1. No category

‫השפעת טריגליצרידים על רעילות שומן בכבד דרך מערכת ‪ NO‬ונגזרות‬
‫חמצן פעילות‬
‫חיבור לשם קבלת תואר‬
‫דוקטור לפילוסופיה‬
‫מאת‪ :‬ארז אילן‬
‫הוגש לסינט האוניברסיטה העברית‪ ,‬בירושלים‬
‫טבת‪/‬תשס"ח‬
‫‪2‬‬
‫עבודה זו נעשתה בהדרכתם של‪:‬‬
‫פרופ' זכריה מדר‬
‫דר' אורן תירוש‬
‫‪3‬‬
‫תקציר‬
‫רקע‪ :‬מחלת כבד שומני מוגדרת כהצטברות של שומן בתאי הכבד ושכיחותה עולה במהירות בארצות‬
‫מפותחות כחלק ממגפת ההשמנה‪ .‬תופעה זו הינה אחת הסיבות העיקריות להתפתחות אי ספיקה כבדית‬
‫בארצות מפותחות‪ .‬התפתחות המחלה מובילה להתקדמות במחלת הכבד ממצב ראשוני של הצטברות שומן‬
‫ועד לשחמת‪ ,‬יתר לחץ פורטלי וקרצינומה הפטוצלולרית‪ .‬הגורם העיקרי להתפתחות דלקת כבד ממצב של‬
‫הצטברות של שומן אינו ידוע‪ ,‬אם כי ישנן מספר תיאוריות לגבי גורמים אפשריים‪ .‬חלק מהתופעות‬
‫המתוארות במצב של כבד שומני יכולות להיות מיוחסות לשינויים במאזן חמצון חיזור ובייצור ‪.NO‬‬
‫התופעות כוללות מוות תאי )נקרוטי או אפופטוטי(‪ ,‬יתר לחץ דם תוך כבדי‪ ,‬פגיעה בתהליכי איתות תוך‬
‫תאיים‪ ,‬פגיעה בתפקוד תאי הכבד ופגיעה מיטוכונדריאלית‪.‬‬
‫היפותזה‪ :‬כבד שומני יכול להוביל למחלת כבד‪ ,‬אולם הגורם הישיר לכך אינו ידוע‪ .‬השערתנו הייתה‪ ,‬כי‬
‫למערכת ‪ NO‬ולמאזן חמצון חיזור בתאי הכבד ישנו תפקיד חשוב בהתפתחות מחלת הכבד השומני וכי‬
‫טריגליצרידים משפיעים באופן ישיר או עקיף על מערכות אלו‪.‬‬
‫שיטות המחקר‪ :‬לביצוע מחקר זה השתמשנו בשלושה מודלים‪ .1 :‬תרבית ראשונית של תאי כבד‬
‫מבודדים‪ ,‬אשר הופקו מחולדות מזן ‪ wistar‬על ידי שטיפת הכבד מדם והזרמת בופר המכיל קולגנאז‬
‫לעיכול רמת החיבור‪ .‬התאים סוננו וסורכזו לקבלת תרבית תאים כבד נקייה ונזרעו על צלחות פלסטיק‬
‫מצופות פיברונקטין‪ .‬התאים נחשפו לטיפולים השונים לטווח זמן של עד ‪ 48‬שעות‪ .2 .‬קו תאי כבד מסוג‬
‫‪ FaO‬ממקור קרצינומה של כבד חולדה‪ .‬תאים אלו גודלו על צלחות ונחשפו לטיפולים שונים‪ .3 .‬מודל ‪in-‬‬
‫‪ vivo‬של חולדות מזן ‪ ,wistar‬אשר בהליך ניתוחי הוחדרה להם צינורית לתוך וריד הצוואר )‪.(jugular‬‬
‫הצינורית הועברה תחת העור עד לאזור הגב‪ ,‬הוצאה דרך קפיץ מתכת המחובר ברתמה לגב החולדה‬
‫וחוברה למזרק דרך מקטע צינור המאפשר תנועה חופשית‪ .‬לאחר הניתוח החיות הושרו לה תאוששות‬
‫במשך יומיים ולאחר מכן ניתנה להם אמולסיית שומן בנפח של ‪ 10‬מ"ל בכל יום בקצב של ‪ 2‬מ"ל לשעה‬
‫למשך ‪ ,4,2,1‬או ‪ 6‬ימים‪ .‬בסיום הוקרבו החולדות ודוגמאות מרקמת הכבד ודם נלקחו לאנליזה‪.‬‬
‫אמולסיית השומן ששימשה לניסויים היא אמולסייה על בסיס שמן סויה‪ ,‬המשמשת להזנה תוך ורידית‬
‫בבני אדם‪ .‬לאחר הטיפולים נבדקו הפרמטרים הבאים‪ :‬הצטברות טריגלצרידים בתאים‪,‬‬
‫חיות התאים‪ ,‬היווצרות נגזרות חמצן פעילות‪ ,‬מידת הפרגמנטציה של ה‪ ,DNA-‬שינוי ברמות ‪ ATP‬על‬
‫ידי לוציפראז במיקרופלואורימטר; רמת גלוטטיון באמצעות‬
‫‪;High pressure liquid‬‬
‫‪ chromatography‬פעילות ‪ caspase-3‬באמצעות סובסטרט פלואורסנטי במיקרופלואורימטר; רמות‬
‫ניטריטים במדיום על ידי ‪ ;Griess assay‬ביטוי חלבונים על ידי ‪ ;SDS-PAGE‬שינויים ברמת ‪mRNA‬‬
‫על ידי ‪ Real-time PCR‬ו‪ PCR-‬וצביעות היסטולוגיות על ידי ‪ DAPI‬לצביעת גרעינים ו‪Nile red-‬‬
‫לצביעת שומן‪.‬‬
‫תוצאות‪ :‬תרביות תאים ראשוניות של תאי כבד אשר הודגרו בנוכחות אמולסיית שומן )‪0.1%‬‬
‫טריגליצרידים( למשך ‪ 48‬שעות הראו ירידה בייצור ניטריטים‪ .‬תופעה זה הייתה תלויה בריכוז )‪(r=0.9‬‬
‫בטווח ריכוזים של ‪ 0.1%-0.01%‬טריגליצרידים‪ .‬ירידה זו בייצור הניטריטים לוותה בירידה בביטוי‬
‫האנזימים ‪ e/iNOS‬ברמת החלבון וברמת השעתוק בתרביות התאים הראשוניות‪ .‬מכיוון שידוע כי גנים‬
‫אלו יכולים להיות מווסתים על ידי דחק חמצוני‪ ,‬נבדקו רמות נגזרות חמצן פעילות‪ .‬נמצא כי ישנה עלייה‬
‫תלויית ריכוז )‪ (r=0.9‬ברמות נגזרות החמצן הפעילות לאחר חשיפה לטריגליצרידים )‪.(0.01%-0.1%‬‬
‫עלייה זו נמצאה בהתאמה הפוכה )‪ (r=0.9‬לרמות הניטריטים‪ .‬יחד עם העלייה ברמות נגזרות החמצן‬
‫הפעילות נצפתה ירידה ברמות גלוטטיון מחוזר‪ .‬כמו כן‪ ,‬עיכוב מכוון של יצירת גלוטטיון גרם להשפעה‬
‫דומה לזו של הטריגליצרידים על ייצור הניטריטים בתרביות התאים הראשוניות‪ .‬אנטיאוקסידנטים מסיסי‬
‫מים מנעו באופן מלא או חלקי את השפעת הטריגליצרידים על ייצור הניטריטים‪ .‬האנטיאוקסידנט ‪NAC‬‬
‫מיתן את הירידה בשעתוק ‪ mRNA‬של ‪ e/iNOS‬ומנע את ההשפעה של טריגליצרידים על גנים אלו‬
‫ברמת החלבון‪.‬‬
‫בתאי כבד מקו ‪ ,FaO‬אשר הודגרו עם טריגליצרידים בריכוז ‪ ,0.1%‬החל להופיע מוות תאי לאחר ‪12‬‬
‫שעות ומוות מסיבי לאחר ‪ 24‬שעות‪ .‬רמות נגזרות החמצן הפעילות עלו בתאים אלו לאחר ההדגרה עם‬
‫טריגליצרידים )‪ (0.1%‬והגיעו לשיא לאחר ‪ 6‬שעות‪ ,‬תוצאה המצביעה על נגזרות חמצן פעילות כגורם‬
‫אפשרי למוות התאי‪ .‬על מנת לאפיין את מקור נגזרות החמצן הפעילות‪ ,‬הנוצרות לאחר הדגרה עם‬
‫טריגליצרידים‪ ,‬הודגרו תאי ‪ FaO‬עם ‪ ,DPI‬שהינו מעכב ספציפי של פלבופרוטאינים‪ DPI .‬מנע הופעת‬
‫עודף נגזרות חמצן פעילות בתאי ‪ FaO‬כתוצאה מחשיפה לטריגליצרידים‪ .‬ככל הנראה‪ ,‬משום שעודף‬
‫נגזרות החמצן הפעילות הינו ממקור מיטוכונדריאלי‪ .‬עקב הפגיעה האפשרית במיטוכונדריה נבדקו רמות‬
‫‪5‬‬
‫‪ .ATP‬נמצא כי רמות ה‪ ATP-‬ירדו כתוצאה מהחשיפה לטריגליצרידים כבר לאחר ‪ 6‬שעות ובמקביל חלה‬
‫עליה בזרחון ‪ ,AMPK‬סנסור אנרגטי בתא‪ .‬ירידה זו ברמות ‪ ATP‬והעלייה בזרחון ‪ AMPK‬נמנעה על‬
‫ידי מתן האנטיאוקסידנט ‪ .NAC‬על מנת לאפיין את סוג המוות הנגרם לתאי ‪ FaO‬מהחשיפה‬
‫לטריגליצרידים נבדקו שני פרמטרים המעידים על אפופטוזיס‪ :‬פעילות ‪ caspase 3‬ופרגמנטציה של‬
‫‪ .DNA‬בשני הפרמטרים האלו לא היה שינוי בטווח הזמן של עד ‪ 24‬שעות‪ ,HMGB1 .‬פרמטר המעיד על‬
‫נקרוזיס‪ ,‬נבדק ונמצא כי רמתו ירדה לאחר החשיפה לטריגליצרידים‪ .‬שני ממצאים אלו יחד מעידים על‬
‫מוות נקרוטי של תאי ‪ FaO‬לאחר חשיפה לטריגליצרידים ‪ .0.1%‬ייצור ה‪ ATP-‬בתרביות התאים‬
‫הראשוניות לא נפגע מהחשיפה לטריגליצרידים ואף חלה בו מגמת עליה לאחר החשיפה לטריגליצרידים‪.‬‬
‫תוספת של ‪ NAC‬לטריגליצרידים גרמה להגברת העלייה ברמות ה‪ ATP-‬בהשוואה לטריגליצרידים‬
‫לבדם‪ .‬בחיות אשר קיבלו אמולסית שומן בהזנה תוך ורידית במשך ‪ 6‬ימים‪ ,‬הופיע נזק מתון לרקמה‬
‫בהשוואה לחיות אשר קיבלו ‪ .PBS‬בחתכים היסטולוגים ניתן לראות הצטברות גדולה יותר של שומן‬
‫בתאי הכבד‪ .‬בבדיקת רמות אנזימי הכבד ‪ SGOT‬ו‪ SGPT -‬בסרום הופיעה עלייה משמעותית ברמות‬
‫אנזימים אלו לאחר ‪ 6‬ימים )אך לא לפני כן(‪ .‬לאחר ‪ 6‬ימים של מתן אמולסית שומן חלה עליה ב‪4--‬‬
‫)‪ ,Hydroxynonenal (4HNE‬סמן של דחק חמצוני וירידה ב‪ .mRNA eNOS-‬הירידה ברמות חלבון‬
‫‪ eNOS‬הופיעה לאחר ‪ 4‬ימים )‪ ( 35%‬והוגברה לאחר ‪ 6‬ימים )‪.(55%‬‬
‫סיכום‪ :‬מחקר זה מראה כי ייצור ‪ NO‬בתרביות תאים ראשוניות מווסת על ידי טריגליצרידים ומתווך‬
‫באמצעות ייצור נגזרות חמצן פעילות‪ .‬הפגיעה בייצור נובעת מהירידה ברמות האנזימים המייצרים ‪NO‬‬
‫‪ e/iNOS‬ונמנעה על ידי האנטיאוקסידנט ‪ .NAC‬תאי ‪ FaO‬מתו מוות נקרוטי לאחר חשיפה לאמולסיית‬
‫שומן כתוצאה ממשבר אנרגטי בתא‪ ,‬שנגרם על ידי פגיעה של נגזרות חמצן פעילות במיטוכונדריה‪.‬‬
‫הפגיעה במערכת ‪ NO‬והעלייה בייצור נגזרות חמצן פעילות התרחשו גם ‪ in-vivo‬כתוצאה מהזנה תוך‬
‫ורידית של חולדות בטריגליצרידים‪ .‬מוות תאי הכבד‪ ,‬כפי שהתבטא בעלייה באנזימי הכבד בחולדות אשר‬
‫הוזנו באמולסית שומן‪ ,‬הוקדם על ידי ירידה באנזים ‪ .eNOS‬מכאן יתכן שלוויסות מערכת ה‪NO-‬‬
‫מעורבות במוות תאי במצב של כבד שומני‪.‬‬
‫‪6‬‬
‫מחקר זה מצביע על חשיבות היכולת האנטיאוקסידנטית של התאים במצב של הצטברות שומן בכבד‬
‫במקרים כמו מחלת כבד שומני‪ .‬רמת אנטיאוקסידנטים גבוהה בתאי כבד עשויה לגונן עליהם מפני נזק‬
‫חמצוני ופגיעה במערכת ‪ ,NO‬שני גורמים בעלי פוטנציאל נזק במצב של כבד שומני‪.‬‬
‫תוכן‬
‫תקציר‬
‫‪4‬‬
‫תוכן‬
‫‪8‬‬
‫מבוא‬
‫‪11‬‬
‫כבד שומני‬
‫‪11‬‬
‫‪(NO) Nitric Oxide‬‬
‫‪14‬‬
‫עקה חימצונית )‪(Oxidative stress‬‬
‫‪18‬‬
‫אנטיאוקסידנטים ומערך ההגנה האנטיאוקסידנטי בתא‬
‫‪24‬‬
‫הטיפול המקובל בכבד שומני‬
‫‪27‬‬
‫היפותזה‬
‫‪28‬‬
‫מטרה כללית‬
‫‪28‬‬
‫מטרות ספציפיות‬
‫‪28‬‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪29‬‬
‫כימיקלים‬
‫‪29‬‬
‫נוגדנים‬
‫‪31‬‬
‫התחלים‬
‫‪32‬‬
‫תרביות תאים‬
‫‪33‬‬
‫תאי ‪FaO‬‬
‫‪33‬‬
‫הפקת תאי כבד‬
‫‪33‬‬
‫תרביות תאים ראשוניות‬
‫‪33‬‬
‫בדיקת חיות התאים‬
‫‪34‬‬
‫נגזרות חמצן פעילות‬
‫‪34‬‬
‫מדידת כמות שומן בתאים‬
‫‪35‬‬
‫פרגמנטציה של ‪DNA‬‬
‫‪35‬‬
‫פעילות ‪caspase3‬‬
‫‪36‬‬
‫קביעת רמות ‪ATP‬‬
‫‪37‬‬
‫קביעת הרכב טריגליצרידים‬
‫‪37‬‬
‫קביעה של הרכב חומצות שומן‬
‫‪37‬‬
‫מדידת גלוטטיון מחוזר‬
‫‪38‬‬
‫קביעת ריכוז הניטריטים במדיום‬
‫‪38‬‬
‫ניסויים ‪invivo‬‬
‫‪39‬‬
‫פרוטוקול אינפוזיה‬
‫‪39‬‬
‫‪8‬‬
‫היסטולוגיה‬
‫‪40‬‬
‫כללי‬
‫‪40‬‬
‫קביעת חלבון‬
‫‪40‬‬
‫‪Western Blot‬‬
‫‪41‬‬
‫הפקת ‪RNA‬‬
‫‪42‬‬
‫יצירת ‪cDNA‬‬
‫‪43‬‬
‫ריאקצית ‪PCR‬‬
‫‪44‬‬
‫‪Real time PCR‬‬
‫‪45‬‬
‫ניתוח התוצאות‬
‫‪45‬‬
‫תוצאות‬
‫‪46‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪NO‬‬
‫‪46‬‬
‫כניסת טריגליצרידים לתאים‬
‫‪46‬‬
‫השפעת השומן על חיות התאים‬
‫‪48‬‬
‫השפעת השומן על יצור ‪ NO‬בתאי כבד מבודדים‬
‫‪48‬‬
‫אינדוקציה של נגזרות חמצן פעילות על ידי טריגליצרידים‬
‫‪50‬‬
‫השפעת אנטיאוקסידנטים על רמות ניטריטים בתאי כבד שנחשפו לטריגליצרידים‬
‫‪52‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על יצור ‪ NO‬מושרה על ידי ‪TNF α‬‬
‫‪55‬‬
‫השפעה של חשיפת תאי ‪ FaO‬לטריגליצרידים‬
‫‪56‬‬
‫כניסת טריגליצרידים לתוך תאי ‪FaO‬‬
‫‪56‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על חיות התאים ויצירת נגזרות חמצן פעילות‬
‫‪57‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על המאזן האנרגטי‬
‫‪60‬‬
‫סוג המוות הנגרם מחשיפה לטריגליצרידים‬
‫‪61‬‬
‫חשיפה ‪ in vivo‬לטריגליצרידים‬
‫‪63‬‬
‫צריכת מזון‪ ,‬פרופיל שומנים בדם‪ ,‬והצטברות שומן בכבד‬
‫‪63‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מתח חמצוני בכבד‬
‫‪65‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪NO‬‬
‫‪65‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על המאזן האנרגטי‬
‫‪66‬‬
‫דיון‬
‫‪67‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬בתרביות תאים ראשוניות‬
‫‪67‬‬
‫הצטברות שומן בתרביות תאים ראשוניות‬
‫‪67‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪NO‬‬
‫‪67‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על יצור ‪ NO‬המושרה על ידי ‪TNF α‬‬
‫‪70‬‬
‫מודל השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬בתרביות תאים ראשוניות‬
‫‪71‬‬
‫‪9‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על חיות תאי כבד‬
‫‪72‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על חיות התאי כבד במודל תאי ‪FaO‬‬
‫‪73‬‬
‫מוות תאי מושרה על ידי טריגליצרידים‬
‫‪73‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על המאזן האנרגטי‬
‫‪75‬‬
‫סוג המוות הנגרם מחשיפה לטריגליצרידים‬
‫‪76‬‬
‫מודל השפעת טריגליצרידים על חיות תאי הכבד במודל תאי ‪FaO‬‬
‫‪77‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על הנזק החמצוני ומערכת ‪ NO‬במודל הזנה תוך ורידית של חולדות‬
‫‪78‬‬
‫מודל השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬ונגזרות חמצן פעילות בכבד‬
‫‪80‬‬
‫סיכום‬
‫‪81‬‬
‫רשימת פרסומים‬
‫‪82‬‬
‫‪References‬‬
‫‪83‬‬
‫‪10‬‬
‫מבוא‬
‫כבד שומני‬
‫מחלת כבד שומני מוגדרת כהצטברות של שומן בתאי הכבד ברמה החורגת מהכמות הנורמלית )מעל ‪5%-‬‬
‫‪ .(1) (10%‬שכיחותה של מחלת הכבד השומני עולה במהירות בארצות מפותחות כחלק ממגפת ההשמנה‬
‫והיא הופכת להיות אחת הסיבות השכיחות ביותר לאי ספיקה כבדית בארצות מפותחות‪ .‬שכיחות מחלת‬
‫הכבד השומני באוכלוסייה הכללית עומדת על כ‪ ,30%-‬כאשר ‪ 50%‬מהחולים מפתחים פיברוזיס ו‪30% -‬‬
‫מפתחים שחמת‪ ,‬ו‪ 3% -‬מפתחים אי ספיקת כבד ויהיו זקוקים להשתלה ) ‪ .(2‬עד לאחרונה‪ ,‬הייתה הסכמה‬
‫בספרות הרפואית כי כבד שומני אינו מהווה בעיה בריאותית משמעותית )‪ .(3‬לכן‪ ,‬ההמלצה שניתנה לכל‬
‫הסובלים ממנה הייתה הורדת משקל‪ ,‬ללא צורך במעקב רפואי כלשהו‪ .‬עם הזמן החלו להצטבר יותר‬
‫ויותר מקרים של חולים הלוקים במחלת כבד סופנית מבלי שנצפתה סיבה ברורה להיווצרות המחלה )‪.(4‬‬
‫מחקירת התופעה של כבד שומני עולה כי במרבית המקרים הפך כבד שומני לכבד "חולה"‪ .‬כך "נולדה"‬
‫מחלה חדשה‪ :‬מחלת הכבד השומני‪ .‬בקרב בעלי משקל עודף מגיעה שכיחות המחלה למימדים מדאיגים של‬
‫עד ‪ .60%‬התפתחות המחלה מובילה להתקדמות במחלת הכבד ממצב ראשוני של שינויים שומניים‬
‫שפירים ועד לשחמת‪ ,‬יתר לחץ פורטלי וקרצינומה הפטוצלולרית )‪ .(5‬באורח לא מפתיע‪ ,‬התברר שגורמי‬
‫הסיכון למחלות לב וכלי‪-‬דם‪ ,‬כגון‪ :‬סוכרת‪ ,‬יתר לחץ דם‪ ,‬יתר שומנים בדם ובעיקר עודף טריגליצרידים‪,‬‬
‫מהווים גורמי סיכון גם להתפתחות מחלת הכבד השומני‪ .‬מכלול מחלות אלו נקרא "הסינדרום המטבולי"‬
‫וברור כי מחלת הכבד השומני מהווה חלק מסינדרום זה‪ .‬הקשר בין שתי המחלות הינו עמידות תאי הגוף‬
‫לאינסולין‪ .‬מכאן שאנשים בעלי עודף משקל או חולי סוכרת מצויים בסיכון מוגבר להתפתחות המחלה )פי‬
‫שלושה עד ארבעה לעומת אנשים רזים‪ ,‬ללא סוכרת(‪ .‬ההפרעה הינה אסימפטומטית ברב המקרים‪ ,‬אם כי‬
‫חלק מהחולים מתארים עייפות ואי נוחות באזור הבטן‪ .‬אבחון המחלה נעשה על ידי שלילת צריכת‬
‫אלכוהול מוגברת )פחות מ‪ 20-‬גרם ליום( )‪.(5‬‬
‫‪11‬‬
‫מגיפת ההשמנה פוגעת כבר בשלבים המוקדמים של הילדות‪ ,‬ולראיה כחמישית מן הילדים סובלים‬
‫מהשמנת יתר‪ steatosis hepatitis .‬הינה מחלת הכבד הנפוצה ביותר בארצות הברית‪ ,‬וקרוב לודאי גם‬
‫במדינות מפותחות נוספות )‪ .(6,7‬הטיפול במחלה מתמקד בשלושה כיוונים‪ :‬א‪ .‬טיפול בכל התסמינים‬
‫והמחלות הנלוות ב‪ .‬הפחתת גורמי סיכון )ביניהם‪ :‬איזון סכרת‪ ,‬הפחתת רמות שומנים בדם‪ ,‬טיפול‬
‫בהיפרליפידמיה וכו'( ג‪ .‬הורדת משקל וביצוע פעילות גופנית‪ .‬במחקרים נצפה כי הירידה במשקל חייבת‬
‫להיות הדרגתית )עד קילוגרם לשבוע(‪ ,‬היות והורדת משקל מהירה עלולה להחמיר את המחלה‪ .‬על כן‪,‬‬
‫מומלץ להפחית בין ‪ 500‬ל‪ 1,000-‬קלוריות לכל היותר מהצריכה היומית‪ .‬ירידה מהירה מידי במשקל‪,‬‬
‫הנובעת מדיאטות דרסטיות‪ ,‬עשויה דווקא להחמיר את המחלה על‪-‬ידי עידוד היוצרות הדלקת והרקמה‬
‫הצלקתית‪ .‬השפעה פרדוקסלית זו עשויה להיגרם עקב עליה ברמת חומצות שומן בכבד‪ .‬מקורן של‬
‫חומצות שומן אלו הינו פירוק רקמת השומן עקב החוסר האנרגטי‪ .‬בנוסף מקובל מתן טיפול תרופתי‬
‫לאנשים בסיכון יתר ) ‪ .(8‬עד כה לא פותח טיפול ייעודי למחלה‪ ,‬משום שטרם פותחה תרופה המסוגלת‬
‫להפחית את הצטברות חומצות השומן בכבד‪ .‬עד כה נוסו מספר תרופות לטיפול בכבד שומני‪ ,‬אך ללא‬
‫תוצאות חד‪-‬משמעיות‪.‬‬
‫תופעת הכבד השומני שאינו נובע מצריכת אלכוהול‬
‫‪Nonalcoholic Fatty Liver Disease-‬‬
‫)‪ (NAFLD‬ידועה מזה חמישים שנה )‪ ,(9‬אך התקדמות מעטה נעשתה בחקר מחלה זו עד לפרסום‬
‫עבודתם של ‪ Adler‬ו‪ (10) Schaffner-‬בשנת ‪ .1979‬בעבודה זו תוארה התופעה של צהבת ושחמת‬
‫בכבד השומני כחיקוי של המצב הנגרם בכבד כתוצאה מצריכת אלכוהול )‪Alcoholic Fatty (AFLD‬‬
‫‪ Ludwig .Liver Disease‬ועמיתיו )‪ (11‬כינו בשם )‪ Non alcoholic steatohepatitis (NASH‬את‬‫המצב בו נראית בביופסית כבד תמונה דלקתית המתאימה למחלת כבד על רקע שתיית אלכוהול בנשים‬
‫שמנות שהכחישו צריכת אלכוהול‪ .‬המונח ‪ NAFLD‬כולל בתוכו את כל קשת חומרת המחלה‪ ,‬ממצב של‬
‫כבד שומני‪ ,‬דרך התפתחות דלקת‪ ,‬הצטלקות ושחמת ועד להתפתחות של סרטן הכבד או צורך בהשתלת‬
‫כבד‪.‬‬
‫הסימן הראשון למחלה הוא עליה ברמות אנזימי הכבד המלווה במראה אקוגני של הכבד באולטרסאונד‪.‬‬
‫בדיקות ‪ CT‬ו‪ MRI -‬יכולות לשמש לאבחון כבד שומני‪ ,‬אולם ביופסיית כבד הנה בדיקת הבחירה ) ‪gold‬‬
‫‪ ,(standard‬ומראה שינויים זהים למחלת כבד אלכוהולית )‪.(12‬‬
‫‪12‬‬
‫כאשר בנוסף לשומן נראים בביופסיית כבד גם דלקת וצלקת מוגדר המצב כ‪ ,NASH -‬הנחשבת כדרגה‬
‫חמורה יותר של ‪ NASH .NAFLD‬הוכרה בעשרים השנים האחרונות כמחלת כבד שכיחה וחשובה‪,‬‬
‫העלולה להתפתח למחלת כבד כרונית על סיבוכיה‪.‬‬
‫במצבים של תנגודת לאינסולין‪ ,‬כאשר תאי הגוף אינם מגיבים לאינסולין‪ ,‬ישנה עליה ברמות הסוכרים‬
‫והשומנים בדם ועודפי השומן המגיעים מן הדם לכבד מצטברים בתוכו‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬כבד שומני עלול‬
‫להתפתח גם אצל אנשים שאינם מאופיינים בגורמי הסיכון שהוזכרו )‪.(12‬‬
‫הצטברות שומן בתאי הכבד )‪ (steatosis‬נובעת מחוסר איזון בין כמות השומן הנקלטת על ידי הכבד ובין‬
‫כמות השומן היוצאת מן הכבד‪ .‬כיום מקובלת תיאורית שני השלבים להסברת הפתוגנזה של ‪NAFLD‬‬
‫)‪ .(13‬השלב הראשון )‪ (first hit‬מתחיל בתנגודת לאינסולין וכולל עליה בפעילות‬
‫‪Hormone‬‬
‫)‪ ,Sensitive Lipase (HSL‬הורמון הגורם לעליה בפרוק רקמת השומן שיוצרת זרם מוגבר של שומן‬
‫לכבד‪ .‬הכבד קולט את השומן‪ ,‬אך אינו יכול להיפטר ממנו בקצב הנדרש על ידי חמצונו או על ידי יצוא‬
‫השומן בחזרה לדם ולרקמת השומן‪ .‬נוסף לכך‪ ,‬במצב של תנגודת לאינסולין הכבד עצמו מייצר כמות‬
‫עודפת של שומן‪ ,‬המוסיף על השומן המצטבר בכבד‪ .‬בשלב השני )‪ (second hit‬מתפתחת עקה חמצונית‬
‫שנובעת מחמצון עודפי חומצות השומן החופשיות בתוך תאי הכבד‪ .‬תוצרי החמצון מעודדים הפרשת‬
‫חומרים מעודדי דלקת‪ ,‬דוגמת ‪ ,TNF-α‬וכן משפעלים את ה‪ ,stellate cells -‬התאים האחראים על‬
‫היווצרות הצלקת )פיברוזיס( בכבד‪ .‬השלב השני מוביל לצורה החמורה יותר של המחלה – ‪NASH‬‬
‫ועשוי להתקדם עד לשחמת הכבד בחלק קטן מן המקרים‪.‬‬
‫מנגנון הופעת ‪ NAFLD‬אינו ברור דיו‪ ,‬והשאלה המרכזית שאינה פתורה היא מדוע בחלק מהחולים‬
‫מדובר רק בהצטברות שומן ואילו חלק אחר יפתח גם דלקת ופיברוזיס‪ .‬מהלך התקדמות המחלה נבדק‬
‫במספר מועט של מחקרים ולכן עדין אינו ברור דיו‪ .‬על סמך הידע הקיים‪ ,‬נראה כי חלקם הגדול של‬
‫החולים שנמצא אצלם שומן בלבד בביופסיית הכבד "ייהנה" ממהלך קל ושפיר יחסית‪ ,‬בעוד שאצל‬
‫אחרים תחול התדרדרות לדלקת ולעיתים עד לשחמת הכבד ואף אי ספיקת כבד סופנית )‪ .(14‬ישנם‬
‫דיווחים על סרטן הכבד )‪ (15) (hepatocellular carcinoma‬והשתלת כבד עשויה להידרש במקרה של‬
‫שחמת שהתדרדרה לכשל כבדי או לסרטן הכבד )‪ .(6‬למרות שהגורמים להתקדמות המחלה אינם ידועים‬
‫בוודאות‪ ,‬קיים מספר רב של גורמים המשויכים לכך‪ ,‬ביניהם יצירת נגזרות חמצן פעילות וציטוקינים‬
‫‪13‬‬
‫)‪ .(16‬תהליכי המוות התאי והשינויים בלחץ הדם בתוך הכבד יכולים להעיד של שינויים ביצור ‪Nitric‬‬
‫‪.Oxide‬‬
‫‪(NO) Nitric Oxide‬‬
‫בשנת ‪ 1986‬מצאו ‪ Ignarro‬ועמיתיו )‪ (17‬כי ‪ NO‬הוא ה‪endothelium-derived relaxing factor-‬‬
‫)‪ (EDRF‬וב‪ 1998 -‬הוענק לו פרס נובל לרפואה עבור מציאת מעורבות ‪ NO‬בפעולת המערכת‬
‫הקרדיווסקולארית‪ NO .‬הנו גז אנאורגאני‪ ,‬המסונתז בגוף מחומצת האמינו ‪ L-arginine‬על ידי האנזים‬
‫‪ .(NOS) Nitric oxide synthase‬סינתזת ‪ NO‬יוצאת לפועל על ידי חמצון הקבוצה החנקתית של ‪L-‬‬
‫‪ arginine‬התלוי ב‪ .NADPH-‬משערים כי בתגובה זו נוצר חומר ביניים לא יציב‪N-hydroxy-L- ,‬‬
‫‪ ,arginine‬ושנדרשת מולקולה נוספת של ‪ NADPH‬לשם קבלת התוצרים ‪ L-citrulline‬ו‪.NO-‬‬
‫בריאקציה זו נוצרת מולקולה אחת של ‪ L-citrulline‬על כל מולקולת ‪) NO‬איור ‪ .(1‬מולקולת ‪ NO‬היא‬
‫מולקולה המסיסה גם בשומן וגם במים‪ ,‬תכונה המאפשרת לה לעבור דיפוזיה דרך רקמות‪ .‬מנגד עומדת‬
‫העובדה כי זמן מחצית חייה קצר )‪ 4-10‬שניות( ולכן למרות כושר הדיפוזיה שלה היא לא תשפיע על‬
‫רקמות מרוחקות )‪.(18,19‬‬
‫איור ‪ – 1‬תהליך הביוסינתזה של ‪ NO‬מ‪.(20) L-arginine -‬‬
‫‪ NO‬מעורב ת במספר תהליכים חשובים בגוף‪ ,‬בניהם ויסות מתח כלי הדם‪ ,‬תפקיד כנוירוטרנסמיטור‬
‫במערכת העצבים‪ ,‬ותפקיד במערכת החיסון ‪ -‬בהגנה מפני גופים זרים‪ .‬בכך מהווה ‪ NO‬גורם חשוב‬
‫בשמירה על הומיאוסטזיס בגוף‪ .‬עם זאת‪ ,‬נמצא כי ל‪ NO -‬השפעות מזיקות והיא מעורבת גם במצבים‬
‫פתולוגיים כגון דלקות ומחלות שונות‪ ,‬בניהן טרשת עורקים‪ ,‬סרטן‪ ,‬סוכרת ומחלות ניווניות של מערכת‬
‫העצבים )‪) (21‬איור ‪ .(2‬ניתן לחלק את הפעילות הפיזיולוגית של ‪ NO‬לפעילות ישירה ועקיפה‪ .‬הפעילות‬
‫‪14‬‬
‫הישירה מתייחסת לריאקציות בהן ‪ NO‬מגיבה ישירות עם מולקולות נוספות‪ .‬פעילות זו מתרחשת במצב‬
‫ביולוגי תקין‪ ,‬כאשר ריכוז ה‪ NO -‬נמוך יחסית )פחות ממיקרומולר(‪ ,‬אז תגיב ‪ NO‬עם חלבונים שונים‬
‫כגון גואנילאט ציקלאז‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬הפעילות העקיפה של ‪ NO‬מתרחשת במצבים פתולוגים‪ ,‬כאשר ריכוז‬
‫ה‪ NO -‬גבוה מ‪ 1-‬מיקרומולר‪ ,‬פעילות זו מיוחסת להשפעות המתרחשות כתוצאה מתגובה של ‪ NO‬עם‬
‫חמצן או סופראוקסיד )‪ (O2·-‬ליצירת רדיקלים ניטריטים )‪(21,22 ) (RNOS‬‬
‫איור ‪ – 2‬השפעות פיזיולוגיות של ‪.(21) NO‬‬
‫תפקידה הידוע ביותר של ‪ NO‬הוא הרפית כלי דם‪ ,‬אך בנוסף היא מעורב ת במספר תהליכים בהתאם‬
‫לרקמה בה היא מיוצרת ובמיקום היצור בתוך התא ) ‪ NO .(23‬משמשת גם כגורם מחמצן בפרץ החמצוני‬
‫של מקרופגים ובגיוס התגובה הדלקתית )‪.(24‬‬
‫עד כה זוהו שלושה איזופורמים שונים של ‪:NOS‬‬
‫‪ - neuronal nitric oxide synthase (nNOS) NOS-1 .1‬איזופורם קונסטיטוטיבי שבודד מתאי‬
‫המוח‪.‬‬
‫‪ - inducible nitric oxide synthase (iNOS) NOS-2 .2‬איזופורם אינדוקטיבי אשר מבוטא‬
‫בתאים לאחר אינדוקציה או סטימולציה מתאימה‪.‬‬
‫‪endothelial nitric oxide synthase (eNOS) NOS-3 .3‬‬
‫‪ -‬איזופורם קונסטיטוטיבי שבודד‬
‫לראשונה מתאי אנדותל‪.‬‬
‫ריכוזים נמוכים של ‪ ,NO‬המיוצרים על ידי האנזימים הקונסטיטוטיביים ‪ eNOS‬ו‪ ,nNOS-‬משמשים‬
‫כגורמי שרידות )‪ (25‬ולתהליכי איתות ) ‪ NO .(26‬המעורבת בתהליכים דלקתיים ובפרץ חמצוני מיוצרת‬
‫‪15‬‬
‫על ידי האנזים ‪ .iNOS‬יצורה של ‪ NO‬בריכוז גבוה על ידי ‪ iNOS‬גורם ליצירת פראוקסיניטריט על ידי‬
‫תגובה בין ‪ NO‬לסופראוקסיד‪ .‬תוצר זה עלול לגרום לנזק על ידי חמצון וניטרוזילציות של חלבונים‪,‬‬
‫שומנים ו‪.(27 ) DNA-‬‬
‫פעילות האיזופורמים הקונסטיטוטיביים תלויה בסידן ובקלמודולין‪ ,‬בעוד ‪ iNOS‬אינו זקוק למאקטבים‬
‫אלו‪ .‬הבדל זה נובע מכך ש‪ iNOS -‬קשור באופן קונסטיטוטיבי לקלמודולין ולכן לא זקוק לו לשם‬
‫הפעלתו‪ .‬כל שלושת האיזופורמים דורשים את הקופקטורים הבאים לשם פעולתם‪ :‬תיולים‪,NADPH ,‬‬
‫‪ FAD ,FMN‬ו‪.(28) BH4-‬‬
‫בכבד שני איזופורמים של ‪ NOS‬מתבטאים ‪ iNOS‬ו‪.eNOS-‬‬
‫‪(iNOS) NOS-2‬‬
‫‪ iNOS‬מתבטא באופן אינדוקטיבי כמעט בכל סוגי התאים לאחר חשיפתם לציטוקינים שונים כגון‬
‫‪ INFγ ,IL-1 ,TNFα‬ולגורמים נוספים )‪ .(29‬ישנם דיווחים לפיהם ‪ iNOS‬מתבטא גם באופן‬
‫קונסטיטוטיבי בתאים מסוימים )‪ .(30,31‬לאחר אידוקציה‪ ,‬מייצר ‪ iNOS‬כמויות גדולות של ‪ NO‬באופן‬
‫שאינו תלוי ביוני סידן‪ .‬ריכוזים גבוהים אלו של ‪ NO‬מסוגלים לעכב מספר אנזימי מפתח אשר מכילים‬
‫ברזל באתר הקטליטי‪ .‬קבוצת אנזימים זו כוללת את ריבונוקלאוטיד רדוקטאז )אנזים קובע קצב בתהליך‬
‫שכפול ה‪ ,(DNA-‬אנזימים התלויים בקבוצות ברזל וסולפט המעורבים בשרשרת העברת האלקטרונים‬
‫בתהליך הנשימה המיטוכונדריאלי‪ ,‬ואת האנזים אקוניטאז המעורב במעגל חומצת הלימון )‪ .(32‬בנוסף‪,‬‬
‫יכולים ריכוזים גבוהים של ‪ NO‬לגרום לשברים ב‪ DNA-‬ולשינויים במבנהו )‪ .(21,33‬שילוב הפעילויות‬
‫שתוארו משמש כגורם הגנה מפני מיקרואורגניזמים התוקפים את התא ומפני התרבות תאים סרטניים‪.‬‬
‫לכן‪ NO ,‬הינה מולקולה חיונית במערך ההגנה הלא ספציפי של מערכת החיסון )‪ .(34‬לעומת זאת‪ ,‬כמות‬
‫גדולה של ‪ ,NO‬הנוצרת בעקבות ביטוי ‪ ,iNOS‬יכולה להוות גם גורם מזיק‪ .‬נמצא כי ‪ NO‬מעורב בהרס‬
‫של תאי ‪ β‬בלבלב‪ ,‬ובכך עלול לתרום להתפתחות סוכרת מסוג ‪.(35) 2‬‬
‫הגורם העיקרי המווסת את פעילות האנזים הינו הבקרה על ביטוי הגן ל‪ iNOS .iNOS-‬יכול לייצר ‪NO‬‬
‫ברציפות עד אשר הוא עובר דגנרציה ) ‪ .(34,36‬ויסות פעילות ‪ iNOS‬שונה בין סוגי רקמות ותאים‬
‫שונים‪ .‬גורם השעתוק ‪ NFκB‬משמש כמתווך העיקרי לגורמים המשרים ביטוי ‪ iNOS‬כגון‬
‫‪16‬‬
‫)‪ tumor necrosis factor α (TNFα) ,lipopolysaccaride (LPS‬ו‪ ,interleukin 1β (IL-1β)-‬ועקה‬
‫חמצונית‪ ,‬ולגורמים המעכבים אותו כגון גלוקוקורטיקואידים ואנטיאוקסידנטים שונים )‪.(37‬‬
‫‪(eNOS) NOS-3‬‬
‫‪ eNOS‬מייצר כמויות קטנות של ‪ NO‬ותלוי ביוני סידן ובקלמודולין לשם פעולתו‪ .‬ייצור ‪ NO‬על ידי‬
‫‪ eNOS‬הינו גורם חשוב בתהליך הרפיית כלי הדם ומניעת הצמדות טסיות דם‪ .‬בנוסף‪ NO ,‬מונע הדבקות‬
‫לויקוציטים לשכבת האנדותל על ידי עיכוב של החומרים האחראים לכך‪ .‬דווח כי ‪ NO‬מעכב את‬
‫הפרוליפרציה של תאי השריר החלק בדפנות כלי הדם ) ‪ NO .(38,39‬שנוצר על ידי ‪ eNOS‬משמש‬
‫כגורם מגן מפני טרשת עורקים‪ .‬למרות שמו‪ ,‬מצאו כי ‪ eNOS‬מתבטא בתאים נוספים מלבד תאי האנדותל‬
‫כגון תאי כבד‪ ,‬נוירונים‪ ,‬תאי שריר הלב‪ ,‬תאי ‪ T‬ותאים נוספים )‪.(40‬‬
‫הקשר בין ‪ NO‬ו‪O2-‬‬
‫‪ NO‬מסוגל ת להגיב עם חמצן והסיכוי לכך עולה ככל שעולה ריכוז ‪ .(41) NO‬תוצרי הריאקציה של ‪NO‬‬
‫עם חמצן נקראים ‪ (RNS) Reactive nitrogen species‬והם כוללים את ‪ N2O3 ,NO2‬ו‪ ,N2O4 -‬שהנן‬
‫מולקולות לא יציבות וריאקטיביות‪ .‬מולקולות אלו בעלות זמן מחצית חיים קצר וטווח פעולה רחב יותר‬
‫ביחס ל‪ NO-‬עצמה‪ .‬הריכוז של ‪ NO‬וכמות ‪ RNS‬שנוצרים יקבעו את גורל ותפקידי ‪ NO‬במערכת‪.‬‬
‫תהליכי בקרת ייצור ‪ NO‬על‪-‬ידי האיזופורמים הקונסטיטוטיביים של ‪ NOS‬מאפשרים ייצור ריכוזים‬
‫נמוכים של ‪ ,NO‬דבר המביא לעלייה מקומית בריכוזי ‪ NO‬לזמן קצר ללא יצירת ‪ .RNS‬לעומת זאת‪,‬‬
‫פעילות לא מבוקרת של ‪ iNOS‬גורמת לעלייה גבוהה בריכוז ה‪ NO-‬המקומי ולעלייה ברמות ‪RNS‬‬
‫לפרקי זמן ארוכים‪ .‬בנוסף לכך‪ NO ,‬יכול להגיב עם סופראוקסיד )‪ (O2-‬ליצירת פראוקסיניטריט‬
‫)‪ (ONOO-‬שהנה מולקולה ריאקטיבית )‪.(41‬‬
‫‪ NO‬ונזק לכבד‬
‫בשל הרב גוניות של ‪ NO‬בשליטה על תהליכים תוך תאיים יכול כל שינוי ברמותיה להוביל למספר רב‬
‫של תוצאות‪ .‬ההשלכות הנובעות משינויים ברמות ‪ NO‬ורלוונטיות באופן ישיר לכבד שומני הן‪ :‬ירידה‬
‫בלחץ הדם התוך כבדי‪ ,‬עידוד מוות תאי‪ ,‬ופגיעה ביכולת ההפעלה של התאים לאחר גירוי עם ציטוקינים‪.‬‬
‫במצב תקין‪ ,‬מווסת לחץ הדם בתוך הכבד על ידי ‪ ,NO‬הגורמת להרפיית כלי הדם ובכך מאפשרת זרימה‬
‫‪17‬‬
‫של כמויות גדולות יותר של דם דרך הכבד )‪ .(42‬ייחודה של ‪ NO‬הינו בהיותה מולקולה קטנה היכולה‬
‫לעבור דיפוזיה בקלות‪ ,‬ומכך נובעת יכולתה להיות מופרשת מתאי הכבד ולהשפיע על תאים בסביבה‪,‬‬
‫ביניהם תאי אנדותל‪ .‬במצבים של נזק לכבד כתוצאה מכבד שומני מופחתת זרימת הדם בתוך הכבד‪,‬‬
‫תופעה היכולה לגרום לירידה באספקת החמצן לאזורים שונים בכבד ובכך לתרום לנזק בכבד )‪.(43‬‬
‫בריכוזים נמוכים מהווה ‪ NO‬גורם הכרחי להישרדות התא ) ‪ (25‬ומשמשת מולקולת איתות לתהליכים תוך‬
‫תאיים כגון מטבוליזם של שומנים ) ‪ ,(44‬וויסות פעילות המיטוכונדריה ) ‪ .(45‬בריכוזים גבוהים יותר‬
‫יכולה ‪ NO‬להשרות תהליכים של מוות תאי מסוג אפופטוזיס ו‪/‬או נקרוזיס )‪ .(46‬לכן‪ ,‬כל הפרעה באיזון‬
‫רמות ה‪ NO-‬התוך תאיות יכולה להוביל לפגיעה בפעילות התקינה של תאי הכבד ואף למוות‪.‬‬
‫מעורבות ‪ NO‬בבקרת מטבוליזם של שומנים‬
‫‪ NO‬מעורב גם בבקרת מטבוליזם של שומנים בתא‪ .‬כאשר התאים נחשפים ל‪ NO-‬באופן פארקריני או‬
‫אוטוקריני משופרת זרימת הדם‪ .‬כתוצאה מהשיפור בזרימת הדם מגיעה כמות גדולה יותר של חמצן אל‬
‫התא ומתאפשר ניצול טוב יותר של סובסטרטים לאנרגיה‪ .‬בנוסף משפיע ‪ NO‬גם ישירות בתוך התא‪ ,‬שם‬
‫הוא מעלה את כניסת הסובסטרטים ליצור אנרגיה למיטוכונדריה ומגביר את קצב החמצון שלהם )‪.(47‬‬
‫בניסוי שנערך בחולדות אשר הוזנו במעכב של סינתזת ‪ NO‬חלה ירידה בחמצון חומצות שומן בכבד‬
‫)‪.(48‬‬
‫עקה חימצונית )‪(Oxidative stress‬‬
‫יצירת רדיקלים חופשיים היא תהליך טבעי בחיי אורגניזמים אירוביים‪ .‬בנוסף לכך ישנם מקורות חיצוניים‬
‫של רדיקלים חופשיים כגון חום‪ ,‬קרינה מייננת‪ ,‬עישון‪ ,‬מזהמי סביבה ותרופות מסוימות )‪ .(49‬רדיקלים‬
‫חופשיים הם אטומים או מולקולות בעלות אלקטרון אחד או מספר אלקטרונים בלתי מזווגים במבנה‬
‫האטומי שלהם ההופכים עקב כך לאטום או למולקולה ריאקטיבים )‪ .(50‬רוב החמצן שנצרך במטבוליזם‬
‫האנרגיה במיטוכונדריה מתחבר למימן תוך יצירת מים‪ .‬אולם‪ ,‬כ‪ 2-5%-‬מהחמצן המתחזר בשרשרת‬
‫העברת האלקטרונים במיטוכונדריה הופך לנגזרות חמצן פעילות כגון סופראוקסיד )‪ ,(O2·-‬מי חמצן‬
‫)‪ (H2O2‬והידרוקסיל רדיקל )·‪ .(51) (HO‬למרות שישנן מערכות הגנה אנטיאוקסידנטיות בגוף‪ ,‬לעיתים‬
‫‪18‬‬
‫הגנתן אינה מספקת ונוצר חוסר שיווי משקל בין הגורמים המחמצנים לבין הגורמים המגנים בפני חמצון‪.‬‬
‫מצב זה מוגדר כמצב של "עקה חמצונית" ) ‪.(49‬‬
‫רדיקלים חופשיים עלולים להגיב עם מרכיבי התא השונים ולפגוע בתפקודו התקין של התא‪ .‬פגיעה של‬
‫רדיקלים חופשיים בחומצות אמינו שונות עלולה להביא לשינוי במבנה אנזימים ולפגיעה בפעילות‬
‫האנזימתית )‪ HO· .(52‬יכול לגרום לקשרים בין חלבונים שונים ולהרוס קשרים בין חומצות אמינו‪ ,‬דבר‬
‫המוביל לפרגמנטציה של מאקרו מולקולות )‪ .(53‬חומצות הגרעין מהוות מטרה לתקיפת רדיקלים‬
‫חופשיים‪ ,‬הגורמים לשבירה של גדילי ה‪ DNA-‬או לשינויים בבסיסיו המובילים להיווצרות מוטציות‬
‫)‪ .(54‬גם חומצות שומן לא רוויות רגישות מאוד להתקפת רדיקלים חופשיים ופגיעה בהן גורמת לתגובת‬
‫שרשרת שבסופה נוצרים ליפידים פראוקסידים‪ .‬תרכובות אלו הן אבני בניין למולקולות שונות הרעילות‬
‫מאוד לתא )‪ .(55‬כל התהליכים שתוארו מובילים לשינויים במבנה הביולוגי של התא‪ ,‬משפיעים על‬
‫תפקודו ואף עלולים להביא למות התא ) ‪.(56‬‬
‫‪ ROS‬ותהליכי נזק חמצוני‬
‫החמצן הכרחי לחיים וכל האורגניזמים האירוביים צורכים חמצן לשם יצירת אנרגיה הדרושה לתפקודם‪.‬‬
‫רדיקלים חופשיים נוצרים כל הזמן בתוך התאים כחלק מהמטבוליזם הרגיל‪ .‬בתהליך של פוספורילציה‬
‫אוקסידטיבית‪ ,‬בו מחומצנים סוכרים וחומצות שומן‪ ,‬נוצרים רדיקלים בכמויות גדולות‪ .‬תהליך זה מתרחש‬
‫תוך מעבר אלקטרונים בשרשרת נשאי אלקטרונים ומקבל האלקטרונים הסופי הוא חמצן‪ .‬האנרגיה‬
‫הנוצרת בתהליך זה נאגרת במולקולת ‪ ATP‬שפירוקה הוא מקור האנרגיה הנחוצה לכל פעילויות הגוף‪.‬‬
‫באופן פרדוקסאלי‪ ,‬חמצן הוא המקור לנגזרות חמצן פעילות )‪ (ROS‬או לרדיקלים חופשיים ) ‪.(57‬‬
‫הרדיקלים נוצרים גם כמולקולות ביניים בריאקציות אנזימטיות ובתאי דם לבנים‪ ,‬כמו נויטרופילים‬
‫ומקרופאגים‪ ,‬היוצרים נגזרות חמצן פעילות לצורך לוחמה נגד פתוגנים פולשנים‪ .‬יצירת רדיקלים‬
‫חופשיים היא גם חלק בלתי נפרד מהתהליך הדלקתי ) ‪ .(58‬קיימים גם מקורות חיצוניים ליצירת רדיקלים‬
‫חופשיים כמו‪ :‬זיהום אוויר‪ ,‬חשיפה לסוגים שונים של קרינה )כולל קרינת שמש(‪ ,‬חומרי הדברה‪ ,‬סיגריות‬
‫ושתייה מופרזת של אלכוהול‪.‬‬
‫‪19‬‬
‫בגוף מצויה כמות מסוימת של אוקסידנטים ואנטי‪-‬אוקסידנטים‪ .‬במצבי של עקה חמצונית ישנו חוסר איזון‬
‫ועליה בכמות האוקסידנטים‪ .‬במצב זה עלולים הרדיקלים החופשיים לתקוף מקרומולקולות כגון חלבונים‪,‬‬
‫שומנים וחומצות גרעין‪.‬‬
‫חומצות אמינו מסוימות )פרולין‪ ,‬היסטידין‪ ,‬ארגינין‪ ,‬ציסטאין ומתיונין( רגישות במיוחד לפעילות‬
‫החמצונית של הרדיקלים החופשיים‪ .‬תוצאות ההתקפה הן שינויים במבנה ובפעילות החלבונים‪ ,‬המביאים‬
‫לפירוקם או לתפקוד לקוי שלהם )‪ .(59,60‬רדיקלים חופשיים פוגעים גם בנוקליאוטידים של חומצות‬
‫הגרעין‪ .‬הם יכולים לגרום לשבירת סיבי ה‪ ,DNA-‬לשינויים בנוקליאוטידים ולהופעת מוטציות ) ‪.(61‬‬
‫נגזרות חמצן פעילות כשליחים משניים בתא‬
‫בתנאים של עקה חמצונית‪ ,‬יכולות נגזרות חמצן פעילות לפגוע באופן ישיר בחלבונים‪ ,‬ליפידים וחומצות‬
‫גרעין‪ .‬אף על פי כן‪ ,‬בשנים האחרונות הצטבר מידע רב על כך ש‪) ROS-‬בעיקר מי חמצן( ושינויים במצב‬
‫החמצון‪-‬חיזור בתא )‪ (redox-state‬משמשים כשליחים משניים בתא‪ .‬לדוגמא‪ ROS ,‬יכולים להוביל‬
‫לעליה בפעילות פרוטאזות‪ ,‬נוקלאזות ופוספוליפאזות באופן עקיף על ידי כך השריית שחרור יוני סידן‬
‫מהמיטוכונדריה )‪ .(62‬מעבר לכך נמצא כי ‪ ROS‬ו‪ redox-state-‬משפיעים על פעילות קינאזות טירוזין‬
‫וקינאזות סרין‪/‬תראונין‪ ,‬על התמיינות תאי עצב ‪ ,in-vitro‬ועל הפעלה של גורמי שעתוק שונים )‪.(63-65‬‬
‫למרות ש‪ ROS -‬יכולים להזיק למרכיבי התא באופן ישיר‪ ,‬התפקיד הפיסיולוגי שלהם כשליחים משניים‬
‫עדיין לא ברור‪.‬‬
‫שני גורמי שעתוק שידועים כרגישים למצב החמצוני של התא הם ‪(NFκB) nuclear factor κappa B‬‬
‫ו‪.(66) (AP-1) activator protein 1 -‬‬
‫‪Nuclear Factor κappa B‬‬
‫גורמי השעתוק במשפחת ‪ ,NFκB‬המכונה גם ‪ ,Rel family‬מתבטאים בכל תאי היונקים‪ ,‬ומכילים רצפים‬
‫שמורים באורגניזמים שונים‪ .‬ביונקים‪ ,‬מוכרים חמישה חלבונים השייכים למשפחה זו‪p65 ,p52 ,p50 :‬‬
‫)מוכר גם כ‪ c-Rel ,(RelA -‬ו‪ .RelB-‬החלבונים פעילים כדימרים וכל חמשת החלבונים יכולים להיקשר‬
‫ליצירת הומודימרים או הטרודימרים‪ .‬בכל החלבונים נמצא האזור ההומולוגי ‪ ,Rel‬המכיל אתרים חשובים‬
‫לקשירת ה‪ ,DNA-‬לדימריזציה‪ ,‬להכוונה לגרעין ולקישור עם חלבונים מעכבים ממשפחת ‪inhibitory‬‬
‫‪20‬‬
‫‪ ,(IκB) κappa B‬ביניהם ‪ ,IκBb ,IκBα‬ו‪ .IκBε-‬כאשר ‪ NFκB‬אינו פעיל‪ ,‬הדימר ממוקם בציטוזול‬
‫קשור ל‪ .IκB-‬חומרים המשרים פעילות של ‪ NFκB‬משפעלים את קומפלקס החלבונים ‪IκB kinase‬‬
‫‪ ,complex‬שמזרחן את ‪ ,IκBα .IκB‬לדוגמא‪ ,‬עובר זרחון בשני שיירי סרין בעמדות ‪ 32‬ו‪ .36-‬לאחר‬
‫זרחונו עובר ‪ IκB‬יוביקוויטינציה ופירוק‪ ,‬וכך נחשף רצף החלבון שמוביל את ‪ NFκB‬לגרעין )‪(NLS‬‬
‫‪ ,nuclear localization sequence‬וכן אתר הקישור ל‪ .DNA-‬הפעלה של ‪ NFκB‬מובילה לביטוי‬
‫מספר רב של גנים ביניהם ציטוקינים וחלבונים שחלקם מתווכים תהליכי מוות תאי וחלקם מהווים חלק‬
‫ממסלול ההישרדות של התא‪ .‬חלבון נוסף המבוקר ע"י ‪ NFκB‬הוא ‪ ,IκBα‬הנקשר לאחר ביטויו ל‪-‬‬
‫‪ ,NFκB‬מוביל אותו לציטוזול ובכך מפסיק את פעילותו ) ‪ .(67‬ידועים גורמים רבים המשרים פעילות של‬
‫‪ ,NFκB‬ביניהם ציטוקינים וליפופוליסכרידים מחיידקים )‪ .(LPS‬מגוון רב של חיידקים ווירוסים יכולים‬
‫להוביל להפעלת ‪ .NFκB‬בנוסף לפעילותו האנטי‪-‬דלקתית הקשורה למערכת החיסון נמצא כי ‪NFκB‬‬
‫משופעל במצבי עקה שונים כגון חשיפה לקרינת אור אולטרא‪-‬סגול‪ ,‬עקה חמצונית )מי חמצן‪ ,‬אוזון(‪ ,‬וכן‬
‫מופעל על ידי הורמונים וגורמי גדילה )‪.(68‬‬
‫‪(AP-1) Activator Protein 1‬‬
‫פעילות ‪ AP-1‬מקושרת לתהליכים שונים בתאים‪ ,‬כגון טרנספורמציה והתמיינות ובקרה על מות ה תא‪.‬‬
‫קשירה של דימר לאתר הקשירה של ‪ AP-1‬על גבי ה‪ DNA-‬היא שלב ראשון בהפעלתו‪ .‬הדימר יכול‬
‫להקשר גם לאתר הקשירה של ‪ ,(12-O-tetradecanoylphorbol 13 acetate) TPA‬המכונה ‪TRE‬‬
‫)‪ .(TPA-responsive-element‬הדימר מורכב משני חלבונים השייכים למשפחת ‪ Jun‬או מחלבון‬
‫ממשפחת ‪ Jun‬הקשור לחלבון ממשפחת ‪ .Fos‬משפחת ‪ Jun‬מכילה מספר חלבונים‪JunB ,vJun ,cJun :‬‬
‫ו‪ JunD-‬ואילו במשפחת ‪ Fos‬נכללים ‪ (Fos related protein 1) Fra-1 ,FosB ,vFos ,cFos‬ו‪Fos -‬‬
‫‪ .(related protein 2) Fra-2‬ל‪ mRNA-‬של חלבוני ‪ Fos‬זמן מחצית חיים קצר יותר מאשר ל‪mRNA-‬‬
‫של חלבוני ‪ .Jun‬לכן‪ ,‬ללא אינדוקציה מורכבים מרבית הקומפלקסים של ‪ AP-1‬מהומודימר או הטרודימר‬
‫של חלבונים ממשפחת ‪ .Jun‬לאחר אינדוקציה מבוטאים חלבוני ‪ Fos‬ונקשרים לחלבוני ‪ ,Jun‬כך שמרבית‬
‫הקומפלקסים מורכבים מהטרודימר של ‪ Fos‬עם ‪ ,Jun‬שהם יציבים יותר ובעלי אפיניות טובה יותר ל‪-‬‬
‫‪ .DNA‬ההטרודימר הנפוץ ביותר הוא ‪ .cJun-cFos‬לפיכך‪ ,‬בניגוד ל‪ ,NFκB -‬פעילות ‪ AP-1‬במצב של‬
‫עקה תלויה גם בביטוי חלבונים ולא רק בזרחונם‪ .‬לקינאזות )‪,cJun NH2 terminal kinase (JNK‬‬
‫‪21‬‬
‫השייכות למשפחת הקינאזות )‪ ,mitogen-activated protein kinase (MAPK‬תפקיד חשוב בהפעלת‬
‫‪ .AP-1‬היות וקינאזות אלו מעורבות בביטוי ‪ cFos‬ובזרחון שני סרינים ב‪ ,cJun-‬הדרוש על מנת‬
‫שהקומפלקס יהיה פעיל‪ .‬פעילות ‪ AP-1‬מושרית ע"י גורמי גדילה‪ ,‬ציטוקינים‪ ,‬נוירוטרנסמיטורים ומצבי‬
‫עקה שונים אחרים ) ‪.(66,69‬‬
‫מיטוכונדריה ונגזרות חמצן פעילות‬
‫המיטוכונדריה ה ינה אברון בעל ממברנה כפולה בתא האאוקריוטי‪ .‬באופן ייחודי ליונקים מכילה‬
‫המיטוכונדריה גנום עצמאי‪ .‬הדעה הרווחת היא שמקור המיטוכונדריה מחיידקים אירוביים אשר התיישבו‬
‫בתוך תא מארח ויצרו אתו יחסים סימביוטיים )‪ .(70‬בתהליך הזרחון החמצוני )פוספורילציה‬
‫אוקסידטיבית( מייצרת המיטוכונדריה את מרבית האנרגיה בתא בצורת ‪ ,ATP‬כאשר מקבל האלקטרונים‬
‫הסופי הוא חמצן‪ .‬התהליך מתרחש על גבי הממברנה הפנימית של המיטוכונדריון‪ ,‬המכילה את מרכיבי‬
‫מערכת שרשרת הולכת האלקטרונים )‪ (electron transport chain‬ואת הקומפלקס האנזימתי שאחראי‬
‫לסינטזת ‪ .(75,73 71,72) ATP‬היות ו‪ 0.4-4%-‬מהחמצן המולקולרי הנצרך על ידי המיטוכונדריון‬
‫מחוזר חלקית ליצירת רדיקלי סופראוקסיד )‪ ,(O2·-‬תהליך הנשימה התאי מהווה גם מקור לנגזרות חמצן‬
‫פעילות‪ .‬נגזרות אלה יכולות להגביר שחרור יוני סידן מהמיטוכונדריה וכך לעודד פעילות פרוטאזות‪,‬‬
‫נוקלאזות ופוספוליפאזות‪ ,‬העלולות להוביל לפגיעה ב‪ DNA-‬המיטוכונדריאלי‪ .‬נגזרות חמצן פעילות‬
‫יכולות גם לפגוע ישירות ב‪ DNA-‬המיטוכונדריאלי‪ ,‬היות והוא כמעט ואינו מוגן ע"י חלבונים‪ .‬מוטציות‬
‫ב‪ DNA-‬המיטוכונדריאלי הכוללות בין היתר החלפת בסיס ומוטציות חסר‪ ,‬קשורות להתפתחות מחלות‬
‫רבות ) ‪.(77 62,72,74‬‬
‫שומן והמיטוכונדריה‬
‫כפי שכבר צוין המיטוכונדריה היא מקור עיקרי ליצירת נגזרות חמצן פעילות בתא‪ .‬כמות משמעותית של‬
‫נגזרות חמצן פעילות מיוצרת בכבד במהלך נשימה מיטוכונדריאלית תקינה‪ .‬במצבים של השמנת יתר‬
‫וסינדרום מטבולי ישנה זרימה מוגברת של חומצות שומן חופשיות לתאים‪ .‬אספקה מוגברת זו של חומצות‬
‫שומן מספקת עודף סוסבסטרט ליצור אנרגיה במיטוכונדריה‪ .‬כתוצאה מהנשימה המוגברת‪ ,‬תעלה יצירה‬
‫של נגזרות חמצן פעילות במיטוכונדריה‪ ,‬יגבר המתח החמצוני בכבד‪ ,‬ועלולה להיפגע יעילות סינטזת ה‪-‬‬
‫‪22‬‬
‫‪ .(1) ATP‬במצב של ‪ NAFLD‬נמצא כי ישנו נזק למיטוכונדריה )‪ .(1‬נזק זה יכול להתבטא בצורות‬
‫שונות‪ ,‬ביניהן‪ :‬פגיעה בפעילות המיטוכונדריה‪ ,‬דליפה מהמיטוכונדריה‪ ,‬קריעה של מיט וכונדריות‪ ,‬ואיחוד‬
‫מיטוכונדריות‪ .‬כל התופעות הללו תוארו במצב של מחלות כבד‪ ,‬אך זהות הגורם האחראי לנזק נשארה‬
‫שנויה במחלוקת‪ .‬נזק למיטוכונדריה יכול להיווצר כתוצאה מעליה ברמת ‪ TNF‬בדם‪ ,‬תופעה נלווית של‬
‫ההשמנה ) ‪.(1,16‬‬
‫שומן ונגזרות חמצן פעילות‬
‫חשיפה לשומן מעלה יצור נגזרות חמצן פעילות בתרביות תאי אנדותל )‪ ,(75‬בדם )‪ (76‬בלבלב )‪(77‬‬
‫ונצפתה גם בכבד שומני‪ .‬נגזרות חמצן אלו יכולות לגרום לשני סוגי מוות תאי המוכרים כאפופטוזיס‬
‫)המוגדר במקרים אלו לעיתים כליפו‪-‬אפופטוזיס( ונקרוזיס )‪ .(78‬לפיכך יכולות נגזרות חמצן פעילות‬
‫להוות גורם משמעותי במו ת תאי כבד במקרה של כבד שומני‪ .‬רב הנסתר על הגלוי בכל הנוגע להשפעות‬
‫שומן על הכבד ולהפעלה ועיכוב של תהליכים‪ .‬האטיולוגיה של הצטברות שומן בכבד כתוצאה מהזנה תוך‬
‫ורידית אינה מובנת עד תומה‪ ,‬אך מחקרים מציעים תפקיד מרכזי לנגזרות חמצן פעילות )‪ .(13‬הגורל של‬
‫נגזרות החמצן הפעילות נקבע על ידי פעילות האנטיאוקסידנטים ובמיוחד גלוטטיון‪ .‬במחלות כבד‪ ,‬ירידה‬
‫ברמות הגלוטטיון נחשבת לגורם אשר משאיר את תאי הכבד חשופים לנזק חמצוני הנגרם כתוצאה מרמות‬
‫גבוהות של נגזרות חמצן פעילות )‪.(79‬‬
‫המאזן האנרגטי בתא‬
‫המאזן האנרגטי בתא מווסת בין היתר על ידי )‪ ,AMP-activated protein kinase (AMPK‬שזרחונו‬
‫מתרחש כאשר ישנה ירידה ברמות ה‪ ATP-‬בתא‪ .‬כאשר ‪ AMPK‬מזורחן הוא פועל להעלאת יצור ‪ATP‬‬
‫בתא וכך פועל למעשה כסנסור אנרגטי‪ .‬לחלבון זה מיוחסת גם השפעה על ביוסינתזה של מיטוכונדריות‬
‫)‪.(80‬‬
‫‪23‬‬
‫אנטיאוקסידנטים ומערך ההגנה האנטיאוקסידנטי בתא‬
‫רדיקלים של חמצן חיוניים לפעילות התא ופועלים כמולקולות איתות‪ .‬במהלך האבולוציה פיתחו‬
‫אורגניזמים אירוביים מערכת אנטיאוקסידנטית מתוחכמת לשם התמודדות עם עודף רדיקלים חופשיים‬
‫וגורמים מחמצנים נוספים )‪ .(81‬אנטיאוקסידנט הנו כל חומר אשר מונע או מעכב נזק חמצוני למולקולות‪.‬‬
‫מנגנוני הגנה אפשריים של האנטיאוקסידנטים כוללים‪:‬‬
‫‪ .1‬מניעת היווצרות רדיקלים חופשיים‪.‬‬
‫‪ .2‬עיכוב פעילות הרדיקלים על‪-‬ידי נטרול המטבוליטים הפעילים והפיכתם לפחות ריאקטיבים ו‪/‬או על‪-‬‬
‫ידי חיזוק העמידות של מערכות ביולוגיות הרגישות להתקפת רדיקלים‪.‬‬
‫‪ .3‬מניעת הפיכה של רדיקלים פחות פעילים )כגון ‪ H2O2‬ו‪ (O2--‬לצורות מזיקות יותר )כמו ·‪.(HO‬‬
‫‪ .4‬זירוז תיקוני נזק הנגרם על ידי נגזרות חמצן פעילות ועידוד התבטאות גנים המקודדים לאנזימים‬
‫אנטיאוקסידנטים‪.‬‬
‫‪ .5‬אספקת סביבה טובה לפעילות יעילה של אנטיאוקסידנטים אחרים‪.‬‬
‫מערכת אנטיאוקסידנטית אנדוגנית נמצאת בתוך התא )בציטוזול ובמיטוכונדריה( וגם בסביבה החוץ‬
‫תאית‪ .‬מערכת זו כוללת אנזימים אנטיאוקסידנטים )כגון קטלאז‪,superoxide dismutase (SOD) ,‬‬
‫וגלוטטיון פראוקסידאז(‪ ,‬חלבונים קושרי מתכות ואנטיאוקסידנטים אחרים )‪.(82‬‬
‫‪ SOD‬אחראי להפיכת שתי מולקולות של סופראוקסיד )‪ (O2-‬למולקולת ‪ .H2O2‬ישנם שני איזופורמים‬
‫שונים בעלי תכונות קינטיות זהות הרלוונטיים בתאים אאוקריוטים‪ .‬האחד מכיל מנגן באתר הפעיל ומצוי‬
‫בעיקר במיטוכונדריה של תאים פרוקריוטים ואאוקריוטים )‪ ,(MnSOD‬והשני מכיל נחושת ואבץ באתר‬
‫הפעיל ומצוי בציטוזול של תאים אאוקריוטים )‪.(CuZnSOD‬‬
‫‪ H2O2‬מסולק על‪-‬ידי האנזימים גלוטטיון פראוקסידאז או קטלאז‪ .‬קטלאז נמצא בפראוקסיזומים של רוב‬
‫תאי היונקים ומשמש‪ ,‬ככל הנראה‪ ,‬לפרוק ‪ H2O2‬המיוצרים על‪-‬ידי אוקסידאזות בתוך האברון ) ‪.(83‬‬
‫גלוטטיון פראוקסידאז נחשב לאנזים עיקרי המפרק ‪ ,H2O2‬שנוצרים על ידי ‪ SOD‬בציטוזול‬
‫ובמיטוכונדריה בתאי יונקים‪ .‬תוך כדי חיזור של ‪ ,H2O2‬חל חמצון של גלוטטיון מחוזר ‪) GSH‬המשמש‬
‫כסובסטרט לאנזים( לגלוטטיון דיסולפיד ‪ .(83) GSSG‬חיזור של ‪ GSSG‬ל‪ GSH-‬מתבצע תוך חמצון‬
‫‪ NADPH‬על ידי האנזים גלוטטיון רדוקטאז‪.‬‬
‫‪24‬‬
‫האנטיאוקסידנטים האנדוגנים הם בעלי חשיבות גדולה מאוד בשמירה על מאזן חמצון חיזור בתוך התא‬
‫ולפיכך יכולים גם לשמש חיישן למאזן זה‪ .‬גלוטטיון בנוי משלוש חומצות אמינו ‪ -‬גלוטמט‪ ,‬ציסטאין‬
‫וגליצין ‪ -‬ומכיל קשר פפטידי בין קבוצת האמין של הציסטאין לבין קבוצת הקרבוקסיל שעל שרשרת הצד‬
‫של הגלוטמט‪ .‬הגלוטטיון יכול להימצא במצב מחוזר‪ ,GSH ,‬שבו קבוצת התיול )‪ (SH‬יכולה להגיב עם‬
‫רעלנים כדוגמת רדיקלים חופשיים ולנטרל אותם על ידי העברת אלקטרון‪ .‬עם מסירת האלקטרון עובר‬
‫הגלוטטיון למצב מחומצן‪ ,GSSG ,‬בו שתי מולקולות נקשרות זו לזו בקשר דיסולפידי‪ .‬האנזים גלוטטיון‬
‫רדוקטאז אחראי על חיזור גלוטטיון ממצבו המחומצן חזרה ל‪ ,GSH-‬שהוא המצב בו נמצא הגלוטטיון רוב‬
‫הזמן‪ .‬במצב פיזיולוגי תקין )כשאין הרעלה( ריכוז הגלוטטיון המחוזר הינו ‪ 1-10‬מילימולר בתאים של‬
‫בעלי חיים )‪.(83‬‬
‫קיימות גם קבוצות אנזימים אחרות‪ ,‬הדואגות להסרת הנזקים החמצונים שנגרמו ל‪ .DNA-‬כמו כן‪ ,‬ישנן‬
‫מערכות הדואגות לתיקון נזק חימצוני של חומצות השומן‪.‬‬
‫קו הגנה נוסף הינו מערכת אנטיאוקסידנטית לא אנזימתית‪ ,‬הכוללת בין השאר גלוטטיון ותיולים בתוך‬
‫התא‪ ,‬ונתמכת על‪-‬ידי אנטיאוקסידנטים אקסוגנים הניתנים במזון כתוספות תזונתיות‪ .‬הויטמינים ‪ C ,E‬ו‪-‬‬
‫‪ β‬קרוטן‪ ,‬נמצאו כבעלי תכונות מגוונות וחשובות בנטרול רדיקלים חופשיים‪ .‬אנטיאוקסידנטים אלו מגנים‬
‫על התאים על‪-‬ידי ניטרול ו‪/‬או קשירת הרדיקלים ובכך נחסמת התקדמות שרשרת החמצון )‪ .(84‬באופן‬
‫זה מנטרלים אנטיאוקסידנטים את הרדיקלים החופשיים ומונעים נזק תאי‪ .‬ויטמין ‪ ,E‬המסיס בשומן‪ ,‬חודר‬
‫לקרומי התא ומפסיק את שרשרת החמצון בחומצות השומן על ידי החזרת האלקטרונים‪ .‬גם קרטנואידים‪,‬‬
‫כמו בטא קרוטן‪ ,‬מסיסים בקרומים ביולוגיים ושומרים עליהם מפני חמצון‪ .‬ויטמין ‪ ,C‬המסיס במים‪ ,‬פועל‬
‫לנטרול רדיקלים חמצניים בעיקר בסביבה מימית )‪.(85‬‬
‫רסברטרול‬
‫רסברטרול )‪ (3,5,4-trihydroxystilbene‬הנו פוליפנול בעל מבנה סטילבן ‪ .C6C2C6‬כסטילבן‪ ,‬שייך‬
‫הרסברטרול למשפחת הפיטואלקסנים‪ ,‬המסונתזים על‪-‬ידי הצמח בתגובה לעקות שונות וחשובים במנגנון‬
‫ההגנה בפני התקפות פתוגניות‪ .‬רסברטרול מסונתז על‪-‬ידי האנזים האינדוקטיבי סטילבן‪-‬סינטאז בעקבות‬
‫פציעה‪ ,‬זיהום‪ ,‬התקפה פתוגנית‪ ,‬חשיפה לאוזון או לקרינת ‪ .UV‬בנוסף‪ ,‬הוא נמצא כנוגד חמצון יעיל‬
‫במניעת חמצון ליפידים ) ‪ .(86‬מנגנון הפעולה של רסברטרול אינו ברור לחלוטין‪ .‬ברוב המחקרים נמצא‬
‫‪25‬‬
‫כי פעילותו האנטיאוקסידנטית של רסברטרול מתבטאת יותר ביצירת קומפלקסים עם מתכות מחמצנות‬
‫ופחות ביכולתו ללכוד רדיקלים חופשיים ) ‪ .(87,88‬עם זאת‪ ,‬קיימים ממצאים המראים כי רסברטרול‬
‫פועל טוב יותר כלוכד רדיקלים ואינו יוצר קומפלקס עם יוני ברזל )‪ .(89‬יתרה מזאת‪ ,‬ישנם מחקרים‬
‫המראים כי בתנאים מסוימים מתפקד הרסברטרול כפרואוקסידנט על ידי חיזור יוני ברזל ויצירת רדיקלים‬
‫של הידרוקסיל‪ ,‬הגורמים לפרגמנטציה של ה‪ .(90) DNA-‬בנוסף לפעילות אנטיאוקסידנטית שיוחסה‬
‫לרסברטרול‪ ,‬נמצא כי הוא משפיע על יצירה ושחרור של ‪ ,NO‬וכך גורם להרחבת כלי הדם‪ .‬פעילות זו‬
‫מהווה מנגנון הגנה מפני מחלות לב ודם )‪ .(91‬פעילות אנטי‪-‬דלקתית של רסברטרול מתבטאת ביכולתו‬
‫לעכב את האנזימים ‪ lypooxygenase ,cyclooxygenase 1/2‬ו‪ hydroperoxidase -‬המעורבים‬
‫בתהליכים דלקתיים ) ‪.(92‬‬
‫‪(NAC) N-acetylcysteine‬‬
‫‪ NAC‬הנו תיול המשמש פרקורסור לחומצה האמינית ‪ L-cysteine‬ולגלוטטיון מחוזר‪ .‬בנוסף לכך‪ ,‬ל‪-‬‬
‫‪ NAC‬פעילות אנטיאוקסידנטית בלכידת רדיקלים חופשיים כגון מי חמצן והידרוקסיל רדיקל )‪ .(93‬בשל‬
‫תכונה זו‪ ,‬הוצע ‪ NAC‬לשימוש בטיפול במספר מחלות כגון מחלות קרדיווסקולריות‪ ,‬סרטן‪AIDS ,‬‬
‫ומחלות כבד )‪ .(94‬היות ו‪ NAC-‬משמש כפרוקורסור לגלוטטיון מחוזר‪ ,‬הוא מעלה את רמות התיולים‬
‫בתא ובכך יכול לגרום לעליה ברמות ‪ mRNA‬של האנזים ‪ .(95) NOS‬במערכת הנשימה יכול ‪NAC‬‬
‫להועיל במניעת דלקות ובדחיית שתלים )‪ .(96‬ניסויים שנערכו ‪ in vivo‬ו‪ in vitro-‬הראו כי ‪ NAC‬מנע‬
‫אקטיבציה של גורם השעתוק ‪ .NFκB‬עם זאת‪ ,‬פעילתו של ‪ NAC‬והשפעתו על ‪ NFκB‬משתנה בין‬
‫רקמות שונות ובין סוגי תאים שונים ) ‪.(97‬‬
‫ויטמין ‪C‬‬
‫העניין העיקרי בויטמין ‪ C‬מתמקד ביכולתו לתפקד כאנטי אוקסידנט )‪ .(98‬למעשה‪ ,‬הוא נחשב‬
‫כאנטיאוקסידנט החשוב ביותר בנוזלים הבין תאיים וכן כבעל תפקידים רבים כאנטיאוקסידנט תוך תאי‬
‫)‪ . (99‬בנוסף לתפקידו כאנטיאוקסידנט משמש ויטמין ‪ C‬בתהליכים רבים אחרים‪ .‬ויטמין ‪ C‬ממלא תפקיד‬
‫מפתח ביצירת קולגן ‪ -‬החלק העיקרי במרבית רקמות החיבור בגוף‪ .‬יצירת קולגן ברמה מספקת חיונית‬
‫ליצירת ליגמנטים )המחברים עצמות(‪ ,‬גידים‪ ,‬דנטין )מרכיב של השן(‪ ,‬עור‪ ,‬כלי דם ועצמות‪ ,‬וכן לריפוי‬
‫‪26‬‬
‫פצעים ואיחוי רקמות‪ .‬בנוסף‪ ,‬עוזר ויטמין ‪ C‬בספיגת ברזל אנאורגאני ובטיפול באנמיה ובמצבי דחק‬
‫)‪ .(98‬השפעתו של ויטמין ‪ C‬נחקרה גם במודל של כבד שומני בחולדות‪ .‬נמצא כי ויטמין ‪ C‬מנע את‬
‫התפתחות הנזק בכבד ולמרות הצטברות השומן לא הופיעו שינויים פתולוגים )‪.(100‬‬
‫הטיפול המקובל בכבד שומני‬
‫עדיין לא הוגדרה תרופת הבחירה שתמנע את התקדמות הדלקת והצלקת‪ ,‬ומציאתה מהווה אתגר לחוקרים‬
‫רבים‪ .‬היות ומנגנון המחלה מורכב משני שלבים‪ ,‬האחד הצטברות השומן והשני העקה החימצונית‪ ,‬הרי‬
‫שהתרופות הבאות בחשבון הן אלה המסוגלות לפתור את שתי הבעיות‪ ,‬היינו להפחית את הצטברות‬
‫חומצות השומן בכבד ולהקטין את הנזק החמצוני‪ .‬מחקרים ראשוניים שכללו טיפול באורסוליט‪ ,‬בטאין‪,‬‬
‫ויטמין ‪ E‬לבד או בשילוב עם ויטמין ‪ ,C‬תרופות המשמשות להורדת שומני הדם )כמו פיבראטים(‬
‫ותרופות המשמשות לטיפול בסוכרת )כמו מטפורמין(‪ ,‬הראו בחלקם שיפור מסוים‪ ,‬אך התבססו על מספר‬
‫קטן של חולים ולא תמיד כללו לקיחת ביופסיות כבד בתום הטיפול‪ .‬לכן הם אינם מספיקים על‪-‬מנת לצאת‬
‫בהמלצה טיפולית לכלל חולי ה‪ .NAFLD-‬כבד שומני הוא תופעה שטרם נחקרה די הצורך‪ .‬ידוע‬
‫ששינויים שומניים בכבד מתלווים להשמנה ולמחלות מסוימות‪ ,‬אך השמנה אינה הסיבה היחידה לשינויים‬
‫אלו ושכיחות השינויים השונים במבנה הכבד אינה ידועה )‪.(6‬‬
‫‪27‬‬
‫היפותזה‬
‫השערתנו הייתה‪ ,‬כי למערכת ‪ NO‬ולמאזן חמצון חיזור בתאי הכבד תפקיד חשוב בהתפתחות‬
‫מחלת הכבד השומני וכי טריגליצרידים משפיעים באופן ישיר או עקיף על מערכות אלו‪.‬‬
‫מטרה כללית‬
‫לבדוק את ההשפעות המזיקות של חשיפת תאי כבד לטריגליצרידים המתווכות דרך מערכת ‪NO‬‬
‫ונגזרות חמצן פעילות‪.‬‬
‫מטרות ספציפיות‬
‫•‬
‫אפיון השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬בתרביות ראשוניות של תאי כבד‪.‬‬
‫•‬
‫בדיקת ההשפעה של טריגליצרידים על יצור נגזרות חמצן פעילות ותהליכי מוות תאי בשורת‬
‫תאים ממקור קרצינומה של כבד חולדה‪.‬‬
‫•‬
‫בחינת השפעות טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬ועל נזק חמצוני בכבד במודל חולדות המוזנות‬
‫תוך ורידית באמולסית שומן‪.‬‬
‫‪28‬‬
‫חומרים ושיטות‬
‫כימיקלים‬
ABgene, England:
Reverse-iT 1 st strand synthesis kit
Alexis, Nottingham, UK:
Calcein-AM
Amersham pharmacia biotech, England:
Acrylamide solution, TEMED, nitrocellulose membrane, ECL, DTT.
BDH, England:
dimethylsulfoxide (DMSO).
Bio Lab LTD, England:
Bradford reagent- Bio Rad protein assay, Formaldehyde buffered 4%, Broad range
precision protein standards.
Biological industries, Beit Ha Emek, ISRAEL:
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), L-Glutamine in saline solution
Penicillin-Streptomycin,
Roswell
Park
Memorial
Institute
(RPMI)
medium,
Trypsin/EDTA.
Braun, Germany:
Lipofundin, soybean oil TG-based lipid emulsion
Boehringer Biochemical Mannheim, Germany:
30|% Acrylamid-Bis acryl amid, Proteinase inhibitor cocktail tablets.
Cayman USA:
Etomoxir
Chem Service USA:
Paraoxon.
29
Frutarom Chemicals LTD, Haifa, Israel:
KCl, NaOH, KOH, Methanol, NaCl.
Fuji Film, Japan:
Fuji medical x-ray film.
Gibco, USA:
Agarose, DMEM medium, FCS, penicillin, streptomycin, glutamine, trypsin-EDTA,
lipofectamine reagent, Escherichia coli DH5-α compotent cells, OptiMEM.
Hy Laboratories, Israel:
Lambda DNA/Hind III Marker (for long-chain PCR)
JT Baker, USA:
Acetonitril, Tween-20.
Lyco Red, Israel:
Lycopene.
Merck, Germany:
Glycerol, KH2PO4, NaCl, DC-Plastikfolien 60 (Merck, layer thickness 0.2 mm)
Molecular probes USA:
H2DCF-DA
Promega, USA:
Nuclease free water, gel shift assay core system, luciferase reporter system
Caspase Assay System Colorimetric.
Takara Shuzo Biomedical Group, Japan:
Recombinant taq DNA polymerase, PCR Buffer x10, dNTP mixture for PCR
Sigma, Israel:
APS, Ascorbic acid, bradford reagent, Bromophenol Blue, BSA, butathione sulfoxime,
C17 fatty acid, chlorophorm, Diphenyleneiodonium chloride (DPI), ethidium bromide,
30
EDTA, Glutathione, Glycine, isopropanol, KH2PO4, L-glutamic acid monosodium salt,
Lipoic acid, 2-mercaptoethanol, N acetyl cysteine (NAC), NADH, naphthylenediamine
dihydrochloride, Na-Selenite, Nile red, Nitrate reductase, Oligomycin, Propidium
Iodide, PMSF, phosphoric acid, Quercetin, Resveratrol, Rotenone, SDS, Skim milk
powder, SNAP, sulfanilamide, TNF-α, Tris, triton x, tri- reagent, Tween 20, TEMED,
Tocopherol, Trypan Blue.
‫נוגדנים‬
Cell Signaling Technology, USA:
anti AMPK antibody, anti Β-actin antibody, anti Phospho-AMPK (THR 172) antibody.
MBL, Nagoya, Japan:
anti HMG-β1 antibody.
Jackson Immuno Research Laboratories, USA:
Peroxidase conjugated affinity pure goat anti- rabbit IGg antibody.
Santa Cruz Biotechnology, USA:
anti eNOS antibody, Anti c-JUN antibody, anti P65 antibody.
Transduction Laboratories, USA:
peroxidase conjugated affinity pure goat anti- mouse IGg antibody, anti iNOS antibody,
anti 4HNE antibody.
31
‫התחלים‬
Hy Laboratories, Israel:
eNOS- Rat
Forward: GAGCATACCCGCACTTCTGT
Reverse: GAAGATATCTCGGGCAGCAG
iNOS- Rat
Forward: CAGCACAGAGGGCTCAAAGG
Reverse: TCGTCGGCCAGCTCTTTCT
GAPDH- Rat
Forward: TCCTCCGCCCCTTCCGCTGAT
Reverse: CACGGAAGGCCATGCCAGTGA
32
‫תרביות תאים‬
‫תאי ‪FaO‬‬
‫תאי ‪ ,FaO‬שמקורם בכבד של חולדה‪ ,‬גודלו במדיום ‪ RPMI‬מועשר ב‪ 1% ,FCS 10% -‬גלוטמין ו‪1%-‬‬
‫פניצילין‪-‬סטרפטומיצין‪ .‬התאים הוחזקו בטמפרטורה של ‪ 37°C‬בסביבה לחה המכילה ‪ 95%‬אוויר ו‪5%-‬‬
‫‪ .CO2‬התאים נותקו ע" י טריפסין ‪ 2X‬ונזרעו לניסויים בצלחות של ‪ 6‬בארות בריכוז התחלתי של ‪50,000‬‬
‫תאים למ"ל בנפח של ‪ 3‬מ"ל‪ .‬ארבעים ושמונה שעות לאחר הזריעה הוחלף המדיום למדיום טרי והתאים‬
‫נחשפו לטיפולים השונים‪.‬‬
‫הפקת תאי כבד‬
‫חיות מזן ‪ wistar‬השוקלות ‪ 200-250‬גר' הורדמו על ידי הזרקה תוך בטנית של סודיום ברביטל‪ .‬החיות‬
‫חוטאו בעזרת אתנול ‪ 75%‬והונחו על משטח הניתוחים‪ .‬חלל הבטן ובית החזה נפתחו‪ venflon ,‬הוחדר‬
‫מתוך העלייה הימנית של הלב אל כיוון הכבד וקובע בתוך כלי הדם‪ .‬וריד השער נחתך ודרך הונפלון‬
‫הוזרם בופר ‪ (40°C) Hanks‬המכיל ‪ EGTA‬על מנת לשטוף את הכבד מדם‪ .‬לאחר שהכבד נוקה מדם‬
‫הוזרם דרכו בופר ‪ (40°C) Hanks‬המכיל את האנזים קולגנאז על מנת לעכל את רקמת החיבור‪ .‬לאחר‬
‫‪ 10‬דקות הוצא הכבד המעוכל והועבר דרך ממברנת ‪ 50 mesh‬מיקרון‪ .‬התסנין נשטף עם בופר ‪Hanks‬‬
‫)‪ (4 °C‬וסורכז ב‪ 60 *g -‬על מנת להיפטר מתאים שאינם תאי כבד‪ .‬לאחר מכן נספרו התאים וחיותם‬
‫נקבעה על ידי צביעה ב‪.Trypan blue-‬‬
‫תרביות תאים ראשוניות‬
‫לאחר הפקת תרביות התאים‪ ,‬הורחפו התאים במדיום ‪ DMEM‬מועשר ב‪ 1% ,FCS 10% -‬גלוטמין ו‪-‬‬
‫‪ 1%‬פניצילין‪ -‬סטרפטומיצין ונזרעו בריכוז של ‪ 750,000‬או ‪ 2,000,000‬תאים למ"ל בצלחת ‪ 6‬בארות‬
‫או צלחות פטרי בהתאמה‪ .‬לפני הזריעה צופו הצלחות בפיברונקטין והוחזקו בטמפרטורה של ‪37°C‬‬
‫בסביבה לחה המכילה ‪ 95%‬אוויר ו‪ .CO2 5%-‬ארבע שעות לאחר הזריעה הוחלף המדיום למדיום טרי‬
‫והתאים נחשפו לטיפולים השונים‪.‬‬
‫‪33‬‬
‫בדיקת חיות התאים‬
‫חיות התאים נבדקה על ידי שימוש בסמן הפלורוסנטי קלצאין )‪ .(calcein-AM‬קלצאין הופך לנגזרת‬
‫פלורוסנטי ת על ידי אנזימים בתא החי‪ .‬לאחר הטיפולים‪ ,‬התאים נותקו בעזרת טריפסין‪ ,‬סורכזו במהירות‬
‫‪ 1000*g‬למשך ‪ 5‬דקות‪ ,‬והורחפו ב‪ .PBS-‬לאחר מכן הודגרו התאים עם קלצאין בריכוז ‪ 5‬מיקרומולר‬
‫למשך ‪ 30‬דקות ב‪ .37°C-‬עוצמת הפלורוסנציה נמדדה באמצעות מכשיר ‪.(FACSort, BD) FACS‬‬
‫ערכי הפלורוסנציה‪ :‬עירור ב‪ ,488 nm-‬פליטה ב‪ .575 nm-‬בכל מדידה נבדקו ‪ 10,000‬תאים ) ‪.(101‬‬
‫צילום התאים החיים נעשה בדומה לבדיקה ב‪ .FACS -‬התאים בצלחת נשטפו והודגרו עם קלצאין בריכוז‬
‫‪ 5‬מיקרומולר ב‪ 37°C-‬למשך חצי שעה‪ .‬לאחר מכן צולמו התאים במיקרוסקופ פלואורסנטי ‪Nikon‬‬
‫‪ eclipse TS100‬המצויד בנורת כספית‪.‬‬
‫שלמות הממברנה התאית נבדקה על ידי שימוש בסמן הפלורוסנטי פרופידיום יודיד )‪ ,(PI‬שאינו חודר‬
‫ממברנות של תאים חיים‪ .‬לאחר הטיפולים‪ ,‬נותקו התאים בעזרת טריפסין‪ ,‬סורכזו במהירות ‪1000*g‬‬
‫למשך ‪ 5‬דקות‪ ,‬והורחפו ב‪ .PBS-‬לאחר מכן נצבעו התאים עם ‪ PI‬בריכוז ‪ 2‬מיקרוגרם למ"ל‪ .‬עוצמת‬
‫הפלורוסנציה נמדדה באמצעות מכשיר ‪ .(FACSort, BD) FACS‬ערכי הפלורוסנציה‪ :‬עירור ב‪488 -‬‬
‫‪ ,nm‬פליטה ב‪ .575 nm-‬בכל מדידה נבדקו ‪ 10,000‬תאים )‪.(101‬‬
‫שלמות הממברנה התאית נבדקה גם ע"י שימוש בסמן ‪ Trypan blue‬שאינו חודר ממברנות של תאים‬
‫חיים‪ .‬כאשר התא מת חודר הסמן לגרעין וצובע אותו בצבע כחול‪ .‬תרביות התאים הראשוניות נצבעו‬
‫ונספרו‪.‬‬
‫נגזרות חמצן פעילות‬
‫רמות נגזרות החמצן הפעילות בתאים נמדדו באמצעות הסמן הפלורוסנטי ‪ .H2DCF‬לאחר הטיפולים‬
‫השונים התאים נותקו מהצלחות‪ ,‬סורכזו במהירות ‪ 1000*g‬למשך ‪ 5‬דקות‪ ,‬והורחפו ב‪ .PBS-‬התאים‬
‫הודגרו עם ‪ H2DCF‬בריכוז ‪ 25‬מיקרומולר ב‪ 37°C-‬למשך חצי שעה והפלואורסנציה של התוצר‬
‫המחומצן נמדדה במכשיר ‪ .FACS‬ערכי הפלורוסנציה‪ :‬עירור ב‪ ,488 nm-‬פליטה ב‪ .530 nm-‬בכל‬
‫מדידה נבדקו ‪ 10,000‬תאים )‪(101‬‬
‫‪34‬‬
‫צילום התאים החיים נעשה בדומה לבדיקה ב‪ FACS -‬התאים בצלחת נשטפו והודגרו עם ‪H2DCF‬‬
‫בריכוז ‪ 25‬מיקרומולר ב‪ 37°C-‬למשך חצי שעה‪ .‬לאחר מכן התאים צולמו במיקרוסקופ פלורוסנטי )כפי‬
‫שצוין קודם לכן(‪.‬‬
‫רמות נגזרות החמצן הפעילות בתאים נמדדו באמצעות הסמן הפלורוסנטי ‪ .H2DCF‬לאחר הטיפולים‬
‫השונים הודגרו התאים עם ‪ H2DCF‬בריכוז ‪ 25‬מיקרומולר ב‪ 37°C-‬למשך חצי שעה‪ ,‬נשטפו עם ‪PBS‬‬
‫והוסף להם ‪ .PBS-Triton 0.2%‬הנוזל נאסף והפלואורסנציה של התוצר המחומצן נמדדה‬
‫בפלואורימטר‪.‬‬
‫מדידת כמות שומן בתאים‬
‫כמות השומן בתאים נמדדה על ידי ‪ FACS‬באמצעות הסמן הפלורוסנטי ‪ .Nile red‬לאחר הטיפולים‬
‫השונים התאים נותקו מהצלחות‪ ,‬סורכזו במהירות ‪ 1000*g‬למשך ‪ 5‬דקות‪ ,‬והורחפו ב‪ .PBS-‬התאים‬
‫הודגרו עם ‪ Nile red‬בריכוז ‪ 1‬מיקרוגרם למ"ל ב‪ 37°C-‬למשך חצי שעה והפלואורסנציה בתאים נמדדה‬
‫במכשיר ‪ .FACS‬ערכי הפלורוסנציה‪ :‬עירור ב‪ ,488 nm-‬פליטה ב‪ .530 nm-‬בכל מדידה נבדקו‬
‫‪ 10,000‬תאים‪.‬‬
‫צילום כמות השומן נעשה בדומה לבדיקה ב‪ .FACS-‬התאים בצלחת נשטפו והודגרו עם ‪ Nile red‬בריכוז‬
‫‪ 1‬מיקרוגרם למ"ל ב‪ 37°C-‬למשך חצי שעה‪ .‬לאחר מכן צולמו התאים במיקרוסקופ פלורוסנטי )כפי‬
‫שצוין קודם לכן(‪.‬‬
‫פרגמנטציה של ‪DNA‬‬
‫פרגמנטציה של ‪ DNA‬נבדקה על ידי שימוש בסמן הפלורוסנטי פרופידיום יודיד )‪ ,(PI‬הנקשר ל‪.DNA-‬‬
‫לאחר הטיפולים‪ ,‬התאים נותקו בעזרת טריפסין‪ ,‬סורכזו במהירות ‪ 1000*g‬למשך ‪ 5‬דקות‪ ,‬וקובעו ב‪-‬‬
‫‪ 1% (v/v) paraformaldehyde‬למשך ‪ 15‬דקות בקרח‪ .‬התאים הושקעו שוב על ידי סרכוזם ב‪-‬‬
‫‪ 5000 *g‬למשך ‪ 5‬דקות ונצבעו עם ‪ PI‬בריכוז ‪ 2‬מיקרוגרם למ"ל בבופר ציטראט‪ .‬עוצמת הפלורוסנציה‬
‫נמדדה באמצעות מכשיר ‪ .(FACSort, BD) FACS‬ערכי הפלורוסנציה‪ :‬עירור ב‪ ,488 nm-‬פליטה ב‪-‬‬
‫‪ .575 nm‬בכל מדידה נבדקו ‪ 10,000‬תאים )‪.(102‬‬
‫‪35‬‬
‫פעילות ‪caspase-3‬‬
‫פעילות האנזים ‪ caspase-3‬נבדקה בתאים באמצעות סובסטרט )‪ (Ac-DEVD-pNA‬המכיל סובסטרט‬
‫מסומן עם ‪ pNA .(pNA) Chromophore p-nitroaniline‬משתחרר מהסובסטרט כאשר מתבצע ביקוע‬
‫של הסובסטרט על ידי פעילות האנזים ‪ pNA .(Caspase-3) DEVDase‬חופשי מייצר צבע צהוב‪ ,‬אשר‬
‫בולע אור באורך גל של ‪ .405 nm‬עוצמת הצבע שנוצרה בזמן הביקוע פרופורציונית לפעילות ‪caspase-‬‬
‫‪ 3‬בדוגמה הנבדקת‪.‬‬
‫התאים נותקו בעזרת טריפסין‪ ,‬סורכזו במהירות ‪ 1000*g‬למשך ‪ 5‬דקות‪ .‬התאים הומגנו בבופר ליזיס קר‬
‫)‪ .(Caspase 3 Assay System Colorimetric‬ההומוגנטים סורכזו בקור במהירות של ‪,15,000*g‬‬
‫במשך ‪ 20‬דקות ונאסף התרחיף‪ .‬הריאקציה כללה ‪ 20‬מיקרוליטר הומוגנט )‪ 25-100‬מיקרוגרם חלבון(‪,‬‬
‫‪ 32‬מיקרוליטר של ‪ 2 ,Caspase Assay Buffer‬מיקרוליטר ‪ 10 ,DMSO‬מיקרוליטר ‪ DTT‬בריכוז‬
‫‪ 100‬מילימולר‪ .‬נפח הריאקציה הושלם ל‪ 100-‬מיקרוליטר עם מים מזוקקים‪ .‬עבור כל דוגמת הומוגנט‪,‬‬
‫תערובת שהכילה ‪ 20‬מיקרוליטר דוגמת הומוגנט‪ 32 ,‬מיקרוליטר של ‪2 ,Caspase Assay Buffer‬‬
‫מיקרוליטר ‪ 10 ,DMSO‬מיקרוליטר ‪ DTT‬בריכוז ‪ 100‬מילימולר ומים מזוקקים עד לנפח הסופי שימשה‬
‫כביקורת ללא סובסטרט‪ .‬כבלנק שימשה תערובת דומה ללא הומוגנט )עם מים מזוקקים(‪ .‬כסטנדרט‬
‫לעקומת כיול שימשה תמיסת הצבע ‪ (p-nitroaniline) pNA‬בריכוזים שונים )‪ 0-150‬פיקומול‬
‫למיקרוליטר(‪ .‬דוגמאות הריאקציה והביקורת הודגרו בצלחות של ‪ 96‬בארות למשך ‪ 3‬שעות ב‪.37 oC-‬‬
‫הדוגמאות נקראו באורך גל של ‪ 405 nm‬במכשיר ‪ ELISA reader‬של חברת ‪.Bio-Rad‬‬
‫חישוב פעילות האנזים נעשה על פי הנוסחה הבאה‪:‬‬
‫) )‬
‫(‬
‫(‬
‫()‬
‫‪X = (∆A − Y ) incubation time in hours ⋅ 100µl sample volume S‬‬
‫‪µg protein‬‬
‫‪SA = X‬‬
‫כאשר‪:‬‬
‫‪ – ∆A‬הפרש הבליעה ב‪ 405 nm-‬עבור כל הומוגנט עם סובסטרט מהבליעה עבור כל הומוגנט ללא‬
‫סובסטרט )ביקורת(‪.‬‬
‫‪ – Y‬חותך עקומת הסטנדרט של ‪.pNA‬‬
‫‪36‬‬
‫‪ – S‬שיפוע עקומת הסטנדרט של ‪.(A405/pmol/µl) pNA‬‬
‫‪ – X‬פעילות ‪.(pmol pNA librated/hour) caspase-3‬‬
‫‪ – SA‬פעילות ספציפית של ‪.(pmol pNA librated per hour/µg protein) caspase-3‬‬
‫קביעת רמות ‪ATP‬‬
‫בדיקת רמות ‪ ATP‬בתאים נעשה על פי שיטת ‪ .luciferase assay‬התאים נשטפו פעמיים ב‪ PBS-‬קר‪,‬‬
‫לאחר מכן הוסף ‪ 100‬מיקרוליטר בופר ‪ glycine) GG‬בריכוז ‪ 75‬מילימולר ‪ MgCl2, pH 7.8‬בריכוז‬
‫‪ 15‬מילימולר( והתאים גורדו למבחנות אפנדורף על ידי מגרדת תאים מפלסטיק‪ .‬התאים הורתחו חמש‬
‫דקות ב‪ 95°C-‬וסורכזו בקור חמש דקות ב ‪ .30,000*g‬שלושים מיקרוליטר מהתרחיף הועברו לבארות‬
‫בצלחת של ‪ 96‬בארות‪ .‬בנוסף‪ ,‬הוספו ‪ 200‬מיקרוליטר בופר ‪ GG‬ושני מיקרוליטר אנזים ‪Fle-50‬‬
‫)‪ .(Sigma‬הצלחת עברה אינקובציה של דקה אחת לפני קריאה בלומינומטר‪ .‬עקומת סטנדרט של ‪ATP‬‬
‫בריכוזים עולים )‪ 0, 50, 100, 150, 250, 500‬פיקומולר( הוכנה על מנת ליחס אליה את קריאות‬
‫הלומינסנציה של כל דוגמא‪ .‬עוצמות הלומינסנציה בריאקציה נבדקו באמצעות לומינומטר‪ .‬לאחר קריאת‬
‫רמות ה‪ ATP-‬נבדקה רמת החלבון תוך שימוש ב‪ DC protein Assay-‬על מנת לייחס את רמות ה‪ATP-‬‬
‫לכמות החלבון‪.‬‬
‫קביעת הרכב טריגליצרידים‬
‫טריגליצרידים וחומצות שומן חופשיות הופרדו על ידי כרומטוגרפיה על רובד דק )‪.(103) (TLC‬‬
‫דוגמאות מדיום הגידול הוטענו על פלטות ‪ TLC‬יחד עם סטנדרטים של חומצות שומן חופשיות‬
‫וטריגליצרידים‪ .‬המדיום והסטנדרטים יובשו והפלטה הונחה בסולבנט הרצה ‪petroleum ether:diethyl‬‬
‫)‪ . ether :acetic acid (80:19:1, by vol‬כאשר חזית הנוזל הגיעה עד ל‪ 2 -‬ס"מ לפני סוף הפלטה‪,‬‬
‫הפלטה הוצאה מנוזל ההרצה‪ ,‬פותחה על ידי צביעת יוד וצולמה‪.‬‬
‫קביעה של הרכב חומצות שומן‬
‫הרכב חומצות השומן נקבע על ידי מכשיר כרומטוגרפיה גזית )‪ .(GC‬לאחר הטיפול נאספו התאים‬
‫מהצלחות וסורכזו במהירות ‪ 1000*g‬למשך ‪ 5‬דקות‪ .‬לאחר מכן הוסף להם ‪chloroform:methanol‬‬
‫)‪ ,(2:1‬סטנדרט פנימי של חומצות שומן ‪ 0.1) C17‬מ"ג עבור ‪ 1,000,000‬תאים( וריאגנט מתיליציה‬
‫‪37‬‬
‫)‪ .(MetPREP‬הדוגמאות יובשו והומסו מחדש בנפח של ‪ 50‬מיקרוליטר טולואן‪ .‬הדוגמאות המוכנות‬
‫הוזרקו למכשיר ‪ GC‬וזוהו על ידי גלאי להבה )‪.(104‬‬
‫מדידת כמות גלוטטיון מחוזר‬
‫כמות גלוטטיון נקבעה על ידי ‪ .HPLC‬לאחר הטיפול התאים נאספו מהצלחות‪ ,‬סורכזו במהירות ‪1000*g‬‬
‫למשך ‪ 5‬דקות‪ .‬לאחר מכן הוסף להם ‪ ,4% metaphosphoric acid‬הדוגמאות הוטענו ל‪HPLC-‬‬
‫והורצו בבופר ‪ KH2PO4 pH 2.7‬בריכוז ‪ 50‬מילימולר הכולל ‪ acetonitrile 2%‬בקולונה ‪Synergy‬‬
‫)‪ Polar-RP 80A column (Phenomenex‬כאשר פוטנציאל התא היה ‪ 800‬מיליוולט עם גלאי‬
‫אלקטרוכימי‪ .‬התוצאות כוילו לריכוז החלבון )‪.(104‬‬
‫קביעת ריכוז הניטריטים במדיום‬
‫לאחר ‪ 24‬שעות ממתן הטיפולים‪ ,‬נאספו ‪ 900‬מיקרוליטר מדיום ונשמרו ב‪ -80°C-‬לשם קביעת ריכוזי‬
‫ניטריטים‪ .‬לאחר איסוף המדיום התאים עברו ‪ lysis‬באמצעות ‪ lysis buffer‬המכיל‪ EDTA :‬בריכוז ‪5‬‬
‫מילימולר‪ NaCl ,‬בריכוז ‪ 150‬מילימולר‪ tris base ,‬בריכוז ‪ 50‬מילימולר‪ NP40 5% ,‬ומעכבי‬
‫פרוטאזות‪ .‬התאים הודגרו בנוכחות הבופר כ‪ 20-‬דקות ולאחר מכן נאספו לתוך מבחנות אפנדורף וסורכזו‬
‫למשך ‪ 5‬דקות ב‪ .5000*g-‬לאחר הסרכוז נאסף הנוזל העליון ונשמר ב‪ -20°C-‬לשם קביעת חלבון‪.‬‬
‫ריכוז הניטריטים במדיום נקבעו באמצעות ריאקציית ‪ :Griess‬בצלחת של ‪ 96‬בארות עורבבו ‪100‬‬
‫מיקרוליטר של מדיום גידול ו‪ 100-‬מיקרוליטר של תמיסת ‪ Griess‬המכילה ‪ sulfanilamide 1%‬ו‪-‬‬
‫‪ naphthylethylenediamine dihydrochloride 0.1%‬ב‪ .phosphoric acid 2.5%-‬לאחר הדגרת‬
‫הצלחת בטמפרטורת החדר למשך ‪ 10‬דקות‪ ,‬נמדדה הבליעה באורך גל של ‪ 540 nm‬במכשיר ‪ELISA‬‬
‫‪.reader‬‬
‫‪38‬‬
‫ניסוים ‪in vivo‬‬
‫פרוטוקול אינפוזיה‬
‫הרדמת החיה נעשתה על ידי מתן זריקה לחלל הבטן של תערובת קטמין קסילזין )‪100 (0.15/0.85‬‬
‫מיקרוליטר ל‪ 100-‬גר'‪ .‬הפרווה גולחה בצידו השמאלי של הצוואר ומאמצע הגב עד לקו האוזניים‪ .‬החיה‬
‫קובעה ללוח שעם עם סיכות הלוחצות משני צידי הרגליים הקדמיות ואזור הצוואר חוטא באתנול‪ .‬בעזרת‬
‫סכין מנתחים בוצע חתך על פני העור מכיוון עצם הבריח ועד ‪ 0.5‬ס"מ לפני הלסת ונחשף וריד הצוואר‬
‫)‪ .(Jugular‬הוריד בודד מהרקמה והושחלו שני חוטי משי תחת הוריד‪ .‬לאחר מכן בוצע חתך בחצי מרוחב‬
‫הוריד בזוית של ‪ 45°‬והוחדרה לתוך הוריד צינורית עם קצה סיליקון עד כניסת טבעת הסיליקון לווריד‪.‬‬
‫הצינורית נקשרה משני צידי טבעת הסיליקון ובעזרת המזרק הוחדרו ‪ 200‬מיקרוליטר הפרין לתוך הוריד‪,‬‬
‫נמשך דם לתוך הצינורית והוחזר לחיה‪ .‬בוצע חתך קטן בעור )‪ 3‬מ"מ( בגב החיה והצינורית הועברה תת‬
‫עורית והוצאה דרך החתך בעור‪ .‬החיה נתפרה בעזרת חוט משי באזור הצוואר ובאזור הגב‪ .‬הצינורית‬
‫הועברה דרך קפיץ המחובר לרתמה )איור ‪ (3 A‬והרתמה נסגרה על בטן החיה‪ .‬החיה הועברה לכלוב בבית‬
‫החיות בחדר מבודד והצינורית חוברה לסביבון מעל הכלוב )איור ‪ .(3 B‬הסביבון‪ ,‬שמטרתו לאפשר תנועה‬
‫חופשית של החיה בכלוב‪ ,‬חובר עם מקטע צינור נוסף למזרק במשאבת מזרקים )‪) (syringe pump‬איור‬
‫‪C‬‬
‫‪.(3 C‬‬
‫הכנת הקנולה מתוארת באיור‬
‫‪ .4‬נחתכו שני מקטעי ‪silastic‬‬
‫‪B‬‬
‫באורך של ‪ 1 cm‬ושל ‪,2mm‬‬
‫בנוסף נחתך ‪ PE50‬באורך‬
‫של ‪ .25cm‬המקטע הקצר‬
‫)‪(2mm‬‬
‫של‬
‫ה‪silastic-‬‬
‫הושחל על צינורית ה‪PE50-‬‬
‫‪A‬‬
‫ומקטע ה‪ silastic-‬הארוך‬
‫‪A‬‬
‫יותר )‪ (1 cm‬הושחל הקצה‬
‫‪39‬‬
‫איור ‪ - 3‬מערכת האינפוזיה‪.‬‬
‫צינורית ה‪ PE50-‬עד לחצי אורכו‪.‬‬
‫קצה ה‪ silastic-‬נחתך בזוית של ‪ 45°‬וטבעת ה‪ silastic-‬כוונה כך שתהיה במרחק ‪ 2cm‬מקצה הקנולה‪.‬‬
‫החיות הוזנו בטריגליצרידים לתקופה של עד ‪ 6‬ימים‪ 10 ,‬מ"ל אמולסית שומן בכל יום בקצב של ‪ 2‬מ"ל‬
‫לשעה‪.‬‬
‫איור ‪ - 4‬קנולה לאינפוזיה‪.‬‬
‫היסטולוגיה‬
‫לצביעת ‪ H&E‬הכבדים נשטפו מדם על ידי הזרמת ‪ PBS‬דרך וריד השער ולאחר מכן הועברה אונת כבד‬
‫לתוך פורמאלדהיד ‪ .4%‬הדוגמאות נשלחו ליחידת ההיסטולוגיה של האוניברסיטה העברית בה נעשו‬
‫חתכים שצולמו ופוענחו על ידי וטרינר מומחה‪.‬‬
‫לצביעת שומנים וגרעינים הכבדים נשטפו מדם על ידי הזרמת ‪ PBS‬דרך וריד השער ולאחר מכן הוקפאו‬
‫בחנקן נוזלי‪ .‬החתכים הוכנו בקריוסטט‪ ,‬קובעו בפראפורמאלדהיד ‪ 20‬דקות ב‪ ,-20°C-‬יובשו באוויר‬
‫ונשמרו ב‪ -20°C-‬לשימוש מאוחר יותר‪ .‬צביעת הגרעינים נעשתה באמצעות ‪ DAPI‬וצביעת השומנים‬
‫באמצעות ‪ . Nile red‬החתכים נחשפו לצבעים למשך ‪ 5‬דקות‪ ,‬נשטפו‪ ,‬וצולמו במיקרוסקופ ‪(Axiovert‬‬
‫)‪.200 with apotome function, Zeiss, Göttingen, Germany‬‬
‫כללי‬
‫קביעת חלבון‬
‫קביעת חלבון על פי שיטת לאורי נעשתה בעזרת הקיט ‪ detergent compatible protein assay‬לפי‬
‫הוראות היצרן )‪ .(Transduction Laboratories, NH, USA‬חלבון אלבומין מסרום בקר ‪ 2‬מיליגרם‬
‫למ"ל שימש כסטנדרט לעקומת כיול‪ ,‬כאשר לכל באר בעקומת הכיול הוסף נפח זהה של בופר ‪ lysis‬לנפח‬
‫הדוגמא שנלקח לקריאה‪ .‬לאחר הוספת כל החומרים והמתנה של ‪ 15‬דקות נמדדה עוצמת הבליעה של‬
‫הדוגמאות באורך גל של ‪ 650 nm‬במיקרופלואורימטר‪.‬‬
‫קביעת חלבון על פי שיטת ברדפורד נעשתה באמצעות חלבון אלבומין מסרום של בקר ‪ 2‬מיליגרם למ"ל‬
‫אשר שימש כסטנדרט לעקומת כיול‪ .‬הדוגמאות נבדקו בצלחת של ‪ 96‬בארות‪ ,‬לכל באר הוספה תמיסת‬
‫‪40‬‬
‫ברדפורד ולאחר טלטול והמתנה של ‪ 5‬דקות נמדדה עוצמת הבליעה של הדוגמאות באורך גל של ‪595‬‬
‫‪ nm‬במיקרופלואורימטר )‪.(105‬‬
‫‪Western Blot‬‬
‫לאחר הטיפולים השונים התאים נותקו מהבארות‪ ,‬סורכזו במהירות ‪ 2500*g‬למשך ‪ 5‬דקות והורחפו ב‪-‬‬
‫‪) PBS‬להלן שטיפת התאים(‪ .‬לאחר שתי שטיפות וסרכוז נוסף התאים הורחפו ב‪ 100-‬מיקרוליטר בופר‬
‫‪ ,lysis‬הדוגמאות הורתחו למשך ‪ 10‬דקות ונשמרו ב‪ -20°C-‬עד הבדיקה‪.‬‬
‫לצורך מיצוי חלבוני גרעין מרקמה ותאים הרקמה נטחנה בבופר היפוטוני‪ ,‬ואילו התאים נותקו בעזרת‬
‫טריפסין ונשטפו פעמיים עם ‪ PBS‬קר‪ .‬לאחר השקעה נוספת של התאים‪ ,‬המשקע הורחף ב‪ 1-‬מ"ל בופר‬
‫על מנת לקרוע את ממברנות התאים‪ .‬הדוגמאות סורכזו במהירות של ‪ 3000*g‬למשך ‪ 10‬דקות‪ ,‬הנוזל‬
‫העליון הורחק ומשקע הגרעינים הורחף בבופר היפרטוני‪ .‬הדוגמאות טולטלו למשך ‪ 30‬דקות ב‪ 4°C -‬על‬
‫מנת לקרוע את ממברנות הגרעינים‪ .‬לאחר מכן בוצע סרכוז נוסף במהירות של ‪ 14000*g‬למשך ‪30‬‬
‫דקות על מנת להיפטר משאריות הגרעינים‪ .‬לאחר הסרכוז הנוזל העליון המכיל את חלבוני הגרעין נאסף‬
‫ונשמר ב‪ .(71) -70°C-‬קביעת חלבון בוצעה בשיטת ברדפורד‪.‬‬
‫לאחר קביעת ריכוז החלבון בדוגמאות‪ ,‬הדוגמאות הובאו לריכוז זהה על ידי מיהול במים מזוקקים ו‪-‬‬
‫‪ .sample buffer‬הדוגמאות חוממו ל‪ 90°C-‬במשך כ‪ 10-‬דקות‪ .‬כמות החלבון שהוטענה על הג'ל הייתה‬
‫כ‪ 20-100-‬מיקרוגרם‪.‬‬
‫הרצת הדוגמאות בוצעה בג'ל אקרילאמיד דנטורטיבי‬
‫הרכב הג'ל התחתון‪:‬‬
‫כמות שנלקחה )‪(ml‬‬
‫החומר‬
‫‪Acryl amide solution‬‬
‫‪3.3‬‬
‫]‪Resolving gel buffer [Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪10% SDS‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪ddH2O‬‬
‫‪Ammonium persulfate‬‬
‫‪TEMED‬‬
‫‪41‬‬
‫‪4‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪0.004‬‬
‫הרכב הג'ל העליון‪:‬‬
‫כמות שנלקחה )‪(ml‬‬
‫החומר‬
‫‪Acryl amide solution‬‬
‫‪0.44‬‬
‫]‪Stacking gel buffer [Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪10% SDS‬‬
‫‪0.033‬‬
‫‪ddH2O‬‬
‫‪2.03‬‬
‫‪Ammonium persulfate‬‬
‫‪0.03‬‬
‫‪TEMED‬‬
‫‪0.003‬‬
‫הרצת הג'ל בוצעה בבופר הרצה ]‪ 0.192 Glycine ,0.1% SDS‬מולר‪ 0.025 Tris ,‬מולר‪,[pH 8.3 ,‬‬
‫בזרם של ‪ 100‬מיליאמפר עבור ‪ 2‬ג'לים עד אשר הדוגמאות הגיעו כס"מ לפני סוף הג'ל‪ .‬לאחר ההרצה‬
‫הועברו חלבוני הג'ל לממברנת ניטרוצלולוזה‪ ,‬תנאי ההעברה עבור שני ג'לים ‪ 250‬מיליאמפר‪.‬‬
‫על מנת לוודא שהוטענו כמו יות אחידות של חלבון ושתהליך ההעברה היה אחיד עבור כל הדוגמאות‪,‬‬
‫הממברנה נצבעה עם תמיסת ‪ Ponceau‬ל‪ 5-‬דקות‪ .‬לאחר מכן הממברנה הושרתה במשך שעה בתמיסת‬
‫חלב בבופר ‪ TBST‬ובמשך שעה )או לילה בטמפ' של ‪ (4°C‬עם נוגדן ראשוני‪ .‬לאחר ‪ 3‬שטיפות של ‪10‬‬
‫דקות עם ‪ TBST‬הושרתה הממברנה עם נוגדן שני למשך שעה‪ .‬הממברנה נשטפה עם ‪ TBST‬ופותחה‬
‫באמצעות ‪.(106) Western blotting luminal reagent‬‬
‫הפקת ‪RNA‬‬
‫דוגמאות מהרקמות הקפואות הומגנו ב‪ 1-‬מ"ל טריריאגנט‪ .‬במקרה של תאים לאחר הטיפולים השונים‬
‫התאים נאספו‪ ,‬נשטפו ‪ 3‬פעמים עם ‪ PBS‬והמשקע הומגן ב‪ 0.5-‬מ"ל טריריאגנט‪ .‬לאחר הדגרה של ‪5‬‬
‫דקות בטמפרטורת החדר‪ ,‬הוספו לכל מבחנה ‪ 0.2‬מ"ל כלורופורם לכל מ"ל טריריאגנט‪ ,‬והמבחנה נוערה‬
‫‪ 15‬שניות לקבלת צבע ורוד‪ .‬הדוגמאות סורכזו במהירות של ‪ 14000*g‬במשך ‪ 10‬דקות‪ .‬התקבלו ‪3‬‬
‫פאזות‪ ,‬הפאזה האמצעית מכילה את החלבונים והעליונה את ה‪ .RNA -‬הפאזה העליונה נאספה לאפנדורף‬
‫שהכיל ‪ 0.25‬מ"ל ‪ Isopropanol‬לכל ‪ 1‬מ"ל טריריאגנט‪ ,‬והושארה להדגרה בטמפרטורת החדר למשך‬
‫‪ 10‬דקות‪ .‬הדוגמאות סורכזו ב‪ 14000*g -‬למשך ‪ 10‬דקות והנוזל העליון הורחק‪ ,‬המשקע )‪(RNA‬‬
‫‪42‬‬
‫הורחף ב‪ 0.5 -‬מ"ל אתאנול ‪ 75%‬ובוצע סרכוז נוסף במהירות של ‪ 14000*g‬למשך ‪ 5‬דקות‪ .‬הנוזל‬
‫העליון נשאב‪ ,‬המשקע יובש והומס ב‪ 50-‬מיקרוליטר מים שטופלו ב‪.(107) DEPC -‬‬
‫ריכוז ה‪ RNA-‬נקבע בספקטופוטומטר באורכי גל של ‪ 260 nm‬לחומצות גרעין ו‪ 280 nm -‬לחלבונים‪.‬‬
‫דוגמאות אשר הראו יחס בין ‪ 260/280=1.7-2‬נשמרו ב‪ -20°C -‬עד לשימוש‪.‬‬
‫יצירת ‪cDNA‬‬
‫יצירת ‪ cDNA‬עם טיפול מקדים ב‪ dnase-‬בוצעה כמפורט בטבלאות‪:‬‬
‫נפח נדרש לדוגמא )‪(µl‬‬
‫מרכיב‬
‫‪RNA sample‬‬
‫‪16‬‬
‫‪Dnase buffer *10‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪Dnase enzyme‬‬
‫הדגרה של תערובת זו שעתיים בטמפ' של ‪ 37°C‬ולאחר מכן ‪ 20‬דקות ב‪.70°C -‬‬
‫נפח נדרש לדוגמא )‪(µl‬‬
‫מרכיב‬
‫‪) 3 µg‬לפי הריכוז(‬
‫)‪RNA sample (after dnase‬‬
‫‪DEPC treated water‬‬
‫להשלים נפח דוגמת ‪RNA‬‬
‫ל‪11.5 -‬‬
‫‪Hexamers‬‬
‫אינקובציה של ‪ 5‬דקות ‪ 65 °C‬ולאחר מכן ‪ 5‬דקות בקרח‪.‬‬
‫‪0.5‬‬
‫לאחר מכן הוסף לכל מבחנה‪:‬‬
‫נפח נדרש לדוגמא )‪(µl‬‬
‫מרכיב‬
‫‪RT buffer‬‬
‫‪4‬‬
‫‪dNTP‬‬
‫‪2‬‬
‫‪rnasin‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪M-MLV‬‬
‫תוכנית ‪ 60 :RT‬דקות ב‪ 42°C -‬ו‪ 15 -‬דקות ב‪ .70°C -‬הדוגמאות נשמרו ב‪ -20°C -‬עד לביצוע ‪.PCR‬‬
‫יצירת ‪ cDNA‬ללא טיפול ב‪ dnase-‬התבצעה באמצעות הקיט ‪Reverse-iT 1st ) ABgene, UK‬‬
‫‪ strand synthesis kit‬על פי הוראות היצרן‪ .‬בקצרה‪ :‬לריאקציה נלקח כ‪ 1-‬מיקרוגרם ‪ .RNA‬הוסף ‪1‬‬
‫מיקרוליטר)‪ Oligo (dT‬והנפח הושלם ל‪ 13-‬מיקרוליטר עם מים מעוקרים‪ .‬הדוגמאות הודגרו ב‪70°C -‬‬
‫‪43‬‬
‫למשך ‪ 10‬דקות וקוררו במהירות בקרח‪ .‬שאר מרכיבי הריאקציה הוספו‪ ,‬הדוגמאות סורכזו במשך ‪10‬‬
‫שניות והוכנסו למכשיר ה‪ .PCR-‬תוכנית ‪ 60 :RT‬דקות ב‪ 42°C-‬ו‪ 15-‬דקות ב‪.70°C-‬‬
‫הדוגמאות נשמרו ב‪ -20°C -‬עד לביצוע ‪.PCR‬‬
‫ריאקצית ‪PCR‬‬
‫מרכיבי ריאקציית ה‪ PCR-‬מפורטים בטבלה‪:‬‬
‫נפח נדרש לדוגמא )‪(µl‬‬
‫מרכיב‬
‫‪2.5‬‬
‫‪10x PCR buffer, No Mg‬‬
‫‪4‬‬
‫‪25 mM dNTP mixture‬‬
‫‪50 mM MgCl2‬‬
‫)‪Primer mix (10 µM each‬‬
‫‪0.75‬‬
‫‪) 0.05‬מיהול ‪(10 x‬‬
‫‪0.125‬‬
‫‪PLATINUM Taq DNA‬‬
‫‪polymerase‬‬
‫השלמה ל‪22.5 µl -‬‬
‫‪Sterile water‬‬
‫התערובת עם כל המרכיבים )ללא ה‪ (DNA-‬הוכנה ועורבבה ב‪ .vortex -‬לכל מבחנה הוכנסו ‪2.5‬‬
‫מיקרוליטר ‪ cDNA‬והוספו ‪ 22.5‬מיקרוליטר מהתערובת‪ .‬הדוגמאות הוכנסו למכשיר ה‪ PCR-‬והופעלה‬
‫התוכנית המבוקשת‪ .‬התוכנית ה תחילה ב‪ 30-‬שניות דנטורציה של גדילי ה‪ cDNA-‬ב‪ ,95°C-‬כ‪ 60-‬שניות‬
‫ב‪) X-‬ראה טבלה( מעלות היברידיזציה של הפריימרים אל מקטעי ה‪ (annealing) cDNA-‬ו‪ 60-‬שניות‬
‫ב‪ 72°C-‬התארכות הגדילים החדשים )‪ (elongation‬וחזרה לדנטורציה ב‪) Y-‬ראה טבלה( מחזורים‬
‫)מספר המחזורים נקבע על ידי ביצוע כיול של מספר מחזורים שונה ונבחר התחום הליניארי לעבודה(‪.‬‬
‫עבור כל דוגמא נבדקו גם רמות השעתוק של הגן הקונסטיטוטיבי ‪glyceraldehyde-3 phosphate‬‬
‫‪ (GAPDH) dehydrogenase‬כביקורת‪.‬‬
‫הגן‬
‫‪iNOS/eNOS‬‬
‫‪X‬‬
‫‪Y‬‬
‫‪57°C‬‬
‫‪34/27‬‬
‫‪19‬‬
‫‪57°C‬‬
‫‪GAPDH‬‬
‫תוצרי ה‪ PCR-‬הופרדו על ג'ל אגרוז ‪ 1.25%‬בנוכחות אתידיום ברומיד‪ ,‬על ידי מכשיר אלקטרופורזה‬
‫אופקי‪ .‬לכל ‪ 8‬מיקרוליטר דוגמא הוספו ‪ 3‬מיקרוליטר ‪ 6x Loading gel‬ולאחר ערבוב הדוגמא הוטענה‬
‫על הג 'ל‪ .‬ההרצה נעשתה בבופר ‪ TEA‬במתח של ‪ 100 V‬עבור ג'ל גדול ו‪ 75 V -‬עבור ג'ל קטן ללא‬
‫‪44‬‬
‫הגבלת זרם עד אשר הדוגמאות הגיעו כס"מ לפני סוף הג 'ל‪ .‬כסמן גודל שימש ‪direct load DNA step‬‬
‫‪(108 ) ladder‬‬
‫‪Real Time PCR‬‬
‫הכנת הדוגמאות כמפורט בטבלה‪:‬‬
‫נפח נדרש לדוגמא )‪(µl‬‬
‫מרכיב‬
‫‪RT Ready Mix‬‬
‫‪10‬‬
‫)‪Primer mix (10 µM each‬‬
‫‪5‬‬
‫‪5‬‬
‫‪cDNA sample‬‬
‫התערובת עם כל המרכיבים )ללא ה‪ (DNA-‬הוכנה ועורבבה ב‪ .vortex -‬לכל מבחנה הוכנס ‪cDNA‬‬
‫והוספה התערובת‪ ,‬הדוגמאות הוכנסו למכשיר ה‪ Real Time PCR-‬והופעלה התוכנית המבוקשת‪.‬‬
‫ניתוח התוצאות‬
‫קביעה כמותית של עוצמת הבנדים נעשתה באמצעות תוכנת הדנסיטומטריה ‪.GelPro3‬‬
‫הניתוח הסטטיסטי של תוצאות הניסויים נעשה בתוכנת ‪ .JMP‬להשוואה בין שתי קבוצות ניסוי בודדות‬
‫בוצע ‪ .t-test‬לניסויים בעלי מספר קבוצות גדול מ‪ 2-‬נערך ניתוח סטטיסטי על ידי מבחן ‪one/two-way‬‬
‫‪ .ANOVA‬ואנליזת ‪) Post-Hoc tukey‬על פי מספר הגורמים(‪ .‬ההבדלים נחשבו מובהקים כאשר רמת‬
‫המובהקות הייתה ‪.P<0.05‬‬
‫‪45‬‬
‫תוצאות‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪NO‬‬
‫כניסת טריגליצרידים לתאים‬
‫כניסת טריגליצרידים לתוך תאי כבד מבודדים אומתה על ידי בדיקת תכולת השומן בתאים לאחר הדגרה‬
‫בנוכחות ‪ 0.1%‬טריגליצרידים לזמנים שונים )איור ‪ .(5A‬בהשוואה לתאים אשר לא טופלו‬
‫בטריגליצרידים תכולת השומן עלתה בתאים לאחר חשיפתם לטריגליצרידים למשך ‪ 48‬שעות‪ .‬העלייה‬
‫בתכולת השומן הייתה תלוית זמן חשיפה לשומן )איור ‪ .(5 B‬בצילום במיקוסקופ אור ללא צביעה ניתן‬
‫להבחין בואקואלות השומן כמבנים קטנים )ראה חץ( ועגולים בתוך התאים לאחר חשיפה לטריגליצרידים‬
‫)איור ‪.(5C‬‬
‫איור ‪ - 5‬הצטברות שומן בתאי כבד ראשוניים מכבד חולדה‪ .A .‬צילום התאים במיקרוסקופ )הגדלה ‪ (x100‬לאחר הדגרה‬
‫עם טריגליצרידים וצביעה עם ‪ .B .nile red‬תכולת השומן נבדקה ב‪ ,FACS-‬לאחר הדגרה של התאים עם טריגליצרידים‬
‫לזמנים שונים וצביעה ב‪ .C .nile red-‬צילום התאים במיקרוסקופ )הגדלה ‪ .(x400‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק‬
‫‪.n=3, p<0.05‬‬
‫‪46‬‬
‫כדי לבדוק האם מתרחש פירוק טריגליצרידים‬
‫במדיום ועקב כך ישנה חשיפה לחומצות שומן‪,‬‬
‫הוטענו דוגמאות מדיום על גבי פלטת ‪ .TLC‬לא‬
‫נמצאו חומצות שומן חופשיות )‪ (FFA‬במדיום הגידול‬
‫לאחר ‪ 48‬שעות הדגרה של התאים עם מדיום המכיל‬
‫טריגליצרידים‪) .‬איור ‪.(6‬‬
‫בעקבות החשיפה לטריגליצרידים השתנה פרופיל‬
‫חומצות שומן בתאי הכבד‪ ,‬בעיקר בחומצות השומן‬
‫הנפוצות באמולסית השומן בה השתמשנו )טבלה ‪.(1‬‬
‫איור ‪ - 6‬נוכחות חומצות שומן חופשיות במדיום הגידול‪.‬‬
‫התאים הודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 48‬שעות‬
‫ודוגמאות המדיום הוטענו על גבי פלטת ‪ TLC‬והורצו כנגד‬
‫סטנדרט של טריגליצרידים ו‪.FFA-‬‬
‫טבלה ‪ - 1‬פרופיל חומצות שומן של תאי כבד ראשוניים ושל אמולסית הטריגליצרידים‪ .‬תאים ראשוניים ממקור כבד הודגרו עם‬
‫‪ TG‬למשך ‪ 24‬שעות‪ ,‬לאחר מכן נאספו התאים ונעשה מהם מיצוי שומני ולמיצוי נעשתה מתילציה‪ .‬הדוגמאות הורצו ב‪.GC-‬‬
‫הנתונים מופיעים כמ"ג חומצת שומן ל‪ 106-‬תאים‪ ,‬המספרים בסוגריים מציינים את שגיאות התקן‪* P<0.05 .‬‬
‫‪Cells lipids profile following treatment‬‬
‫‪Fatty acid composition‬‬
‫‪of the lipid emulsion‬‬
‫‪Lipid emulsion‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪Fatty acid‬‬
‫)‪(mg/100mg emulsion‬‬
‫‪47‬‬
‫‪4‬‬
‫*)‪7.95(0.42‬‬
‫)‪6.15(0.08‬‬
‫‪16 palmitic‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪0.43(0.04‬‬
‫)‪0.33(0.11‬‬
‫‪16-1 palmitoleic‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪0.43(0.22‬‬
‫)‪0.76(0.41‬‬
‫‪16-2 hxadecadienoic‬‬
‫‪1.6‬‬
‫*)‪7.41(0.41‬‬
‫)‪5.85(0.23‬‬
‫‪18 stearic‬‬
‫‪8.5‬‬
‫*)‪4.56(0.27‬‬
‫)‪2.12(0.07‬‬
‫‪18-1 oleic‬‬
‫‪19.5‬‬
‫*)‪1.69(0.10‬‬
‫)‪1.39(0.04‬‬
‫‪18-2 linoleic‬‬
‫השפעת השומן על חיות התאים‬
‫נבחנה השפע תה של חשיפת תאי הכבד‬
‫לריכוזים שונים של טריגליצרידים‬
‫)‪ (0.01%-0.1%‬למשך ‪ 48‬שעות‪.‬‬
‫חיות התאים נבדקה על ידי צביעה ב‪-‬‬
‫‪ .Propidium iodide‬לא נצפה שינוי‬
‫משמעותי בחיות התאים לאחר הדגרתם‬
‫בנוכחות‬
‫טריגליצרידים‬
‫בטווח‬
‫איור ‪ - 7‬חיות תאי כבד ראשוניים מכבד חולדה לאחר חשיפה לשומן‪ .‬חיות‬
‫התאים נבדקה ב‪ ,FACS-‬לאחר הדגרה של התאים עם טריגליצרידים‬
‫בריכוזים שונים נצבעו התאים עם ‪. n=6.Propidium iodide‬‬
‫הריכוזים הנמדד עד לריכוז של ‪0.1%‬‬
‫)איור ‪.(7‬‬
‫השפעת השומן על יצור ‪ NO‬בתאי כבד מבודדים‬
‫על מנת להעריך את התפקיד האפשרי של‬
‫‪ NO‬בתהליכי רעילות שומן‪ ,‬נבדקו רמות‬
‫הניטריטים במדיום הגידול אשר בו הודגרו‬
‫התאים לאחר הדגרה בנוכחות או העדר‬
‫טריגליצרידים )‪ .(0.1%‬באיור ‪ 8‬ניתן‬
‫לראות כי ירידה משמעותית התלויה בריכוז‬
‫הטריגליצרידים נמצאה בריכוז הניטריטים‬
‫במדיום )‪ ,(r=0.99‬כאשר ריכוז של ‪0.1%‬‬
‫איור ‪ - 8‬יצור ניטריטים על ידי תאי כבד ראשוניים מכבד חולדה לאחר‬
‫חשיפה לשומן‪ .‬כמות הניטריטים שהצטברו במדיום הגידול במשך ‪48‬‬
‫שעות של הדגרה עם ריכוזים שונים של ‪ TG‬נבדקו בריאקצית‬
‫‪ .Griess‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪. n=3, p<0.05‬‬
‫טריגליצרידים הוביל לירידה של ‪ 70%‬בריכוז הניטריטים במדיום הגידול בהשוואה לתאים אשר לא‬
‫נחשפו לטריגליצרידים‪.‬‬
‫על מנת לבחון את המנגנון דרכו טריגליצרידים מפחיתים יצור ‪ NO‬נבדקו רמות ביטוי ה‪ mRNA‬של‬
‫‪ eNOS‬ו‪ iNOS-‬על ידי ‪ .PCR‬טריגליצרידים הפחיתו את רמות ה‪ eNOS-‬ב‪) 37%-‬איור ‪ (9A‬ואת‬
‫רמות ‪ iNOS‬ב‪) 67%-‬איור ‪ ,(9B‬בהשוואה לתאים אשר לא נחשפו לטריגליצרידים‪ .‬הירידה ברמות ה‪-‬‬
‫‪48‬‬
‫‪ mRNA‬לוותה בירידה משמעותית של כ‪ 50%-‬ברמת החלבון של ‪) eNOS‬איור ‪ (9C‬וירידה של כ‪-‬‬
‫‪ 30%‬ברמת החלבון של ‪) iNOS‬איור ‪.(9D‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪Control‬‬
‫אינדוקציה של נגזרות חמצן פעילות על ידי טריגליצרידים‬
‫מכיוון שבעבר דווח כי ישנם יחסי גומלין בין ‪ NO‬ונגזרות חמצן פעילות‪ ,‬בנוסף לרמות ניטריטים במדיום‬
‫נבדקו הרמות התוך תאיות של נגזרות חמצן פעילות כפונקציה של הזמן לאחר חשיפה לטריגליצרידים‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪Control emulsion‬‬
‫‪Control‬‬
‫)‪ .(0.1%‬נמצא‪ ,‬כי‪iNOS‬‬
‫כפונקציה של הזמן‪ .‬רמות אלו היו‬
‫רמות נגזרות חמצן פעילות בתוך התאים עלו‬
‫‪eNOS‬‬
‫‪actin‬‬
‫בהתאמה הפוכה לרמות לרמות הניטריטים במדיום )‪) (r=0.9‬איור ‪.(10A‬‬
‫‪actin‬‬
‫בצילום במיקרוסקופ פלורסנטי ניתן לראות את העליה בפלורסנציה של התאים לאחר הדגרתם עם‬
‫טריגליצרידים וצביעה ב‪) DCF-‬איור ‪.(10B‬‬
‫איור ‪ - 9‬רמות חלבון ו‪ mRNA-‬של ‪ i/eNOS‬לאחר הדגרה עם שומן‪ .‬התאים הודגרו עם שומן )‪ (TG 0.1%‬ל‪ 48-‬שעות‪ .‬רמות‬
‫‪ mRNA‬של ‪ .B eNOS .A‬ו‪ iNOS-‬נבדקו ב‪ .PCR-‬ורמות התבטאות החלבון של ‪ .D eNOS .C‬ו‪ iNOS-‬ב‪.Western blot-‬‬
‫‪. n=3, *p<0.05‬‬
‫‪49‬‬
‫אינדוקציה של נגזרות חמצן פעילות על ידי טריגליצרידים‬
‫איור ‪ - 10‬יצור נגזרות חמצן פעילות לאחר הדגרה עם שומן‪ .‬התאים הודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 48‬שעות‪.A .‬‬
‫כמות הניטריטים במדיום הגידול נבדקה בריאקצית ‪ griess‬ורמות נגזרות חמצן פעילות נבדקו ב‪ FACS-‬לאחר צביעה עם‬
‫‪ .B DCF‬צילום התאים במיקרוסקופ )הגדלה ‪ (x100‬לאחר הדגרה עם שומן וצביעה עם ‪ .DCF‬אותיות שונות מצינות‬
‫הבדל מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫על מנת לבדוק האם שינוי ב‪ NO-‬השפיע על‬
‫רמות נגזרות חמצן פעילות‪ ,‬התאים נחשפו ל‪-‬‬
‫‪) SNAP‬חומר המשחרר ‪ (NO‬לתקופה של ‪48‬‬
‫שעות‪ .‬הוספת ‪ SNAP‬לא השפיעה על רמות‬
‫‪ROS‬התוך תאיות בנוכחות או בהעדר‬
‫טריגליצרידים )‪ (0.1%‬במדיום הגידול )איור‬
‫איור ‪ - 11‬יצור נגזרות חמצן פעילות לאחר הדגרה עם ‪.SNAP‬‬
‫התאים הודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 48‬שעות ויצור‬
‫הניטריטים נבדק בריאקצית ‪ .griess‬אותיות שונות מצינות הבדל‬
‫מובהק ‪. n=3, p<0.05‬‬
‫‪.(11‬‬
‫‪50‬‬
‫במקביל לעליה ברמות ‪ ROS‬התוך תאיות‪ ,‬נבדקו רמות האנטיאוקסידנט האנדוגני גלוטטיון‪ ,‬בעקבות‬
‫חשיפה לטריגליצרידים )‪ .(0.1%‬נמצא‪ ,‬כי הייתה ירידה של ‪ 46%‬ברמות הגלוטטיון התוך תאיות )איור‬
‫‪ .(12 A‬כאשר התאים טופלו ב‪) BSO-‬מעכב סינטזה של גלוטטיון( חלה ירידה ברמות הניטריטים במדיום‬
‫הגידול )איור ‪ .(12 B‬הירידה ברמות הניטיריטים כתוצאה מחשיפה לגלוטטיון הייתה דומה לירידה‬
‫שנרשמה כתוצאה מחשיפה לאמולסית שומן‪ .‬מתן משולב של טריגליצרידים ו‪ BSO-‬לא הגביר את‬
‫הירידה ביצור ‪) NO‬איור ‪. (12B‬‬
‫איור ‪ - 12‬יצור ניטריק אוקסיד ורמות ‪ GSH‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‪ .‬התאים הודגרו עם טריגליצרידים למשך‬
‫‪ 48‬שעות‪ .A .‬רמות ‪ GSH‬תאיות נבדקו על ידי הרצת הדוגמאות ב‪ .B .HPLC-‬כמות הניטריטים במדיום הגידול נבדקה‬
‫בריאקצית ‪ griess‬לאחר הדגרה בנוכחות או בהעדר ‪ .BSO‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪.*p<0.05 , p<0.05‬‬
‫טיפול ב‪) Rotenone-‬מעכב קופלקס ‪ 1‬במיטוכונדריה(‪ ,‬גרם לעלייה ברמות נגזרות חמצן פעילות ב תוך‬
‫התאים )איור ‪ ,(13A‬באופן דומה לזה של חשיפה לטריגליצרידים‪ .‬העלייה ברמות נגזרות חמצן הפעילות‬
‫הובילו גם לירידה משמעותית ברמות הניטריטים במדיום )איור ‪.(9B‬‬
‫איור ‪ - 13‬יצור נגזרות חמצן פעילות וניטריטים לאחר הדגרה עם ‪ .Rotenone‬התאים הודגרו עם טריגליצרידים ו‪-‬‬
‫‪ (40µM) Rotenone‬למשך ‪ 48‬שעות‪ A .‬נגזרות חמצן פעילות נבדקו ב‪ FACS-‬לאחר צביעה עם ‪ .B .DCF‬כמות‬
‫הניטריטים במדיום הגידול נבדקה בריאקצית ‪ .griess‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫‪51‬‬
‫השפעת אנטיאוקסידנטים על רמות ניטריטים בתאי כבד שנחשפו לטריגליצרידים‬
‫העלאה מכוונת של רמות נגזרות חמצן פעילות בתאים גרמה לאפקט דומה לאפקט הנצפה כתוצאה‬
‫מחשיפה לטריגליצרידים )איור ‪ .(13A,B‬לכן נבחנה השאלה האם אנטיאוקסידנטים יכולים למנוע ירידה‬
‫זו ביצור ‪.NO‬‬
‫נמצא כי מתן אנטיאוקסידנטים ‪ NAC‬מיתן את השפעת של טריליצרידים על יצור הניטריטים‪ ,‬ל‪NAC-‬‬
‫עצמו לא הייתה השפעה על יצור הניטיריטים )איור ‪ .(14A‬כאשר נבדקו ההשפעת של אנטיאוקסידנטים‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫איור ‪ – 14‬השפעת ‪ NAC .A‬או ‪ .B‬אנטיאוקסידנטים נוספים על יצור ניטריק אוקסיד בתאי כבד ראשוניים‬
‫מכבד חולדה לאחר חשיפה לטריגליצרידים‪ .‬רמות ניטריטים שהצטברו במדיום הגידול במשך ‪ 48‬שעות של‬
‫הדגרה עם אנטיאוקסידנטים שונים וטריגליצרידים‪ ,‬נבדקו בריאקצית ‪. n=3 .Griess‬‬
‫‪52‬‬
‫נוספים נמצא כי אנטיאוקסידנטים מסיסי שמן ביחד עם טריגליצרידים )‪ (0.1%‬לא מנעו את הירידה‬
‫ברמות הניטיריטים במדיום הגידול )איור ‪ .(14 B‬לעומת זאת‪ ,‬אנטיאוקסידנטים מסיסי מים מנעו חלקית‬
‫אך משמעותית את ההשפעה של אמולסית השומן‪ .‬מתן משולב של שלושה אנטיאוקסידנטים )‪,NAC‬‬
‫ויטמין ‪ C‬ו‪ (resveratrol-‬במינון נמוך יו תר הניב אפקט סינרגיסטי )איור ‪.(15‬‬
‫איור ‪ - 15‬השפעת אנטיאוקסידנטים מסיסי מים על יצור ניטריק אוקסיד בתאי כבד ראשוניים מכבד חולדה לאחר חשיפה‬
‫לטריגליצרידים‪ .‬רמות ניטריטים שהצטברו במדיום הגידול במשך ‪ 48‬שעות של הדגרה עם אנטיאוקסידנטים שונים וטריגליצרידים‪,‬‬
‫נבדקו בריאקצית ‪.n=3 .Griess‬‬
‫‪53‬‬
‫מכאן ואילך נבחר ‪ NAC‬כמייצג לבחינת ההשפעה של אנטיאוקסידנטים מסיסי מים על השינויים‬
‫הנגרמים מחשיפה לטריגליצרידים‪ .‬כפי שניתן לראות )איור ‪ NAC ,(16 A,B‬הפחית את הירידה בסינטזת‬
‫ה‪ mRNA-‬של ‪ eNOS‬ו‪ iNOS-‬הנגרמת כתוצאה מחשיפה לטריגליצרידים‪ .‬בנוסף לכך ‪ NAC‬מנע את‬
‫הירידות ברמת החלבון של ‪ eNOS‬ו‪) iNOS-‬איור ‪.(1 6C,D‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪emulsion +NAC NAC‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪+NAC NAC‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪NAC‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪emulsion +NAC NAC‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪Control emulsion‬‬
‫‪NAC‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪iNOS‬‬
‫‪actin‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪emulsion +NAC NAC‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪eNOS‬‬
‫‪actin‬‬
‫איור ‪ - 16‬רמות חלבון ו‪ mRNA-‬של ‪ i/eNOS‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים ו‪ .NAC-‬התאים הודגרו עם‬
‫טריגליצרידים ו‪ (3mM) NAC-‬למשך ‪ 48‬שעות‪ .‬רמות ‪ mRNA‬של ‪ .B eNOS .A‬ו‪ iNOS-‬שנבדקו ב‪ .PCR-‬ורמות‬
‫התבטאות החלבון של ‪ .D eNOS .C‬ו‪ iNOS-‬שנבדקו ב‪ .Western blot-‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪, p<0.05‬‬
‫‪.n=3‬‬
‫‪54‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על יצור ‪ NO‬מושרה על ידי ‪TNF α‬‬
‫הירידה ברמת ביטוי ‪ iNOS‬לאחר חשיפה לטריגליצרידים‪ ,‬הביאה אותנו לבחון את ההשפעה של‬
‫טריגליצרידים )‪ (0.1%‬על אינדוקצית יצירת ‪ NO‬על ידי ‪ .TNF α‬לאחר אינקובציה של התאים בנוכחות‬
‫או בהעדר טריגליצרידים למשך ‪ 48‬שעות‪ ,‬התאים נשטפו והודגרו עם ‪ TNF α‬למשך ‪ 12‬שעות‪ .‬הבדל‬
‫מובהק ברמות הניטריטים במדיום נמצא‬
‫לאחר הדגרה עם ‪ TNF α‬למשך ‪ 9‬ו‪12-‬‬
‫שעות‪ .‬הטריגליצרידים הורידו את יצור‬
‫הניטריטים באופן משמעותי ב‪ 26%-‬ו‪-‬‬
‫‪ 38%‬בהתאמה )איור ‪.(17‬‬
‫איור ‪ - 17‬השפעת ‪ TNF α‬על יצור ניטריק אוקסיד בתאי כבד ראשוניים‬
‫מכבד חולדה לאחר חשיפה לטריגליצרידים‪ .‬רמות ניטריטים שהצטברו‬
‫במדיום הגידול במשך ‪ 3,6,9,12‬שעות של הדגרה עם ‪ TNF α‬לאחר פרה‪-‬‬
‫אינקובציה של ‪ 48‬שעות עם טריגליצרידים נבדקו בריאקצית ‪. n=3 .Griess‬‬
‫‪ AP1‬ו‪ NFkB-‬הם גורמי שעתוק‬
‫היכולים להקשר באזור הפרומוטור של הגנים של ‪ eNOS‬ו‪ iNOS-‬והם ידועים כמושפעים ממתח‬
‫חימצוני‪ .‬טריגליצרידים )‪ (0.1%‬גרמו לירידה של ‪ 15%‬ברמות ה‪ NFkB-‬בגרעין )איור ‪ ,(18 A‬אולם‬
‫לא השפיעו על המעבר של ‪ AP1‬לגרעין )איור ‪.(18B‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪Control‬‬
‫איור ‪ - 18‬רמות חלבון ‪ AP1‬ו‪ NFkB-‬במיצוי חלבוני גרעין לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‪ .‬התאים הודגרו עם‬
‫טריגליצרידים למשך ‪ 48‬שעות‪ .‬רמות התבטאות החלבון של ‪ (A) NFkB‬ו‪ (B) AP1-‬כפי שנבדקו ב‪Western blot-‬‬
‫בפרקציה גרעינית‪ ,‬רמות ביטוי גורמי השעתוק נורמלו לכמות החלבון הכללית בגרעין‪.n=3, *p<0.05 .‬‬
‫‪55‬‬
‫השפעה של חשיפת תאי ‪ FaO‬לטריגליצרידים‬
‫כניסת טריגליצרידים לתוך תאי ‪FaO‬‬
‫כניסת טריגליצרידים לתוך תאי ‪ FaO‬נבדקה על ידי צביעה ב‪ nile red-‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‬
‫)‪ (0.1%‬למשך ‪ 24‬ו‪ 48-‬שעות‪ .‬בהשוואה לתאים אשר לא טופלו בטריגליצרידים‪ ,‬תכולת השומן על תה‬
‫כתלות בזמן האינקובציה עם טריגליצרידים עד ל‪ 48-‬שעות )איור ‪.(19 A,B‬‬
‫את כניסת הטריגליצרידים לתאים ניתן גם לראות בצילומי התאים אשר נצבעו ב‪) nile red-‬איור ‪.(19C‬‬
‫איור ‪ - 19‬הצטברות שומן בתאי ‪ FaO‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‪ A .‬היסטוגרמת ‪ FCAS‬לאחר הדגרה לזמנים שונים עם‬
‫טריגליצרידים וצביעה עם ‪ .B .nile red‬כימות תוצאות ‪ FCAS‬לאחר הדגרה לזמנים שונים עם טריגליצרידים וצביעה עם‬
‫‪ .C .nile red‬צילום במיקרוסקופ פלואורסנטי )הגדלה ‪ (x100‬לאחר הדגרה למשך ‪ 24‬שעות עם טריגליצרידים וצביעה עם‬
‫‪ .nile red‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫‪56‬‬
‫על מנת לבדוק האם השומן נכנס לתאים כטריגליצרידים או כחומצות שומן חופשיות נעשה שימוש ב‪-‬‬
‫‪ ,Paraoxon‬מעכב כללי של ליפאזות‪ .‬תאי ‪ FaO‬הראו עלייה בשומן התאי לאחר ‪ 6‬שעות חשיפה‬
‫לטריגליצרידים ולאחר ‪ 6‬שעות חשיפה לפראוקוסון‪ .‬חשיפה לפראוקוסון וטריגליצרידים יחד גרמה‬
‫להשפעה מצטברת ברמת השומן התוך תאית )איור ‪.(20 A,B‬‬
‫איור ‪ - 20‬אפיון כניסת השומן לתאי ‪ .FaO‬התאים הודגרו עם טריגליצרידים ו‪ paraoxon-‬ל‪ 6-‬שעות‪ A .‬היסטוגרמת ‪ FCAS‬לאחר‬
‫הדגרה עם טריגליצרידים ו‪ paraoxon-‬וצביעה עם ‪ .B .nile red‬כימות תוצאות ‪ FCAS‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים ו‪paraoxon -‬‬
‫וצביעה עם ‪ .nile red‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על חיות התאים ויצירת‬
‫‪A‬‬
‫נגזרות חמצן פעילות‬
‫על מנת להעריך את השפעת השומן על חיות‬
‫התאים‪ ,‬תאי ‪ FAO‬הודגרו עם קלצאין‪ ,‬חומר‬
‫ההופך לפלואורסנטי כתוצאה מפעילות אנזימתית‬
‫‪B‬‬
‫בתאים חיים‪ .‬הדגרה עם שומן גרמה למות התאים‬
‫כפונקציה של זמן החשיפה‪ .‬שיעורי התמותה עמדו‬
‫על ‪ 30%‬ו‪ 70%-‬לאחר ‪ 12‬ו‪ 24 -‬שעות‪,‬‬
‫בהתאמה )איור ‪.(21‬‬
‫איור ‪ - 21‬השפעת טריגליצרידים על חיות תאי ‪ .FaO‬התאים‬
‫הודגרו עם טריגליצרידים למשך פרקי זמן שונים‪ .A .‬כימות‬
‫תוצאות ‪ FCAS‬לאחר הדגרה עם שומן )‪ (TG 0.1%‬לזמנים‬
‫שונים וצביעה עם קלצאין‪ .‬היסטוגרמות ‪ FCAS‬לאחר הדגרה‬
‫בהעדר )‪ (B‬או בנוכחות )‪ (C‬טריגליצרידים וצביעה עם קלצאין‬
‫‪.n=3‬‬
‫‪57‬‬
‫‪C‬‬
‫במות התאים ניתן להבחין גם בצילום של תאים‬
‫שהודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 24‬שעות וצולמו‬
‫לאחר אינקובציה עם קלצאין‪ .‬ניתן להבחין במוות‬
‫כמעט מלא של כל התאים בתרבית )איור ‪.(22‬‬
‫בשיטה דומה לבדיקת החיות נבדקו רמות נגזרות חמצן‬
‫פעילות בתוך התאים עם הסנסור הפלואורסנטי ‪.DCF‬‬
‫לאחר חשיפה לטריגליצרידים ישנה עליה ברמות‬
‫נגזרות חמצן פעילות כפי שנמדדו ב‪ .FACS-‬העלייה‬
‫איור ‪ – 22‬חיות תאי ‪ FaO‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‪ .‬התאים‬
‫הודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 24‬שעות‪ ,‬נצבעו עם קלצאין וצולמו‬
‫במיקרוסקופ פלואורסנטי )הגדלה ‪.(x100‬‬
‫מגיעה לשיא לאחר ‪ 6‬שעות )איור ‪ (21‬ומקדימה את‬
‫תהליכי המוות‪ .‬ניתן לראות את העלייה בנגזרות החמצן‬
‫הפעילות ‪ 6‬שעות לאחר ההדגרה עם הטריגליצרידים‬
‫כפי שנצפתה במיקרוסקופ )איור ‪.(23‬‬
‫איור ‪ - 23‬יצור נגזרות חמצן פעילות בתאי ‪ FaO‬לאחר הדגרה עם‬
‫טריגליצרידים‪ .‬התאים הודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 6‬שעות‪.‬‬
‫התאים נצבעו עם ‪ DCF‬וצולמו במיקרוסקופ פלואורסנטי )הגדלה‬
‫‪.(x100‬‬
‫‪58‬‬
‫הדגרת התאים עם אנטיאוקסידנטים שונים מנעה באופן חלקי או מלא את מות התאים שנגרם מהחשיפה‬
‫לטריגליצרידים )איור ‪.(24‬‬
‫איור ‪ - 24‬השפעת אנטיאוקסידנטים על מות תאי ‪ FaO‬הנגרם על ידי טריגליצרידים‪ .‬התאים הודגרו עם‬
‫טריגליצרידים ואנטיאוקסידנטים‪ .A .‬כימות תוצאות ‪ FCAS‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים בשילוב עם‬
‫אנטיאוקסידנטים וצביעה עם קלצאין‪ .‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫על מנת למצוא את המקור ליצור המוגבר‬
‫של נגזרות חמצן הפעילות שנצפה‬
‫כתוצאה‬
‫מהדגרה עם טריגליצרידים‬
‫)‪ ,(0.1%‬נבדקה ההשפעה של ‪DPI‬‬
‫)מעכב‬
‫של‬
‫פלבו‪-‬אנזימים‬
‫הדורשים‬
‫‪ NADH‬או ‪ NADPH‬לפעילותם(‪.‬‬
‫בבדיקת רמת נגזרות החמצן הפעילות בתוך‬
‫התא על ידי ‪ ,FACS‬נמצא כי ‪ DPI‬ביטל‬
‫איור ‪ - 25‬השפעת ‪ DPI‬על יצור נגזרות חמצן פעילות הנגרם על ידי‬
‫טריגליצרידים‪ .‬כימות תוצאות ‪ FCAS‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‬
‫בשילוב עם ‪ DPI‬וצביעה עם ‪.n=3, *p<0.05 .DCF‬‬
‫את יצור נגזרות החמצן הפעילות שנוצרו עקב חשיפה לטריגליצרידים )איור ‪.(25‬‬
‫‪59‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על המאזן האנרגטי‬
‫לאחר חשיפה לטריגליצרידים נבדקו רמות ‪.ATP‬‬
‫נמצא‪ ,‬כי טריגליצרידים )‪ (0.1%‬גרמו לירידה ביצור‬
‫‪ ATP‬לאחר ‪ 6‬שעות חשיפה של תאי ‪ .FaO‬כביקורת‬
‫שימש ‪ ,oligomycin‬אנטיביוטיקה המעכבת את מעבר‬
‫הפרוטונים במיטוכונדריה )‪.(109‬‬
‫‪Oligomycin‬‬
‫הירידה ברמות התוך תאיות של ה‪ ,ATP-‬שנבעה‬
‫מחשיפה‬
‫לטריגליצרידים‪,‬‬
‫נמנעה‬
‫על‬
‫‪NAC+‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪NAC‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪pAMPK‬‬
‫‪actin‬‬
‫‪pAMPK‬‬
‫‪actin‬‬
‫ידי‬
‫האנטיאוקסידנט ‪ .NAC‬בתאים אשר הודגרו עם‬
‫טריגליצרידים בשילוב עם ‪ NAC‬רמות ה‪ATP-‬‬
‫שנמדדו אף היו גבוהות יותר מאשר בתאים אשר לא‬
‫נחשפו לטריגליצרידים )איור ‪.(26A‬‬
‫רמות הסנסור האנרגטי ‪ pAMPK‬נבדקו אף הן ונמצא‬
‫איור ‪ - 26‬השפעת שומן ו‪ NAC-‬על המאזן האנרגטי בתאי ‪ .A .FaO‬רמות‬
‫‪ ATP‬בתאי ‪ FaO‬כפי שנבדקו ב‪ oligomycin ) luciferase assay-‬שימש‬
‫כביקורת שלילית לייצור ‪ .B .(ATP‬זרחון ‪ AMPK‬נבדק ב‪western blot-‬‬
‫התוצאות נורמלו לביטוי החלבון ‪ oligomycin ) actin‬שימש כביקורת‬
‫חיובית(‪ .‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫כי חלה עליה ברמתו כתוצאה מחשיפה לטריגליצרידים‬
‫לאחר הדגרה של ‪ 6‬שעות‪ .‬תוספת של ‪ NAC‬בשילוב‬
‫עם‬
‫טריגליצרידים‬
‫מיתנה‬
‫את‬
‫ההשפעה‬
‫של‬
‫הטריגליצרידים על זרחון ‪) AMPK‬איור ‪.(26 B‬‬
‫בניגוד להשפעת טריגליצרידים על תאי ‪ ,FaO‬חשיפה‬
‫של תרביות ראשוניות של תאי כבד לטריגליצרידים‬
‫העלתה את יצור ה‪ .ATP-‬הוספת ‪ NAC‬גרמה לנטייה‬
‫לעליה ברמות ה‪ ATP-‬מעל לרמתם בתאים אשר לא‬
‫נחשפו לטריגליצרידים‪ .‬טיפול משולב של ‪NAC‬‬
‫איור ‪ - 27‬השפעת טריגליצרידים ו‪ NAC-‬על המאזן האנרגתי בתאי כבד‬
‫ראשוניים‪ .A .‬רמות ‪ ATP‬בתרביות ראשוניות של תאי כבד נבדקה ב‪-‬‬
‫‪ oligomycin) luciferase assay‬שימש כביקורת שלילית(‪ .‬אותיות שונות‬
‫מצינות הבדל מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫וטריגליצרידים העלה את יצור ה‪ ATP-‬באופן מובהק מעל רמות ה‪ ATP-‬בתאים אשר לא נחשפו‬
‫לטריגליצרידים )איור ‪.(27‬‬
‫‪60‬‬
‫‪ Etomoxir‬הינו חומר המעכב את‬
‫‪(carnitinepalmitoyltransferase 1 ) CPT1‬‬
‫ומונע את ניצול חומצות השומן לצרכים‬
‫אנרגטיים‪ .‬אמנם ‪ Etomoxir‬גרם למות‬
‫התאים בפני עצמו‪ ,‬אך הדגרה של התאים‬
‫עם ‪ Etomoxir‬יחד עם טריגליצרידים‬
‫מנעה חלקית את השפעת הטריגליצרידים‬
‫על חיות התאים )איור ‪.(28‬‬
‫סוג‬
‫המוות‬
‫הנגרם‬
‫איור ‪ - 28‬השפעת ‪ Etomoxir‬על מות תאי ‪ FaO‬הנגרם על ידי טריגליצרידים‪.‬‬
‫התאים הודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 24‬שעות אותיות שונות מצינות הבדל‬
‫מובהק ‪.n=3, p<0.05‬‬
‫מחשיפה‬
‫לטריגליצרידים‬
‫על מנת לקבוע את סוג המוות התאי‬
‫הנגרם כתוצאה מחשיפה לטריגליצרידים‬
‫נבדקו שני סוגי מוות‪ :‬מוות אפופטוטי‬
‫ומוות נקרוטי‪ .‬שני פרמטרים שימשו‬
‫לבחינת השאלה האם סוג המוות הוא‬
‫אפופטוטי‪.‬‬
‫הראשון‬
‫מביניהם‬
‫הוא‬
‫פרגמנטציה של ‪ .DNA‬פרגמנטציה של‬
‫‪ DNA‬הינה אירוע המתרחש במקביל‬
‫למות התאים בתהליך אפופטוטי‪ .‬לא‬
‫ניתן להבחין בעלייה בפרגמנטציה של‬
‫‪ DNA‬ב‪ 24-‬השעות הראשונות של‬
‫איור ‪ - 29‬אפיון סוג מות תאי ‪ FaO‬הנגרם על ידי טריגליצרידים‪ .‬התאים‬
‫הודגרו עם טריגליצרידים לזמנים שונים‪ .A .‬לאחר חשיפה לטריגליצרידים‬
‫התאים קובעו עם פורמאלדהיד ונצבעו עם ‪ propidium iodide‬התוצאה‬
‫מוצגת כהיסטוגרמה‪ .B .‬פעילות ‪ caspase3‬נבדקה בתאים שהודגרו עם‬
‫טריגליצרידים למשך זמנים שונים‪.n=3 ,‬‬
‫החשיפה לטריגליצרידים‪ ,‬אולם לאחר ‪ 48‬שעות חשיפה החלה להופיע הפרגמנטציה )איור ‪.(29 A‬‬
‫הפרמטר השני שנבחן הוא פעילות ‪ .caspase3‬הפעלה של ‪ caspase3‬מתרחשת לפני המוות בתהליכים‬
‫של מוות אפופטוטי‪ .‬לא חל שינוי בהפעלת ‪ caspase3‬במשך ‪ 24‬השעות הראשונות של חשיפה‬
‫לטריגליצרידים )איור ‪.(29 B‬‬
‫‪61‬‬
‫מכיוון שהפרמטרים המעידים על מוות אפופטוטי הראו תוצאה שלילית נבדק האם סוג המוות הוא נקרוטי‪.‬‬
‫‪ HMGB1‬הוא גורם שעתוק אשר מופרש מחוץ לתא ופועל כציטוקין לפני תהליך של מוות נקרוטי‪ .‬כפי‬
‫שניתן לראות‪ ,‬לאחר חשיפת התאים לטריגליצרידים למשך ‪ 6‬שעות חלה ירידה ברמות ‪ HMGB1‬התוך‬
‫תאיות )איור ‪.(30‬‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪emulsion‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪HMGB1‬‬
‫‪actin‬‬
‫איור ‪ - 30‬רמות ‪ HMGB1‬בתאי ‪ FaO‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‪ .‬התאים‬
‫הודגרו עם טריגליצרידים למשך ‪ 6‬שעות ורמות ביטוי החלבון ‪ HMGB1‬נבדקו ב‪-‬‬
‫‪.n=3, *p<0.05 .Western blot‬‬
‫‪62‬‬
‫חשיפה ‪ in vivo‬לטריגליצרידים‬
‫צריכת מזון‪ ,‬פרופיל שומנים בדם‪ ,‬והצטברות שומן בכבד‬
‫חולדות אשר הוזנו בהזנה תוך ורידית של‬
‫אמולסית שומן‪ ,‬צרכו כמות מזון קטנה‬
‫טבלה ‪ - 2‬צריכת מזון ‪ g/day‬בחולדות אשר קיבלו הזנה תוך ורידית‪.‬‬
‫ממוצע צריכת המזון מהיום הרביעי ועד היום השישי המספרים‬
‫בסוגריים מציינים שגיאות תקן‪n=5 .‬‬
‫)‪Food consumption (g/day‬‬
‫יותר באופן משמעותי לעומת חולדות‬
‫הביקורת )טבלה ‪.(2‬‬
‫)‪21.9 (2.9‬‬
‫‪Control‬‬
‫)‪12.3(1.3‬‬
‫)‪Lipid emulsion (6 days‬‬
‫בנוסף לשינויים בצריכת המזון חלה גם עלייה ברמות הכולסטרול וברמות הטריגליצרידים בדם‪ ,‬לאחר ‪6‬‬
‫ימים של מתן הזנה תוך ורידית של אמולסית השומן‪.‬‬
‫טבלה ‪ - 3‬פרופיל השומנים בדם של חיות אשר הוזנו בהזנה תוך ורידית במשך ‪6‬‬
‫ימים‪ .‬החיות הוקרבו ביום השישי ונבדקו רמות הטריגליצרידים והכולסטרול בסרום‪.‬‬
‫המספרים בסוגריים מציינים שגיאות תקן ‪.n=5 * p<0.05‬‬
‫‪TG‬‬
‫‪Cholesterol‬‬
‫)‪(mg/dl‬‬
‫)‪(mg/dl‬‬
‫*)‪33.7 (4.4‬‬
‫)‪53.7 (1.7‬‬
‫*)‪920 (145‬‬
‫)‪96 (1.2‬‬
‫‪Control‬‬
‫)‪Lipid emulsion (6 days‬‬
‫בבחינה של חתכים היסטולוגים אשר נצבעו בצביעת ‪ H&E‬ופוענחו על ידי פתולוג מומחה ניתן לראות‬
‫את הנזק אשר נגרם לכבד לאחר הזנה של ‪ 6‬ימים באמולסית השומן )איור ‪ .(31A,B‬הנזק בכבד לווה‬
‫בהפחתה בכמות כלי הדם‪ ,‬הופעת אזורים קטנים של נקרוזיס ועלייה בפעילות תאי קופפר‪ ,‬כפי שהעלתה‬
‫בדיקת הפתולוג‪ .‬בנוסף חלה עלייה בכמות הואקואלות בציטופלסמה של תא י הכבד ובגודל הואקואלות‬
‫)‪ .(10µm-4µm‬בצביעה כפולה של החתכים עם ‪ Nile red‬ו‪ DAPI-‬ניתן לראות כי הואקואלות מכילות‬
‫שומן‪ .‬באיור ‪ 31D-G‬נראית העלייה בתכולת השומן בתאי הכבד‪ ,‬כפונקציה של זמן מתן אמולסית‬
‫השומן‪ ,‬זאת בהשוואה לחיות הבקרה )איור ‪.(31C‬‬
‫‪63‬‬
‫איור ‪ - 31‬חתכי כבד של חולדות אשר הוזנו בהזנה תוך ורידית במשך תקופה של עד ‪ 6‬ימים‪ (A,B) .‬צביעת ‪ H&E‬של‬
‫חתכי כבד מייצגים של חולדות אשר הוזנו בהזנה תוך ורידית ל‪ 6-‬ימים‪ (C-G) .‬חתכי כבד מייצגים של חולדות אשר הוזנו‬
‫בהזנה תוך ורידית ל‪ 1,2,4,6-‬ימים‪ ,‬נצבעו עם ‪ DAPI‬לצביעת גרעינים ועם ‪ nile red‬לצביעת השומן וצולמו במיקרוסקופ‬
‫)הגדלה ‪.(x100‬‬
‫‪64‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מתח חמצוני בכבד‬
‫‪ 4HNE‬הינו אינדיקטור לרמת חמצון‬
‫השומנים ברקמה‪ ,‬המזהה חומצות שומן‬
‫שקשורות‬
‫לחלבונים‬
‫ועברו‬
‫תהליכי‬
‫חמצון‪ .‬ניתן להבחין בעלייה משמעותית‬
‫ברמתו של ‪ 4HNE‬בכבד של חיות אשר‬
‫הוזנו תוך ורידית באמולסית שומן‬
‫בהשוואה לחיות הבקרה )איור ‪.(32‬‬
‫איור ‪ - 32‬רמות ‪ 4HNE‬בכבד חולדות אשר הוזנו בהזנה תוך‬
‫ורידית‪ .‬החיות הוזנו למשך ‪ 6‬ימים עם ‪ PBS‬או אמולסית שומן‬
‫ורמות ‪ 4HNE‬נבדקו ב‪.n=7 ,*p<0.05 .Western blot-‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪NO‬‬
‫רק לאחר ‪ 4‬ימים של הזנה תוך ורידית‬
‫‪Day 6‬‬
‫‪Day4‬‬
‫‪Day2‬‬
‫‪Day‬‬
‫‪1‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪eNOS‬‬
‫‪actin‬‬
‫באמולסית שומן‪ ,‬ניתן להבחין בירידה של‬
‫‪ 35%‬בביטוי של ‪ eNOS‬שהתעצמה‬
‫לאחר ‪ 6‬ימים )‪) (55%‬איור ‪.(33‬‬
‫איור ‪ - 33‬רמות החלבון ‪ eNOS‬בכבד חולדות אשר הוזנו בהזנה תוך ורידית‪ .‬החיות‬
‫הוזנו ל‪ 6-‬ימים עם ‪ PBS‬או אמולסית שומן ורמות החלבון ‪ eNOS‬נבדקו ב‪-‬‬
‫‪ *p<0.05 .Western blot‬ימים ‪ ,n=3 1,2‬יום ‪ , n=4 4‬יום ‪ 6‬וביקורת ‪ .n=7‬אותיות‬
‫שונות מצינות הבדל מובהק ‪.p<0.05‬‬
‫‪65‬‬
‫הירידה ברמות החלבון של‬
‫‪ eNOS‬לוותה בירידה ברמות‬
‫‪120‬‬
‫‪a‬‬
‫‪a‬‬
‫ה‪ mRNA-‬של ‪ eNOS‬לאחר ‪6‬‬
‫‪100‬‬
‫‪a‬‬
‫ימי הזנה תוך ורידית באמולסית‬
‫שומן‬
‫ומגמה‬
‫לירידה‬
‫ביום‬
‫‪eNOS/gapdh mRNA‬‬
‫‪precent of control‬‬
‫‪80‬‬
‫‪60‬‬
‫‪b‬‬
‫‪40‬‬
‫הרביעי )איור ‪.(34‬‬
‫‪20‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Day 6‬‬
‫‪Day 4‬‬
‫‪Day 2‬‬
‫‪Control‬‬
‫איור ‪ - 34‬רמות ‪ mRNA eNOS‬בכבד חולדות אשר הוזנו בהזנה תוך‬
‫ורידית‪ .‬החיות הוזנו ל‪ 6-‬ימים עם ‪ PBS‬או אמולסית שומן ורמות ‪eNOS‬‬
‫‪mRNA‬נבדקו ב‪ *p<0.05 .Rt pcr-‬יום ‪ ,n=3 2‬יום ‪ , n=4 4‬יום ‪ 6‬וביקורת‬
‫‪ .n=7‬אותיות שונות מצינות הבדל מובהק ‪.p<0.05‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על המאזן‬
‫‪Lipid‬‬
‫‪Control emulsion‬‬
‫‪P-AMPK‬‬
‫האנרגטי‬
‫‪AMPK‬‬
‫לאחר ‪ 6‬ימים של מתן טריגליצרידים‬
‫נצפתה ירידה משמעותית בזרחון ‪AMPK‬‬
‫)איור ‪ ,(35‬תופעה המעידה על עלייה במאזן‬
‫האנרגטי בתאי הכבד‪.‬‬
‫איור ‪ - 35‬המאזן האנרגטי של הכבד בחיות שהוזנו בהזנה תוך‬
‫ורידית‪ .‬החיות הוזנו במשך ‪ 6‬ימים עם ‪ PBS‬או אמולסית שומן‬
‫ורמות הזרחון של ‪ AMPK‬נבדק ב‪ western blot-‬התוצאות‬
‫מבוטאות כחלבון מזורחן מתוך חלבון לא מזורחן‪.n=7 ,*p<0.05 .‬‬
‫‪66‬‬
‫דיון‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬בתרביות תאים ראשוניות‬
‫הצטברות שומן בתרביות תאים ראשוניות‬
‫הצטברות השומן במחלת הכבד השומני מובילה לשינויים בפעילות תאי הכבד ואף למוות שלהם‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫שינויים נוספים מתרחשים ברמת האיבר השלם‪ ,‬עלייה בהתנגדות הכבד לזרימת דם המתבטאת ביתר לחץ‬
‫דם בווריד השער )‪ .(110,111) (portal vein‬שינויים ברמת התא כמו‪ :‬מוות תאי )‪ ,(112‬פגיעה‬
‫באיתותים תאיים ) ‪ (113‬ופגיעה בתפקוד המיטוכונדריה )‪ ,(114‬הנצפים בכבד במחלת הכבד השומני‪,‬‬
‫יכולים להיגרם כ תוצאה משינויים במערכת ‪ .NO‬מכיוון שעד כה לא נבדקה ההשפעה הישירה של‬
‫טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬בתאי כבד בחרנו לאפיין השפעות אלו‪.‬‬
‫בחלק הראשון של עבודה זו חקרנו את ההשפעה של טריגליצרידים על ויסות מערכת ‪ .NO‬לצורך כך‬
‫השתמשנו במודל ‪ in vitro‬של תרבית תאים ראשונית של תאי כבד‪ .‬יתרון שיטה זו הוא הדמיון היחסי של‬
‫מודל זה למודל ‪ .in vivo‬חסרונה העיקרי הוא פרק הזמן הקצר יחסית )עד ‪ 48‬שעות( בו אפשר לעבוד עם‬
‫תרביות אלו‪ .‬תכולת השומן של התאים שטופלו בטריגליצרידים הייתה גדולה ב‪ 40%-‬מתאים שלא טופלו‬
‫בטריגליצרידים‪ ,‬עם עלייה משמעותית בחומצות השומן‪ .18:2 ,18:1 ,18:0 ,16:0 :‬יחד עם זאת לא‬
‫נמצאו במדיום הגידול חומצות שומן חופשיות‪ ,‬עובדה המעידה על כך שהתאים לא נחשפו לחומצות שומן‬
‫חופשיות אלא לטריגליצרידים שלמים‪ .‬אף על פי כן‪ ,‬יתכן כי האפקט של השומן נגרם כתוצאה מניצול‬
‫חומצות שומן חופשיות בתוך התאים כפי שידוע בספרות ) ‪.(115‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪NO‬‬
‫בגלל זמן מחצית החיים הקצר של מולקולת ה‪ NO-‬קשה למדוד את ריכוזה ישירות‪ .‬לכן‪ ,‬כדי לגלות‬
‫שינויי ביצור ‪ NO‬נבדקות רמות הניטריטים‪ ,‬תוצר הפירוק היציב של מולקולת ‪ ,(116 ) NO‬המצטברים‬
‫במדיום הגידול‪ .‬תוצר נוסף של פירוק ‪ NO‬הוא ניטרט‪ ,‬אך מחיזורו לניטריט ובדיקתו בריאקצית ‪Griess‬‬
‫נמצא כי כמותו קטנה יחסית לכמות הניטיריט והיחס בינו לבין הניטריט לא הושפע מהטיפולים השונים‪.‬‬
‫‪67‬‬
‫יצור ‪ NO‬עלול להיות מושפע מתהליך הפקת תרביות התאים‪ ,‬מאחר והוא מושפע ממתח גזירה ) ‪shear‬‬
‫‪ ,(stress‬אך השפעה זו מתוארת רק בטווח הזמן הקצר )‪ .(117‬התוצאות שמדווחות בעבודה זו מראות כי‬
‫רמות הניטריטים במדיום הגידול‪ ,‬יורדות לאחר חשיפת תרבית תאים ראשונית של תאי כבד‬
‫לטריגליצרידים באופן תלוי ריכוז‪ .‬למיטב ידיעתנו‪ ,‬דיווח זה הוא הדיווח הראשון בו מתואר ויסות יצור‬
‫‪ NO‬על ידי טריגליצרידים בתאי כבד‪ .‬מחקר שבוצע על ידי ‪ Steinberg et al‬הראה כי רמות ניטריטים‬
‫בדם ירדו לאחר אינפוזיה של אמולסית שומן )‪ .(111‬מחקר תומך חלקית‪ ,‬אם כי נסיבתית‪ ,‬בתוצאות‬
‫שתיארנו‪ .‬בהמשך לתוצאה זו של ירידה ביצור ‪ ,NO‬נבדק המנגנון דרכו התרחשה ירידה זו ונבדק ביטוי‬
‫האנזימים המייצרים ‪ NO‬בתאי כבד‪ .‬חלה ירידה ברמות ‪ mRNA‬של שני האיזופורמים ‪ eNOS‬ו‪.iNOS-‬‬
‫ירידה זו לוותה בירידה ברמות החלבון של שני איזופורמים אלו‪ .‬תוצאות אלו מראות כי הירידה ביצור‬
‫‪ NO‬נגרמה כתוצאה מהשפעה של טריגליצרידים על שעתוק אנזימי ‪ .NOS‬אין עדויות בספרות המדעית‬
‫על השפעת חומצות שומן חופשיות או טריגליצרידים על מערכת ‪ .NO‬במחקר בו הוזנו חולדות בדיאטה‬
‫עשירה בשומן )‪ (118‬דווח כי חלה עלייה בשעתוק ‪ .iNOS‬למרות ש תוצאה זו נראית כעומדת בסתירה‬
‫לממצאים בעבודה זו‪ ,‬נראה שהשפע ת הדיאטה נבעה מהשפעת הכולסטרול‪ .‬במודל תאים נמצא כי‬
‫כולסטרול עצמו גורם לעלייה במערכת ‪ .(118 ) NO‬לעומת זאת במחקר אשר נערך בבני אדם נמצא כי‬
‫אמולסית שומן הפחיתה את רמות הניטריטים בדם )‪ .(111‬עובדה זו תומכת באופן עקיף במנגנון אותו אנו‬
‫מציעים‪ ,‬זאת לאור העובדה כי במודל בו השתמשנו השפעת הטריגליצרידים מבודדת מהשפעת‬
‫הכולסטרול‪.‬‬
‫אף על פי ששני האיזופורמים מושפעים מהחשיפה לטריגליצרידים‪ eNOS ,‬הינו האיזופורם בעל‬
‫החשיבות הגדולה יותר מכיוון שהוא אחראי על יצירת ‪ NO‬ברמה הבזלית )חשיבותו של ויסות ‪iNOS‬‬
‫תוזכר בהמשך(‪.‬‬
‫החשיפה לטריגליצרידים גרמה לעלייה ברמות התוך תאיות של נגזרות חמצן פעילות בתרבית הראשונית‬
‫של תאי הכבד‪ .‬תוצאות דומות דווחו בתאי אנדותל )‪ (75‬ובניסוים ‪ in vivo‬בהם דווח על ירידה ברמות‬
‫הניטריטים בדם )‪ .(76‬העלייה ברמות נגזרות חמצן פעילות לאחר חשיפה לטריגליצרידים הייתה תלוית‬
‫ריכוז )‪ (r=0.9‬ובהתאמה הפוכה לרמות ‪) (r=-0.9) NO‬איור ‪ .(10‬מכאן יתכן כי לרמות נגזרות החמצן‬
‫‪68‬‬
‫הפעילות תפקיד בויסות מערכת ‪ .NO‬תוצאות אלו נמצאו בהתאמה עם תוצאות שנצפו בבני אדם בהם‬
‫מתן אמולסית שומן לדם גרמה לעלית המתח החמצוני בדם במקביל לירידה ברמות הניטריטים )‪.(76‬‬
‫יתכן והעלייה ביצור נגזרות חמצן פעילות נובעת מהפרת צימוד פעילות האנזים ‪ ,NOS‬וכתוצאה מכך‬
‫יצירה מוגברת של רדיקלים והפחתה ביצור ‪ .NO‬ישנם מחקרים המצביעים על קיומיו של איזופורם‬
‫‪ NOS‬מיטוכונדריאלי )‪ ,(mtNOS‬העשוי להיות מעורב ביצור נגזרות חמצן פעילות‪ ,‬אם כי קיומו עדיין‬
‫שנוי במחלוקת )‪.(119‬‬
‫על מנת לתמוך בממצאינו הראנו כי מתן ‪) Rotenone‬מעכב מיטוכונדריה(‪ ,‬בריכוז שלא פגע בחיות‬
‫התאים אך גרם ליצור מוגבר של רדיקלים‪ ,‬פגע גם ביצור ‪ .NO‬פן נוסף של העלייה שנצפתה ברמות‬
‫התוך תאיות של נגזרות החמצן הפעילות הוא הירידה בגלוטטיון שנלוותה לעליה זו‪ .‬על מנת להמשיך‬
‫ולבסס את הקשר בין רמות נגזרות חמצן פעילות ליצור ‪ NO‬חשפנו את התאים ל‪ ,BSO-‬חומר המעכב‬
‫את יצירת גלוטטיון‪ BSO .‬נמצא בעל השפעות דומות לאלו של טריגליצרידים‪ ,‬כלומר העלה את רמות‬
‫נגזרות החמצן הפעילות בתא ועיכב את יצירת ‪ .NO‬גלוטטיון יכול להגביר יצור ‪ NO‬על ידי שמירת‬
‫‪ ,Tetrahydrobiopterin‬קופקטור של ‪ ,NOS‬במצבו המחוזר )‪ .(28‬בנוסף‪ ,‬גלוטטיון עצמו יכול לגרום‬
‫לשעתוק של ‪ (95) iNOS‬ובעבר דווח כי עיכוב סינתזת גלוטטיון מפחיתה את שעתוק ‪ iNOS‬בתאי כבד‬
‫) ‪ .(120,121‬גורמי השעתוק ‪ NFkB‬ו‪ AP1-‬המפעילים את ‪ e\iNOS‬מופעלים אחרי חשיפה של התאים‬
‫לנגזרות חמצן פעילות‪ ,‬אולם על מנת לפעול הם זקוקים לסביבה מחזרת כדי להקשר לרצפי ההכרה ב‪-‬‬
‫‪ .DNA‬יתכן כי הרמות הגבוהות של נגזרות חמצן פעילות המיוצרות כתוצאה מחשיפה לטריגליצרידים‬
‫משרות בתא עקה חמצונית חזקה יותר‪ ,‬וכך גורמות לירידה בסינטזת ‪ NO‬בתרבית התאים הראשונית של‬
‫תאי הכבד‪.‬‬
‫כניסת ‪ AP1‬לגרעין לא הושפעה מהטריגליצרידים‪ ,‬אולם חלה ירידה של ‪ 15%‬ברמתו של ‪NFkB‬‬
‫בגרעין )איור ‪ .(18‬ירידה זו אינה יכולה להסביר את השינויים המשמעותיים בשעתוק של האיזופורמים‬
‫של ‪ .NOS‬מנגנון אפשרי היכול להסביר כיצד טריגליצרידים משפיעים על רמות שעתוק גנים אלו‪ ,‬הוא‬
‫הפרעה בקשירה של גורמי השעתוק בתוך הגרעין‪ .‬יתכן שהשפעה זו מתווכת על ידי שינויים במאזן חמצון‬
‫חיזור תוך גרעיני או על ידי גורם אחר‪ ,‬שעדיין איננו יודעים לזהותו‪ .‬יש לחקור מנגנון זה במערכת‬
‫‪69‬‬
‫ניסויית ‪ in vitro‬בה תיבדק ההשפעה הישירה של רמת חימצון חיזור על קשירת ‪ AP1‬לרצף ההכרה של‬
‫‪.NOS‬‬
‫לאחר שהראנו כי טריגליצרידים העלו את רמות נגזרות החמצן הפעילות סביר היה לבדוק חומרים אשר‬
‫עשויים לנטרל השפעה זו‪ ,‬לדוגמא אנטיאוקסידנטים מסיסי מים ומסיסי שמן‪ .‬כפי שניתן לראות‪,‬‬
‫לאנטיאוקסידנטים מסיסי שמן הייתה השפעה מתונה או כלל לא הייתה השפעה על עיכוב יצירת ‪ NO‬על‬
‫ידי טריגליצרידים )איור ‪ .(14‬לעומת זאת‪ ,‬אנטיאוקסידנטים מסיסי מים מי תנו את השפעת‬
‫הטריגליצרידים על יצור ‪ .NO‬מעניין היה להבחין כי משימוש בתערובת של שלושה אנטיאוקסידנטים‬
‫)‪ (NAC 0.3mM Resveratrol 60 µM vitamin C 0.3mM‬בריכוזים נמוכים יותר התקבל אפקט‬
‫סינרגיסטי ועיכוב מלא של השפעת הטריגליצרידים על יצור ‪) NO‬איור ‪.(15‬‬
‫המשך העבודה היה כרוך בלימוד המנגנונים של אופן השפעת טריגליצרידים ולכן מתוך‬
‫האנטיאוקסידנטים מסיסי המים נבחר ‪ NAC‬כנציג‪ .‬נמצא‪ ,‬כי השינויים ברמות השעתוק והתרגום של‬
‫האנזימים ‪ e\iNOS‬מותנו או נמנעו לחלוטין על ידי מתן ‪ .NAC‬ממצאים אלו תומכים בחשיבות השינוי‬
‫במאזן חמצון חיזור הנגרם כתוצאה מחשיפה לטריגליצרידים כגורם המתווך בפגיעה במערכת ‪.NO‬‬
‫על מנת לבדוק האם ‪ NO‬יכול להשפיע על יצור נגזרות חמצן פעילות‪ ,‬נבדקה ההשפעה של ‪ SNAP‬חומר‬
‫המשחרר ‪ SNAP .NO‬לא שינה את יצור נגזרות החמצן הפעילות בנוכחות או היעדר טריגליצרידים‪.‬‬
‫עובדה זו מרמזת על כך שבמודל זה של תאי כבד‪ ,‬נגזרות חמצן פעילות משפיעות על יצור ‪ ,NO‬אך ‪NO‬‬
‫אינו משפיע על יצורן של נגזרות חמצן פעילות‪ .‬עם זאת‪ ,‬יש לציין כי זמן מחצית החיים של ‪ SNAP‬עומד‬
‫על כ‪ 8-‬שעות בלבד‪ ,‬ויתכן שהעדר ההשפעה של הטיפול על ייצור ‪ ROS‬נובע מכך‪ .‬לכן‪ ,‬על בסיס‬
‫התוצאות המוצגות‪ ,‬לא ניתן לשלול את האפשרות כי ירידה בייצור ‪ NO‬הינה הגורם לעליה בייצור‬
‫נגזרות חמצן פעילות‪.‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על יצור ‪ NO‬המושרה על ידי ‪TNF-α‬‬
‫עד כה נבחנה ההשפעה של טריגליצרידים על היצור הבזלי של ‪ ,NO‬כאשר האנזים החשוב יותר היה‬
‫‪ .eNOS‬ההשלכות האפשריות של תוצאות אלו הן בעלות חשיבות במצב לא דלקתי של הכבד‪ .‬מכיוון‬
‫שבמהלך העבודה אובחנה השפעה של טריגליצרידים גם על האנזים ‪ ,iNOS‬בדקנו גם את ההשפעה של‬
‫טריגליצרידים על יצור ‪ NO‬מושרה על ידי ‪ ,TNF-α‬במצב המחקה דלקת‪.‬‬
‫‪70‬‬
‫נמצא כי חשיפת התאים לטריגליצרידים למשך ‪ 48‬שעות לפני החשיפה ל‪ TNF-α-‬גרמה למיתון‬
‫ההשפעה של ‪ TNF-α‬בתרבית תאי הכבד )איור ‪ .(17‬יצור ‪ NO‬בעקבות ההשריה היה נמוך יותר ‪ 9‬ו‪-‬‬
‫‪ 12‬שעות לאחר השרייה‪ .‬העיכוב של טריגליצרידים על השריית יצור ‪ NO‬מופיע רק לאחר ‪ 9‬שעות‪,‬‬
‫יתכן כי השפעה מאוחרת זו נגרמת עקב פער הזמן מרגע ההשריה ועד לביטוי ‪.iNOS‬‬
‫ההשפעה המעכבת של טריגליצרידים על השריית יצור ‪ NO‬על ידי ‪ ,TNF-α‬יכולה לנבוע מהשינויים‬
‫במאזן חמצון חיזור וברמת גלוטטיון מחוזר‪ .‬אפקט דומה נמצא גם בתאי כבד ראשוניים בהם נמצא כי‬
‫הורדת רמות גלוטטיון עיכבה את השפעת ‪ .TNF-α‬גם בתאי לנגרהנס מהלבלב )‪ (122‬נמצא כי ירידה‬
‫ברמות ‪ GSH‬עיכבה פעילות של ציטוקין אחר ‪ .interleukin-1ß‬יצור ‪ NO‬המושרה במצבי דחק הינו‬
‫בעל פוטנציאל השפעה חיובית בהתמודדות עם קרצינומה של הכבד דרך ההשפעה על חיות התאים‬
‫)‪.(123‬‬
‫מודל השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬בתרביות תאים ראשוניות‬
‫התוצאות שהוצגו עד כה מובילות אותנו להציג את המודל הבא‪ ,‬המסביר את אופן השפעת טריגליצרידים‬
‫על מערכת ‪ NO‬בתאי כבד מבודדים‪.‬‬
‫מובילים‬
‫טריגליצרידים‬
‫לעלייה ביצור נגזרות‬
‫‪Triglycerides‬‬
‫‪Water‬‬
‫‪soluble‬‬
‫‪Antioxidants‬‬
‫חמצן פעילות ולירידה‬
‫ברמות‬
‫הגלוטטיון‬
‫‪TNF-α‬‬
‫המחוזר‪.‬‬
‫במאזן‬
‫‪ROS ↑/ glutathione‬‬
‫‪depletion‬‬
‫שינויים אלו‬
‫חמצון‬
‫חיזור‬
‫↓ ‪eNOS/ iNOS‬‬
‫גורמים לירידה בשעתוק‬
‫ותרגום אנזימי ‪,NOS‬‬
‫המובילים לירידה ביצור‬
‫‪.NO‬‬
‫‪71‬‬
‫↓ ‪NO‬‬
‫הפגיעה במערכת ‪ NO‬ניתנת למניעה על ידי אנטיאוקסידנטים מסיסי מים‪ .‬בנוסף‪ ,‬ניתן להשתמש‬
‫בתערובת של אנטיאוקסידנטים מסיסי מים שונים ולמנוע את השפעת הטריגליצרידים על מערכת ‪NO‬‬
‫בריכוזים אפקטיביים נמוכים יותר של כל אחד מהם‪ NO .‬לא השפיע במודל זה על יצור נגזרות חמצן‬
‫פעילות‪ .‬טריגליצרידים מנעו את יצור ‪ NO‬המושרה על ידי ‪ TNF-α‬כנראה על ידי יכולתם לפגוע‬
‫בשעתוק ‪.iNOS‬‬
‫בספרות המדעית ישנן מספר ראיות נסיבתיות מהן אפשר ללמוד כי ל‪ NO-‬תפקיד חשוב במניעת הנזק‬
‫הנגרם לכבד במקרים של כבד שומני‪ .‬בניסוי במודל של כבד שומני המושרה על ידי כולסטרול מצאו כי‬
‫מתן ‪ L-arginine‬שיפר את מצב הכבד השומני ואילו ‪ L-NAME‬החריף את מצב הכבד )‪ .(124‬גם‬
‫במודל של כבד שומני בחיות אשר הוזנו בהזנה תוך ורידית נצפה שיפור במצב החיות אשר קבלו בנוסף‬
‫להזנה התוך ורידית גם ‪ .(125 ) L-arginine‬מתן אנטיאוקסידנטים נמצא כטיפול יעיל בחלק מהמקרים‬
‫במניעת נזק הנגרם בכבד שומני ) ‪ .(8,126‬יתכן שתועלת טיפול זה נובעת ממניעת השפעת טריגליצרידים‬
‫על מערכת ‪ .NO‬ניסויים אלו מדגימים את חשיבותו של ‪ NO‬בשמירה על הכבד מפני פגיעה במצב של‬
‫כבד שומני‪ .‬לכן‪ ,‬יתכן שהפגיעה אשר נצפתה במחקר זה במערכת ‪ NO‬הינה אחד הגורמים המרכזיים‬
‫בהפיכת כבד שומני ללא נזק למחלת הכבד השומני‪ .‬גם לאיזופורם המושרה ‪ iNOS‬חשיבות במחלת הכבד‬
‫השומני‪ ,‬אם כי לאיזופורם זה חשיבות במצב מתקדם יותר של המחלה‪ .‬חיות ‪ knockout‬ל‪iNOS-‬‬
‫רגישות יותר להתקדמות מכבד שומני דלקתי להצטלקות של הכבד ) ‪.(127‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על חיות תאי כבד‬
‫לימוד יסודי של המנגנונים דרכם משפיעים טריגליצרידים כפי שהראנו בתרביות התאים הראשוניות‪,‬‬
‫הצריך שימוש במודל נוסף‪ .‬בחרנו במודל של קו תאים ‪ FaO‬ממקור קרצינומה של כבד חולדה‪ .‬המודל‬
‫נבחר בגלל היותו ממקור חולדה דבר שאפשר לנו לשמור ככל הניתן על אחידות במודל ובגלל היותו מודל‬
‫מקובל לעבודה עם תאי כבד‪.‬‬
‫‪72‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על חיות תאי הכבד במודל תאי ‪FaO‬‬
‫בחלק זה של במחקר נבדק כיצד חשיפה לטריגליצרידים הובילה למוות של תאי כבד חולדה מקו ‪.FaO‬‬
‫הדגרת התאים עם טריגליצרידים הובילה לעלייה משמעותית בתכולת הטריגליצרידים בכבד‪ .‬בצילום‬
‫במיקרוסקופ אור ניתן לראות את ואקואולות השומן בתוך התאים‪ .‬צורת ההצטברות של השומן בתאים‬
‫דומה לצורת ההצטברות שלו בתאי כבד במקרים של כבד שומני ) ‪ .(128‬כניסת הטריגליצרידים לתאים‬
‫במקרה של הדגרת קו תאי ‪ FaO‬עם טריגליצרידים‪ ,‬נבדקה תוך שימוש ב‪ ,Paraoxon-‬מעכב כללי של‬
‫ליפאזות‪ Paraoxon .‬הגביר את תכולת השומן בתאים‪ ,‬שנמדדה על ידי צביעה עם ‪ .nile red‬עליה זו‬
‫נובעת כתוצאה מעיכוב הליפאזה בתוך התא‪ ,‬הגורם לעיכוב ניצול הטריגליצרידים על ידי התא לצרכים‬
‫אנרגטיים‪ .‬לכן‪ ,‬כאשר התאים נחשפו לטריגליצרידים יחד עם ‪ ,Paraoxon‬העלייה בתכולת השומן בתאים‬
‫הייתה גדולה יותר מהעלייה בנוכחות המעכב בלבד‪ .‬מכיוון שהעלייה בתכולת השומן בנוכחות‬
‫הטריגליצרידים וה‪ Paraoxon-‬הייתה אדטיבית‪ ,‬אנו מסיקים שכניסת הטריגליצרידים לתאים שהתרחשה‬
‫בנוכחות ‪ Paraoxon‬הינה כטריגליצרידים שלמים ללא פירוקם לחומצות שומן חופשיות מחוץ לתא‪.‬‬
‫מוות תאי מושרה על ידי טריגליצרידים‬
‫תאי ‪ FaO‬החלו לבטא מוות בצורה מועטה‪ ,‬לאחר ‪ 12‬שעות‪ ,‬כאשר מוות מסיבי של התאים נמדד לאחר‬
‫‪ 24‬שעות‪ .‬סוג המוות והגורמים אשר מובילים את התאים לתהליכי מוות שנויים במחלוקת ) ‪ .(129‬מספר‬
‫רב של גורמים הוצעו כפקטורים משמעותיים בתהליך ההתקדמות מהצטברות שומן בכבד למצב של מוות‬
‫התאים‪ .‬בין הגורמים האלו נמצאים פגיעה בפעילות המיטוכונדריה )‪ ,(130‬פגיעה כתוצאה מחשיפה ל‪-‬‬
‫‪ ,(131) TNF-α‬ופגיעה במאזן חמצון חיזור ) ‪.(132‬‬
‫בבדיקת השפעה של חשיפת התאים לטריגליצרידים נמצא כי חלה עלייה בריכוזי נגזרות החמצן הפעילות‬
‫לאחר חשיפת התאים לטריגליצרידים‪ .‬השיא בעלייה זו הופיע לאחר ‪ 6‬שעות חשיפה לטריגליצרידים‬
‫)איור ‪ .(21‬עובדה זו מצביעה על העלייה בנגזרות החמצן הפעילות כגורם מקדים אפשרי לתהליכי המוות‪.‬‬
‫עלייה זו ביצור נגזרות חמצן פעילות התרחשה בדומה לתוצאות בתרביות התאים הראשוניות ומדווחת‬
‫בספרות המדעית כנגרמת מחשיפה של תאי כבד לסוגים שונים של מקורות שומן כמו טריגליצרידים‬
‫)‪ ,(133‬חומצות שומן חופשיות )‪ (134,135‬ומלחי מרה )‪.(136‬‬
‫‪73‬‬
‫ניסינו למנוע את מות התאים על ידי שימוש באנטיאוקסידנטים מסיסי מים‪ ,‬אשר הצליחו למנוע את המוות‬
‫של התאים כתוצאה מהחשיפה לטריגליצרידים‪ .‬בנוסף‪ ,‬בדומה לתוצאות ב תרביות התאים הראשוניות‪ ,‬גם‬
‫בתאי ‪ FaO‬הצלחנו למנוע השפעת הטריגליצרידים על ידי שימוש בתערובת האנטיאוקסידנטים אשר‬
‫שימשה בתרביות הראשוניות‪ .‬השימוש בתערובת אנטיאוקסידנטים בריכוזים נמוכים יחסית נותן‬
‫אינדיקציה שתאפשר ניצול הפוטנציאל של אנטיאוקסידנטים אלו כחומרים היכולים למנוע מוות תאי גם‬
‫בכבד שומני‪.‬‬
‫הטיפול בכבד שומני באמצעות אנטיאוקסידנטים הוכח במקרים רבים כיעיל בהורדת רמת אנזימי הכבד‬
‫בדם ומניעת חלק מהשינויים המיוחסים לנזק מכבד שומני במודלים של חיות‪ .‬אולם בסקירה שנערכה על‬
‫ידי ‪ Lirussi et al‬לא הצליחו למצוא הוכחות חד משמעיות להגנה של אנטיאוקסידנטים במקרים של כבד‬
‫שומני )‪ .(126‬יתכן שהבעיה במציאת ההוכחות נובעת מהמספר הקטן יחסית של עבודות שנעשו בתחום‪,‬‬
‫האיכות הנמוכה של שיטות הבדיקה בהם השתמשו‪ ,‬חוסר העקביות בפרמטרים שנבדקו להערכת הנזק‬
‫וחוסר האחידות בסוגי האנטיאוקסידנטים בהם נעשה שימוש )‪.(126‬‬
‫על מנת למצוא את מקור נגזרות החמצן הפעילות הנוצרות כתוצאה מחשיפה לטריגליצרידים ומכיוון‬
‫שהמיטוכונדריה הינה מקור עיקרי ליצירת נגזרות חמצן פעילות בהפטוציטים )‪ ,(137,138‬נבדקה‬
‫ההשפעה של ‪ DPI‬על יצור נגזרות החמצן הפעילות‪ DPI .‬הינו חומר המעכב פלבו‪-‬פרוטאינים ביניהם‬
‫‪ .NAD(P)H Reductases‬עיכוב אנזימים אלו מונע יצור נגזרות חמצן פעילות ממקור מיטוכונדריאלי‬
‫)‪ .(139‬חשיפת תאי ‪ FaO‬לטריגליצרידים הובילה לעלייה ביצור נגזרות חמצן פעילות‪ DPI .‬מנע יצור‬
‫עודף של נגזרות חמצן פעילות לאחר חשיפה לטריגליצרידים‪ ,‬עובדה המרמזת על כך שמקור נגזרות‬
‫החמצן הפעילות הינו מיטוכונדריאלי‪.‬‬
‫בכבד שומני נוצרות כמויות גדולות של נגזרות חמצן פעילות ממקור מיטוכונדריאלי )‪ .(140‬נגזרות חמצן‬
‫פעילות אלו יכולות לגרום לנזק לכבד דרך מנגנונים של נזק חמצוני הפוגע ב‪ DNA-‬ויכול להוביל‬
‫להתפתחות קרצינומה )‪ .(141‬עודף נגזרות החמצן יכול גם לפגוע ביצור ‪ (142) ATP‬ולגרום למוות‬
‫אפופטוטי )‪ ,(143‬נקרוטי )‪ (144‬או אפופטוטי ללא תלות בכספאז )‪ NADPH Oxidase .(145‬הינו‬
‫פלבו‪-‬פרוטאין נוסף הנמצא בתא ומעוכב על ידי ‪ ,DPI‬אך נמצא כלא רלוונטי במחלת כבד שומני ) ‪.(146‬‬
‫‪74‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על המאזן האנרגטי‬
‫עם התקדמותה של מחלת הכבד השומני ישנה פגיעה במיטוכונדריה ויחד איתה פגיעה ביצירת ‪ATP‬‬
‫)‪ .(147‬כאשר נבדקה השפעת טריגליצרידים על יצור ‪ ATP‬נמצא כי החשיפה לטריגליצרידים גרמה‬
‫לפגיעה ביצור ‪) ATP‬איור ‪ .(26‬פגיעה זו התרחשה כבר לאחר ‪ 6‬שעות‪ ,‬במקביל לעלייה בייצור נגזרות‬
‫חמצן פעילות‪ .‬כאשר חושפים את תאי הכבד לטריגליצרידים מספקים למיטוכונדריה יותר סובסטרט‬
‫ליצור אנרגיה‪ .‬פעילות המיטוכונדריה יוצרת נגזרות חמצן פעילות באופן טבעי‪ ,‬כתוצאה מדליפת‬
‫אלקטרונים משרשרת העברת האלקטרונים‪ .‬כאשר יצור האנרגיה מוגבר‪ ,‬עולה במקביל גם יצור נגזרות‬
‫החמצן הפעילות )‪ .(132‬לנגזרות החמצן הפעילות פוטנציאל לפגיעה במיטוכונדריה ובתא ישנן מספר‬
‫מערכות אנטיאוקסידנטיות בכדי להתמודד עם עודף נגזרות החמצן הפעילות )‪ .(61,140,142‬הוספת‬
‫‪ NAC‬לתאים אשר לא נחשפו לטריגליצרידים הוביל למגמת עלייה ביצור ‪ ATP‬לעומת תאים אשר לא‬
‫טופלו ב‪ .NAC-‬ממצא זה מעיד כי יש מקום לשיפור בהגנה האנטיאוקסידנטית גם כאשר אין יצור מוגבר‬
‫של נגזרות חמצן פעילות כתוצאה ממתן עודף סובסטרט למיטוכונדריה‪ .‬מתן אנטיאוקסידנט ים יחד עם‬
‫טריגליצרידים אפשר לתאי הכבד לנצל את עודף הסובסטרט ללא פגיעה במיטוכונדריה כתוצאה מעודף‬
‫נגזרות החמצן הפעילות‪ .‬כתוצאה מכך חלה עלייה משמעותית ביצור ‪ ,ATP‬אף מעבר לתאי הביקורת‪.‬‬
‫כפי שניתן היה לצפות זרחון הסנסור האנרגטי ‪ AMPK‬היה במגמה הפוכה לזו של ‪ ATP‬וחלה עלייה ב‪-‬‬
‫‪ pAMPK‬לאחר הדגרה עם טריגליצרידים‪ .‬עלייה זו מעידה על השינוי במצב האנרגטי של התאים‪.‬‬
‫בתרביות תאים ראשוניות השפעתם של ‪ NAC‬ו‪/‬או טריגליצרידים דומה להשפעה אשר נצפתה בקו תאי‬
‫‪ .FaO‬התוצאה השונה בין שני המודלים הייתה הירידה ביצור ‪ ATP‬שנצפ תה בתאי ‪ ,FaO‬לעומת העלייה‬
‫שנצפתה בתרביות התאים הראשוניות‪ .‬הבדלים אלו יכולים לנבוע משוני בהגנה האנטיאוקסידנטית של‬
‫התאים לפני תחילת הטיפול‪ ,‬שנובעת מההבדל בין שני המודלים‪ .‬נקודה זו הינה בעלת חשיבות רבה ובכדי‬
‫לעמוד על הגורמים להבדלים יש צורך בהשוואת הסטטוס האנטי‪-‬אוקסידנטי של תרביות תאים ראשוניות‬
‫ושל תאי ‪ FaO‬לאורך זמן‪.‬‬
‫השוני בהשפעת הטריגליצרידים על יצור ‪ ATP‬יכול להסביר את ההבדל בהשפעת טריגליצרידים על‬
‫חיות התאים בשני מודלים שונים אלו ולסמן את הירידה ביצור ‪ ATP‬בתור הגורם למוות התאי‪ .‬השינוי‬
‫במצב האנרגטי יכול להיות הגורם הישיר למוות הנקרוטי של התאים ) ‪.(148‬‬
‫‪75‬‬
‫הוכחה נוספת התומכת בכך כי המוות נובע כתוצאה מנזק למיטוכונדריה הוא עיכוב המוות על ידי‬
‫‪ .Etomoxir‬מות תאי ‪ ,FaO‬הנגרם כתוצאה ממתן טריגליצרידים‪ ,‬נמנע חלקית על ידי ‪.Etomoxir‬‬
‫מוות נקרוטי מתרחש בכבד השומני‪ ,‬אולם הגורם הישיר לכך אינו ידוע‪ .‬אנו מציעים כי הפגיעה במאזן‬
‫האנרגטי‪ ,‬הנגרמת כתוצאה מפגיעה של נגזרות חמצן פעילות במיטוכונדריה‪ ,‬מהווה את הגורם הישיר‬
‫למוות של תאי הכבד‪ .‬התוצאות שהתקבלו לגבי הירידה ברמות ‪ ATP‬העלייה בנגזרות החמצן הפעילות‬
‫והשינוי במאזן האנרגטי תמוכות התיאוריה כי המוות נגרם כתוצאה מפגיעה מיטוכונדריאלית‪ ,‬אך כדאי‬
‫בעתיד גם לבדוק את השינוי בפעילות המיטוכונדריה על ידי חומרים המראים את פוטנציאל הממברנה של‬
‫המיטוכונדריה‪.‬‬
‫סוג המוות הנגרם מחשיפה לטריגליצרידים‬
‫מספר סוגי מוות דווחו כאפשריים בכבד שומני‪ :‬אפופטוטי )‪ ,(143‬נקרוטי )‪ (144‬או אפופטוטי ללא תלות‬
‫בכספאז )‪ .(145‬על מנת לבדוק את סוג המוות המתרחש בתאי ‪ FaO‬שנחשפו לטריגליצרידים נבדקו שני‬
‫פרמטרים מקדימי מוות אפופטוטי‪ .‬פעילות ‪ caspase3‬לא השתנתה במהלך ‪ 24‬השעות הראשונות עד‬
‫למוות התאי‪ .‬פרמטר נוסף של מוות אפופטוטי הוא פרגמנטציה של ‪ ,DNA‬שנבדקה מרגע החשיפה‬
‫לטריגליצרידים והופיעה רק לאחר ‪ 48‬שעות‪ .‬שני ממצאים אלו מצביעים על כך שמות התאים אינו‬
‫אפופטוטי‪ .‬כדי לבדוק האם המוות נקרוטי‪ ,‬נבדקה נוכחות ‪ HMGB1‬בתאים‪ HMGB1 .‬הוא גורם‬
‫שעתוק אשר בתהליך מוות נקרוטי משתחרר ופועל כציטוקין )‪ .(149,150‬בעבודתנו חלבון זה שימש‬
‫כמרקר למוות נקרוטי של התאים‪ .‬נמצא כי בתאים אשר נחשפו לטריגליצרידים חלה ירידה ברמת‬
‫‪ HMGB1‬בתוך התאים‪ ,‬עובדה המעידה על מוות נקרוטי של התאים‪ .‬לא ניתן לשלול כי ההשפעה על‬
‫רמות ‪ HMGB1‬נובעות משינוי בביטוי החלבון‪ ,‬אך הסבר זה אינו סביר מכיוון ומדובר בזמן חשיפה קצר‬
‫יחסית )‪ 6‬שעות(‪.‬‬
‫בחשיפת תאים לשומן נמצא במקרים רבים כי התרחש מוות אפופטוטי ולא נקרוטי‪ ,‬אולם מקור השומן‬
‫במקרים אלו היה חומצות שומן חופשיות )‪ .(135,151-153‬במקרים של כבד שומני המתקדם לכיוון‬
‫מחלת הכבד השומני ישנם אזורים נקרוטיים מצומצמים או נרחבים בכבד ) ‪ .(154‬בכבד שומני סביר‬
‫שמתקיימים כל סוגי המוות‪ ,‬אך בתאי ‪ FaO‬אשר שמשו בעבודה זו התגלתה פגיעה מיטוכונדריאלית ולכן‬
‫המוות התאי התאפיין כמוות נקרוטי‪.‬‬
‫‪76‬‬
‫מודל השפעת טריגליצרידים על חיות תאי הכבד במודל תאי ‪FaO‬‬
‫בתאי‬
‫‪FaO‬‬
‫טריגליצרידים‬
‫קיבלנו‬
‫דומה‬
‫השפעת‬
‫לזו‬
‫‪Triglycerides‬‬
‫אשר‬
‫‪Antioxidant‬‬
‫התקבלה ב תאי כבד ראשוניים‪ ,‬אך‬
‫עם מספר הבדלים‪ .‬טריגליצרידים‬
‫‪Mitochondria‬‬
‫הובילו לעלייה ביצור נגזרות חמצן‬
‫פעילות‬
‫ממקור‬
‫עלייה‬
‫זו‬
‫‪ROS‬‬
‫‪ATP‬‬
‫מיטוכונדריאלי‪.‬‬
‫גרמה‬
‫במיטוכונדריה ולירידה‬
‫לפגיעה‬
‫‪Necrosis‬‬
‫ביצור‬
‫‪ .ATP‬הפגיעה במאזן האנרגטי התבטאה גם בעלייה בזרחון ‪ .AMPK‬הפגיעה במיטוכונדריה הובילה את‬
‫התאים למסלול מוות נקרוטי ונמנעה על ידי אנטיאוקסידנטים מסיסי מים‪ .‬בנוסף נמצא כי משימוש‬
‫בתערובת של אנטיאוקסידנטים מסיסי מים שונים התקבל אפקט סינרגיסטי‪.‬‬
‫מעצם העובדה כי ישנם מספר סוגי מוות תאי המאופיינים במצב של כבד שומני‪ ,‬ניתן ללמוד כי ישנם‬
‫מספר גורמים אפשריים שיכולים לגרום למות תאי הכבד‪ .‬אנו מציעים כי המוות התאי הנגרם כתוצאה‬
‫מחשיפה של תאי ‪ FaO‬לטריגליצרידים נובע מחוסר היכולת של תאים אלו להתמודד עם העלייה ביצור‬
‫נגזרות חמצן פעילות‪ .‬בתאים אלו עלייה זו גורמת לפגיעה מיטוכונדריאלית המובילה לפגיעה אקוטית‬
‫במאזן האנרגטי ולמוות‪.‬‬
‫חיות התאים לאחר הדגרה עם טריגליצרידים מושפעת מהמצב האנטיאוקסידנטי של התאים‪ .‬יתכן כי תאי‬
‫‪ FaO‬הם בעלי הגנה אנטיאוקסידנטית פחות טובה מתרביות התאים הראשוניות ולכן נצפית בהם פגיעה‬
‫מיטוכונדריאלית המובילה למוות‪ ,‬לעומת תרביות התאים הראשוניות בהן אין פגיעה מיטוכונדריאל ית ואין‬
‫מוות‪.‬‬
‫‪77‬‬
‫השפעת טריגליצרידים על נזק חמצוני ומערכת ‪ NO‬במודל הזנה תוך ורידית של‬
‫חולדות‬
‫בחלק האחרון של העבודה היה ניסיון להתמודד עם השאלה‪ :‬כיצד תשפיע העמסת כבד בשומן הניתן תוך‬
‫ורידית במודל ‪ ,in vivo‬מצב המחקה הזנה אנטרלית‪ ,‬על הפרמטרים שנבדקו עד כה‪.‬‬
‫כפי שתואר‪ ,‬החולדות אשר הוחדרה להם אמולסית שומן בהזנה תוך ורידית צרכו פחות מזון לאחר ‪4‬‬
‫ימים של הזנה זו‪ .‬תופעה זו של ויסות צריכת המזון כתוצאה מהזנה תוך ורידית נובעת מפיצוי על העודף‬
‫הקלורי הנגרם מההזנה התוך ורידית‪ .‬התופעה של ויסות צריכת המזון נסקרה על ידי ‪ Opara et al‬והיא‬
‫נובעת מיכולת החישה של רמת הניוטריאנטים בדם על ידי מערכת העצבים המרכזית )‪.(155‬‬
‫בחיות אשר הוזנו באמולסית השומן חלה עלייה ברמות הכולסטרול והטריגליצרידים בדם לאחר ‪ 6‬ימים‬
‫של הזנה תוך ורידית‪ .‬החיות הוקרבו כשעה לאחר סיום מתן ההזנה האחרונה‪ ,‬ולכן כנראה שלפחות חלק‬
‫מהטריגליצרידים בדם מקורם באמולסית השומן אשר טרם פונתה מהדם‪ .‬מצב בו ישנן רמות‬
‫טריגליצרידים גבוהות‪ ,‬מחקה את המצב הקיים באנשים אשר הסובלים מכבד שומני‪ ,‬ובנוסף עלייה‬
‫בטריגליצרידים היא גורם סיכון לכבד שומני )‪ .(156,157‬העלייה ברמות הכולסטרול מופיעה אף היא‬
‫באנשים בעלי כבד שומני‪ ,‬ונחשבת לגורם סיכון מקדים ליצירת כבד שומני בבני אדם ) ‪.(157‬‬
‫העלייה באנזימי הכבד שנמדדה ביום השישי של מתן הטריגליצרידים‪ ,‬מעידה על מוות של תאי כבד‬
‫ושחרור אנזימים הנמצאים בתוך התאים אל הדם‪ .‬עלייה זו באנזימי הכבד מאפיינת את המצב של‬
‫התקדמות מחלת הכבד השומני אל מעבר להצטברות שפירה של שומן בכבד ואת תחילתם של תהליכי‬
‫נזק‪ .‬נזק זה הפיך בבני אדם כאשר מקפידים על ירידה במשקל ושינוי אורח חיים שבדרך כלל משפרים‬
‫את פרופיל אנזימי הכבד בדם‪ .‬בבני אדם עלייה באנזימי כבד בדם היא בדרך כלל הממצא הראשוני אותו‬
‫מזהים‪ ,‬ובאמצעותו מגיעים לאבחון של כבד שומני )‪.(8,158‬‬
‫בממצאים ההיסטולוגים ניתן היה לראות נזק לכבד בחיות שהוזנו בהזנה תוך ורידית )תמונה ‪ .(31‬הנזק‬
‫בכבדים של חיות שונות היה בעל מגוון מופעים‪ ,‬החל מנזק קל ועד לנזק של ירידה בכמות כלי הדם‬
‫ואזורים נקרוטיים נרחבים‪ .‬הממצאים של ירידה בכמות כלי הדם ויצירת אזורים נקרוטיים‪ ,‬מתרחשים‬
‫בכבד השומני כאשר ישנה התקדמות לדלקת כבד שומני ומתוארים בכבד שומני בבני אדם )‪.(159,160‬‬
‫השונות בחתכים ההיסטולוגים בין כבדי החולדות אשר הוזנו באמולסית שומן מעיד כי חלק מהחיות הגיעו‬
‫‪78‬‬
‫למצב של דלקת כבד שומני חמורה יותר ובחלק מהחיות‪ ,‬אשר הראו אזורים נקרוטיים קטנים בלי שינויים‬
‫בכלי הדם‪ ,‬התפתחה דלקת מתונה‪ .‬מגוון ההשפעות עולה גם מהשינויים ברמות אנזימי הכבד בדם‪ -‬אף על‬
‫פי שבחלק מהחיות הופיעה עלייה מתונה בלבד באנזימי הכבד היו חיות שבהן התקבלו שינויים גדולים‪.‬‬
‫מגוון השפעות זה מקובל וצפוי עקב השונות בין פרטים שונים של החיות‪.‬‬
‫ממצאים אלו מעידים כי במודל זה הייתה התפתחות מהירה של כבד שומני ונזק לכבד וכי ישנה הצטברות‬
‫של שומן מהיום השני ועלייה באנזימי הכבד ביום השישי‪ .‬שינויים אלו מראים כי קיבלנו מודל של כבד‬
‫שומני עם הצטברות שומן בלבד עד היום הרביעי ונזק עם דלקת ביום השישי‪.‬‬
‫על מנת לבדוק את השפעת טריגליצרידים על מאזן חמצון חיזור‪ ,‬נבדק הפרמטר של חמצון חומצות שומן‬
‫‪ .4HNE‬העלייה שנצפתה ברמת ‪ 4HNE‬בכבד חיות אשר הוזנו בטריגליצרידים מעידה על מתח חמצוני‬
‫גבוה יותר בכבד חיות אלו והיא תומכת בתוצאות ‪ in vitro‬שהתקבלו במודלים של התאים‪ .‬תופעה זו של‬
‫עלייה ברמתו של ‪ 4HNE‬נצפתה גם בבני אדם בעלי כבד שומני ובכבד שומני דלקתי באחוזים דומים‬
‫לעלייה שקיבלנו במודל זה )‪ .(161‬מלבד היותו סמן של מתח חמצוני‪ 4HNE ,‬הוא גם בעל פוטנציאל‬
‫נזק‪ ,‬המעלה את הסיכון לסרטן על ידי נזק ישיר ל‪ DNA-‬ואינטראקציה עם הגן מדכא הסרטן ‪.P53‬‬
‫‪ 4HNE‬יכול גם להוביל את הכבד לתהליך של יצירת רקמת צלקת דרך הפעלת תאי ‪162-) stellate‬‬
‫‪.(164‬‬
‫בניגוד לממצאים בקו תאי ‪ FaO‬ובדומה לממצאים בתרביות התאים הראשוניות‪ ,‬חלה ירידה בזרחון‬
‫‪ AMPK‬בחיות אשר הוזנו באמולסית שומן‪ .‬עליה זו מעידה על כך שמוות תאי הכבד כפי שנצפה‬
‫בחולדות על פי העלייה באנזימי הכבד בדם‪ ,‬אינו נגרם במנגנון הדומה למנגנון שנמצא בקו תאי ‪.FaO‬‬
‫במודל זה נצפתה גם ירידה בביטוי האנזים ‪ eNOS‬שהופיעה לאחר ‪ 4‬ימים והתעצמה לאחר ‪ 6‬ימים )איור‬
‫‪ .(33‬ירידה זו תומכת בממצאים אשר נמצאו בתרביות התאים הראשוניות )איור ‪ .(9‬הירידה בביטוי‬
‫החלבון ‪ eNOS‬לוותה בירידה ב‪.mRNA eNOS-‬‬
‫הירידה באנזים ‪ eNOS‬הקדימה את העלייה באנזימי הכבד‪ .‬ממצא זה מצביע על הירידה ב‪ eNOS-‬כגורם‬
‫מקדים אפשרי לנזק לכבד‪ .‬כפי שכבר צוין ‪ NO‬הינה מולקולה קטנה אשר יכולה לעבור ממברנות בקלות‬
‫ולהשפיע על תאים בקרבתה‪ .‬לכן‪ ,‬הירידה בכמות כלי הדם‪ ,‬הנראית בחתכים ההיסטולוגים יחד עם‬
‫הירידה ב‪ ,eNOS-‬יכולה להצביע על ירידה בשחרור ‪ .NO‬ירידה זו גורמת לירידה בהרפיית כלי הדם‬
‫‪79‬‬
‫בתוך הכבד‪ ,‬לזרימת דם פחות טובה באזורים אלו וכתוצאה מכך ליצירת אזורים נקרוטיים ופגיעה בכבד‪.‬‬
‫במודל זה לא הופיעו שינוים ברמות האנזים ‪ iNOS‬בחיות אשר הוזנו באמולסית השומן‪ .‬ממצא זה מצביע‬
‫על היעדר הפעלה דלקית של ‪ iNOS‬האופיינית לפגיעה אקוטית‪.‬‬
‫מודל השפעת טריגליצרידים על מערכת ‪ NO‬ונגזרות חמצן פעילות בכבד‬
‫תוצאות עבודה זו הביאו אותנו לפיתוח המודל הבא‪ ,‬אשר מציג את השפעת רעילות טריגליצרידים בכבד‬
‫דרך מערכת ‪ NO‬ונגזרות חמצן פעילות‪.‬‬
‫כאשר ההגנה האנטיאוקסידנטית מספיק יעילה‪ ,‬מצב שקיים ככל הנראה בתרביות התאים הראשוניות‪,‬‬
‫העלייה הנגרמת ברמות נגזרות החמצן הפעילות התוך תאיות לא גורמת למוות של התאים‪ ,‬אך גורמת‬
‫לפגיעה במערכת ‪ .NO‬הפגיעה במערכת ‪ NO‬יכולה להיות אחד הגורמים החשובים בהתפתחות מכבד‬
‫שומני לנזק בכבד‪.‬‬
‫המצב‬
‫כאשר‬
‫האנטיאוקסידנטי‬
‫‪Triglycerides‬‬
‫‪Antioxidant‬‬
‫של‬
‫התאים בכבד ירוד‪,‬‬
‫כפי‬
‫שנראה‬
‫בתאי‬
‫‪ ,FaO‬העלייה ביצור‬
‫נגזרות‬
‫החמצן‬
‫הפעילות‬
‫גורמת‬
‫לפגיעה‬
‫‪Mitochondria‬‬
‫‪ATP‬‬
‫‪ROS‬‬
‫‪glutathione‬‬
‫‪depletion‬‬
‫‪eNOS/ iNOS‬‬
‫‪Necrosis‬‬
‫‪NO‬‬
‫במיטוכונדריה‪ .‬פגיעה‬
‫זו מובילה לפגיעה במאזן האנרגיה ולמוות של התאים‪ .‬מנגנון מוות זה הוא אחת הדרכים האפשריות‬
‫למוות תאי במצב של כבד שומני‪.‬‬
‫בשתי הפגיעות האפשריות בתאי הכבד מתן אנטיאוקסידנטים מסיסי מים מנע את הפגיעה ותערובת‬
‫האנטיאוקסידנטים )‪ (Resveratrol, NAC, Vitamin C‬הייתה יעילה בריכוזים נמוכים יותר מאשר כל‬
‫אנטיאוקסידנט לבדו‪.‬‬
‫‪80‬‬
‫כל אחד משני המודלים השונים ‪ ) in vitro‬תרביות תאים ראשוניות ותאי ‪ (FaO‬יכול לייצג את המצב‬
‫בכבד השומני ‪ ,in vivo‬אך עם זאת לכל אחד מהמודלים חסרונות‪ .‬תרביות התאים הראשוניות מתאימות‬
‫למחקר בטווח זמן מוגבל ממועד הפקתם‪ ,‬ולכן עלולים התאים להימצא במצב דחק מסוים‪ .‬תאי ‪ FaO‬הינם‬
‫תאים שעברו טרנספורמציה‪ ,‬דבר המונע מהם לדמות באופן מוחלט את התנהגותם של תאי כבד רגילים‪.‬‬
‫מתן האמולסיה לחולדות ‪ in vivo‬הוא המודל הקרוב ביותר להשריית מצב של כבד שומני בגוף החי‪ ,‬אם‬
‫כי מודל זה מקשה על השגת הבנה מנגנונית של התהליכים ברמת התא‪ .‬למרות מגבלותיהם‪ ,‬מאפשר‬
‫השימוש המשולב בשלושת המודלים את קבלת מירב המסקנות‪.‬‬
‫סיכום‬
‫במחקר זה נבדקה השפעת טריגליצרידים על רעילות שומן בכבד דרך מערכת ‪ NO‬ונגזרות חמצן פעילות‪.‬‬
‫במחקר זה נראה לראשונה כי ייצור ‪ NO‬בתרביות תאים ראשוניות מווסת על ידי טריגליצרידים ומתווך‬
‫באמצעות ייצור נגזרות חמצן פעילות‪ .‬הפגיעה בייצור נובעת מהירידה ברמות האנזימים המייצרים ‪NO‬‬
‫‪ e/iNOS‬וניתנת למניעה על ידי האנטיאוקסידנט ‪ .NAC‬בנוסף‪ ,‬נצפה כי תאי ‪ FaO‬מתים מוות נקרוטי‬
‫לאחר חשיפה לאמולסית שומן‪ .‬המוות נגרם כתוצאה ממשבר אנרגטי בתא‪ ,‬שנגרם מפגיעה של נגזרות‬
‫חמצן פעילות במיטוכונדריה‪ .‬הפגיעה במערכת ‪ NO‬והעלייה בייצור נגזרות חמצן פעילות התרחשו גם ‪in-‬‬
‫‪ vivo‬כתוצאה מהזנה תוך ורידית של חולדות בטריגליצרידים‪ .‬מוות תאי הכבד‪ ,‬כפי שהתבטא בעלייה‬
‫באנזימי הכבד בחולדות אשר הוזנו באמולסית שומן‪ ,‬הוקדם על ידי ירידה בביטוי האנזים ‪ .eNOS‬מכאן‬
‫יתכן שלוויסות מערכת ‪ NO‬מעורבות במוות תאי במצב של כבד שומני‪.‬‬
‫מחקר זה מצביע על חשיבות היכולת האנטיאוקסידנטית של התאים במצב של הצטברות שומן בכבד‬
‫במקרים כמו מחלת כבד שומני‪ .‬רמת אנטיאוקסידנטים גבוהה בתאי כבד עשויה לגונן עליהם מפני נזק‬
‫חמצוני ופגיעה במערכת ‪ ,NO‬שני גורמים בעלי פוטנציאל נזק במצב של כבד שומני‪.‬‬
‫‪81‬‬
‫רשימת פרסומים‬
‫הצגת פוסטרים‬
3rd Russell Berrie D-Cure Symposium (2007)
24th International Symposium on Diabetes and Nutrition (2006)
The Federation of the Israel Societies for Experimental Biology 5th Congress (2005)
Conference of the Israeli Society of Free Radicals and Antioxidants. (2005).
‫פרסומים‬
Lipid emulsion infusion leads to a modulation of AMP-activated protein kinase
(AMPK) and related proteins in rat liver, muscle and adipose tissues. Sarit Anavi,
Erez Ilan, Oren Tirosh, Zecharia Madar. - in process
Down regulation of eNOS in a nutritional model of fatty liver. Sarit Anavi, Erez Ilan*,
Oren Tirosh, Zecharia Madar. Submitted to Clinical Nutrition. *equal contribution
Nutritional Lipids-Induced Oxidative Stress Leads to Mitochondrial Dysfunction
Followed by Necrotic Death in FaO Hepatocytes. Sarit Anavi, Erez Ilan*, Oren
Tirosh, Zecharia Madar. Accepted for publication in nutrition. *equal contribution.
Herschkovitz A, Liu YF, Ilan E, Ronen D, Boura-Halfon S, Zick Y. (2007) Common
inhibitory serine sites phosphorylated by IRS-1 kinases, triggered by insulin and
inducers of insulin resistance. J Biol Chem. 22;282(25):18018-27.
Ilan E, Tirosh O, Madar Z. (2005) Triacylglycerol-mediated oxidative stress inhibits
nitric oxide production in rat isolated hepatocytes. J Nutr. 135(9):2090-5.
‫פטנטים‬
Means and method for treating lipotoxicity and other metabolically related
Phenomena. United States Patent 20080015251
82
References
1. Reddy, J. K. & Rao, M. S. (2006) Lipid metabolism and liver inflammation. II.
Fatty liver disease and fatty acid oxidation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol
290: G852-858.
2. Haslam, D. W. & James, W. P. (2005) Obesity. Lancet 366: 1197-1209.
3. Cauble, M. S., Gilroy, R., Sorrell, M. F., Mailliard, M. E., Sudan, D. L., Anderson,
J. C., Wisecarver, J. L., Balakrishnan, S. & Larsen, J. L. (2001) Lipoatrophic diabetes
and end-stage liver disease secondary to nonalcoholic steatohepatitis with recurrence
after liver transplantation. Transplantation 71: 892-895.
4. Teli, M. R., James, O. F., Burt, A. D., Bennett, M. K. & Day, C. P. (1995) The
natural history of nonalcoholic fatty liver: a follow-up study. Hepatology 22: 17141719.
5. Zivkovic, A. M., German, J. B. & Sanyal, A. J. (2007) Comparative review of diets
for the metabolic syndrome: implications for nonalcoholic fatty liver disease. Am J
Clin Nutr 86: 285-300.
6. Schwimmer, J. B., Deutsch, R., Kahen, T., Lavine, J. E., Stanley, C. & Behling, C.
(2006) Prevalence of fatty liver in children and adolescents. Pediatrics 118: 13881393.
7. Roberts, E. A. (2007) Pediatric nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD): a
"growing" problem? J Hepatol 46: 1133-1142.
8. Siebler, J. & Galle, P. R. (2006) Treatment of nonalcoholic fatty liver disease.
World J Gastroenterol 12: 2161-2167.
9. Westwater, J. O. & Fainer, D. (1958) Liver impairment in the obese.
Gastroenterology 34: 686-693.
10. Adler, M. & Schaffner, F. (1979) Fatty liver hepatitis and cirrhosis in obese
patients. Am J Med 67: 811-816.
11. Ludwig, J., Viggiano, T. R., McGill, D. B. & Oh, B. J. (1980) Nonalcoholic
steatohepatitis: Mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease. Mayo Clin
Proc 55: 434-438.
12. Cortez-Pinto, H. & Camilo, M. E. (2004) Non-alcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis (NAFLD/NASH): diagnosis and clinical course. Best Pract
Res Clin Gastroenterol 18: 1089-1104.
13. Mehta, K., Van Thiel, D. H., Shah, N. & Mobarhan, S. (2002) Nonalcoholic fatty
liver disease: pathogenesis and the role of antioxidants. Nutr Rev 60: 289-293.
83
14. Browning, J. D. & Horton, J. D. (2004) Molecular mediators of hepatic steatosis
and liver injury. J Clin Invest 114: 147-152.
15. Hubscher, S. G. (2006) Histological assessment of non-alcoholic fatty liver
disease. Histopathology 49: 450-465.
16. Portincasa, P., Grattagliano, I., Palmieri, V. O. & Palasciano, G. (2005)
Nonalcoholic steatohepatitis: recent advances from experimental models to clinical
management. Clin Biochem 38: 203-217.
17. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Wood, K. S., Byrns, R. E. & Chaudhuri, G. (1987)
Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is
nitric oxide. Proc Natl Acad Sci U S A 84: 9265-9269.
18. Ortega Mateo, A. & Amaya Aleixandre de, A. (2000) Nitric oxide reactivity and
mechanisms involved in its biological effects. Pharmacol Res 42: 421-427.
19. Kelm, M. (1999) Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta
1411: 273-289.
20. Knowles, R. G. & Moncada, S. (1992) Nitric oxide as a signal in blood vessels.
Trends Biochem Sci 17: 399-402.
21. Wink, D. A. & Mitchell, J. B. (1998) Chemical biology of nitric oxide: Insights
into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radic
Biol Med 25: 434-456.
22. Davis, K. L., Martin, E., Turko, I. V. & Murad, F. (2001) Novel effects of nitric
oxide. Annu Rev Pharmacol Toxicol 41: 203-236.
23. Oess, S., Icking, A., Fulton, D., Govers, R. & Muller-Esterl, W. (2006)
Subcellular targeting and trafficking of nitric oxide synthases. Biochem J 396: 401409.
24. Wahl, S. M., McCartney-Francis, N., Chan, J., Dionne, R., Ta, L. & Orenstein, J.
M. (2003) Nitric oxide in experimental joint inflammation. Benefit or detriment?
Cells Tissues Organs 174: 26-33.
25. Dimmeler, S. & Zeiher, A. M. (1999) Nitric oxide-an endothelial cell survival
factor. Cell Death Differ 6: 964-968.
26. Erceg, S., Monfort, P., Cauli, O., Montoliu, C., Llansola, M., Piedrafita, B. &
Felipo, V. (2006) Role of extracellular cGMP and of hyperammonemia in the
impairment of learning in rats with chronic hepatic failure. Therapeutic implications.
Neurochem Int 48: 441-446.
27. Jaeschke, H., Gores, G. J., Cederbaum, A. I., Hinson, J. A., Pessayre, D. &
Lemasters, J. J. (2002) Mechanisms of hepatotoxicity. Toxicol Sci 65: 166-176.
84
28. Stuehr, D. J., Kwon, N. S. & Nathan, C. F. (1990) FAD and GSH participate in
macrophage synthesis of nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun 168: 558-565.
29. Saha, R. N. & Pahan, K. (2006) Regulation of inducible nitric oxide synthase gene
in glial cells. Antioxid Redox Signal 8: 929-947.
30. Carse, A. L. (1998) Impartial principle and moral context: securing a place for the
particular in ethical theory. J Med Philos 23: 153-169.
31. Casado, M., MJ, D. i.-G., Rodrigo, J., Fernandez, A. P., Bosca, L. & Martin-Sanz,
P. (1997) Expression of the calcium-independent cytokine-inducible (iNOS) isoform
of nitric oxide synthase in rat placenta. Biochem J 324 ( Pt 1): 201-207.
32. Nathan, C. F. & Hibbs, J. B., Jr. (1991) Role of nitric oxide synthesis in
macrophage antimicrobial activity. Curr Opin Immunol 3: 65-70.
33. Fehsel, K., Kroncke, K. D., Meyer, K. L., Huber, H., Wahn, V. & Kolb-Bachofen,
V. (1995) Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytes. J Immunol 155: 28582865.
34. MacMicking, J., Xie, Q. W. & Nathan, C. (1997) Nitric oxide and macrophage
function. Annu Rev Immunol 15: 323-350.
35. Kolb-Bachofen, V. (1996) Intraislet expression of inducible nitric oxide synthase
and islet cell death. Biochem Soc Trans 24: 233-234.
36. MacMicking, J. D., North, R. J., LaCourse, R., Mudgett, J. S., Shah, S. K. &
Nathan, C. F. (1997) Identification of nitric oxide synthase as a protective locus
against tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 5243-5248.
37. Kleinert, H., Euchenhofer, C., Ihrig-Biedert, I. & Forstermann, U. (1996) In
murine 3T3 fibroblasts, different second messenger pathways resulting in the
induction of NO synthase II (iNOS) converge in the activation of transcription factor
NF-kappaB. J Biol Chem 271: 6039-6044.
38. Forstermann, U., Nakane, M., Tracey, W. R. & Pollock, J. S. (1993) Isoforms of
nitric oxide synthase: functions in the cardiovascular system. Eur Heart J 14 Suppl I:
10-15.
39. Forstermann, U., Closs, E. I., Pollock, J. S., Nakane, M., Schwarz, P., Gath, I. &
Kleinert, H. (1994) Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification,
molecular cloning, and functions. Hypertension 23: 1121-1131.
40. Forstermann, U., Boissel, J. P. & Kleinert, H. (1998) Expressional control of the
'constitutive' isoforms of nitric oxide synthase (NOS I and NOS III). Faseb J 12: 773790.
41. Kroncke, K. D., Suschek, C. V. & Kolb-Bachofen, V. (2000) Implications of
inducible nitric oxide synthase expression and enzyme activity. Antioxid Redox
Signal 2: 585-605.
85
42. Ramalho, F. S., Fernandez-Monteiro, I., Rosello-Catafau, J. & Peralta, C. (2006)
Hepatic microcirculatory failure. Acta Cir Bras 21 Suppl 1: 48-53.
43. Langer, D. A. & Shah, V. H. (2006) Nitric oxide and portal hypertension:
interface of vasoreactivity and angiogenesis. J Hepatol 44: 209-216.
44. Kapur, S., Picard, F., Perreault, M., Deshaies, Y. & Marette, A. (2000) Nitric
oxide: a new player in the modulation of energy metabolism. Int J Obes Relat Metab
Disord 24 Suppl 4: S36-40.
45. Erusalimsky, J. D. & Moncada, S. (2007) Nitric oxide and mitochondrial
signaling: from physiology to pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27:
2524-2531.
46. Tesauro, M., Thompson, W. C. & Moss, J. (2006) Effect of staurosporine-induced
apoptosis on endothelial nitric oxide synthase in transfected COS-7 cells and primary
endothelial cells. Cell Death Differ 13: 597-606.
47. Ruiz-Stewart, I., Tiyyagura, S. R., Lin, J. E., Kazerounian, S., Pitari, G. M.,
Schulz, S., Martin, E., Murad, F. & Waldman, S. A. (2004) Guanylyl cyclase is an
ATP sensor coupling nitric oxide signaling to cell metabolism. Proc Natl Acad Sci U
S A 101: 37-42.
48. Khedara, A., Kawai, Y., Kayashita, J. & Kato, N. (1996) Feeding rats the nitric
oxide synthase inhibitor, L-N(omega)nitroarginine, elevates serum triglyceride and
cholesterol and lowers hepatic fatty acid oxidation. J Nutr 126: 2563-2567.
49. Jacob, R. A. & Burri, B. J. (1996) Oxidative damage and defense. Am J Clin Nutr
63: 985S-990S.
50. Halliwell, B. & Cross, C. E. (1994) Oxygen-derived species: their relation to
human disease and environmental stress. Environ Health Perspect 102 Suppl 10: 5-12.
51. Machlin, L. J. & Bendich, A. (1987) Free radical tissue damage: protective role of
antioxidant nutrients. Faseb J 1: 441-445.
52. Haussinger, D., Gerok, W. & Sies, H. (1986) The effect of urea synthesis on
extracellular pH in isolated perfused rat liver. Biochem J 236: 261-265.
53. Davies, K. J., Delsignore, M. E. & Lin, S. W. (1987) Protein damage and
degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids. J Biol Chem 262:
9902-9907.
54. Sies, H. & Menck, C. F. (1992) Singlet oxygen induced DNA damage. Mutat Res
275: 367-375.
55. Kappus, H. (1985) Lipid peroxidation: Mechanisms, analysis, enzymology and
biological relevance. . Oxidative Stress: 273–310.
86
56. Tribble, D. L., Aw, T. Y. & Jones, D. P. (1987) The pathophysiological
significance of lipid peroxidation in oxidative cell injury. Hepatology 7: 377-386.
57. Chandel, N. S. & Schumacker, P. T. (2000) Cellular oxygen sensing by
mitochondria: old questions, new insight. J Appl Physiol 88: 1880-1889.
58. Lambeth, J. D., Kawahara, T. & Diebold, B. (2007) Regulation of Nox and Duox
enzymatic activity and expression. Free Radic Biol Med 43: 319-331.
59. Bourdon, E. & Blache, D. (2001) The importance of proteins in defense against
oxidation. Antioxid Redox Signal 3: 293-311.
60. Berlett, B. S. & Stadtman, E. R. (1997) Protein oxidation in aging, disease, and
oxidative stress. J Biol Chem 272: 20313-20316.
61. Wei, Y. H. & Lee, H. C. (2002) Oxidative stress, mitochondrial DNA mutation,
and impairment of antioxidant enzymes in aging. Exp Biol Med (Maywood) 227: 671682.
62. Fleury, C., Mignotte, B. & Vayssiere, J. L. (2002) Mitochondrial reactive oxygen
species in cell death signaling. Biochimie 84: 131-141.
63. Kamata, H. & Hirata, H. (1999) Redox regulation of cellular signalling. Cell
Signal 11: 1-14.
64. Kamata, H., Honda, S., Maeda, S., Chang, L., Hirata, H. & Karin, M. (2005)
Reactive oxygen species promote TNFalpha-induced death and sustained JNK
activation by inhibiting MAP kinase phosphatases. Cell 120: 649-661.
65. Maher, P. & Schubert, D. (2000) Signaling by reactive oxygen species in the
nervous system. Cell Mol Life Sci 57: 1287-1305.
66. Sen, C. K. & Packer, L. (1996) Antioxidant and redox regulation of gene
transcription. Faseb J 10: 709-720.
67. Rothwarf, D. M. & Karin, M. (1999) The NF-kappa B activation pathway: a
paradigm in information transfer from membrane to nucleus. Sci STKE 1999: RE1.
68. Kabe, Y., Ando, K., Hirao, S., Yoshida, M. & Handa, H. (2005) Redox regulation
of NF-kappaB activation: distinct redox regulation between the cytoplasm and the
nucleus. Antioxid Redox Signal 7: 395-403.
69. Shaulian, E. & Karin, M. (2002) AP-1 as a regulator of cell life and death. Nat
Cell Biol 4: E131-136.
70. Weisiger, R. A. & Fridovich, I. (1973) Mitochondrial superoxide simutase. Site of
synthesis and intramitochondrial localization. J Biol Chem 248: 4793-4796.
87
71. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M. & Roeder, R. G. (1983) Accurate transcription
initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.
Nucleic Acids Res 11: 1475-1489.
72. Wallace, D. C. (2001) A mitochondrial paradigm for degenerative diseases and
ageing. Novartis Found Symp 235: 247-263; discussion 263-246.
73. Fernandez-Silva, P., Enriquez, J. A. & Montoya, J. (2003) Replication and
transcription of mammalian mitochondrial DNA. Exp Physiol 88: 41-56.
74. Kokoszka, J. E., Coskun, P., Esposito, L. A. & Wallace, D. C. (2001) Increased
mitochondrial oxidative stress in the Sod2 (+/-) mouse results in the age-related
decline of mitochondrial function culminating in increased apoptosis. Proc Natl Acad
Sci U S A 98: 2278-2283.
75. Kunsch, C. & Medford, R. M. (1999) Oxidative stress as a regulator of gene
expression in the vasculature. Circ Res 85: 753-766.
76. Lopes, H. F., Martin, K. L., Nashar, K., Morrow, J. D., Goodfriend, T. L. & Egan,
B. M. (2003) DASH diet lowers blood pressure and lipid-induced oxidative stress in
obesity. Hypertension 41: 422-430.
77. Mootha, V. K., Lindgren, C. M., Eriksson, K. F., Subramanian, A., Sihag, S.,
Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M. et al. (2003) PGC-1alpharesponsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately
downregulated in human diabetes. Nat Genet 34: 267-273.
78. Moshage, H. (2004) The cirrhotic hepatocyte: navigating between Scylla and
Charybdis. J Hepatol 40: 1027-1029.
79. Perez-Carreras, M., Del Hoyo, P., Martin, M. A., Rubio, J. C., Martin, A.,
Castellano, G., Colina, F., Arenas, J. & Solis-Herruzo, J. A. (2003) Defective hepatic
mitochondrial respiratory chain in patients with nonalcoholic steatohepatitis.
Hepatology 38: 999-1007.
80. Zong, H., Ren, J. M., Young, L. H., Pypaert, M., Mu, J., Birnbaum, M. J. &
Shulman, G. I. (2002) AMP kinase is required for mitochondrial biogenesis in skeletal
muscle in response to chronic energy deprivation. Proc Natl Acad Sci U S A 99:
15983-15987.
81. Michiels, C., Raes, M., Toussaint, O. & Remacle, J. (1994) Importance of Seglutathione peroxidase, catalase, and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative
stress. Free Radic Biol Med 17: 235-248.
82. Maritim, A. C., Sanders, R. A. & Watkins, J. B., 3rd (2003) Diabetes, oxidative
stress, and antioxidants: a review. J Biochem Mol Toxicol 17: 24-38.
83. Gutteridge, J. M. & Halliwell, B. (2000) Free radicals and antioxidants in the year
2000. A historical look to the future. Ann N Y Acad Sci 899: 136-147.
88
84. Halliwell, B. (1996) Antioxidants in human health and disease. Annu Rev Nutr
16: 33-50.
85. Haldar, S., Rowland, I. R., Barnett, Y. A., Bradbury, I., Robson, P. J., Powell, J. &
Fletcher, J. (2007) Influence of habitual diet on antioxidant status: a study in a
population of vegetarians and omnivores. Eur J Clin Nutr 61: 1011-1022.
86. Lin, J. K. & Tsai, S. H. (1999) Chemoprevention of cancer and cardiovascular
disease by resveratrol. Proc Natl Sci Counc Repub China B 23: 99-106.
87. Fauconneau, B., Waffo-Teguo, P., Huguet, F., Barrier, L., Decendit, A. &
Merillon, J. M. (1997) Comparative study of radical scavenger and antioxidant
properties of phenolic compounds from Vitis vinifera cell cultures using in vitro tests.
Life Sci 61: 2103-2110.
88. Belguendouz, L., Fremont, L. & Linard, A. (1997) Resveratrol inhibits metal iondependent and independent peroxidation of porcine low-density lipoproteins.
Biochem Pharmacol 53: 1347-1355.
89. Tadolini, B., Juliano, C., Piu, L., Franconi, F. & Cabrini, L. (2000) Resveratrol
inhibition of lipid peroxidation. Free Radic Res 33: 105-114.
90. Burkitt, M. J. & Duncan, J. (2000) Effects of trans-resveratrol on copperdependent hydroxyl-radical formation and DNA damage: evidence for hydroxylradical scavenging and a novel, glutathione-sparing mechanism of action. Arch
Biochem Biophys 381: 253-263.
91. Chen, C. K. & Pace-Asciak, C. R. (1996) Vasorelaxing activity of resveratrol and
quercetin in isolated rat aorta. Gen Pharmacol 27: 363-366.
92. Subbaramaiah, K., Chung, W. J., Michaluart, P., Telang, N., Tanabe, T., Inoue,
H., Jang, M., Pezzuto, J. M. & Dannenberg, A. J. (1998) Resveratrol inhibits
cyclooxygenase-2 transcription and activity in phorbol ester-treated human mammary
epithelial cells. J Biol Chem 273: 21875-21882.
93. Aruoma, O. I., Halliwell, B., Hoey, B. M. & Butler, J. (1989) The antioxidant
action of N-acetylcysteine: its reaction with hydrogen peroxide, hydroxyl radical,
superoxide, and hypochlorous acid. Free Radic Biol Med 6: 593-597.
94. Gate, L., Paul, J., Ba, G. N., Tew, K. D. & Tapiero, H. (1999) Oxidative stress
induced in pathologies: the role of antioxidants. Biomed Pharmacother 53: 169-180.
95. Chen, G., Wang, S. H. & Warner, T. D. (2000) Regulation of iNOS mRNA levels
in endothelial cells by glutathione, a double-edged sword. Free Radic Res 32: 223234.
96. Zafarullah, M., Li, W. Q., Sylvester, J. & Ahmad, M. (2003) Molecular
mechanisms of N-acetylcysteine actions. Cell Mol Life Sci 60: 6-20.
89
97. Brennan, P. & O'Neill, L. A. (1995) Effects of oxidants and antioxidants on
nuclear factor kappa B activation in three different cell lines: evidence against a
universal hypothesis involving oxygen radicals. Biochim Biophys Acta 1260: 167175.
98. Van Duyn, M. A. & Pivonka, E. (2000) Overview of the health benefits of fruit
and vegetable consumption for the dietetics professional: selected literature. J Am
Diet Assoc 100: 1511-1521.
99. Harats, D., Chevion, S., Nahir, M., Norman, Y., Sagee, O. & Berry, E. M. (1998)
Citrus fruit supplementation reduces lipoprotein oxidation in young men ingesting a
diet high in saturated fat: presumptive evidence for an interaction between vitamins C
and E in vivo. Am J Clin Nutr 67: 240-245.
100. Oliveira, C. P., Gayotto, L. C., Tatai, C., Della Nina, B. I., Lima, E. S., Abdalla,
D. S., Lopasso, F. P., Laurindo, F. R. & Carrilho, F. J. (2003) Vitamin C and vitamin
E in prevention of Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) in choline deficient
diet fed rats. Nutr J 2: 9.
101. Tirosh, A., Rudich, A., Potashnik, R. & Bashan, N. (2001) Oxidative stress
impairs insulin but not platelet-derived growth factor signalling in 3T3-L1 adipocytes.
Biochem J 355: 757-763.
102. Shilo, S. & Tirosh, O. (2003) Selenite activates caspase-independent necrotic cell
death in Jurkat T cells and J774.2 macrophages by affecting mitochondrial oxidant
generation. Antioxid Redox Signal 5: 273-279.
103. Ray, T. K., Skipski, V. P., Barclay, M., Essner, E. & Archibald, F. M. (1969)
Lipid composition of rat liver plasma membranes. J Biol Chem 244: 5528-5536.
104. Aronis, A., Madar, Z. & Tirosh, O. (2005) Mechanism underlying oxidative
stress-mediated lipotoxicity: exposure of J774.2 macrophages to triacylglycerols
facilitates mitochondrial reactive oxygen species production and cellular necrosis.
Free Radic Biol Med 38: 1221-1230.
105. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem 72: 248-254.
106. Burnette, W. N. (1981) "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins
from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and
radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem
112: 195-203.
107. Chomczynski, P. & Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by
acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156159.
108. Shilo, S., Aharoni-Simon, M. & Tirosh, O. (2005) Selenium attenuates
expression of MnSOD and uncoupling protein 2 in J774.2 macrophages: molecular
90
mechanism for its cell-death and antiinflammatory activity. Antioxid Redox Signal 7:
276-286.
109. Guigas, B., Taleux, N., Foretz, M., Detaille, D., Andreelli, F., Viollet, B. & Hue,
L. (2007) AMP-activated protein kinase-independent inhibition of hepatic
mitochondrial oxidative phosphorylation by AICA riboside. Biochem J 404: 499-507.
110. Alfire, M. E. & Treem, W. R. (2006) Nonalcoholic fatty liver disease. Pediatr
Ann 35: 290-294, 297-299.
111. Steinberg, H. O., Paradisi, G., Hook, G., Crowder, K., Cronin, J. & Baron, A. D.
(2000) Free fatty acid elevation impairs insulin-mediated vasodilation and nitric oxide
production. Diabetes 49: 1231-1238.
112. Zeini, M., Hortelano, S., Traves, P. G., Gomez-Valades, A. G., Pujol, A.,
Perales, J. C., Bartrons, R. & Bosca, L. (2005) Assessment of a dual regulatory role
for NO in liver regeneration after partial hepatectomy: protection against apoptosis
and retardation of hepatocyte proliferation. Faseb J 19: 995-997.
113. Farghali, H., Hodis, J., Kutinova-Canova, N., Potmesil, P., Kmonickova, E. &
Zidek, Z. (2007) Glucose release as a response to glucagon in rat hepatocyte culture:
involvement of NO signaling. Physiol Res.
114. Kim, J. S., Ohshima, S., Pediaditakis, P. & Lemasters, J. J. (2004) Nitric oxide: a
signaling molecule against mitochondrial permeability transition- and pH-dependent
cell death after reperfusion. Free Radic Biol Med 37: 1943-1950.
115. Listenberger, L. L., Ory, D. S. & Schaffer, J. E. (2001) Palmitate-induced
apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway. J Biol Chem 276:
14890-14895.
116. Moreno, J. J., Carbonell, T., Sanchez, T., Miret, S. & Mitjavila, M. T. (2001)
Olive oil decreases both oxidative stress and the production of arachidonic acid
metabolites by the prostaglandin G/H synthase pathway in rat macrophages. J Nutr
131: 2145-2149.
117. Wang, H., Gao, X., Fukumoto, S., Tademoto, S., Sato, K. & Hirai, K. (1998)
Post-isolation inducible nitric oxide synthase gene expression due to collagenase
buffer perfusion and characterization of the gene regulation in primary cultured
murine hepatocytes. J Biochem (Tokyo) 124: 892-899.
118. Kim, J. W., Kang, K. W., Oh, G. T., Song, J., Kim, N. D. & Pak, Y. K. (2002)
Induction of hepatic inducible nitric oxide synthase by cholesterol in vivo and in vitro.
Exp Mol Med 34: 137-144.
119. Lacza, Z., Pankotai, E., Csordas, A., Gero, D., Kiss, L., Horvath, E. M., Kollai,
M., Busija, D. W. & Szabo, C. (2006) Mitochondrial NO and reactive nitrogen
species production: does mtNOS exist? Nitric Oxide 14: 162-168.
91
120. Harbrecht, B. G., Di Silvio, M., Chough, V., Kim, Y. M., Simmons, R. L. &
Billiar, T. R. (1997) Glutathione regulates nitric oxide synthase in cultured
hepatocytes. Ann Surg 225: 76-87.
121. Tirmenstein, M. A., Nicholls-Grzemski, F. A., Schmittgen, T. D., Zakrajsek, B.
A. & Fariss, M. W. (2000) Glutathione-dependent regulation of nitric oxide
production in isolated rat hepatocyte suspensions. Antioxid Redox Signal 2: 767-777.
122. Nikulina, M. A., Andersen, H. U., Karlsen, A. E., Darville, M. I., Eizirik, D. L.
& Mandrup-Poulsen, T. (2000) Glutathione depletion inhibits IL-1 beta-stimulated
nitric oxide production by reducing inducible nitric oxide synthase gene expression.
Cytokine 12: 1391-1394.
123. Lechner, M., Lirk, P. & Rieder, J. (2005) Inducible nitric oxide synthase (iNOS)
in tumor biology: the two sides of the same coin. Semin Cancer Biol 15: 277-289.
124. Ijaz, S., Yang, W., Winslet, M. C. & Seifalian, A. M. (2005) The role of nitric
oxide in the modulation of hepatic microcirculation and tissue oxygenation in an
experimental model of hepatic steatosis. Microvasc Res 70: 129-136.
125. Zheng, J. F., Wang, H. D. & Liang, L. J. (2002) Protective effects of nitric oxide
on hepatic steatosis induced by total parenteral nutrition in rats. Acta Pharmacol Sin
23: 824-828.
126. Lirussi, F., Azzalini, L., Orando, S., Orlando, R. & Angelico, F. (2007)
Antioxidant supplements for non-alcoholic fatty liver disease and/or steatohepatitis.
Cochrane Database Syst Rev: CD004996.
127. Chen, Y., Hozawa, S., Sawamura, S., Sato, S., Fukuyama, N., Tsuji, C., Mine,
T., Okada, Y., Tanino, R. et al. (2005) Deficiency of inducible nitric oxide synthase
exacerbates hepatic fibrosis in mice fed high-fat diet. Biochem Biophys Res Commun
326: 45-51.
128. Roblin, X., Pofelski, J. & Zarski, J. P. (2007) [Steatosis, chronic hepatitis virus C
infection and homocysteine]. Gastroenterol Clin Biol 31: 415-420.
129. Neuschwander-Tetri, B. A. & Caldwell, S. H. (2003) Nonalcoholic
steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology 37:
1202-1219.
130. Mantena, S. K., King, A. L., Andringa, K. K., Landar, A., Darley-Usmar, V. &
Bailey, S. M. (2007) Novel interactions of mitochondria and reactive oxygen/nitrogen
species in alcohol mediated liver disease. World J Gastroenterol 13: 4967-4973.
131. Pappo, I., Bercovier, H., Berry, E., Gallilly, R., Feigin, E. & Freund, H. R.
(1995) Antitumor necrosis factor antibodies reduce hepatic steatosis during total
parenteral nutrition and bowel rest in the rat. JPEN J Parenter Enteral Nutr 19: 80-82.
132. Garcia-Ruiz, C. & Fernandez-Checa, J. C. (2006) Mitochondrial glutathione:
hepatocellular survival-death switch. J Gastroenterol Hepatol 21 Suppl 3: S3-6.
92
133. Dominiczak, M. H. (2005) Hyperlipidaemia and cardiovascular disease:
triglycerides--new evidence for links with atherogenesis? Curr Opin Lipidol 16: 701704.
134. Neumeier, M., Weigert, J., Schaffler, A., Weiss, T. S., Schmidl, C., Buttner, R.,
Bollheimer, C., Aslanidis, C., Scholmerich, J. & Buechler, C. (2006) Aldehyde
oxidase 1 is highly abundant in hepatic steatosis and is downregulated by adiponectin
and fenofibric acid in hepatocytes in vitro. Biochem Biophys Res Commun 350: 731735.
135. Santangelo, C., Matarrese, P., Masella, R., Di Carlo, M. C., Di Lillo, A.,
Scazzocchio, B., Vecci, E., Malorni, W., Perfetti, R. & Anastasi, E. (2007)
Hepatocyte growth factor protects rat RINm5F cell line against free fatty acid-induced
apoptosis by counteracting oxidative stress. J Mol Endocrinol 38: 147-158.
136. Perez, M. J., Velasco, E., Monte, M. J., Gonzalez-Buitrago, J. M. & Marin, J. J.
(2006) Maternal ethanol consumption during pregnancy enhances bile acid-induced
oxidative stress and apoptosis in fetal rat liver. Toxicology 225: 183-194.
137. Oliveira, C. P., Coelho, A. M., Barbeiro, H. V., Lima, V. M., Soriano, F.,
Ribeiro, C., Molan, N. A., Alves, V. A., Souza, H. P. et al. (2006) Liver mitochondrial
dysfunction and oxidative stress in the pathogenesis of experimental nonalcoholic
fatty liver disease. Braz J Med Biol Res 39: 189-194.
138. Lenaz, G., Bovina, C., D'Aurelio, M., Fato, R., Formiggini, G., Genova, M. L.,
Giuliano, G., Merlo Pich, M., Paolucci, U. et al. (2002) Role of mitochondria in
oxidative stress and aging. Ann N Y Acad Sci 959: 199-213.
139. Nomura, S., Tatemichi, M., Kaminishi, M. & Esumi, H. (2001) A novel method
for detecting single glandular intestinal metaplasia in the mucosal surface of the fixed
stomach using methylene blue. Jpn J Cancer Res 92: 659-665.
140. Sastre, J., Serviddio, G., Pereda, J., Minana, J. B., Arduini, A., Vendemiale, G.,
Poli, G., Pallardo, F. V. & Vina, J. (2007) Mitochondrial function in liver disease.
Front Biosci 12: 1200-1209.
141. Bartsch, H. & Nair, J. (2004) Oxidative stress and lipid peroxidation-derived
DNA-lesions in inflammation driven carcinogenesis. Cancer Detect Prev 28: 385-391.
142. Pessayre, D., Fromenty, B. & Mansouri, A. (2004) Mitochondrial injury in
steatohepatitis. Eur J Gastroenterol Hepatol 16: 1095-1105.
143. Albano, E. (2006) Alcohol, oxidative stress and free radical damage. Proc Nutr
Soc 65: 278-290.
144. Kim, B. C., Kim, H. G., Lee, S. A., Lim, S., Park, E. H., Kim, S. J. & Lim, C. J.
(2005) Genipin-induced apoptosis in hepatoma cells is mediated by reactive oxygen
species/c-Jun NH2-terminal kinase-dependent activation of mitochondrial pathway.
Biochem Pharmacol 70: 1398-1407.
93
145. Guicciardi, M. E., Deussing, J., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Svingen, P. A., Peters,
C., Kaufmann, S. H. & Gores, G. J. (2000) Cathepsin B contributes to TNF-alphamediated hepatocyte apoptosis by promoting mitochondrial release of cytochrome c. J
Clin Invest 106: 1127-1137.
146. dela Pena, A., Leclercq, I. A., Williams, J. & Farrell, G. C. (2007) NADPH
oxidase is not an essential mediator of oxidative stress or liver injury in murine MCD
diet-induced steatohepatitis. J Hepatol 46: 304-313.
147. Romestaing, C., Piquet, M. A., Letexier, D., Rey, B., Mourier, A., Belouze, M.,
Rouleau, V., Dautresme, M., Ollivier-Hourmand, I. et al. (2007) Mitochondrial
adaptations to Steatohepatitis induced by a methionine-choline deficient diet. Am J
Physiol Endocrinol Metab.
148. Orrenius, S. (2007) Reactive oxygen species in mitochondria-mediated cell
death. Drug Metab Rev 39: 443-455.
149. Scaffidi, P., Misteli, T. & Bianchi, M. E. (2002) Release of chromatin protein
HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature 418: 191-195.
150. Rovere-Querini, P., Capobianco, A., Scaffidi, P., Valentinis, B., Catalanotti, F.,
Giazzon, M., Dumitriu, I. E., Muller, S., Iannacone, M. et al. (2004) HMGB1 is an
endogenous immune adjuvant released by necrotic cells. EMBO Rep 5: 825-830.
151. Barreyro, F. J., Kobayashi, S., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Malhi, H. &
Gores, G. J. (2007) Transcriptional regulation of Bim by FoxO3A mediates
hepatocyte lipoapoptosis. J Biol Chem 282: 27141-27154.
152. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W. & Gores, G. J. (2006) Free fatty acids
induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. J Biol Chem 281: 12093-12101.
153. Ji, J., Zhang, L., Wang, P., Mu, Y. M., Zhu, X. Y., Wu, Y. Y., Yu, H., Zhang, B.,
Chen, S. M. & Sun, X. Z. (2005) Saturated free fatty acid, palmitic acid, induces
apoptosis in fetal hepatocytes in culture. Exp Toxicol Pathol 56: 369-376.
154. Parola, M. & Robino, G. (2001) Oxidative stress-related molecules and liver
fibrosis. J Hepatol 35: 297-306.
155. Opara, E. I., Meguid, M. M., Yang, Z. J. & Hammond, W. G. (1996) Studies on
the regulation of food intake using rat total parenteral nutrition as a model. Neurosci
Biobehav Rev 20: 413-443.
156. Assy, N., Kaita, K., Mymin, D., Levy, C., Rosser, B. & Minuk, G. (2000) Fatty
infiltration of liver in hyperlipidemic patients. Dig Dis Sci 45: 1929-1934.
157. Bedogni, G., Miglioli, L., Masutti, F., Tiribelli, C., Marchesini, G. & Bellentani,
S. (2005) Prevalence of and risk factors for nonalcoholic fatty liver disease: the
Dionysos nutrition and liver study. Hepatology 42: 44-52.
94
158. Malhi, H., Gores, G. J. & Lemasters, J. J. (2006) Apoptosis and necrosis in the
liver: a tale of two deaths? Hepatology 43: S31-44.
159. Tacikowski, T., Dzieniszewski, J., Nowicka, G. & Ciok, J. (2002) Comparative
analysis of lipid profiles assessed by ultracentrifugation in patients with various
hyperlipoproteinaemia types in correlation with hepatic steatosis. Med Sci Monit 8:
CR697-701.
160. Adams, L. A., Angulo, P. & Lindor, K. D. (2005) Nonalcoholic fatty liver
disease. Cmaj 172: 899-905.
161. Videla, L. A., Rodrigo, R., Araya, J. & Poniachik, J. (2004) Oxidative stress and
depletion of hepatic long-chain polyunsaturated fatty acids may contribute to
nonalcoholic fatty liver disease. Free Radic Biol Med 37: 1499-1507.
162. Zamara, E., Novo, E., Marra, F., Gentilini, A., Romanelli, R. G., Caligiuri, A.,
Robino, G., Tamagno, E., Aragno, M. et al. (2004) 4-Hydroxynonenal as a selective
pro-fibrogenic stimulus for activated human hepatic stellate cells. J Hepatol 40: 60-68.
163. Dianzani, M. U. (2003) 4-hydroxynonenal from pathology to physiology. Mol
Aspects Med 24: 263-272.
164. Laurora, S., Tamagno, E., Briatore, F., Bardini, P., Pizzimenti, S., Toaldo, C.,
Reffo, P., Costelli, P., Dianzani, M. U. et al. (2005) 4-Hydroxynonenal modulation of
p53 family gene expression in the SK-N-BE neuroblastoma cell line. Free Radic Biol
Med 38: 215-225.
95
‫תודה גדולה מגיעה למי שתרמו לעבודה זו‪.‬‬
‫לפרופ' מדר ודר' תירוש‪ ,‬על הדרכתם המקצועית‪ ,‬העידוד‬
‫והסבלנות גם ברגעים הקשים והפחות מוצלחים‪.‬‬
‫תודה רבה‪ ,‬לכל חברי המעבדה ובמיוחד לנגה בודיק‪,‬‬
‫שרית ענבי‪ ,‬אופיר בכר‪ ,‬ואנה ארוניס על עזרתם‪.‬‬
‫תודה מיוחדת לאשתי מרב אשר נתנה את העידוד‬
‫והשלווה על מנת להשלים משימה זו‪.‬‬
‫‪96‬‬
Effect of Triglycerides on Lipotoxicity in the Liver- Interaction
with the Nitric Oxide System and Reactive Oxygen Species.
Thesis submitted for the degree
"Doctor of Philosophy"
By: Erez Ilan
Submitted to the Senate of the Hebrew University of Jerusalem
December/2007
97
Effect of Triglycerides on Lipotoxicity in the Liver- Interaction
with the Nitric Oxide System and Reactive Oxygen Species.
Thesis submitted for the degree
"Doctor of Philosophy"
By: Erez Ilan
Submitted to the Senate of the Hebrew University of Jerusalem
December/2007
98
This work was done under the supervision of:
Prof. Zecharia Madar
Dr. Oren Tirosh
99
Abstract
Background: Fatty liver disease is defined as lipid accumulation in the liver and its
prevalence is increasing in developed countries as part of the obesity epidemic. This
phenomenon is the leading cause of hepatic failure in developed countries. The
diseases develops from an initial state of simple steatosis and progresses to non
alcoholic steatohepatitis (NASH), fibrosis portal hypertention and hepatocellular
carcinoma. The cause for the progression of the steatosis to NASH is unknown but
several options have been raised regarding its nature. Some of the symptoms
described in fatty liver disease can be attributed to changes in cellular redox balance
and the nitric oxide (NO) system. The symptoms include: cell death (necrotic or
apoptotic), intrahepatic hypertention, cellular signaling dysfunction, hepatocyte
dysfunction and mitochondrial damage.
Hypothesis: Fatty liver can lead to liver disease although the precise mechanisms are
unknown. We assume that the NO system and the redox balance of the hepatocytes,
play a significant role in the development of fatty liver disease and triglycerides can
directly modulate these factors.
Methods: This study used three models: 1. Primary cultures of isolated rat
hepatocytes isolated from Wistar rats by washing the liver from blood and digesting it
with buffer containing collagenase. Cells were filtered, centrifuged to get a clean
culture and seeded on fibronectin coated plates. The cells were then incubated with
different treatments for periods up to 48 hours.
2. FaO rat hepatic carcinoma cell
line. These cells were cultured on plastic dishes and exposed to different treatments
3. An in vivo model of Wistar rats. A silicon tip plastic tube was inserted into the
jugular vein of experimental animals and the tube was moved subcutaneously to the
back of the neck and externalized. The rat was then attached to a harness connected to
100
a metal spring, and the tube was joined threw the spring to a swivel which enabled
free movement within the cage. The rats were administered 10 ml of lipid emulsion
per day at rate of 2 ml per h for 1, 2,4 or 6 days. At the end of the experiments the
rats were sacrificed and blood and liver samples were collected.
The lipid emulsion used in the experiments was soy based and commonly used for
total parental nutrition. Following treatments the parameters examined were: lipid
accumulation, cell viability, reactive oxygen species (ROS) levels, DNA
fragmentation, changes in ATP levels, glutathione levels, caspase 3 activity, nitrite
levels in culture medium, expression of proteins by SDS-PAGE, changes in mRNA
levels by real-time PCR, histological stainings.
Results: Primary cell cultures incubated with lipid emulsion (0.1% triglycerides
(TG)) for 48 h exhibited a marked reduction in nitrite production, this reduction was
dose dependent (r=0.9) in concentrations ranging 0.1%-0.01% TG.
Nitrite
production was accompanied by a reduction in endothelial/inducible nitric oxide
synthase (e/iNOS) mRNA and protein levels. Because these genes can be regulated
by oxidative stress, ROS levels were determined. ROS levels were found to be
inversely correlated to the cellular nitrite production (r=0.9) in the concentration range
of 0.1%-0.01%. Together with this increase in ROS levels, a marked reduction in
glutathione levels was observed. Inhibiting the production of glutathione led to an
effect similar to the effect cause by TG on nitrite production.
Water soluble
antioxidant partially (or fully) prevented the reduction of nitrite production induced by
TG. The antioxidant NAC attenuated the reduction in the e/iNOS mRNA levels and
prevented changes in enzyme levels induced by TG.
In FaO hepatic cells exposed to TG 0.1%, cell death started after 12 h and massive
cell death was observed after 24 h. ROS levels were elevated in these cells following
101
incubation with TG 0.1% and peaked after 6 h. This implicated high ROS levels as a
potential cause for cell death. In order to identify the source of the excess ROS
induced by incubation with TG, cells were incubated with DPI a flavoproteins specific
inhibitor. DPI prevented the production of excess ROS induced by TG, indicating the
source of ROS is probably mitochondrial. Due to the potential mitochondrial damage
induced by the TG, ATP production was measured. TG induced a reduction in the
ATP levels 6 h following the TG exposure, this reduction was accompanied with an
increase in the phosphorylation of AMPK, a cellular energy sensor. The reduction in
the ATP levels and increase in AMPK phosphorylation induced by the TG was
prevented by NAC. To determine the type of cell death induced by TG two
parameters associated with apoptosis were examined: caspase 3 activity and DNA
fragmentation. In these two parameters no change was observed in the first 24 h
following the incubation with TG. HMGB1, a parameter used to help identify necrosis
was determined and found to be decreased by 6 h incubation with TG. These two
parameters together indicate that TG induced necrotic cell death in the FaO cell line
model. In contrast to the FaO cell line, the production of ATP in the primary cell
cultures was not negatively effected by the TG exposure however, a trend towards
elevated levels was observed. Addition of NAC to the TG treatment increased the
ATP levels.
Animals administered with lipid emulsion for 6 days exhibited mild damage to the
liver tissue compared to the PBS treated animals. In histological sections
accumulation of lipids in the hepatocytes was observed in rats treated with lipid
emulsion. Blood liver enzymes were elevated in the lipid emulsion treated animals
after 6 day (but not before). This was accompanied by an increase in 4HNE, a marker
102
for oxidative stress, and a decrease in eNOS mRNA levels. The protein levels of
eNOS were markedly reduced after 4 day (35%) and after 6 day (55%).
Conclusion: This research showed that the production of NO in primary rat
hepatocytes is regulated by TG and mediated by the production of ROS. The
reduction in the NO production was a result of decreased NOS enzymes and was
prevented by the antioxidant NAC. TG induced necrotic cell death, in the FaO cell
line, was caused by energy crises resulting from damage caused to the mitochondria
by ROS. The downregulation of the NO system and the elevation of the oxidative
stress by the lipid emulsion occurred in the in vivo model as well as in the primary
hepatocytes. The hepatic cell death in vivo, as concluded from the increase in blood
liver enzymes, was preceded by an increase in the eNOS enzyme, suggesting that NO
regulation may be an important factor in hepatic cell death. This research suggests
that the antioxidant status of hepatocytes in fatty liver disease is of great importance.
High levels of antioxidants in hepatocytes can protect them from oxidative damage
and reduction in the NO production system, two potential damaging factors in fatty
liver.
103
Table of Contents
Abstract
4
Table of Contents
8
Introduction
11
Fatty liver
11
Nitric Oxide (NO)
14
Oxidative stress
18
Antioxidant and the cellular antioxidant array
24
The common treatment for fatty liver
27
Hypothesis
28
General aim
28
Specific aims
28
Materials and methods
29
Chemicals
29
Antibodies
31
Primers
32
Cell cultures
33
FaO cell line
33
Preparation hepatocytes
33
Primary cell culture
33
Cell viability assay
34
Reactive oxygen species
34
Quantification of cellular fat content
35
DNA fragmentation
35
Caspase3 activity
36
Quantification of ATP levels
37
Triglycerides profile assay
37
Fatty acid profile assay
37
Reduced glutathione assay
38
Nitrite in culture media assay
38
In vivo experiment
39
Infusion protocol
39
104
Histology
40
General
40
Protein quantification
40
Western Blot
41
RNA extraction
42
cDNA synthesis
43
PCR reaction
44
Real time PCR
45
Data analysis
45
Results
46
The effects of triglycerides on the NO system
46
The entry of triglycerides into the cells
46
The effects of lipid on cell viability
48
The effects of lipids on the NO production in primary cell culture
48
ROS induction by triglycerides
49
The antioxidants effects on nitrite production in cells exposed to triglycerides
52
The effects of triglycerides TNF α induced NO production
55
The effects of FaO cells exposure triglyceride
56
The entry of triglycerides into FaO cells
56
The effects of triglyceride exposure on cell viability and ROS production
57
The effects of triglyceride exposure on the cellular energy balance
60
The type of cell death induced by triglycerides
61
In Vivo exposure to triglycerides
63
Food consumption, lipid profile, and accumulation of fat in the liver
63
The effects of triglyceride on liver oxidative stress
65
The effects of triglyceride exposure on the NO system
65
The effects of triglyceride exposure on the energy balance
66
Discussion
67
The effects of triglyceride exposure on the NO system in primary cell culture
67
The accumulation of lipid in primary cell culture
67
The effects of triglyceride exposure on the NO system
67
The effects triglyceride on the TNF α induced NO production
70
A model for the effects of triglycerides on the NO system in primary cell culture 71
105
The triglyceride effect on hepatocytes viability
72
The triglyceride effect on cell viability in FaO cell line model
73
Cell death induced by triglycerides
73
The triglyceride effect on the cellular energy balance
75
Type of cell death induced by triglycerides
76
A model for the triglyceride effect on cell viability in FaO cell line model
77
The triglyceride effect on oxidative damage and the NO system in rat total
Parenteral nutrition model
78
A model for the effect of triglycerides on the NO system and ROS in the liver
80
Summery
81
Publications
82
References
83
106