מאמר 2
עבור פרוייקט "בשער ברשת" בלבד פרק מבוא מתוך עבודה לתואר שני של פנחס קריץ שנערכה במנהל המחקר החקלאי – מרכז וולקני ואוניברסיטת בר-אילן. ביוסינתזה של גליקואלקלואידים בתפוח-אדמה )(Solanum tuberosum L. שאלות נוספות ניתן לפנות לדר' עידית גינזברג ,המכון למדעי הצמח ,מרכז וולקני http://www.agri.gov.il/he/people/588.aspx .2מבוא 2.1הגליקואלקלואידים בתפו"א תפוח האדמה )( (Solanum tuberosumתפו"א) הינו צמח ממשפחת הסולניים ) ,(Solanaceaeהכוללת גם את הפלפל ,החציל ,העגבנייה ,והטבק ,ויוצר את הפקעת העמילנית למאכל .בגלל היותו צמח מזין ,הוא הגידול הנפוץ ביותר בעולם של גידול פקעות ,והרביעי בגודלו בעולם בכמות היבול ,אחרי אורז חיטה ותירס. מקור הפקעות של זני הבר הוא מאזור הרי האנדים בדרום אמריקה ומשם נפוצו לספרד ולאירופה כולה בסוף המאה ה .16-הריבוי של תפו"א בעולם המודרני נעשה בצורה וגטטיבית :מהפקעת יוצאים נצרונים ( ,)Sproutsואלו הם פקעות הזריעה ,בניגוד לריבוי בזרעים המתבצע בצמחים אחרים ממשפחת הסולניים. פקעות הזריעה ,או הפקעות למאכל ,עשויות להופיע בצבע לבן ,אדום או בגוון חום-אדמדם ,כתלות בזן .לאחר פריחת הצמח נוצרים פירות הדומים לעגבניות שרי ירוקות ,בהם נמצאים "הזרעים האמיתיים" ,שאינם משמשים לזריעה .לרוב איסוף הפקעות מתבצע בשלב מוקדם יותר מהופעת הפירות ,ועל כן הם לא נראים בד"כ בשדה .הזן העיקרי של תפו"א למאכל הינו ( S. tuberosumטטרפלואידי עם 48כרומוזומים) ,אך קיימים גם זנים דיפלואידים ,ביניהם גם ( S. phurejaעם 24כרומוזומים) .בין הזנים שעברו השבחה וטיפוח קיימים גם טריפלואידים ופנטפלואידים. הצמחים ממשפחת הסולניים ,מייצרים רכיבים רעילים כחלק ממערך ההגנה של הצמח ,הכוללים את האלקלואידים והגליקואלקלואידים .אברי הצמח בהם נמצאים הגליקואלקלאידים בתפו"א הם :פקעות ( 1-14מ"ג 100 /גר' חומר טרי בתפו"א מסחרי) ,גבעולים (בין 32ל 46 -מ"ג 100 /גר' חומר טרי), שורשים ( 86מ"ג 100 /גר' חומר טרי) ,עלים ( 145מ"ג 100 /גר' חומר טרי) ,פרחים ( 500מ"ג 100 /גר' חומר טרי) ונצרונים ( 997מ"ג 100 /גר' חומר טרי) ).(Friedman and Dao 1992 נוכחותם של הגליקואלקלואידים בפקעות והיותם רעילים גם לאדם ,הובילה לסלקציה של צמחים המכילים רמות נמוכות של גליקואלקלואידים .אולם ביצירת היברידים בין S. tuberosumלזני בר ,בנוסף להעברת תכונות רצויות כמו רמה תזונתית גבוהה יותר הועברו גם תכונות בלתי רצויות ,כגון רמה גבוהה של גליקואלקלואידים בפקעות למאכל ) .(Kozukue et al. 1999עדיין ,רמות הגליקואלקלואידים כיום נמוכות בהרבה בתפו"א תרבותיים יחסית לזני הבר. הגליקואלקלואידים העיקריים בתפו"א תרבותי הינם שקונין וסולנין והפרקורסור הסטרואידיאלי שלהם, סולנידין ) .(Rodick et al. 1988שקונין וסולנין הינם גליקוזידים של סולנידין בעמדה -3הידרוקסי של המולקולה .הגליקוזיד של -αסולנין הינו ( α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosyl- β-galactopyranoseסולטריוז) וזה של -αשקונין הינו (( β-D-glucopyranose -2)α-L-rhamnopyranosylשקוטריוז) (( (Friedman and McDonald 1997; Friedman et al. 1993איור .)1 איור .1מבנה הגליקואלקלואידים העיקריים בתפו"א תרבותי-α ,שקונין מצד ימין ו-α-סולנין משמאל. הרכב הסוכרים והסידור שלהם על עמדה -3הידרוקסי של הסולנידין הינו גורם המשפיע על הרעילות שלהם ( .)Friedman et al. 1993רעילותם של שקונין וסולנין נובעת מפעילות מעכבת של אנזים במערכת העצבים, אצטילכולין אסתראז ,המוביל להצטברות של אצטיל כולין ברקמת העצב .כמו כן ,פעילותם כספונינים פוגעת בשלמות ממבראנות תאיות .רעילותם של שני הגליקואלקלואידים אינה שווה ,כאשר -αשקונין נמצא פעיל יותר מ -α סולנין פי ,3-10ושתי צורות הגליקואלקלואידים פועלות באופן סינרגטי ) .(Smith et al. 2001בנוסף ,היחס הכמותי בין שתי הצורות בזנים התרבותיים עומד על -α 2.4שקונין -α 1 :סולנין .בגלל הרעילות השונה של שני הגליקואלקלואידים ,שינוי ביחס זה ישפיע על רעילות הפקעת מלבד הריכוז הכולל של הגליקואלקלואידים ).(Friedman and Dao 1992 כנאמר ,הגליקואלקלואידים מהווים חלק ממערך ההגנה של הצמח כנגד מחלות ומזיקים שונים :נגד פטריות ) (Fewell et al. 1993; Fewell and Roddick 1997חיידקים ווירוסים ) ,(Austin et al. 1988; Pehu et al. 1990; Rokka et al. 1994וחרקים ).(Sanford et al. 1992; 1997 בזני הבר קיימים גליקואלקלואידים נוספים ,שרעילותם ידועה פחות ) ,(Friedman 2006מבניהם הלפטינים והלפטינינים אשר נחקרו בעיקר בשל פעילותם בעיכוב התפתחות המזיק Colorado Potato Beetle )(Sinden et al. 1986; 1988) (Leptinotarsa decemlineata ).(Sanford et al. 1997; Veilleux and Miller 1998; Ranjarajan et al. 2000 גליקואלקלואידים אלו נמצאים בגנוטיפים chc 80-1ו chc 55-1 -של S. chacoenseהמשמשים במחקר זה, שם הם מהווים את עיקר טיפוסי הגליקואלקלואידים בצמח ) .(Kowalski et al. 2000; Yencho et al. 2000; Sanford et al. 1996טיפוסי S. chacoenseאו זני בר אחרים יכ ולים לשמש בתכניות השבחה עם זני תפוחי אדמה תרבותיים כדי להקנות לאחרונים עמידות כנגד מזיקים. הגן ללפטין מופה על כרומוזום מס' 1של S .chacoense ) (Deahl et al. 1991; Hutvagner et al. 2001הלפטינים למעשה הם תוצרי אצטילציה של סולנין ושקונין. בקבוצת הלפטינים קיימים שני אגליקונים( 23-hydroxysolanidine ,לפטינינים) ו- ( 23-acetylleptinidineלפטינים) .לצורות ההידרוקסיל או האצטיל קשורים שיירי הסוכר סולטריוז (לפטין +IIלפטינין )IIאו שקוטריוז (לפטין +Iלפטינין ( )Iאיור .)2 בהקשר של עבודה זו ,ייחודם של הלפטינים הוא בכך שהם נמצאים רק בעלים ולא בפקעות; תכונה המעידה על רגולציה ייחודית לרקמות הצמח השונות ועל האפשרות לבקר את יצירת הגליקואלקלואידים בפקעות למאכל בנפרד מזו של שאר רקמות הצמח. איור .2מבנה הלפטינים בעלים של גנוטיפים של .(Friedman 2006) S. chacoense 2.2גליקואלקלואידים ותזונה בריכוזים נמוכים הגליקואלקלואידים מקנים לתפו"א את הטעם האופייני לו אולם בריכוזים גבוהים מ20 - מ"ג 100 /גר' חומר טרי של הפקעת הם רעילים לאדם ).(Smith et al. 1996; Valkonen et al. 1996 כבר בריכוזים מעל 14מ"ג 100/גר' חומר טרי יגרמו לטעם מריר ) ,(Sinden et al. 1976ומעל 22מ"ג/ 100גר' חומר טרי יגרמו לצריבות בפה ובגרון .להגבלה על ריכוזם בפקעות למאכל חשיבות רבה מאחר והגליקואלקלואידים עמידים להרתחה ,בישול ,אפייה ,טיגון או הכנה במיקרוגל ( .(Alt et al. 2005חשיפה לרמה גבוהה של גליקואלקלואידים עשויה לגרום להפרעות בקיבה ובמעיים ,קומה ואפילו מוות ) .(Alt et al. 2005; Smith et al. 1996; Roddick 1996מלבד השימוש של פקעות תפו"א למאכל, התפו"א בעל חשיבות רבה בתעשיית העמילן .על כן הפחתת רמות גליקואלקלואידים במהלך הכנת המיצוי מהפקעות חשיבות רבה .במידה ורמת הגליקואלקלואידים בפקעות היא ברמה גבוהה הם יופיעו גם במיצוי, וכך יהוו גורם רעיל במוצר ) .(Alt et al. 2005רמת הגליקואלקלואידים בפקעת אינה אחידה ,ומרוכזת בעיקרה בקליפה של הפקעת בהשוואה לפרנכימה של הפקעת ) .(Friedman and McDonald 1997; Bejerano et al. 2000; Friedman et al. 2003הריכוז הגבוה ביותר של הגליקואלקלואידים בפקעת נמצא בשכבה בעובי של כ 1.5-מ"מ הממוקמת ישירות מתחת לקליפה ).(Valkonen et al. 1996 הקליפה מהווה חלק מהפרידרם שהינו רקמת הגנה לפקעת .הפרידרם מורכב משלושה סוגי תאים :תאי פלם ) (Phellemמשועם מרכיבים את שכבות התאים החיצוניות ומהווים את קליפת הפקעת .הפלוגן ,קמביום השעם ,הינו רקמה מריסטמתית הממוקמת מתחת לפלם ויוצרת את הקליפה כלפי חוץ ואת שכבות הפלודרם כלפי פנים הפקעת ) .(Lulai 2001בעבודה זו מוצע כי עיקר הביוסינתזה של הגליקואלקלואידים בזן תרבותי של תפו"א ממוקמת בשכבת הפלודרם (איור .)3 Phellem Phellogen Phelloderm Parenchyma cells איור .3מבנה הקליפה בתפו"א .שכבת הפלם החיצונית ,הנוצרת משכבת הפלוגן המריסטמית .כלפי פנים הפלוגן יוצר את הפלודרם דמוי הפרנכימה ).(Lulai 2001 ר מות הגליקואלקלואידים בצמח ובפקעות מושפעות מגורמי גידול ומטיפול בתוצרת לאחר האסיף ,במהלך האחסון והשיווק ( .(Friedman and McDonald 1997ידועים מספר גורמים המשרים צבירה של גליקואלקלואידים :פגיעה מכאנית ) ,(Mondy et al. 1988חשיפה לאור ) ,(Dao et al. 1994; Dimenstein et al. 1997; Percival et al. 1999חום ) ,(Lafta and Lorenzen 2000וחשיפה לפתוגנים .גורמים אלו אינם בעלי השפעה זהה על כל אברי הצמח. חשיפה ממושכת של הפקעות לאור תגרום לעלייה מהירה וחדה ברמת הגליקואלקלואידים .יחד עם זאת ,אותם התנאים לא ישפיעו באותה הרמה על עלים ) .(Griffiths and Dale 2001בתנאי אחסון יבשים ולא מתאימים רמת הגליקואלקלואידים עשויה לעלות בין 43-50%בהשוואה לפקעות שלא נחשפו לתנאי יובש ) .(Bejerano et al. 2000מלבד טמפרטורה ועוצמת הארה ,גם המצב המטבולי של הפקעת עצמה יכול להשפיע על רמת הגליקואלקלואידים .פקעות שאינן בשלות ,או פקעות מצמחים שנחשפו לתנאי סביבה קיצוניים שגרמו לאי הבשלת הפקעת גרמה גם לעליית גליקואלקלואידים .מאידך ,שינוי בגודל העלה במהלך גדילתו כמעט ולא משפיע על רמות הגליקואלקלואידים .יתר דישון בחנקן ופגיעה פיסית בפקעות במהלך גידולן ,עשוי גם כן להעלות גם את רמת הגליקואלקלואידים בפקעות ) .(Lafta et al. 2000על כן ,בקרה על רמת הגליקואלקלואידים ברמה הגנטית תאפשר לפתח זן שרמת הגליקואלקלואידים בפקעות תהיה נמוכה גם בעת חשיפה לתנאים לא מיטביים. 2.3מסלול הביוסינתזה של הגליקואלקלואידים מסלול הביוסינתזה של הגליקואלקלואידים מתפצל מהמסלול המוולוני/איזופרנואידי ,דרך השלבים הבאים :אצטט) ,(C2מוולונט ) ,(C6איזופנטניל פירופוספאט ) ,(C30) squalene ,(C5וכולסטרול ).(C27 כולסטרול הוא הפרקורסור הראשוני ליצירת אגליקון בלתי רווי סולנידין שהוא הפרקורסור הישיר לגליקואלקלואידים סולנין ושקונין ;(Kozukue et al. 2001; Friedman and McDonald 2006 )Bergenstraahle et al. 1996 (איור .)4 האנזים (HMGR) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductaseמקטלז את הריאקציה הספציפית הראשונה של המסלול המוולוני ע"י הפיכת HMG-Coenzyme Aלחומצה מוולונית ,הפרקורסור הראשוני לכל האיזופרנואידים ).(Choi et al. 1992; Chappell 1995 קיימים לפחות שלושה איזופורמים של HMGRהמקודדים ע"י משפחת הגנים (Choi et al. hmg ) ,1992דבר המעיד על מעורבותם בתהליכים מטבוליים נפרדים לביוסינתזה של איזופרנואידים (Stermer et ) .al. 1994הגברה בפעילותו של ה HMGR-נגרמת מעקה כתוצאה מפציעה והדבקת פתוגנים .פציעה גורמת להפעלתו של hmg1בעוד ששני האיזוגנים הנוספים hmg2ו hmg3-מושרים כתגובה לפתוגן כגון- ;Phytophthora infestansעלייה בביטוי של hmg1תהיה מלווה בירידת ביטוי של hmg2וhmg3- ) .(Choi et al. 1992; Yang et al. 1991האיזופורם HMGR1נראה כאחראי לביוסינתזה של סטרולים, ויש לו חשיבות רבה ביחס לצבירת הגליקואלקלואידים במסלול ) .(Choi et al. 1992יתרה על כך ,השתקתו של הגן hmg1נמצאת בקורלציה לירידה ברמת הגליקואלקלואידים ) .)Choi et al. 1992; 1994בהתאם, עבודה זו מתמקדת ב hmg1מבין שלושת האיזוגנים ובודקת את רמת ביטויו ביחס לרמת הגליקואלקלואידים בצמח .בהמשך המסלול האיזופרנואידי Farnesyl-PP ,הינו פרקורסור לפעילות האנזימים Squalene (PSS1) synthase 1ו( (PVS1) Sesquiterpene (vetispiradiene) cyclase 1-איור .)4אנזימים אלו מקטלזים את השלב הראשון של ענפים מטבוליים המובילים לסטרולים וגליקואלקלואידים ,ו- Sesquiterpenoid phytoalexinsבהתאמה ) .(Choi et al. 1992; Chappell et al. 1995כיוון ששני האנזימים מתחרים על אותו הפרקורסור ,הגברת פעילותו של אנזים אחד תגרום לירידה בפעילותו של האנזים השני ).(Zook and Kuc 1991 האנזים PSS1מתחיל את זרימת התוצרים מ Squalene-לתוצרים הסטרולים ).(Piironen et al. 2000 גורמים סביבתיים עשויים להשפיע על ביטוי הגן pss1בתפו"א .לדוגמא ,הדבקה ב P. infestans -או חשיפה לאליסיטור מגבירים את פעילותו של PVS1הגורמת לעלייה ב ,vetispiradiene-הפרקורסור ל- ( Sesquiterpenoid phytoalexinsלובימין ורישיטין) וירידה בפעילות .(Yoshioka et al. 1999) pss1 לעומת זאת ,פציעה תגרום ל שפעול של סינתזת סטרולים וסינתזת גליקואלקלואידים ,דרך מסלול בו מוגבר ביטוי ה HMGR -ו.(Yoshioka et al. 1999; Kondo et al. 2003) PSS1 -כלומר ,הרגולציה של HMGR1הינה בהתאמה עם פעילות .(Zook and Kuc 1991; Yoshioka et al. 1999) PSS1לכן, בעבודה זו נמדדה רמת הביטוי של hmg1ו pss1-ביחס לרמת הגליקואלקלואידים בגנוטיפים שונים של תפו"א ,וברקמות שונות. איור .4תרשים סכמאטי של ביוסינתזת גליקואלקלואידים .חץ משולש מציג מספר שלבים אנזימתיים. אנזים המפתח לביוסינתזה של סטרולים ממברנליים מ cycloartenol -הוא .(SMT1) Sterol C24-methyltransferase type 1ביטוי ביתר של SMT1גרם לירידה משמעותית ברמת הכולסטרול ,ובהתאם חלה גם ירידה ברמת הגליקואלקלואידים ) .(Arnqist et al. 2003עליה ברמת הגליקואלקואידים ,ביניהם הסולנידין ,ה-α-סולנין וה-α-שקונין גרמה לירידה ברמת הכולסטרול ,שסונתז מ- .(Bergenstrahle et al. 1996) cycloartenolזה מוכיח כי הכולסטרול הוא הפרקורסור לביוסינתזה של גליקואלקלואידים בתפו"א ורמתו בצמח חיונית להמשך ביוסינתזה של הגליקואלקלואידים. הריאקציה הסופית של ביוסינתזת הגליקואלקלואידים היא גליקוזילציה של סולנידין ע"י סולנידין גלוקוסיל טראנספראז sgt2 ,וסולנידין גלקטוזיל טרנספראז sgt1 ,היוצרים -γשקונין ו- γ-סולנין בהתאמה. הפעילות היחסית של שני אנזימים אלו קובעת את היחס הכמותי בין סולנין לשקונין ) .(Moesh et al. 1997; McCue et al. 2005; 2006לאחרונה נתגלה SGT3בעל פעילות רמנוזיל טראנספראז הפועל על צורות βשל סולנין ושקונין ,לקבלת צורת αשלהם ).(McCue et al. 2007 במסלול הייחודי לביוסונתזה של הגליקואלקלואידים ,ביטוי תעתיקי sgtנמצא בקורלציה עם ביטוי ,hmg1ומושפע גם כן מפציעה ,תוצאה המעידה על רגולציה מתואמת בין שני הגנים לקבלת התוצר הסופי ).(Moesh et al. 1997; Choi et al. 1994 כל האנזימים היחודיים לביוסינתזה של גליקואלקלואידים הידועים כיום ,קובעים את הצורות השונות של הסולנין והשקונין ,אך לא ידוע עדיין על אנזים המבקר את רמת כלל הגליקואלקלואידים ,או אנזימים המבקרים את המסלול הספיציפי ליצירתם .מאחר והאנזימים HMGRו PSS1-במעלה המסלול המוולוני/איזופרנואידי יוצרים את הפרקורסורים לסינתזת הגליקואלקלואידים ,תבוצע אנליזה שתבחן את פעילותם .במערכת זו יבוצעו אנליזות של הגנים יחד עם אנליזות לבדיקת רמות גליקואלקלואידים .ניסויים אלו יהוו את השלב ראשון בקביעת הגורמים התורמים לרמת הגליקואלקלואידים בצמח.
© Copyright 2024