברנה מתקבלת‬
‫בצורת ‪ ghost‬הנראה ב א ל ק ט ר ו ן ‪ -‬מ י ק ר ו ס ק ו פ ו כ ן ב ־ ‪ Freeze -Etching‬כמבנ‬
‫הדומה לממברנת התא השלם‪.‬‬
‫‪M. Fermentans‬‬
‫עמיד י ח ס י ת ב פ נ י שוק א ו ס מ ו ט י )‪ ,(20‬לכן ה י ה‬
‫צורך להשתמש בשיטה דרסטית על מ נ ת לקבל פרפרט מ מ ב ר נ ל י ‪ .‬ם ו נ י ק צ י ה של‬
‫ה במכשיר‬
‫‪ 3 B r a n s o n‬דקות‪ ,‬ל ס י ר ו ג י ן תוך קרור ל ‪-‬‬
‫משך‬
‫הפרקציה הבלתי מסיטה נעשתה על י ד י צ ב ט ר י פ ו ג צ י ה ) ‪4 0 , 0 0 0‬‬
‫‪C0°‬״‬
‫‪xg‬‬
‫‪Sorvall,30‬ד ק ו ת ( ־ פ ע י ל ו ת ה י ד ר ו ל י ט י ת נבדקה ב ת ס נ י ן הראשון ו כ ן במשקע‬
‫‪2‬‬
‫‪:‬‬
‫‪ M e r c a p t o e t h a n o l‬־ ‪5 0‬‬
‫‪mM NaCl150‬‬
‫‪MB10;mMTris‬‬
‫מובא ל‪ -4‬״‪ 7pH‬עם‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫‪m‬‬
‫;‬
‫־‪HCl‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬רגיש ל ת נ א י ם ה י פ ו ט ו נ י י ם ‪ .‬הרחפת התאים‬
‫בבופר & מהול ‪ 1:20‬עם מ י ם מ ז ו ק ק י ם ו א י נ ק ו ב צ י הב‪C-37°‬‬
‫משך ‪ 30‬דקות‬
‫‪29‬‬
‫תוצאתה‬
‫נ י ת ן לעקוב אחר הירידה ב צ פ י פ ו ת האופטית‬
‫ל י ז י ם טל ר ו ב התאים‪.‬‬
‫של ה ת ר ח י ף ב ‪ -‬ת‪1‬וו‪ 500‬ו ב מ ק ב י ל א ח ר העל י ה ב ב ל י ע ה טל ה ת ם נ י ן ב ‪ -‬וזזוו‪260‬‬
‫‪ .‬ת א י ם שלא נ ש ב ר ו ה ו פ ר ד ו ע ל י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ב ־‬
‫‪9,000‬‬
‫‪xg‬‬
‫‪40,000‬‬
‫התםניו עבר צנטריפוגציה ב ‪-‬‬
‫‪xg‬‬
‫משך‬
‫משך ‪ 30‬ד ק ו ת ל א י ס ו ף‬
‫פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ו ת נשטף ‪ 4-5‬פ ע מ י ם ) ע ד ש ת ם נ י ו השטיפה חסר‬
‫הממברנות‪.‬‬
‫ב ל י ע ה ב ‪nm260-‬א ו ‪(280nm‬‬
‫‪8‬והורחף‬
‫‪ .‬פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ו ת נשמר‬
‫בבופר‬
‫ב ‪ -20°C -‬־‬
‫‪ 3 . 8‬קביעת פוספט א י א ו ר ג נ י‬
‫בשיטה של‪( E i b l(61‬‬
‫ואורגני‬
‫ל ק ב ו ע א ת ה ק ו מ פ ל ק ס פ ו ם פ ו מ ו ל י ב ד ט עם‬
‫ניתו‬
‫‪ Triton x-100‬ב מ ק ו ם ח מ ר י ם מ ח ז ר י ם ‪.‬‬
‫‪30-90‬‬
‫פ ט ב ת ח ו ם של‬
‫ה ע כ י ר ו ת המתקבלת פ ר ו פ ו ר צ י ו נ י ת‬
‫‪ . n m o l e‬ב ה ק ט נ ת ה נ פ ח ה ס ו פ י של ת ע ר ו ב ת‬
‫‪1‬‬
‫י א ק צ י ה אפשר ל ה ג ד י ל את ה ר ג י ש ו ת עד ל ק ב י ע ה של‬
‫פ ו ס פ ט ‪ .‬שחרור‬
‫‪nmole‬‬
‫ה פ ו ם פ ט מ ח ו מ ר א ו ר ג נ י נעשה ע ל י ד י ש ר י פ ה ב נ ו כ ח ו ת ח ו מ צ ה ג פ ר י ת נ י ת‬
‫) ‪3 0 %‬‬
‫‪,‬‬
‫‪H‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪2‬‬
‫ו ח מ ו ם נ ו ס ף משך ‪ 15‬ד ק ׳‬
‫(‬
‫ב ‪ ) 300°C -‬ע ו ד ף ה פ ר ה י ד ר ו ל נ ה ר ס ( ‪ .‬לאחר ק ר ו ר מ ו ה ל י ם א ת ה ד ג י מ ה ב מ י ם‬
‫ו ק ו ב ע י ם א ת ה פ ו ס פ ט שהשתחרר‪,‬‬
‫‪3.9‬‬
‫ק ב י ע ת פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז‬
‫הפעילות‬
‫ירידה‬
‫כ נ ג ד עקומת כ י ו ל עם נתרו פ ו ס פ ט ‪.‬‬
‫בבליעה ב ‪-‬‬
‫הקשור ל מ מ ב ר נ ה של‬
‫נ ב ד ק ה בשיטה ם פ ק ט ר ו ם ק ו פ י ת )‪(26‬‬
‫‪nm‬‬
‫‪340‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫ו ה י א מעקב א ח ר מ ה ל ך‬
‫עם ה ו ס פ ת ‪ NADH‬ל ת כ ש י ר ה נ ב ד ק ‪ .‬ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה‬
‫) מ י י ל ‪ ( 3‬ה כ י ל ה ‪ 0.05 :‬עד ‪ 1‬מ ״ ג ח ל ב ו ו של התכשיר ה ק ר ו מ י ;‪;mMNaCl25‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪ - 2 m M‬התחלת‪; pH‬‬
‫‪mercaptoethanol‬‬
‫‪NADH‬‬
‫‪i‬‬
‫־‬
‫‪-4‬‬
‫ז‬
‫ס ו פ י של‬
‫הפעילות‬
‫(‬
‫)‬
‫‪r‬‬
‫‪e‬‬
‫‪g‬‬
‫‪n‬‬
‫‪r‬‬
‫‪h‬‬
‫‪e‬‬
‫‪o‬‬
‫‪B‬‬
‫‪M10x‬־‬
‫ה א נ ז י מ ט י ת מ ב ו ט א ת כ י ר י ד ה ב ב ל י ע ה )‪ (AOD‬בדקה ל מ ״ ג ח ל ב ו ו ק ר ו מ י ‪.‬‬
‫‪30‬‬
‫זיהוי‬
‫‪3.10‬‬
‫חלבונים‬
‫ב ת כ ש י ר ק ר ו מ י של‬
‫על‪-‬ידי‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫‪(SDS-PAGE) SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis‬‬
‫אלקטרופוריזה‬
‫בוצעה ב ג י ל י ם טל‬
‫‪Acrylamide‬‬
‫‪ N,N-Methylenebisacrylamide‬ב י ח ס )‪37:1 (62‬‬
‫טל‬
‫)‬
‫‪w‬‬
‫‪/‬‬
‫‪w‬‬
‫( ) ל פ י ההגדרה‬
‫‪Hjerten)63( )02.6%; T=22.8%‬ה ר י כ ו ז של א ק ר י ל א מ י ד ב ת ע ר ו ב ת‬
‫‪0‬‬
‫ה פ ו ל י מ ר י ז צ י ה ה י ה ‪. 7.5%‬‬
‫ה פ ו ל י מ ר י ז צ י ה נעשתה ע ם א מ ו נ י ו ם פ ר ם ו ל פ ט‬
‫) ‪w/v)0 . 0 7 5 %‬מ י מ י ‪ .‬ת ע ר ו ב ת ה א ק ל י ל א מ י ד ו ב ו פ ר ההרצה ה כ י ל ו נ ת ר ן‬
‫ב ‪2 -‬־‪pH 7‬‬
‫‪M‬‬
‫‪1%‬‬
‫ו‪-‬‬
‫‪M 2-Mercaptoethanol‬‬
‫יות‬
‫‪, x 0 . 5‬‬
‫פרספקס ב ג ו ד ל‬
‫‪ S D S‬־ ‪ 0‬־ ב ו פ ר ההרצה ה כ י ל ג ם‬
‫‪ .‬ההרצה ב ו צ ע ה ב מ כ ש י ר ת ו צ ר ת " י ד ע " ‪.‬‬
‫ם ״ מ ‪ 6‬ה ה ר צ ה בכוון‬
‫ה י ה בדרך כ ל ל כ ‪ 3 -‬טעות‪ ,‬בזרם טל‬
‫פוספט‬
‫‪6-8‬‬
‫‪mA‬‬
‫הגלים‬
‫ה א נ ו ד ה ‪ .‬מ ט ך ההרצה‬
‫ל ג ל ‪ ,‬ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ח ד ר ‪ .‬כל‬
‫ה ר י א ג נ ט י ם ה י ו מ ת ו צ ר ת ‪ ,BDH‬כ ד ר ג ת ה נ ק י ו ו ה ג ב ו ה ה ב י ו ת ר ‪.‬‬
‫דוגמאות תכטיר קרומי עברו דנטורציה ל פ נ י‬
‫ט ה כ י ל ) נ פ ח ס ו פ י ‪ 33‬מייל(‪1 :‬נתרן פ ו ס פ ט ח ד ב ס י ס י‬
‫האלקטרופוריזה בבופר‬
‫(‪M1‬מייל(; נ ת ר ן‬
‫פ ו ס פ ט ד ו ב ס י ס י ‪ M5»0 (10‬מייל(; ‪ SDS10% (0.33‬מ י י ל ( ;‬
‫ג ל י צ ר ו ל )‪ 3.3‬מייל(;‬
‫‪5%‬‬
‫מ י ם מ ז ו ק ק י ם להטלמת ה נ פ ח ‪.‬‬
‫צביעה‬
‫ט ל ‪0.25%‬‬
‫ם ‪ ,‬משך‬
‫ב‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ 1‬שעות ב ת מ י ס ת‬
‫ה ד נ ט ו ר צ י ה נעטתה ב ‪-‬‬
‫לזיהוי‬
‫) ‪5 : 1 : 5‬‬
‫‪-‬‬
‫‪Blue‬‬
‫‪ B r o m o p h e n o l‬״ ‪ 1.3) 0‬מייל(;‬
‫‪3 C 1 0 0 °‬‬
‫ח ל ב ו נ י ם נעטתה עם )‪(R 250‬‬
‫‪,‬‬
‫‪Mercaptoethanol‬‬
‫‪( v / v / v‬‬
‫משך‬
‫דקות‪.‬‬
‫‪Ccomassie B r i l l i a n t‬‬
‫מ ת נ ו ל ‪ :‬ח ו מ צ ת חומץ‪:‬‬
‫שעות ב ‪ . C 4 5 °‬מ י צ ו י ע ו ד ף הצבע נעשה ע ל י ד י ה ש ר י י ת ה ג ל י ם‬
‫) ‪5 : 1 : 5‬‬
‫‪ ( v / v / v ,‬מ ת נ ו ל ‪ :‬ח ו מ צ ת חומץ‪:‬מים ולאחר‬
‫‪ 5‬מתנול ‪.‬‬
‫מ כ ן ה ו ע ב ר ו ל ת מ י ס ה מ י מ י ת ה מ כ י ל ה ‪ 7.5%‬ח ו מ צ ת ח ו מ ץ ו ‪% -‬‬
‫‪31‬‬
‫תוצאות‬
‫‪4.1‬‬
‫ודיון‬
‫פעילות אמידטית של מיקופלםמה‬
‫ההידרוליזה של ‪-3‬נפתילאמידים של חומצות אמיניות שונות על ידי‬
‫תאים שלמים נקבעה בשיטה הפלואורימטרית המתוארת בפרק ‪ . 3.2‬מהירות‬
‫ההידרוליזה חושבה מו הדקות הראשונות של הריאקציה כאשר הםובםטרט מצוי‬
‫בעודף ניכר וקצב ההידרוליזה מראה תלות לינארית בזמו‪ .‬הפעילות‬
‫ההידרוליטית נבדקה בריכוזי םובסטרט שונים ותלות הקצב ההתחלתי של‬
‫הריאקציה ‪ v/1‬ב‪ s/1 -‬הוצגה לפי‬
‫ה‪-‬‬
‫)‪(apparent‬‬
‫‪ . Lineweaver-Burk‬מתלות זו חושב‬
‫‪ .‬הפעילות הספציפית מבוטאת על ידי כמות התוצר‬
‫‪-nmoles‬נפתילאמין( המשתחררת לדקה על ידי כמות תאים האקויולנטית‬
‫‪6‬‬
‫למ״ג חלבון‪ .‬כיול הפליטה של תוצר ההידרוליזה נעשה עם ש־נפתילאמין‬
‫מסחרי ) ‪, F l u k a‬‬
‫(‬
‫‪M‬־‪- 5xlO‬‬
‫‪M‬־‬
‫שגובש מאתנול‪ .‬מידת הפליטה ב‪nm410-‬של ש‪-‬נפתילאמין‬
‫ה‬
‫‪5‬‬
‫‪4.1.1‬‬
‫ח‬
‫ו‬
‫ר‬
‫מ‬
‫‪m‬‬
‫‪n‬‬
‫‪ ,‬בתחום של‬
‫‪6‬‬
‫־‪lxlO‬‬
‫הפעילות האמידטית של‬
‫‪Mycoplasma fermentans‬‬
‫תוצאות בדיקת הפעילות האמידטית של‬
‫‪ M.fermentans‬לגבי‬
‫^‪-‬נפתילאמידים של חומצות אמיניות שונות מוצגות בטבלה ‪. 1‬‬
‫נמצא כי תאי‬
‫‪ M. fermentans‬מסוגלים לפרק את הקשר האמידי שליד‬
‫השייר הנפתילאמיני‬
‫ב‬
‫‪-‬ו‪NA6-L-Arg-L-His-eNA‬גם כאשר הקבוצה‬
‫ה־ ‪ a - ₪ 2‬בתרכובות אלו מותמרת בשייר אצטיל או בנזואיל‪ ,‬אלא‬
‫שהפרוק במקרים אלו איטי בכ‪ 50% -‬בהשוואה לםובסטרט בעל הקבוצה‬
‫ה‪ a -‬אמינית החופשית‪.‬‬
‫‪32‬‬
‫טבלה‬
‫‪: 1‬‬
‫‪M-fermentans‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של‬
‫‪specific activity‬‬
‫‪apparent‬‬
‫‪nmoles/min/mg‬‬
‫‪M‬‬
‫‪cell protein‬‬
‫‪4‬‬
‫‪4‬‬
‫‪4‬‬
‫‪0‬־‪1.25xl‬‬
‫‪5‬‬
‫‪L-His-BNA‬‬
‫‪9‬‬
‫‪4.8‬‬
‫‪L-Arg-BNA‬‬
‫‪ 0‬־ ‪8.5 x l‬‬
‫‪4.6‬‬
‫‪L-Lys-gNA‬‬
‫"‪xlO‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0‬‬
‫‪L-a-Glu-3NA‬‬
‫‪-‬‬
‫‪1‬‬
‫‪Ala-3NA‬־‪L‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0‬‬
‫‪L L-Phe-BNA‬‬
‫הרכב תערובת הריאקציה ה י ה כדלקמן‬
‫‪o‬‬
‫‪m‬‬
‫‪0‬‬
‫‪y‬‬
‫‪substrate‬‬
‫‪.‬‬
‫‪s:L-His-gNA2.14‬‬
‫‪5‬‬
‫‪e‬‬
‫‪;L-Lys‬‬
‫של שאר ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ;‬
‫‪l‬‬
‫‪m‬‬
‫‪o‬‬
‫‪y‬‬
‫;‬
‫‪3-ymoles‬נפתילאמידים‪NA-‬‬
‫‪ 50‬כ ו פ ר ו ר ו נ ל‪8.6pHymoles‬ו ‪ 0 . 2 -‬מייל‬
‫ת ר ח י ף ת א י ם ה מ ת א י ם ל כ ‪ 0.6 -‬מ ״ ג ח ל ב ו ן ‪ .‬ה נ פ ח ה ס ו פ י של ת ע ר ו ב ת‬
‫ה ר י א ק צ י ה ה י ה ‪ 1‬מ ״ ל ‪ ,‬ה ט מ פ ר ט ו ר ה ‪.l°C+25°‬‬
‫‪4.1.2‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫ב ד י ק ה מ ו ק ד מ ת הראתה ש ה ת ר כ ו ב ו ת ‪;L-Arg-3NA ;L-His-3NA‬‬
‫‪NA‬‬
‫ידי‬
‫ב ת נ א י נ ס י ו ו ה ד ו מ י ם לאלה ב ה ם נ ב ח ן פ ר ו ק ם ע ל י ד י‬
‫) ס ע י ף‪-L-Ala4.1.1‬מ א י ד ך נמצא‬
‫ל י ד י תרחיף תאי‬
‫ש(‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫‪NA3-‬‬
‫מתפרק על י ד י‬
‫‪3‬‬
‫‪a‬‬
‫‪N‬‬
‫נ ק ב ע בשיטה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת ) פ ר ק ‪(3.2‬‬
‫‪-‬‬
‫‪i‬‬
‫‪i‬‬
‫‪w‬‬
‫‪. A. laidlawii‬‬
‫‪l‬‬
‫‪d‬‬
‫‪i‬‬
‫‪a‬‬
‫‪A. l‬‬
‫ו ה מ ה ל ך ה א ו פ י י נ י של ה ר י א ק צ י ה‬
‫מ ת ו א ר ב צ י ו ר ‪.1‬‬
‫ר ו ל י ז ה ה ה ת ח ל ת י ב ת נ א י ם א ל ו נמצא‬
‫נפתילאמיו‬
‫בריכוזי‬
‫והטמפ‪.‬‬
‫‪0.9±0.1‬‬
‫המשתחרר בדקה ל מ ״ ג ח ל ב ו ו ‪.‬‬
‫‪nmoles‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת נקבעה‬
‫ס ו ב ם ט ר ט ש ו נ י ם ו ה ‪6xlO~^(apparent)-‬נמצא!‬
‫המצוי י נ י ם ‪.‬‬
‫‪4‬‬
‫‪M‬‬
‫‪,‬‬
‫ב ת נ א י ה ‪pH -‬‬
‫‪33‬‬
‫את ה ה י ד ר ו ל י ז ה של‬
‫‪A1a-3NA‬־‪L‬‬
‫‪4‬‬
‫על י ד י תאי ‪ A. laidlawii‬בתנאי ה נ ם י ו ן המפורטים ל ע י ל ‪ .‬לעומת זאת‬
‫ה ד י ‪ -‬פ פ ט י ד ‪ L-A1a-D-A1a‬נמצא מעכב את ה פ ע י ל ו ת האמידטית של התאים ‪-‬‬
‫כאשר ‪ 50%‬ע י כ ו ב הושג ב ר י כ ו ז ד י פ פ ט י ד של ‪M‬‬
‫‪_9‬‬
‫‪5xl0‬״‪. 2‬‬
‫צ י ו ר מ ם ‪.1:‬ה ק י נ ט י ק ה של ה י ד ר ו ל י ז ת ‪eNA‬־‪ a1L-A‬על י ד י תאי‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫תערובת הריאקציה‪ ,‬בתא ב ו הטמפרטורה מ ו ו ס ת ת ל ‪ ,25°C -‬הכילה בנפח‬
‫‪:50ymoles; L-Ala‬מ״ל‪NA3-1‬‬
‫‪ 8.6pH‬ו‬
‫‪ymoles2.8‬‬
‫מייל תרחיף תאים המכיל‪10x5-0.5‬תאים‬
‫ל כ ‪ 0 . 3 -‬מ״ג ח ל ב ו ן ( ‪.‬‬
‫בופר ו ר ו נ ל‬
‫כמות‬
‫המתאימה)‬
‫‪34‬‬
‫‪4.1.3‬‬
‫תלות הפעילות האמידטית ב‪pH -‬‬
‫התלות ב‪ pH -‬של פעילות‬
‫‪L-His-BNA‬‬
‫‪ M. fermentans‬בהידרוליזה של‬
‫נבדקה עם תאים שלמים ועם פרפרט ממברנלי‪ .‬התאים השלמים‬
‫הוכנו בתמיסת ם ו כ ר ו ז ‪ -‬מ ג נ ז י ו ם א י ז ו ט ו נ י ת )פרק ‪ .(3.1‬פרפרט ממברנלי הוכ‬
‫על ידי סוניקציה של תרחיף תאים במכשיר‬
‫‪ ,Branson‬שלש פעמים משך דקה‪,‬‬
‫בעצמה של ‪ amp3.5‬תוך קרור ל‪ . C0° -‬כתוצאה מטיפול זה קטנה העכירות‬
‫של התרחיף בכ‪ .40% -‬הממברנות הורחפו על ידי צנטריפוגציה ב‪,Sorvall -‬‬
‫‪g‬‬
‫משך‬
‫‪x‬‬
‫‪0‬‬
‫‪ 3‬דקות ב‪ . C4° -‬תרחיף הממברנות נשטף פעמים מספר‬
‫בבופר & מהול ‪ 1 : 2 0‬פ ר ק‬
‫) ‪ ( 3 . 7‬ונשמר ב‪C20° -‬־ ‪.‬‬
‫תמיסות בופר לבדיקת פעילות תאים שלמים הוכנו בריכוז של ‪0.1M‬‬
‫בתמיסת ס ו כ ר ו ז ־ מ ג נ ז י ו ם ‪ .‬פעילות אנזימטית של ממברנות נבדקה בכופר‬
‫ללא םוכרוז‪.‬‬
‫תוצאות של בדיקת הפעילות האמידטית של תאי‬
‫תאים אלה‪ ,‬לגבי‬
‫‪ N A 3 - H i s‬־ ‪, L‬שונים‪pH‬בתנאי‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫מובאות‬
‫בציור ‪. 2‬‬
‫כדי לודא שהשינוי במהירות ההידרוליזה בערכי ה‪ pH -‬השונים אכן‬
‫מבטא תכונה אינטרינםית של הפעילות הקטליטית של האנזים‪ ,‬בדקנו באם‬
‫הפליטה הפלואורסצנטית של נפתילאמין תלויה ב‪ . pH -‬מצאנו כי בתחום‬
‫ה‪ pH -‬הנבדק ד ה י י נ ו ‪ , 6-9.6‬לא היה שינוי בפליטה של ‪-3‬נפתילאמין‬
‫ב־ ‪.420nm‬‬
‫תלות הפעילות האמידטית של תאי ‪ A. laidlawii‬ב‪ pH -‬נבדקה עם‬
‫תאים מורחפים בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת )פרק ‪ (3.1‬והתוצאות מתוארות‬
‫בציור ‪. 3‬‬
‫‪55‬‬
‫‪T‬‬
‫‪8‬‬
‫‪7‬‬
‫‪10‬‬
‫‪9‬‬
‫‪pH‬‬
‫צ י ו ר מ ס ‪:2 .‬‬
‫‪(0‬‬
‫ת ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ז ר ‪ ,‬של ‪ ,L-His-gNA‬על י ד י תאי‬
‫‪( M . fermentans‬‬
‫)<( ב ‪pH -‬‬
‫ופרפרט ממברנלי‬
‫הרכב תערובת הריאקציה ל צ ו ר ך הבדיקה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת )פרק ‪(3.2‬‬
‫ס ו פ י של ‪ 1‬מייל ה י ה כ ד ל ק מ ן‬
‫‪ymoles‬‬
‫‪50‬‬
‫‪ y m o l e s:gNA2.14‬־ ‪; L - H i s‬‬
‫ב ו פ ר ב ‪ pH -‬ה מ ת א י ם ; ת ר ח י ף ת א י ם ב ת מ י ס ת ם ו כ ר ו ז‬
‫מ ג נ ז י ו ם ) ‪ 0 . 2‬מייל‪ ,‬כ מ ו ת המתאימה ל כ ‪ 0 . 6 -‬מ ״ ג ח ל ב ו ן ( א ו ת ר ח י ף‬
‫מ מ ב ר נ ו ת ‪ )0.2‬מייל‪ 0 . 2 ,‬מ ״ ג ח ל ב ו ן (‬
‫בבופר‬
‫‪1:20‬‬
‫‪g‬‬
‫ט מ פ ר ט ו ר ה ‪C25°‬‬
‫ה כ ו פ ר י ם ה י ן כ ד ל ק מ ן ‪ :‬ט ר י ם ‪ -‬מ ל א ט ל ‪ 8.0pH -‬ו ‪74 -‬״;‬
‫‪-‬‬
‫קרבונט‪-‬ביקרבונט‬
‫ל‪9.6pH‬‬
‫ו‪-9,15‬‬
‫ה א נ ז י מ ט י ת מבוטאת כאחוז מהפעילות המירבית‪.‬‬
‫ורונל‬
‫‪ .‬הפעילות‬
‫־‬
‫‪36‬‬
‫צ י ו ר מ ס ‪ :3 .‬ת ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ז ה עול ‪L-Ala-BNA‬‬
‫‪A, laidlawii‬‬
‫ב ‪pH -‬‬
‫ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ל ב ד י ק ה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת ‪ ,‬בטמפ׳‬
‫י‬
‫י‬
‫ל‬
‫‪1‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬
‫על י ד י תאי‬
‫‪, 25°‬‬
‫‪ C‬ה כ י ל ה‬
‫‪ymoles2.8ymoles; L-Ala-eNA‬בול׳‬
‫‪Q‬‬
‫ים‬
‫)‬
‫(‬
‫‪) .‬‬
‫מ״ג‬
‫ח ל ב ו ן ‪ 0 . 3‬ם (‬
‫‪ ( M ; 0 . 0 5 (0‬ב ו פ ר פ ו ס פ ט ; ב ו פ ר ו ר ו נ ל ;‬
‫הידרוקםיד‪M ,0.05‬‬
‫־‬
‫ב ו פ ר חומצה ב ו ד י ת ‪ -‬ב י ד‬
‫ביקרבונט‪-‬םודיום‬
‫‪37‬‬
‫דיון‬
‫ב פ ר ק ‪4.1‬‬
‫פ ע י ל ו ת א מ י ד ט י ת ו פ פ ט ל ד ט י ת של‬
‫ע ל י ד י נ ו )‪ .(64‬לאחר מ כ ן‬
‫ש ו נ ה ‪ ,‬ג ם ב ‪laidlawii(65-‬‬
‫שבדקנו‬
‫‪ Mycoplasma fermentans‬ד ו ו ח ה‬
‫א י פ י י נ ו פ ע י ל ו ת ד ו מ ה ‪ ,‬ב ע ל ת תיזום ס פ צ י פ י ו ת‬
‫‪ .(Acholeplasma‬שני מ י נ י המיקופלםמה‬
‫מ ג ל י ם פ ע י ל ו ת ב ה י ד ר ו ל י ז ה של הקשר ה א מ י ד י ב נ פ ת י ל א מ י ד י ם של‬
‫אמיניות שונות‪.‬‬
‫חומצות‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫הראה ס פ צ י פ י ו ת ב ב י ק ו ע הקשר‬
‫ה א מ י ד י ל י ד ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ה ב ס י ס י ו ת ו ל א ה ת ק י ף כ ל ל את ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם‬
‫ו פ נ י ל א ל נ י ן ‪ ,‬א ל נ י ל נ פ ת י ל א מ י ד התפרק א ך במעט‪.‬‬
‫של ח ו מ צ ה ג ל ו ט מ י ת ‪,‬‬
‫‪ A. laidlawii‬הראה ל ע ו מ ת ז א ת ס פ צ י פ י ו ת ב ה י ד ר ו ל י ז ה של א ל נ י ל נ פ ת י ל א מ י ד‬
‫בעוד‬
‫ש ה י ד ר ו ל י ז ה של שאר ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם ש נ ב ד ק ו ה י ת ה מ ו ע ט ת ‪.‬‬
‫האמידז‬
‫בשני מ י נ י ה מ י ק ו פ ל ס מ ה ל נ פ ת י ל א מ י ד י ם ה ש ו נ י ם ‪ ,‬המבוטאת על י ד י‬
‫‪4‬‬
‫ה‪-‬‬
‫ה א פ י נ י ו ת טל‬
‫נמצאה ד ו מ ה ‪,‬‬
‫‪-‬‬
‫ד ה י י נ ו ב ת ח ו ם של ‪M‬‬
‫‪4‬‬
‫‪- 8.5x10‬‬
‫‬‫‪.1.25x10‬‬
‫ב ד י ק ת ת ל ו ת ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ב ‪ pH -‬הראתה ה ב ד ל נ י כ ר ב י ן ש נ י מ י נ י‬
‫המיקופלםמה‪.‬‬
‫ב ע ו ד ט ה ה י ד ר ו ל י ז ה ה מ י ר ב י ת של ה י ם ט י ד י ל נ פ ת י ל א מ י ד ע ל י ד י‬
‫‪ M. fermentans‬ה י ת ר ב ת ח ו ם‬
‫אופטימום‬
‫י ד י ‪laidlawii‬‬
‫‪.‬‬
‫‪9.5-10pH‬‬
‫‪.‬‬
‫)למעשה ל א נ י ת ן ה י ה ל ק ב ל ע ק ו מ ת‬
‫ב ג ל ל ה ‪ pH -‬ה ג ב ו ה ( ‪ ,‬ה ר י ה פ ר ו ק ה מ י ר ב י ט ל א ל נ י ל נ פ ת י ל א מ י ד‬
‫‪A‬‬
‫התרחש ב ‪ p H‬נ מ ו ך י ו ת ר ‪. 8-9pH ,‬‬
‫‪-‬‬
‫‪ M. fermentans‬ש ל מ י ם ‪,‬‬
‫תאי‬
‫ו פ ר פ ר ט מ מ ב ר נ ל י שהוכן מ ת א י ם א ל ו מ ר א י ם ת ל ו ת‬
‫ד ו מ ה של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ב ‪ .pH -‬ממצא ז ה מרמז ע ל החשיפה האפשרית של‬
‫האמידז‬
‫ב מ מ ב ר נ ה ל ‪ pH -‬ב מ ד י ו ם ‪ .‬ל א נ י ת ן ה י ה ל ע ר ו ך ה ש ו ו א ה ד ו מ ה‬
‫ב ‪A. laidlawii -‬‬
‫מאחר ו ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ב פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ל י אבדה מ ה י ר ו ת ‪,‬‬
‫כפי שידווח להלן‪.‬‬
‫פעילות‬
‫החומצה‬
‫קרבוניל‪.‬‬
‫האמידז‬
‫י ו ר ד ת ב מ י ד ה נ י כ ר ת כאשר ה ק ב ו צ ה ה ‪ - 0 -‬א מ י נ י ת של‬
‫ה א מ י נ י ת ‪ -‬נ פ ת י ל א מ י ד מותמרת על י ד י ש י י ר אצטיל א ו‬
‫בנזילאוקסי‪-‬‬
‫ממצא ז ה תמך ב ה נ ח ת נ ו ש ה פ ע י ל ו ת ה ז ו ה י א מ ס ו ג א ק ס ו פ פ ט י ד ז ‪.‬‬
‫‪38‬‬
‫א נ ז י ם ב ע ל פ ע י ל ו ת א ר י ל א מ י ד ז ‪ ,‬המפרק את הקטר ה א מ י ד י ב ת ר כ ב ו ת‬
‫‪Pspudomonas aeruginosa‬‬
‫‪ - 6‬נ פ ת י ל א מ י ד י ם של ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ו ד ד מ ‪-‬‬
‫באנזים תוך‪-‬תאי‬
‫ואופיין‬
‫וקונסטיטוטיבי )‪.(66‬‬
‫ה י א ב ב י ק ו ע הקטר ה א מ י ד י טל‬
‫‪ 6‬־ נ פ ת י ל א מ י ד י ם טל )‪(L‬‬
‫האנזים ד י ‪ -‬ו‬
‫ו א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת א ל ה ‪,‬‬
‫ה‪ -‬ג>‪-‬אמיני‪.‬‬
‫פעילות הפפטידז‬
‫א מ י ד י ם ‪ ,‬ז א ת הראו‬
‫החופשיים בקצה‬
‫א י נ ה ת ל ו י ה ב מ ע ר כ ת ההחדרה של ה נ פ ת י ל ‪-‬‬
‫ב ח י י ד ק י ם אשר ג ד ל ו במצע מ י ז ע ר י‬
‫א ך ח ס ר ו את ה י כ ו ל ת ל ה ח ד י ר את ה ם ו ב ם ט ר ט ‪.‬‬
‫שהראנו‬
‫חומצות אמיניות‬
‫ו נ י ט ר ל י ו ת ‪ ,‬אשר הקצה ה ‪ - 0 -‬א מ י נ י שלהם ח ן פ ט י ‪ .‬כ מ ן כ ן מ פ ר ק‬
‫בסיסיות‬
‫פעילות‬
‫ה ס פ צ י פ י ו ת של א נ ז י ם ז ה‬
‫האמידז‬
‫ו ה כ י ל ו את ה פ פ ט י ד ז‬
‫של מ י ק ו פ ל ם מ ה ‪ ,‬ב ע ל‬
‫א נ ל ו ג י ת ל ז ו שנמצאה ב ח י י ד ק י ם ‪ ,‬מ מ ו ק ם ל ע ו מ ת ז א ת ב מ מ ב ר נ ה כ פ י‬
‫ב פ ר ק ‪ . 4 . 6‬אפשר ש מ י ק ו ם ה א נ ז י ם ב מ מ ב ר נ ה ה פ ל ם מ ט י ת ‪,‬‬
‫באורגניזם‬
‫ח ס ר ד ו פ ן ‪ ,‬בצורר‪ .‬המאפשרת ל ו מ ג ע ע ם ם ו ב ם ט ר ט י ם ב מ ד י ו ם ‪ ,‬יש ב ו משום‬
‫ל מ י ק ו פ ל ס מ ה ה ד ו ר ש י ם א ת ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת במצע ה ג י ד ו ל‬
‫תועלת‬
‫ומקבלים אותן‬
‫שה‪-pH‬‬
‫ב צ ו ר ת ה י ד ר ו ל י ז ט ח ל ק י של ח ל ב ו נ י ם ‪ .‬יש ל צ י י ן בהקשר זר‪.‬‬
‫האופטימלי‬
‫ל פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ז של ‪A. laidlawii‬‬
‫ו כ ן ג ם ה‪ -pH‬ה א ו פ ט י מ ל י‬
‫‪4.2‬‬
‫נמצא ב ת ח ו ם ‪8-9H‬׳‬
‫ל ג י ד ו ל ה ת א י ם ה ו א ב ת ח ו ם‪. ( 8 - 8 . 5 p H(67‬‬
‫השפעת ר י א ג נ ט י ם מ ע כ ב י ם על ה פ ע י ל ן ת ה א מ י ד ט י ת של‬
‫בלפי‬
‫‪••]. fermentans‬‬
‫‪His-BNA‬־‪ L‬ו ע ל כ ו ש ר ק ל י ט ת ה י ס ט י ד י ן‬
‫ע י כ ו ב ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של‬
‫‪4.2.1‬‬
‫ריאגנטי‬
‫יודואצטט‪,‬‬
‫כריאגנטים‬
‫אלקילציה‬
‫יודואצטאמיד ו ‪-‬‬
‫המתמידים שיירי ציסטאין‪,‬‬
‫ת ל ו י ה ב ‪pH -‬‬
‫חומצות‬
‫‪N-ethylmaleimide‬‬
‫מתיונין‬
‫ידועים‬
‫והיסטידין‬
‫בחלבוני‪,‬‬
‫‪ ,mM5-10‬עם ח ל ב ו נ י ם‬
‫(‪.‬‬
‫האמינית‪.‬‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫על י ד י‬
‫ה י ו ת ו ה ם מ ג י ב י ם ע ם ה צ ו ר ה ה מ י ו נ נ ת של ש י י ר החומ^‪-‬‬
‫י ו ד ו א צ ט ט )‪12‬־‪ (pK=3‬מ ת א י ם לשמש כ ר י א ג נ ט ל ה ת מ ד ת ש י י ר י‬
‫א מ י נ י ו ת ב ק ר ו ם התא‪,‬‬
‫החשופות למדיום ה ח י צ ו נ י ‪,‬‬
‫ה י ו ת והתאי‬
‫‪39‬‬
‫מצויירים במחסום חדירות ל א נ י ו נ י ם ‪ .‬כמו כ ן ‪ ,‬יודואצטט נוטה להתרכז‬
‫בפאזה שומנית )קבוע התחלקות ‪. (2.9‬‬
‫השפעת הריאגנטים הללו על הפעילות האמידטית של ‪M. fermentans‬‬
‫נבדקה על ידי הדגרה של התאים עם הריאגנט ולאחר מכן בדיקת הפעילות‬
‫האמידטית של התאים המטופלים בהשוואה לבקורת טל תאים שהודגרו‬
‫באותם תנאים אך בהעדר הריאגנט‪ .‬זאת נעשה באופן הבא‪ :‬לתרחיף תאים‬
‫)‪ 2.5-3‬מ״ג חלבון ב‪ 1 -‬מייל תמיסת ם ו כ ר ו ז ‪ -‬מ ג נ ז י ו ם א י ז ו ט ו נ י ת ‪,‬‬
‫ב‪ 7 . 5 p H -‬ה ו ס פ ו‬
‫‪ 0.5‬מייל מתמיםות המוצא של חומצה יודואצטית או‬
‫(‬
‫יודואצטאמיד )‪ (uka,purumF1‬בבופר טרים‪-‬מלאט ‪1M‬״‪, ,pH7.50‬שריכוזן‬
‫‪2‬‬
‫‪10M ~xlO4‬״ ההדגרה עם הריאגנט‪ ,‬בריכוז סופי של‪(30°mM‬בוצעהב־נ‪,‬‬
‫תוך טלטול קל‪ .‬בזמנים שונים נלקחה דגימה של תאים‪ ,‬פעילות הריאגנט‬
‫ה הופסקה על ידי הוספת‬
‫מייל של‬
‫‪0‬‬
‫‪1‬‬
‫^‬
‫‪2‬‬
‫‪,‬‬
‫‪0‬ב‪MKNaHPO‬‬
‫‪-‬‬
‫‪8.5pH‬‬
‫)‪ (69‬והתאים הורחקו על ידי צנטריפוגציה‪ .‬התאים נשטפו פעמים מספר‬
‫בתמיסת ם ו כ ר ו ז ‪ -‬מ ג נ ז י ו ם א י ז ו ט ו נ י ת והובאו לנפח ההתחלתי של הדגימה‪.‬‬
‫הפעילות האמידטית נבדקה בשיטה הפלואורימטרית )פרק ‪ (3.2‬עם‬
‫‪ L-His-BNA‬כסובםטרט‪.‬‬
‫תוצאות נםיןן כמתואר לעיל מובאות בציור ‪. 4‬‬
‫הנתונים טבטבלה ‪ 1‬מראים של‪-‬‬
‫‪ M. fermentans‬פעילות אמידטית‬
‫ספציפית לגבי החומצות האמיניות הבסיסיות‪ .‬הואיל וטריפםין פועל‬
‫אף הוא כהידרולז של אסטרים ואמידים של חומצות אמיניות הבסיסיות‬
‫ליזין‬
‫ו א ר ג י נ י ן ‪ ,‬והוא נעכב ספציפית על ידי‬
‫‪Tosyl-L-Lys-‬‬
‫‪ . ( T L C K )chloromethylketone)(70‬בחנו את השפעתו של מעכב זה על‬
‫הפעילות האמידטית של‬
‫‪. M. fermentans‬‬
‫תרחיף תאים )‪ 3‬מ״ג חלבון( הודגר עם ר י כ ו ז י ם שונים של ‪, TLCK‬‬
‫‪ 7 . 4 p‬ה מ כ י ל סוכרוז לריכוז א י ז ו ט ו נ י‬
‫‪,‬‬
‫‪.‬‬
‫‪40‬‬
‫‪40‬‬
‫‪3‬‬
‫‪60‬‬
‫‪50‬‬
‫‪min‬‬
‫צ י ו ר מ ם ‪:4 .‬‬
‫הפעילות‬
‫על י ד י ח ו מ צ ה י ו ד ו א צ ט י ת ) ‪( 0‬‬
‫ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד נ‪(8‬‬
‫ה א מ י ד ט י ת של ת א י ם ש ט ו פ ל ו ב ח ו מ צ ה י ו ד ו א צ ט י ת ) ‪ ! : ( 0‬ו‬
‫יודואצטאמיד‬
‫כדלקמן‪:‬‬
‫ע י כ ו ב ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של‬
‫‪M. fremantans‬‬
‫)•(‬
‫נ ב ד ק ה בשיטה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת ) פ ר ק ‪(3.2‬‬
‫ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ‪ ,‬בטמפ' ‪ C 2 5 °‬נ פ ח ס ו פ י‬
‫‪s‬‬
‫‪e‬‬
‫‪l‬‬
‫‪o‬‬
‫‪m‬‬
‫‪y‬‬
‫‪ 1‬מייל ה כ י ל ה‬
‫‪,‬‬
‫‪6‬‬
‫‪.‬‬
‫‪8‬‬
‫ודגימת‬
‫ת א י ם )‪ 0.2‬מייל(‪ .‬כ ד י ל ב ד ו ק ה ג נ ה על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת מ פ נ י‬
‫ה ר י א ג נ ט המעכב‪ ,‬באמצעות ה י ם ט י ד י ן ‪,‬‬
‫‪l-His‬‬
‫עם‬
‫)ריכוז‬
‫‪30°C‬‬
‫צנטריפוגציה‬
‫יודואצטית‬
‫מהירה‬
‫ה ו ד ג ר ו ת א י ם כמשך ‪ is‬ר ק ­ ­‬
‫ס ו פ י‪. ( 2 5 m M )(A‬‬
‫ו ה ו ר ח פ ו ל ר י כ ו ז ם ההתחלתי‬
‫ה ת א י ם ה ו ר ח ק ו על‬
‫ו ט ו פ ל ו עם ח ו מ צ ה‬
‫כמתואר ל ע י ל ‪.‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ב כ ל ד ג י מ ה מ ב ו ט א ת כ א ח ו ז מ ה פ ע י ל ו ת של ה ת א י ם ב ב ק ו ר ת‬
‫ששהתה ב ה ד ג ר ה ב א ו ת ו פ ר ק ז מ ן ‪.‬‬
‫‪41‬‬
‫ה נ פ ח ה ס ו פ י של ת ע ר ו ב ת ה ת א י ם עט ה ר י א ג נ ט ה י ה‬
‫מייל ה ט מ פ ר ט ו ר ה ‪C30°2‬‬
‫ו ה ז מ ן מ ‪ 45 -‬ד ק ו ת ע ד ‪ 75‬ד ק ו ת ‪ .‬ת א י ם אשר ה ו ד ג ר ו ב ב ו פ ר ם ו כ ר ו ז‬
‫ב א ו ת ם ת נ א י ם א ך בהעדר ה ר י א ג נ ט שימשו כ ב ק ו ר ת ‪ .‬עם ת ו ם‬
‫איזוטוני‬
‫ה ה ד ג ר ה ה ו ר ח ק ו ה ת א י ם על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ‪ ,‬נשטפו מ ס פ ר פ ע מ י ם‬
‫בבופר‬
‫לבדיקה‬
‫והרחפו ל נ פ ח התחלתי בתמיסה ה א י ז ו ט ו נ י ת ‪.‬‬
‫כסובסטרט‪.‬‬
‫פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת עם ‪L-His-eNA‬‬
‫דגימות נלקחו‬
‫תוצאות נ ס י ו ו זה‬
‫מ ת ו א ר ו ת בטבלה ‪. 2‬‬
‫טבלה‬
‫‪:2‬‬
‫השפעת ‪ TLCK‬ע ל ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ת א י‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫‪activity‬‬
‫‪%‬‬
‫‪incubation period‬‬
‫‪min.‬‬
‫‪TLCK‬‬
‫‪M‬‬
‫‪63‬‬
‫‪75‬‬
‫‪3‬‬
‫‪0‬־‪6xl‬‬
‫‪20‬‬
‫‪60‬‬
‫‪2‬‬
‫־‪3xlO‬‬
‫‪20‬‬
‫‪45‬‬
‫‪2‬‬
‫־‪2xlO‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת אשר נ ק ב ע ה בשיטה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת‬
‫) פ ר ק ‪ (3.2‬מ ב ו ט א ת כ א ח ו ז מ ה פ ע י ל ו ת של ה ת א י ם ב ב ק ו ר ת המתאימה״‬
‫ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ‪ ,‬ט מ פ ' ‪1 ,C25°‬הכילה ב נ פ ח ס ו פ י של‬
‫‪14‬״‪2ymoles‬‬
‫‪NA350ymoles ; L-His-‬ב ו פ ר ו ר ו נ ל ‪,‬‬
‫מ״ל‪:‬‬
‫‪ pH‬ודגימת‪8.6‬‬
‫ת א י ם )‪ 0.2‬מ י י ל ( ‪.‬‬
‫ר י א ג נ ט א ח ר ‪ ,‬ה ‪(NEM) -‬‬
‫‪ N-ethylmaleimide‬נ ב ד ק ג ם כ ו כ מ ע כ ב‬
‫אפשרי של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של‬
‫‪ ,M. fermentans‬ב ת נ א י ם ד ו מ י ם‬
‫‪_3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪M10x‬מ ע כ ב כ ‪60% -‬‬
‫ב ר י כ ו ז של‪NEM‬נמצאכ י‬
‫מ ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ל א ח ר ט י פ ו ל של ‪ 60‬ד ק ו ת ב ת א י ם ‪.‬‬
‫‪4.2.2‬‬
‫השפעה של ח ו מ צ ה י ו ד ו א צ ט י ת על ח ד י ר ו ת‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫להיסטידיו‬
‫‪ fermentans‬״‪ M‬ק ו ל ט ה י ס ט י ד י ו‬
‫ב מ נ ג נ ו ן המראה ק י נ ט י ק ת ר ו ו י ה ‪,‬‬
‫‪42‬‬
‫התלויה‬
‫חומצה‬
‫ב ט מ פ ר ט ו ר ה ו ב ‪ .(34a) pH -‬מ ע נ י ן ה י ה א י פ ו א ל ב ח ו ן השפעת‬
‫יודואצטית‪,‬‬
‫ר י א ג נ ט המעכב א ת ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ה א ו ר ג נ י ז מ ‪.‬‬
‫על ק ל י ט ת ה ה י ם ט י ד י ן ‪ .‬לשם כ ך ה ו ם פ ו ל ת ר ח י ף ת א י‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫)‪ 1‬מייל‪ 0.2 ,‬מ ״ ג ח ל ב ו ן ; ב ת מ י ס ת ם ו כ ר ו ז ‪ -‬מ ג נ ז י ו ם ה מ כ י ל ה ב ו פ ר‬
‫ט ר י ם ‪ -‬מ ל א ט ב ‪MpH05-‬‬
‫‪5‬‬
‫‪s‬‬
‫יודואצטט‬
‫) ‪1‬‬
‫‪M‬‬
‫(‬
‫ב ב ו פ ר ט ר י ם ‪ -‬מ ל א ט ( ‪ .‬ה ת א י ם ה ו ד ג ר ו עם ה ר י א ג נ ט ‪,‬‬
‫‪2‬‬
‫שריכוזו‬
‫הודגרה‬
‫‪.‬‬
‫‪7‬‬
‫‪ 0‬״ ‪ 1 0‬מ י ק ר ו ל י ט ר מ ת מ י ס ת מ ו צ א של אשלגן‬
‫ב‬
‫~‪ ,M lxlO‬משך‪-30°C20‬ד ק ו ת‬
‫״ כ מ ו ת א ק ו י ו ל נ ט י ת טל תאים‬
‫בתמיטת ה ב ו פ ר ה א י ז ו ט ו נ י ת ‪ ,‬ללא ה ר י א ג נ ט ‪ .‬התאים הורחקו‬
‫ע ל י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ו נ ש ט פ ו מ ס פ ר פ ע מ י ם עם ת מ י ס ת ם ו כ ר ו ז ‪ -‬מ ג נ ז י ו ט‬
‫מקוררת‪.‬‬
‫ל צ ו ר ך ב ד י ק ת ה ק ל י ט ה של ה י ם ט י ד י ן‬
‫שהודגרה‬
‫‪.(34‬‬
‫בנוכחות הריאגנט וכן‬
‫‪pH5.6‬‬
‫ל י ד י ם נ ו נ ם על מ י ל י פ ו ר פ י ל ט ר‬
‫נקבעה בתאים שהודגרו פרק ז מ ן קבוע‬
‫‪0‬‬
‫‪14‬‬
‫עם ה י ס ט י ד י ן ]‪C‬‬
‫ד ו ג מ ת ה ב י ק ו ר ת ‪ ,‬בתמיסה מתאימה‬
‫) ‪ a‬ק ל י ט ת היםטידין‬
‫[ ב‪-‬‬
‫הורחפו התאים‪ ,‬הדוגמה‬
‫‪37‬‬
‫‪ .‬עודף החומצה ה א מ י נ י ת הורחק מן התאים‬
‫‪C‬‬
‫ה נ ק ב ו ב י ו ת ‪. ( y‬‬
‫)‪ 0.45‬גודל‬
‫נשטפו מספר פעמים בתמיסת ם ו כ ר ו ז ‪ :‬מ ג נ ז י ו ם מ ק ו ר ר ת ‪,‬‬
‫והועברו‬
‫יובשו באויר‬
‫השפעת י ו ד ו א צ ט ט על ח ד י ר ו ת‬
‫‪:3‬‬
‫‪cpm/0.2mg iodoacetate‬‬
‫‪protein pretreatment‬‬
‫‪+‬‬
‫‪ M. fermentans‬ל ה י ס ט י ר י ן‬
‫‪activity‬‬
‫‪%‬‬
‫‪2985‬‬
‫‪10‬‬
‫‪30850‬‬
‫‪100‬‬
‫ה ת ו צ א ו ת ה מ ו ב א ו ת ב ט ב ל ה ה י נ ן מ מ ו צ ע של שלוטה‬
‫קליטת‬
‫ההיסטידין‬
‫נ ם י ו נ ו ת נפרדים‪.‬‬
‫נ ב ד ק ה ב ת ע ר ו ב ת ש ה כ י ל ה ב נ פ ח ס ו פ י ט ל ‪ 1‬מייל‪:‬‬
‫ת א י ם ב כ מ ו ת א ק ו י ו ל נ ט י ם ל ‪ 0.2 -‬מ ״ ג חלבון‪mM ;50‬‬
‫‪28‬בריכוז‬
‫)‪.(59‬‬
‫ל ב ק ב ו ק י ם ה מ כ י ל י ם ‪ 10‬מייל נ ו ז ל ם י נ ט י ל צ י ה ב ד י א ו ק ס ן‬
‫טבלה‬
‫‪mM ;pH5.6280‬‬
‫ס ו כ ר ו ז ; ‪ 7mM‬מ ג נ ז י ו ם כ ל ו ר י ד ;‬
‫(‬
‫‪C‬‬
‫ס ו פ י טל‬
‫הפילטרים‬
‫‪e‬‬
‫משך ה ה ד ג ר ה ה י ה ‪ 15‬ד ק ו ת ‪.‬‬
‫‪l‬‬
‫‪o‬‬
‫‪m‬‬
‫‪p‬‬
‫‪/‬‬
‫‪i‬‬
‫בופר טרים‪-‬מלאט‪,‬‬
‫‪14‬‬
‫[‪CJL-His‬‬
‫‪y‬‬
‫~‬
‫‪6‬‬
‫״‬
‫‪M‬‬
‫ד ג י מ ו ת של ‪ 0.5‬מייל נ ל ק ח ו ל ב ד י ק ת‬
‫‪2‬‬
‫‪43‬‬
‫הרדיואקטיביות‪ .‬הפילטרים הושרו קודם בתמיסת היםטידין בלתי‬
‫מ ס ו מ ן על מ נ ת ל מ נ ו ע ס פ י ח ה ב ל ת י ס פ צ י פ י ת ‪.‬‬
‫ד י ן ן ב פ ר ק ‪4.2‬‬
‫י ו ד ו א צ ט ט ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד מ ג י ב י ם ע ם ש י י ר י ם נ ו ק ל א ו פ י ל י י ם )‪. (69‬‬
‫ב ‪ , pH7.5-8 -‬ב ר י כ ו ז י ם של ‪ ,5-10mM‬ה ת ג ו ב ה ה מ ת ר ח ש ת ה י נ ד ‪ ,‬ב ע י ק ר‬
‫ק ר ב ו ק ם י מ ת י ל צ י ה של צ י ם ט א י ן ‪ .‬ב ר י כ ו ז י ם י ו ת ר ג ב ו ה י ם י כ ו ל ה ל ה ת ר ח ש ג ם‬
‫ת ג ו ב ה ע ם מ ת י ו נ י ן )~‪) ,(pH3‬אמידזול ‪ (5.5-6PH‬ן ל י ז י ן )‪ (8.5pH‬כ פ י ש נ מ צ א‬
‫ב ה ת מ ד ה של ר י ב ו נ ו ק ל י א ז )‪.(71‬‬
‫ת ו צ א ו ת נ ס י ו נ ו ת י נ ו מ ר א י ם ש פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ‪ ,M. fermentans‬כ ל פ י‬
‫‪ - $‬נ פ ת י ל א מ י ד של ה י ס ט י ד י ן ‪ ,‬מ ע ו כ ב ת על י ד י י ו ד ו א צ ט ט ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד ‪ .‬ע י כ ו ב‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת מ ה י ר י ו ת ר ו ח ז ק י ו ת ר עם י ו ד ו א צ ט ט ‪ .‬ה ז מ ן שנדרש ל ע י כ ו ב‬
‫של ‪ 50%‬ע ל י ד י י ו ד ו א צ ט ט ה י ה ‪ 5‬ד ק ו ת ‪ ,‬ל ע ו מ ת ‪ 50%‬ע י כ ו ב ע ל י ד י י ו ד ו א צ ט א מ י ד‬
‫ת ו ך ‪ 30‬ד ק ו ת ‪ .‬א פ ש ר ל ה ב ח י ן ב מ ה ל ך ה ע י כ ו ב ע ם י ו ד ו א צ ט ט ש נ י ש ל ב י ם ‪ ,‬שלב מ ה י ר‬
‫ה מ ב י א ל ‪ 50% -‬ע י כ ו ב ת ו ך ‪ 5‬ד ק ו ת ו ש ל ב א י ט י ה מ ב י א ל ע י כ ו ב נ ו ס ף ע ד ‪ 80%‬ב מ ש ך‬
‫‪ 60‬ד ק ו ת ‪ .‬ה ד ג ר ה מ ו ק ד מ ת של ה ת א י ם ע ם ה י ס ט י ד י ן ‪ ,‬אשר ה נ פ ת י ל א מ י ד ש ל ו משמש‬
‫םובםטרט ל א מ י ד ז ‪ ,‬בטרם הוספה ה י ו ד ו א צ ט ט נתנה ה ג נ ה מלאה לאותן ק ב ו צ ו ת‬
‫ר ג י ש ו ת אשר מ ו ת ק פ ו ת ע ל י ד י ה ר י א ג נ ט ‪ .‬ה ן ע ם י ו ד ו א צ ט ט ו ה ן עם י ו ד ו א צ ט א מ י ד‬
‫ע י כ ו ב ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת א י נ ו מ ל א ו מ ג י ע ל מ י ר ב של ‪ 80%‬ת ו ך פ ר ק ז מ ן של‬
‫‪ 60‬ד ק ו ת ‪ .‬ג ם ‪ , TLCK‬אשר ה י ה צ פ ו י ל ה י ו ת ר י א ג נ ט ס פ צ י פ י ‪ ,‬ו כ ן ‪ NEM‬ל א‬
‫ע י כ ב ו י ו ת ר מ ‪ 60% -‬של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ‪ ,‬ב ת ח ו ם ר י כ ו ז י ם ד ו מ ה משך א ו ת ו‬
‫פ ר ק ז מ ן ‪ .‬כ נ ר א ה שיש ל ‪ M. fermentans -‬ל פ ח ו ת ש נ י ס ו ג י ם של ש י י ר י ח ל ב ו נ י ם‬
‫ה ר ג י ש י ם ל י ו ד ו א צ ט ט ‪ ,‬אשר מ י ד ת ח ש י פ ת ם ע ל שטח פ נ י ה ת א א ו ה ר י א ק ט י ב י ו ת‬
‫ש ל ה ם בשל מ י ק ו ם ב א י ז ו ר ס פ צ י פ י ש ו נ ה ו ל כ ן הם מ ג י ב י ם ע ם ה ר י א ג נ ט ב מ ה י ר ו ת‬
‫שונה‪.‬‬
‫ה ע ו ב ד ה ש‪ TLCK -‬ל א ש י מ ש כ מ ע כ ב ט ו ב י ו ת ר ב ה ש ו ו א ה ל י ו ד ו א צ ט ט ‪ ,‬ע ל א ף‬
‫ה י ו ת ו ת ר כ ו ב ת של ל י ז י ן אשר ה נ פ ת י ל א מ י ד ש ל ו משמש כ ס ו ב ס ט ר ט ל א מ י ד ז‬
‫‪44‬‬
‫מ ק ו ם לחשוב ט ה ק ב ו צ ו ת ה ר ג י ט ו ת ל ע י כ ו ב א י נ ן מ ע ו ר ב ו ת ב א ו פ ן ישיר ב ק י ט ו ר‬
‫ה ם ו ב ס ט ר ט א ו ב ת ה ל י ך ה ק ט ל י ט י ‪ .‬התמרת ק ב ו צ ו ת פ ו נ ק צ י ו נ ל י ו ת של ח ל ב ו נ י ם‬
‫י כ ו ל ה ג ם ל ג ר ו ם ל ש י נ ו י י ם ב מ ב נ ה ו ע ל י ד י כ ך ל ה ש פ י ע ב א ו פ ן ע ק י ף על פ ע י ל ו ת‬
‫מ צ א נ ו כ י ג ם כ ן ש ר ההחדרה של‬
‫האמידז ‪.‬‬
‫ע ד כ ד י ‪ ,90%‬ל א ח ר שהתאים ט ו פ ל ו‬
‫כלפי‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫ב י ו ד ו א צ ט ט ‪ .‬הממצא של שתי‬
‫חומצה א מ י נ י ת מ ס ו י י מ ת ‪ ,‬הקשורות ב ק ר ו ם התא‪,‬‬
‫פעילויות שונות‬
‫ו ה מ ע ו כ ב ו ת במידה דומה‬
‫על י ד י א ו ת ו מ ע כ ב ת ו מ כ ת במחשבה על קשר פ ו נ ק צ י ו נ ל י ב י ן‬
‫הטרנספורט‪.‬‬
‫להיסטידין‬
‫נפגם‬
‫ה א נ ז י ם למערכת‬
‫ר ע י ו ן ד ו מ ה העלה על י ד י‪ ( C r a n e(72‬ל ג ב י קשר פ ו נ ק צ י ו נ ל י ב י ן‬
‫א נ ז י מ י ם מ פ ר ק י ס ו כ ר י ם ו מ ע ר כ ו ת ט ר נ ס פ ו ר ט ל ס ו כ ר י ם א ל ה בתאי א פ י ט ל ה מ ע י ‪.‬‬
‫ההבדל‬
‫בריאקטיביות בין‬
‫יודואצטט ליודואצטאמיד ידוע בספרות‪.‬‬
‫למשל פ ע י ל י ו ת ר ב א ל ק י ל צ י ה של צ י ס ט א י ן‬
‫יודואצטט‬
‫ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד לעומת זאת מתמיר‬
‫ב מ ה י ר ו ת ר ב ה י ו ת ר ת י ו ג ל י ק ו ל ט )‪ .(73‬ה ר ג י ש ו ת ה ש ו נ ה של ק ב ו צ ו ת ‪ SH‬ב מ ו ל ק ו ל ה‬
‫חלבון‬
‫ל ר י א ג נ ט י ה א ל ק י ל צ י ה נמצאה ב מ ע ר כ ו ת כ מ ו‬
‫‪( K i n a s e (74‬‬
‫‪Bovine Brane Kreatine‬‬
‫ו ‪. ( R a b b i t Muscle Aldolase(75-‬‬
‫‪ SH‬ב א נ ז י ם ק י נ ז ‪,‬‬
‫ב א ל ק י ל צ י ה טל ש נ י ש י י ר י‬
‫ה ח י ו נ י י ם ל פ ע י ל ו ת ו ‪ ,‬נמצא כ י ה ע י כ ו ב א י נ ו מ ו ח ל ט ו מ ג י ע‬
‫ל ‪ 75% -‬ג ם כאשר ה ר י א ג נ ט מ צ ו י ב י ח ס ‪ .100:1‬כ מ ו כ ן מצאו כ י ‪ ADP‬ו מ ג נ ז י ו ם‬
‫מ ג י נ י ם על ה א נ ז י ם ב פ נ י ה ע י כ ו ב ע ל י ד י‬
‫י ו ד ו א צ ט א מ י ד ‪ .‬א ל ק י ל צ י ה ט ל ט י י ר ‪SH‬‬
‫א ח ד מ ג י נ ה על ה ש י י ר ה ח י ו נ י השני מ פ נ י ח י מ צ ו ן‬
‫פעילותו‬
‫מולקולת‬
‫ו ה א נ ז י ם ט ה י נ ו ‪ 50%‬מ ע ו כ ב‬
‫י צ י ב ה י ו ת ר ‪ .‬מ נ י ח י ם כ י התמרת ‪ SH‬ח י ו נ י ג ו ר מ ת ל ש י נ ו י ב מ ב נ ה של‬
‫החלבון‪,‬‬
‫ו כ ת ו צ א ה מ כ ך ש י י ר י ם מ ם ו י י מ י ם ח ש ו פ י ם פ ח ו ת להתמדה נ ו ם פ ת ‪.‬‬
‫ג ם ב א נ ז י ם א ל ד ו ל ז נמצא כ י ה ם ו ב ס ט ר ט פ ר ו ק ט ו ז ‪ - 6 - 1 -‬ד י פ ו ס פ ט מ ג ן על ש י י ר י ‪SH‬‬
‫החיוניים‬
‫מ פ נ י התמרה‪ .‬מ ת ו ך שלושת ש י י ר י ה ‪ SH -‬ה ח ש ו ב י ם ל פ ע י ל ו ת ו ה ק ט ל י ט י ת‬
‫ש נ י י ם מ ג י ב י ם ב מ ה י ר ו ת עם י ו ד ו א צ ט א מ י ד ו א י ל ו השלישי מ ג י ב בקצב הרבה י ו ת ר‬
‫איטי‪.‬‬
‫‪45‬‬
‫פ ע י ל ו ת פפטידטית של מיקופלסמוז‬
‫‪4.3‬‬
‫לאחר שאפיינתי את ה ס פ צ י פ י ו ת של האמידז‬
‫של‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫ו ‪ A. laidlawii -‬לנפתילאמידינו של החומצות ה א מ י נ י ו ת ה ש ו נ ו ת ‪ ,‬בדקתי‬
‫פ ע י ל ו ת ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז מ י ם ב ה י ד ר ו ל י ז ה של ד י ‪ -‬ו א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם ‪ .‬פ ע י ל ו ת‬
‫פפטידטית של‬
‫‪ M.fermentans‬נבדקה ל ג ב י די ו ט ר י פ פ ט י ד י ם של החומצות‬
‫ה א מ י נ י ו ת ה ב ס י ס י ו ת ‪ ,‬כ מ צ ו י י ו בפרק ‪ . 3 . 3‬פ ע י ל ו ת פפטידטית של ‪A.laidlawii‬‬
‫נבדקה כלפי א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של )‪ (L‬א ל נ י ן וכן א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של )‪(L‬‬
‫ו ‪ (D) -‬א ל נ י ן המסודרים ברצף מ ס ו י י ם‬
‫‪4.3.1‬‬
‫פ ע י ל ו ת פפטידטית של‬
‫‪Mycoplasma fermentans‬‬
‫פ ע י ל ו ת ם הפפטידטית של תאי‬
‫של ‪()L‬‬
‫חומצות‬
‫‪:‬‬
‫‪, Lys-Ala; His-Ala‬‬
‫)־‪Lys-(Orn‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ M. fermentans‬נבדקה עם ה ד י ‪-‬‬
‫;‪Lys-Lys‬‬
‫אמינו;‪Ala-Lys0‬‬
‫;‪rn‬־‪rn0‬‬
‫ו ה ט ר י ‪ -‬פ פ ט י ד י ם ‪0 :‬־(‪ ( r n 0 ; )rn; )Ala‬־ ‪A l a‬‬
‫;‪(rn0) Lys‬״‬
‫‪2‬‬
‫‪n‬‬
‫)‪ fL(LD‬שהוכנו כמתואר בפרק ‪. 3.3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫תוצרי ה פ י ר ו ק ז ו ה ו באופן א י כ ו ת י על‬
‫י ד י השוואת נ ד י ד ת ם ב כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה ל נ ד י ד ה של ס מ נ י ם י ד ו ע י ם ‪.‬‬
‫בדיקת ה פ ע י ל ו ת נעשתה על י ד י הדגרת תאים בתמיסת מלחים‬
‫א י ז ו ט ו נ י ת עם הפפטיד המומס בבופר ו ר ו נ ל ‪ ,‬ב ‪ . pH8.3 -‬כמות דומה‬
‫של תאים הודגרה ב מ ק ב י ל ‪ ,‬אך בהעדר סובסטרט‪ ,‬כ ב י ק ו ר ת לאפשרות של‬
‫שיחדור חומצות א מ י נ י ו ת ל מ ד י ו ם ‪ .‬כעבור שעתיים של הדגרה‪ ,‬תוך‬
‫ט י ל ט ו ל קל ב ‪ ,37°C -‬ה ו פ ר ד ו התאים על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה‬
‫ב ‪ ,(-Beckman)M i c r o f u g e‬על טיפת שמן בעלת צ פ י פ ו ת של ‪.g/cc1.024‬‬
‫תוצרי ה פ י ר ו ק ב ת ס נ י ו ז ו ה ו על י ד י כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה על נ י י ר ווטמו‬
‫מם׳‬
‫‪ 1 ,‬ב מ ע ר כ ת הממיטים‪ :‬ב ו ט נ ו ל )‪ :(30‬חומצת חומץ )‪ :(6‬מ י ם ‪:(j24‬‬
‫פירידיו‬
‫)‪ , v/v (20‬משך ‪ 40‬שעות ל פ י‪. ( W a l e y and Watson(52‬‬
‫פתוח הכרומטוגרם נעשה עם ר י א ג נ ט נ י נ ה י ד ר י ו ‪ ,‬כמתואר בפרק ‪. 3.4‬‬
‫תוצאות בדיקת ה פ ע י ל ו ת הפפטידטית של‬
‫ב צ י ו ר ‪ 5‬ובטבלה ‪. 4‬‬
‫‪ M. fermentans‬מ ו ב א ו ת‬
46
‫‪47‬‬
‫ז י ה ו י כרומטוגרפי של תוצרי הפעילות הפפטידטית‬
‫ציור מס‪:5 .‬‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫טל‬
‫תערובת הריאקציה הכילה בנפח סופי טל ‪ 0.5‬מייל‪ 0.2 :‬מייל תרחיף‬
‫פפטיד;‪mM50‬בופר ורונל‬
‫תאים )כ‪ -0.2‬מ״גחלבון(‪mM;50‬‬
‫‪ ,‬בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת ‪ .‬הדגרה ‪ 120‬דקותב‪> , C-37°‬‬
‫ב‪8.3 -pH‬‬
‫‪ - A‬מיקופלסמה אטד הודגרו עם הפפטידים‪Lys -1 :‬־ )‪;(Orn‬‬
‫ס מ נ י ם ‪;Lys - 5‬‬
‫‪:‬‬
‫‪(rn0) -2‬־‪Lys‬־‪> , A l a - 4 ;Lys-Lys -3;Lys‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫‪Ala‬־‪;Orn-6‬‬
‫;‪Lys‬־‬
‫) ‪ ( 0 r n‬־ ‪2‬‬
‫‪ L y s‬־‬
‫‪2‬‬
‫‪-7‬‬
‫; ) ‪ 0 r n‬־ )‪;rn0-(Ala‬‬
‫) ‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4-Ala‬־ )״(‪Orn‬‬
‫ )‪;rn0-(Ala‬‬‫‪ r n ) -4‬־ סמנים‪-Ala;5 :‬‬
‫‪2‬‬
‫פטידים‬
‫‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2-Ala‬־ )‪;(0rn) -3 ;(Orn(0‬‬
‫‪«(0rn) -7 ;Orn -6‬‬
‫)כוןן הנדידה מימין לשמאל בתמונה‪ ,‬ד ה י י נ ו מלמעלה למטה‬
‫בכרומטוגרם(‪.‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫תוצאות הכרומטוגרם שהובא בציור ‪ 5‬סוכמו בטבלה ‪.4‬‬
‫טבלה ‪:4‬‬
‫הידרוליזה של ד י ‪ -‬וטריפפטידים על ירי ‪M, fermentans‬‬
‫‪hydrolysis‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‬‫‪-‬‬
‫תנאי‬
‫‪products‬‬
‫)‪His; Ala; (His-Ala‬‬
‫‪Lys; Ala‬‬
‫‪Ala; Lys‬‬
‫‪Lys‬‬
‫)‪Ala;(Orn‬‬
‫‪2‬‬
‫‪substrate‬‬
‫‪His-Ala‬‬
‫‪Lys-Ala‬‬
‫‪Ala-Lys‬‬
‫‪Lys-Lys‬‬
‫)‪rn‬־)‪Ala0‬‬
‫‪ Ala‬־)‪(0rn‬‬
‫)‪(Orn‬‬
‫‪2‬‬
‫‬‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫)‪Lys; (Orn‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪(Orn‬־‪Lys‬‬
‫‪(0rn) -Lys‬‬
‫ה נ ם י ו ן ז ה י ם ל ת נ א י ם שפורטו בהסבר ל צ י ו ר ‪. 5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪48‬‬
‫טבלה ‪ 4‬מראה שתאי‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫מפרקים שיירי ל י ז י ן‬
‫ואלניו מן הקצה האמיני טל הפפטידים שנבדקו‪ .‬מאידך‪ ,‬פפטידים‬
‫שהכילו אורניטיו בקצה האמיני לא התפרקו‪ .‬הידרוליזה ליד שייר‬
‫טל ל י ז י ן או אלניו אינה יוצאת לפועל כאשר הקבוצה ה‪ -‬מ‪-‬אמינית‬
‫מותמרת‪ ,‬למשל על ידי טייר אצטיל‪ .‬דיפפטידים המכילים ל י ז י ן ‪,‬‬
‫היםטידיו או אלנין מתפרקים בדרך כלל בשלמות‪ .‬בדיקת פעילות‬
‫‪fermentans‬‬
‫‪)P‬לגבי‬
‫כרומטוגרפית‬
‫‪.‬‬
‫‪M‬‬
‫(‬
‫‪0‬‬
‫‪3‬‬
‫‪6‬‬
‫‪m‬‬
‫‪,‬‬
‫‪,‬‬
‫‪4.3.2‬‬
‫‪.‬‬
‫פעילות פפטידטית של‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫פעילותם של תאי ‪ A. laidlawii‬בפירוק פפטידים של אלניו נבדקה‬
‫עם שתי סדרות של פפטידים‪ ,‬אשר הוכנו כמתואר בפרק ‪. 3.3‬‬
‫א‪.‬‬
‫ב‪.‬‬
‫אוליגופפטידים של ‪-1.‬אלנין המכילים עד ששה שיירים‪.‬‬
‫אוליגופפטידים של ‪-L‬‬
‫ו ‪ -‬ס ־ א ל נ י ן ‪ ,‬המכילים עד תשעה‬
‫שיירים‪ ,‬ומסודרים ברצף מסויים לפי הנוסחה ‪ H L(LD) 0H‬״‬
‫‪n‬‬
‫תוצרי הפירוק זוהו באופן איכותי על ידי כרומטוגרפיה במשטח‬
‫דק )‪ (TLC‬ונקבעו באופן כמותי על ידי הפרדה על עמודת‬
‫ה‪-‬‬
‫‪ Amino Acid Analyzer‬כפי שפורט בפרק ‪. 3.4‬‬
‫בדיקת הפעילות הפפטידטית של ‪ A. laidlawii‬נעשתה על ידי‬
‫הדגרת התאים עם הפפטיד בבופר ורונל ב‪ , pH8.3 -‬בתמיסת מלחים‬
‫י ת ‪ .‬ההדגרה‪ ,‬ב‪ ,C37° -‬נמשכה מ‪-‬‬
‫‪1 5 0 3 0‬‬
‫דקות עד‬
‫דקות‪.‬‬
‫התאים הורחקו מתערובת הריאקציה על ידי צנטריפוגציה‪ .‬כביקורת‬
‫שימשה דוגמה של תאים ששהתה באותם תנאי הדגרה‪ ,‬אך בהעדר סובסטרט‪.‬‬
‫תוצרי הפירוק נבדקו בתםנין על ידי הפרדה בכרומטוגרפיה בשכבה‬
‫דקה על פלטות צ ל ו ל ו ז ‪ ,‬עם ה נ ו ז ל המפתח‪ :‬בוטנול )‪ :(4‬חומצת חומץ‬
‫)‪: (1‬‬
‫מים נ ! ( ‪ v/v ,‬״‬
‫התוצאות מובאות בציורים ‪ 6‬ו ‪. 7 -‬‬
‫‪49‬‬
‫‪L-ala‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪(a1a‬־‪L‬‬
‫‪3‬‬
‫)‪(a1a‬־‪L‬‬
‫‪6‬‬
‫)‪L-(ala‬‬
‫‪(ala) +M‬‬
‫‪2‬‬
‫‪(ala) +M‬‬
‫‪3‬‬
‫‪(ala) +M‬‬
‫‪5‬‬
‫‪(ala) +M‬‬
‫‪g‬‬
‫ציור מם‪:6 .‬‬
‫זיהוי כרומטוגרפי טל תוצרי הפעילות הפפטידטית‬
‫של‬
‫‪ A. laidlawii‬לגבי ‪ L-Ala‬אוליגופפטידים‬
‫תערובת הריאקציה הכילה בנפח םופי של ‪ 0.5‬מ״ל‪ :‬תאי מיקופלםמה‬
‫בכמות המתאימה לכ‪ -0.2‬מ״ג חלבון; ‪ 50mM‬פפטיד;‪mM50‬בופר ורונל‬
‫ב‪ , 8 . 3 -PH‬בתמיסת מלחים איזוטונית‪ .‬הדגרה ‪ 30‬דקותב‪ C-37°‬״‬
‫דוגמה של ‪ 10‬מיקרוליטר מהתסנין‪ ,‬לאחר הרחקת התאים‪ ,‬הושמה על‬
‫פלטת ה‪ TLC -‬״ ההרצה מלמטה למעלה בוצעה במיכל סגור‪ ,‬רווי באידי‬
‫הנוזל המפתח‪ ,‬עד שהנוזל הגיע לקצה המשטח )כ‪ 90-‬דקות(‪.‬‬
‫‪- M‬‬
‫מסמל מיקולפסמה‪.‬‬
‫מציור ‪ 6‬ניתן לראות שתאי ‪ A. laidlawii‬מפרקים אוליגופפטידים‬
‫טל ‪-1.‬אלנין לאלנין‪ ,‬באופן כמעט מלא‪ ,‬בתנאי הנסיןן‪.‬‬
‫פעילות תאי ‪ A. laidlawii‬נבדקה גם לגבי פפטידים של אלנין‬
‫המכילים עד תטעה שיירים והמסודרים לפי הרצף )‪ ,L(LD‬וכן כלפי‬
‫אלנין פפטיד המכיל את הרצף ‪ LL‬בקצה הקרבוקםילי‪ .‬התוצאות מובאות‬
‫בציור ‪. 7‬‬
50
B
r
‫־‬
LL
LL+M ;
LLD
f
LLD+M
LLDLD
ZLLD
LLDLD+M
- ZLLD+M
‫ ־‬M
M
L-ala
LLD
t
- LLD+M
DLL
i
j; DLL+M
•i
}' AcDLL
j:
1 AcDLL+M
‫‪51‬‬
‫ציור מס‪:7 .‬‬
‫ז י ה ו י כרומטוגרפי של תוצרי הפעילות הפפטידטית‬
‫של ‪ A. laidlawii‬לגבי אלנין אוליגופפטידיס‬
‫המכילים שיירי ‪L‬‬
‫ו‪D -‬‬
‫תערובת הריאקציה הכילה בנפח סופי של ‪ 0.5‬מייל‪ :‬ו‪;0‬י מיקופלםמה‬
‫בכמות המתאימה‬
‫לכ‪-0.2‬‬
‫מייג חלבון; ‪ mM‬פפטיד; ‪ mM50‬בופר ו ר ו נ ל‬
‫ב‪ ,8.3pH -‬בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת ‪ .‬הדגרה נמשכה‬
‫‪0‬‬
‫‪3‬‬
‫‪-‬‬
‫דקות ב ‪ 3 7 ° 0‬״‬
‫דוגמה של ‪ 10‬מיקרוליטר מהתםנין‪ ,‬לאחר הרחקת התאים‪ ,‬הושמה על‬
‫פלטת ה‪ TLC -‬״‬
‫‪- M‬‬
‫מסמל תאי מיקופלסמה‪.‬‬
‫נראה כי תאי המיקופלםמה מפרקים ‪ a17‬מהקצה האמינו‬
‫‪L-A‬‬
‫טרמינלי של אלניל אוליגופפטידים ברצף )‪) L(LD‬חלק א(‪ .‬הפפטידז‬
‫אינו‬
‫מפרק דיפפטיד של אלנין )‪ ,(LD‬ב נ י ג ו ד לפירוק מלא של )‪) (LL‬חלק ב(‪.‬‬
‫כמו כן אין האנזים מסוגל לפרק את האלנין הטרמינלי כאשר הקבוצה‬
‫ה‪-(* -‬אמינית חסומה‪ .‬הפפטידז‬
‫א י נ ו מפרק את הרצף )‪ (LL‬כאשר נמצא בקצה‬
‫הקרבוקםילי כמו בפפטיד ‪ ,DLL‬לעומת פירוק אלניו כאשר רצף זה מצוי‬
‫בקצה האמיני בפפטיד ‪) ,LLD‬חלק ג ( ‪ .‬דוגמה של תאים בכופר‪ ,‬ללא פפטיד‪,‬‬
‫משחררת בפרק זמן ההדגרה כמות כה זעירה של חומצות אמיניות שאינה‬
‫מפריעה ל ז י ה ו י אלנין חופשי בהשוואה לנדידתו של הסמן )חלק א(‪.‬‬
‫בדקנו גם את הפעילות הפפטידטית של ‪ A. laidlawii‬לגבי פפטידים‬
‫המכילים חומצות אמיניות אחרות ו ‪ (L) -‬אלנין בקצה האמיני או‬
‫הקרבוקסילי‪.‬‬
‫תוצאות נםיון כזה מובאות בציור ‪. 8‬‬
‫תוצאות הבדיקה הכרומטוגרפית מראות כי הפפטידז של ‪A. laidlawii‬‬
‫בעל פעילות אמינופפטידז אך במידת מה גם קרבוקםיפפטידז ‪ .‬הפפטיד‬
‫‪ Ala-Gly-Gly‬התפרק לחלוטין לאלנין ו ג ל י צ י ן ‪ .‬הפפטיד ‪ Gly-Phe-Ala‬התפרק‬
‫לאלנין‬
‫ן ג ל י צ י ן ‪ ,‬אך הפירוק לא היה מלא והופיעו גם הדיפפטיד ‪Phe-Ala‬‬
‫וכן הםובסטרט‪ .‬כאשר הקבוצה ה־ ‪-0‬אמינית של טריפפטיד זה היתה חסומה‬
‫על ידי שייר אצטיל הופיע אלנין בלבד כתוצר הפירוק האנזימטי‪.‬‬
‫‪-Phe-Ala, P h e - A‬התפרק לאלנין‬
‫ו(‬
‫תוצאה המראה כי‬
‫‪52‬‬
‫‪Phe-Ala‬־‪(Ala),‬‬
‫‪AcGly-Phe-Ala‬‬
‫‪Gly-Phe-Ala‬‬
‫‪Phe-Ala‬‬
‫‪Gly-Phe‬‬
‫‪Ala+Gly+Phe‬‬
‫‪G‬‬
‫‪5‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3‬‬
‫‪Z‬‬
‫‪1‬‬
‫צ י ו ר מם‪:8 .‬‬
‫פ ע י ל ו ת פ פ ט י ד י ת של ‪ A. laidlawii‬כלפי פ פ ט י ד י ם‬
‫המכילים )‪ (L‬א ל נ י ן בקצר• ה א מ י נ י או ת ק ר כ ו ק ס י ל י‬
‫תערובת הריאקציה הכילה בנפח ס ו פ י של ‪ 0.5‬מ״ל‪ :‬תאי מיקופלםמה‬
‫בכמות המתאימה‬
‫לכ‪-0.2‬‬
‫מ״ג ח ל ב ו ן ; ‪ 50mM‬פפטיד; ‪ mM50‬ב ו פ ר ו ר ו נ ל‬
‫ב‪ , 8 . 3 -pH‬בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת ‪ .‬משך ההדגרה ‪ 30‬דקות ב‪ C -37°‬״‬
‫דוגמה של ‪ 10‬מ י ק ר ו ל י ט ר מ ה ת ס נ י ן ‪ ,‬לאחר הפרדת התאים‪ ,‬נלקחה להפרדה‬
‫על פלטת ה‪ TLC -‬״‬
‫‪:1-5‬‬
‫תערובת של ‪ A. laidlawii‬עם הפפטידים הבאים‪;Ala-Lys :‬‬
‫‪Ala ;Gly-Phe-Ala ;Ac-Gly-Phe-Ala ;Ala-Gly-Gly‬־‪ (Ala) -Phe‬־‬
‫‪2‬‬
‫‪6‬‬
‫‪-‬‬
‫תאי ‪A. laidlawii‬‬
‫בבופר א י ז ו ט ו נ י ‪.‬‬
‫‪53‬‬
‫פעילות האמינופפטידז‬
‫הינה הפעילות העיקרית‪.‬‬
‫מהבדיקה הכרומטוגרפית קבלנו מושג על הספציפיות טל הפפטידז‬
‫של‬
‫המיקופלםמה לחומצות האמיניות השונות ולמיקומן בקצה האמיני או‬
‫הקרבוקסילי של האוליגופפטיד‪ .‬כדי לקבוע את מידת הפירוק של פפטידים‬
‫מאורך שונה בחרנו בשיטה המאפשרת קביעה כמותית של תוצרי הפירוק‬
‫האנזימטי עם ריאגנט נינהידרין‪ ,‬לאחר הפרדתם על עמודת מחליף יונים‬
‫של ה‪-‬‬
‫‪Amino Acid Analyzer‬‬
‫הפרדת תערובת של אלנין ואלנין‬
‫בבדיקה מוקדמת כיילנו את המערכת על ידי‬
‫אוליגופפטידים מהסדרה )‪L(LD‬‬
‫‪N‬‬
‫בריכוז‬
‫ידוע‪.‬‬
‫תוצאות ההפרדה הכרומטוגרפית של אלנין אוליגופפטידים‬
‫ב‪Amino Acid Analyzer -‬‬
‫מובאות בציור ‪. 9‬‬
‫קבוע האינטגרציה)‪ ( c )(76‬לשטח מתחת לשיאים נקבע עבור אלנין‬
‫וכל אחד מן האוליגופפטידים‪ .‬בערכי ‪ c‬אלה השתמשנו על מנת לקבוע את‬
‫כמות האלנין או האוליגופפטידים בתסנין טל תערובת הריאקציה האנזימטית‪.‬‬
‫לאחר שהיתה בידינו טיטה לקביעה כמותית טל תוצרי ההידרוליזה‬
‫בדקנו את תוצרי הפעילות הפפטידטית של ‪ A. laidlawii‬לגבי אלנין‬
‫אוליגופפטידים המכילים מטלוטה עד תטעה‬
‫שיירים של אלניו‪,‬‬
‫היחידי טל אלנין המתפרק הינו האלנין ה‪^ -‬טרמינלי‪.‬‬
‫תוצאות נםיון כזה מתוארות בטבלה ‪.5‬‬
‫כאשר השייר‬
‫‪54‬‬
‫‪o‬‬
‫‪6‬‬
‫)‪Ime(min‬‬
‫צ י ו ר מ ם ‪:9 .‬‬
‫‪0‬‬
‫‪T‬‬
‫הפרדת א ל נ י ן‬
‫ו א ל נ י ן ‪ -‬א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם על ע מ ו ד ת‬
‫‪ Dowex-50‬של‬
‫‪Amino Acid Analyzer‬‬
‫ת ע ר ו ב ת של א ל נ י ן‬
‫ו א ל נ י ן ‪ -‬א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם ה ו כ נ ה ב ר י כ ו ז של‬
‫‪ 0 ymoles05‬ב נ פ ח של ‪ 1‬מייל מ י ם ‪ .‬מ ת מ י ס ת ז א ת נ ל ק ח ו‬
‫־‬
‫מייל‪0.5‬‬
‫ל ע מ ו ד ת ‪ 5 0‬־ ‪ Dowex‬מ ם ‪ 1 .‬ה ס ט נ ד ר ט י ת של מ כ ש י ר‬
‫ה כ ו פ ר י ם כדלקמן‬
‫‪.‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-‬‬
‫‪.‬‬
‫ס ו ד י ו ם ציטרט‬
‫םודיום‬
‫ל‪3.25pHM‬‬
‫כ ל ו ר י ד ל‪« 5pH« -25‬‬
‫‪B‬‬
‫ו ‪ -‬״‪M ;pH1.225‬‬
‫םודיום‬
‫ציטרט־‪4‬‬
55
‫ש‬
(‫ יל‬OI M
CI <t ‫י ז‬
‫•)ז‬
fl•
o
‫ש‬
‫ש‬
r‫־‬
j —
o
n
‫ש‬
<c o
E
3-
‫ ו‬in
O •‫׳‬-
‫י‬3-
o
00
cr>
•‫־‬3
CM
vo ‫י‬-‫ו‬
o‫״‬v 1
—
1
O
o
‫י—י‬
o
O
o
n
‫ש‬
r/‫י־‬
X
n.
S_ w
‫>> כד‬s«
‫י‬
<S‫־‬
«d‫־‬
«3‫־‬
«c
O
o
o
o
1 m
o •‫׳‬s- w
‫י‬
O
o
o
>7‫ו‬0
O
o
rz
••
o
*‫־‬3
u‫>־‬
O
vo
CO
vo
LO
vo
a
‫מ‬
o
‫ש‬
in
ro Q)
o
p.
VO
ro
O
in
O
CO
10
o o o o
co
o
CM
Q
oo
v '
•
c
CM
I
9
o
o
‫ש‬
o
'5
CO
o
o
O
CM
oo
‫נח‬
‫כד‬
1
•—
•
O •r-
s- in
‫«&י< נ ד‬
<<‫׳‬3:
o
n
r—‫ם‬
VO
‫ש‬
m
n
n
/‫ד‬
c
‫ש‬
CO
o
3.
1 in
O •‫׳‬s- in
‫די‬
in
o•
o
oo
•
00
zc
a.
rz
rr•
3
to
­ ‫ ס‬so (‫ ע‬E ro
s_ -t->
a. o 1- J3
­‫ כי‬+-> 3
O
C
o
o
‫י‬0
o
LO
G
r»
a
*‫י‬
n
n
<—
‫•ת‬
n
o
‫ת‬
1
r•
n
VO
c!
o
r~
r•
r-
a
rz
5>
.Tv
rz
ci
‫פ‬
/‫י־‬
CO
a
n
o
ci
‫׳—י‬
1
o
n
C
E:
IT)
o
o9
o
•
a
-
c
/‫י‬
li.
r
r—
S\
/‫י‬
o
li.
r‫־‬
rz
Cl
o
n
rr-‫י‬
‫ד׳‬
ri.
c
/—
ri —
c
‫ג‬:
c
3
in
a
3
a
Pv
-Tv
V—
r:
Cl
c
C
r
n
‫ג‬:
o
LO
1
‫מ‬
/‫י‬
a
‫פ‬
aj
M
>>
X
r• =
‫ש‬
r‫־‬
r*
O
*
f
‫די‬
r
j \
c
rz
n
1—
£3
?1
r•
<—
‫סי‬
‫ש‬
‫־‬s:
n
n
•r—
<J
o
cz
• r—
E
•
X
r\
Jr*\
J—
o
rz
T—1
rz
r
CM
O
l_>
a
CL
,—
c
n
a
n
n:
^
Pv
a!
CO
a
O
/‫י‬
-Tv
Cl
‫י־׳‬
JN
?1
‫מ‬
‫״‬
r:
c
o
ro
E
*‫ר‬
‫ן‬/‫•י‬
t—
s_
D
rz
‫די‬
X
<u
s
o
j —
‫ג‬:
Pv
‫מ‬
,—
Cl
1—
>‫ה‬
ro
,—
n
y\
n
O
rr-
c
‫פ‬
a)
‫ש‬
n.
>\
rz
‫פ‬S3
1‫ד‬
a ro
c
Pv <c
rz
r
r—
a
—‫ו‬
r~
n
a
rz
r‫־‬
c
rz
Q
­‫ו‬
r‫־‬
a!
1—
S>
s\
rz
c\
v '
-Tv
/‫י‬
>1
r
n
a
4N
1
r‫־‬
r—
>—
1
—
c
—
o
r
ci
r
ar• .
‫ג‬:
c
ro
n
,—•
2:
f ‫־‬
‫בד‬
ai 4 - ‫ש‬
<-> c
u •‫׳‬3
E o o
‫ת‬
j—•
o
‫ —׳‬o
•a: E
r—
*—
n
•
in
>‫ע‬
ro 1
—
ci
r‫־‬
r‫־‬
• r—
r‫־‬-
r‫־‬
‫ש‬
o
LO co
>-1
•*
o
r‫־‬
‫ש‬
o
O
‫פ‬
1
—
1
o
O
in
CO
‫ש‬
1—
‫—׳‬
‫ ו‬in
o •‫׳‬S- in
‫>> פד‬j
o
a
r—
»
X
‫כ‬
Q
<
r‫־‬
tLO
^-
c
1
/‫י‬
o
/- ^
‫ג‬:
r~
•
a
a
n1
1
‫ש‬
n
r~
JS
n
r~
>X
Pv
n
ft.
r1
‫ש‬
/
o
<<‫־־׳‬
<
a
r
o
rz
rz
CTv
CM
r-l
o
‫ש‬
f—V
LO
*‫ד־‬
*\
/‫י‬
an
<<53
o
v—
E
^‫׳‬
n
n
00
r
‫ש‬
ac
S- m
‫ס־‬
rz
rz
r
^
r
rz
c
‫יד‬
1 in
O •r-
ft.
i —
‫‪56‬‬
‫מכמות ה א ל נ י ו שנקבעה ב ת ס נ י ן של תערובת הריאקציה עם תאי‬
‫המיקופלסמה‪,‬‬
‫ה ו ר ד נ ו את כמות ה א ל נ י ן שנמדדה ב ב י ק ו ר ת של תרחיף תאים‬
‫שעברו הדגרה באותם תנאים אך בהעדר הםובםטרט‪ .‬למשל‪ymoles006,< ,0‬‬
‫א ל נ י ו שוחרר ל מ ד י ו ם כעבור ‪ 60‬דקות ו ‪0ymoles01 -‬״ כ ע ב ו ר ‪ 150‬דקות‪.‬‬
‫ב ד ק נ ו האם הפרדת הפפטידים מתאי המיקופלסמה בתערובת ההדגרה‪ ,‬בשיטת‬
‫ההרחפה ההפרדתית על טיפת שמו‪ ,‬אכו כמותית ו א י ו טפיחה של הפפטיד‬
‫ל ‪ ,,pellet -‬זאת נעשה על י ד י הדגרת התאים עם א ו ל י ג ו פ פ ט י ד של‬
‫אלניו‬
‫שאינו משמש סובסטרט כמו‬
‫‪4‬‬
‫)‪ ,(LD‬בתנאים הדומים לאלה בהם‬
‫בוצע ה נ י ס ו י ל ע י ל ‪ .‬ה ת ס נ י ו של תערובת הריאקציה‪ ,‬טחופרד על י ד י‬
‫צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה על טימו שמו‪ ,‬נבדק ב ‪-‬‬
‫‪ Amino Acid Analyzer‬ונמצאה‬
‫ב ו כמות הפפטיד שהוכנסה באופן מ ק ו ר י לתערובת ב ג ב ו ל ו ת ד י ו ק של‬
‫כ ‪. ±10% -‬‬
‫ד י וו בפרק ‪4.5‬‬
‫על פ ע י ל ו י ו ת פפטידז ו א ר י ל א מ י ד ז הקשורות בקרום התא של‬
‫‪fermentans‬‬
‫ד ו ו ח על י ד י נ ו נ‪ .(64‬ה פ ע י ל ו ת הפפטידטית של‬
‫‪Mycoplasma‬‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫ה י נ ה כלפי די וטרי פ פ ט י ד י ם ה מ כ י ל י ם ה י ס ט י ד י ן ‪ ,‬ל י ז י ן ובמידה פחותה א ל נ י ו ‪.‬‬
‫הפרוק מתבצע מהקצה האמיני ו מ ו ת נ ה בכך שהקבוצה ה‪-(* -‬אמינית הופשלה‪.‬‬
‫הפפטידז א י נ ו פעיל בפרוק פ ו ל י _ ‪ - 1‬ל י ז י ן ‪ .‬ה ס פ צ י פ י ו ת של הפפטידז טל‬
‫‪ M. fermentans‬חופפת את ה ס פ צ י פ י ו ת של האמידז כלפי ‪ - 3‬נ פ ת י ל א מ י ר י ם של‬
‫החומצות ה א מ י נ י ו ת ה ב ס י ס י ו ת ה י ס ט י ד י ן ל י ז י ו‬
‫ו א ר ג י נ י ו ‪ .‬גם ת ח ו ם ה ‪ pH -‬של‬
‫שתי ה פ ע י ל ו י ו ת ‪ ,‬הפפטיד ו ה א מ י ד ז ‪ ,‬דומה‪8.3-8.6-pH‬‬
‫״ י ת כ ן ושתי ה פ ע י ל ו י ו ת‬
‫קשורות באותה מ ו ל ק ו ל ה או קומפלכס ‪.‬‬
‫פ ע י ל ו ת פפטידטית דומה‪,‬אך בעלת ס פ צ י פ י ו ת שונה‪ ,‬מצאנו גם בהאי‬
‫‪Acholeplasma laidlawii‬‬
‫ו ב ק ר ו ם המבודד מתאים א ל ו )‪ .(65‬הפפטידז של‬
‫‪ laidlawii‬מגלה ס פ צ י פ י ו ת בפרוק פ פ ט י ד י ם באורך שונה‪ ,‬מ ‪ -‬ד י ועד נ ו נ פ פ ט י ד ‪,‬‬
‫כאשר ה ב י ק ו ע מתרחש ל י ד ה ק ר ב ו ק ם י ל של ‪ - 1 .‬א ל נ י ו‬
‫הפפטידז‬
‫וגליצין‪.‬‬
‫ה ס פ צ י פ י ו ת של‬
‫ד ו מ ה ל ז ו של ה א מ י ד ז ה פ ע י ל ב פ י ר ו ק ‪ 6‬־ נ פ ת י ל א מ י ד של א ל נ י ן ‪ .‬מ צ א נ ו‬
‫כי ם־אלנין‬
‫ה נ ו ט ל ה ל ק בקשר ה פ פ ט י ד י ) כ מ ו ‪(LD‬‬
‫מ ו נ ע את ה ה י ד ר ו ל י ז ה ו ד ר ו ש‬
‫ר צ ף של ש י י ר י א ל נ י ן מ ה ס ו ג ‪ ,LLD‬כאשר ם ־ א ל נ י ן במרחק של ל פ ח ו ת ש נ י ש י י ר י ם‬
‫מהקשר המתבקע )‪.(LLD‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה ע י ק ר י ת של ה א ק ס ו פ פ ט י ד ז ה י א א מ י נ ו פ פ ט י ד ט י ת ‪.‬‬
‫ר א י נ ו כ י א ל נ י ן ט ר י פ פ ט י ד מ ה ס ו ג ‪ DLL‬א י נ ו מתפרק ו כ ן ה ט ט ר פ פ ט י ד‬
‫‪Phe-Ala‬־ )‪ (Ala‬מתפרק ל ‪ Ala -‬ו ‪ ,Phe-Ala -‬מ א י ד ך ‪ ,‬מ צ א נ ו פ ע י ל ו ת נ מ ו כ ה של‬
‫‪2‬‬
‫קרבוקםיפפטידז‬
‫כרומטוגרפית(‪.‬‬
‫שהטריפפטידים‬
‫כ ל פ י ה פ פ ט י ד ‪Gly-Phe-Ala‬‬
‫מעניו‬
‫) ה פ פ ט י ד עצמו ה י ה נ ק י ל פ י ב ד י ק ה‬
‫ל צ י י ן כ י ה פ י ר ו ק של ה ד י פ פ ט י ד י ם ה י ה מ ל א ב ע ו ד‬
‫התפרקו ב א ו פ ו‬
‫ח ל ק י ‪ ,‬ב פ ר ק ז מ ו של ‪ 30‬ד ק ו ת ‪ .‬האם ע ו ב ד ה ז ו‬
‫מבטאת את ה ד י פ ו ז י ה של ה ס ו ב ם ט ר ט אל ה א נ ז י ם ה מ מ ב ר נ ל י ‪,‬‬
‫התלויה כמובו‬
‫בגדלו‪,‬‬
‫א ו את האפשרות ש ה ד י פ פ ט י ד י ם ח ו ד ר י ם ל ת ו ך התא ו מ ת פ ר ק י ם ע ל י ד י פ פ ט י ד ז ו ת‬
‫ציטופלסמטיות‬
‫ב ע ו ד ש ה ט ר י פ פ ט י ד י ם א י נ ם ע ו ב ר י ם את מ ח ס ו ם ה ח ד י ר ו ת ‪.‬‬
‫נראה ל פ י‬
‫ת ו צ א ו ת שהתקבלו בהמשך ב ב ד י ק ת ה ח ד י ר ו ת ל א ל נ י ו כ י האפשרות ה ר א ש ו נ ה ס ב י ר ה‬
‫יותר‬
‫במערכת ז ו ‪ .‬השימוש ב פ פ ט י ד י ם של א ל נ י ן‬
‫כםובסטרטים‬
‫האלניו‬
‫ל פ פ ט י ד ז של ‪A. laidlawii‬‬
‫ה‪-[^-‬טרמינלי‪,‬‬
‫ה מ ס ו ד ר י ם ל פ י הרצף‬
‫‪n‬‬
‫)‪L(LD‬‬
‫א י פ ש ר ל ק ב ו ע את מ י ד ת ה פ י ר ו ק של‬
‫ב ת ל ו ת ב ג ו ד ל ה פ פ ט י ד ‪ .‬מ צ א נ ו כ י עם ע ל י ת א ו ר ך ה פ פ ט י ד‬
‫ק ט נ ה מ י ד ת ה פ י ר ו ק ‪ ,‬מ ‪ 60% -‬פ י ר ו ק של ה ט ר י פ פ ט י ד ‪ LLD‬ל ‪ 40% -‬פ י ר ו ק של‬
‫ה נ ו נ פ פ ט י ד ^)‪L(LD‬״ ל ע ו מ ת ז א ת ‪,‬‬
‫פ י ר ו ק ה ד י פ פ ט י ד ‪ LL‬ה י נ ו מ ל א ‪ .‬הארכת‬
‫משך‬
‫ה א י נ ק ו ב צ י ה מ ‪ 30 -‬ד ק ו ת ל ‪ 150 -‬ד ק ו ת איפשרה פ י ר ו ק של ע ו ד כ ‪5-10% -‬‬
‫מהסובםטרט‪ ,‬אך ה ת ו צ א ו ת בפרקי ה ז מ ו‬
‫ה א ר ו כ י ם פ ח ו ת מ ה י מ נ ו ת ע ק ב ‪leakiness‬‬
‫של ה ת א י ם ב ת מ י ס ה ה ש ו נ ה מ מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל שלהם‪.‬‬
‫ת ו צ א ו ת אלה‬
‫א ת ר ה ק י ש ו ר של ה פ פ ט י ד ז מ ס ו ג ל ל ק ש ו ר ב א ו פ ו א ו פ ט י מ ל י‬
‫ארוכים‬
‫יותר יתפרקו‬
‫נ י ת נ ו ת ל ה ס ב ר אם‬
‫די‪-‬פפטיד‪.‬‬
‫פפטידים‬
‫ב י ע י ל ו ת ה ו ל כ ת וקטנה עקב ע י כ ו ב י ם סטארים ה נ ו ב ע י ם‬
‫מהפרעה של ה ק י ש ו ר א ו של ה ת ה ל י ך ה ק ט ל י ט י ‪.‬‬
‫‪58‬‬
‫‪Choules‬‬
‫ו ‪ ( G r a y(77-‬נתקלו גם הם ב פ ע י ל ו ת פפטידז הקשורה לממברנר‪.‬‬
‫של ‪ A. laidlawii‬בעת שהכינו פרפרטים מ מ ב ר נ ל י י ם לצורר מ י פ ו י פ פ ס י ד י של‬
‫ה ח ל ב ו נ י ם ‪ .‬כאשר השתמשו בממברנות לא ד נ ט ו ר ט י ב י ו ת )בהעדר ‪ (SDS‬מצאו כי‬
‫חלק נ י כ ר מהחלכון הממברנלי עבר פ י ר ו ק ‪ .‬הם בדקו את ה פ ע י ל ו ת של הפרפרט‬
‫הממברנלי כלפי ד י פ פ ט י ד י ם ו ד י פ פ ט י ד ‪ -‬א מ י ד י ם ם י נ ט ט י י ם‬
‫כ‬
‫מ‬
‫ו‬
‫;‪NH‬׳ ‪Leu‬‬
‫‪2‬‬
‫‪.‬‬
‫‪ A r g - A‬׳ ‪ S e r - T y r‬ומצאו פ י ר ו ק של‪Ac-Phe-Trp80-90%‬בבדיקהשל‬
‫מצאו פ ע י ל ו ת נמוכה של ק ר ב ו ק ס י פ פ ט י ד ז ) ‪ . ( > 1 0 %‬מסקנתם היתה כ י ה פ ע י ל ו ת‬
‫העיקרית ה י נ ה א מ י נ ו פ פ ט י ד ז ו ד י פ פ ט י ד ז ‪ ,‬אר הם לא בדקו את ה פ ע י ל ו ת כלפי‬
‫פ פ ט י ד י ם א ר ו כ י ם י ו ת ר ו כ ן לא א פ י י נ ו ת כ ו נ ו ת ק י נ ט י ו ת או ת ל ו ת ב‪ pH -‬ו י צ י ב ו ת ‪.‬‬
‫פ ע י ל ו ת של א ק ס ו פ פ ט י ד ז הקשורה לממברנות של כ ד ו ר י ו ת דם אדומות ידועה‬
‫מכבר ) ‪ . ( 7 8‬ב ח י ד ק י ם יש רק ד ו ג מ א ו ת ס פ ו ר ו ת ל פ ע י ל ו ת מ ס ו ג ז ה ‪ ,‬למשל‬
‫‪ D-Alanine Carboxypeptidase‬שנמצא ב ‪-‬‬
‫‪ subtil is‬״‪ B‬וקשור כנראה‬
‫ב ב י ו ס י נ ת י ז ה של ד ו פ ן התא ) ‪ . ( 7 9‬פ פ ט י ד ז ו ת של ח י י ד ק י ם א ו פ י י נ ו בדרר כלל‬
‫ב א נ ז י מ י ם ק ו נ ם ט י ט ו ט י ב י י ם ‪ ,‬ת ו ר ת א י י ם ‪ ,‬ה מ צ ו י י ם בפרקציה הציטופלםמטית‪.‬‬
‫א ו פ י י נ ו למשל פ פ ט י ד ז ו ת בעלות פ ע י ל ו ת ב פ י ר ו ק די וטרי‬
‫פנילאלנין‬
‫האמיני‬
‫פ פ ט י ד י ם של‬
‫ו מ ת י ו נ י ן מהקצה האמיני ) ‪ , ( 8 0‬א נ ז י ם המבקע שיירי‬
‫)‪(81‬‬
‫ו א נ ז י ם ס פ צ י פ י ל ‪-6 -‬אםפרטיל פ פ ט י ד י ם‬
‫)‪,(82‬‬
‫לויצין‪,‬‬
‫פרולין‬
‫מהק״ה‬
‫ו ל פ ח ו ת ארבע‬
‫פ פ ט י ד ז ו ת ט ו נ ו ת המבקעות קשרי ל י ז י ל ‪ -‬ל י ז י ן בדי טרי וטטרפפטידים‬
‫ליזין‬
‫על‬
‫) ‪ . ( 8 3‬פפטידז הקשור לפרקציה ה ר י ב ו ז ו מ ל י ת א ו פ י י ן על י ד י‪( M a t h e s o n(84‬‬
‫בחלבון גבה מ ו ל ק ו ל ר י ) ‪ 3 - 4 1 0‬ד ל ט ו ן ( הדורש ק ב ו צ ו ת ‪SH‬‬
‫‪5‬‬
‫שלפפטידזות ת פ ק י ד י ם ‪ ,‬בצד ב י ק ו ע של פ פ ט י ד י ם ה מ נ ו צ ל י ם‬
‫לפעילותו‪.‬‬
‫מחמדיום‪,‬‬
‫כנראה‬
‫בתהליכים‬
‫תיר ת א י י ם הקשורים ב ם י נ ת י ז ה ו פ י ר ו ק של פ ו ל י פ פ ט י ד י ם ‪ .‬תפקיד נ ו ס ף של‬
‫ה פ פ ט י ד ז ו ת י כ ו ל ל ה י ו ת בטמטם כמנטרלים טל פ פ ט י ד י ם מעכבים כמו פ פ ט י ד י ם טל‬
‫לויצין‪,‬‬
‫א ו ר נ י ט י ן או ל י ז י ן‬
‫)‪.(85‬‬
‫א נ ז י ם שהוגדר כ ‪"Peptidase like" -‬‬
‫ו‪-‬‬
‫‪ ,Arylamidase‬המשחרר‬
‫‪59‬‬
‫‪ - £‬נ פ ת י ל א מ י ן מ ‪ £ -‬־ נ פ ת י ל א מ י ד י ם של ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת נמצא ב ח י י ד ק י ם ג ר ם ‪-‬‬
‫ש ל י ל י י ם )‪(86‬‬
‫ואופיין‬
‫ו ג ר ם ח י ו ב י י ם )‪.(87,88‬‬
‫באנזים תוךתאי‪,‬‬
‫נמצאה כ ל פ י‬
‫לטרמינל‬
‫ואוליגופפטידים‪.‬‬
‫ה א נ ז י ם ב ו ד ד מ ‪aeruginosa(66-‬‬
‫קונסטיטוטיבי‪.‬‬
‫‪( P .‬‬
‫ה ס פ צ י פ י ו ת של ה א נ ז י ם ה מ נ ו ק ה‬
‫‪ - [ .‬ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ס י ס י ו ת ו נ י ט ר ל י ו ת של ד י‬
‫כאשר ה ש י י ר ה ס מ ו ך ל ח ו מ צ ה ה א מ י נ י ת ה ‪ ^ -‬ט ר מ י נ ל י ת ה י נ ו‬
‫‪ 'n-D‬א מ י נ י ת ‪ ,‬ל א מתרחשת ה י ד ר ו ל י ז ה ‪.‬‬
‫אם בעבר ה י ת ה ק י י מ ת השקפה ב ד ב ר ה ת כ ו נ ו ת ה מ י ו ח ד ו ת של פ פ ט י ד י ם‬
‫ספציפיים‬
‫כמעוררי‬
‫ג י ד ו ל )‪ ,(growth promoters‬ה ר י המחשבה ה מ ק ו ב ל ת כ י ו ם‬
‫ה י א שערכם ה ה ז נ ת י של פ פ ט י ד י ם ה ו א ב ה י ו ת ם מ ס פ ק י ם ב ב ת אחת כמה ח ו מ צ ו ת‬
‫אמיניות‪,‬‬
‫ב ת נ א י של נ ו כ ח ו ת ה פ פ ט י ד ז ה מ ת א י ם ‪ .‬למשל‪,‬‬
‫החסר פ ע י ל ו ת של ד י ג ל י צ י ן פ פ ט י ד ז א י נ ו‬
‫ש ד י פ פ ט י ד ז ה ח ו ד ר ל ת ו ך התא )‪.(89‬‬
‫המיקופלםמה‬
‫גליצין אוקםוטרופ‬
‫יכול לנצל ד י ג ל י צ י ן‬
‫ה מ י ק ו ם של ה פ פ ט י ד ז‬
‫ל ג י ד ו ל ‪ ,‬למרות‬
‫) א מ י ד ז ( של‬
‫ב ק ר ו ם התא‪ ,‬ה ש ו נ ה ב ה ש ו ו א ה ל ח י י ד ק י ם ו ד ו מ ה י ו ת ר ל ת א י ם‬
‫אאוקריוטים‪ ,‬וכן‬
‫י כ ו ל ת ה א נ ז י מ י ם האלה ל פ ר ק א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם ‪ -‬ק ש ו ר י ם א ו ל י‬
‫באופי‬
‫ה פ ר ז י ט י של מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם ז ה ה מ ת ק י י ם ב ס ב י ב ה עשירה ב ח ו מ ר י מ ז ו ן‬
‫וצריך‬
‫ל ק ל ו ט את ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת מן ה מ ו כ ן ‪.‬‬
‫‪4.4‬‬
‫א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת על י ד י ק ט י ו נ י ם חד ע ר כ י י ם‬
‫הואיל‬
‫ו מ י נ י מיקופלסמה שונים‪,‬‬
‫ב מ י ו ח ד אלה ה מ כ י ל י ם ס ט ר ו ל י ם‬
‫ב מ מ ב ר נ ה שלהם‪ ,‬מ צ ט י י נ י ם י ח ס י ת ב י צ י ב ו ת א ו ס מ ו ט י ת )‪,(67‬‬
‫נ י ת נ ה האפשרות‬
‫ל ב ח ו ן את ההשפעה של מ ל ח י ם ב ע ל י ק ט י ו נ י ם ש ו נ י ם על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת‬
‫שלהם‪.‬‬
‫‪4.4.1‬‬
‫השפעת ש י נ ו י י ם ב ר י כ ו ז ‪ NaCl‬ב מ ד י ו ם‬
‫ת ר ב י ת ‪A. laidlawii‬‬
‫לכ־‬
‫‪1 0‬‬
‫מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י נשטפה ו ר ו כ ז ה‬
‫‪ 5 x l 0‬ת א י ם ב ‪ 1 -‬מייל ת מ י ס ת מ ל ח י ם‬
‫‪ M NaCl25‬״ ‪ ( 0‬״ כ מ ו ת של‬
‫;‬
‫‪2‬‬
‫‪(0.01M MgCl‬‬
‫מייל מ ת ר ח י ף ז ה נ ל ק ח ה ל ב ד י ק ת פעילות‪0.1‬‬
‫‪60‬‬
‫א מ י ד ט י ת עם‬
‫כ ם ו ב ס ט ר ט ב ש י ט ה הפלואורומטרית‬
‫‪ N A 6‬־ ‪, L - A l a‬‬
‫) פ ר ק ‪ ( , 3 . 2‬ב ‪ 8.5PH -‬ב נ ו כ ח ו ת ר י כ ו ז י ם ש ו נ י ם של ‪ NaCl‬ב ת ע ר ו ב ת‬
‫הריאקציה‪.‬‬
‫‪-‬‬
‫ה ת ו צ א ו ת מ ס ו כ מ ו ת בטבלה ‪6‬‬
‫‪A‬‬
‫‪ L‬על י ד י‬
‫בנוכחות‬
‫‪N‬‬
‫‪6‬‬
‫‪-‬‬
‫ו צ י ו ר ‪.10‬‬
‫‪1‬‬
‫‪a‬‬
‫‪laidlawii A‬‬
‫‪0‬‬
‫ר י כ ו ז י ם ש ו נ י ם של ‪NaCl‬‬
‫‪Rate of‬‬
‫‪Hydrolysis‬‬
‫)‪(U/min‬‬
‫‪NaCl in‬‬
‫‪reaction‬‬
‫)‪mixture (M‬‬
‫‪1.36‬‬
‫‪0.175‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0.425‬‬
‫‪2.36‬‬
‫‪0.55‬‬
‫‪2.7‬‬
‫‪0.675‬‬
‫‪3.34‬‬
‫‪0.925‬‬
‫‪6.2‬‬
‫‪1.675‬‬
‫‪7.6‬‬
‫‪2.175‬‬
‫ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ב ק י ו ו ט ה ה כ י ל ה ב נ פ ח ס ו פ י של ‪1‬‬
‫‪9‬‬
‫‪ 0.1‬מייל ת ר ח י ף ת א י‬
‫ר ורונל‬
‫‪M‬‬
‫ב‬
‫כמצויין‬
‫‪m‬‬
‫‪-A.laidlawii‬‬
‫‪-‬‬
‫כ )‪ 10x5‬ת א י ם ( ;‬
‫‪ NaCl ;pH‬להשלמת ה ר י כ ו ז‬
‫המולרי‪8.5‬‬
‫ב ט ב ל ה ‪ 2.8 :‬מ י ק ר ו מ ו ל י ם של ‪ - U .L-Ala-BNA‬י ח י ד ו ת‬
‫א ר ב י ט ר ר י ו ת של פ ל י ט ה פ ל ו א ו ר ם צ נ ט י תב‪NM-410‬‬
‫״‬
‫כ ד י ל ו ו ד א שהעליה ב מ ה י ר ו ת ה פ י ר ו ק של ה ס נ ב ס ט ר ט ‪ L-Ala-gNA‬א י נ ת‬
‫ת ו צ א ה של ת ל ו ת ה פ ל י ט ה של ה ת ו צ ר ‪ - $‬נ פ ת י ל א מ י ן‬
‫את ה פ ל י ט ה ה פ ל ו א ו ר ס צ נ ט י ת של ת מ י ס ת‬
‫ב ‪nm335 -‬בטני‬
‫ריכוזי (‬
‫ב ר י כ ו ז המלח‪,‬‬
‫בדקנו‬
‫נ פ ת י ל א מ י ן ב ‪ ) 410NM -‬ע ר ו ר‬
‫‪ NaCl‬קיצוניים‪M :2‬‬
‫ו ‪, 0M2 -‬‬
‫־‬
‫וערכי‬
‫הפליטה טהתקבלו ה י ו ש ו ו י ם ‪.‬‬
‫התוצאות‬
‫ה מ ו ב א ו ת ב ט ב ל ה ע ו ב ד ו ע ל מ נ ת ל ה צ י ג את מ י ד ת‬
‫ה א ק ט י ב צ י ה ט ל ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת עם ע ל י ת ר י כ ו ז המלח ב ת ע ר ו ב ת‬
‫הריאקציה‪,‬‬
‫כאשר כ‪ 100%-‬פ ע י ל ו ת נ ל ק ח הערך שהתקבל ב נ ו כ ח ו ת‬
‫‪61‬‬
‫ציור‬
‫‪.‬‬
‫‪0.175‬‬
‫צ י ו ר מם‪:10 .‬‬
‫‪.10‬‬
‫אקטיבציה של ה פ ע י ל ו ת האמידטית של ‪A. laidlawii‬‬
‫בהשפעת ר י כ ו ז י ם ע ו ל י ם של ‪ NaCl‬בתערובת הריאקציה‬
‫מידת האקטיבציה חושבה מ ה נ ת ו נ י ם המובאים בטבלה ‪ .6‬קצב ה פ ע י ל ו ת‬
‫ב נ ו כ ח ו ת‪MNaCl0.175‬‬
‫האקטיבציה‪.‬‬
‫נלקח‬
‫כ‪-1‬‬
‫ו ב א ו פ ו יחסי חוטבה מידת‬
‫‪62‬‬
‫ה ת ו צ א ו ת ה מ ו ב א ו ת ב ט ב ל ה ‪ 6‬ו צ י ו ר ‪ 10‬מ ר א ו ת על א ק ט י ב צ י ה של‬
‫הפעילות‬
‫ה א מ י ד ט י ת פ י ‪ ,5‬עם ע ל י ת ר י כ ו ז המלח ב ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה‬
‫ה‬
‫וסקופ נ י ג ו ד‬
‫פ‬
‫ששהו ב מ ד י ו ם ה ה י פ ר ט ו נ י ב ת נ א י ב ד י ק ת ה פ ע י ל ו ת כ ־‬
‫ו‬
‫ז‬
‫ת‬
‫דקות‬
‫ב‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪ ,‬בתאים‬
‫‪1‬‬
‫‪,C25° -‬‬
‫נ י ת ן ה י ה ל ר א ו ת שהתאים ה ת כ ו ו צ ו ב מ י ד ה נ י כ ר ת א ך ע ד י י ן ה י ו ב ל ת י‬
‫חדירים ל ‪-‬‬
‫ששהו ב מ ד י ו ם ה ה י פ ר ט ו נ י‬
‫‪ . Trypan blue‬ב ד י ק ת פ ע י ל ו ת א מ י ד ט י ת ב ת ה נ י ן טל ה ת א י ם‬
‫) צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה משך ‪ 30‬ד ק ו ת ב ‪-‬‬
‫‪100,000‬‬
‫‪x‬‬
‫‪g‬‬
‫(‬
‫היתר‪ .‬ש ל י ל י ת ‪ .‬ה מ ס ק נ ה ה י א שתאי ‪ A. laidlawii‬ב מ ד י ו ם ה י פ ר ט ו נ י‬
‫מגלים‬
‫פ ע י ל ו ת אמידטית גבוהה י ו ת ר בהשוואה ל מ ד י ו ם א י ז ו ט ו נ י‬
‫ו פ ע י ל ו ת ז ו א י נ ה הופכת למסיםה עקב ה ט י פ ו ל הזה‪.‬‬
‫‪4.4.2‬‬
‫השפעת ס ו ג ה ק ט י ו ן ה ח ד ע ר כ י ב מ ד י ו ם‬
‫בדקנו‬
‫השפעתם של ק ט י ו נ י ם חד ע ר כ י י ם ש ו נ י ם על ה פ ע י ל ו ת‬
‫ה א מ י ד ט י ת של ‪A. laidlawii‬‬
‫ו בהרכב התמיסה‬
‫מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י ‪ ,‬כמתואר בסעיף הקודם‪.‬‬
‫״‬
‫ה י ו ‪1:CsCl;L i C l ; NaCl; K C‬‬
‫כאשר ר י כ ו ז ם ה ס ו פ י ב ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ה י ה ‪ 1.675M‬״ מ י ד ת ה א ק ט י ב צ י ה‬
‫אשר חושבה ב י ח ס ל מ ה י ר ו ת ה ה י ד ר ו ל י ז ה של ‪ L-Ala-eNA‬ב מ ד י ו ם של‬
‫‪M25‬־‪ ,NaCl 0‬מ ו ב א ת ב ט ב ל ה‬
‫‪7.‬‬
‫‪63‬‬
‫טבלה‬
‫‪:7‬‬
‫השפעת ק ט י ו נ י ם ש ו נ י ם על ה פ ע י ל ו ת האמידטית של‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫‪Activation‬‬
‫‪Monovalent‬‬
‫‪cation‬‬
‫‪x 6‬‬
‫‪+‬‬
‫‪K‬‬
‫‪x 4.5‬‬
‫‪+‬‬
‫‪x 1.5‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Li‬‬
‫‪x 1‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Cs‬‬
‫‪Na‬‬
‫תערובת הריאקציה ב ק י ו ו ט ה הכילה בנפה ס ו פ י של ‪ 1‬מ״ל‪:‬‬
‫מייל תרהיף תאי‬
‫כי)‪A.laidlawii‬‬
‫ו ר ו נ ל ב‪8.5 -pH‬‬
‫‪.‬‬
‫של‬
‫‪9‬‬
‫בופר‬
‫;(‪0 xl5‬‬
‫; מ ל ה ב ר י כ ו ז של ‪ M; 1.6758«2‬מ י ק ר ו מ ו ל י ם‬
‫‪ L - A l a - g N A‬ה ר י א ק צ י ה ב־ ‪. C25°‬‬
‫די וו בפרק ‪4.4‬‬
‫התוצאות המובאות בפרק זה מראות כי למלחים יש השפעה בהגברת הפעילות‬
‫האמידטית של תאי ‪ A. laidlawii‬כלפי ‪ .L-Ala-gNA‬התאים החשופים זמו קצר‬
‫ל מ ד י ו ם ה ה י פ ר ט ו נ י משנים אמנם את צורתם אך א י נ ם נצבעים ב ‪-‬‬
‫‪,Trypan blue‬‬
‫כלומר מחסום החדירות שלהם לא נ פ ג ע ‪ .‬פ ע י ל ו ת האמידז‪ ,‬כתוצאה מהטיפול במלח‪,‬‬
‫א י נ ה י ו ר ד ת לתמיסה ‪ -‬עובדה המצביעה על מידת האינטגרציה של החלבוו הפעיל‬
‫במבנה הממברנה‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬ר י כ ו ז מלח גבוה )‪ (2M Na I‬נמצא י ע י ל בהוצאת‬
‫‪) ATPase‬שאינו רגיש ל ‪ (Oabain -‬ממברנת א ר י ת ר ו צ י ט י ם ומפרקציות מ י ק ר ו ם ו מ ל י ו ת‬
‫של רקמות ש ו נ ו ת )‪ .(90‬הו ל ר י כ ו ז עולה של המלח והו ל ס ו ג ה ק ט י ו ו החד ערכי‬
‫יש השפעה באקטיבציה של הפעילות האמידטית של ‪ .A. laidlawii‬האקטיבציה‬
‫מירבית )‬
‫(‬
‫‪ x 6‬ה ו ש ג ה עם‪MKC11.675‬‬
‫‪ .‬למלחים ב מ ד י ו ם יתכו אפקט כ פ ו ל על‬
‫התאים‪:‬‬
‫א(‬
‫השפעה אוםמוטית המתבטאת ב א י ב ו ד או קליטת מים על י ד י התא‪.‬‬
‫נמצאו י צ י ב י ם בלחץ אוסמוטי המשתנה בתחום של‬
‫«‪atm7-27‬‬
‫‪,‬‬
‫‪64‬‬
‫ו ה ‪ tonicity -‬ה א ו פ ט י מ ל י טל ה מ ד י ו ם ה י נ ו כ ‪. ( l O a t m(134-‬‬
‫נמצאו‬
‫מ פ ס י ד י ם ח ו מ ר ת ו ך תאי ב ת נ א י ם ה י פ ר ט ו נ י י ם ו נ י ת ן‬
‫‪++‬‬
‫ז ה על י ד י ת ו ס פ ת‬
‫ב(‬
‫א ו ‪(135‬‬
‫‪Ca‬‬
‫‪++‬‬
‫מיקופלסמה‬
‫ל מ נ ו ע ‪leakage‬‬
‫‪. ( M g‬‬
‫הטפעה ע ל מ ב נ ה ה מ מ ב ר נ ה ‪.‬‬
‫י ד ו ע כ י ה ק ב ו צ ו ת ה פ ו ל ר י ו ת טל ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם ב ל י פ י ד ‪ -‬ח ל ב ו ן‬
‫‪Micellar Interface‬‬
‫חלבונים‪,‬‬
‫מ ט פ י ע ו ת ע ל ה י א ו נ י ז צ י ה ט ל ק ב ו צ ו ת פ ו נ ק צ י ו נ ל י ו ת טל‬
‫הטפעה ט י ט לה ה ט ל כ ו ת ע ל ה ת ה ל י ך ה ק ט ל י ט י‬
‫‪Clustering‬‬
‫ה ט ל י ל י י ם על פ נ י הממברנה י כ ו ל ל ג ר ו ם ל ‪-‬‬
‫של ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם מצד א ח ד ו ל מ נ י ע ת‬
‫מ מ ב ר נ ל י י ם ב א מ צ ע ו ת ‪ion-pairs‬‬
‫)‪ .(136‬מ י ס ו ך המטענים‬
‫טל ה ק ב ו צ ו ת ה פ ו ל ר י ו ת‬
‫א י נ ט ר א ק צ י ה טל ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם‬
‫מאידך‪.‬‬
‫השפעת ק ט י ו נ י ם ח ד ע ר כ י י ם א י נ ה רק ת ו פ ע ה של מ י ס ו ך על פ נ י השטח‪ ,‬אלא‬
‫כ פ י שהראו ‪Trauble‬‬
‫‪,K‬‬
‫צב‬
‫בניגוד‬
‫‪+‬‬
‫‪,Na‬‬
‫ו ‪( E i b l(94-‬‬
‫‪+‬‬
‫"‬
‫ג ם ע ל ה נ ו ז ל י ו ת של ה מ מ ב ר נ ה ‪.‬‬
‫ה‬
‫ו‬
‫נ‬
‫ז‬
‫ל‬
‫י‬
‫חוקרים‬
‫" של ה מ מ ב ר נ ה‬
‫ל י א ו נ י ם ד ו ע ר כ י י ם ה מ ש פ י ע י ם על י י צ ו ב המצב " ה מ ע ו ב ה ״ ‪.‬‬
‫ה ר י כ ו ז הגבוה‬
‫טל ה מ ל ח י ם ה ד ר ו ש ל ק ב ל ת א פ ק ט מ י ר ב י ) ע ד ‪ ( ,M2‬מ ר א ה כ י א י ן ז ו א י ט נ ר א ק צ י ה‬
‫ס פ צ י פ י ת א ל א אפקט של ח ו ז ק י ו נ י ‪ .‬ל א ר ג ו ן‬
‫או חצי גבישי‬
‫ה ל י פ י ד י ם ב מ מ ב ר נ ה במצב נ ו ז ל י‬
‫) מ ע ו ב ה ( יש השפעה ע ל פ ע י ל ו י ו ת ב י ו ל ו ג י ו ת ה ק ש ו ר ו ת ב מ מ ב ר נ ה‬
‫כ מ ו ט ר נ ס פ ו ר ט ו א נ ז י מ י ם ) ‪ . ( 9 2 , 9 3‬השפעה ז ו מתבטאת ב א ו פ ן‬
‫ב נ ק ו ד ו ת שבירה ש ו נ ו ת ב ע ק ו מ ת א ר נ י ו ם ‪,‬‬
‫הפחמתיות‪.‬‬
‫נ ס י ו נ י למטל‬
‫ב ת ל ו ת ב מ צ ב י א ר ג ו ן ש ו נ י ם של ה ש ר ש ר ו ת‬
‫נמצא כ י פ ע י ל ו ת א ו פ ט י מ ל י ת ד ו ר ש ת שהשרשרות ה פ ח מ ת י ו ת טל ה ל י פ י ד י ם‬
‫ת ה י י נ ה במצב מ ו ב י ל י ‪.‬‬
‫ת ו פ ע ה של י י צ ו ב ה מ מ ב ר נ ה של ‪laidlawii‬‬
‫במיקופלסמה )‪ (94‬במדידת ה ש נ ו י י ם ב ‪-‬‬
‫‪1-N‬‬
‫‪.‬‬
‫‪A.‬‬
‫‪turbidity‬‬
‫על י ד י‬
‫ק ט י ו נ י י ם נמצאה‬
‫ב נ ו כ ח ו ת מלחים‬
‫‪65‬‬
‫‪4.5‬‬
‫השפעת א נ ז י מ י ם על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ‪A. laidlawii‬‬
‫טריפםין‬
‫‪4.5.1‬‬
‫פ ר ו ט א ו ל י ט י ם משמשים כ מ כ ש י ר ל ח ק ר שטח ה פ נ י ם ה ח י צ ו נ י‬
‫אנזימים‬
‫של ק ר ו מ י ם על י ד י הפעלתם על ת א י ם שלמים א ו על ת כ ש י ר י ם ק ר ו מ י י ם ‪.‬‬
‫חלבוני‬
‫יציבים‬
‫ה מ מ ב ר נ ה ב ת א י ם שלמים הם ב ד ר ך כ ל ל פ ח ו ת ח ש ו פ י ם ו ל כ ן‬
‫ל פ ר ו ט א ז ו ת ל ע ו מ ת ה מ מ ב ר נ ו ת ה מ ב ו ד ד ו ת )‪.(95‬‬
‫יותר‬
‫ב ד ק נ ו השפעת‬
‫ט ר י פ ם י ן על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ת א י ם שלמים של ‪ A. laidlawii‬״‬
‫לשם כ ך השתמשנו בתאי ‪A. laidlawii‬‬
‫תמיסת מלח א י ז ו ט ו נ י ת‬
‫מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י אשר נשטפו‬
‫; ‪MTris-HCl0.05);0.01MMgCl‬‬
‫‪2‬‬
‫־‬
‫‪M NaCl25‬‬
‫‪-‬‬
‫ב ‪ . ( 7 . 5 p H 0‬תרחיף תאים‬
‫‪OJ‬‬
‫(‬
‫עם ר י כ ו ז י ם ש ו נ י ם של ט ר י פ ס י ו‪saltfree)Worthington,2‬‬
‫מ ‪ lmg/mlO -‬ע ד ‪, mg/ml0.5‬‬
‫‪0‬‬
‫טריפסין‬
‫‪10‬‬
‫) ‪, 1‬מ״ל‪10 x2‬תאיםהודגר(‬
‫‪15‬משך‬
‫דקות‬
‫‪cryst‬‬
‫ב‪-37°C‬‬
‫‪x‬‬
‫ת ו ך טיטול קל‪.‬‬
‫ב ת נ א י ם ד ו מ י ם פ ע ל על תכשיר ק ר ו מ י ש ה ו כ ן מתאי‬
‫‪ laidlawii‬״‪ A‬ו ג ר ם ל פ ר ו ק של כ ‪ 20-30% -‬מ ה ח ל ב ו ן ‪ ,‬אשר נ ק ב ע בשיטת‬
‫‪ . Lowry‬כ ד י ל ע כ ב את ה פ ע י ל ו ת ה פ ר ו ט א ו ל י ט י ת ה ו ס פ ת י ‪ 50‬מ י ק ר ו ל י ט ר‬
‫ת מ י ס ת מ ע כ ב ט ר י פ ס י ן מ פ ו ל י ס ו י ה )‪ .(15mg/ml‬ה ת א י ם ה ו פ ר ד ו מ ת ע ר ו ב ת‬
‫ה ה ד ג ר ה על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ו פ ע י ל ו ת ם כ ל פ י ‪ L-Ala-eNA‬נ ב ד ק ה בשיטה‬
‫ה פ ל ו א ו ר ו מ ט ר י ת ) פ ר ק ‪.(3.2‬‬
‫ת ו צ א ו ת הבדיקה הראו כ י ה ט י פ ו ל ב ט ר י פ ס י ן‬
‫ל א ע י כ ב את ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ה ת א י ם ‪ .‬מ צ א נ ו כ י כ‪ 80%-‬מ ה פ ע י ל ו ת‬
‫ה ה ת ח ל ת י ת נשארה קשורה ל ת א י ם ‪ ,‬ל ע ו מ ת כ ‪ 10% -‬פ ע י ל ו ת מ ם י ס ה ש י כ ו ל ה‬
‫ל ה י ו ת ג ם ת ו צ א ה של פ ר ג מ נ ט צ י ה של ה ת א י ם ‪.‬‬
‫תנאי‬
‫ב ב י ק ו ר ת של ת א י ם ב א ו ת ם‬
‫ה ד ג ר ה ‪ ,‬בהעדר ט ר י פ ס י ן ‪ ,‬ל א ה י ה כ ל א י ב ו ד של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת‬
‫של ה ת א י ם ו כ ן לא ה י ה הפסד של פ ע י ל ו ת ל ת מ י ס ה ‪.‬‬
‫נ ם י ו ן ז ה מראה כ י‬
‫ה ח ל ב ו ן ) א ו ה ק ו מ פ ל כ ם ( ב ע ל ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת כ ל פ י ‪L-Ala-BNA‬‬
‫אינו‬
‫ע ו ב ר א י נ א ק ט י ב צ י ה על י ד י פ ע ו ל ת ט ר י פ ם י ן ‪ ,‬אם מ ה י ו ת ו חשוף‬
‫ב מ י ד ה מ ו ע ט ת לשטח ה ח י צ ו נ י של התא א ו ש ה י נ ו מ מ ו ס ך על י ד י מ ו ל ק ו ל ו ת‬
‫‪66‬‬
‫של פ ו ל י ה ק ם ו ז א מ י ן שנמצאו ק ש ו ר ו ת ל ת א י‪l a i d l a w i i(96‬‬
‫‪4.5.2‬‬
‫‪. ( A .‬‬
‫פוספוליפז ‪c‬‬
‫‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫כמרכיבים‬
‫מכיל פוםפטידיל‪-‬גליצרול‬
‫ע י ק ר י י ם של ה ל י פ י ד י ם ב ק ר ו ם התא‬
‫של פ ע ו ל ת פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ c‬מ ‪-‬‬
‫מהבחינות‬
‫ודיפוםפטידיל‪-‬גליצרול‬
‫)‪.(97‬‬
‫‪ B. cereus‬ע ל ת א י‬
‫ב ד ק נ ו את ההשפעה‬
‫‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫הבאות‪:‬‬
‫‪ A. l a i d l a w i i‬ש ל מ י ם ‪.‬‬
‫א‪.‬‬
‫ה ת ב ט א ו ת של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ת א י‬
‫ב‪.‬‬
‫שחרור פ ו ס פ ט מסים בחומצה‪ ,‬בעקבות הפעלת ה א נ ז י ם על התאים‪.‬‬
‫פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ c‬פ ו ע ל ע ל פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ב ר י א ק צ י ה הבאה‪:‬‬
‫‪- Diglyceride+Phosphoryl -R‬י‬
‫‪Phosphatide‬‬
‫ש י י ר ‪ R‬ה י נ ו ב ד ר ך כ ל ל כ ו ל י ו ‪ ,‬א ך ה א נ ז י ם מ ‪ B. cereus -‬ב ע ל‬
‫ספציפיות‬
‫גליצרול‬
‫יוני‬
‫רחבה ו ת ו ק ף ג ם פ ו ם פ ו ג ל י צ ר י ד י ם א נ י ו נ י י ם כ מ ו‬
‫)‪.(98‬‬
‫סידן‬
‫מקור״‬
‫האנזים מ‪-‬‬
‫לפעילותו‬
‫א י נ ו המוליטי‬
‫‪B. cereus‬‬
‫פוספטידיל‬
‫ו א י נ ו דורש‬
‫)‪ .(99‬ה פ ר פ ר ט של ה פ ו ס פ ו ל י פ ז שהתקבל מ ח ב ר ת‬
‫) י ר ו ש ל י ם ( ע ב ר ט י פ ו ל מ ו ק ד ם של א י נ ק ו ב צ י ה‬
‫ב‪C60°‬‬
‫משך‬
‫‪ 10‬ד ק ו ת ‪ ,‬ל ה ר י ס ת פ ע י ל ו ת פ ר ו ט י א ו ל י ט י ת נ י ל ו ו י ת ‪.‬‬
‫פ ע י ל ו ת א מ י ד ט י ת של ‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫‪4.5.2.1‬‬
‫תרחיף‬
‫איזוטונית‬
‫‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫)ריכוז‬
‫‪++‬‬
‫‪Mg‬‬
‫מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י הוכן בתמיסת מלחים‬
‫רק ‪ImM‬‬
‫ו ר י כ ו ז ה ב ו פ ר ט ר י ס ‪ -‬מ ל א ט ‪,mM5‬‬
‫כ ד י שלא ל ע כ ב פ ע י ל ו ת ה פ ו ם פ ו ל י פ ז ( ‪.‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ה ת א י ם‬
‫נ ב ד ק ה עם ‪ L-Ala-eNA‬בשיטה ה פ ל ו א ו ר ו מ ט ר י ת ) פ ר ק ‪ .(3.2‬ת מ י ס ת‬
‫פוספוליפז‬
‫השימוש‪.‬‬
‫‪mg/ml04‬־‬
‫״ ה ה ד ג ר ה נעשתה‬
‫נבדקה‬
‫במים‪,c‬‬
‫ב ר י כ ו ז טל ‪ mg/ml2‬ה ו כ נ ה ז מ ן ק צ ר ל פ נ י‬
‫פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ c‬הוסף לתרחיף התאים כך ש ר י כ ו ז ו ה ס ו פ י‬
‫ב‬
‫‪0‬‬
‫‪ C37° -‬משך ד ק ו ת ‪. 6 0‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ט ל ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ו כ ן של ה ת א י ם‬
‫‪67‬‬
‫והתםנין־‬
‫ל א ח ר ה פ ר ד ת ם ‪ .‬לא נמצאה י ר י ד ה מ ש מ ע ו ת י ת ב פ ע י ל ו ת‬
‫ה א מ י ד ט י ת של ה ת א י ם ‪ ,‬ל א ח ר חשיפתם ל פ ו ס פ ו ל י פ ז ‪ ,‬ו כ ך ל א עברה‬
‫מ ש מ ע ו ת י ת מן ה ת א י ם ל ת ם נ י ן ‪.‬‬
‫פעילות‬
‫‪4.5.2.2‬‬
‫ש ח ר ו ר פ ו ס פ ט מ ס י ם ב ח ו מ צ ה מתאי‬
‫עקב ט י פ ו ל‬
‫‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫בפוספוליפז ‪c‬‬
‫אחת ה ש י ט ו ת ל ב ד י ק ת פ ע י ל ו ת ל י ט י ת של פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ c‬ה י א‬
‫ב ד י ק ת שחרור פ ו ס פ ט ל מ ד י ו ם ‪ ,‬אחרי ה פ י כ ת ו מפוספט א ו ר ג נ י‬
‫לאיאורגני‪.‬‬
‫ו‪-‬‬
‫ב מ ו ד י פ י ק צ י ה של השיטה של‬
‫‪ClOO) Macfarlane‬‬
‫‪. ( E i b l (61‬‬
‫‪c‬‬
‫רה‬
‫השתמשנו‬
‫תרחיף‬
‫‪Knight‬‬
‫ו ק ב ע נ ו את ה פ ו ס פ ט ה א ו ר ג נ י בשיטה של‬
‫‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫‪2‬‬
‫ב ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י ה ו ד ג ר עם‬
‫מ ת מ י ס ת ה מ ו צ א של ‪mg/ml‬‬
‫נעשתה ב ‪ C37° -‬משך‬
‫ט י ל ט ו ל ‪. 6 0‬‬
‫דקות תוך‬
‫במים‪.‬‬
‫במקביל הועמדו‬
‫שתי ב י ק ו ר ו ת ‪ ,‬ת א י ם ב ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י א ך ב ה ע ד ר פ ו ס פ ו ל י פ ז‬
‫‪M‬‬
‫במקום‬
‫נלקחו ‪4‬‬
‫‪0‬‬
‫‪m‬‬
‫לתםניו‬
‫טריכלורואצטית‪,‬‬
‫א ו ר ג נ י על שתי‬
‫ה ו ס פ ו ‪ 20‬מ י ק ר ו ל י ט ר של ח ו מ צ ה‬
‫ס ו פ י של ‪%‬ר‪ .‬ל א ח ר הרחקת המשקע‪,‬‬
‫נקבע‬
‫ד ג י מ ו ת של ‪ 100‬מ י ק ר ו ל י ט ר ו פ ו ס פ ט‬
‫ד ג י מ ו ת א ח ר ו ת ‪ ,‬ל א ח ר שריפה ) פ ר ק ‪. ( 3 . 8‬‬
‫התוצאות‬
‫ב ט ב ל ה ‪.8‬‬
‫הנסי וו‬
‫פוספט‬
‫לריכוז‬
‫א י א ו ר ג נ י על שתי‬
‫מסוכמות‬
‫‪.‬‬
‫מ‬
‫ל‬
‫נסיון‬
‫ד ג י מ ו ת של ‪ 0 . 2‬מייל ו ה ת א י ם ה ו ר ח ק ו ע ל י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה‬
‫ב ‪.Microfuge -‬‬
‫פוספט‬
‫‪5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪M‬‬
‫‪m‬‬
‫כ‬
‫וביקורת‬
‫ה מ ס ו כ ם ב ט ב ל ה ‪ 8‬מראה כ י א י ו ש ח ר ו ר משמעותי של‬
‫א ו ר ג נ י או‬
‫הפוספוליפז‪.‬‬
‫א י א ו ר ג נ י מתאי‬
‫‪ A. l a i d l a w i i‬כ ת ו צ א ה מ פ ע ו ל ת‬
‫י ר י ד ה ב ר י כ ו ז המלח ב מ ד י ו ם‬
‫מ ו ע ט של פ ו ס פ ט א ו ר ג נ י‬
‫כ ת ו צ א ה של י צ י א ת‬
‫)כ‪10%-‬‬
‫) ב ק ו ר ת ‪(B‬‬
‫י ו ת ר בהשוואה ל ב ק ו ר ת ‪,(A‬כנראה‬
‫נ ו ק ל י א ו ט י ד ‪ -‬פ ו ס פ ט י ם ‪,‬מהתאים‪.‬‬
‫של ח ו מ ר ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י מתאי‬
‫גורמת לשחרור‬
‫‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫א י ב ו ד משמעותי‬
‫בתנאים ה י פ ו ט ו נ י י ם‬
‫‪68‬‬
‫יש רק ב ר י כ ו ז י ם נ מ ו כ י ם מ ‪NaCl 150mM -‬‬
‫טבלה‬
‫‪:8‬‬
‫קביעת פוספט א ו ר ג נ י‬
‫)‪.(20‬‬
‫ו א י א ו ר ג נ י ב ת ם נ י ן של‬
‫‪ A. l a i d l a w i i‬ל א ח ר ט י פ ו ל ב פ ו ס פ ו ל י פ ז ‪c‬‬
‫‪nmole Po/ml‬‬
‫‪203‬‬
‫‪61.5‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪282‬‬
‫‪70.5‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪220‬‬
‫‪70.5‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪207‬‬
‫‪75‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪253‬‬
‫‪59‬‬
‫־ )‪A‬‬
‫‪290‬‬
‫‪70.5‬‬
‫־ )‪B‬‬
‫‪A. l a i d l a w i i x 2‬‬
‫הריאקציה הכילה‬
‫ופוםפוליפז‬
‫)‪1‬נפח ס ו פ י‬
‫‪nmole Pi/ml‬‬
‫‪PLC‬‬
‫‪mg/ml‬‬
‫תאי‬
‫‪,‬‬
‫‪10‬‬
‫‪ c‬ב ר י כ ו ז י ם המצויינים‪ ,‬בבופר א י ז ו ט ו נ י‬
‫מ ״ ל ( ‪ .‬ה ד ג ר ה מטך ‪ 60‬ד ק ו ת ב ‪C 3 7 ° -‬‬
‫־‬
‫פוספט‬
‫מ ס י ם ב ח ו מ צ ה נ ק ב ע ב ד ג י מ ו ת של ‪ 0.1‬מייל ‪.‬‬
‫‪- (A‬‬
‫ב ק ו ר ת של ת א י ם ב ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י‬
‫)‪;5mM Tris-maleate ;250mM NaCl‬‬
‫‪-( B‬‬
‫‪2‬‬
‫‪(pH7.2 ;lmM MgCl‬‬
‫ב ק ו ר ת של ת א י ם ב ב ו פ ר ש ה כ י ל ‪ m M NaCl225‬״‬
‫ק י צ ו ר י ם ‪PLC :‬‬
‫)‬
‫(‬
‫‪Po,‬פוםפוליפז‪c‬‬
‫)פוספט א ו ר ג נ י ( ‪,‬‬
‫‪ ) Pi‬פ ו ס פ ט א י א ו ר ג נ י ( ‪.‬‬
‫ה ק ב י ע ו ת הן מ מ ו צ ע של ד ו פ ל י ק ט י ם שההבדל ב י נ י ה ם לא עלה‬
‫על‬
‫דיון‬
‫‪4%‬‬
‫‪.‬‬
‫בפרק ‪4 . 5‬‬
‫תוצאות‬
‫ה נ ס י ו נ ו ת ש פ ו ר ט ו ב פ ר ק ז ה ה ר א ו כ י ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של האי‬
‫‪ A. l a i d l a w i i‬א י נ ה מ ו ש פ ע ת‬
‫‪ in s i t u‬מחשיפת ה ת א י ם ל פ ע ו ל ת טריפםין או‬
‫פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ c‬ו כ מ ו כ ן א י ן מעבר של פ ע י ל ו ת ל ת מ י ס ה ‪.‬‬
‫ב מ י ד ה ש ו נ ה ל ט ר י פ ם י נ י ז צ י ה ‪ .‬למשל‪,‬‬
‫ק ט נ ה של‬
‫ס ו ג י תאים ש ו נ י ם רגישים‬
‫כ ד ו ר י ו ת דם א ד ו מ ו ת מ ש ח ר ר ו ת רק כ מ ו ת‬
‫ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם ו א י נ ן ע ו ב ר ו ת ל י ז י ס ‪ ,‬ב ע ו ד שתאי‬
‫‪Ehrlich ascites‬‬
‫‪69‬‬
‫‪ lymphoid‬נ ה ר ס י ם ע ק ב ט י פ ו ל ק צ ר ב ט ר י פ ם י ן ‪ .‬ההטפעה ט ל א נ ז י מ י ם‬
‫או תאי‬
‫פ ר ו ט א ו ל י ט י ם על פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת ט ל ה מ מ ב ר נ ה ת ל ו י ה ב מ י ק ו מ ו טל‬
‫פ ע י ל ו י ו ת א ל ה ב ק ר ו ם ו ב מ י ד ת ח ט י פ ת ם ט ל ה ח ל ב ו נ י ם ל א י נ ט ר א ק צ י ה עם‬
‫מקרומולקולה‬
‫אדומות‬
‫ב א נ ז י ם ‪ .‬ה פ ע ל ת פ ר ו נ ז ‪ ,‬ט ר י פ ם י ו א ו כ י מ ו ט ר י פ ס י ו על כ ד ו ר י ו ת‬
‫ה ו ר ס ת א ת ר ו ב פ ע י ל ו ת ה כ ו ל י ו א ם ט ר ז א ך ל א מ ט פ י ע ה כמעט על פ ע י ל ו ת‬
‫ה ט ר נ ס פ ו ר ט טל כ ו ל י ו ו ט ל‬
‫נ ת ר ו )‪.(101‬‬
‫יוני‬
‫מ כ ד ו ר י ו ת ה ד ם פ ע י ל ו ת ה ־ ‪ATPase‬‬
‫לטריפםיו‬
‫קרומי‬
‫ואובדת במהירות‪.‬‬
‫)‪,(102‬‬
‫בתכטיר‬
‫נתרו‬
‫התלויה ב י ו נ י‬
‫ב ה פ ע ל ת פ ר ו נ ז על ת א י‬
‫נמצא כ י ‪ATPase‬‬
‫הקרומי‪,‬‬
‫לעומת זאת‪,‬‬
‫בממברנות המבודדות‬
‫ואטלגו‪ ,‬רגיטה ביותר‬
‫‪A. l a i d l a w i i‬‬
‫ועל תכטיר‬
‫ו ‪ NADH oxidase -‬ט ה י נ ם ר ג י ט י ם ל א י נ א ק ט י ב צ י ה‬
‫י צ י ב י ם ב י ו ת ר בתאים הטלמים‪.‬‬
‫ה פ ע ל ת א נ ז י מ י ם ל י פ ו ל י ט י י ם ב ע ל י ס פ צ י פ י ו ת ט ו נ ה ע ל התא השלם י כ ו ל ה‬
‫ל ת ת מ ו ט ג על מ י ד ת ה ח ט י פ ה ט ל ה פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ה ט ו נ י ם ו ע ל ת ר ו מ ת ם ל י צ י ב ו ת‬
‫או ל פ ע י ל ו ת טל א נ ז י מ י ם הממוקמים ב ק ר ו ם ‪ .‬למטל‪,‬‬
‫ט י נ ו י י ם בליפידים ממברנליים‬
‫ה נ ג ר מ י ם ע ק ב פ ע ו ל ת פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ת ו צ א ת ם ט ח ר ו ר ט ל א נ ז י מ י ם מ ם ו י י מ י ם מו‬
‫ה מ מ ב ר נ ה כ מ ו‪ ( H y d r o x y b u t y r a t edehydrogenase-3(103‬ו ‪NADH -‬‬
‫‪ dehydrogenase‬מ י ט ו כ ו נ ד ר י א ל י )‪.(104‬‬
‫היות‬
‫ב נ ס י וו ז ה ל א ה ט ת מ ט נ ו‬
‫ו א נ ז י ם ז ה מטחרר ח ו מ צ ו ת ט ו מ נ י ו ת ח פ ט י ו ת‬
‫מולקולות‬
‫לפירוק‬
‫בפוםפוליפז ‪A‬‬
‫ו ל י ז ו פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם טבהיותו‬
‫ד מ ו י ו ת ד ט ר ג נ ט ג ו ר מ ו ת ל ה ר ס התא ה ט ל ם ‪.‬‬
‫פוםפוליפז ‪ c‬אינו‬
‫גורם‬
‫מ ט מ ע ו ת י טל פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ב כ ד ו ר י ו ת א ד ו מ ו ת ט ל מ ו ת ב ת נ א י ם‬
‫איזוטוניים‬
‫)‪.(105‬‬
‫ה א נ ז י ם י כ ו ל לפרק‬
‫לציטיו‬
‫ו ל ג ר ו ם ל ל י ז י ם טל ה כ ד ו ר י ת‬
‫ר ק א ח ר י ט י פ ו ל מ ו ק ד ם ב ס פ י נ ג ו מ י י ל י נ ז המבקע ע ד ‪ 80-85%‬מ ה ס פ י נ ג ו מ י י ל י ו‬
‫הממברנלי‪,‬‬
‫בעלי‬
‫ט כ נ ר א ה ממסך את ה ל צ י ט י ו‬
‫תכולה גבוהה טל ל צ י ט י ו‬
‫זאת לפעולת פ ו ס פ ו ל י פ ז ‪c‬‬
‫ב כ ד ו ר י ת טלמה‪.‬‬
‫ו כ מ ו ת ק ט נ ה טל‬
‫מ ‪B. cereus -‬‬
‫כ ד ו ר י ו ת דם מ ח ז י ר י ‪ -‬י ם‬
‫םפינגומייליו‪,‬‬
‫ועוברות ליזיס‬
‫ודיפוםפטידיל גליצרול וכו‬
‫רגיטות לעומת‬
‫)‪ .(106‬פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם‬
‫ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם הם‬
‫חומציים‪,‬‬
‫פוםפטידיל גליצרול‬
‫המרכיבים‬
‫ה ע י ק ר י י ם ט ל ה ל י פ י ד י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם ב מ י ק ו פ ל ס מ ה )‪.(97‬‬
‫כולסטרול‬
‫‪70‬‬
‫מ צ ו י ג ם ה ו א ב כ מ ו ת נ י כ ר ת ב מ מ ב ר נ ת ‪ , A. laidlawii‬עד כ‪ 10-12%-‬מ כ ל ל‬
‫ה מ מ ב ר נ ל י י ם )‪ .(107‬מ ד י ד ו ת ב ש י ט ו ת פ י ס י ק ל י ו ת ה ר א ו כ י כ‪90%-‬‬
‫הליפידים‬
‫מהליפידים‬
‫)‪.(108‬‬
‫ע ר ו כ י ם במבנה ה ‪-‬‬
‫‪ bilayer‬כ פ י שהוצע ב מ ו ד ל של ד נ י א ל י‬
‫ודווסוו‬
‫י ד ו ע ר ק מ ע ט ע ל ה א ר ג ו ן של ה ל י פ י ד י ם מ ש נ י ע ב ר י ק ר ו ם התא טל‬
‫‪ , A. laidlawii‬למשל ב ד י ק ו ת א י מ ו נ ו ל ו ג י ו ת ה ר א ו כ י ה ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם ח ש ו פ י ם‬
‫ע ל שטח פ נ י התא )‪ .(41‬כ ו ל ס ט ר ו ל מ צ ו י כ נ ר א ה ג ם כ ן על שטח פ נ י התא‬
‫פוספוליפז ‪ c‬אינו‬
‫)‪.(109 ,110‬‬
‫י כ ו ל ל פ ע ו ל על ת א י ם שלמים של ‪A. laidlawii‬‬
‫מהסיבות הבאות‪:‬‬
‫א( מ ס ו ך ה פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ה ח ו מ צ י י ם ע ל י ד י‬
‫גליקוליפידים וכולסטרול‪.‬‬
‫ב( צ פ י פ ו ת י ת ר של ה מ ו ל ק ו ל ו ת ה נ ו ב ע ת מ א ר ג ו ן ה ‪. ( b i l a y e r(105-‬‬
‫פ ע י ל ו ת ו י צ י ב ו ת ה פ פ ט י ד ז ‪ -‬א מ י ד ז בתכשיר ק ר ו מ י‬
‫‪4.6‬‬
‫ידינו באנזים‬
‫ה פ פ ט י ד ז ) ‪ - 6‬נ פ ת י ל א מ י ד ז ( של מ י ק ו פ ל ם מ ה ה ו ג ד ר על‬
‫מ מ ב ר נ ל י מאחר ו ה פ ע י ל ו ת נמצאה ק ש ו ר ה ב א ו פ ן ב ל ע ד י עם ה פ ר ק צ י ה ה מ מ ב ר נ ל י ת ‪.‬‬
‫במטרה ל ח ק ו ר א ת ה ת כ ו נ ו ת של ה א נ ז י ם ‪ ,‬ש א ן פ י י ן עד עתה ע ל י ד י ב ד י ק ת‬
‫פ ע י ל ו ת התא השלם‪ ,‬ב ‪-‬‬
‫קרומי‬
‫‪Mioroenvironment‬‬
‫הממברנלי‬
‫נ י ס י נ ו ה כ נ ת תכשיר‬
‫בשיטות שונות‪:‬‬
‫שבירת תאי‬
‫א(‬
‫‪M. Fermentans‬‬
‫העמידים יותר בשנויים אוסמוטיים‬
‫)‪ - (20‬ה פ ע ל ת ל ח ץ )‪ 750‬א ו ‪ 1250‬א ט מ ו ס פ י ר ו ת ( ב מ כ ש י ר‬
‫א ו ם ו נ י ק צ י ה במכשיר‬
‫ל‪C -0°‬‬
‫ב(‬
‫ו‬
‫‪.‬‬
‫‪0.05‬‬
‫ק‬
‫ק‬
‫י‬
‫‪ Branson‬מ ט ך ‪ 3‬ד ק ו ת ל ס י ר ו ג י ן ת ו ך ק י ר ו ר‬
‫ל י ז י ם א ו ם מ ו ט י של ‪A. laidlawii‬‬
‫הרכבו‬
‫ם‬
‫‪Yeda Press‬‬
‫‪M‬‬
‫‪;NaCl‬‬
‫‪ ,‬מובא ל ‪-‬‬
‫ב כ ו פ ר ‪ 6‬מ ה ו ל ‪ ,1:20‬משך‬
‫‪M‬‬
‫‪H C p H‬‬
‫‪6‬‬
‫עם‬
‫‪5‬‬
‫‪1‬‬
‫‪.‬‬
‫‪0‬‬
‫‪M‬‬
‫;‬
‫‪. 1 7 . 4‬‬
‫ש ב י ר ת ה ת א י ם נ ב ד ק ה על י ד י מעקב ם פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י א ח ר ה י ר י ד ה‬
‫‪(500‬‬
‫‪ n m‬ו ב מ ק ב י ל עליה בחומצות נ ו ק ל י א י ו ת‬
‫)‪(260‬‬
‫‪ n m‬ב ת ס נ י ו ‪.‬‬
‫‪71‬‬
‫א י ם שלא נ ש ב ר ו ה ו ר ח ק ו על י ד י‬
‫מברנות הושקעו ב ‪-‬‬
‫צנטריפוגציה ב‪-‬‬
‫‪xg‬‬
‫‪40,000‬‬
‫ב ב ו פ ר ‪ B‬מ ה ו ל ‪. 1:20‬‬
‫ה‪Flotation‬‬
‫בצפיפות‬
‫‪9,000‬‬
‫ה מ מ ב ר נ ו ת נ י ת נ ו ת להשקעה ג ם בשיטת ה ­‬
‫ד ר ך שמן ב ע ל צ פ י פ ו ת ‪,g/cc1.011-1.012‬‬
‫ג ב ו ה ה מ ‪ 1.014 -‬ה מ מ ב ר נ ו ת א י נ ן‬
‫במשקע ה מ מ ב ר נ ו ת של‬
‫האנזימטית‬
‫‪xg‬‬
‫משך ‪ 30‬ד ק ו ת ו נ ש ט פ ו פ ע מ י ם א ח ד ו ת‬
‫‪­Differential‬‬
‫ההתחלתית‪,‬‬
‫ואילו‬
‫‪M. Fermentans‬‬
‫ע ו ב ר ו ת את שכבת השמן‪.‬‬
‫מ צ א נ ו ‪ 60-70%‬מ ן‬
‫הפעילות‬
‫ב ה ש ו ו א ה ל ת א י ם ש ל מ י ם ‪ ,‬אשר נ ק ב ע ה עם ה ס ט י ד י ל‬
‫‪ - 3‬נ פ ת י ל א מ י ד כםובםטרט‪.‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת של המשקע ה מ מ ב ר נ ל י א י נ ה‬
‫י צ י ב ה א ף ב ‪ , 0 ° 0 -‬כ ‪ 50% -‬מ ה פ ע י ל ו ת ה ו ל כ ת ל א י ב ו ד א ח ר י ש ע ת י י ם‬
‫ומחצה מ ע ת הפקת ה מ מ ב ר נ ו ת ‪.‬‬
‫פעילותם‬
‫ת א י ם שלמים ל ע ו מ ת ז א ת ‪ ,‬ש ו מ ר י ם על‬
‫ה א נ ז י מ ט י ת ל פ ח ו ת ‪ 12‬שעות מעת ק צ י ר ת ם ‪ ,‬כאשר נ ש מ ר י ם ב ‪. 0 ° 0 -‬‬
‫במשקע מ מ ב ר נ ו ת מ ו פ ק מ ‪A. l a i d l a w i i -‬‬
‫מהפעילות‬
‫ההתחלתית‪.‬‬
‫מ צ א נ ו ע ד ‪ 10%‬ב ל ב ד‬
‫ב ש נ י ה מ ק ר י ם ‪ ,‬ל א ח ר נ י ס ו י ש י ט ו ת שבירה ש ו נ ו ת ‪,‬‬
‫ל א נמצאה פ ע י ל ו ת ה י ד ר ו ל י ט י ת כ ל פ י א ל נ י ל & ‪ -‬נ פ ת י ל א מ י ד ב ת ס נ י ן ה ת א י ם‬
‫השבורים‪.‬‬
‫‪,1‬‬
‫ח ו ס ר ה י צ י ב ו ת של ה פ פ ט י ד ז ‪ -‬א מ י ד ז בתכשיר ק ר ו מ י ‪ ,‬אף‬
‫‪2-Mercaptoethanol‬‬
‫‪ m M‬מ ע י ד על ח י ו נ י ו ת ה א ר ג ו ן השלם‬
‫של התא ל ה ת ב ט א ו ת ת ק י נ ה של ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת ה מ מ ב ר נ ל י ת ‪ .‬ל פ י‬
‫ה ק ר י ט ר י ו נ י ם של ב י ד ו ד א נ ז י מ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם )‪ (111‬אפשר לתאר ס ו ג‬
‫א נ ז י מ י ם זה ב ח ל ב ו נ י ם א י נ ט ג ר ל י י ם‬
‫הפעילות‬
‫מהסיבות‬
‫בלתי‬
‫)אינטרינםיים(‪.‬‬
‫א י ב ו ד נ י כ ר של‬
‫ה ה י ד ר ו ל י ט י ת במעבר מהרמה ה ת א י ת לרמה מ מ ב ר נ ל י ת י כ ו ל ל ה י ו ת‬
‫הבאות‪:‬‬
‫עיכול פרוטאוליטי א נ ד ו ג נ י בקרום המבודד‪,‬‬
‫ה פ י כ י ם ה נ ו צ ר י ם בקרום כתוצאה מ ה ל י ז י ם ה ה י פ ו ט ו נ י‬
‫לשוני‬
‫באינטראקציה ב י ן‬
‫פקטורים‬
‫שינויים‬
‫הגורמים‬
‫ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם )‪ ,(112,113‬א ו א י ב ו ד‬
‫הדרושים ל פ ע י ל ו ת או‬
‫ליציבות האנזים‪.‬‬
‫אי ל כ ך לא ה י ה באפשרותי ל ב ד ו ק‬
‫ו ל ה ש ו ו ת את ה ת כ ו נ ו ת של ה א מ י ד ז‬
‫‪72‬‬
‫והפפטידז בתכשיר הקרומי לתכונות האנזים )אנזימים( שאופיינו‬
‫בהאים‬
‫שלמים‪.‬‬
‫‪4.7‬‬
‫חדירות ‪ A. laidlawii‬לאלנין וקביעת נפה האינולין‬
‫התחלקות ‪-!.‬אלניו וחומרים גבה מולקולריים ביו נפח המים התוך‪-‬תאי‬
‫והחוץ‪-‬תאי של תאי ‪ A. laidlawii‬נמדדה עם תאים מורחפים בתמיסת מלחים‬
‫איזוטונית‪ ,‬כמתואר בחלק הנסיוני )פרק ‪ . ( 3 . 4‬היות וחדירת האלניו לתאים‬
‫נקבעת על ידי מנית הרדיואקטיביות בדוגמא של ה‪ ,Pellet -‬יש לקחת‬
‫בחטבוו‬
‫את הנפח הביו‪-‬תאי הנקבע באמצעות חומרים גבה מולקולריים כאינוליו‬
‫ודקםטרו שאינם חודרים לתאים‪.‬‬
‫התוצאות המסוכמות בטבלה ‪ 9‬מראות בבירור שבתנאי הנסי וו התאים‬
‫אינם חדירים ל א ל נ י ו ‪ ,‬היות ואלניו נמצא מוגבל לנפח האינוליו‬
‫)‪ (Trapped Volume‬המהווה כ‪ 60% -‬מנפח ה‪.Pellet -‬‬
‫טבלה ‪:9‬‬
‫התחלקות‬
‫‪ ,L-Alanine‬דקסטרן ואינולין ב‪Pellet -‬‬
‫של ‪A. laidlawii‬‬
‫‪Relative‬‬
‫** ‪solute‬‬
‫‪Concentration‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Concentration x 10 M‬‬
‫*‪in supernatant in pellet‬‬
‫‪solute‬‬
‫‪0.60‬‬
‫‪0.10‬‬
‫‪0.17‬‬
‫‪Dextran‬‬
‫‪0.58‬‬
‫‪8.60‬‬
‫‪14.60‬‬
‫‪Inulin‬‬
‫‪0.63‬‬
‫‪0.22‬‬
‫‪0.35‬‬
‫‪L-Alanine‬‬
‫* הריכוז מחושב לגבי תכולת המים של ה‪Pellet -‬‬
‫שנקבעה‬
‫בנפרד‬
‫כמתואר בחלק הנםיוני )פרק ‪. ( 3 . 6‬‬
‫** ריכוז המומס ב‪ Pellet -‬הושווה לריכוזו‬
‫האחרוו נלקח כ‪. 1 . 0 0 0 -‬‬
‫בתסנין‪,‬‬
‫כאער הערך‬
‫‪73‬‬
‫(‪L-‬‬
‫ב נ ס י ו נ ו ת המסוכמים בטבלה ‪ 10‬ה ו ד ג ר ו התאים עם ‪C) Alanine‬‬
‫ו ‪ ( H) Inulin -‬בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת או במדיום ג י ד ו ל ט ר י ‪ .‬יחם‬
‫‪3‬‬
‫האלנין‬
‫ל א י נ ו ל י ן )‪C/ H‬‬
‫‪14‬‬
‫ב ‪Pellet -‬‬
‫(‬
‫הושווה ליחס חומרים אלה‬
‫בתערובת ה א י נ ק ו ב צ י ה ‪ ,‬כ ע ב ו ר ‪ 20‬דקות‪ .‬ר י כ ו ז י א ל נ י ו‬
‫ו א י נ ו ל י ו ב ‪Pellet -‬‬
‫התאים חושבו ל ג ב י נ פ ח המים הכללי של ‪ Pellet‬״‬
‫ל ‪L-Alanine -‬‬
‫טבלה ‪ :10‬ח ד י ר ו ת ‪A. laidlawii‬‬
‫‪Ratio‬‬
‫‪L-alanine/‬‬
‫‪inulin‬‬
‫)‪(normalized‬‬
‫‪Inulin‬‬
‫)‪(nmole/yl‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪L-alanine‬‬
‫)‪(nmole/pl‬‬
‫‪0.236‬‬
‫‪1.7‬‬
‫‪Fraction‬‬
‫‪analyzed‬‬
‫‪Suspension 0.071‬‬
‫‪0.142+0.011 0.267±0.003‬‬
‫‪0.233‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪Suspension 0.074‬‬
‫‪Salt solution‬‬
‫‪Pellet‬‬
‫תרחיף ה א י נ ק ו ב צ י ה הכיל תאי ‪laidlawii‬‬
‫‪ 1 { A .‬מייל‪,‬‬
‫מ ל ח י ם ‪9,250mMNaCl ;10mM MgCl ) , p H‬‬
‫‪.‬‬
‫‪2‬‬
‫‪Potassium Phosphate50‬‬
‫‪Growth medium‬‬
‫‪Pellet‬‬
‫‪0.083±0.004 0.256±0.008‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪Incubation‬‬
‫‪mixture‬‬
‫‪10x6‬‬
‫;‬
‫‪7‬‬
‫‪ ( m M‬א ו ב מ ד י ו ם ג י ד ו ל טרי גם כן‪,‬‬
‫מ י ק ר ו ל י ט ר מתמיסת מוצא של החומרים ה ר ד י ו ­‬
‫ב ‪,7.9pH -‬‬
‫ו‪-40‬‬
‫אקטיביים‪.‬‬
‫תמיסת המוצא ה ו כ נ ה כתערובת של‪:‬‬
‫‪3‬‬
‫‪M - ( H-Methoxy)Inulinx101‬‬
‫‪14‬‬
‫‪- ( C-U)L-Alanine‬‬
‫‪3‬‬
‫‪25CCi/mole,‬פעילותספציפית‬
‫‪M‬‬
‫‪e‬‬
‫‪l‬‬
‫‪o‬‬
‫‪m‬‬
‫‪/‬‬
‫‪i‬‬
‫‪C‬‬
‫ביחס של ‪ v / v ( ) 1:1‬־ א י נ ק ו ב צ י ה נעשתה ב ‪ C37° -‬ללא טלטול‪ .‬ד ג י מ ו ת‬
‫של ‪ 200‬מ י ק ר ו ל י ט ר נלקחו אחרי ‪ 20‬דקות ו ‪ Pellets -‬ה ו כ נ ו לספירה‬
‫כמתואר בפרק ה נ ס י ו נ י )פרק ‪ .(3.5‬בכל נסי ו ו ‪ ,‬היחס של א ל נ י ן‬
‫לאינוליו‬
‫שנקבע בתרחיף ה א י נ ק ו ב צ י ה נלקח כ ‪. 1.0 -‬‬
‫בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת ‪ ,‬יחס ר י כ ו ז י א ל נ י ו ל א י נ ו ל י ו ב ‪Pellet -‬‬
‫נמצא שווה ליחס זה בתרחיף ה א י נ ק ו ב צ י ה ‪ ,‬בתקופת זמו מ ‪ 2 -‬דקות עד‬
‫‪ 70‬דקות )בטבלה מובא ל ד ו ג מ א הערך שנקבע כעבור ‪ 20‬ד ק ו ת ( ‪ .‬אי ל כ ך ‪ ,‬נמצא‬
‫כי א ל נ י ו תופס את א ו ת ו חלק של נ פ ח ה‪ Pellet -‬כמו ה א י נ ו ל י ו המשמש כםמו‬
‫‪,‬‬
‫‪74‬‬
‫של הנפח ה ב י ו ‪ -‬ת א י ‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬תאים המורחבים ב מ ד י ו ם ג י ד ו ל טרי‬
‫באותו ‪ ,pH‬נמצאו ח ד י ר י ם ל א ל נ י ן ‪ -‬היחס א ל נ י ן ל א י נ ו ל י ן גבוה‬
‫ב‪ Pellet -‬בהשוואה לתרחיף‪ .‬יחס זה עלה מ‪ 1.2 -‬כעבור ‪ 2‬דקות ל ‪2.5 -‬‬
‫כעבור ‪ 70‬דקות‪.‬‬
‫ד י ו ן בפרק ‪4.7‬‬
‫ה נ ם י ו נ ו ת לקביעת ח ד י ר ו ת תאי ‪ laidlawii‬״‪ A‬ל א ל נ י ן ‪ ,‬בתנאים של ב ו פ ר‬
‫איזוטוני‬
‫בהשוואה ל מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל ‪ ,‬נעשו כ ד י לברר את מידת החדירות של‬
‫התאים בתנאים בהם ב ד ק נ ו את פ ע י ל ו ת ם כלפי א ל נ י ל נפתילאמיד ו כ ל פ י‬
‫אוליגופפטידים‪.‬‬
‫מצאנו כי בתנאים בהם נבדקו פ ע י ל ו י ו ת הפפטידז ו ה א מ י ד ז ‪,‬‬
‫ד ה י י נ ו תמיסת ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י ת ‪ ,‬התאים א י נ ם ח ד י ר י ם ל א ל נ י ן ‪ ,‬הממלא את הנפח‬
‫הביו ת א י ‪ .‬מתוצאה ז ו הסקנו כ י פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת אלו הקשורות לממברנה‬
‫ממוקמות בעברה ה פ ו נ ה ל מ ד י ו ם ה ח י צ ו נ י ‪.‬‬
‫על טרנספורט של פ פ ט י ד י ם ב ח י י ד ק י ם י ד ו ע כ י ק י י מ ו ת מערכות להחדרת‬
‫דיפפטידים‬
‫ו א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם )‪ .(83‬המסקנות בדבר חדירתם טל פ פ ט י ד י ם מ ב ו ס ס ו ת‬
‫על נ י צ ו ל ם לצורך ג י ד ו ל ‪ ,‬במצע מ ו ג ד ר ‪ .‬במספר מקרים הראו כ י מ ע ר כ ו ת‬
‫הטרנספורט טל פ פ ט י ד י ם נ פ ר ד ו ת מ ה פ פ ט י ד ז ו ת ‪ ,‬זאת על י ד י ט י מ ו ט ב מ ו ט נ ט י ם‬
‫שאיבדו את פ ע י ל ו ת הפפטידז אך מ ס ו ג ל י ם להחדיר את הפפטיד או ל ה י פ ך ‪ ,‬א י ב ד ו‬
‫את כושר ההחדרה בעוד שפעילות הפפטידז לא הופרעה )‪ .(89‬טרנספורט של‬
‫פ פ ט י ד י ם במיקופלסמה לא נבדק עקב הקושי בהרכבת מ ד י ו ם מ ו ג ד ר ‪ .‬דרישת‬
‫מיקופלסמה לחומצות א מ י נ י ו ת הוגדרה עבור מספר מצומצם של מ י נ י ם ‪.‬‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫דורש ‪ 17‬חומצות א מ י נ י ו ת במצע ה ג י ד ו ל ‪ ,‬אך א ל נ י ו א י נ ה חומצה‬
‫הכרחית ‪ -‬פ נ י ל א ל נ י ו‬
‫ו ט י ר ו ז י ו מספקים גם את הדרישה ל א ל נ י ן )‪ .(114‬ב ס ו ג אחר‬
‫‪ Mycoplsma strain Y‬הראו כי א ל נ י ו א י נ ו דרוש בחומצה החופשית ב מ ד י ו ם‬
‫ומסופק בצורת הטריפפטיד של _‪-1‬אלניו )‪ .(115‬ה י ו ת ולא נמצא קשר ישיר ב י ו‬
‫הדרישה ל פ פ ט י ד י ם של מ י נ י מיקופלסמה מ ס ו י י מ י ם ל ב י ו תכולת החומצות ה א מ י נ י ו ת‬
‫‪75‬‬
‫והרצף שלהן בפפטידים‪ ,‬הועלתה הסברה כ י תפקידם של הפפטידים במצע ה ג י ד ו ל‬
‫לשמש כמנטרלים של חומצות ש ו מ נ י ו ת הדרושות ל ג י ד ו ל )‪ .(116‬תפקיד הפפטידים‬
‫ב ת ז ו נ ה של מיקופלסמה כ ‪-‬‬
‫‪ Growth Promoting Factors‬לא הוכה עד עתה באופך‬
‫ישיר‪.‬‬
‫פיוו‬
‫‪ NADH oxidase‬בממברנה של ‪A. laidlawii‬‬
‫ו ס י מ ו ו ‪4.8‬‬
‫‪ laidlawii‬״‪ A‬נמנה עם המיקופלסמה הפרמנטטיביים המקבלים את הפחמו‬
‫‪14‬‬
‫ו ה א נ ר ג י ה מ פ י ר ו ק של ס ו כ ר י ם שש פ ח מ נ י י ם ‪ .‬מתו ג ל ו ק ו ז ‪c -‬‬
‫של ה ס י מ ו ו ב ‪-‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ , co‬אצטט‪ ,‬פ י ר ו ב ט ולקטט‪ .‬ה מ י נ י ם ה פ ר מ נ ט ט י ב י י ם ה י נ ם‬
‫בעלי שרשרת הימצוו המסתיימת ב פ ל ב י ו )‪ ,(117‬בדומה ל ‪-‬‬
‫מנדיוו‪,‬‬
‫מראה פ י ז ו ר‬
‫‪ Lactobacilli‬״‬
‫ד י כ ל ו ר ו פ נ ו ל א י נ ד ו פ נ ו ל ו פ ר י צ י א נ י ד י כ ו ל י ם להחליף החמצו‬
‫כאקספטורים לחימצוו ה‪-‬‬
‫‪ Cyt C . NADH‬לעומת זאת‪ ,‬א י נ ו י כ ו ל לשמש‬
‫כאקספטור‪ .‬מערכת מעבר ה א ל ק ט ר ו נ י ם ב ‪ A. laidlawii -‬מכילה פ ל ב ו פ ר ו ט א י ו‬
‫אחד או ש נ י י ם )‪ ;(48‬ה פ ע י ל ו ת א י נ ה ת ל ו י ה ב ל י פ י ד י ם הממברנליים )‪(27‬‬
‫ו א י נ ה מושפעת ממצבם ה פ י ס י ק ל י )‪ .(118‬ממצאים אלה מצביעים על כך שמערכת‬
‫מעבר האלקטרונים ב ‪A. laidlawii -‬‬
‫כנראה א י נ ה משולבת באופו הדוק‬
‫ב י ו ת ר במבנה הממברנה‪ ,‬ב נ י ג ו ד ל ‪NADH oxidase -‬‬
‫‪ lysodeikticus‬הדורש ל י פ י ד י ם ל פ ע י ל ו ת ו )‪.(119‬‬
‫ב‪-‬‬
‫‪Micrococcus‬‬
‫מעבר האלקטרונים ב מ י נ י ם פ ר מ נ ט ט י ב י י ם של מיקופלסמה ל פ י ‪(67) Smith‬‬
‫מתואר ב צ י ו ר הםכימתי‪:‬‬
‫‪MENADIONE‬‬
‫\‬
‫‪I‬‬
‫‪/‬‬
‫‪NADP‬‬
‫‪76‬‬
‫ע ב ו ד ת ו של‬
‫בפרקציות‬
‫‪Pollack‬‬
‫ע ל מ י ק ו ם פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת של מ י ק ו פ ל ס מ ה‬
‫ה ש ו נ ו ת של התא הראתה כ ל ה פ ע י ל ו ת של‬
‫ב ־ ‪A. laidlawii‬‬
‫קשורה ל מ מ ב ר נ ה )‪.(26‬‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫לעומת ז א ת ‪,‬‬
‫פעילות‬
‫‪ NADPH oxidase‬מ צ ו י י ר ‪ .‬ב א ו פ ו ב ל ע ד י ב פ ר ק צ י ה ה מ ס י ס ה של ה ת א ‪.‬‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫ה מ י ק ו ם של‬
‫שונה במיקופלסמה הדורשים םטרול לעומת האכולפלםמה שאינם‬
‫דורשים םטרול ‪ -‬ב ר א ש ו נ י ם ה פ ע י ל ו ת ה י א מםיסה ב ע ו ד ש ב א ח ר ו נ י ם ה פ ע י ל ו ת‬
‫קשורה ל ק ר ו ם התא )‪.(120‬‬
‫ה א נ ז י ם המחמצו ‪ NADH‬א י נ ו ב ה כ ר ח ק ש ו ר ל מ מ ב ר נ ה‬
‫של מ י ק ו פ ל ם מ ה ‪ ,‬כ פ י ש נ כ ו ו ב ד ר ך כ ל ל ב ח י י ד ק י ם )‪.(121‬‬
‫ה‪-‬‬
‫‪ NADH oxidase‬של ‪A. laidlawii‬‬
‫מ ב ו ק ר ת ע ל י ד י רמת ה ‪ ADP -‬״ בקרה‬
‫ז ו א פ י י נ י ת ר ק ל א נ ז י ם הקשור ל מ מ ב ר נ ה ‪,‬‬
‫ר ג י ש כ ל ל ל ‪. ( A D P(122-‬‬
‫המסיס‬
‫בעוד שהאנזים הציטופלםמטי א י נ ו‬
‫הבדלים נוספים ב י ו‬
‫נמצאו ביחס פ ע י ל ו י ו ת ה א ו ק ם י ד ז‬
‫ל א י נ א ק ט י ב צ י ה ע ל י ד י ח ו ם )‪.(123‬‬
‫פעילות‬
‫ה א נ ז י ם הממברנלי‬
‫לאוקםידורדוקטז וכו‬
‫פעילות ה‪-‬‬
‫לאנזים‬
‫הרגישות‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫ב ‪ A. laidlawii -‬נמצאה י צ י ב ה ב ת נ א י ם ד ר ס ט י י ם של ט י פ ו ל ב מ מ ב ר נ ה כ מ ו‬
‫אצטוו‬
‫מכילה‬
‫מ י מ י ‪ ,‬אבקת ה א צ ט ו ו המתקבלת ב ע ק ב ו ת מ י צ ו י ר ו ב ה ש ו מ נ י ם ע ד י י ו‬
‫פ ע י ל ו ת א ו ק ם י ד ז )‪.(124‬‬
‫דיאליזה‬
‫כ נ ג ד בופר המכיל‬
‫יוני‬
‫מ מ ב ר נ ו ת שהומסו‬
‫ב ד ט ר ג נ ט ו ע ב ר ו לאחר מכו‬
‫מ ג נ ז י ו ם ‪ ,‬מראות פ ע י ל ו ת‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫ה ע ו ל ה ע ם מ י ד ת ה א ג ר ג צ י ה )‪ .(125‬ה ס ת ב ר כ י ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ח ו ז ר ת ג ם‬
‫כשהריאגרגציה‬
‫א י נ ה ס פ צ י פ י ת )‪ ,(126‬כ ך כאשר משתמשים ב ד ט ר ג נ ט י ו נ י‬
‫כמו‬
‫‪ SDS‬ה ג ו ר ם ל ש י נ ו י י ם ד נ ט ו ר ט י ב י י ם ב ל ת י ה פ י כ י ם ב מ ב נ ה ח ל ב ו נ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם‬
‫)‪,(127‬‬
‫ולאחר מ כ ו מ ר ח י ק י ם את הדטרגנט יוצאת ל פ ו ע ל א ג ר ג צ י ה ה מ ל ו ו ה‬
‫פעילות‬
‫ב ‪ A. laidlawii -‬ק ש ו ר‬
‫באופו‬
‫א נ ז י מ ט י ת ‪ .‬ה ע ו ב ד ה ש‪-‬‬
‫א י נ ט ג ר ל י בממברנה‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫ו י צ י ב ב מ י ד ה ר ב ה ל ט י פ ו ל י ם ש ו נ י ם )‪ ,(27‬מאפשרת‬
‫ב ד י ק ת ההשפעות של מ ו ד י פ י ק צ י ו ת כ י מ י ו ת א ו א נ ז י מ ט י ו ת ע ל פ ע י ל ו ת ה א נ ז י ם ‪.‬‬
‫המסה מ ב ו ק ר ת של ה מ מ ב ר נ ה ע ל י ד י ד ט ר ג נ ט לא י ו נ י‬
‫נ ו ת נ ת אפשרות ל ב ד ו ק‬
‫‪77‬‬
‫את ה מ ז ו מ נ ו ת של ה ח ל ב ו נ י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם ל מ ע כ ב י ם ב מ מ ב ר נ ה שעברה ש י נ ו י ‪,‬‬
‫ב ה ש ו ו א ה למצב ה מ ק ו ר י ‪.‬‬
‫במטרה ל ק ב ל מ י ד ע על הקשר ב י ו‬
‫בממברנה‬
‫ושלמות המבנה‪,‬‬
‫‪ NADH oxidase‬ל ב י ן מ ר כ י ב י ם א ח ר י ם‬
‫נ י ס י נ ו ל ב ח ו ו את השפעת הרחקתם ה ס ל ק ט י ב י ת של‬
‫ל י פ י ד י ם א ו ח ל ב ו נ י ם מ ו ה מ מ ב ר נ ה על ה פ ע י ל ו ת ה נ מ ד ד ת ‪.‬‬
‫פעולת פ ו ס פ ו ל י פ ז ו ת ‪A‬‬
‫‪4.8.1‬‬
‫ו־ ‪C‬‬
‫תכשיר ק ר ו מ י של ‪A. laidlawii‬‬
‫על מ מ ב ר נ ת‬
‫ה ו כ ו על י ד י ל י ז י ס א ו ם מ ו ט י של‬
‫ה ת א י ם ‪ ,‬אשר נ ק צ ר ו ב פ ז ה ה ל ו ג ר י ת מ י ת )‪ 18‬ש ע י ( ‪,‬‬
‫משך ‪ 30‬ד ק ו ת ב ‪-‬‬
‫‪37°‬‬
‫ונשמרו‬
‫‪8‬‬
‫בבופר‬
‫ב ב ו פ ר ‪ 8‬מ ה ו ל ‪,1:20‬‬
‫) ‪ C‬פ ר ק ‪ .(3.7‬ה מ מ ב ר נ ו ת ר ו כ ז ו ‪ ,‬לאחר הרחקת ת א י ם‬
‫שלא ע ב ר ו ל י ז י ם ‪ ,‬על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ב ‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪A.laidlawii‬‬
‫‪40,000‬‬
‫‪ ,‬משך ‪ 40‬ד ק ו ת ‪,‬‬
‫‪xg‬‬
‫המהול ב ‪ - C 2 0 °‬־‬
‫תכשיר של פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ C‬מ ‪-‬‬
‫‪ (Sigma) C l . welchii‬א ו מ ‪-‬‬
‫‪ (Makor) B» cereus‬ב ר י כ ו ז של ‪ 2‬מ ״ ג ‪ /‬מ ״ ל ע ב ר ט י פ ו ל מ ו ק ד ם של ח י מ ו ם‬
‫ת‬
‫נ‬
‫‪ A‬מ‪-‬‬
‫ל‬
‫ו‬
‫ו‬
‫י‬
‫ת‬
‫‪(Worthington) Crotalus adamenteus‬‬
‫‪0‬‬
‫‪1‬‬
‫ב ר י כ ו ז של ‪ 1‬מ ״ ג ‪ /‬מ ״ ל‬
‫לא ע ב ר ט י פ ו ל מ י ו ח ד ‪ .‬התכשיר ה ק ר ו מ י מ ‪A. laidlawii -‬‬
‫פ ו ס פ ו ל י פ ז‪C(200‬‬
‫ב ‪ C37° -‬למשך ‪15‬‬
‫מ י ק ר ו ג ר ם ( א ו עם פ ו ם פ ו ל י פ ז‪A(100‬‬
‫דקותפעילות‬
‫)‬
‫הפרדתם ב צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה‬
‫פעילות‬
‫‪0‬‬
‫‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫‪.‬‬
‫פוםפוליפז‬
‫ה ו ד ג ר עם‬
‫מיקרוגרם(‪,‬‬
‫‪ NADH‬א ו ק ם י ד ז נ ב ד ק ה ב ת ע ר ו ב ת ה ה ד ג ר ה‬
‫‪,‬‬
‫‪xg‬‬
‫‪40,000‬‬
‫דקות(‬
‫ה א ו ק ם י ד ז נ ב ד ק ה כ מ ת ו א ר ב פ ר ק ‪ ,3.9‬ע ל י ד י מעקב א ח ר ה י ר י ד ה‬
‫‪-4‬‬
‫ב‪-‬‬
‫‪340‬‬
‫‪ n m‬ע ם הוספת‬
‫תוצאות‬
‫‪NADH‬‬
‫ב ר י כ ו ז של ‪M‬‬
‫‪2xl0‬־‪ l‬־‬
‫ב ד י ק ת ה פ ע י ל ו ת של תכשיר ק ר ו מ י מ ‪ A. laidlawii -‬ב ח י מ צ ו ו‬
‫‪ NADH‬לאחר ט י פ ו ל ב פ ו ס פ ו ל י פ ז ו ת מ ת ו א ר ב צ י ו ר ‪. 11‬‬
78
‫ן‬
1
‫ה‬
1
1
1
1
1
1
1
1
o Membranes
° Phospholipase A treated membranes
• Phospholipase C treated membranes
& Soluble fraction
A Soluble fraction
A Insoluble fraction
»Insoluble traction
l
l
1
l
2
l
3
‫ י ד י‬- ‫ ע ל‬NADH
‫בפוספוליפזות‬
I
I
I
I
I
1
4 5
time (min)
2
‫מעקב ט פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י אחר ח י מ צ ו ן‬
‫אשר ט ו פ ל ו‬
:11
‫ציור‬
A. l a i d l a w i i - ‫מ מ ב ר נ ו ת מ‬
: ‫ מייל( ה כ י ל ה‬3) ‫ה ר י א ק צ י ה ל ב ד י ק ה ה ס פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י ת‬
‫ מ ת מ י ס ת מ ו צ א‬NADH ‫ מ י ק ר ו ל י ט ר‬10 ; ( ‫ מ ״ ג ח ל ב ו ו‬0.4)
;pH7.4 ‫־‬
I
‫תערובת‬
‫תכשיר ק ר ו מ י‬
2
10mM T r i s - H C l ; 25mM NaCl ; 3 6 x l 0 ‫ ־‬M ‫של‬
‫ ב ת ע ר ו ב ת‬NADH ‫ה ר י כ ו ז ה ס ו פ י של‬
I
3 4 5
time (min)
o
‫ ״‬m M Mercaptoethanol
-4
o l x l 0 M‫־‬2 ‫ה ר י א ק צ י ה ה י ה‬
‫‪79‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת של ה ת כ ש י ר ה ק ר ו מ י ב ת נ א י ם אלה נ מ צ א ה‬
‫‪ 0.42‬מ י ק ר ו מ ו ל י מ ‪ /‬ד ק ה ‪ /‬מ ״ ג ח ל ב ו ן ‪ .‬ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת של ה ת כ ש י ר ה ק ר ו מ י‬
‫שעבר ט י פ ו ל על י ד י פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ושל ה ת ס נ י ן של התכשיו‬
‫המטופל‬
‫מ ו צ ג ו ת ב ט ב ל ה ‪.11‬‬
‫טבלה ‪:11‬‬
‫המסת‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫על י ד י הפעלת פ ו ס פ ו ל י פ ז ‪ A‬ו‪(:-‬‬
‫על ממברנת ‪A. laidlawii‬‬
‫‪Phospholipase C‬‬
‫‪Phpspholipase A‬‬
‫‪ymole NADH/‬‬
‫‪% of ymole NADH/‬‬
‫‪% of‬‬
‫‪min/mg‬‬
‫‪initial‬‬
‫‪min/mg‬‬
‫‪initial‬‬
‫‪protein‬‬
‫‪activi ty‬‬
‫‪protein‬‬
‫‪activity‬‬
‫‪84‬‬
‫‪0.354‬‬
‫‪78.5‬‬
‫‪0.33‬‬
‫‪78‬‬
‫‪0.33‬‬
‫‪74‬‬
‫‪0.31‬‬
‫‪Enzyme‬‬
‫‪treated‬‬
‫‪membrane‬‬
‫‪preparation‬‬
‫‪Supernatant‬‬
‫התנאים לבדיקת ה פ ע י ל ו ת של ‪ NADH‬א ו ק ם י ד ז ה י ו כמפורט בהסבר‬
‫ל צ י ו ר ‪ .11‬ה פ ע י ל ו ת חושבה מן החלק ה ל י נ א ר י של ה ר י א ק צ י ה ‪ ,‬ד ה י י נ ו‬
‫בדקה הראשונה אחרי הוספת ‪ .NADH‬ה פ ע י ל ו ת הספציפית מבוטאת‬
‫כ ‪ ymole NADH -‬אשר התחמצנו בדקה על י ד י ‪ 1‬מ״ג של ח ל ב ו ן ‪.‬‬
‫של התכשיר הקרומי היתר‪.‬‬
‫חלבון‬
‫‪0.42‬‬
‫‪.ymole/min/mg‬‬
‫ב ת ס נ י ן היה ‪ 0.36-0.37‬מ״ג ‪.‬‬
‫תוצאות ה נ ס י ו ן של ש י נ ו י מבוקר בתכשיר הקרומי על י ד י הפעלת‬
‫פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת מצביעות על מ ס ק נ ו ת הבאות‪:‬‬
‫א(‬
‫כתוצאה מ ש נ ו י י ם ב פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם של הקרום נגרמה א י נ א ק ט י ב צ י ה‬
‫מועטת של פ ע י ל ו ת ה א ו ק ס י ד ז ‪ ,‬בשיעור של ‪ .15-20%‬ר ז י ו ו ק ב ו צ ת ו‬
‫מצאו גם כן כ י אפשר להרחיק את ר ו ב ה ל י פ י ד י ם הממברנלים‬
‫מהפרקציה המכילה ‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז על עמודת ‪G-200‬‬
‫ב נ ו כ ח ו ת דטרגנט ולקבל ע ד י י ו פ ע י ל ו ת נ י כ ר ת )‪. (27‬‬
‫‪Sephadex‬‬
‫‪80‬‬
‫ב(‬
‫ה ש י נ ו י י ם ב ל י פ י ד י ם של הקרום גרמו להופעת הפעילות‬
‫‪40,000‬‬
‫האוקםידטיבית ב ח ל ק י ק י ם שאינם שוקעים ב ‪-‬‬
‫‪g‬‬
‫‪x‬‬
‫‪ .‬במשקע‬
‫נמצאו רק עקבות פ ע י ל ו ת ‪ . > 5% ,‬ב ב י ק ו ר ת של תכשיר קרומי שהודגר‬
‫במקביל בתנאים ז ה י ם ‪ ,‬בהעדר פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ ,‬לא אבדה פ ע י ל ו ת ו כ ן לא‬
‫היה שחרור של פ ע י ל ו ת א ו ק ס י ד ז ל ת ס נ י ן ‪ .‬אי ל כ ך א י ן ל ה נ י ח שהמםת‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת היא תוצאה של פרגמנטציה של הממברנה בתנאי‬
‫ההדגרה‪.‬‬
‫‪ ( J i n k s (48‬אשר ק י ב ל ‪NADH‬‬
‫ד ה י ד ר ו ג נ ז "מסים" ב מ י צ ו י א ת נ ו ל י‬
‫של ממברנת ‪ A. laidlawii‬הראה כ י פ ע י ל ו ת ז ו עשירה ב ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם‬
‫)‪ (30-40%‬ולכן קשה לקבלה בצורה מםיסה‪ .‬מ י צ ו י ה ל י פ י ד י ם בדרך ז ו‬
‫גרם להריסת פ ע י ל ו ת האוקםידז עם חמצן מ ו ל ק ו ל ר י כאקםפטור‪ ,‬ומאידך‬
‫ל נ י ק ו י של ה ד ה י ד ר ו ג נ ז שהוא כנראה חלק מקומפלכם ה ‪ NADH -‬א ו ק ס י ד ז ‪.‬‬
‫‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז "מסים" מ ו פ י ע בנפה ה פ נ ו י של עמודת ‪,Sephadex G-200‬‬
‫ממצא המעיד על האופי האגרגטיבי של א נ ז י ם זה )‪.(27‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת הספציפית של התכשיר הקרומי הבלתי מטופל שמצאתי דומה‬
‫ל פ ע י ל ו ת שמצא‪ ( L a r r a g a(123‬בתכשיר שהוכן מתרבית בת ‪ 18‬שעות‪.‬‬
‫מ ע נ י ן כ י ה פ ע י ל ו ת עולה פ י ‪ 10‬עם עלית ג י ל התאים‪ ,‬ממצא שלא הוסבר‬
‫על ידם‪.‬‬
‫‪4.8.2‬‬
‫השפעת המסה סלקטיבית של הממברנה‬
‫על פ ע י ל ו ת‬
‫באמצעות דטרגנט‬
‫לא י ו ג י‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫הדטרגנטים הלא י ו נ י ם‬
‫שפעילותם בהמסת הממברנה חלשה י ו ת ר מאשר‬
‫הדטרגנטים ה י ו נ י י ם ‪ ,‬נמצאו מתאימים י ו ת ר להמסה מבוקרת ובלתי‬
‫ד נ ט ו ר ט י ב י ת של הממברנה‪ .‬במקרים אחדים קבלו בדרך ז ו קומפלכםים‬
‫ל י פ ו פ ר ו ט א י נ י ם אשר שמרו על פ ע י ל ו ת א נ ז י מ ט י ת )‪ .(128‬בחנתי את‬
‫י ע י ל ו ת הדטרגנט ‪ Tween 20‬בהמסת תכשיר ממברנלי שהוכן ^ ‪, A . l a i d l a w i i‬‬
‫‪81‬‬
‫על ידי בדיקה של חלבונים ופוםפוליפידים אשר שוחררו לתמיסה לעומת‬
‫אלה שנשארו קשורים לממברנה אחרי הטיפול בדטרגנט‪ .‬בדקתי את מיקום‬
‫ה‪ NADH oxidase -‬אם בפרקציה המסיסה או הבלתי מםיסה לאחר הטיפול‪,‬‬
‫והשוויתי את הפעילות האנזימטית של הממברנה שטופלה בדטרגנט‬
‫לפעילות הממברנה המקורית בתנאי ‪ pH‬שונים וכן תגובה למעכבים‪.‬‬
‫‪4.8.2.1‬‬
‫מיצוי של חלבונים ופוספוליפידים מממברנת‬
‫‪ A, laidlawii‬על ידי ‪Tween 20‬‬
‫המסת הממברנה נעשתה על ידי הוספת נפח אחד של בופר ‪3‬‬
‫‪Atlas chemie GMBH, E s s e n‬‬
‫)‬
‫‪Tween5%‬‬
‫‪ (Germany‬לנפח אחד של תכשיר ממברנלי )‪ 7.5‬מ״ג חלבון ב‪ 1 -‬מייל(‪.‬‬
‫אחרי ‪ 60‬דקות בטמפרטורת החדר םורכזה התערובת משך ‪ 30‬דקות‬
‫ב‪-‬‬
‫‪40,000‬‬
‫‪xg‬‬
‫״ פעילות‬
‫‪ NADH oxidase‬נבדקה בתערובת‬
‫האינקובציה‪ ,‬במשקע אשר הורחף בבופר ‪ 8‬לנפח ההתחלתי ןבתםנין‪,‬‬
‫כמתואר בפרק ‪ . 3 . 9‬חלבון נקבע בשיטת ‪ Lowry‬־ פוספט אורגני‬
‫נקבע כמתואר בפרק ‪ , 3 . 8‬עם ‪-6‬גליצרופוםפט כסטנדרט‪ .‬פיזור‬
‫הפעילות האנזימטית‪ ,‬חלבון ופוםפט בתערובת ההדגרה‪ ,‬משקע ותסנין‬
‫מתוארים בטבלה ‪ . 1 2‬יש לציין כי הממברנות איבדו כתוצאה מהטיפול‬
‫בדטרגנט את הצבע הצהוב של הקרוטנואידים ופלבין‪ ,‬אשר הופיע‬
‫בתסנין‪.‬‬
‫‪82‬‬
‫טבלה‬
‫המסה של מ מ ב ר נ ת ‪ A. laidlawii‬ב ‪Tween 20 -‬‬
‫‪:12‬‬
‫וההשפעה ע ל פ ע י ל ו ת‬
‫‪NADH oxidase‬‬
‫‪specific‬‬
‫‪total‬‬
‫‪activity protein activity phosphate‬‬
‫‪ymole/mg ymole‬‬
‫‪AOD/min‬‬
‫‪mg‬‬
‫‪protein‬‬
‫‪3.6‬‬
‫‪0.288‬‬
‫‪7.5‬‬
‫‪2.4‬‬
‫‪membrane‬‬
‫‪preparation‬‬
‫‪1.2‬‬
‫‪0.518‬‬
‫‪5.4‬‬
‫‪2.8‬‬
‫‪Tween‬‬
‫‪treated‬‬
‫‪membrane‬‬
‫‪insoluble‬‬
‫‪fraction‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.06‬‬
‫‪solubilized‬‬
‫‪material‬‬
‫ספקטרופוטומטרי‬
‫פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז נ ב ד ק ה ב א ו פ ו‬
‫ב ת ע ר ו ב ת ר י א ק צ י ה אשר ה כ י ל ה א ת ה מ ר כ י ב י ם ה ב א י ם נ ב ‪ 3 -‬מייל(‪:‬‬
‫ת כ ש י ר ק ר ו מ י )‪ 0.75‬מ ״ ג ח ל ב ו ו ( א ו ת כ ש י ר ל א ח ר ה ט י פ ו ל‬
‫ב ד ט ר ג נ ט }‪ 0.27‬מ ״ ג ח ל ב ו ו ( ; ‪ 10‬מ י ק ר ו ל י ט ר ‪ NADH‬מ ת מ י ס ת‬
‫‪2‬‬
‫‪xlO«63‬‬
‫‪10m‬־‪ M‬מוצאש ר י כ ו ז ה‬
‫ב ‪0.5 -‬״‪ . 7mM Mercaptoethanol ;pH4‬ה ר י כ ו ז ה ס ו פ י טל‬
‫‪-4‬‬
‫‪ NADH‬ב ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ה י ה ‪M‬‬
‫‪.1,2x10‬‬
‫חושבה מ ו החלק ה ל י נ א ר י של ה ר י א ק צ י ה ‪.‬‬
‫מבןטאת‬
‫חלבוו‬
‫המהירות ההתחלתית‬
‫הפעילות הספציפית‬
‫כ מ י ק ר ו מ ו ל י ם ‪ NADH‬אשר ה ת ח מ צ נ ו בדקה ע ל י ד י ‪ 1‬מ ״ ג‬
‫קרומי‪.‬‬
‫ה ת ו צ א ו ת ה מ ס ו כ מ ו ת בטבלה ‪ 12‬מ צ ב י ע ו ת ע ל ה מ ס ק נ ו ת ה ב א ו ת ‪:‬‬
‫א‪.‬‬
‫כ ת ו צ א ה מ ו ה א י נ ט ר א ק צ י ה ב י ו ה ד ט ר ג נ ט ‪ Tween 20‬ל ת כ ש י ר‬
‫ה ק ר ו מ י ל א התרחשה א י נ א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ם י ד ט י ב י ת ‪.‬‬
‫ה י ת ה ע ל י ת מה ב כ ל ל פ ע י ל ו ת ה ת כ ש י ר ‪.‬‬
‫ב‪.‬‬
‫ה ט י פ ו ל ב ד ט ר ג נ ט ג ר ם ל מ י צ ו י ס ל ק ט י ב י של ח ל ב ו נ י ם‬
‫׳ופוספוליפידים‪.‬‬
‫ב ת כ ש י ר ה ק ר ו מ י לאחר ה מ י צ ו י נ מ צ א ו ‪ 73%‬מ ה ח ל ב ו ו‬
‫ו ־ ‪ 33%‬מ ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם ‪ ,‬ב ה ש ו ו א ה ל ת כ ש י ר ה מ ק ו ר י ‪ .‬ה י ח ס ח ל ב ו ו ‪:‬‬
‫‪83‬‬
‫ל י פ י ד השתנה‬
‫ג‪.‬‬
‫מ‪ 2:1 -‬ל ‪ ,4.5:1 -‬כלומר העשרה נ י כ ר ת ב ח ל ב ו ן ‪.‬‬
‫עקב ה מ י צ ו י הסלקטיבי עלתה הפעילות ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת הספציפית‬
‫של התכשיר הקרומי פ י ‪. 1.8‬‬
‫ד‪.‬‬
‫פ ע י ל ו ת ה‪ NADH -‬א ו ק ס י ד ז נמצאה ממוקמת באופן בלעדי בפרקציה‬
‫של הממברנה המטופלת בדטרגנט אשר הושקעה ב‪-‬‬
‫‪4.8.2.2‬‬
‫אלקטרופוריזה ב‪-‬‬
‫‪40,000‬‬
‫‪.‬‬
‫‪xg‬‬
‫‪ SDS-Polyacrylamide gel‬של תכשיר‬
‫ק ר ו מ י לאחר מ י צ ו י ב ‪-‬‬
‫‪Tween 20‬‬
‫האם ההרחקה הסלקטיבית של ל י פ י ד י ם לעומת ח ל ב ו נ י ם ו ש י נ ו י‬
‫היחס ח ל ב ו ן ‪ :‬ל י פ י ד ‪ ,‬כ פ י שהראינו בפרק הקודם‪ ,‬השפיעה על א ר ג ו ן‬
‫ה ח ל ב ו נ י ם בממברנה? על שאלה ז ו נ י ס י נ ו ל ע נ ו ת על י ד י בדיקה‬
‫א ל ק ט ר ו פ ו ר י ט י ת של ח ל ב ו נ י הממברנה לאחר מ י צ ו י ב ‪-‬‬
‫‪Tween 20‬‬
‫בהשוואה לממברנה המקורית‪ .‬ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה נעשתה כמתואר בפרק ‪,3.10‬‬
‫ב ג ל י ם של ‪ 7.5%‬אקרילאמיד ה מ כ י ל י ם‬
‫‪ 7,2pH‬המכיל‬
‫ב‪-‬‬
‫‪1%‬‬
‫‪0,1%‬‬
‫‪ . S D S‬ההרצה היתה בבופר פוספט‬
‫‪ S D S‬ד ג י מ ו ת מתכשיר ק ר ו מ י ‪ ,‬תכשיר ק ר ו מ י שטופל‪.‬‬
‫‪ Tween 20‬ו ת ס נ י ן של תכשיר זה ‪ -‬נמהלו ‪ 1:10‬בבופר פוספט‬
‫‪ ,7pH M0.075,‬המכיל ‪2 S D S 1 0 %‬‬
‫־‬
‫ו ־ ‪ -‬מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ‪ .‬ד נ ט ו ר צ י ה של‬
‫ת נעשתה ב־ ‪C100°‬־‪ 90‬משך ‪ 3‬ד ק ו ת ד ו ג מ א ו ת המכילות‬
‫‪.‬‬
‫‪50‬‬
‫מ י ק ר ו ג ר ם חלבון הושמו על הגל אשר ב צ י נ ו ר י ת ‪ .‬א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה בוצעה‬
‫בטמפרטורת החדר משך כ ‪ 3 -‬שעות‪ ,‬עד אשר הצבע ב ר ו מ ו פ נ ו ל ‪ -‬כ ח ו ל המסמן‬
‫את ח ז י ת ה נ ד י ד ה ה ג י ע למרחק של כ ‪ 2 -‬מ״מ מקצה ה צ י נ ו ר י ת ‪ ,‬בתנאים‬
‫של‪mA8‬ל ג ל )‪30‬זאת לאחר פ ר א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה של‬
‫פרםולפט(‪.‬‬
‫עם‬
‫דקות ל ס י ל ו ק א מ ו נ י ו ם‬
‫צביעת ה ג ל י ם ‪ ,‬לאחר פיקסציה במתנול‪-‬חומצת חומץ‪ ,‬נעשתה‬
‫‪,Coomassie blue‬‬
‫‪84‬‬
‫ג‬
‫ציור ‪:12‬‬
‫א‬
‫ב‬
‫אלקטרופוריזר‪ .‬של ח ל ב ו נ י ממברנת ‪A. laidlawii‬‬
‫לפני‬
‫ואחרי ט י פ ו ל ב ‪-‬‬
‫‪Tween 20‬‬
‫)א(‬
‫תכשיר ק ר ו מ י ; )ב( תכשיר קרומי לאחר ט י פ ו ל בדטרגנט;‬
‫)ג(‬
‫ת ס נ י ן של התכשיר הקרומי המטופל‪.‬‬
‫תמונת האלקטרופוריזה של ח ל ב ו נ י הקרום לאחר מ י צ ו י בדטרגנט‬
‫)ב( מראה הבדלים בהשוואה לתכשיר הקרומי המקורי )א( ‪ -‬פסים מס‪2 .‬‬
‫) נ מ ו ך מ ו ל ק ו ל ר י ( ומם‪) 9 .‬גבה מ ו ל ק ו ל ר י ( חסרים; במקום פסים מם‪3 .‬‬
‫ו ‪ 4 -‬מ ו פ י ע פס אחד שמרחק נ ד י ד ת ו הוא ב י ו שני פסים אלה‪ .‬ב ת ס נ י ן‬
‫)‪40,000‬‬
‫‪g‬‬
‫( של התכשיר המטופל בדטרגנט ה ו פ י ע ו שני פסים גבה‬
‫‪x‬‬
‫מולקולרים‪.‬‬
‫שקיבלו‬
‫תמונת ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה של התכשיר הקרומי דומה לתמונה‬
‫‪Hjerten‬‬
‫ו ‪ ( J o h a n s s o n(129-‬המסקנה היא שנוסף על מ י צ ו י‬
‫חלק מהחלבוו הממברנלי‪ .‬ל ת ס נ י ו ‪ ,‬גרם הדטרגנט ל ש י נ ו י מהותי במבנה‬
‫הקרום אשר התבטא ב נ ד י ד ה שונה של חלק מ ה פ ו ל י פ פ ט י ד י ם ‪.‬‬
‫‪85‬‬
‫ע י כ ו ב ו ר י א ק ט י ב צ י ה טל פ ע י ל ו ת‬
‫‪4.8.2.3‬‬
‫שטופלה ב ‪-‬‬
‫המיצוי‬
‫לשינוי‬
‫ב א ר ג ו ן שארית מ ר כ י ב י ה מ מ ב ר נ ה ‪,‬‬
‫ב י ט ו י לכך גם בשוני‬
‫הבדלים‬
‫בהשוואה לממברנה ר ג י ל ה‬
‫ה ס ל ק ט י ב י של ה ק ר ו ם ו ש י נ ו י י ח ם ה ח ל ב ו ן ‪ :‬ל י פ י ד ג ו ר מ י ם‬
‫מהותי‬
‫האוקסידז‬
‫‪,Tween 20‬‬
‫‪ NADH oxidase‬ב מ מ ב ר נ ה‬
‫י ת כ ן א י פ ו א שימצא‬
‫ב ת כ ו נ ו ת של ה א נ ז י ם ה ק ש ו ר ‪.‬‬
‫ב ח נ ת י על כ ן האם‬
‫ה ק ש ו ר ל מ מ ב ר נ ה ‪ ,‬שמוצו מ מ נ ה ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם ‪ ,‬מראה‬
‫ב ר ג י ש ו ת ל מ ע כ ב י ם ב ה ש ו ו א ה ל מ מ ב ר נ ה ה מ ק ו ר י ת ‪ .‬למטרה ז ו‬
‫בריאגנט המגיב באופן‬
‫השתמשתי‬
‫ו ר ב ר ס י ב ל י עם ק ב ו צ ו ת ‪-SH‬‬
‫ספציפי‬
‫ב ח ל ב ו נ י ם ‪.p-Chloromercuriphenyl sulfonate (PCMBS) (Sigma) -‬‬
‫פעילות‬
‫מהלך‬
‫‪ NADH oxidase‬ב נ ו כ ח ו ת‬
‫‪ PCMBS‬נ ב ד ק ה כ מ ת ו א ר ב פ ר ק ‪.3.9‬‬
‫ה ע י כ ו ב עם ‪ PCMBS‬של מ מ ב ר נ ה שמוצתה ב ד ט ר ג נ ט ל ע ו מ ת תכשיר‬
‫ממברנת‬
‫ר ג י ל מתואר ב צ י ו ר ‪. 1 3‬‬
‫התוצאות‬
‫המובאות ב צ י ו ר זה מראות כ י‬
‫ב נ ו כ ח ו ת ‪ PCMBS‬ב ר י כ ו ז‬
‫‪-4‬‬
‫של‪M0xl3‬״‪-95%‬מ ו ש ג ע י כ ו ב מ י י ד י טל למעלה‬
‫האוקםידז‪.‬‬
‫הפעילות‬
‫ב ר י כ ו ז ה נ מ ו ך י ו ת ר טל‬
‫‪4‬‬
‫‪l‬־‪66xlC. M‬‬
‫מ‪8‬‬
‫של פ ע י ל ו ת‬
‫אין‬
‫ע י כ ו ב של‬
‫ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת ‪ . .‬מ י ד ת ה ע י כ ו ב של ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת‬
‫ד ו מ ה הן ב ת כ ש י ר מ מ ב ר נ ל י ר ג י ל ו ה ן ל א ח ר מ י צ ו י ו ב ד ט ר ג נ ט‬
‫‪ ,Tween 20‬מה שמראה על ר ג י ש ו ת ד ו מ ה של ה א נ ז י ם ב ש נ י ה ת כ ש י ר י ם‬
‫למעכב‪.‬‬
‫ר י א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ‪ ,‬ה מ ע ו כ ב ת על י ד י ‪,PCMBS‬‬
‫נ ב ד ק ה בשתי ד ר כ י ם ‪:‬‬
‫א( על י ד י ה ד ג ר ה מ ו ק ד מ ת של ת כ ש י ר מ מ ב ר נ ל י ר ג י ל א ו תכשיר‬
‫שטופל‬
‫ב ד ט ר ג נ ט ‪ ,‬במשך ‪ 1 0‬ד ק ו ת ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ח ד ר ‪ ,‬עם‬
‫‪ B-Mercaptoethanol‬ב ר י כ ו ז ס ו פ י של ‪ .5mM‬לאחר מ כ ן‬
‫פעילות‬
‫ה א ו ק ם י ד ז טל ש נ י התכשירים‪.‬‬
‫נבדקה‬
‫‪86‬‬
‫ב( על ידי הוספת מרקפטואתנול לתערוכת ריאקציה המכילה‬
‫‪ NADH‬ותכשיר ממברנלי המעוכב על ידי ‪.PCMBS‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫ן‬
‫ן‬
‫ו‬
‫‪1‬‬
‫ו‬
‫‪Membranes‬‬
‫‪-3‬‬
‫^‪1.66x10‬‬
‫‪membranes‬‬
‫‪M‬‬
‫‪8.3x10‬‬
‫‪T w e e n 20 treated‬‬
‫•‬
‫‪Tween‬‬
‫‪x‬‬
‫‪mernb.+PCMB‬‬
‫‪M‬‬
‫‪-4‬‬
‫‪1.66x10 M‬‬
‫‪8.3»I0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪x Membranes • P C M B‬‬
‫‪Membrones-fPCMB‬‬
‫•‬
‫‪;*Membranes• P C M B‬‬
‫‪1.0,‬‬
‫‪K‬‬
‫‪-n‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫*‬
‫‪M‬‬
‫‪o‬‬
‫וד־י־**ץ‬
‫\‬
‫\‬
‫\‬
‫•‬
‫‪o‬‬
‫גי‬‫‪ro‬‬
‫‪V‬‬
‫‪°‬‬
‫‪Q‬‬
‫‪O‬‬
‫\‬
‫‪0 5‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫)‪time (min‬‬
‫ציור ‪:13‬‬
‫פעילות ‪ NADH‬אוקסידז הקשור לממברנת‬
‫‪ ,A. laidlawii‬בנוכחות ‪PCMBS‬‬
‫תערובת הריאקציה בקיווטה הכילה‪ :‬בופר ‪Tris-HCl 50mM‬‬
‫ב‪ ;pH7 6 -‬כמות אקויולנטית של תכשיר ממברנלי שטופל‬
‫‪0‬‬
‫ב‪ Tween 20 -‬או של תכשיר ממברנלי רגיל; ‪ PCMBS‬בריכוזים‬
‫שונים‪ .‬התחלת הריאקציה על ידי הוספת ‪ NADH‬לריכוז סופי‬
‫של ‪ M‬־‪3xlO‬־‬
‫‪4‬‬
‫‪87‬‬
‫תוצאות נםיונות הריאקטיבציה מסוכמים בציור ‪.14‬‬
‫‪1‬‬
‫ו‪1‬‬
‫‪r‬‬
‫‪T‬‬
‫‪1‬‬
‫‪o - Tween 20 treated membranes‬‬
‫‪• - Tween 20 treated membranes• ME‬‬
‫‪T‬‬
‫‪o - Membranes‬‬
‫)‪Membrane$«PCMB(3.3xl0' M‬‬
‫‪4‬‬
‫‪a-‬‬
‫‪• - Membranes• ME‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪(•ME‬‬
‫‪I‬‬
‫\‬
‫‪0.4‬‬
‫‪o‬‬
‫‪6‬‬
‫•‬
‫•‬
‫\‬
‫‪J‬‬
‫‪L‬‬
‫‪5‬‬
‫‪4‬‬
‫ציור‬
‫‪:14‬‬
‫\‬
‫‪I‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪0.2‬‬
‫\‬
‫‪I‬‬
‫‪I‬‬
‫‪1‬‬
‫‪I‬‬
‫‪5‬‬
‫‪I‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫)‪time (min‬‬
‫ריאקטיבציה של ‪ NADH‬אוקסידז ממברנלי עם‬
‫‪Mercaptoethanol‬‬
‫בדיקת פעילות האוקסידז נעשתה כמתואר בהסבר לציור ‪,13‬‬
‫‪4‬־‬
‫ריכוז ‪ NADH‬בתערובת הריאקציה היה ‪o l 8xl0 M‬‬
‫־‬
‫הנסיונות מראים כי תכשיר ממברנות רגיל‪ ,‬בהעדר מרקפטואתנול‪,‬‬
‫אינו מראה את מלוא פעילותו בהימצוו ‪ .NADH‬אם פעילות התכשיר היתה‬
‫‪ , D0min 0A / 1 2‬הרי בנוכחות מרקפטואתנול הגיעה הפעילות‬
‫־‬
‫‪,‬‬
‫‪Q34‬‬
‫‪0 42/min‬‬
‫‪o‬‬
‫‪q‬‬
‫‪5‬‬
‫תוספת מרקפטואתנול לתכשיר לפני הריאקציה עם‬
‫‪.‬‬
‫‪. 3‬‬
‫‪ NADH‬או במהלכה‪,‬‬
‫כאשר הפעילות מעוכבת על ידי ‪ , PCMBS‬תוצאתה שווה דהיינו‬
‫אקטיבציה של הפעילות האוקםידטיבית לערך מירבי דומה‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬תכשיר ממברנלי לאחר מיצוי חלק מהחלבונים והליפידים‬
‫מראה פעילות אוקסידטיבית מירבית גם בהעדר מרקפטואתנול‪ ,‬פעילות‬
‫‪88‬‬
‫ה ג ב ו ה ה פ י ‪ 1.3‬ב ה ש ו ו א ה ל ת כ ש י ר ה מ מ ב ר נ ו ת ה מ ק ו ר י ‪.‬‬
‫מ ס ק נ ו ת ה נ ם י ו נ ו ת ה מ ו ב א י ם ל ע י ל מ צ ב י ע י ם על מ ע ו ר ב ו ת ש ו נ ה‬
‫של ק ב ו צ ו ת ‪ SH‬ב ה ת ב ט א ו ת ה מ י ר ב י ת של ה א ו ק ס י ד ז ה מ מ ב ר נ ל י ‪ .‬ח ל ק‬
‫מ ק ב ו צ ו ת ה ‪ SH -‬ה מ ע ו ר ב ו ת ב כ ‪ 70% -‬מ ה פ ע י ל ו ת של ה א ו ק ס י ד ז ‪ ,‬ר ג י ש‬
‫ל ח מ צ ן ה א ו י ר ו ל כ ן פ ע י ל ו ת ז ו ב א ה ל י ד י ב י ט ו י מ ל א רק ב נ ו כ ח ו ת‬
‫מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ‪ .‬שאר ק ב ו צ ו ת ה ‪ SH -‬אשר א י נ ן ר ג י ש ו ת ל ח מ צ ן ה א ו י ר‬
‫נ ת נ ו ת ל ע י כ ו ב ע ל י ד י ‪ .PCMBS‬ה ר ג י ש ו ת ה ש ו נ ה של ה א ו ק ס י ד ז ל ח מ צ ן‬
‫ו ל ‪ PCMBS -‬מ ר מ ז ת ע ל מ י ק ו ם א ו מ י ד ת ח ט י פ ה ט ו נ י ם של ק ב ו צ ו ת ‪SH‬‬
‫בתכטיר הקרומי‪.‬‬
‫א י ב ו ד ה ר ג י ש ו ת טל ה א ו ק ס י ד ז ל מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ב ת כ ט י ר ט מ ו צ ו‬
‫מ מ נ ו ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם מראה על התרחשות ש י נ ו י י ם בלתי ה פ י כ י ם‬
‫ב מ ב נ ה ה ק ר ו ם ‪ .‬נ י ת ן לשער כ י ע ק ב ה ו צ א ת ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם‬
‫מהממברנה חל ש י נ ו י ב א ר ג ו ן שארית ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם ה פ ר ק צ י ה‬
‫ה ב ל ת י מ ס י ט ה ‪ ,‬ה מ ש פ י ע על י י צ ו ב ק ב ו צ ו ת ה ‪ SH -‬ה ח י ו נ י ו ת ל פ ע י ל ו ת‬
‫ה א נ ז י מ ט י ת ‪ .‬נ ם י ו נ ו ת אלה א י נ ם מ ו כ י ח י ם אם מ ע ו ר ב ו ת ק ב ו צ ו ת‬
‫ה ‪ SH -‬ה י נ ה מ י ב נ י ת ‪ ,‬ד ה י י נ ו ק ב ו צ ו ת ה ‪ SH -‬ב מ צ ב ה מ ח ו ז ר ד ר ו ש ו ת‬
‫ל י י צ ו ב מ ב נ ה ה ק ר ו ם ה מ ב ו ד ד ‪ .‬י ת כ ן ג ם כ י ק ב ו צ ו ת ‪ SH‬דרושות באופן‬
‫יטיר לתהליך הקטליטי בקיטור הםובםטרט או ב מ נ ג נ ו ן החימצון‪.‬‬
‫‪ 4.8.2.4‬ה ט פ ע ת ט י פ ו ל ב ד ט ר ג נ ט‬
‫א ו ק ס י ד ז ה מ מ נ ר נ ל י ב ת נ א י ‪ pH‬ט ו נ י ם‬
‫ה ר א י נ ו כ י מ י צ ו י ס ל ק ט י ב י של ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם מהקרום‬
‫מ ש פ י ע ע ל פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ם י ד ז ‪ ,‬ב כ ך ש מ ש ת נ ה ה ס ב י ב ה הקרובה טל‬
‫ק ב ו צ ו ת ה ‪ SH -‬ה ח י ו נ י ו ת ל פ ע י ל ו ת ו ה ר ג י ש ו ת ל ע י כ ו ב על י ד י ‪PCMBS‬״‬
‫ב ד ק ת י ב א ם ה ש י נ ו י ב‪croenvironment-‬יווה ‪ ,‬ע ק ב א ר ג ו ן מ ח ד ש של‬
‫ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם בקרום לאחר ה מ י צ ו י ‪ ,‬בא ל י ד י ב י ט ו י גם‬
‫‪ Tween -20‬על פ ע י ל ו ת ‪NADH‬‬
‫‪89‬‬
‫בתכונה אחרת של ה א נ ז י ם ‪ -‬פ ע י ל ו ת בתנאי ‪ pH‬ט ו נ י ם ‪ .‬לשם כך בחנתי‬
‫פ ע י ל ו ת של תכשיר ק ר ו מ י ‪ ,‬ל פ נ י ואחרי מ י צ ו י עם ‪,Tween -20‬‬
‫בחימצון ‪ NADH‬בשיטה המתוארת בפרק ‪ .3.9‬תוצאות הבדיקות מסוכמות‬
‫ב צ י ו ר ‪ 15‬ובטבלה ‪. 13‬‬
‫ו‬
‫ו‬
‫ו‬
‫ו‬
‫‪1‬‬
‫‪ Tween treated membranes pH 76‬ם‬
‫‪l‬‬
‫‪l l l‬‬
‫‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫‪5‬‬
‫)‪time (min‬‬
‫צ י ו ר ‪:15‬‬
‫‪J‬‬
‫‪1 2‬‬
‫מעקב ספקטרופוטומטרי אחר פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ם י ד ז של תכשיר‬
‫קרומי לאחר מ י צ ו י ב ‪ Tween -‬ושל תכשיר ק ר ו מ י ר ג י ל ‪ ,‬בתנאי‬
‫‪ pH‬ט ו נ י ם‬
‫תערובת הריאקציה ב ק י ו ו ט ה )נפח ס ו פ י ‪ 3‬מייל( הכילה‪ 0.05 :‬מייל תכשיר‬
‫קרומי )‪ 370‬מ י ק ר ו ג ר ם ח ל ב ו ן ( או ‪ 0.1‬מייל תכשיר קרומי לאחר מ י צ ו י כמתואר‬
‫‪-4‬‬
‫חלבון‪ N A D H ; ( 4 . 8 . 2 . 1 )270‬ל ר י כ ו ז ס ו פ י של‪; M 1 0x3‬‬
‫‪5‬״‪-6‬ל‪ p H M mTris-HCl‬או בופר ו ר ו נ ל‪. 5 0 ^806pH7‬‬
‫‪ 5‬הכופרים ה כ י ל ו מרקפטואתנול ב ר י כ ו ז ס ו פ י ‪mM‬‬
‫‪a‬‬
‫‪M‬‬
‫‪m‬‬
‫ש‬
‫נ‬
‫י‬
‫‪90‬‬
‫ה כ ל ל י ת ו ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת אשר ח ו ש ב ו מ צ י ו ר ‪,15‬‬
‫הפעילות‬
‫בטבלה ‪.13‬‬
‫נתונים‬
‫‪:13‬‬
‫טבלה‬
‫ה ש ו ו א ת ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ם י ד ט י ב י ת של ת כ ש י ר ק ר ו מ י‬
‫ל א ח ר מ י צ ו י ו ת כ ש י ר ק ר ו מ י ר ג י ל ‪ ,‬ב ת נ א י ‪ pH‬ט ו נ י ם‬
‫‪pH 7.6‬‬
‫‪pH 8.6‬‬
‫‪specific‬‬
‫‪specific‬‬
‫‪total‬‬
‫‪total‬‬
‫‪activity‬‬
‫‪activity‬‬
‫‪activity‬‬
‫‪activity‬‬
‫‪ymole/min/mg‬‬
‫‪ymole/min/mg‬‬
‫‪pmole/min‬‬
‫‪ymole/min‬‬
‫‪protein‬‬
‫‪protein‬‬
‫‪0.24‬‬
‫‪0.09‬‬
‫‪0.81‬‬
‫‪0.30‬‬
‫‪Membrane‬‬
‫‪preparation‬‬
‫‪2.04‬‬
‫‪0.55‬‬
‫‪1.63‬‬
‫‪0.44‬‬
‫‪Tween‬‬
‫‪treated‬‬
‫‪membrane‬‬
‫‪preparation‬‬
‫ה מ ס ו כ מ ו ת ב ט ב ל ה ז ו מ ר א ו ת על א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת‬
‫התוצאות‬
‫האוקםידטיבית‬
‫בממברנה שמוצו ממנה חלק מ ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם‬
‫על י ד י ה ד ט ר ג נ ט‬
‫ה כ ל ל י ת א ל א ג ם ב ת ז ו ז ה טל מ י ר ב ה פ ע י ל ו ת ל ע ר כ י ‪pH‬‬
‫בפעילות‬
‫גבוהים‬
‫‪pH‬‬
‫‪.Tween‬‬
‫ה ש י נ ו י ב ק ר ו ם מתבטא לא רק ב ע ל י ה‬
‫יותר‪.‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה מ י ר ב י ת של התכשיר ה ק ר ו מ י ה מ ק ו ר י ה י א‬
‫כ‬
‫ו ב ‪ 6 - 7‬־ ‪ p H‬נ מ צ א ו רק‬
‫לעומת זאת‪,‬‬
‫‪8‬‬
‫‪ 30% -‬מ ה פ ע י ל ו ת ה מ י ר ב י ת ‪.‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ם י ד ט י ב י ת של התכשיר ה ק ר ו מ י הממוצה‬
‫ה י א מ י ר ב י ת ב ‪pH6 -‬״‪ 8‬ו א י ל ו ב ‪ 7,,pH6 -‬נ מ צ א ו ‪ 75%‬מ ה פ ע י ל ו ת‬
‫המירבית‪.‬‬
‫האנזים‪,‬‬
‫ת ו פ ע ה ז ו מ ר מ ז ת על ש י נ ו י י ם ב ס ב י ב ה ה מ ק ו מ י ת טל‬
‫ה י כ ו ל י ם להתבטא ב ר י כ ו ז מ ק ו מ י ט ו נ ה של פ ר ו ט ו נ י ם א ו‬
‫סובסטרט‪,‬‬
‫ואשר כ נ ר א ה נ ג ר מ ו כ ת ו צ א ה מ ה א ר ג ו ו מחדש טל ט א ר י ת‬
‫החלבונים‬
‫בפרקציה הבלתי מםיסה לאחר מ י צ ו י חלק מ ה ח ל ב ו נ י ם‬
‫והליפידים‬
‫מהקדום‪.‬‬
‫‪91‬‬
‫‪4.8.3‬‬
‫ס י מ ו ן ז י ק ה של החלבון הפעיל בחימצון ‪ NADH‬בממברנת‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫לסימון זיקה‬
‫נםיון‬
‫)‪ (Affinity labeling‬טל מול‪!.‬ולת)ות(‬
‫החלבון בעלת ה פ ע י ל ו ת בחימצון ‪ NADH‬הממוקמת בקרום טל ‪A. laidlawii‬‬
‫נעטר• על סמך נ ס י ו נ ו ת מוקדמים טל בדיקת הטפעת ‪NAD‬‬
‫ו ‪,NADH -‬‬
‫המחומצנים בקבוצות ‪ H0 '3‬ו ‪ '2 -‬טל ט י י ר ה ר י ב ו ז ‪ ,‬על פ ע י ל ו ת הקרום‬
‫בחימצון ‪ .NADH‬ב ד ק נ ו גם את ח י ו נ י ו ת ן טל ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת חפטיות‬
‫ל פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ם י ד ז על י ד י מ ו ד י פ י ק צ י ה טל תכטיר קרומי עם‬
‫ר י א ג נ ט י ם הפועלים על ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ‪ ,‬כמו‬
‫‪Dansyl chloride,‬‬
‫‪ .Succinic anhydride‬מצאנו כ י ט נ י ה ר י א ג נ ט י ם ה ל ל ו ‪ ,‬ב ר י כ ו ז טל‬
‫‪ mM5‬ו ב ‪-‬‬
‫‪ , 9 . 5 p H 7 . 6‬א י נ ם מטפיעים כלל על פ ע י ל ו ת‬
‫או‬
‫הקרומי‪.‬‬
‫אוקסידז‪NADH‬‬
‫נראה כי ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ח ל ב ו נ י הקרום ז מ י נ ו ת להתמדה מבלי‬
‫ל פ ג ו ע ב פ ע י ל ו ת ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת ‪ ,‬בתנאי ט ה ט י נ ו י א י נ ו באתר הפעיל‪.‬‬
‫חימצון‬
‫ה פ י ר י ד י ן נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם נעשה ל פ י‪ { G i l h a m(130‬אשר תאר‬
‫ק י ט ו ר של נ ו ק ל י א ו ז י ד י ם ‪ ,‬נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם ו ח ו מ צ ו ת נ ו ק ל י א י ו ת‬
‫ל‪-‬‬
‫‪ .Aminoethyl cellulose‬הצימוד נעשה על י ד ו בשלושה שלבים ‪-‬‬
‫חימצון ק ב ו צ ו ת ה ה י ד ר ו ק ס י ל ׳ ‪ - 3‬׳ ‪ 2‬של שייר ה ר י ב ו ז על י ד י פ ר י ו ד ט ‪,‬‬
‫יצירת בסים שיף )‪ (Schiff base‬עם א מ י נ ו א ת י ל צ ל ו ל ו ז ו ל ב ס ו ף ח י ז ו ר‬
‫בסיס שיף עם נתרן ב ו ר ו ה י ד ר י ד ‪ .‬ב ע י ק ר ו ן של שיטה ז ו השתמשנו ל ס י מ ו ן‬
‫הזיקה של ה‪ NADH -‬א ו ק ס י ד ז עם הםובסטרט המותמר ל ד י ‪ -‬א ל ד ה י ד ‪Lamed .‬‬
‫ו ח ב ר י ו )‪ (131‬הטתמטו כ נ ג ז ר ו ת א ל ד ה י ד י ו ת טל נ ו ק ל י א ו ט י ד די ו ט ר י ‪-‬‬
‫פ ו ס פ ט י ם ל ק י ט ו ר ם לעמודת‬
‫‪ Agarose hydrazide‬לצורך הכנת עמודות‬
‫ז י ק ה להפרדת ד ה י ד ר ו ג נ ז ו ת המטתמטות ב פ י ר י ד י ן נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם‬
‫כקופקטורים‪.‬‬
‫‪92‬‬
‫‪4.8.3.1‬‬
‫‪NADH‬לתמיסת‬
‫או‬
‫הכנת פ י ר י ד י ן‬
‫‪NAD‬‬
‫‪(10‬‬
‫נוקליאוטידים מחומצנים‬
‫) ‪ m M‬ב כ ו פ ר‪MTris-HCl0005‬‬
‫ב ‪ ,pH7«6 -‬ה ו ס ף ס ו ד י ו ם מ ט ה פ ר י ו ד ט ל ר י כ ו ז ס ו פ י של ‪.lOmM‬‬
‫תערובת הריאקציה הודגרה ב ‪-‬‬
‫‪ 0 °‬משך שעה‬
‫‪-340nm‬ב‬
‫א‬
‫‪0‬‬
‫ח‬
‫ת‬
‫‪7‬‬
‫‪ .‬ה ב ל י ע ה של‬
‫‪C‬‬
‫‪2‬‬
‫ת ו פ ש י אפשר ל ז ה ו ת על י ד י ב ל י ע הב‪nm-232‬‬
‫‪»0 I‬‬
‫‪*= 6‬‬
‫‪4‬‬
‫"(‪E‬‬
‫ו ל ס ל ק ו על י ד י ה ע ב ר ת‬
‫ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה על ע מ ו ד ת ‪ . ( D o w e x(132-50‬ל פ י י ח ס י ה ב ל י ע ה‬
‫לתמיםות‪,‬‬
‫שעה‪ ,‬ב ה ש ו ו א ה‬
‫הריאקציה‪232nm‬‬
‫של ת ע ר ו ב ת‬
‫של ר י א ג נ ט י ה מ ו צ א ‪ ,‬ל א נשאר "^‪ 10‬ח ו פ ש י ‪.‬‬
‫המחומצנים‬
‫‪4.8.3.2‬‬
‫הפירידין‬
‫נוקלאוטידים‬
‫נשמרו ב ‪ -20°C -‬״‬
‫השפעת פ י ר י ד י ן‬
‫נ ו ק ל י א ו ט י ד י ס מ ח ו מ צ נ י ם על פ ע י ל ו ת‬
‫‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז‬
‫‪NAD‬‬
‫נבדקו‬
‫קרומי‬
‫ו ‪ NADH -‬ד י ‪ -‬א ל ד ה י ד ‪ ,‬אשר ה ו כ נ ו כ מ ת ו א ר ב ס ע י ף ה ק ו ר ם ‪,‬‬
‫כ מ ע כ ב י ם של פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז על י ד י ה ו ס פ ת ם ל ת כ ש י ר‬
‫ב ב ו פ ר ‪0.05M Tris-HCl‬‬
‫מרקפטואתנול(‬
‫ב ‪pH7.6 -‬‬
‫ל ר י כ ו ז ס ו פ י של ‪mM4‬״‪-2‬‬
‫‪.‬‬
‫) ה מ כ י ל ‪10mM‬‬
‫‪ l‬ה פ ע י ל ו ת האוקםידטיבית‬
‫של התכשיר ה ק ר ו מ י נ ב ד ק ה כ ל פ י‪ m M )NADH13‬״ ‪( 0‬‬
‫בפרק‬
‫ב ‪ -‬שוו‪340,‬כמתואר‬
‫‪ . 3.9‬ב מ ה ל ך ה ר י א ק צ י ה שנמשכה כ ־ ‪ 5‬ד ק ו ת נמצא כ י ‪NAD‬‬
‫ד י ‪ -‬א ל ד ה י ד מ ע כ ב את ה פ ע י ל ו ת ב כ ‪ ,20-30% -‬ב ע ו ד ש‪NADH -‬‬
‫די‪-‬אלדהיד‬
‫‪4.8.3.3‬‬
‫ג ו ר ם ל ע י כ ו ב מלא של פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ם י ד ז ‪.‬‬
‫א י נ ט ר א ק צ י ה ב י ן ‪NADH‬‬
‫ריאקצית‬
‫קרומי‬
‫)‬
‫מ״ג‬
‫ה צ י מ ו ד ב י ו ‪NADH‬‬
‫א ל ד ה י ד לתכשיר ק ר ו מ י‬
‫א ל ד ה י ד ) ‪ 2 y m o l e‬־ ‪ ( 7‬ל ב י ן תכשיר‬
‫ח ל ב ו ן ‪ ( 0 . 7‬נעשתה ב ‪0 -‬״‪ ) 9pH‬נ ת ר ן‬
‫‪(M0.1‬‬
‫ביקרבונט‬
‫ת ו ך א י נ ק ו ב צ י ה ב ט מ פ ר ט ו ר ת החדר משך ‪ 90‬דקותכבקורת‪.‬‬
‫שמש פ ר פ ר ט מ מ ב ר נ ו ת ש ה ו ד ג ר ב ב י ק ר ב ו נ ט ב א ו ת ם ת נ א י ם ‪ .‬עם ת ו ם‬
‫‪93‬‬
‫נ ל ק ח ו ד ו ג מ א ו ת מכל פרפרט לבדיקת פ ע י ל ו ת‬
‫הריאקציה‬
‫‪ NADH oxidase‬ב‪ -5‬״‪ 7«1M) pH0‬ב ו פ ר פ ו ס פ ט ‪mM10,‬מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ( ‪.‬‬
‫פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ו ת ש ה ו ד ג ר ב נ ו כ ח ו ת ב י ק ר ב ו נ ט ב ל ב ד הראה פ ע י ל ו ת‬
‫אלדהיד‬
‫‪/min‬‬
‫‪min/0.015AOD‬‬
‫מ ה פ ע י ל ו תהמקורית‪6%‬כלומררק‬
‫בנםיון‬
‫‪.‬‬
‫‪,‬‬
‫ל י י צ ב את בסים ש י ף ‪ ,‬ש נ ו צ ר כ נ ר א ה ב א י נ ט ר א ק צ י ה ב י ן‬
‫ק ב ו צ ת ה א ל ד ה י ד של ה ר י א ג נ ט ו ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ב מ מ ב ר נ ה ‪ ,‬ע ם נ ת ר ן‬
‫ב ו ר ו ה י ד ר י ד ‪ -‬הסתבר כ י נ ת ר ן‬
‫גדולים‬
‫ב ו ר ו ה י ד ר י ד עצמו ג ו ר ם ל ש י נ ו י י ם‬
‫ב מ מ ב ר נ ה ‪ -‬נ ו ס ף ל א י נ א ק ט י ב צ י ה של פ ע י ל ו ת ה‪NADH -‬‬
‫‪ oxidase‬נ ג ר ם כ נ ר א ה ג ם נ ז ק ל ק ר ו ט נ ו א י ד י ם ו ה פ ל ב י נ י ם שכן‬
‫הממברנה מאבדת את צ ב ע ה ה צ ה ו ב ה ט י פ ו ס י ‪.‬‬
‫ע ל מ נ ת ל ב ו ד ד ו ל א פ י י ן את ה ח ל ב ו ן א ו ה ח ל ב ו נ י ם ש ״ ס ו מ נ ו "‬
‫ב ‪ NADH -‬א ל ד ה י ד נ י ס י נ ו ש י ט ו ת ש ו נ ו ת ‪:‬‬
‫גל‬
‫א( א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ב ‪ SDS -‬פ ו ל י א ק ר י ל א מ י ד‬
‫מ מ ב ר נ ו ת ש ט ו פ ל ו ב ‪ NADH -‬א ל ד ה י ד נ ש ט פ ו ‪ ,‬ת ו ך שמירה ע ל‬
‫‪ 9~pH‬ו ט ו פ ל ו ב ב ו פ ר המסה המתאים ל א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה )(‪3.10.‬פרק‬
‫טרופוריזה‬
‫נעשתה ב ג ל י ם של‬
‫אקרילאמיד‬
‫ב נ ו כ ח ו ת‪SDS1%.'0‬‬
‫ב‬
‫״הפרדת ה ח ל ב ו נ י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם ל א הראתה‬
‫ת מ ו נ ה ב ר ו ר ה אך ה ב ח נ ו‬
‫הארת ה ג ל‬
‫הראתה‬
‫‪%‬‬
‫‪5‬‬
‫‪.‬‬
‫‪7‬‬
‫‪-‬‬
‫‪2‬־‪7pH‬‬
‫ב ב ר ו ר בפס פ ל ו א ו ר ם צ נ ט י י ר ק ר ק אחר‬
‫ב מ נ ו ר ת ‪UV‬״ צ ב י ע ת ג ל מ ק ב י ל עם‬
‫‪Coomassie blue‬‬
‫נ ו כ ח ו ת ח ל ב ו ן ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י )מעל ‪ 1 4 0 , 0 0 0‬ל פ י‬
‫נדידת‬
‫סמן ‪ 3‬ג ל ק ט ו ז י ד ז ( ‪ ,‬בראשית ה ג ל ב א ז ו ר ה מ ק ב י ל ל ה ו פ ע ת הפס‬
‫הפלואורםצנטי‪.‬‬
‫נוצרו‬
‫כ נ ר א ה שכתוצאה מ ה ט י פ ו ל עם ‪ NADH‬א ל ד ה י ד‬
‫א ג ר ג ט י ם של ק ו מ פ ו נ נ ט ו ת מ מ ב ר נ ל י ו ת שלא נ פ ר ד ו ב ‪,,SDS -‬‬
‫‪94‬‬
‫ב‪.‬‬
‫ה פ ר ד ה של ת כ ש י ר ק ר ו מ י מ ס ו מ ן ב ‪ NADH -‬ר י ‪ -‬א ל ד ה י ר על‬
‫‪B4Sepharose‬‬
‫עמודת‬
‫תכשיר ק ר ן מ י‬
‫‪(Triton x‬‬
‫בנוכחות‬
‫)‪ 0.5‬מ ״ ג ח ל ב ו ן (‬
‫‪( 1 0 0 - 3 %‬‬
‫‪ 3‬מייל ‪. ( V o i d volume‬‬
‫‪100-Tritonx‬״‬
‫ה מ כ י ל ‪ NADH‬ק ש ו ר ‪ ,‬ה ו מ ם‬
‫ו ה ו ש ם על ע מ ו ד ת ‪ 4B‬ם פ ר ו ז )‪ 15x0.9‬ם״מ;‬
‫ה א ל ו צ י ה היתר‪ ,‬עם ב ו פ ר ‪ 3‬מ ה ו ל ‪ 1:20‬ה מ כ י ל‬
‫‪ Triton x-100‬ב ר י כ ו ז ס ו פ י של ‪.0.16%‬‬
‫באוסף‬
‫פ ר ק צ י ו ת ‪()LKB‬‬
‫ממברנות‬
‫ציור‬
‫ב‪-‬‬
‫ה ב ל י ע ה ב ‪ mM260 -‬ו כ ן‬
‫חלבון לפי‬
‫ת ו צ א ו ת ה ה פ ר ד ה ה מ ו ב א ו ת ב צ י ו ר ‪ 16‬מ ר א ו ת ח פ י פ ה ר ב ה על‬
‫‪Lowry‬״‬
‫עצמו‪.‬‬
‫ונקבעה בהן‬
‫פ ר ק צ י ו ת של ‪ 0.6‬מייל נ א ס פ ו‬
‫הביקורת‪,‬‬
‫מ מ ב ר נ ו ת מ ט ו פ ל ו ת ב ‪ NADH -‬א ל ד ה י ד ו ה ר י א ג נ ט‬
‫שיטה ז ו ל א נמצאה מ ת א י מ ה ל ה פ ר ד ה ה מ ב ו ק ש ת ‪.‬‬
‫‪:16‬‬
‫ה פ ר ד ה של ת כ ש י ר ק ר ו מ י מ ס ו מ ן ב ‪ NADH -‬א ל ד ה י ד ו מ ו מ ם‬
‫‪100-Tritonx‬ע ל ע מ ו ד ת ‪,B4Sephorose‬‬
‫ב נ ו כ ח ו ת הדטרגנט‬
‫‪95‬‬
‫ג‪.‬‬
‫הפרדה של תכשיר קרומי מסומן ב ‪ NADH -‬אלדהיד על עמודת‬
‫‪ B4Sepharose‬ב נ ו כ ח ו ת‬
‫‪58‬‬
‫‪BRIJ‬‬
‫‪ 58BRIJ‬כמו ‪ Triton x-100‬ה י נ ם ד ט ר ג נ ט י ם לא יוניםנגזרות‪,‬‬
‫של ‪Glycol‬‬
‫‪ ,Polyoxyethylene‬כאשר ‪ BRIJ 58‬ה י נ ו ‪Cetyl Alcohol‬‬
‫ו א י ל ו ‪ Triton x-100‬ה י נ ו‬
‫ב‪-‬‬
‫‪ .Octylphenol‬יש ב י נ י ה ם הבדל‬
‫‪ ,Critical micelle concentration‬ו כ ן נמצאו בעלי י ע י ל ו ת‬
‫שונה בהמסת ממברנות ובעלי השפעה שונה על פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת ‪.‬‬
‫תכשיר‬
‫‪2% BRIJ‬‬
‫קרומי מסומן ב ‪NADH -‬‬
‫‪ 5 8‬ה ה פ ר ד ה נעשתה על עמודת ס פ ר ו ז ‪ B4} 26x1.3‬ס״מ‪,‬‬
‫‪ 23‬םמ״ק‬
‫‪0.16%‬‬
‫אלדהיד }‪ 0.5‬מיע ח ל ב י ו ( הומס‬
‫‪BRIJ‬‬
‫‪ ,(void volume‬א ל ו צ י ה עם בופר ‪ 6‬מהול ‪ 1:20‬המכיל‬
‫‪ .‬נאספו פ ר ק צ י ו ת של ‪ 1.1‬מייל ונקבעה בהן הבליעה‬
‫ב‪ - n m 2 6 0 -‬ו ‪ 2 8 0‬־ לדטרגנט עצמו א י ן בליעה בתחום זה ) ב נ י ג ו ד‬
‫ל ‪x100- -‬‬
‫‪ Triton‬שיש ל ו בליעה נ י כ ר ת ב ‪(nm280 -‬״ יחסי הבליעה‬
‫‪ 280/260‬ל ג ב י חמרי המוצא נקבעו בנפרד ונמצאו‬
‫על העמודה(‪NADH :‬‬
‫אלדהיד‬
‫) ב ר י כ ו ז י ם שהושמו‬
‫אלדהיד ‪ ;0.28‬ממברנות מותמרות ב ‪NADH -‬‬
‫‪ ;0.5‬ממברנות לא מ ט ו פ ל ו ת ‪ .1.14‬תוצאות ההפרדה של פרפרט‬
‫הממברנות המותמר עם ‪ NADH‬אלדהיד מ ו ב א ו ת ב צ י ו ר ‪.17‬‬
‫התמונה מראה הפרדה ב י ן הממברנות שעברו מ ו ד י פ י ק צ י ה ל ב י ו עודף‬
‫ה ר י א ג נ ט שלא נקשר‪ ,‬ה מ ו פ י ע ב ‪-‬‬
‫‪ .Void volume‬ב נ ס י ו נ ו ת לקבל‬
‫את החלבון הממברנלי המסומן ב ‪ NADH -‬חופשי מדטרגנט על י ד י‬
‫ד י א ל י ז ה של הפרקציות המתאימות שעברו א ל ו צ י ה מהעמודה כ נ ג ד ב ו פ ר‬
‫התקבלו א ג ר ג ט י ם בלתי מ ס י ס י ם ששקעו בשקית ה ד י א ל י ז ה ‪.‬‬
‫‪96‬‬
‫ז‬
‫‪104‬‬
‫)‬
‫)‬
‫‪OX - NADH treated membranes‬‬
‫‪!reeled membranes‬‬
‫־‬
‫‪OX - NADH‬‬
‫ציור ‪:17‬‬
‫ב‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪m‬‬
‫‪m‬‬
‫‪NADH‬‬
‫‪n‬‬
‫‪n‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪oxidized‬‬
‫‪6‬‬
‫‪8‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫הפרדה של תכשיר קרומי מסומן כ‪-‬‬
‫‪Brij‬‬
‫‪58‬‬
‫(‬
‫(‬
‫‪NADH‬‬
‫•‬
‫»‬
‫אלדהיד ומומם‬
‫על עמודת ‪ ,B4Sepharose‬כנוכחות הדטרגנט‬
‫תוצאות נםיוו םימוו תזיקר‪ .‬של ‪NADH‬‬
‫די‪-‬אלדהיד מצביעות על‬
‫‪-‬ם‬
‫אוקסידז הקרומי באמצעות ‪NADH‬‬
‫המסקנות הבאות‪NADH :‬‬
‫די‪-‬אלדחיד בניגוד ל‪!AD! -‬‬
‫‪1‬‬
‫די‪-‬אלדהיד מעכב את הפעילות האוקםידטיבית באופו מוחלט ומתאים לשמש כמעכב‬
‫זיקה‪ .‬קישור הנוקליאוטיד המותמר לקרום‪ ,‬כפי שנראה בנםיוו האלקטרופוריזה‬
‫בנוכחות ‪ ,SDS‬גרם לשינוי במצב החלבונים בקרום ולהופעת אגרגטים גבה‬
‫מולקולרים‪ .‬הריאגנט בהיותו בי‪-‬פונקציונלי יתכו וגרם לצילוב של שרשרות‬
‫פוליפפטידיות שמבחינה מבנית מצויות בקרבה רבה אך אינו שייכות לאותה‬
‫מולקולת חלבוו‪ .‬התכשיר הקרומי המותמר ב‪ NADH -‬די‪-‬אלדהיד נתו להמסה‬
‫על ידי הדטרגנטים ‪Triton x-100‬‬
‫ו‪ Brij 58 -‬״ העובדה שהפרקציה המכילה‬
‫‪97‬‬
‫את ה‪ NADH -‬הקשור היא גבה מ ו ל ק ו ל ר י ת באה ל י ד י ב י ט ו י בהופעתה‬
‫‪volume‬‬
‫‪-void‬‬
‫‪B4‬‬
‫ב נ ו כ ח ו ת‪Tritonx.58100-Brij‬‬
‫נמצא מתאים י ו ת ר להפרדת הפרקציה ה ח ל ב ו נ י ת המסומנת‪ ,‬אך כל ה נ ם י ו נ ו ת ל נ ק ו ת‬
‫את החלבון המסומן שיצא מהעמודה ב נ ו כ ח ו ת הדטרגנט על י ד י ד י א ל י ז ה ‪ -‬לא ע ל ו ‪.‬‬
‫אי לכך נ מ נ ע המשך ה א י פ י ו ן של הקרום המותמר על י ד י מעכב ה ז י ק ה ‪.‬‬
‫‪98‬‬
‫‪.5‬‬
‫די ן ן‬
‫מסכם‬
‫בחלקה הראשון של עבודה זו זיהיתי ואיפיינתי פעילות ארילאמידז ופפטידז‬
‫‪•Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma fermentans‬‬
‫בשני מיני מיקופלסמה‪,‬‬
‫הארילאמידז הוא אנזים המפרק ‪-5‬נפתילאמידים של _‪-1‬חומצות אמיניות לחומצה‬
‫האמינית ו‪-6 -‬נפתילאמין‪ ,‬והינו מוכר בחיידקים באנזים תוך‪-‬תאי )‪. (137‬‬
‫תפקידו הפיסיולוגי העיקרי כנראה בםינתיזה ודגרדציה של פוליפפטידים‪ ,‬אם כי‬
‫לא ברור מהו הםובסטרט הטבעי של אנזים זה‪ .‬ב‪ Pseudomonas -‬מצאו כי הפעילות‬
‫היא מירבית כאשר התאים בפזה הלוגריתמית ויורדת בפזה הקבועה‪.‬‬
‫המאפיין את הארילאמידז של שני מיני המיקופלםמה‪ ,‬כפי שהראיתי‪ ,‬היותו‬
‫אנזים קשור לקרום התא‪ .‬תאים שלמים‪ ,‬מורחפים בבופר איזוטוני‪ ,‬מפרקים את‬
‫הסובסטרט הנפתילאמידי‪ .‬עם שבירת התא התקבלה הפעילות האמידטית באופן בלעדי‬
‫יה השוקעת ב‪-‬‬
‫‪g‬‬
‫‪40,000‬‬
‫‪x‬‬
‫‪ ,‬מהירות בה ניתן להשקיע את הממברנה של‬
‫מיקופלםמה‪ .‬הפעילות האמידטית של התכשיר הקרומי לא היתר‪ ,‬יציבה ודעכה‬
‫במהירות‪ ,‬גם ב‪ , C0° -‬עם זמן מחצית חיים של כ‪ -‬שעות‪ .2.5‬הניצולת הנמוכה‬
‫ואי היציבות של האמידז בתכשיר הקרומי‪ ,‬גם בנוכחות מרקפטואתנול‪ ,‬מעידים‬
‫על המעורבות של האנזים במבנה הממברנה ואולי אף על אפשרות של קשר‬
‫פונקציונלי עם מרכיבים אחרים בקרום‪.‬‬
‫שני מיני המיקופלםמה השונים נבדלו גם בספציפיות לגבי פרוק‬
‫הנפתילאמידים של חומצות אמיניות שונות‪.‬‬
‫‪ M. fermentans‬הראה אפיניות‬
‫גבוהה ביותר בביקוע היסטידיל נפתילאמיד בעוד ש‪ A. laidlawii -‬היה פעיל‬
‫ביותר כלפי אלניל נפתילאמיד‪ .‬הוצע להשתמש בספציפיות של הארילאמידז כאמצעי‬
‫למיון של חיידקים‬
‫)‪.(138‬‬
‫נמצא למשל כי ניתן להבדיל בין‬
‫‪Leptospirae‬‬
‫פתוגניים לבלתי פתוגניים על סמך נוכחות הארילאמידז בזנים הפתוגניים בלבד‬
‫)‪.(139‬‬
‫וחבריו‬
‫מיון מיקופלסמה על פי פעילות אנזימטית הוצעה כבר על ידי בירגר‬
‫)‪.(140‬‬
‫חוקרים אלה הראו גם כן פעילות נפתילאמידז של תאי מיקופלםמה‬
‫‪99‬‬
‫ממינים שונים‪ ,‬מורחפים בתמיסת מלח‪ ,‬אך ה‪ 0‬השתמשו בשיטה קולורימטרית‬
‫שהרגישות שלה נמוכה וכן לא הגדירו את הספציפיות של המינים השונים לחומצות‬
‫האמיניות השונות‪ .‬השיטה הפלואורימטרית בה השתמשתי לבדיקת פעילות‬
‫דז הינה פי ‪1000‬‬
‫יותר רגישה וניתן לזהות באמצעותה‬
‫‪005‬‬
‫‪nmole‬‬
‫של‬
‫נפתילאמין‪.‬‬
‫הארילאמידז של מיקופלםמה‪ ,‬בדומה לארילאמידז הבקטריאלי‪ ,‬הינו‬
‫אמינופפטידז כלומר דורש לפעילותו קבוצה גו‪-‬אמינית חופשית‪ .‬בניגוד‬
‫לארילאמידזות טל בעלי חיים )‪ (141,142‬הדורשים יוני‬
‫מתכת דו‪-‬ערכית‬
‫לפעילותם‪ ,‬הארילאמידזות בחיידקים אינם תלויים במתכות‪ .‬גם הארילאמידז של‬
‫מיקופלםמה אינו דורש יוני‬
‫ומאידך תוספת או העדר יוני‬
‫מתכת; טיפול ב‪ EDTA -‬אינו גורם לאינאקטיבציה‬
‫מגנזיום או סידן בבופר הריאקציה אינה משפיעה‬
‫על מהירות ההידרוליזה‪ .‬לקבוצת ה‪-6 -‬נפתילאמין יש כנראה חשיבות ביצירת‬
‫הקומפלכס אנזים‪-‬סובסטרט היות ומצאתי כי פירוק תרכובת ק‪-‬ניטרואניליד של‬
‫אלנין הרבה יותר איטי בהשוואה לנפתילאמיד‪.‬‬
‫כמו בחיידקים‪ ,‬לא ברור מהו הםובסטרט הטבעי עליו פועל הארילאמידז של‬
‫המיקופלסמה אך מיקומו בקרום התא יכול להעיד על תפקידים נוספים מלבד‬
‫ביוסינתיזה ודגרדציה של חלבונים‪ ,‬למשל בניצול חומצות אמיגיות מפפטידים‬
‫במדיום‪ .‬הממצא שפעילות היסטידיל נפתילאמידז וכן כושר ההחדרה של היםטידין‬
‫ב‪ M. fermentans -‬מעוכבים במידה דומה על ידי טיפול בתאים ביודואצטט‪,‬‬
‫יכול לתמוך בכוון מחשבה על קשר פונקציונלי בין הארילאמידז למערכת ההחדרה‬
‫טל החומצה האמינית הספציפית‪ .‬כמו כן יש מקום לבדוק את הספציפיות של‬
‫הארילאמידז טל מיני מיקופלסמה נוספים בטיטה הפלואורימטרית הרגיטה‪ ,‬כדי‬
‫להפוך טיטה זו לעזר במיון הטקס ו נ ומי‪ .‬טל מיקופלםמה‪.‬‬
‫על קשר הדוק בין מבנה הממברנה ופעילות הארילאמידז הקשור בה‪ ,‬מראה‬
‫הממצא טל אקטיבצית הפעילות האמידטית על ידי ריכוזים עולים של מלח ובעיקר‬
‫‪100‬‬
‫עם ‪ K‬״ האקטיבציה המשמעותית המושגת בריכוז גבוה למדי של מלח‪ ,‬כאשר‬
‫‪+‬‬
‫התאים עדיין יציבים מבחינה אוסמוטית‪ ,‬ניתן להסבירה כתוצאה של מיסוך‬
‫מטענים שליליים על פני הממברנה‪ ,‬בעיקר של הקבוצות הפולריות של‬
‫פוספוליפידים‪ .‬מיסוך זה יגרום לארגון הדוק יותר‪ ,‬דהיינו לעיבוי של‬
‫ה‪ bilayer -‬הליפידי‪ .‬שינוי בארגון השכבה הליפידית ישפיע מאידך על ארגןן‬
‫החלבונים הבאים במגע עם הליפידים ויכול להתבטא בשינויים בפעילויות של‬
‫חלבונים אלה‪ ,‬למשל בפעילות הקטליטית‪.‬‬
‫מאידך‪ ,‬טיפול בתאים באנזימים כמו טריפםין ופוספוליפז ‪ C‬לא גרם‬
‫לאינאקטיבציה משמעותית של פעילות הארילאמידז‪ .‬עובדה זו ניתנת להסבר אם‬
‫האנזים טמון במידה מסויימת בשכבת הממברנה‪ ,‬או אם שטח פני הממברנה ממוסך‬
‫על ידי מולקולות שאינן חלבונים או פוספוליפידים‪ ,‬כמו הפולימר המורכב‬
‫מיחידות הקםוזאמין שנמצא קשור באופן רופף לתאי ‪. A. laidlawii‬‬
‫בדקתי את פעילות התאים השלמים בפירוק קשרים אמידיים בפפטידים‪ .‬אכן‬
‫נמצא כי שני מיני המיקופלםמה שנבדקו מגלים פעילות של אמינופפטידז‪,‬‬
‫המתבטאת בביקוע הדרגתי מן השייר ה‪^ -‬טרמינלי‪ .‬פעילות הפפטידז‪ ,‬בדומה‬
‫לאמידז‪ ,‬דורשת כי הקבוצה ה‪-0 -‬אמינית של השייר ה‪^ -‬טרמינלי תהיה חופשית‪.‬‬
‫תאים שלמים פרקו פפטידים המכילים מ‪ 2-‬ועד ‪ 9‬חומצות אמיניות‪ .‬ספציפיות‬
‫הפפטידז נמצאה דומה לזו של הארילאמידז‪ .‬דהיינו‪,‬‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫מבקע פפטידים של היסטידין והחומצות האמיניות הבסיסיות‪ ,‬ואילו‬
‫נמצא‬
‫‪A.laidlawii‬‬
‫פעיל בעיקר בביקוע פפטידים המכילים אלנין כשייר ה‪N -‬־טרמינלי‪.‬הפפטידז של‬
‫‪ laidlawii‬״‪ A‬הראה סטראוספציפיות מוגדרת ועל מנת לבקע את הקשר האמידי‬
‫ה‪^! -‬טרמינלי דרוש רצף של שיירי אלנין מהסוג ‪LLD‬״ שייר ם־אלנין בסמוך‬
‫לקשר הפפטידי ה‪ -N -‬טרמינלי מונע פעילות הפפטידז‪ .‬מהדמיון בספציפיות‬
‫לחומצות אמיניות ותחום ה‪ pH -‬האופטימלי‪ ,‬וכן אי היציבות עם שבירת התא‪,‬‬
‫יש להניח כי שתי הפעילויות ‪ -‬הארילאמידז והפפטידז קשורות באותו חלבון או‬
‫‪101‬‬
‫ממברנלי‪.‬‬
‫קומפלכס‬
‫ה מ י י ח ד את ה פ פ ט י ד ז ט ל מ י ק ו פ ל ס מ ה ‪ ,‬כ פ י ש ה ר א נ ו ה ו א ה מ י ק ו ם ב ק ר ו ם התא‪.‬‬
‫ממברנלי‬
‫אנזים‬
‫י כ ו ל ל ה י ו ת מ מ ו ק ם ב ע ב ר ה צ י ט ו פ ל ם מ ט י של ה ק ר ו ם א ו ב ע ב ר‬
‫ה ח י צ ו נ י הבא ב מ ג ע עם ה מ ד י ו ם ‪.‬‬
‫על פ ע י ל ו ת ו‬
‫ת ח ד י ר ו ת תאי‬
‫מ י ק ו ם ז ה ט ל ה א נ ז י ם ב ק ר ו ם יש ל ו ה ש ל כ ו ת‬
‫ה פ י ס י ו ל ו ג י ת ‪ .‬כ ד י ל ע נ ו ת על טאלה ז ו ל ג ב י מ י ק ו ם ה פ פ ט י ד ז ב ד ק נ ו‬
‫‪.‬‬
‫‪laidlawii‬‬
‫‪A‬‬
‫‪.‬‬
‫‪14‬‬
‫ל א ל נ י ן ק ב י ע ת התחלקות א ל נ י ו מםומו ב ‪,(C ) -‬‬
‫לעומת חומר גבה מ ו ל ק ו ל ר י ט א י נ ו חודר לתא כ א י נ ו ל י ו המםומו ב ‪,(H) -‬‬
‫הנפח‬
‫בין‬
‫ה ת ו ך ת א י ל נ פ ח ה ב י ו ת א י הראתה כ י ת א י ם ה מ ו ר ח פ י ם ב ת מ י ס ת מלח‬
‫איזוטונית‬
‫ריכזו‬
‫א י נ ם מחדירים א ל נ י ו ‪ .‬לעומת ז א ת ‪ ,‬תאים המורחפים במדיום ה ג י ד ו ל‬
‫אלניו‬
‫ב ת ו ך ה ת א ‪ ,‬א ם כ י ב מ י ד ה מ ו ע ט ת ‪ .‬ה ע ו ב ד ה טתאי‬
‫‪A. laidlawii‬‬
‫טלמים מפרקים פ פ ט י ד י ם ה מ כ י ל י ם עד ‪ 9‬ט י י ר י א ל נ י ו באותם ת נ א י ם בהם א ל נ י ו‬
‫חודר לתא‪ ,‬מעידה כ י מ י ק ו מ ו טל ה א נ ז י ם ה ו א בעברו‬
‫אינו‬
‫תמיכה‬
‫ה ח י צ ו נ י טל ה ק ר ו ם ‪.‬‬
‫נ ו ס פ ת ל מ י ק ו ם ה ח י צ ו נ י ט ל ה א נ ז י ם ה מ מ ב ר נ ל י ה ז ה באה מהממצא טהתקבל‬
‫בהשוואת‬
‫שלמים‪.‬‬
‫פ ר ו פ י ל ה ‪ pH -‬ט ל ה א ר י ל א מ י ד ז ב ת כ ט י ר ק ר ו מ י‬
‫ה א נ ז י ם בשני המצבים ה ג י ב ב א ו ת ו א ו פ ו‬
‫ובתאי‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫ל ש י נ ו י ה ‪ pH -‬ב מ ד י ו ם ‪,‬‬
‫דהיינו‪,‬‬
‫ה א נ ז י ם בתא השלם ו ה א נ ז י ם ב ק ר ו ם ה מ ב ו ד ד מ צ ו י י ם ב ס ב י ב ה א ל ק ט ר ו ס ט ט י ת ד ו מ ה‬
‫ל א ו ת ו ‪ pH‬״‬
‫וחשופים‬
‫אם כ י ה פ פ ט י ד ז ב ר גישה ל מ ד י ו ם ה ח י צ ו נ י ‪ ,‬ה ו א א י נ ו חשוף ל ג מ ר י ע ל שטח‬
‫פ נ י ה ק ר ו ם ‪ .‬ז א ת ל מ ד נ ו מ מ ה י ר ו ת ה ת ג ו ב ה ט ל ה פ פ ט י ד ז עם א ל נ י ו‬
‫אורך‬
‫פפטידים בעלי‬
‫ע ו ל ה מ ד י ‪ -‬פ פ ט י ד ו ע ד פ פ ט י ד ט ל תשעה ש י י ר י ם ‪ .‬מצאתי כ י ב פ ר ק ז מ ו של‬
‫‪ 30‬ד ק ו ת ‪,‬‬
‫ד י ‪ -‬פ פ ט י ד התפרק ל ג מ ר י ב ע ו ד ט מ ט ר י ‪ -‬פ פ ט י ד התפרק ר ק ‪ 60%‬טל ה א ל נ י ו‬
‫ה‪-^ -‬טרמינלי‬
‫ו מ ה נ ו נ ‪ -‬פ פ ט י ד התפרק ‪ 40%‬א ל נ י ו ‪ .‬ת ל ו ת מ י ד ת ה ה י ד ר ו ל י ז ה ב א ו ר ך‬
‫הפפטיד‬
‫י כ ו ל ה ל ה י ו ת ה ת ב ט א ו ת טל ה ד י פ ו ז י ה ט ל ה פ פ ט י ד אל ה א נ ז י ם ה מ צ ו י ב ע ו מ ק‬
‫מםויים‬
‫ב מ מ ב ר נ ה ‪ .‬מ א י ד ך י י ת כ ו כ י אתר ה ק י ט ו ר טל ה א נ ז י ם מ ת א י ם ב א ו פ ו‬
‫אופטימלי‬
‫ל ד י ‪ -‬פ פ ט י ד ו ה ק י ט ו ר טל פ פ ט י ד י ם א ר ו כ י ם י ו ת ר פ ח ו ת י ע י ל ‪.‬‬
‫‪102‬‬
‫ה פ ע י ל ו ת של ב י ק ו ע ק ש ר י ם פ פ ט י ד י י ם מ ו ג ב ל ת ל א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם ב ל ב ד ‪ ,‬שכן‬
‫‪M. fermentans‬‬
‫תאי‬
‫כםובםטרטים‬
‫ו ‪ A. laidlawii -‬ל א ג י ל ו פ ע י ל ו ת פ ר ו ט א ו ל י ט י ת ‪.‬‬
‫ל ב ד י ק ת פ ע י ל ו ת פ ר ו ט א ו ל י ט י ת )‪ (143‬השתמשתי ב ק ז א י ן‬
‫של א י נ ס ו ל י ן ו כ ן‬
‫‪.‬‬
‫לא ה ת ג ל ה פ י ר ו ק ל ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת הן‬
‫בפולי‬
‫והמוגלובין‬
‫‪ - 1‬ל י ז י ן )‪(m360‬״‬
‫בתגובה קולורימטרית והן‬
‫בבדיקה‬
‫כרומטוגרפית‪.‬‬
‫מיקום‬
‫)‪(144‬‬
‫ה פ פ ט י ד ז של מ י ק ו ל פ ם מ ה ב ק ר ו ם ה ת א ‪ ,‬ב ד ו מ ה ל ת א י ם א א ו ק ר י ו ט י ם‬
‫שונה מ פ ר ו ק ר י ו ט י ם ‪.‬‬
‫ב ח י י ד ק י ם נמצאו‬
‫)‪ (80,83‬א ו ק ש ו ר י ם ל ר י ב ו ז ו מ י ם )‪.(145‬‬
‫הבקטריאליות‪,‬‬
‫פפטידים‬
‫בתהליכי‬
‫פפטידזות בעיקר בציטופלסמה‬
‫ה מ י ק ו ם ה ת ו ך ת א י של ה פ פ ט י ד ז ו ת‬
‫ו ה י ו ת ם א נ ז י מ י ם ק ו נ ס ט י ט ו ב י י ם אשר רמתם א י נ ה מ ו ש פ ע ת מ ת ו ס פ ת‬
‫ל מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל ‪ -‬ת כ ו נ ו ת אלה מ ע י ד ו ת על תפקיד א נ ז י מ י ם אלה ב ע י ק ר‬
‫פירוק‬
‫מיקופלםמה‬
‫ו ב נ י ה של פ ו ל י פ פ ט י ד י ם ב ת ו ך ה ת א ‪.‬‬
‫לעומת זאת‪,‬‬
‫ה פ פ ט י ד ז של‬
‫הממוקם ב ק ר ו ם י כ ו ל לתפקד ב נ י צ ו ל פ פ ט י ד י ם מ ה מ ר י ו ם לאספקת ח ו מ צ ו ת‬
‫והתחלקות התאים‪.‬‬
‫אמיניות‬
‫הדרושות ל ג י ד ו ל‬
‫מוגבלת‪.‬‬
‫‪ A. laidlawii‬למשל‪,‬‬
‫ה י כ ו ל ת ה ב י ו ס י נ ט ט י ת של מ י ק ו פ ל ס מ ה‬
‫ת ל ו י באספקת ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ‪ ,‬מלבד‬
‫חומצה‬
‫א ס פ ר ט י ת ו ג ל ו ט מ י ת ה נ ט מ ע ו ת ר ק ב צ ו ר ת ה א מ י ד י ם )‪.(146‬‬
‫הורכב‬
‫ע ב ו ר מ ס פ ר מ י נ י מ ק ו פ ל ס מ ה ו א כ ו ל פ ל ס מ ה ו נ ר א ה כ י הדרישה ה י א ל כ ‪13-17 -‬‬
‫חומצות‬
‫אמיניות‪.‬‬
‫מדיום מוגדר‬
‫ה י ד ר ן ל י ז ט ח ל ב ן ן ‪ ,‬ל א ח ר ד י א ל י ז ה י כ ו ל ל ס פ ק ל פ ח ו ת חלק‬
‫מ ה ח ו מ צ ו ת י ־ ׳ א מ י נ י ו ת )‪ ( R o d w e l l(147.(67‬הראה צ ו ר ך ב פ פ ט י ד ס פ צ י פ י‬
‫ה ג י ד ו ל של ‪. Mycoplasma strain Y‬‬
‫במדיום‬
‫ג י ד ו ל תאים אלה ה י ה מהיר ב נ ו כ ח ו ת‬
‫ה ט ר י ‪ -‬פ פ ט י ד ^)‪ ,(L-Ala‬פ ח ו ת מ ה י ר ב נ ו כ ח ו ת ה ח ו מ צ ה ה א מ י נ י ת ה ח ו פ ש י ת ו א י ט י‬
‫בהעדר החומצה ה א מ י נ י ת א ו ה פ פ ט י ד ‪.‬‬
‫ב‪-‬‬
‫פחות‬
‫הצורך בפפטידים ל ג י ד ו ל מוכר גם בחידקים‪.‬‬
‫‪ Lactobacillus delbrueckii‬נמצא כ י‬
‫נ י צ ו ל חומצות א מ י נ י ו ת מסויימות‬
‫י ע י ל כאשר הן ב צ ו ר ה ח ו פ ש י ת ל ע ו מ ת ה פ פ ט י ד י ם )‪ .(148‬ל א ב ר ו ר באם‬
‫הדרישה של מ י ק ו פ ל ס מ ה ל פ פ ט י ד י ם ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל ה י נ ה ס פ צ י פ י ת ‪ ,‬ל א נמצא קשר‬
‫ב י ן ה ה ר כ ב ו ה ר צ ף של ה פ פ ט י ד י ם אשר נ ב ד ק ו‬
‫)‪(147,149‬‬
‫לבין‬
‫יכולתם בזירוז‬
‫‪103‬‬
‫ה ג י ד ו ל ‪ .‬ב ‪A. laidlawii -‬‬
‫אספקת‬
‫ג ל ו ט מ י ן ו ‪ Tween -80 -‬כ מ ק ו ר ל ח ו מ צ ה א ו ל א י ת )‪.(150‬‬
‫ניצול‬
‫מספקים‬
‫ביותר‬
‫ולכן‬
‫מ צ א ו כ י הדרישה ה ז ו‬
‫נ י ת נ ת להתמדה על י ד י‬
‫פפטידים מהמדיום והיותם מזרזי‬
‫גידול‪,‬‬
‫נ ו ב ע כנראה בהיותם‬
‫ב ב ת אחת כמה ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ‪ .‬ה מ י ק ו פ ל ם מ ה ב א ו ר ג נ י ז מ י ם ה ק ט נ י ם‬
‫המסוגלים להתרבות באופן‬
‫א ו ט ו נ ו מ י ‪ ,‬ב ע ל י ג נ ו ם ק ט ן בהרבה מ ‪E. coli -‬‬
‫ח ס ר י ם הרבה מ ה מ נ ג נ ו נ י ם ה ב י ו ס י נ ט ט י י ם ה מ ו כ ר י ם ב ח י י ד ק י ם ‪,‬‬
‫ב א מ צ ע ו ת ה פ פ ט י ד ז ב ק ר ו ם התא ל נ צ ל ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ב א ו פ ן‬
‫יכולים‬
‫י ע י ל מהמדיום ללא‬
‫צ ו ר ך ל ה ח ד י ר את ה פ פ ט י ד י ם ל ת ו ך התא ד ר ך מ ע ר כ ו ת ט ר נ ס פ ו ר ט נ פ ר ד ו ת ) ה ק י י מ ו ת‬
‫)‪((85‬‬
‫בחיידקים‬
‫‪.‬‬
‫חלקה ה ט נ י ט ל ה ע ב ו ד ה ה ת ר כ ז ב א י פ י ן ן ‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז ה פ ע י ל ב ה ע ב ר ת‬
‫א ל ק ט ר ו נ י ם מ ‪NADH -‬‬
‫ב מ י ק ו פ ל ם מ ה ‪NADH .‬‬
‫חלבון‬
‫לחמצן‬
‫ו ה י נ ו ה מ ר כ י ב ה ע י ק ר י טל טרטרת ה ח י מ צ ן ן‬
‫א ו ק ם י ד ז ה ק ט ו ר ל ק ר ו ם התא טל‪laidlawii(151‬‬
‫‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫( הוא‬
‫א י נ ט ר י נ ם י אטר נ י ת ן ל ה ר ח ק ה מ ה ק ד ו ם ר ק על י ד י ד ט ר ג נ ט י ם א ו מ מ י ס י ם‬
‫)‪ ,(27,48‬א ך ל א על י ד י ‪ EDTA‬ו ת מ י ס ה ה י פ ו ט ו נ י ת )‪.(152‬‬
‫אורגניים‬
‫הראיתי‬
‫כי ניתן‬
‫ב פ ר ק ‪4.8.1‬‬
‫ל ה ו צ י א את ה ‪ NADH -‬א ו ק ס י ד ז מ ה ק ד ו ם ל ת מ י ס ה‬
‫על י ד י ב ק י ע ה ס פ צ י פ י ת ט ל ט ו מ נ י ה ק ר ו ם ב א מ צ ע ו ת פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ‪ .‬ל צ ו ר ך ז ה‬
‫השתמטתי‬
‫ב נ ו ס ף ל פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪ ,A‬ט א י נ ו ת כ ט י ר מ נ ו ק ה ו מ כ י ל ב ד ר ך כ ל ל פ ע י ל ו ת‬
‫פ ר ו ט א ו ל י ט י ת ‪ ,‬ג ם ב פ ו ס פ ו ל י פ ז ‪ C‬מ נ ו ק ה ו ח ו פ ט י מ פ ע י ל ו ת פ ר ו ט א ו ל י ט י ת ‪ .‬הפעלת‬
‫ט נ י ה א נ ז י מ י ם ‪ ,‬ב ע ל י ה ס פ צ י פ י ו ת ה ט ו נ ה ‪ ,‬על ת כ ט י ר ק ר ו מ י ט ה ו כ ן‬
‫מ ־ ‪ A. laidlawii‬גרמה ל ת ו צ א ה ד ו מ ה ‪ -‬ט ח ר ו ר ר ו ב פ ע י ל ו ת ‪ NADH‬א ו ק ס י ד ז‬
‫דהיינו לתסנין‬
‫ע ל י ו ן טל‬
‫‪40,000‬‬
‫‪xg‬‬
‫‪ ,‬מבלי ל ג ר ו ם לאינאקטיבציה‬
‫מ ט מ ע ו ת י ת ט ל ה פ ע י ל ו ת ‪ NADH .‬ד ה י ד ר ו ג נ ז התקבל )‪(48‬‬
‫ב מ י צ ו י א ת נ ו ל י )‪(9%‬‬
‫ב ‪ ,C43° -‬מ ת כ ט י ר ק ר ו מ י טל ‪ . A. laidlawii‬א י ט ק י ע ת ה א נ ז י ם ב ‪-‬‬
‫‪xg100,000‬‬
‫נ ב ע מ ת כ ו ל ת ה ל י פ י ד ט ב ו ‪ ,‬טנמצאה כמחצית מכמות ה ח ל ב ו ן ‪ ,‬כ ל ו מ ר ב א ו ת ו יחם‬
‫כמו בממברנה המקורית‪.‬‬
‫ה א נ ז י ם א ט ר ה ו פ ק ב נ י צ ו ל ת ב י נ ו נ י ת )‪ ,(40%‬א י ב ד את‬
‫‪104‬‬
‫ה כ ו ש ר ל ה ג י ב עם ח מ צ ן ‪ .‬נ ר א ה כ י ה ת ס נ י ן ש ק י ב ל ת י ב ע ק ב ו ת הפעלת ה פ ו ס פ ו ל י פ ז ו ת‬
‫ואשר מ כ י ל את ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת עם חמצן כ א ק ם פ ט ו ר י כ ו ל לשמש כ ת כ ש י ר‬
‫מוצא מתאים ל נ י ק ו י‬
‫נ ו ס ף של ה א נ ז י ם ה מ כ י ל את ש נ י א ת ר י ה ת ג ו ב ה ‪ -‬הן עם‬
‫חמצן ו ה ן עם א ק ס פ ט ו ר י ם ם י נ ט ט י י ם כ פ ר י צ י א נ י ד ‪.‬‬
‫השימוש ב ע י כ ו ל על י ד י‬
‫במספר מקרים כ מ ו ל ג ב י‬
‫דהידרוגנז‬
‫פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ל ה ו צ א ת א נ ז י מ י ם מ ה ק ד ו ם נמצא מ ו ע י ל‬
‫‪ - 6‬ה י ד ר ו ק ם י ב ו ט י ר ט ד ה י ד ר ו ג נ ז )‪ (103‬ו ‪NADH -‬‬
‫ה א נ ז י ם ששימש למטרה ז ו ה י ה פ ו ם פ ו ל י פ ז ‪A‬‬
‫מ י ט ו כ ו נ ד ר י א ל י )‪.(104‬‬
‫ה ל י פ ו ל י ט י ת ה י ש י ר ה משחרר ל י ז ו פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם‬
‫מארם נ ח ש י ם ‪ ,‬אשר ב נ ו ס ף ל פ ע י ל ו ת ו‬
‫ו ח ו מ צ ו ת ש ו מ נ י ו ת אשר ע ל ו ל י ם ל ה פ ר י ע את מ ב נ ה ה מ מ ב ר נ ה ב ה י ו ת ם ד מ ו י י‬
‫)‪.(153‬‬
‫דטרגנטים‬
‫הנסיונות‬
‫א(‬
‫ה מ ס ו כ מ י ם ב פ ר ק ‪ 4.8.1‬מ צ ב י ע י ם ע ל שתי מ ס ק נ ו ת ע י ק ר י ו ת ‪:‬‬
‫המצב ב ו ה א נ ז י ם ‪NADH‬‬
‫א ו ק ם י ד ז קשור למבנה מ מ ב ר נ ל י מ א ו ר ג ן ‪,‬‬
‫אינו‬
‫ב ה כ ר ח ד ר ו ש ל ב י ט ו י פ ע י ל ו ת ו ה מ ח מ צ נ ת ‪ ,‬אשר נ ב ד ק ה עם חמצן כ א ק ם פ ט ו ר ‪.‬‬
‫ו ה מ ע ב ר ל ת מ י ס ה פ ו ג ע ב פ ע י ל ו ת עם א ק ם פ ט ו ר י ם א ח ר י ם ‪ ,‬פ ע י ל ו ת‬
‫יתכן‬
‫א ו ק ם י ד ו ‪ -‬ר ד ו ק ט ז ‪ ,‬אשר מתרחשת כ נ ר א ה באתר נ פ ר ד )‪ .(154‬ג ם ‪Larraga‬‬
‫ו ‪ ( R a z i n(123-‬ה ר א ו כ י ‪NADH‬‬
‫בלעדי‬
‫הוכח‬
‫א ו ק ס י ד ז במיקופלםמה א י נ ו קשור באופן‬
‫ל מ ב נ ה ה ק ר ו מ י ו מ צ ו י ב צ י ט ו פ ל ס מ ה של‬
‫הדמיון‬
‫המולקולרי בין‬
‫‪ , M. mycoides‬אם כ י לא‬
‫ה א נ ז י מ י ם בשני ה מ י נ י ם ה ש ו נ י ם‬
‫)‪. (M. mycoides, A.laidlawii‬‬
‫ב(‬
‫פ ג י ע ה ב פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם א י נ ה משפיעה על פ ע י ל ו ת ה ‪NADH -‬‬
‫אוקסידז‪.‬‬
‫נאמן‬
‫ו ר ז י ו מצאו ג ם כ ן )‪ (102‬כ י‬
‫ליפידים אינם חיוניים‬
‫ל פ ע י ל ו ת ה ‪ NADH -‬א ו ק ס י ד ז של ‪ A. laidlawii‬אשר ה ו פ ר ד מ ן ה ק ר ו ם ב נ ו כ ח ו ת‬
‫דטרגנט‪.‬‬
‫‪105‬‬
‫מצאתי ע נ י ו מיוחד ב א י פ י ו ן פ ע י ל ו ת האוקםידז ‪ situ‬חיו בקרום‪ ,‬ובבדיקת‬
‫השפעתם של ש י נ ו י י ם במבנה הקרום על התכונות של הפעילות האוקםידטיבית‪.‬‬
‫האנזים הקשור לקרום שנעשו ב ו ש י נ ו י י ם ב ר ר נ י י ם ‪ ,‬תוך הרחקת מרכיבים ש ו נ י ם ‪,‬‬
‫י כ ו ל לשמש מעין אלקטרודה טבעית רגישה ב י ו ת ר המדווחת על השפעת ה ש י נ ו י י ם‬
‫במבנה על פ ע י ל ו ת ו של האנזים‪ .‬המסה מבוקרת של ממברנת ב י ו ל ו ג י ת אפשר להשיג‬
‫על י ד י שימוש בדטרגנטים לא י ו נ י י ם אשר בהיותם אמפיפיליים הם מתקשרים‬
‫ל ח ל ב ו נ י ם האינטירינםיים בממברנה שגם הם בעלי אופי אמפיפילי )‪ .(128‬ב ר ו ב‬
‫המקרים נשמרת הפעילות האנזימטית הקשורה לממברנה מאחר והדטרגבט הלא י ו נ י‬
‫א י נ ו גורם ל ש י נ ו י י קונפורמציה בלתי הפיכים או להפרדה של תת‪-‬יתידות ח ל ב ו ן ‪.‬‬
‫דטרגנטים חלשים כמו ‪ Tween -20‬חינם סלקטיביים בפעולת ההמםה ה י ו ת וכמעט‬
‫אינם פועלים על א ז ו ר י ממברנה בהם יש אינטראקציות ח ל ב ו ו ־ ח ל ב ו ן ‪Hierten .‬‬
‫ו ‪ ( J o h a n s s o n(129-‬השתמשו בדטרגנט זה להמסה מבוקרת של תכשיר קרומי‬
‫מ‪A. laidlawii -‬‬
‫והראו באלקטרופוריזה כ י הרחקת החלבון הקרומי היתה‬
‫סלקטיבית‪ .‬נאמו )‪ (102‬הראה שאפשר לתמים את הקרום של ‪ A. laidlawii‬על ידי‬
‫הדטרגנטים הלא י ו נ י י ם‬
‫‪ Triton x -100‬ו ‪ Brij 58 -‬ולקבל את מלוא פעילות‬
‫‪ NADH‬אוקסידז‪ .‬ב נ ם י ו נ ו ת בהם השתמשתי ב‪ 2 0 -‬־ ‪ Tween‬להמסה של הממברנה‬
‫)פרק ‪ (4.8.2‬הסתבר כי אכו נ י ת ן היה לקבל ש י נ ו י מבוקר של הקרום באופן שיחס‬
‫החלבון ל ל י פ י ד השתנה באופן משמעותי ל כ י ו ו ן של העשרה ב ח ל ב ו ו ‪ .‬ל ש י נ ו י זה‬
‫היתה השפעה על רגישות של ק ב ו צ ו ת ‪ SH‬ה ח י ו נ י ו ת לפעילות של האנזים ו כ ן על‬
‫תלות הפעילות ב ־ ‪ .pH‬החלבונים אשר נשארו בקרום המטופל נ ד ד ו בחלקם באופן‬
‫טונה באלקטרופוריזה‪ ,‬בהשוואה ל ח ל ב ו נ י הקרום המקורי‪ .‬ממצא זה מעיד על‬
‫התארגנות שונה בקרום ‪ -‬על אינטראקציות חדשות שלא ה י ו קיימות כאשר הקרום‬
‫היה עשיר בליפידים‪ .‬תכשיר קרומי של ‪A. laidlawii‬‬
‫מגלה מירב הפעילות‬
‫האוקסידטיבית ל ג ב י ‪ NADH‬רק ב נ ו כ ח ו ת ש־מרקפטואתנול בתערובת הריאקציה‪.‬‬
‫י ד ו ע כי א נ ז י מ י ם ממברנליים הדורשים קבוצות ‪ SH‬חופשיות לפעילותם רגישים‬
‫מאד לאינאקטיבציר‪ .‬בעת ב י ד ו ד הקרום‪ ,‬עקב חימצון על י ד י חמצו מ ו ל ק ו ל ר י ‪.‬‬
‫‪106‬‬
‫מסתבר כי ‪ NADH‬אוקסידז שאכן מגלה רגישות כ ז ו בתכשיר קרומי מאבדה בקרום‬
‫אשר טופל ב‪ Tween -‬״ יתכן‪ ,‬כי הארגון מחדש של החלבונים אשר נשארו בקרום‬
‫שעבר מיצוי חלקי‪ ,‬יוצר אפשרות לאינטראקציות אשר גורמים לייצוב קבוצות‬
‫ה‪SH -‬‬
‫שנחשפו‪ .‬הראינו גם רגישות שונה של ‪ NADH‬אוקםידז בקרום של‬
‫‪ laidlawii‬״‪ A‬לחמצן ו ל ‪ PCMBS -‬הניתנת להסבר במיקום או מידת חשיפה שונים‬
‫של קבוצות ה‪ SH -‬בתכשיר הקרומי‪.‬‬
‫השפעות של ריאגנטי ‪ SH‬ברמה התאית מתבטאות בתהליכים הקשורים בממברנה‪-‬‬
‫פעילות אנזימים ותהליכי טרנספורט‪ .‬רוב הפעילויות הממוקמות בממברנה‬
‫והקשורות בחדירות הסלקטיבית ל י ו נ י ם‬
‫ולמטבוליטים‪ ,‬אנזימי חימצון‪-‬חיזור‬
‫ואנזימים הקשורים במטבוליזם של שומנים וחלבונים ממברנלים ‪ -‬רובם מעוכבים‬
‫על ידי ריאגנטי‪SH(73‬‬
‫(‪ .‬במערכת מורכבת כממברנה ב י ו ל ו ג י ת תלויה‬
‫הריאקטיביות של קבוצות ה‪ SH -‬ב־‬
‫‪ ;microenvironment‬בתרומה של קבוצות‬
‫מ י ו נ נ ו ת המצויות בסמיכות ובמידת החשיפה של החלבון לסביבה הידרופילית‪.‬‬
‫לא כל קבוצות ה‪ SH -‬קשורות באופן ישיר לפעילותם הביולוגית של החלבונים‬
‫הממברנלים‪ ,‬לחלקן יש גם תפקיד בייצוב המבנה של הממברנה‪ .‬קבוצות ‪SH‬‬
‫בממברנה יכולות להיות מעורבות בקשרי מימן‪ ,‬קשרי ונדרוולם או אינטראקציות‬
‫הידרופוביות‪ .‬נמצאה למשל עדות לאינטראקציה בין קבוצות ‪ SH‬של חלבונים‬
‫לבין קשרים כפולים טל ליפידים בממברנות מיקרוםומליות‬
‫סלקטיבית של קבוצות ‪ SH‬עם המעכב ‪ PCMB‬נמצאה באלדולז‬
‫)‪.(155‬‬
‫)‪.(156‬‬
‫תגובה‬
‫חלק מהקבוצות‬
‫נמצא מגיב במהירות עם הריאגנט‪ ,‬מעט מגיבים בצורה איטית ושאר הקבוצות‬
‫אינן מגיבות כלל אלא אם כן גורמים לדנטורציה של החלבון‪ .‬דווקא הקבוצות‬
‫החשופות לתגובה מהירה עם המעכב אינן ח י ו נ י ו ת לפעילות האנזימטית‪ ,‬אלא‬
‫הקבוצות המגיבות באיטיות‪ .‬מצב דומה נמצא במערכת ‪ NADH‬דהידרוגנז;‬
‫‪ NADH;Cyt C‬רדוקטז ו ‪ NADH -‬אוקםידז‬
‫)‪.(157‬‬
‫בעוד שפעילות האוקסידז‬
‫והרדוקטז רגישות ביותר ל־ ‪ PCMB‬הרי פעילות הדהידרוגנז בחיזור פריציאניד‬
‫אינה מושפעת‪ .‬הוצע ששני סוגי קבוצות ‪SH‬‬
‫משתתפות בחימצון ‪ - NADH‬ס ו ג אחד‬
‫‪107‬‬
‫רגיש לריאגנט ‪ PCMB‬ומצוי בין האתר הפעיל של הדהידרוגנז וקצה שרשרת‬
‫החימצון‪ ,‬וסוג שני החבוי בקומפלכס הדהידרוגנז ונחשף רק בהתפרקו ל־ ‪Cyt C‬‬
‫רדוקטז‪ .‬נחיצות קבוצות ‪ SH‬לפעילות ‪ NADH‬אוקסידז ו‪ NADH-DCPIP -‬אוקםידו‪-‬‬
‫סמה‪ ,‬הראו גם‬
‫ורזיו‬
‫‪•123C)Larraga‬‬
‫השינוייח אשר התרחשו בקרום של ‪ A. laidlawii‬בעקבות הטיפול בדטרגנט‬
‫‪ ,Tween -20‬באו לידי ביטוי גם בתזוזה של מירב הפעילות של ‪ NADH‬אוקסידז‬
‫לערכי ‪ pH‬גבוהים יותר בהשוואה לתכשיר הקרומי המקורי )פרק‬
‫‪.(4.8.2.4‬‬
‫ממצא זה מראה על הרגישות הרבה של אנזים ממברנלי לסביבתו הקרובה‪ ,‬במקרה‬
‫זה השינוי בסביבה האלקטרוסטטית המקומית‪ ,‬דהיינו שינוי בריכוז המקומי של‬
‫פרוטונים או םובםטרט מתבטא בתזוזה של מהירות התגובה האנזימטית המירבית‬
‫מ‪ -‬״‪ 7pH5‬ל‪ .8pH6» -‬תופעה דומה נחקרה ביסודיות לגבי אנזימים הקשורים‬
‫לפולימרים סינטטים‪ ,‬אניוניים או קטיוניים‪ ,‬ואכו נמצאה השפעה גדולה של‬
‫הסביבה האלקטרוםטטית בקרבת האתר הפעיל טל האנזים‪ ,‬התלויה בסוג המטען‬
‫ובצפיפותו )‪.(158‬‬
‫הראיתי כי ‪ NADH‬אוקםידז הממברנלי טל ‪ A. laidlawii‬אינו דורט ליפידים‬
‫לפעילותו וניתו להוצאה מו הקרום בעקבות פעולת פוםפוליפזות‪ ,‬או מאידך‬
‫יכול לשמש כמרווח רגיש לטינויים מבניים בקרום אם הקרום ממוצה באופו‬
‫בררני והאנזים נשאר קשור‪ .‬בשלב האחרוו של איפיוו ה־ ‪ NADH‬אוקםידז‪,‬‬
‫ניסיתי לאפיינו על ידי םימוו זיקה כאשר האנזים ‪,‬עדייו מהווה חלק מהקדום‬
‫ועל ידי כך לקבלו בצורה טבעית ושלמה ככל האפשר אחרי המסת הממברנה‬
‫בדטרגנט‪ .‬פירידיו נוקליאוטידים מחומצנים קשורים לםפדקם או ספרוז שימשו‬
‫להפרדת זיקה של דהידרוגנזות‬
‫)‪.(131‬‬
‫לאחר שמצאתי כי ‪ NADH‬מחומצו בקבוצות‬
‫הידרוקסי ' ‪ 2 ' - 3‬של שייר הריכוז‪ ,‬משמש מעכב של האנזים בריכוז נמוך‪,‬‬
‫הוחלט להטתמש ב‪ NADH -‬די‪-‬אלדהיד כמעכב זיקה אשר יתקשר לאתר הפעיל של‬
‫האוקסידז בקרום של ‪ . A. laidlawii‬התברר כי אכו התרחש קישור של‬
‫‪108‬‬
‫די‪-‬אלדהיד‬
‫ל ת כ ט י ר ק ר ו מ י טל ‪ , A. laidlawii‬ת ו ך ע י כ ו ב פ ע ו ל ת ה א ו ק ם י ד ז ‪.‬‬
‫ה ס פ צ י פ י ו ת ט ל ה ק י ט ו ר נתמכה ב ע ו ב ד ה ט א נ ה י ד ר י ד ט ל ח ו מ צ ה ס ו ק צ י נ י ת ל א ע י כ ב‬
‫ק י ט ו ר ה ד י ‪ -‬א ל ד ה י ד התבטא ב ה ו פ ע ת פ ל ו א ו ר ם צ נ צ י ה‬
‫א ת פ ע י ל ו ת ה ‪ NADH -‬א ו ק ס י ד ז ‪.‬‬
‫י ר ק ר ק ה ב ‪ SDS -‬ג ל א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ‪ ,‬הקשורה ל ח ל ב ו ן ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י ‪.‬‬
‫הדי‪-‬אלדהיד גרם לצילןב בין‬
‫היה‬
‫הספציפי‬
‫גם‬
‫חלבונים שונים‪ ,‬וכן‬
‫קישור בלתי ס פ צ י פ י ‪.‬‬
‫נראה כ י‬
‫נראה כ י בצד ק י ש ו ר ו‬
‫י ד ו ע מהספרות כ י אלקילציה מחזרת‬
‫של ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ח ל ב ו נ י ם ‪ ,‬ה נ ע ש י ת על י ד י ר י א ק צ י ה עם א ל ד ה י ד י ם א ו‬
‫ב נ ו כ ח ו ת נתרן‬
‫קטיונים‬
‫החלבונים‬
‫ב ו ר ו ה י ד ר י ד ‪ ,‬א י נ ה גורמת ל ש י נ ו י מהותי במבנה‬
‫ה מ ו ת מ ר י ם )‪.(159‬‬
‫נ ס י ו ן ל ה פ ר י ד את ה ח ל ב ו ן ה ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י ה מ ס ו מ ן ‪,‬‬
‫ל א ח ר המסת ה מ מ ב ר נ ה ב ד ט ר ג נ ט ‪ ,‬על ע מ ו ד ת ס פ ר ו ז ב נ ו כ ח ו ת ד ט ר ג נ ט לא עלה י פ ה ‪.‬‬
‫ז א ת ב ג ל ל ה א ו פ י ה א ג ר ג ט י ב י של ה ח ל ב ו ן א פ י ל ו‬
‫השימוש ב ש י ט ו ת ז י ק ה ל ז י ה ו י‬
‫אנלוגי‬
‫בנוכחות הדטרגנט‪.‬‬
‫ח ל ב ו נ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם בעלי פ ע י ל ו ת ב י ו ל ו ג י ת‬
‫)‪ (160‬עם כ ר ו מ ו פ ו ר ‪,‬‬
‫ל ס י מ ו ן אתר פ ע י ל של א נ ז י ם ב ת מ י ס ה ‪,‬‬
‫‪,spin-label‬‬
‫א ו ח ו מ ר ר ד י ו א ק ט י ב י ב ע ל א פ י נ י ו ת לאתר ה פ ע י ל ‪.‬‬
‫נעשו‬
‫נ ס י ו נ ו ת לסמן את ה א ת ר י ם ה פ ע י ל י ם של ‪ ) ATPase‬נ ת ר ן ‪ ,‬א ש ל ג ן (‬
‫‪3‬‬
‫ה מ מ ב ר נ ל י על י ד י ק י ש ו ר‬
‫כמעכבים‬
‫‪ cardiac glycosides‬מ ס ו מ נ י ם ב ‪,( H) -‬‬
‫ס פ צ י פ י י ם טל ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ושל ט ר נ ס פ ו ר ט האשלגן‬
‫ז ו ל א הצליהר‪ .‬מאחר ו ה ת ק ב ל ס י מ ו ן על ר ק ע ב ל ת י ס פ צ י פ י‬
‫הבלתי‬
‫)‪(162‬‬
‫ספציפי התגברו בסימון‬
‫ובסימון‬
‫הידועים‬
‫)‪.(161‬‬
‫גישה‬
‫ג ב ו ה ‪ .‬על ב ע י ת ה ס י מ ו ן‬
‫ז י ק ה טל אצטיל כ ו ל י ן אסטרז מ א ר י ת ר ו צ י ט י ם‬
‫ה ח ל ב ו ן ה מ ע ו ר ב ב ט ר נ ס פ ו ר ט ט ל ‪ - 5‬ג ל ק ט ו ז י ד י ם ב ‪Eo coli -‬‬
‫ר י ו ו י הממברנה בחומר המסומן‬
‫)‪ , (163‬על י ד י‬
‫ב נ ו כ ח ו ת מעכב ס פ צ י פ י‬
‫ובטלב‬
‫ש נ י ל א ח ר ס י ל ו ק המעכב התרחטה ת ג ו ב ה ס פ צ י פ י ת ב י ן המעכב ל א ת ר ה פ ע י ל ‪.‬‬
‫יודואצטט‬
‫אדנילט‬
‫סימון‬
‫שהינו‬
‫ציקלז‬
‫ר י א ג נ ט ב ע ל ס פ צ י פ י ו ת ר ח ב ה ‪ ,‬שימש ל ס י מ ו ן‬
‫ס פ צ י פ י של‬
‫)‪ ,(164‬בשיטה ד ו מ ה ת ו ך ה ג נ ה על האתר ה פ ע י ל ע ל י ד י‬
‫‪14‬‬
‫כ פ ו ל עם ) ‪( C‬‬
‫‪3‬‬
‫ו ‪( H) -‬‬
‫יודואצטט‪,‬‬
‫ב נ ו כ ח ו ת ובהעדר‬
‫גלוקגון‪.‬‬
‫ג ל ו ק ג ו ן ‪ ,‬איפשר‬
‫‪109‬‬
‫זיהוי‬
‫מ ר כ י ב של א ד נ י ל ט צ י ק ל ז ב ‪ SDS -‬ג ל א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה כ פ ו ל י פ פ ט י ד בעל‬
‫משקל מ ו ל ק ו ל ר י ‪. 240,000‬‬
‫ההסתייגות‬
‫ב ס י מ ו ן מ ר כ י ב י ם מ מ ב ר נ ל י י ם על י ד י‬
‫י צ י ר ת קשרים ק ו ו ל נ ט י ם‬
‫ה י א כ י ה ש י נ ו י ה כ י מ י של מ ו ל ק ו ל ה ס פ צ י פ י ת י כ ו ל ל ה ש פ י ע על מ ב נ ה המערכת‬
‫ה מ מ ב ר נ ל י ת המורכבת ולהתבטא ב א ו פ ן בלתי ס פ צ י פ י ב מ ר כ י ב י ם א ח ר י ם ‪.‬‬
‫כדי‬
‫ל ו ו ד א שהחומר המסמן אכן ק ש ו ר ל ח ל ב ו ן ה ס פ צ י פ י ב ק ר ו ם יש צ ו ר ך‬
‫ל ה פ ר י ד את ה ח ל ב ו ן ה מ ס ו מ ן‬
‫ו ל א פ י י נ ו בצורה מסיםה‪.‬‬
‫מ ה מ מ ב ר נ ה שהומסה ב ד ט ר ג נ ט הם ב צ ו ר ה‬
‫של ק ו מ פ ל כ ס‬
‫ה ח ל ב ו נ י ם המשתחררים‬
‫חלבון‪-‬דטרגנט‪-‬ליפיד‪.‬‬
‫את מ י צ ל ו ת ה ל י פ י ד י ם אפשר ל ה פ ר י ד ב ש י ט ו ת פ י ל ט ר צ י ה על ע מ ו ד ו ת ‪ .‬מ א י ד ך ‪,‬‬
‫סילוק‬
‫הדטרגנט מהקומפלכס ח ל ב ו ן ‪ -‬ד ט ר ג נ ט ג ו ר ם בדרך כ ל ל ל א ג ר ג צ י ה ו ל ה ו ו צ ר ו ת‬
‫משקעים א מ ו ר פ י י ם נ‪ .(160‬ת ו פ ע ת ה א ג ר ג צ י ה ה י א כ נ ר א ה ת ו צ א ה של ח ט י פ ת א ז ו ר י ם‬
‫ה י ד ר ו פ ו ב י י ם על ה ח ל ב ו ן ה א מ פ י פ י ל י ‪ .‬ל א ח ר ו נ ה ה צ ל י ח ו ל ק ב ל ג ל י ק ו פ ר ו ט א י ן‬
‫נגיפי‬
‫ח ו פ ש י מ ל י פ י ד ו ד ט ר ג נ ט על י ד י הפרדה ה ד ר ג ת י ת ב מ פ ל י ם ו כ ר ו ז ‪ .‬אך גם‬
‫ה ח ל ק י ק י ם שהתקבלו לא ה י ו מ ו נ ו מ ר י ם אלא א ו ק ט מ ר י ם ב ע ל י משקל מ ו ל ק ו ל ר י‬
‫של ‪900,000‬‬
‫)‪. (128‬‬
110
REFERENCES
1.
K a t c h a l s k i , E . , Silman, I . and Goldman, R . , Adv. i n Enzymol. 3U,
kh$
(1971).
2.
Bulos, B. and Racker, E . , J . B i o l . Chem. 2h3, 3891 (1968).
3.
Baron, C. and Abrams, A . , J . B i o l . Chem. 2h6, 15h2 (1971).
h.
Fleischer,
S. , B r i e r l y , G. , Klouwer, H. and Slauterbach, D.B. ,
J . B i o l . Chem. 237,
326U (1962).
5.
R o t h f i e l d , L . and Pearlman, H . , J . B i o l . Chem. 2kl, 1386 (1966).
6.
Jones, P.D. and V a k i l , S . , J . B i o l . Chem. 2^2, 5267 (1967).
7•
Coleman, R . , Biochim. Biophys. Acta 300, 1 (1973).
8.
Racker, E . and Proctor, H . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 39,
1120 (1970).
9•
Rottem, S . , C i r i l l o , V . P . , de Kruyff, B . , Shinitzky, M. and
Razin, S . , Biochim. Biophys. Acta
10.
11.
Kaback, H . R . , Ann. Rev. Biochem.
323, 509 (1973).
39,
561 (1970).
1
Singer, S . J . , i n "Structure and ! unction of B i o l o g i c a l Membranes"
(Rothfield,
L . I . , e d . ) , pp. 1U6-190, Academic Press, N.Y. (1971).
Singer, S . J . , i n Ann. Rev. Biochem., V o l . U3, p. 805 (197*0•
12.
Edward, D.G. f . f . and Freundt, E . A . , J . Gen. M i c r o b i o l . 62, 1
(1970).
13.
Edward, D.G. f . f . et a l . , Intern. J . Sys. B a c t e r i o l . 22, 18U
(1972).
1U.
Razin, S . , Cosenza, B . J . and T o u r t e l l o t t e ,
M . E . , Ann. N.Y. Acad.
S c i . 1U3, 66 (1967).
15.
Carstensen,
11,
16.
E . L . , Maniloff, J . and E i n l o f , C.W. J r . , Biophys. J .
572 (1971).
Morowitz, H . J . , i n "The Ifycoplasmatales and the L-phase of
Bacteria"
(L. Hayflick, ed.) pp. U05-^12, Appleton Century
Crofts, N.Y. (1969).
1
17•
Smith, D.W., Biochim. Biophys. Acta
179, +08 (1969)•
18.
S l a t e r , M.L. and Falsome, C . E , , Nature 229, 117 (1971).
19.
Smith, D.W. and Hanawalt, P . C . , J . B a c t e r i o l .
96, 2066 (1968).
1
20.
Razin, S. , J . Gen.. M i c r o b i o l . 33, *71 (1963).
21.
Kahane, I . and Razin, S . , J . B a c t e r i o l . 100, 187 (1969)•
Ill
22.
23.
6 7 , 585 ( 1 9 6 9 ) .
1U3_, 115 ( 1 9 6 7 ) .
Razin, S. , Ann. N.Y. Acad. S c i .
2U.
Morowitz, H . J . and T e r r y , T . M . , Biochim. Biophys. Acta 1 8 3 , 2 7 6
Hollingdale, M.R. and Lemcke, R.M.
, J . Hyg.
(1969).
25•
Razin, S. , Adv. Microb. Physiol.
10,
26.
P o l l a c k , J . D . , Razin, S. and Cleverdon, R . C . , J . B a c t e r i o l . 9 0 ,
pp. 31-32
(1973).
617 ( 1 9 6 5 ) .
27.
Neeman, Z. , Kahane, I . , Kovartovsky, Y. and Razin, S . , Biochim.
Biophys. Acta
2 6 6 , 255 ( 1 9 7 2 ) .
28.
Rottem, S. and Razin, S . , J . B a c t e r i o l .
29•
Razin, S. , Morowitz, H . J . and Terry, T . M . , Proc. N a t l . Acad. S c i .
U.S.
9 2 , 71U ( 1 9 6 6 ) .
5 ^ , 219 ( 1 9 6 5 ) .
32.
(1972).
Choules, G . L . and Bjorklund, R . F . , Biochemistry 9., U759 ( 1 9 7 0 ) .
Kahane, I.
Ph. D. Thesis, The Hebrew University Jerusalem ( 1 9 7 1 ) .
33•
Camejo, G. , Colacicco, G. and Rapport, M.M.
30.
31.
Razin, S. Biochim. Biophys. Acta
265,
2 k l
, J . L i p i d Res. 9., 5 6 2
(1968).
3Ua.
Razin, S. , G o t t f r i e d , L . and Rottem, S. , J . B a c t e r i o l .
95., 1 6 8 5
(1968) .
b. Cho, H.W. and Morowitz, H . J . , Biochim. Biophys. Acta
1 8 3 , 295
(1969) .
35•
Rottem, S. and Razin, S. , J . B a c t e r i o l .
36.
Razin, S . , Cosenza, B . J . and T o u r t e l l o t t e ,
biol.
37•
38.
U2,
139
9h_,
359 ( 1 9 6 7 ) .
M . E . , J . Gen. Micro-
(1966).
9., 57 ( 1 9 7 0 ) .
Edward, D.G. f . f . and Freundt, E . A . , i n "The M y c o p l a s m a t a l e s
and the L-phase of Bacteria"
(L. H a y f l i c k , ed.)
pp. 1 U 7 - 2 0 0 ,
Appleton Century Crofts, N.Y. ( 1 9 6 9 ) .
39• Argaman, M. and Razin, S . , J . Gen. M i c r o b i o l . 3 8 , 153 ( 1 9 6 5 ) .
h0.
Rottem, S. and Razin, S . , Med. M i c r o b i o l . Immunol. 1 5 7 , 171 ( 1 9 7 2 ) .
Rottem, S. and Panos, C. , Biochemistry
*
Ul.
Razin, S . , Prescott, B. and Chanock, R . M . , Proc. N a t l . Acad. S c i .
U.S.
U2.
6 7 , 590 ( 1 9 7 0 ) .
Van Demark, P . J . and Plackett,
P . , J . Bacteriol. I l l ,
1
1+5* ( 1 9 7 2 ) .
112
1+3.
Razin, S. and Cohen, A . , J . Gen. M i c r o b i o l . 30,
hh.
Tourtellotte,
Bacteria"
1U1 ( 1 9 6 3 ) .
M . E . , i n "The Mycoplasmatales and the L-phase of
(L. Hayflick, ed.)
Appleton Century C r o f t s , N.Y.
(1969)•
1+5•
Y a r r i s o n , G. , Young, D.W. and Choules, G . L . , J . B a c t e r i o l . 1 1 0 ,
k9h
(1972).
28,
(1962).
1+6.
Razin, S . , J . Gen. M i c r o b i o l .
1+7•
Razin, S . , Knyszynski, A. and L i f s h i t z , Y . , J . Gen. M i c r o b i o l .
36,323
1+8.
2h3
(196U).
J i n k s , D.C. and Matz, L . L . , Biochim. Biophys. Acta
1+30, 7 1
(1976).
238 (19I+7).
1+9.
Edward, D.G. f . f . ,
50.
Lowry, O . H . , Rosebrough, N . J . , F a r r , A . L . and Randall, R . J .
J.
B i o l . Chem.
J . Gen. M i c r o b i o l . 1 ,
1 9 3 , 265 ( 1 9 5 1 ) .
51.
52.
53.
5U.
55•
9., 1+30 ( 1 9 6 2 ) .
Waley, S.G. , and Watson, J . , Biochem. J . 55., 328 ( 1 9 5 3 ) .
Schechter, I. and Berger, A . , Biochemistry 5., 3362 ( 1 9 6 6 ) .
Van Slyke, D.D. , J . B i o l . Chem. 8 3 , 1+25 (1929)•
McKenzie, H.R. and Wallace, H . S . , Aust. J . Chem. 7 , 55 (195*0.
56.
Anderson, G.W., Zimmerman, J . B . and Callahan, F . N . , J.Am. Chem.
Greenberg, L . J . , Biochem. Biophys. Res. Comm.
Soc. 8 6 , 1839 (1961+).
57•
58.
59.
60.
61.
Bray, G . A . , Anal. Biochem.
62.
Shapiro, A . L . , Vinuela, E . and M a i z e l , J . V . , Biochem.
Spackman, D . H . , Fed. Proc.
22,
2kh
(1963).
Giberman, E . and Rosenberg, E . , J . B a c t e r i o l .
Dostrovsky,
1 , 279 ( i 9 6 0 ) .
2H,
I. and K l e i n , F . S . , Anal. Chem.
E i b l . H . J . and Lands, W.E.M., Anal. Biochem.
Res.
Comm.
1 0 U , 87 ( 1 9 7 0 ) .
30,
(1952).
51 ( 1 9 6 9 ) .
k l k
Biophys.
2 8 , 815 ( 1 9 6 7 ) .
63.
Hjerten, S . , Arch. Biochem. Biophys.
6k.
Pecht, M. , I s r a e l J . Chem.
65•
Pecht, M. , Giberman, E . , Keysary, A . , Y a r i v , J . and K a t c h a l s k i , E . ,
Biochim. Biophys. Acta
66.
Suppl.
1 , 11+7 ( 1 9 6 2 ) .
8 , 187p ( 1 9 7 0 ) .
2 9 0 , 267 ( 1 9 7 2 ) .
R i l e y , P . S . and Behal, F . J . , J . B a c t e r i o l .
1 0 8 , 809 ( 1 9 7 1 ) .
113
67•
Smith, P . F .
"The Biology of Mycoplasmas"
Academic P r e s s ,
N.Y.
(1971).
68.
Cohen, L . A . ,
69.
Crestfield,
i n Ann. Rev. Biochem., V o l .
37,
P-
695 ( 1 9 6 8 ) .
A . M . , S t e i n , W.H. and Moore, S . , J . B i o l .
Chem. 2 3 8 ,
2U13 ( 1 9 6 3 ) .
70.
Shaw, E. and Springhorn, S . , Biochem. Biophys. Res. Comm. 2 7 ,
391 ( 1 9 6 7 ) .
71.
Gundlach, H . G . , S t e i n , W.H. and Moore, S.
J . Biol.
Chem. 2 3 U ,
175U ( 1 9 5 9 ) .
72.
Crane, R.K.
Cell.
Biol.
i n " I n t r a c e l l u l a r Transport"
(K.B. Warren, e d . ) ,
Vol.
Symp. Intern. Soc.
5 , p.
Academic P r e s s ,
71,
N.Y. ( 1 9 6 6 ) .
73•
Webb, J . L .
"Enzyme and Metabolic
Press, N.Y.
7*+.
Atherton,
Inhibitors", Vol.
3 , Academic
(1966).
R . S . , Laws, J . F . and Thomson, A . R . , Biochem. J . 1 1 8 ,
903 ( 1 9 7 0 ) .
1
75•
Anderson, P . J . and Perham, R . N . , Biochem. J .
76.
Moore,
S. and S t e i n , W.H. i n "Methods
Colowick and N.O.
Kaplan, e d . ) ,
1 1 7 , +90 ( 1 9 7 0 ) .
i n Enzymology"
Vol. VI,
p.
(S.P.
8 1 9 , Academic P r e s s ,
N.Y. ( 1 9 6 3 ) .
77•
Choules, G.L. and Gray, W.R.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 1+5,
8U9 ( 1 9 7 1 ) .
78.
Bishop, C. and Surgmor, D.M.
Academic P r e s s , N.Y.
79•
"The Red Blood C e l l " p. 11+8,
(1961+).
Lawrence, P . J . and Strominger,
J . L . , J . Biol.
Chem. 21+5, 3660
(1970) .
80.
Simmonds, S . , Biochemistry
81.
S a r i d , S . , Berger, A. and K a t c h a l s k i ,
£,
1 (1970).
E., J . Biol.
Chem.
237,
2207 ( 1 9 6 2 ) .
82.
Haley, E . E . , J . B i o l .
83•
Sussman, A . J .
Chem.,
and G i l v a r g ,
21+3, 571+8 ( 1 9 6 8 ) .
C . , Ann. Rev. Biochem. U0, 3 9 7
(1971) .
81+.
Dick, A . J . , Matheson,
U8, 1181 ( 1 9 7 0 ) .
A.T.
and Wang, J . H . , Canad. J . Biochem.
‫ו*״‬
85.
86.
Payne, J.W. and G i l v a r g , C . ,
87.
Behal, F . J . and Folds, J . D .
3 5 , 187 ( 1 9 7 1 ) .
9 6 , 12U0 ( 1 9 6 8 ) .
Adv. i n Enzymol.
Behal, F . J . and Cox, S.T. , J . B a c t e r i o l .
Biochem. Biophys. Res. Comm. 27,
3kk ( 1 9 6 7 ) .
88.
89.
Muftic, M . , F o l i a M i c r o b i o l .
90.
Nakao, T . , Nakao, M . , Mizuno, N . , Komatsu, Y. and F u j i t a , M . ,
(1967).
500
Kessel, D. and Lubin, M. , Biochim. Biophys. Acta
J.
91.
12,
Biochem. 73,
7 1 , 656 ( 1 9 6 3 ) .
609 ( 1 9 7 3 ) .
Trauble, H. and E i b l , H . J . , Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S. 7 1 , 2 1 U
(197*0•
92.
Overath, P . , Schairer, H.U. and S t o f f e l ,
Sci. U.S.
93.
6 7 , 606 ( 1 9 7 0 ) .
Esfahani, M . , Limbrick, A . R . , Knutton, S . , Oka, T. and W a c k i l , S . J .
Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S.
9k.
W., Proc. N a t l . Acad.
6 8 , 3180 ( 1 9 7 1 ) .
Spears, D.M. and Provost, P . J .
Canad. J . M i c r o b i o l . 13,
213
(1967).
95•
Rosenberg, S.A. and G u i d o t t i , G . , i n "Red C e l l Membranes Structure and Function"
p.
96.
172,
(G.A. Jamieson and T . J . Greenwalt,
ed.)
(1969)•
J . B . L i p p i n c o t , Philadelphia
Terry, T.M. and Zupnik, J . S . , Biochim. Biophys. Acta
291, i k k
(1973).
97•
Razin, S . ,
i n "The Mycoplasma Membrane" (series Progress i n
Surface and Membrane Science) (D.A. Cadenhead, J . F . D a n i e l l i
and M.D. Rosenberg,
ed.)
V o l . 9 , p• 2 5 7 , Academic Press, N.Y.
(1975).
98.
van Deenen, L . L . M . and de Haas, G.H.
,
Ann. Rev. Biochem.
35.,
178 ( 1 9 6 6 ) .
99•
Ottolenghi, A . C . , i n "Methods i n Enzymology" ( J . H . Lowenstein,
ed.), Vol. I k ,
p. 188, Academic Press, N.Y.
(1969).
100.
Ottolenghi, A . C . , i b i d , p. 1 9 3 •
101.
Martin, K . C . ,
102.
Ne'eman, Z. and Razin, S . , Biochim.
103.
F l e i s c h e r , B . , Casu, A. and F l e i s c h e r , S . , Biochem. Biophys.
Biochim. Biophys. Acta
Res. Comm. 2U,
189 ( 1 9 6 6 ) .
182 ( 1 9 7 0 ) .
Biophys. Acta 3 7 5 , 5*+ ( 1 9 7 5 ) .
203,
115
10k.
Aswathi, Y . C . , Ruzicka, F . J . and Crane, F . L . , Biochim. Biophys.
Acta
105•
203, 233 (1970).
Zwaal, R . F . A . , Roelofsen, B. and C o l l e y , C M . , Biochim. Biophys
Acta
300,
11973)
‫צ‬
9
)
.
106.
Zwaal, R . F . A . et a l . , i b i d , p. 1 6 8 .
107.
de K r u i j f f , B . , Demel, R.A. and van Deenen, L . L . M . , Biochim.
Biochim. Biophys. Acta
108.
255,
331
(1972).
D a n i e l l i , J . F . and Davson, H . , J . C e l l .
Comp. Physiol.
5., U 9 5
(1935).
109.
Caspar, D . L . D . and Kirschner, D . A . , Nature new B i o l . 231, k6
(1971).
110.
V e r k l e i j , A . J . , de K r u i j f f , B . , Gerritsen, W.F. , Demel, R.A.
2 9 1 , 577 (1973)
25., 205 ( 1 9 7 2 ) .
and van Deenen, L . L . M . , Biochim. Biophys. Acta
111.
Capaldi, R.A. and Green, D . E . , FEBS L e t t .
112.
Woodward, C.B. and Zwaal, R . F . A . , Biochim. Biophys. Acta
2!k,
272 ( 1 9 7 2 ) .
113.
Carr away, K . L . , Kobylka, D. , Summer z , J . and Carraway, C A . ,
Chem. Phys. Lipids
Ilk.
Tourtellotte,
8_, 6 5 ( 1 9 7 2 ) .
M . E . , i n "The *fycoplasmatales and L-Phase of
Bacteria" (L. H a y f l i c k , e d . ) ,
Crofts, N.Y.
pp.
U51-U68,
Appleton Century
(1969).
115•
Rodwell, A . W . , J . Gen. M i c r o b i o l .
116.
Smith, P . F . , i n "The Biology of Mycoplasma", p. 12k, Academic
Press, N.Y.
117•
58, 39 (1969).
(1971).
van Demark, P . J . , i n "The Itycoplasmatales and L-Phase of
Bacteria" (L. H a y f l i c k , e d . ) ,
p. U 9 1 , Appleton Century Crofts,
N.Y. ( 1 9 6 9 ) .
118.
de K r u i j f f , B . , van D i j c k , P.W.M., Goldbach, R.W., Demel, R.A.
and van Deenen, L . L . M . , Biochim. Biophys. Acta
119.
330,
269 (1973)
Nachbar, M.S. and Salton, M . R . J . , Biochim. Biophys. Acta
223,
309 ( 1 9 7 0 ) .
120.
121.
P o l l a c k , J . D . , Int.
2 5 , 108 ( 1 9 7 5 ) .
M i c r o b i o l . 1 , 161 ( 1 9 7 1 ) .
J . Syst. B a c t e r i o l .
Salton, M . R . J . , CRC C r i t i c a l Rev.
116
122.
Stopkie, R . J . and Weber, M.M.,
Biochem. Biophys. Res. Comm.
2 8 , 103k ( 1 9 6 7 ) .
1 2 8 , 827 ( 1 9 7 6 ) .
123.
Larraga, V. and Razin, S . , J . B a c t e r i o l .
12U.
Rodwell, A . W . , Razin, S . , Rottem, S. and Argaman, M . , Biochim.
Biophys. Acta
125.
1 2 2 , 621 ( 1 9 6 7 ) .
Rottem, S . , S t e i n , 0 . and Razin, S . , Arch. Biochem. Biophys.
1 2 5 , U6 ( 1 9 6 8 ) .
126.
Kahane, I . and Razin, S . , Biochim. Biophys. Acta
21+9, 159 ( 1 9 7 1 ) .
127.
Reynolds, J . A . , and Tanford, C. Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S.
6 6 , 1002 ( 1 9 7 0 ) .
128.
Helenius,-A. and Simons, K . , Biochim. Biophys. Acta U 1 5 ,
29
(1975).
129.
Hjerten, S. and Johansson, K . E . ,
Biochim. Biophys. Acta 2 8 8 ,
312 ( 1 9 7 2 ) .
130.
Gilham, P . T . , Methods Enzymol.
131.
Lamed, R . , L e v i n , Y. and Wilchek, M . , Biochim. Biophys. Acta
30k,
132.
133.
13U.
2 1 , 191 ( 1 9 7 1 ) .
231 ( 1 9 7 3 ) .
135•
82_, 6380 ( i 9 6 0 ) .
Shelton, K . R . , Biochem. Biophys. Res. Comm. k 3 , 367 ( 1 9 7 1 ) .
Leach, R . H . , J . Gen. M i c r o b i o l . 2 7 , 3U5 ( 1 9 6 2 ) .
Rodwell, A . W . , J . Gen. M i c r o b i o l . U0, 227 ( 1 9 6 5 ) .
136.
T r i g g l e , D . J . , i n "Recent Progress i n Surface Science"
Khym, J . X . and Cohn, W . E . , J . Am. Chem. Soc.
(J.F.
137•
273-290
(1970).
Westley, J . W . , Anderson, P . J . , Close, V . A . , Halpern, B. and
Appl. M i c r o b i o l .
1 5 , 822 ( 1 9 6 7 ) .
Burton, G . , Blenden, D.C. and Goldberg, H.S. Appl. M i c r o b i o l . 19
586
1U0.
pp.
(1967).
Lederberg, E.M.,
139•
3,
Behal, F . J . and Folds, J . D . , Biochem. Biophys. REs. Comm. 2 7 ,
3kk
138.
D a n i e l l i et a l . , e d . ) , V o l .
(1970).
Burger, H . , Doss, M . , Mannheim, W. and Schuler, A . , Z . Med.
Mikrobiol. Immun.
1 5 3 , 138 ( 1 9 6 7 ) .
11+1.
Brecher, A . S . and Suszkiw, J . B . , Biochem. J .
11+2.
Behal, F . J . , L i t t l e , G.H. and K l e i n , R.A,., Biochim. Biophys.
Acta
1 7 8 , 118 ( 1 9 6 9 ) .
1 1 2 , 335 ( 1 9 6 9 ) .
117
11*3.
Northrop, J . H . , Kunitz, M. and H e r r i o t , R.M.
Enzymes"
11*1*.
2 n d ed.,
Columbia Press, N.Y.
"Crystalline
(19U8).
L i t t l e , G . H . , Starnes, W.L. and Behal, F . J . , Methods Enzymol.
XLV, U95 ( 1 9 7 6 ) .
1U5.
Matheson, A . T . and Murayama, T . , Canad. J . Biochem. M*_, 11*07
(1966).
1U6.
11*7•
11*8.
Razin, S . , Adv. M i c r o b i a l . Physiol.
1 0 , 1 (1973).
Rodwell, A.W. , Ann. N.Y. Acad. S c i . 11*3, 88 ( 1 9 6 7 ) .
Leech, F.R. and S n e l l , E . E . , J . B i o l . Chem. 235, 3523 ( i 9 6 0 ) .
11*9•
Tourtellotte,
M . E . , Morowitz, H . J . and Kasimer, P . ,
J.Bacteriol.
8 8 , 1 1 (1961*).
150.
Tourtellotte,
M . E . , i n "The Mycoplasmatales and L-Phase of
Bacteria" (L. H a y f l i c k , e d . ) ,
C r o f t s , N.Y.
p.
1*51-1*68,
Appleton Century
(1969).
151.
Razin, S . , Progr. Surface Membrane S c i . £ ,
293 ( 1 9 7 5 ) .
152.
Ne'eman, Z. , Kahane, I . and Razin, S . , Biochim. Biophys. Acta
21*9, 169 ( 1 9 7 1 ) .
153.
151*.
155•
156.
157•
Minakami, S. et a l .
158.
L e v i n , Y . , Pecht, M . , Goldstein, L . and K a t c h a l s k i , E .
Coleman, R . , Biochim. Biophys. Acta
300,
1 (1973).
J i n k s , D.C. andMatz, L . L . , Biochim. Biophys. Acta
Robinson, J . O .
Nature
1*52,
(1976).
30
2 1 2 , 199 ( 1 9 6 6 ) .
7 9 , 2171* ( 1 9 5 7 ) .
2 3 8 , 1529 (1963).
Swenson, A.D. and Boyer, P.D. , J . Am. Chem. Soc.
Biochemistry
J . B i o l . Chem.
3 , 1 9 0 5 (1961*).
159•
160.
161.
Means, G.E. and Feeney, K . E . ,
162.
Bellhorn, M . B . , Blumenfeld, 0 . 0 . and Gallop, P . M . , Biochem.
Carraway, K . L .
Hokin, L . E . ,
Biophys.
163.
7., 2 1 9 2 ( 1 9 6 8 ) .
, Biochim. Biophys. Acta 1*15., 379 ( 1 9 7 5 ) .
J . Gen. Physiol.
5**., 3275 ( 1 9 6 9 ) .
Res. Comm.
Biochemistry
3 9 , 267 ( 1 9 7 0 ) .
Fox, C . F . and Kennedy, E . P . , Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S.
5U,
891 ( 1 9 6 5 ) .
161*.
Storm, D.R. and Dolginow, Y . D . , J . B i o l . Chem.
21*8, 5208 ( 1 9 7 3 ) .
STUDY
OF ENZYMES
MEMBRANE
LOCATED
OF MYCOPLASMA
Thesis for
IN THE C E L L
AND
ACHOLEPLASMA
the [Degree of
DOCTOR OF PHILOSOPHY
by
MARIT
PECHT
(LANDAU)
Submitted to the Scientific Council of the Weizmann Institute of Science
Rehovot
September 1977
STUDY
OF ENZYMES
MEMBRANE
OF
LOCATED
MYCOPLASMA
Thesis for
the
AND
IN
THE
CELL
ACHOLEPLASMA
Degree of
DOCTOR OF PHILOSOPHY
by
MARIT
PECHT
(LANDAU)
Submitted to the Scientific Council of the Weizmann Institute of Science
Rehovot
September
1977
SUMMARY
Enzymes located i n the c e l l membrane of Mycoplasma and Acholeplasma have been studied as a model for the r e l a t i o n between the
membrane
and the properties of enzymes bound to i t .
Mycoplasma and
Acholeplasma, belonging to the family I^ycoplasmataceae
of the
Mollicutes c l a s s , were chosen as the most suitable system since these
procaryotes lack a r i g i d peptidoglycan c e l l wall and the plasma
membrane i s t h e i r only c e l l u l a r membrane.
The enzymes that have been studied and characterized are:
(a)
Amidase and peptidase of Mycoplasma fermentans
laidlawii.
(b)
and Acholeplasma
NADH oxidase i n Acholeplasma l a i d l a w i i .
An amidase capable of hydrolyzing amino acid-B-naphthylamides
has been shown to be
inuiuDrciic
bound i n M. fermentans.
This enzyme
exhibits s p e c i f i c i t y towards the basic amino acids h i s t i d i n e , arginine
and l y s i n e , having the highest a f f i n i t y towards h i s t i d y l - B - n a p h t h y l amide
(K = 1 . 2 5 X 1 0 ~
m
k
M).
The optimal pH for the hydrolysis of the
naphthylamide substrates was found to be i n the range of pH
9•5-10.
The pH p r o f i l e s of the amidase a c t i v i t y of the intact c e l l and of the
i s o l a t e d membrane were found to be very s i m i l a r , suggesting that the
enzyme i s exposed to the same environment i n both states.
To exhibit
maximal a c t i v i t y of the amidase, a free a-amino group on the
substrate
i s required.
A membrane bound amidase has been found also i n A. l a i d l a w i i ,
however i t was shown to have a different s p e c i f i c i t y .
The l a t t e r
amidase was most active towards alanyl-3-naphthylamide (K
1
= 6 x 1 0 *M
whereas hydrolysis of other amino acid-naphthylamides was n e g l i g i b l e .
The pH optimum for the hydrolysis of alanyl-S-naphthylamide was pH 8 - 9
The hydrolytic a c t i v i t y observed with A. l a i d l a w i i could also be
defined as that of an aminopeptidase, acting only on substrates
containing free a-amino group.
The naphthylamidases that we have
characterized i n M. fermentans
and A. l a i d l a w i i
are reminiscent of
- ii -
arylamidases found in the cytoplasm of some b a c t e r i a , but d i f f e r i n
t h e i r r e s t r i c t e d l o c a l i z a t i o n to the c e l l membrane.
a c t i v i t y of M. fermentans
The amidase
could be i n h i b i t e d with iodoacetate and
protected from modification by preincubation with h i s t i d i n e .
The
i n h i b i t i o n was a two stage process - a rapid i n h i b i t i o n of 50%
followed by a much slower r a t e , which d i d not reach complete
inhibition.
essential
This might suggest that not a l l the sulfhydryl groups,
for the enzymic a c t i v i t y , are available or sensitive to the
same extent.
A l t e r n a t i v e l y i t i s conceivable that modification of
part of the SH groups leads to s t r u c t u r a l rearrangements that
the protection of the r e s t .
by M. fermentans
induces
We have found that the uptake of h i s t i d i n e
i s also i n h i b i t e d by iodoacetate.
The above data
lend further support to the idea that a functional r e l a t i o n s h i p may
exist between a transport system and a membrane enzyme acting on the
same substrate, which has been put forward by Crane (72 ).
In further work a peptidase that hydrolyses synthetic d i - and
tripeptides containing ^ - h i s t i d i n e and L - l y s i n e , but not o r n i t h i n e ,
was found i n M. fermentans membrane.
The hydrolysis products iden-
t i f i e d by chromatography have proven that t h i s was an aminopeptidase,
cleaving the amino terminal residue possessing a free a-NH2 group.
The substrate s p e c i f i c i t y and pH optimum of the amidase and the p e p t i dase i n M. fermentans
overlapped, suggesting that both
activities
originate in the same membrane protein or protein complex.
membrane of A. l a i d l a w i i
L - a l a oligopeptides
In the
a peptidase was found capable of hydrolyzing
of 2 to 6 residues length.
This enzyme also
cleaved the N-terminal L - a l a from oligoalanine peptides of the
designed sequence L ( L D )
n
strict stereospecificity,
D
(n = 1 ; 2; U ) . The peptidase showed a
cleaving the N-terminal L - a l a only when the
residue was at a distance of two peptide bonds.
cleavage of L - a l a of the
specially
The efficiency
digopeptide decreased with the increase
of
in •
peptide length, suggesting a l i m i t e d binding capacity of the enzyme
­‫י‬ite or slower d i f f u s i o n of the peptide to the enzyme embedded i n the
membrane .
- iii -
A. l a i d l a w i i
c e l l s kept i n isotonic
be impermeable to L-alanine.
growth medium at
s a l t solution were found to
Even when the c e l l s were suspended i n
3 T ° C , the i n t e r n a l concentration of alanine was
found to be rather low. The external l o c a t i o n of the peptidase was
deduced from the observation that the nonapeptide Ala(L)-{ Ala(L)-Ala(D)],
was cleaved by intact c e l l s under conditions at which the c e l l s were
nonpermeable to alanine.
Monovalent cations, known to s t a b i l i z e the f l u i d state of the
membrane, have an a c t i v a t i n g influence on A. l a i d l a w i i amidase.
Though being exposed to quite high s a l t concentration, the amidase
not detached o f f the membrane.
is
A l s o , i t was not inactivated by
t r e a t i n g A. l a i d l a w i i c e l l s with t r y p s i n or phospholipase C.
The
i n t e g r i t y of the membrane structure seems to be e s s e n t i a l for the
a c t i v i t y of the amidase and peptidase,
since both a c t i v i t i e s were
r a p i d l y l o s t i n membrane preparations.
This l i m i t e d the efforts
to
characterize further the enzyme properties i n the i s o l a t e d membrane
compared to the intact
cells.
NADH oxidase i s an i n t r i n s i c membrane protein that is part of the
f l a v i n terminated respiratory chain i n A. l a i d l a w i i
study I have investigated
( 67).
In t h i s
some properties of t h i s enzyme that might be
dominated by the membranal environment.
The NADH
oxidase could be
s o l u b i l i z e d by t r e a t i n g the membrane preparation with
phospholipases.
The p a r t i a l l y s o l u b i l i z e d a c t i v i t y can be further used for p u r i f i c a t i o n
of the enzyme capable of electron transfer to oxygen. This also
corroborates previous findings that l i p i d s are not e s s e n t i a l for the
oxidase a c t i v i t y .
detergent
Tween-20'
Treatment of the membrane with the non-ionic
caused a selective s o l u b i l i z a t i o n of the membrane
and to a •enrichment of protein r e l a t i v e to l i p i d .
The s t r u c t u r a l
rearrangement of the membrane constituents was manifested by a
different mobility pattern i n SDS-acrylamide gel
electrophoresis.
A l s o , the oxidase of the modified membrane i n contrast to the enzyme
in the native membrane, did not require mercaptoethanol i n order to
- iv -
exhibit maximal a c t i v i t y . The change i n the oxidase microenvironment
was also manifested by a s h i f t i n the pH optimum.
The technique of a f f i n i t y l a b e l i n g was employed to l a b e l the
NADH oxidase i n the membrane.
NADH aldehyde, prepared by periodate
oxidation, did apparently react with amino groups at the
by Schiff-base
formation.
surface,
The chemical modification d i d , however,
cause drastic changes i n the membrane, r e s u l t i n g in protein
aggregations that could not be s o l u b i l i z e d even i n SDS.
This
labeled protein complex appeared i n the void volume of Sepharose
UB
columns, also i n the presence of detergents.
Further
characterization of the labeled protein aggregate was thus not
feasible.