1 Mikroskopije Sestava aparature za slikanje Interakcija med snovjo
Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Sestava aparature za slikanje Interakcija med snovjo in valovanjem (delci) IZVOR valovanja (delcev) „OPTIKA“ OPAZOVANA SNOV / PRIPRAVA VZORCA „OPTIKA“ DETEKTOR Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 1 Primerjaj med metodami!! • občutljivost • razmerje signal/šum Kontrast – zaznavanje robov/mej!!! • dinamični razpon • prostorska ločljivost • časovna ločljivost • osnovni princip nastanka slike • pogoji priprave opazovanega sistema • komponente aparatur oz. opreme Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Mikroskopija • Pred očesom potrebujemo vmesnik, ki poveča sliko ! Slednja pomeni povečane razdalje med deli slike oz. povečanimi koti ! • Še vedno gledamo krajevno odvisno absorbcijo svetlobe ! • V vsaki točki slike zbiramo svetlobo – iz vseh optičnih ravnin in – različnih valovnih dolžin ! • Kontrast pomeni razliko v inteziteti v dveh točkah slike ! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 2 Povečava mikroskopa okular kot povečevalno steklo Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Primeri slik optične mikroskopije majhni organizmi, organi (6x, ~ 100 m) 1 mm = 1000 m tkiva (600x, ~ 10 m) posamezne celice (1000x, ~ 1 m) Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 3 Povečava vs. ločljivost Poljubno velika povečava nam ne da poljubno velike ločljivosti!! GEOMETRIJSKA OPTIKA Zoran Arsov VALOVNA OPTIKA Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Uklon na eni reži in interferenčni vzorec Airyjev disk * .... točkast izvor svetlobe Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 4 Rayleighjev kriterij S1 max. S2 (1.) min. dva točkasta izvora (S1, S2) y … lateralna ločljivost Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Meja ločljivosti pri optičnem mikroskopu kot zajema (kotna apertura) y ≈ 0.61 / sin y bo manjši za nižje in večje Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 5 Kako lahko povečamo ločljivost y = 0.61 / (n sin) = = 0.61 / NA NA ... numerična apertura imerzijska mikroskopija /n (n ... lomni količnik) y ≈ 200 nm ≈ /2 = 450 nm n = 1.5 = 70° Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Lateralna vs. aksialna ločljivost z ≈ 2 y 3D Airyjev vzorec Zoran Arsov 2D Airyjev vzorec Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 6 Različni načini izvedbe presevne optične mikroskopije Metode za neobarvane vzorce!! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Mikroskopija s svetlim poljem Svetlobna mikroskopija eritrocitov Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 7 Mikroskopija s temnim poljem Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Fluorescenčna mikroskopija • Ne gledamo absorpcije vse svetlobe, temveč le tisto, ki se absorbira na fluorescenčnih označevalcih, ki svetlobo absorbirajo ter jo nato emitirajo pri višji valovni dolžini (nižji energiji) ! svetlo polje Zoran Arsov fluorescenca Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 8 Fluorescenčna mikroskopija celic; sestavljena slika iz slik citoskeleta, jedra in membran Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Časovna ločljivost dinamika membranskih domen na orjaških lipidnih vesiklih 0 s 5 s 10 s 15 s 10 µm Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 9 Konfokalna mikroskopija • Dodatna drobna zaslonka zbira svetlobo le iz izbrane optične ravnine ! • V vsaki točki slike zbiramo svetlobo – iz ene same izbrane optične ravnine in – različnih valovnih dolžin ! • Kontrast pomeni razliko v inteziteti v dveh točkah slike v eni optični ravnini ! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini z fluorescenca Zoran Arsov 6 m konfokalna fluor. Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 10 Spektroskopija • Ne zanima nas, od kje prihaja svetloba, temveč kakšna je ! • Gledamo spekter ! Iz celotne slike zbiramo svetlobo in jo analiziramo pri različnih valovnih dolžinah ! • Kontrast pomeni razliko spektralne gostote pri dveh podobnih valovnih dolžinah ! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Konfokalna mikrospektroskopija • Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin ! • Gledamo krajevno odvisno absorbcijo spektra svetlobe ! Ne zanima nas le intenziteta spektra, temveč posamezni deli spektra oz. spektralna gostota, ki se s krajem spreminja ! • Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike ! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 11 Fluorescence intensity (a.u.) konfokalno mikrospektroskopija Membrane probe Nanoparticles 500 550 600 Wavelength (nm) Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini IR in ramanska mikrospektroskopija • Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin v IR področju! • Gledamo krajevno odvisno absorbcijo IR ali Ramanskega spektra! Zanimajo nas posamezni deli spektra, npr. slika v izbranem vibracijskem načinu določene kemijske skupine ! IR vs. Raman y = 0.61 / (n sin) = = 0.61 / NA NA ... numerična apertura • Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike ! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 12 KONCEPT vibracijske MIKROSPEKTROSKOPIJE!!! V vsaki točki slike zajamemo celoten vibracijski spekter. To pomeni, da lahko kontrastiramo sliko preko lokalizacije različnih molekulskih skupin (kemično mapiranje). Intenziteta barve lahko pomeni lokalno koncentracijo neke snovi. Pri SPEKTROSKOPIJI posnamemo povprečen vibracijski spekter vzorca. NI KRAJEVNE INFORMACIJE o razporeditvi komponent v vzorcu!!! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Sklopitev FTIR spektrometra in mikroskopa Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 13 Shema FTIR mikroskopa Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Možnosti za zajem slike vrstični mikroskop (zajem slike točko po točko) mikroskop s FPA detektorjem (zajem celotne slike hkrati) Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 14 Shema Ramanskega mikroskopa spektrometer z detektorjem posebni optični filtri!!! notch – (anti)Stokes edge - Stokes prostor za vzorce Zoran Arsov monokromatski izvor STABILNOST!!! Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Spektralna ločljivost - Raman odvisnost od disperzijskih lastnosti uklonske mrežice Zoran Arsov odvisnost od goriščne razdalje zrcal v spektrometru Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 15 Stimulated Raman Scattering Microscopy – Mikroskopija s stimuliranim ramanskim sipanjem Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 16 Ko svetlobo zamenjajo hitri delci Zelo hitri delci se namreč obnašajo kot svetloba ! Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Presevna elektronska mikroskopija (TEM) • Gledamo krajevno odvisno (ne)sipanje hitrih elektronov ! • V vsaki točki slike zbiramo elektrone, ki se niso sipali na vzorcu, ki mora biti v vakuumu in na prevodnem nosilcu (da se vzorec ne nabija) ! leča • Kontrast pomeni razliko v sipanju elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev (jeder) ! Zoran Arsov elektromagnetna leča (tuljava, kondenzator) fosforna plošča Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 17 TEM Golgijevega aparata rastlinskih celic Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) • Gledamo krajevno odvisno emisijo sekundarno vzbujenih elektronov zaradi trkov z elektroni zelo ozkega snopa! • Kontrast pomeni razliko v intenziteti sekundarnih elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev in njihove elektronske strukture! Zoran Arsov elektromagnetna leča kot objektiv elektromagnetna leča kot deflektor Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 18 SEM izvornih celic Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini 19
© Copyright 2024