UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO ODDELEK ZA FIZIKO ˇ PEDAGOSKA SMER Grega Celcar Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo Diplomsko delo Mentor: izr. prof. dr. Boris Majaron Somentor: dr. Zoran Arsov Ljubljana, maj 2014 Povzetek Pogosto nas zanimajo fizikalne in kemijske lastnosti razliˇcnih vzorcev. Prouˇcujemo jih lahko na razliˇcne naˇcine, ena od primernih eksperimentalnih metod pa je ramanska spektroskopija. Z opazovanjem spektra Ramanovega sipanja lahko ugotovimo prisotne nihajne naˇcine molekulskih struktur, kar nam da podatke o kemijski sestavi vzorcev ter o medmolekulskih interakcijah. Pomanjkljivost spektroskopskega pristopa je v tem, da merimo povpreˇcne lastnosti po celem vzorcu. Eden od naˇcinov dobivanja informacij o lokalnih lastnostih vzorca je sklopitev spektroskopije z mikroskopijo. Zdruˇzena metoda mikrospektroskopije nam omogoˇca, da dobimo sliko vzorca, kjer kontrast slike doloˇcajo lokalne spektroskopske lastnosti opazovanega vzorca. Namen diplomskega dela je bila postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo ter predstavitev koncepta mikrospektroskopije. Sistem smo najprej preizkusili z opazovanjem spektrov standardnih topil organskih snovi, ki smo jih primerjali s priˇcakovanimi spektri. Nato pa smo funkcionalnost sistema potrdili z mikrospektroskopskim slikanjem. Za primerjavo smo uporabili tudi komercialni sistem za ramansko mikroskopijo. Na koncu diplome je podan ˇse kratek pedagoˇski model, s katerim bi lahko Ramanovo sipanje vkljuˇcili v gimnazijski pouk fizike. Kljuˇ cne besede: Ramanska spektroskopija, Ramanovo sipanje, ramanski spekter. Abstract We are often interested in physical and chemical characteristics of different samples. We can study them in different ways. One of possible experimental techniques is Raman spectroscopy. While observing spectrum of the Raman scattering, we are able to detect different vibrations in the molecular structure. This can give us information about composition of samples and intermolecular interactions. A disadvantage of the spectroscopic approach is the measurement of average characteristics in the whole sample area. One of the ways to get information of a specific area in the sample is to couple spectroscopy with microscopy. With the help of microspectroscopy we can get an image of a sample, where the contrast of the image is determined by 1 the local spectroscopic characteristics of the observed sample. The aim of this work was to introduce the concept of microspectroscopy and to build the laboratory system for Raman microscopy. Firstly, we observed spectra of standard organic compounds, which we compared with the expected spectra. Secondly, the functionality of the system was confirmed with the microspectroscopical imaging. For comparison, we also used a commercial system for the Raman microscopy. Finally, a short teaching model of Raman scattering is described that could be used in the grammar school physics classes. Keywords: Raman spectroscopy, Raman scattering, Raman spectrum. PACS: 01.40.ek, 33.20.Fb, 87.64.kp 2 Kazalo 1 Uvod 5 2 Zgodovina 6 3 Osnove 9 3.1 Prostostne stopnje molekule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.2 Klasiˇcen opis Ramanovega sipanja . . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.3 Kvantni opis Ramanovega sipanja . . . . . . . . . . . . . . . . 14 3.4 Razlaga spektrov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.5 Prikaz nekaterih spektrov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 4 Sestavni deli laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo 24 4.1 Laserski izvor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 4.2 Osnovna shema postavitve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 4.3 Uklonski spektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 4.4 Detektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 5 Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo 31 5.1 Opis in lastnosti sestavnih delov . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 5.2 Postavitev sestavnih delov in optiˇcnih komponent . . . . . . . 38 5.3 Izraˇcun postavitve leˇc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 5.4 Ustrezna postavitev in zasuk spektrometra . . . . . . . . . . . 43 3 6 Primeri slikanja z laboratorijskim sistemom za ramansko mikroskopijo 45 6.1 Ramanska spektroskopija standardnih topil . . . . . . . . . . . 45 6.2 Slikanje s sistemom za ramansko mikroskopijo . . . . . . . . . 47 6.3 Primerjava s komercialnim sistemom za ramansko mikroskopijo 51 7 Pedagoˇ ski model Ramanovega sipanja 55 8 Zakljuˇ cek 62 4 1 Uvod Ramanska spektroskopija meri vibracijska stanja molekule. To pomeni, da je ramanska spektroskopija podzvrst t. i. vibracijske spektroskopije. Osnova ramanske spektroskopije je Ramanovo sipanje svetlobe na vzorcu. Z opazovanjem spektra sipane svetlobe, lahko doloˇcimo posamezne karakteristike oziroma kemijsko sestavo opazovanega materiala [1]. Glavna prednost ramanske spektroskopije je njena enostavnost, saj ni potrebna posebna priprava vzorcev. Poleg tega gre za nedestruktivno tehniko. To pomeni, da lahko vzorec uporabimo veˇckrat, ne da bi pri tem spremenili lastnosti vzorca [2]. Ramanska spektroskopija se veliko uporablja v kemijskem in fizikalnem laboratoriju. Vendar se zahvaljujoˇc tehnoloˇskemu napredku ramanska spektroskopija ˇsiri tudi na druga znanstvena podroˇcja, kot so farmacija, sodna medicina, geologija, metalurgija, biokemija, nanotehnologija itd. V biomedicini se na primer uporablja za doloˇcanje rakastih in drugih bolezni pri ˇcloveku in ˇzivalih. Prav tako se NASA ukvarja z izdelavo ramanskega spektrometra, ki bi ga poslali na Luno in Mars z namenom analize kamnin in tal [3]. Za pridobivanja informacij o lokalnih lastnostih vzorca ter slikanje, kjer kontrast slike doloˇcajo spektroskopske lastnosti opazovanega vzorca, lahko uporabimo ramansko mikroskopijo. Pri ramanski mikroskopiji gre za sklopitev spektroskopije z mikroskopijo. Namen diplomskega dela je bila postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo. Na zaˇcetku smo se ukvarjali z ustrezno postavitvijo optiˇcnih elementov. Potem smo za referenco opazovali tipiˇcne organske vzorce, ki imajo znaˇcile ramanske spektre. Te vzorce smo torej izbrali zato, ker nam lahko sluˇzijo kot primerjalni sistem. Ramanski mikroskop namreˇc ˇzelimo uporabljati za slikanje vzorcev na osnovi lipidnih, proteinskih in drugih organskih molekul, npr. za slikanje modelnih in bioloˇskih lipidnih membran. Da bi potrdili ustrezno delovanje sistema, smo izmerjene spektre izbranih topil primerjali s priˇcakovanimi spektri. Kasneje nas je tudi zanimalo, ali je z naˇsim sistemom moˇzno posneti mikrospektroskopsko sliko. Na koncu smo za primerjavo posneli spektre in mikrospektroskopsko sliko izbranih vzorcev tudi na komercialnem sistemu za ramansko mikroskopijo. 5 2 Zgodovina ”Profesor Compton je opazoval dve vrsti sipanja rentgenske svetlobe. Prva izmed teh je bilo nespremenjeno sipanje, ki ustreza normalnim stanjem molekul in atomov, medtem ko druga ustreza spremenjenemu sipanju rentgenske svetlobe in ustreza fluktuacijam med stanji atomov. Zato lahko upraviˇceno priˇcakujemo, da bomo ti dve sipanji opazili tudi pri vidni svetlobi. Prva bo rezultat zaradi optiˇcnih lastnosti atomov in molekul, medtem ko bo druga posledica prehoda iz osnovnega oziroma normalnega stanja. Eksperiment, ki sva ga naredila s K. S. Krishnanom, je potrdil najina priˇcakovanja. Rezultat je pokazal, da se svetloba na molekulah v ˇcisti tekoˇcini in plinu siplje tako, da dobimo poleg elastiˇcnega sipanja tudi neelastiˇcno sipanje.”(Prevedeno po [4]). Tako se je leta 1928 glasil zaˇcetek ˇclanka indijskega fizika Sira Chandrasekharja Venkate Ramana (slika 1) in njegovega ˇstudenta K. S. Krishnana. V tem ˇclanku sta objavila svojo ugotovitev glede neelastiˇcnega sipanja. Teoretiˇcno zasnovo je sicer ˇze leta 1923 postavil avstrijski fizik A. Smekal, vendar vse do leta 1928, z izjemo Comptonovega sipanja iz leta 1923, ni bilo nobene eksperimentalne potrditve o neelastiˇcnem sipanju [5]. Slika 1: Indijski fizik Sir Chandrasekhar Venkata Raman (1888-1970) [6]. Raman je pri svojem odkritju uporabil teleskop, skozi katerega je usmeril snop bele svetlobe [4]. Za teleskopom je postavil dva razliˇcna filtra, med katera je postavil vzorec, kot prikazuje slika 2. 6 Slika 2: Model eksperimenta, ki ga je izvedel Raman. Vijoliˇcni filter prepuˇsˇca svetlobo vijoliˇcne barve, ostalo svetlobo pa absorbira. Svetloba vijoliˇcne barve vpada na vzorec, na katerem se siplje elastiˇcno in neelastiˇcno. Povzeto po [7]. Na sliki 2 je razvidno, da vijoliˇcni filter prepuˇsˇca le vijoliˇcno svetlobo. Vijoliˇcna svetloba se na vzorcu sipa elastiˇcno in neelastiˇcno. Pri elastiˇcnem oziroma Rayleighjevem sipanju ima svetloba enako valovno dolˇzino kot vpadna svetloba. Drugi del sipane svetlobe ustreza neelastiˇcnemu sipanju. Valovna dolˇzina sipane svetlobe je razliˇcna od valovne dolˇzine vpadle svetlobe. Raman je neelastiˇcno sipanje opazoval tako, da je za vzorcem postavil zelen filter. Pri tem je Raman opazoval pribliˇzno 60 razliˇcnih tekoˇcin. Pri vseh tekoˇcinah je priˇslo do neelastiˇcnega sipanja [7]. Za svoje delo je C. V. Raman leta 1930 dobil Nobelovo nagrado za fiziko. Takˇsno neelastiˇcno sipanje se imenuje Ramanovo sipanje [5]. Kljub zaˇcetnemu navduˇsenju se je med 30-imi in 60-imi leti 20. stoletja z ramansko sprektroskopijo ukvarjala le peˇsˇcica ljudi. Glavni razlog je bilo teˇzavno merjenje ramanskega signala, ki je ˇsibak. Najveˇcji razvoj je ramanska spektroskopija doˇzivela ˇsele v 60-ih letih 20. stoletja, ko je ameriˇski fizik T. Maiman razvil prvi laser. Laser namreˇc oddaja zelo moˇcno monokromatsko (enobarvno) svetlobo, ki je idealna za eksperimente povezane z Ramanovim sipanjem [5]. V 70-ih letih se je v Lillu, Franciji, pod vodstvom M. Delhayeja zaˇcela razvijati ramanska mikroskopija, ki so jo poimenovali MOLE (Molecular Op7 tics Laser Examiner). Z razvojem holografskih uklonskih mreˇzic, laserjev, veˇckanalnih detektorjev in CCD kamer je bilo v 90-ih letih mogoˇce zgraditi ramanski mikroskop v obliki ene aparature. Ramanski mikroskop omogoˇca analizo mikroskopskih vzorcev ali mikroskopsko podroˇcje veˇcjih vzorcev [8]. 8 3 3.1 Osnove Prostostne stopnje molekule ˇ ˇzelimo razloˇziti Ramanovo sipanje, je potrebno vpeljati prostostne stoCe pnje, ki doloˇcajo moˇzne lastne nihajne naˇcine molekule. V sploˇsnem so proˇ imamo v molekuli stostne stopnje med seboj neodvisne moˇznosti gibanja. Ce N atomov, imamo v sploˇsnem 3N prostostnih stopenj [9]. Vzemimo molekulo vode, ki je sestavljena iz dveh atomov vodika in enega atoma kisika. Molekula vode ima 9 prostostnih stopenj. Tri prostostne stopnje ustrezajo premiku teˇziˇsˇca molekule v smeri x, y in z. Prav tako molekuli vode ustrezajo tri rotacijske koordinate, ki predstavljajo orientacijo molekule v prostoru [9]. Slika 3a prikazuje ˇse tri prostostne stopnje, ki ustrezajo lastnim nihajnim naˇcinom molekule vode. Ena prostostna stopnja ustreza simetriˇcnemu raztezanju, druga ustreza asimetriˇcnemu raztezanju in tretja ustreza ravninskemu upogibanju (striˇzenju) [1]. Po prostorski razporeditvi atomov molekulo vode uvrˇsˇcamo med molekule, ki niso linearne. V sploˇsnem je ˇstevilo lastnih nihajnih naˇcinov 3N -6 v molekuli, ki ni linearna. Za linearno molekulo ustreza lastnim nihajnim naˇcinom molekuke 3N -5 prostostnih stopenj. Slika 3b prikazuje linearno molekulo (CO2 ), za katero so znaˇcilni ˇstirje lastni nihajni naˇcini. Prva prostostna stopnja ustreza vzdolˇznemu simetriˇcnemu raztezanju, druga ustreza vzdolˇznemu asimetriˇcnemu raztezanju, medtem ko tretja in ˇcetrta ustrezata ravninskemu (striˇzenju) upogibanju [1]. Za laˇzjo predstavitev molekularnih deformacij si sedaj oglejmo klasiˇcen opis. 9 Slika 3: Prikazani so razliˇcni nihajni naˇcini za a) molekulo vode in za b) molekulo CO2 . Povzeto po [1]. 3.2 Klasiˇ cen opis Ramanovega sipanja Predstavljajmo si enostavno dvoatomno molekulo, ki jo prikazuje slika 4. Slika 4: Dvoatomna molekula je sestavljena iz dveh atomov, ki sta povezana z vezjo [1]. Atoma v molekuli sta povezana z vezjo, ki si jo lahko predstavljamo kot vzmet s koeficientom k. Ko atoma nihata, imata razliˇcni amplitudi, ampak nihata z enako frekvenco. Klasiˇcno lahko frekvenco nihanja molekule zapiˇsemo z zvezo 10 1 ν= 2π r k( 1 1 + ). m1 m2 (1) Iz zveze (1) vidimo, da veˇcji kot je koeficient k vzmeti, veˇcja je frekvenca ν. ˇ sta atoma v molekuli povezana z dvojno ali trojno vzmetjo, bo koeficient Ce vzmeti veˇcji in s tem poslediˇcno frekvenca ν. Sedaj nas zanima, kako bi lahko fizikalno opisali sipanje svetlobe na nihajoˇci molekuli. Svetlobo v klasiˇcni fiziki obravnavamo kot elektromagnetno valovanje. Nihajoˇce elektriˇcno polje opiˇsemo z zvezo E = E0 cos(2πν0 t). (2) Svetloba s frekvenco ν0 , ki vpada na molekulo, deformira elektronski oblak molekule. Vzrok za to je delovanje elektriˇcne sile na delce, ki so v elektriˇcnem polju E, pri ˇcemer elektriˇcna sila deluje na pozitivne delce v smeri elektriˇcnega polja in na negativne delce v nasprotni smeri elektriˇcnega polja [10]. Rezultat deformacije elektronskega oblaka je inducirani dipol µind , ki ga zapiˇsemo z zvezo µind = αE, (3) kjer α predstavlja polarizabilnost molekule. Polarizabilnost je v sploˇsnem tenzor drugega ranga in je odvisna od simetriˇcnosti molekule. Polarizabilnost v molekuli ni konstantna, saj se zaradi vibracije molekule elektronski oblak ves ˇcas spreminja. Za naˇse potrebe smemo predpostaviti, da imamo eno molekulo, katere jedra nihajo okoli ravnovesne lege in se ne vrti. Takrat je polarizabilnost funkcija normalnih koordinat [11]. Za majhne vibracije lahko polarizabilnost razvijemo v Taylorjevo vrsto po normalnih koordinatah: Q X ∂α )0 qn + ... α = α0 + ( ∂q n n=1 11 (4) ˇ gre za majhna nihanja kjer Q predstavlja ˇstevilo lastnih nihajnih naˇcinov. Ce jeder, lahko normalne koordinate zapiˇsemo v obliki harmonskega nihanja qn = qn0 cos(2πνn t), (5) kjer qn0 predstavlja amplitudo nihanja in νn frekvenco lastnega nihajnega naˇcina molekule n. Sedaj lahko zvezi (4) in (5) vstavimo v zvezo (3) in dobimo µind Q X ∂α )0 qn0 cos(2πνn t)]E0 cos(2πν0 t). = [α0 + ( ∂q n n=1 (6) V naslednjem koraku preoblikujemo produkt trigonometriˇcnih funkcij v vsoto in dobimo µind = α0 E0 cos(2πν0 t) + Q 1 X ∂α ( + )0 qn0 E0 [cos(2π(ν0 − νn )t) + cos(2π(ν0 + νn )t)]. (7) 2 n=1 ∂qn Prvi ˇclen na desni strani predstavlja nihanje induciranega dipola z enako frekvenco kot je frekvenca vpadle svetlobe. Tedaj govorimo o elastiˇcnem ali Rayleighjevem sipanju. Drugi ˇclen v zvezi (7) je znaˇcilen za Ramanovo sipanje. Razlika frekvence ν0 − νn predstavlja niˇzjo frekvenco sipanja od frekvence vpadle svetlobe in jo imenujemo Stokesovo sipanje. Vsota frekvenc ν0 + νn predstavlja viˇsjo frekvenco sipanja od frekvence vpadle svetlobe in jo imenujemo anti-Stokesovo sipanje. ∂α )0 = 0 nimamo Ramanovega sipanja [10]. Iz zveze (7) ˇse opazimo, da za ( ∂q n To je torej izbirno pravilo za Ramanovo sipanje. Klasiˇcni opis nam poda pravilne frekvence ramanskih ˇcrt. V naslednjem koraku si poglejmo kako je z intenziteto elastiˇcnega in Ramanovega sipanja. Klasiˇcno si lahko predstavljamo, da elektron kroˇzi v atomu 12 okoli jedra s frekvenco ν0 . Takˇsno gibanje ustreza pospeˇsenemu gibanju. Zato elektron seva elektromagnetno sevanje. Izkaˇze se, da je izsevano elektriˇcno polje sorazmerno s pospeˇskom elektrona. Pospeˇsek a elektrona predstavlja drugi odvod dipolnega momenta [12]: Esev ∝ a = ∂ 2µ . ∂t2 (8) Skupna gostota energijskega toka je sorazmerna s kvadratom izsevanega ele2 ktriˇcnega polja Esev , povpreˇcenega po ˇcasu. Ob upoˇstevanju pogoja (8) je gostota energijskega toka sorazmerna z ν04 µ2 [12]. Poslediˇcno lahko intenziteto zapiˇsemo, kot prikazuje zveza I= ν04 µ2 , 12π0 c3 (9) ˇ v zvezi (9) dipolni moment kjer 0 predstavlja influenˇcno konstanto. Ce nadomestimo z induciranim dipolnim momentom iz zveze (7), ter upoˇstevamo povpreˇcenje po ˇcasu, dobimo zvezo B I = ν04 Acos2 (2πν0 t)+ [(ν0 −νn )4 cos(2π(ν0 −νn )t+(ν0 +νn )4 cos(2π(ν0 +νn )t)]. 4 (10) V zvezi (10) je konstanta A = α20 E0 2 12π0 c3 q2 E 2 ∂α 2 n0 0 in konstanta B = ( ∂q ) 3. n 0 12π0 c Iz zveze (10) vidimo, da je intenziteta Rayleighjevega sipanja sorazmerna ν04 , intenziteta Stokesovega sipanja z (ν0 − νn )4 in intenziteta anti-Stokesovega sipanja z (ν0 + νn )4 . Razmerje intezitet anti-Stokesovega in Stokesovega sipanja lahko zapiˇsemo z zvezo IAS (ν0 + νn )4 = . IS (ν0 − νn )4 (11) Zveza (11) napove, da je intenziteta anti-Stokesovega sipanja veˇcja od intenzitete Stokesovega sipanja, kar pa ne ustreza eksperimentalnim vrednostim [13]. Da razloˇzimo to odstopanje je potrebno vpeljati kvantno mehaniko. 13 3.3 Kvantni opis Ramanovega sipanja V kvantni mehaniki svetlobo obravnavamo kot fotone. Vibracijska energija v kvantni mehaniki ni zvezna, ampak je diskretna spremenljivka. To pomeni, da molekula lahko prejme ali izgubi le doloˇceno koliˇcino energije, da preide iz enega energijskega stanja v drugega [9]. V kvantnem opisu lahko uporabimo harmonski oscilator, kjer je vibracijska energija doloˇcena z zvezo 1 Ev = (v + )hν, 2 (12) kjer je v = 0, 1, 2... in predstavlja vibracijsko kvantno ˇstevilo. Pri prehodu iz enega stanja v drugega pride do spremembe vibracijske enerˇ preide molekula iz niˇzjega stanja v viˇsje stanje, se gije molekule ∆Ev . Ce energija molekule poveˇca za ∆Ev [9]: 1 1 ∆Ev = [(v + 1) + ]hνn − (v + )hνn = hνn . 2 2 (13) Kadar foton s frekvenco ν0 interagira z molekulo, ga lahko molekula sipa [9]. Pri sipanju molekula najprej preide v viˇsje neobstojeˇce energijsko stanje, ki ga imenujemo ”virtualno stanje”. Ker gre za prepovedani prehod, molekula hitro odda (sipa) foton in se vrne najveˇckrat nazaj v osnovno energijsko stanje [14]. Ta sipani foton ima potem enako frekvenco ν0 kot vpadni foton. To ustreza elastiˇcnemu ali Rayleighjevem sipanju (slika 5), kjer ni spremembe vibracijske energije [9]. Lahko se zgodi, da majhen deleˇz molekul ne pade nazaj v osnovno stanje, ampak zasede viˇsje vibracijsko energijsko stanje. Pri tem se molekuli poveˇca vibracijska energija za ∆Ev [9]. Ker velja ohranitev energije, lahko to spremembo zapiˇsemo kot ∆Ev = hν0 − hνs , 14 (14a) kjer νs predstavlja frekvenco sipanega fotona. Za ∆Ev lahko uporabimo rezutat iz zveze (13) in dobimo νs = ν0 − νn . (14b) Zveza (14b) ustreza Stokesovemu sipanju, ki je prikazano na sliki 5. Druga moˇznost je, da je molekula ˇze v vzbujenem vibracijskem stanju pred procesom ˇ molekula pri sipanju preide iz ”virtualnega stanja”v osnovno sipanja. Ce stanje, se vibracijska energija molekule zmanjˇsa za ∆Ev . Ker velja izrek o ohranitvi energije, lahko postopamo podobno kot v prejˇsnjem primeru, le da tokrat dobimo νs = ν0 + νn (15) kar ustreza frekvenci sipanega fotona pri anti-Stokesovemu sipanju [11]. Slika 5: Energijski diagram za Rayleighjevo in Ramanovo sipanje. Ramanski spekter prikaˇzemo kot funkcijo ramanskega premika ∆w. Zvezo za ramanski premik pri Stokesovemu sipanju definiramo kot ∆w = ( 1 1 − ), λ0 λS 15 (16) kjer je λ0 vzbujevalna valovna dolˇzina in λS valovna dolˇzina Stokesovega sipanja. ∆w je obiˇcajno izraˇzena v cm−1 . Ramanski premik za Stokesovo ˇcrto je nasprotno enak ramanskemu premiku za anti-Stokesovo ˇcrto, kot prikazuje slika 6. S pomoˇcjo kvantne mehanike lahko doloˇcimo pravilno intenziteto Stokesovih in anti-Stokesovih ˇcrt. Veˇcina svetlobe se siplje elastiˇcno, medtem ko se en foton na pribliˇzno 106 -108 fotonov siplje Ramanovo. Poslediˇcno je intenziteta Rayleighjevega sipanja pribliˇzno 106 -108 -krat veˇcja od Ramanovega sipanja. Na sliki 6 intenziteto Rayleighjevega sipanja predstavlja sredinska ˇcrta. Razmerje ˇstevilske gostote molekul, ki se nahajajo v osnovnem in v viˇsjem vibracijskem energijskem nivoju podaja Boltzmanova porazdelitev [13], hνn n1 = exp(− ). n0 kb T (17) V zvezi (17) n0 predstavlja ˇstevilsko gostoto molekul v osnovnem vibracijskem stanju, n1 ˇstevilsko gostoto molekul v vzbujenem vibracijskem stanju, T ˇ zdruˇzimo razmerje intenzitemperaturo in kb Boltzmanovo konstanto [9]. Ce tet sevanja (10) in Boltzmanovo porazdelitev (17), dobimo pravilno razmerje intenzitet IAS hνn (ν0 + νn )4 exp(− ). = 4 IS (ν0 − νn ) kb T (18) 1 Ker je kb T ≈ 40 eV, hνn pa je tipiˇcno reda velikosti nekaj desetink eV, je iz zveze (18) razvidno, da je pri tipiˇcnih ramanskih premikih intenziteta Stokesovega sipanja praviloma veˇcja od intenzitete anti-Stokesovega sipanja. Ta trditev se sklada z eksperimentalnimi vrednostmi. 16 Slika 6: Sredinski vrh predstavlja intenziteto Rayleighjevega sipanja. Levo od sredinskega vrha vidimo Stokesove vrhove, kjer je intenziteta veˇcja od intenzitete anti-Stokesovih vrhov, ki leˇzijo desno od sredinskega vrha [13]. 3.4 Razlaga spektrov Za razlago ramanskih spektrov so v tabeli 1 prikazani ramanski premiki in nihajni naˇcini nekaterih najpomembnejˇsih molekulskih skupin za naˇs eksperiment, ki smo jih opazovali v srednjem IR obmoˇcju (λ = 2,5 - 25 µm oziroma ∆w = 400 - 4000 cm−1 ). Za doloˇcitev nihajnih naˇcinov molekulskih skupin smo si pomagali s sledeˇco klasifikacijo. Vzdolˇznemu raztezanju ustrezata simetriˇcno in asimetriˇcno raztezanje. Ravninskemu upogibanju ustrezata striˇzenje in zibanje. Neravninskemu upogibanju ustrezata kolebanje in zvijanje. 17 Tabela 1: Izbrane molekulske skupine za naˇs eksperiment. Oznaka za jakost: m - moˇcna, s - srednja in ˇs - ˇsibka Molekulska skupina Ramanski premik [cm−1 ] Nihajni naˇ cin Metilenska CH2 1430 - 1480 (ˇs-s) Striˇzenje 2840 - 2870 (m) Simetriˇcno raztezanje 2900 - 2940 (m) Asimetriˇcno raztezanje Metilna CH3 1430 - 1480 (ˇs-s) Kolebanje 2865 - 2885 (m) Simetriˇcno raztezanje 2920 - 2975 (m) Asimetriˇcno raztezanje Hidroksilna O − H 3000 - 3700 (ˇs) Simetriˇcno raztezanje CH 600 - 900 (ˇs-s) Kolebanje 2980 - 3200 (m) Simetriˇcno raztezanje C − OH 750 - 1250 (m) Asimetriˇcno raztezanje C−O−C 800 - 1140 (m) Simetriˇcno raztezanje Aromatski obroˇc C − C 1580 - 1620 (m) Simetriˇcno raztezanje 3.5 3.5.1 Prikaz nekaterih spektrov Etanol Etanol je predstavnik alkoholov. Njegovo strukturno formulo prikazuje slika 7. Slika 7: Strukturna formula za etanol [15]. Moˇcne ramanske ˇcrte okrog ∆w = 3000 cm−1 ustrezajo simetriˇcnim raztegom OH skupine. Ramanska ˇcrta pri ∆w = 880 cm−1 ustreza simetriˇcnemu raztezanju skupine C − C − O. Asimetriˇcnemu raztezanju skupine C − OH 18 ustrezata dvojni ramanski ˇcrti, in sicer pri ∆w = 1023 cm−1 in ∆w = 1078 cm−1 . Ramanska ˇcrta pri ∆w = 1456 cm−1 ustreza kolebanju metilne skupine CH3 [1]. Slika 8: Spekter etanola [16]. 3.5.2 Toluen Toluen je predstavnik aromatskih ogljikovodikov. Slika 9 prikazuje sestavo toluena. Vidimo, da ga sestavlja aromatski obroˇc, na katerega je vezana metilna skupina CH3 . Spekter toluena je prikazan na sliki 10. Srednje moˇcne ramanske ˇcrte pri ∆w = 3056 cm−1 ustrezajo simetriˇcnim raztezanjem skupine CH. Dvojni ramanski ˇcrti pri ∆w = 1032 cm−1 ustrezata striˇzenju aromatskega obroˇca. Ramanska ˇcrta pri ∆w = 1005 cm−1 ustreza kolebanju aromatskega obroˇca. Srednje moˇcna ramanska ˇcrta pri ∆w = 787 cm−1 ustreza kolebanju skupin ˇ CH. Sibka ramanska ˇcrta pri ∆w = 623 cm−1 predstavlja kolebanje aromatskega obroˇca. Prisotnost metilne skupine CH3 prikazuje ramanska ˇcrta pri ∆w = 2921 cm−1 , ki predstavlja asimetriˇcno raztezanje. Prav tako prisotnost 19 Slika 9: Strukturna formula toluena [17]. metilne skupine predstavljata zelo ˇsibki ramanski ˇcrti pri ∆w = 1400 cm−1 . ˇ Nihajni naˇcin pri teh dveh ramanskih ˇcrtah ustreza kolebanju CH3 . Sibka −1 ramanska ˇcrta pri ∆w = 1606 cm je posledica simetriˇcnega raztezanja aromatskega kvarteta [1]. Na sliki 10 in na sliki 12, spodnja spektra prikazujeta ramanski spekter, medtem ko zgornja spektra prikazujeta IR spekter. Pri ramanskem spektru vrhovi predstavljajo intenziteto sipane svetlobe. Pri IR spektroskopiji je osnova absorpcija fotona na ustreznih molekulskih skupinah, kar prikazujejo doline v transmisijskem spektru. Veˇcja kot je absorpcija, manjˇsa je prepustnost. Do absorpcije pride takrat, kadar pri prehodu med vibracijskimi stanji pride do spremembe dipolnega momenta molekule. To je izbirno pravilo za absorpcijo infrardeˇce svetlobe. Ker izbirni pravili za procesa sipanja in absorpcije nista enaki, sta ramanska in IR spektroskopija komplementarni metodi. 3.5.3 Cikloheksan Strukturno formulo za cikloheksan prikazuje slika 11. Opazimo, da je molekula cikloheksana sestavljena iz 6 atomov ogljika in 12 atomov vodika. Cikloheksan je predstavnik alkanov, saj so vse vezi v molekuli enojne. Slika 12 predstavlja ramanski spekter, na katerem vidimo, da ima cikloheksan pri ramanskem premiku okrog 2900 cm−1 dva vrhova. Ta vrhova ustrezata 20 Slika 10: Spekter toluena [1]. Slika 11: Strukturna formula cikloheksana [18]. metilenski skupini CH2 , kjer levi viˇsji vrh predstavlja simetriˇcno raztezanje molekule, medtem ko desni niˇzji vrh predstavlja asimetriˇcno raztezanje molekule. Vrh pri ∆w = 1445 cm−1 prikazuje srednje moˇcno ramansko ˇcrto, ki ustreza striˇzenju metilena. Simetriˇcno raztezanje aromatskega obroˇca predstavlja moˇcna ramanska ˇcrta pri ∆w = 802 cm−1 . 21 Slika 12: Spekter cikloheksana [1]. 3.5.4 Polistiren Stireni se lahko s polimerizacijo veˇzejo v verige polistirena. Slika 13 prikazuje strukturo stirena in polistirena. Skupine CH − CH2 so v polistirenu povezane z enojno vezjo. Slika 13: Strukturna formula polistirena [22]. Na sliki 14 je prikazan spekter polistirena. Srednje moˇcna ramanska ˇcrta pri ∆w = 3054 cm−1 in ˇsibka ramanska ˇcrta pri ∆w = 1155 cm−1 ustrezata olefinski skupini. Za prvo je znaˇcilno simetriˇcno raztezanje skupine CH, medtem ko je za drugo znaˇcilno kolebanje skupine CH. Metilenski skupini CH2 ustreza simetriˇcno raztezanje pri ∆w = 2852 cm−1 in asimetriˇcno raztezanje 22 pri ∆w = 2904 cm−1 . Simetriˇcnemu raztezanju aromatskega obroˇca ustreza ˇ moˇcna ramanska ˇcrta pri ∆w = 1001 cm−1 . Sibka ramanska ˇcrta pri ∆w = −1 795 cm ustreza kolebanju skupine HC = CH v aromatskem obroˇcu [1]. Slika 14: Spekter polistirena [20]. 23 4 Sestavni deli laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo Ramanski mikrospektrometer predstavlja sklopitev optiˇcnega mikroskopa in spektrometra. Sestava teh dveh komponent nam omogoˇca zajem slike, ki odraˇza vibracijske lastnosti opazovanega vzorca v posamezni toˇcki [14]. Iz vsake toˇcke vzorca namreˇc zajamemo svoj ramanski spekter. 4.1 Laserski izvor Starejˇsi sistemi ramanskih spektrometrov so uporabljali ˇzivosrebrno svetilo kot izvor svetlobe. Problem teh svetil so ˇsiroke emisijske ˇcrte. Poslediˇcno so bile tudi ramanske ˇcrte ˇsiroke in so se med seboj prekrivale. Zato so laserji idealen izvor svetlobe, saj ustvarjajo ozke ramanske ˇcrte [13]. Uporabljajo se laserji z razliˇcnimi valovnimi dolˇzinami v UV, vidnem in bliˇznjem IR obmoˇcju. Kot je razvidno iz enaˇcbe (9), je intenziteta Ramanovega sipanja odvisna od ν 4 . ν je obratno sorazmerna z valovno dolˇzino λ. Torej je intenziteta Ramanovega sipanja sorazmerna λ−4 , kjer je λ valovna dolˇzina vzbujevalnega laserja [21]. Recimo, da primerjamo intenziteto Ramanovega sipanja za laserja z valovnima dolˇzinama za vzbujanje 785 nm in 448 nm. Potem dobimo (785nm)4 IV = = 9, 4. INIR (448nm)4 (19) To nakazuje, da je za moˇcan ramanski signal ustreznejˇsi laser z niˇzjo valovno dolˇzino. Teˇzava, ki nastopi pri laserjih z niˇzjo valovno dolˇzino, je pojav fluorescence. Fluorescenca je fizikalni pojav, pri katerem je energija izsevanega fotona pri prehodu med elektronskimi stanji manjˇsa od energije absorbiranega fotona (slika 5). Prisotnost fluorescence pada z valovno dolˇzino, ker fotoni z daljˇso valovno dolˇzino nimajo dovolj energije, da bi vzbudili molekulo v viˇsja elektronska stanja. 24 4.2 Osnovna shema postavitve Ramanovo sipanje lahko zbiramo pod kotom 90 stopinj (slika 15a) ali pod kotom 180 stopinj (slika 15b) glede na vpadni laserski snop [14]. Slika 15: Prikazana sta sistema za a) 90 stopinjsko in za b) 180 stopinjsko zbiranje Ramanovega sipanja [14]. Kratica DZ pomeni dikroiˇcno zrcalo. Pri obeh postavitvah uporabimo leˇce, da veˇcino sipane svetlobe preslikamo na vhod v spektrometer. Postavitev pod kotom 180 stopinj je primernejˇsa, ˇce ˇzelimo v sistem postaviti optiˇcni mikroskop [14]. S pomoˇcjo dikroiˇcnega zrcala, ki je postavljen pred leˇci, preusmerimo laserski snop v mikroskop (slika 15b). Odbojnost dikroiˇcnega zrcala pri valovni dolˇzini laserja mora biti ˇcim veˇcja. Svetloba potuje v mikroskopu skozi mikroskopski objektiv [21]. Zatem svetloba vpade na vzorec, na katerem se siplje. V ramanski spektroskopiji nas elastiˇcno oziroma Rayleighjevo sipanje ne zanima. Ker je intenziteta elastiˇcnega sipanja mnogo veˇcja od intenzitete Raˇ ne bi izloˇcili manovega sipanja, smo primorani izloˇciti elastiˇcno sipanje. Ce elastiˇcnega sipanja, ne bi mogli opazovati ramanskih ˇcrt blizu elastiˇcnega sipanja. Nezaˇzeljeni signal lahko izloˇcimo s pomoˇcjo filtrov, ki imajo to lastnost, da prepustijo le doloˇcen del svetlobnega spektra [5]. 25 4.3 Uklonski spektrometer Spektrometer je naprava, s katero izmerimo spekter opazovane svetlobe. Optiˇcna shema Czerny-Turnerjevega spektrometra [22] je predstavljena na sliki 16. Slika 16: Czerny-Turnerjev spektrometer, ki je sestavljen iz konkavnega zrcala (kolimatorja), uklonskega zrcala in konkavnega zrcala. Povzeto po [22]. Spektrometer je sestavljen iz kolimatorja, uklonskega zrcala in konkavnega zrcala. Naloga kolimatorja je, da divergentni snop sipane svetlobe, ki pride v notranjost spektrometra, pretvori v vzporednega in ga usmeri proti uklonskemu zrcalu pod kotom α. Uklonsko zrcalo je sestavljeno iz majhnih stopnic. Razdalja med sosednjimi stopnicami je d. Iz posameznih stopnic izvirajo delna valovanja, ki se seˇstejejo in tvorijo konstruktivno interferenco ˇ pri doloˇcenem kotu za doloˇceno valovno dolˇzino. Zarek, ki vpada na sredino vrstiˇcnega CCD detektorja, se na uklonskem zrcalu odbije pod kotom β in ustreza centralni valovni dolˇzini λc . Na sliki 16 je to valovanje prikazano kot pravokotnica na ravnino CCD detektorja [22]. Konstruktivna interferenca nastane tudi pod drugimi uklonskimi koti, ki ustrezajo drugaˇcni 26 valovni dolˇzini. Slika 16 prikazuje ojaˇcitev delnih valovanj pod kotom β+ξ in z valovno dolˇzino λ0 . Vpadni kot α in kot β sta merjena od normale na uklonˇ se svetloba odbije na isto stran glede na normalo uklonskega sko zrcalo. Ce zrcala, potem je β > 0 [22]. Slika 17: Vzporedna ˇzarka vpadata vsak na svojo stopnico na uklonskem zrcalu in se odbijeta. Do konstruktivne interference pride, ko je razlika poti enaka mnogokratniku valovne dolˇzine. Povezavo med obema kotoma prikaˇzemo s sliko 17. Kadar je razlika optiˇcnih poti enaka valovni dolˇzini λc , bo priˇslo do konstruktivne interference [22]. To lahko zapiˇsemo z zvezo mλc = d sin α + d sin β, 27 (20a) ˇ je m = kjer m predstavlja red ojaˇcitve in je lahko pozitiven ali negativen. Ce 0, sta kota α in β enaka. Takrat se uklonsko zrcalo obnaˇsa kot ravno zrcalo. ˇ je red ojaˇcitve m = 1, govorimo o prvem redu interference, itd. Za viˇsje Ce rede pri istih kotih lahko pride do prekrivanja odbite svetlobe z ustrezno manjˇsimi valovnimi dolˇzinami za vsak red, kot izhaja iz zveze (20a). Ker na optiˇcni poti uporabimo dikroiˇcno zrcalo (slika 15b), ki prepuˇsˇca le svetlobo z veˇcjo valovno dolˇzino kot laserski izvor, izloˇcimo viˇsje rede razen prvega [14]. Zato v nadaljni izpeljavi upoˇstevamo le prvi red ojaˇcanja. Ker obiˇcajno ne poznamo vpadnega kota α, uporabimo v zvezi (20a) izraz za vsoto sinusov [22]. Tedaj dobimo λc α+β β−α = 2 sin( ) cos( ). d 2 2 (20b) Razliko med odbitim in vpadnim kotom lahko zapiˇsemo s kotom γ = β − α. Kot γ je konstanten in znaˇcilen za doloˇcen spektrometer. Z njim lahko izrazimo kot α in ga vstavimo v zvezo (20b). Iz dobljene enaˇcbe izrazimo kot β in dobimo zvezo β = arcsin[ γ λc γ ]+ . 2d cos( 2 ) 2 (20c) ˇ ˇzelimo zvezo (20c) zapisati s kotom ψ, lahko iz slike 16 razberemo, da je Ce ψ = β − γ2 . Kot ψ je kot vrtenja uklonskega zrcala. Potem dobimo ψ = arcsin[ λc ]. 2d sin( γ2 ) (20d) Kota β in kot ψ bosta veˇcja, ˇcim veˇcja je valovna dolˇzina λc in ˇcim manjˇsa je razdalja d med stopnicami na uklonskem zrcalu. V spektrometru so izraˇcuni kotov ˇze vneˇseni v programsko opremo [5]. Ko nastavimo ˇzeljeno centralno valovno dolˇzino, se uklonsko zrcalo samodejno zavrti za ustrezen kot ψ. 4.4 Detektor Slika 16 prikazuje, da se odbita svetloba odbije od konkavnega zrcala proti vrstiˇcnemu CCD detektorju. Da ugotovimo, kakˇsen je spektralni obseg CCD 28 kamere, je potrebno izraˇcunati λ0 , ki takrat pade na rob vrstiˇcnega CCD detektorja v oddaljenosti l od sredine vrstiˇcnega CCD detektorja [5]. Razdaljo l lahko zapiˇsemo z zvezo l = nx, (21) kjer je n ˇstevilo slikovnih elementov ˇsteto od sredine CCD dektektorja in x je razdalja med sredinama sosednjih slikovnih elementov (slika 16). Odbiti kot za svetlobo z valovno dolˇzino λ0 lahko s pomoˇcjo slike 16 zapiˇsemo z zvezo β 0 = β + ξ. (22) Kot ξ lahko zapiˇsemo tudi kot tangens kota, in sicer kot zvezo tan ξ = nx , f (23) kjer je f goriˇsˇcna razdalja spektrometra. Iz zveze (23) lahko izrazimo kot ξ kot ξ = arctan( nx ). f (24) Sedaj v zvezo (20a) za valovno dolˇzino vstavimo λ0 , za odbiti kot β 0 pa upoˇstevamo zvezo (22) λ0 = d sin(α) + d sin(β + ξ). ˇ upoˇstevamo ˇse zvezo (24), ter α = ψ − Ce γ 2 (25a) in β = ψ + γ2 , dobimo γ γ nx λ0 = d[sin(ψ − ) + sin(ψ + + arctan( ))]. 2 2 f (25b) Zveza (25b) prikazuje, da manjˇsa razdalja d med stopnicami na uklonskem zrcalu, povzroˇci manjˇsi spektralni obseg [5]. 29 4.4.1 CCD detektor ˇ je energija absorbiraCCD kamera vsebuje silicijev polprevodnik [30]. Ce nega fotona veˇcja od energijske reˇze (za silicij 1,1 eV), pride do nastanka para elektron-vrzel. Elektron pri tem preide iz valenˇcnega pasu v prevodni pas [23]. Valovno dolˇzino fotonov, s katerim ustvarimo dovolj energije za vzbuditev elektronov v prevodni pas, izraˇcunamo iz λ= hc , Ef (26) kjer je c svetlobna hitrost (3 · 108 ms ), h Planckova konstanta (6, 6 · 10−34 Js) in λ valovna dolˇzina fotona. Za zgornje podatke dobimo za valovno dolˇzino, s katero ˇse lahko vzbudimo elektron v prevodni pas, okrog 1,1 µm. Kvantni izkoristek CCD kamere, ki je definiran kot razmerje med ˇstevilom izbitih elektronov in vpadlih fotonov [22], pri daljˇsih valovnih dolˇzinah torej pade na niˇc. 30 5 Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo Naloga v delu je bila postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo, s katerim smo opazovali Stokesovo sipanje bliˇznje IR svetlobe. Stokesovo sipanje smo zbirali s 180 stopinjsko geometrijsko nastavitvijo sistema. Da smo skonstruirali celotno napravo, smo uporabili optiˇcni mikroskop, spektrometer s CCD kamero za zajem spektra, laser z valovno dolˇzino 785 nm z dodatnim ozkopasovnim filtrom, dve dikroiˇcni zrcali (DZ1 in DZ2, glej sliko 18), filter, ki dovoljuje prehod valovnim dolˇzinam nad 800 nm, razprˇsilno in zbiralno leˇco in CCD kamero za zajem slike v vidni svetlobi. Shema postavitve sistema prikazuje slika 18, medtem ko fotografijo postavitve prikazuje slika 19. Slika 18: Shematiˇcni prikaz postavitve eksperimenta. Za laserjem je postavljeno prvo dikroiˇcno zrcalo (DZ1), pred mikroskopom pa drugo (DZ2). 31 Slika 19: Prikazana je postavitev vseh optiˇcnih elementov in naprav na optiˇcni mizi. Rdeˇca polna ˇcrta predstavlja laserski snop, medtem ko rdeˇca ˇcrtkana ˇcrta predstavlja svetlobo, ki potuje od vzorca do spektrometra. Zelena ˇcrtkana ˇcrta predstavlja vidno svetlobo. 32 5.1 5.1.1 Opis in lastnosti sestavnih delov Laserski izvor Uporabili smo diodni laser TEC510, ki ga proizvaja podjetje Sacher Lasertechnik Group, Marburg, Nemˇcija. Valovna dolˇzina uporabljenega diodnega laserja je 785 nm, medtem ko je bila uporabljena moˇc 38 mW. Maksimalna moˇc tega laserja je 150 mW. Pri delu z laserjem smo se ustrezno zavarovali z zaˇsˇcitnimi oˇcali, saj je laser zelo nevaren za oˇci. 5.1.2 Optiˇ cni filtri Spekter laserja prikazuje slika 20, na kateri je prikazana njegova intenziteta, ki je normirana na maksimum. Intenziteta je seveda najveˇcja okrog 785 nm, vendar pa dobimo nekaj izsevane svetlobe tudi pri niˇzjih in viˇsjih valovnih dolˇzinah. Tako kljub temu, da je laser definiran kot izvor bliˇznje IR svetlobe, del laserske svetlobe vidimo tudi kot vidno svetlobo. Slika 20: Spekter laserja z vzbujevalno valovno dolˇzino 785 nm. Za laserjem je bil postavljen ozkopasovni filter s ˇsirino nekaj nm, ki prepuˇsˇca svetlobo z valovno dolˇzino 785 nm. Ker ozkopasovni filter ni idealen, pre33 pusti majhen del svetlobe tudi pri drugih valovnih dolˇzinah. Na sliki 21 prepustnost ozkopasovnega filtra prikazuje ˇcrna krivulja. Za ozkopasovnim filtrom je bilo postavljeno prvo dikroiˇcno zrcalo (DZ1). Naloga DZ1 je, da odbije lasersko svetlobo v mikroskop in da prepusti Stokesovo sipano svetlobo. Na sliki 21 prepustnost DZ1 prikazuje rdeˇca krivulja. Med DZ1 in mikroskopom smo postavili drugo dikroiˇcno zrcalo (DZ2). Naloga DZ2 je odboj vidnega dela svetlobe na CCD kamero za zajem slike v vidni svetlobi. Del vidne svetlobe, ki jo opazujemo, dobimo z osvetljevanjem vzorca na mikroskopu, del svetlobe pa iz laserja, ki jo ne uspemo odfiltrirati. Prepustnost DZ2 na sliki 21 prikazuje zelena krivulja. Ker smo ˇzeleli ˇse dodatno zmanjˇsati prispevek Rayleighjevega sipanja, smo na pot svetlobe postavili ˇse dodatni filter (slika 18). Prepustnost tega filtra na sliki 21 prikazuje modra krivulja. ˇ Slika 21: Crna krivulja prikazuje spektralno odvisnost prepustnosti ozkopasovnega filtra, ki prepuˇsˇca lasersko svetlobo z valovno dolˇzino 785 nm, rdeˇca krivulja prikazuje prepustnost za prvo dikroiˇcno zrcalo (DZ1), zelena krivulja prikazuje prepustnost za drugo dikroiˇcno zrcalo (DZ2) in modra krivulja prikazuje prepustnost filtra, ki prepuˇsˇca sipano svetlobo nad 800 nm [25-27]. 34 5.1.3 Optiˇ cni mikroskop Uporabljali smo optiˇcni mikroskop Nikon, Eclipse TE-2000, Tokio, Japonska. Pri mikroskopiji v svetlem polju, snop ˇzarkov svetlobe, ki jih oddaja halogenska ˇzarnica, potuje skozi kondenzor. Kondenzor je sestav leˇc, ki ˇzarke iz svetila zbere in usmeri v ravnino vzorca. Od tod svetloba vpada skozi mikroskopski objektiv na premiˇcno veˇcstrano prizmo. Veˇcstrana prizma lahko ˇ hoˇcemo videti sliko vzorca prepusti ali odbije svetlobo proti ˇzeljeni smeri. Ce skozi okular, potem prizma prepusti svetlobo in svetloba vpada na zrcala, ki ˇzarke odbijejo proti okularju. V naˇsem primeru smo s premiˇcno stekleno prizmo usmerili sliko vzorca iz ohiˇsja mikroskopa. Nastalo sliko smo preslikali z leˇcama na vhod spektrometra. Sestava pomembnejˇsih delov mikroskopa za naˇso postavitev prikazuje slika 22. Modra ˇcrtkana ˇcrta prikazuje ˇzarke svetlobe znotraj ohiˇsja mikroskopa, medtem ko rumena ˇcrtkana ˇcrta prikazuje ˇzarke svetlobe, ki jih steklena prizma odbije iz ohiˇsja mikroskopa. Slika 22: Optiˇcni mikroskop in shematiˇcno prikazana notranja sestava, ter pot ˇzarkov. 35 5.1.4 Uklonski spektrometer s CCD kamero Uporabili smo spektrometer iHR 320 (Horiba, Francija), kjer ˇstevilka 320 pomeni goriˇsˇcno razdaljo f = 320 mm. Notranjost uporabljenega spektrometra prikazuje slika 23. Slika 23: Spektrometer iHR320, ki vsebuje kolimator, konkavno zrcalo in tri ˇ uklonska zrcala nameˇsˇcena na vrtljivem nosilcu. Stevilo uklonskih mreˇz je 300 na mm, 600 na mm in 1200 na mm [28]. V naˇsem eksperimentu smo uporabili uklonsko zrcalo s d1 = 300 reˇzami na mm. Za detektor smo uporabili CCD kamero s 1024 (n = 512) x 256 slikovnimi elementi. Razdalja med sredinama sosednjih slikovnih elementov je bila x = 26 µm. Tipiˇcno smo za centralno valovno dolˇzino λc izbrali 950 nm. Za uporabljen spektrometer velja: Ψ = 8,377◦ , γ = 24◦ . Z zgornjimi podatki lahko iz zveze (25b) izraˇcunamo, da sta robni valovni dolˇzini λ0 pri izbranih nastavitvah spektrometra okrog 820 in 1080 nm. Spektralni odziv uporabljene CCD kamere prikazuje slika 24. Vidimo, da spektralni odziv naraˇsˇca z valovno dolˇzino, nato pa pade na 0 pri pribliˇzno 1100 nm. Zaradi uporabljenih filtrov smo lahko opazovali sipano svetlobo z valovno dolˇzino nad 800 nm. Spektralni obseg, ki smo ga torej lahko opazovali je med pribliˇzno 800 nm in 1100 nm. To predstavlja obmoˇcje ramanskega 36 premika od 600 cm−1 do 3650 cm−1 , kar ustreza obmoˇcju nihajnih frekvenc molekulskih skupin, ki nas zanimajo. Slika 24: Krivulja prikazuje spektralni odziv uporabljene CCD kamere [29]. 37 5.2 Postavitev sestavnih delov in optiˇ cnih komponent 1. korak: Izraˇcun za izbiro in postavitev razprˇsilne in zbiralne leˇce. Izpeljava sledi v podpoglavju 5.3. 2. korak: Nastavitev razprˇsilne in zbiralne leˇce glede na optiˇcno os izhoda iz mikroskopa. 3. korak: Ustrezna postavitev in zasuk spektrometra. Podrobna razlaga sledi v podpoglavju 5.4. 4. korak Ustrezna postavitev laserja, prvega dikroiˇcnega zrcala in filtra, ki dovoljuje prehod valovnim dolˇzinam nad 800 nm. Filter smo postavili med prvo dikroiˇcno zrcalo in zbiralno leˇco. 5. korak Z ustreznim zasukom prvega dikroiˇcnega zrcala smo laserski curek preusmerili v optiˇcni mikroskop. 6. korak Ustrezna postavitev drugega dikroiˇcnega zrcala in CCD kamere tik ob izhodu mikroskopa. S to CCD kamero smo dobili optiˇcno sliko vzorcev. Pri nastavitvi poloˇzaja dikroiˇcnega zrcala in CCD kamere smo si pomagali s toˇcko na sredini slike v mikroskopu. 5.3 Izraˇ cun postavitve leˇ c Sliko iz mikroskopa kot navidezni predmet, ki ga na sliki 25 prikazuje toˇcka C, preslikamo na vhod spektrometra. Preslikavo naredimo s pomoˇcjo zbiralne (f1 = 5 cm) in razprˇsilne leˇce (f2 = −10 cm), kot prikazuje slika 25. 38 Razdalja med navideznim predmetom C in spektrometrom je bila fiksna, x” = 22 cm. Slika 25: Shema, ki prikazuje postavitev zbiralne in razprˇsilne leˇce. Modra barva prikazuje pot ˇzarkov skozi zbiralno leˇco, medtem ko ˇzarki z rdeˇco barvo prikazujejo pot ˇzarkov skozi razprˇsilno leˇco. C predstavlja navidezno sliko, medtem ko E predstavlja sliko na vhodu v spektrometer. Zbiralna leˇca prepuˇsˇca in lomi svetlobo, pri tem pa ˇzarke svetlobe zbere. Tam, kjer se ˇzarki svetlobe sekajo v eni toˇcki, dobimo obrnjeno realno sliko navideznega predmeta (na sliki 25 oznaˇcena s toˇcko D). Nato upoˇstevamo ˇse razprˇsilno leˇco, ki svetlobo razprˇsi. Kjer se podaljˇski ˇzarkov sekajo v toˇcki, dobimo sliko pred vhodom v spektrometer. To na sliki 25 prikazuje toˇcka E. Pri izpeljavi, ki sledi, smo uporabili enaˇcbe za tanke leˇce. Najprej si pomagamo z zvezo za zbiralno leˇco 1 1 1 = + , f1 a b (27) kjer a predstavlja razdaljo med navideznim predmetom v toˇcki C in zbiralno leˇco ter b predstavlja razdaljo od zbiralne leˇce do slike v toˇcki D. Razdalja med toˇckama C in D ustreza razdalji x in jo lahko zapiˇsemo kot x =a+b. Ob 39 poznavanju goriˇsˇcne razdalje zbiralne leˇce (f1 ) in ob izbrani razdalji a lahko s pomoˇcjo zveze (27) izraˇcunamo razdaljo b. Sedaj, ko poznamo razdaljo b, lahko izraˇcunamo razdaljo x. Razdalja x’ ustreza razdalji med toˇckama D in E. Razdaljo x’ lahko izraˇcunamo kot x’ = x” − x. Razdalja x’ prav tako ustreza razliki b’ in a’. b’ predstavlja razdaljo od razprˇsilne leˇce do toˇcke E, medtem ko a’ predstavlja razdaljo od razprˇsilne leˇce do toˇcke D. S pomoˇcjo zveze za razprˇsilno leˇco 1 1 1 − 0 =− 0 a |b | |f2 | (28) ˇ v zvezo (28) vstavimo a’ = in ob poznavanju f2 lahko izraˇcunamo b’. Ce |b0 | − x’, dobimo kvadratno enaˇcbo |b02 | − |b0 |x0 − |f2 |x0 = 0. (29) Kvadratna enaˇcba nam da eno ustrezno reˇsitev za b’, ki jo zapiˇsemo kot p 1 b0 = [x0 + x02 + 4|f2 |x0 ]. 2 (30) S pomoˇcjo zveze x’ = b’ − a’ lahko izraˇcunamo a’. Ker poznamo razdaljo b in a’, lahko sedaj izraˇcunamo razdaljo d, ki predstavlja razdaljo med leˇcama: d = b − a0 . (31) Naslednja pomembna lastnost je poveˇcava predmeta. Poveˇcavo slike v toˇcki D, ki jo ustvari zbiralna leˇca, zapiˇsemo kot b N= , a (32) medtem ko je poveˇcava slike v toˇcki E za razprˇsilno leˇco podana kot N0 = b0 b0 = . a0 b0 − x 0 40 (33) Skupna poveˇcava obeh leˇc je potem podana kot produkt obeh poveˇcav: N 00 = N N 0 = b0 b . a (b0 − x0 ) (34) Iz enaˇcb (30), (31) in (34) je bilo veˇc moˇznih reˇsitev, vendar smo ˇzeleli, da je N 00 = 1. Iz enaˇcbe (33) izrazimo b’ za N”=1: b0 = x0 . 1 − ab (35) Iz zveze (35) vidimo, da mora biti razmerje ab manjˇse od 1. To pomeni, da je a veˇcji od b. Ker je x” fiksna, vsota a in b ne sme biti veˇcja od 22 cm. Razdalja a ustreza navedenima pogojema takrat, kadar je a med 10,1 cm in 14,3 cm. V tabeli 2 so prikazane nekatere moˇzne reˇsitve. Rezultati v prvi vrstici ne ustrezajo naˇsi postavitvi, ker zbiralne in razprˇsilne leˇce zaradi njihovih debelin ne moremo postaviti bliˇze od 3 cm. Druga in tretja vrstica ne ustrezata naˇsi postavitvi, ker razprˇsilne leˇce ne moremo postaviti preblizu spektrometra zaradi konstrukcije samega spektometra. Zadnja vrstica prikazuje rezultate, ki so bili ugodni za naˇse potrebe. Tabela 2: Prikazane vrednosti razdalj za izbrano postavitev pri x00 = 22 cm in N 00 = 1. a [cm] 11 13 14 12 b [cm] 9,2 8,1 7,8 8,6 x [cm] 20,2 21,1 21,8 20,6 x’ [cm] 1,8 0,9 0,2 1,4 b’ [cm] 11 2,4 0,5 4,9 a’ [cm] 9,2 1,5 0,3 3,5 d [cm] 0 6,6 7,5 5,1 Druga ideja je bila, da bi zbiralno in razprˇsilno leˇco zamenjali z eno leˇco. Goriˇsˇcno razdaljo leˇce izraˇcunamo kot 1 1 1 = + . f0 f1 f2 41 (36) Za f1 = 5 cm in f2 = −10 cm je goriˇsˇcna razdalja f ’ nove leˇce 10 cm. To pomeni, da imamo opravka z zbiralno leˇco. Razdalja a” predstavlja razdaljo od toˇcke C do zbiralne leˇce, razdalja b” pa ˇ razdaljo od zbiralne leˇce do toˇcke E, ki je na vhodu v spektrometer. Ce navidezni predmet v toˇcki C leˇzi med zbiralno leˇco in goriˇsˇcem leˇce, dobimo navidezno sliko na isti strani kot svetloba vpada na zbiralno leˇco. Zato nam ostane primer, ko je razdalja a” veˇcja od goriˇsˇcne razdalje f ’. Ta primer prikazuje slika 26. Slika 26: Sistem leˇcja z znaˇcilnimi ˇzarki. Vsota razdalj a” in b” ne sme preseˇci 22 cm. Uporabimo enaˇcbo za tanke leˇce 1 1 1 = 00 + 00 f a b (37) in iz nje izrazimo razdaljo b”. V zvezi (37) spreminjamo razdaljo a”. Rezultati nekaterih primerov so prikazani v tabeli 3. Rezultati v tabeli 3 prikazujejo, da je sistem z eno leˇco neustrezen. Pri vseh navedenih primerih je vsota razdalj a” in b” veˇcja od 22 cm. Drugi razlog za neustreznost je poveˇcava. Naˇsa ˇzelja je bila, da je N”= 1, kar pa pri sistemu z eno leˇco za naˇso postavitev zaradi prostorskih omejitev ni moˇzna. Poveˇcava je vedno veˇcja od 1. 42 Tabela 3: Prikazane vrednosti razdalj pri x00 = 22 cm za sistem z eno leˇco. a” [cm] 11 14 16 19 5.4 b” [cm] 110 35 27 21 a” + b” [cm] 121 49 43 40 N” 11 8,8 1,7 1,1 Ustrezna postavitev in zasuk spektrometra Za ustrezno postavitev spektrometra smo uporabili sredino slike, ki smo jo opazovali v mikroskopu. Sliko, ki smo jo opazovali skozi okular v mikroskopu, prikazuje slika 27. S pomoˇcjo kriˇza smo doloˇcili sredino slike v mikroskopu. Kriˇzec je na sliki 27 prikazan kot ilustracija in ni del slike. Slika 27: Opazovana slika v mikroskopu. Slika, ki smo jo dobili zunaj ohiˇsja mikroskopa, je bila obrnjena za 90 stopinj. To sliko smo z leˇcama preslikali na vhod spektrometra. Spektrometer smo nastavili tako, da je toˇcka, ki je na sredini slike 27, prav tako na sredini CCD detektorja na spektrometru. Tukaj smo si pomagali z niˇcelnim redom interference. Da smo doloˇcili sredino slike na CCD kameri, smo si pomagali z opazovanjem slike 28 na raˇcunalniˇskem zaslonu. 43 Slika 28: Opazovana slika na raˇcunalniˇskem zaslonu za 90◦ obrnjeno ustrezno postavljeno sliko 27, s pomoˇcjo katere smo doloˇcili ustrezno postavitev spektrometra. Vodoravna os na sliki 28 ustreza valovni dolˇzini. Dve debelejˇsi ˇcrti na sliki 27 ustrezata daljˇsima robovoma niˇcle, ki ju vidimo na sliki 27. Tanjˇsa ˇcrta, ki jo opazimo na sliki 28, ustreza tanjˇsi ˇcrti na sliki 27. 44 6 6.1 Primeri slikanja z laboratorijskim sistemom za ramansko mikroskopijo Ramanska spektroskopija standardnih topil Kot smo omenili ˇze v uvodu, ˇzelimo ramanski mikroskop uporabljati za slikanje vzorcev na osnovi lipidnih, proteinskih in drugih organskih molekul. Zato organska topila, ki jih sestavljajo podobne molekulske skupine kot omenjene vzorce, uporabimo kot neke vrste standarde. V naˇsem primeru smo opazovali spektra dveh topil, in sicer cikloheksana in toluena. Na vsakem spektru je na osi x prikazan ramanski premik v cm−1 , ki ga izraˇcunamo po zvezi (16), medtem ko os y predstavlja intenziteto signala na CCD kameri. Izmerjena spektra smo prekrili s znanimi spektri standardnih topil, ki smo jih predstavili v podpoglavju 3.5. Prvi posneti ramanski spekter je bil spekter cikloheksana. Ekspozicijski ˇcas za cikloheksan je bil 1 s. Spekter, ki smo ga dobili, prikazuje slika 29. Izmerjeni ramanski spekter je naloˇzen na ozadje, zato imamo opravka z viˇsjo intenziteto. Vzrok za ozadje je lahko elastiˇcno sipanje, ki ga nismo uspeli odfiltrirati, sipanje vidne svetlobe na neˇcistoˇcah, svetloba drugih svetil, kot ˇ ˇzelimo od spektra odˇsteti ozadje, moramo spekje raˇcunalniˇski zaslon ... Ce ter prilagoditi s krivuljo prileganja. Na sliki 29 krivuljo prileganja prikazuje rdeˇca krivulja. Vrh, ki ga vidimo na izmerjenem spektru pri valovni dolˇzini 920 nm, ustreza ozadju. Obdelavo spektra smo naredili v programu OriginPro 8. Podobno obdelavo smo naredili tudi pri ostalih izmerjenih spektrih. Po obdelavi izmerjenega spektra smo ga primerjali z znanmim spektrom. Zgornji spekter na sliki 30 prikazuje priˇcakovani spekter cikloheksana [1], medtem ko spodnji spekter prikazuje izmerjeni spekter cikoheksana po obdelavi. Razvidno je, da se ramanski premiki za izmerjeni in znani spekter za cikloheksan zelo dobro ujemajo. Slika 31 prikazuje spekter toluena. Ekspozicijski ˇcas za toluen je bil 1 s. Zgornji spekter na sliki 31 prikazuje znani spekter toluena [8], medtem ko spodnji spekter prikazuje izmerjeni spekter toluena. Iz te primerjave je razvidno, da se izmerjeni in znani spekter toluena zelo dobro ujemata. 45 Slika 29: Izmerjeni spekter cikloheksana pred obdelavo. Za odpravo ozadja smo si pomagali s krivuljo prileganja, ki jo prikazuje rdeˇca barva. Pri spektrih toluena in cikloheksana vidimo, da se pri viˇsjih ramanskih premikih oziroma pri daljˇsih valovnih dolˇzinah (glej zvezo (16)) intenziteti izmerjenega in znanega spektra razlikujeta. Intenziteta v naˇsem primeru zaradi slabˇsega izkoristka CCD kamere pri daljˇsih valovnih dolˇzinah λS moˇcno pade. 46 Slika 30: Zgornji spekter predstavlja priˇcakovani spekter cikloheksana [1]. Spodnji spekter predstavlja izmerjeni spekter cikloheksana po obdelavi. 6.2 Slikanje s sistemom za ramansko mikroskopijo Za mikrospektroskopsko slikanje cikloheksana in etanola smo uporabili objektno stekelce, na katerem so ”bazenˇcki”velikosti 9,6 mm x 9,5 mm x 9,6 mm. Sliko ”bazenˇckov”prikazuje slika 32. ”Bazenˇcki” so narejeni iz borosilikatnega materiala (Lab-Tek, New York, Zdruˇzene Drˇzave Amerike). 47 Slika 31: Zgornji spekter prikazuje priˇcakovani spekter toluena [1]. Spodnji spekter predstavlja izmerjeni spekter toluena po obdelavi. Slika 32: ”Bazenˇcki”. Uporabili smo dva ”bazenˇcka”, pri ˇcemer je en vseboval etanol in drugi cikloˇ heksan. Crna kvadratka na sliki 32 prikazujeta, katero obmoˇcje smo posneli. Optiˇcno sliko teh dveh obmoˇcij, ki smo ju opazovali na zaslonu, prikazujeta sliki 33a in 34a. Velikost slike, ki smo jo opazovali, je bila 862 µm x 694 µm. Pri tem nas je 48 zanimalo, kako se intenziteta Ramanovega sipanja spreminja z razdaljo od roba ”bazenˇcka”proti notranjosti. Opazovano obmoˇcje za ramansko slikanje smo razdelili na mreˇzo. Smiselna razdalja med dvema sosednjima toˇckama mreˇze je odvisna od velikosti laserskega snopa in razdalje med sredinama sosednjih slikovnih elementov CCD kamere na spektrometru. Presek laserskega snopa je eliptiˇcen, kjer je premer daljˇse polosi 24 µm in premer krajˇse polosi 20 µm pri 10 X poveˇcavi, medtem ko je razdalja med sredinama sosednjih slikovnih elementov v CCD kameri na spektrometru 6,7 µm. To pomeni, da smo bili v naˇsem primeru pri ˇclenjenju mreˇze in s tem pri lateralni loˇcljivosti omejeni predvsem z velikostjo laserskega snopa. Mreˇzo smo razdelili na 10 x 8 elementov, kjer je bila velikost posameznega elementa pribliˇzno 87 µm x 87 µm. V naˇsem primeru bi torej lahko ˇse nekoliko zmanjˇsali velikost elementov, vendar je bila za naˇso postavitev takˇsna izbira zadovoljiva. Teoretiˇcna lateralna loˇcljivost y0 naˇsega sistema je odvisna od valovne dolˇzine laserja in numeriˇcne aperture (NA) mikroskopskega objektiva [12] in jo zapiˇsemo kot y0 = 0.61λ . NA (38) V naˇsem primeru smo uporabljali mikroskopski objektiv z numeriˇcno aperturo 0,3 in svetlobo z valovno dolˇzino 785 nm. Ko ta dva podatka vstavimo v zvezo (38), dobimo za loˇcljivost pribliˇzno 1,6 µm. Ta vrednost je mnogo manjˇsa od premera laserskega snopa. Pri izbranih nastavitvah je torej lateralna loˇcjivost omejena s premerom snopa na okrog 20 µm. Optiˇcno mizo, na kateri je bil ”bazenˇcek”, smo prestavljali tako, da je laserski snop vpadal na sredino posameznega elementa mreˇze za slikanje. Za vsak element posebej smo izmerili spekter. Skupaj smo dobili 80 spektrov, tako za topili etanola kot tudi cikloheksana. Pri tem smo vsak spekter ustrezno obdelali, kot je bilo razloˇzeno v prejˇsnjem podpoglavju. Pri obeh topilih smo za kontrastiranje vzeli najmoˇcnejˇso ramansko ˇcrto in spremljali njeno intenziteto. Za cikloheksan smo vzeli ˇcrto pri ∆w = 820 cm−1 in za etanol ˇcrto pri ∆w = 880 cm−1 . Odvisnost te intenzitete od poloˇzaja na opazovanem delu vzorca je prikazana na mikrospektroskopski sliki. Slika 33a prikazuje optiˇcno sliko ”bazenˇcka”, napolnjenega s cikloheksanom. Slika 33b prikazuje mikrospektroskopsko sliko za cikloheksan. Obmoˇcje s 49 temno barvo prikazuje ˇsibak ramanski signal, saj se nahajamo na robu ”bazenˇcka”. Proti notranjosti ”bazenˇcka” intenziteta ramanskih ˇcrt naraˇsˇca. Na sliki 33b najveˇcjo intenziteto Ramanovega sipanja prikazuje rumeno obmoˇcje. Slika 33: Prikazani sta a) optiˇcna slika in b) mikrospektroskopska slika za cikloheksan. Optiˇcno in mikrospektroskopsko sliko za etanol prikazuje slika 34. Vidimo, da temno obmoˇcje ustreza robu oziroma bliˇzini roba ”bazenˇcka”. Ko premikamo optiˇcno mizo tako, da se premikamo proti notranjosti ”bazenˇcka”, se intenziteta Ramanovega sipanja poveˇcuje. 50 Slika 34: Prikazani sta a) optiˇcna slika in b) mikrospektroskopska slika za etanol. 6.3 Primerjava s komercialnim sistemom za ramansko mikroskopijo Podobne poskuse kot z naˇsim laboratorijskim sistemom smo izvedli s komercialnim ramanskim mikroskopom WITec alpha 300 (WITec, Ulm, Nemˇcija). Pri teh poskusih je bil uporabljen frekvenˇcno podvojen Nd:YAG laser z valovno dolˇzino 532 nm. Najprej smo posneli spekter cikloheksana, ki ga prikazuje slika 35. Izmerjeni spekter (spodnja slika) smo primerjali z znanim spektrom (zgornja slika). Oba spektra se zelo dobro ujameta v ramanskih premikih. Uporabljena moˇc laserja je bila 6 mW. Prav tako smo posneli spekter polistirenskega filma, kjer je bila moˇc laserja 1 mW in spekter polistirenskih kroglic pri laserski moˇci 2 mW. Premer polistirenskih kroglic je bil 10 µm. Na stekleno objektno stekelce smo dali eno 51 Slika 35: Zgornji spekter predstavlja priˇcakovani spekter cikloheksana. Spodnji spekter predstavlja izmerjeni spekter cikloheksana na komercialnem ramanskem mikroskopu. kapljico suspenzije polistirenskih kroglic. Kapljico smo prekrili s krovnim stekelcem. Zaradi kapilarne sile se je kapljica moˇcno sploˇsˇcila, tako da so bile polistirenske kroglice fiksne. Zgornji del slike 36 prikazuje znani spekter polistirena, sredinski del prikazuje spekter polistirenskega filma in spodnji del spekter polistirenske kroglice. Na slednjem so vidne enake ramanske ˇcrte kot na polistirenskem filmu. Podobno kot pri zajemu mikrospektroskopske slike etanola in toluena smo za zajem mikrospektroskopske slike polistirenskih kroglic razdelili opazovani del vzorca na mreˇzo veˇcih elementov. Premer laserskega snopa pri 60 X poveˇcavi je bil 1 µm. V skladu z zvezo (38) je teoretiˇcna lateralna loˇcljivost komercialnega ramanskega sistema pribliˇzno y0 = 0, 4 µm, pri ˇcemer je numeriˇcna apertura objektiva 0,8. Premer laserskega snopa je torej tukaj zelo blizu izraˇcunani loˇcljivosti. 52 Slika 36: Zgornji spekter prikazuje priˇcakovani spekter polistirena, sredinski spekter prikazuje spekter polistirenskega filma, posnet na komercialnem ramanskem mikroskopu in spodnji spekter prikazuje spekter polistirenske kroglice, posnete na komercialnem ramanskem mikroskopu. Opazovano obmoˇcje vzorca smo razdelili na 25 x 25 elementov s korakom 2 µm. Velikost optiˇcne slike je torej bila 50 µm x 50 µm. Skupaj smo torej posneli 625 spektrov v posameznih toˇckah, pri ˇcemer je bil ekspozicijski ˇcas posameznega spektra 1 s. Za izdelavo celotne mikrospektroskopske slike je bilo torej potrebno poˇcakati pribliˇzno 10 minut. Slika 37a prikazuje optiˇcno sliko polistirenskih kroglic, medtem ko slika 37b prikazuje mikrospektroskopsko sliko. Za kontrastiranje mikrospektroskopske slike smo izbrali intenziteto najmoˇcnejˇse ˇcrte v ramanskem spektru (∆w = 1000 cm−1 ). Obmoˇcje s temno barvo prikazuje ˇsibak ramanski signal 53 Slika 37: Prikazani sta a) optiˇcna slika in b) mikrospektroskopska slika polistirenskih kroglic, posnetih na komercialnem ramanskem mikroskopu. in obmoˇcje z rumeno barvo prikazuje visok ramanski signal. Vidimo torej, da ramanski mikroskop odliˇcno loˇci med obmoˇcji brez prisotnosti doloˇcene snovi in obmoˇcji, kjer imamo snov, z lateralno loˇcljivostjo vsaj primerljivo z velikostjo koraka zajema spektrov 2 µm. 54 7 Pedagoˇ ski model Ramanovega sipanja Kadar se foton siplje na molekuli elastiˇcno in se njegova energija ohranja, govorimo o Rayleighjevem sipanju. Pri Stokesovem in anti-Stokesovem sipanju pa se foton siplje na molekuli neelastiˇcno. Pri Stokesovem sipanju foton po trku izgubi energijo, medtem ko pri anti-Stokesovem sipanju pridobi energijo. Po analogiji si smemo elastiˇcno sipanje predstavljati kot proˇzen trk, medtem ko Stokesovo in anti-Stokesovo sipanje ustrezata neproˇznemu trku. Po uˇcnem naˇcrtu za gimnazije [30] se obravnavata proˇzni in neproˇzni trk. Slednjega najdemo v poglavju 5, ki je namenjeno posebnemu znanju in izbirnim vsebinam. Predvideva se, da dijaki znajo uporabiti izrek o ohranitvi gibalne koliˇcine pri trkih. Poglavje 7 v uˇcnem naˇcrtu pod ”sploˇsna znanja” predvideva, da dijaki znajo uporabiti izrek o mehanski energiji vkljuˇcno s proˇznostno energijo, ter da znajo razloˇziti, kdaj se mehanska energija ohranja [30]. Dijaki imajo torej dovolj znanja, da bi jim lahko poskuˇsali razloˇziti Ramanovo sipanje na podlagi mehanskega modela. V literaturi [31] smo naˇsli primer takega modela, s katerim bi lahko preko opazovanja razliˇcnih trkov predstavili Rayleighjevo, Stokesovo in anti-Stokesovo sipanje. V prvem primeru na trdo podlago z viˇsine h spuˇsˇcamo elastiˇcno ˇzogico (”skokico”). Slika 38a prikazuje elastiˇcni trk, kjer je hitrost ˇzogice po trku enaka ˇ hitrosti ˇzogice pred trkom. Zogica odskoˇci nazaj do zaˇcetne viˇsine h. V tem primeru se kinetiˇcna energija ˇzogice ne spremeni. Ta primer ustreza Rayleighjevem sipanju. V drugem primeru na podlago z vzmetjo pritrdimo ploˇsˇco z veˇcjo maso v primerjavi z ˇzogico. Ta model predstavlja dvoatomno molekulo. Na zaˇcetku ploˇsˇca miruje in nanjo spustimo ˇzogico z viˇsine h. Hitrost ˇzogice v’ po trku je manjˇsa kot je hitrost ˇzogice pred trkom v, saj je ˇzogica nekaj kinetiˇcne energije predala vzmeti v obliki proˇznostne energije. Konˇcna viˇsina ˇzogice h’ je manjˇsa od zaˇcetne viˇsine h (slika 38b). Ta primer ustreza neproˇznemu trku, saj ne velja ohranitev kinetiˇcne energije. Ker se kinetiˇcna energija ˇzogice pri odboju zmanjˇsa, gre za analogijo s Stokesovim sipanjem. V tretjem primeru ploˇsˇcico zanihamo in nanjo spustimo ˇzogico z viˇsine h. ˇ ˇzogica prileti na ploˇsˇco, ko se ta dviguje, prejme nekaj energije in ˇzogica Ce 55 odleti viˇse (do viˇsine h”) kot je bila njena zaˇcetna viˇsina h. Hitrost ˇzogice v” po trku je veˇcja, kot je bila pred trkom (slika 38c). Gre torej zopet za neproˇzni trk. Ker se kinetiˇcna energija kroglice pri odboju poveˇca, ta primer ustreza anti-Stokesovem sipanju. Slika 38: Prikazani so mehanski modeli za demonstracijo Ramanovega sipanja [31]. (a) Zgornja slika prikazuje primer za Rayleighjevo sipanje, kjer se ohrani kinetiˇcna energija. Drugi dve sliki predstavljata neelastiˇcno sipanje, saj se kinetiˇcna energija zmanjˇsa (b) oziroma poveˇca (c). Sprememba kinetiˇcne energije ˇzogice je nasprotno enaka spremembi proˇznostne energije vzmeti. Opisani model zahteva izbiro razliˇcnih pogojev. Rayleighjevo sipanje je namreˇc prikazano v primeru, kadar ni ploˇsˇce z vzmetjo. Poleg tega v primeru Stokesovega sipanja ploˇsˇca na vzmeti miruje, v primeru Anti-Stokesovega sipanja pa se ploˇsˇca giblje proti ˇzogici. Ker vsi trije primeri sipanja nastopijo 56 za razliˇcen mehanski sistem, je naˇsa ˇzelja, da bi dobili vse tri moˇzne trke pri istem mehanskem modelu. Zato predlagamo poenoten model, v katerem je moˇzen prikaz Rayleighjevega, Stokesovega in anti-Stokesovega sipanja. Naˇs model je osnovan na ploˇsˇci, ki niha v vodoravni smeri, kot prikazuje slika 39. Pri prehodu skozi ravnovesno lego je hitrost v2 ploˇsˇce najveˇcja in je na sliki 39 prikazana v obe smeri. Enkrat se bo ploˇsˇca gibala v smeri proti ˇzogici, drugiˇc pa stran od ˇzogice. Kadar je odmik ploˇsˇce od ravnovesne lege najveˇcji x0 , takrat ploˇsˇca miruje (slika 39). Nihajoˇco ploˇsˇco potem obstreljujemo z ˇzogico v vodoravni smeri. Masa ˇzogice m1 naj bo mnogo manjˇsa od mase ploˇsˇce m2 . Slika 39: Zgornja slika prikazuje nihajoˇco ploˇsˇco, ki prehaja skozi ravnovesno lego bodisi v smeri proti ˇzogici bodisi v smeri stran od ˇzogice. Spodnji dve sliki prikazujeta skrajni legi ploˇsˇce. Pri obravnavi vseh treh primerov trkov predpostavimo, da je ˇcas trka ˇzogice s ploˇsˇco majhen, tako da se med trkom proˇznostna energija vzmeti ne bo spremenila. Poleg tega bomo predpostavili proˇzni trk med ˇzogico in ploˇsˇco. Ker imata ˇzogica in ploˇsˇca pred in po trku hitrosti vzdolˇz iste smeri, lahko torej naˇs model fizikalno opiˇsemo kot centralni trk. Zapiˇsemo lahko izraza 57 za ohranitev gibalne koliˇcine ter kinetiˇcne energije: m1 v1 + m2 v2 = m1 u1 + m2 u2 1 1 1 1 m1 v12 + m2 v22 = m1 u21 + m2 u22 2 2 2 2 (39) kjer sta v1 in u1 hitrosti ˇzogice pred in po trku ter v2 in u2 hitrost ploˇsˇce pred in po trku. Iz zvez (39) lahko izrazimo hitrost u1 ˇzogice po trku: u1 = 2m2 v2 + v1 (m1 − m2 ) . m1 + m2 (40) V naˇsem primeru je masa ˇzogice m1 mnogo manjˇsa od mase ploˇsˇce m2 , kar pomeni, da lahko v pribliˇzku upoˇstevamo m1 +m2 ≈ m2 . V tej limiti dobimo u1 = 2v2 − v1 . (41) Sedaj pa si oglejmo vse tri primere trkov. V vseh trej primerih pripiˇsemo premikanju v desno pozitivno hitrost in premikanju v levo negativno hitrost. V prvem primeru ˇzogica trˇci s ploˇsˇco, ko ta miruje. Takrat je hitrost ploˇsˇce v2 = 0. Iz zveze (41) dobimo, da je hitrost ˇzogice po trku u1 = −v1 , kjer sta u1 in v1 absolutni vrednosti hitrosti. Ta primer torej ustreza elastiˇcnemu Rayleighjevemu sipanju, ki ga prikazuje slika 40, saj se kinetiˇcna energija ˇzogice ohrani. V drugem primeru naj se ploˇsˇca giba med obema skrajnima legama v enako smer kot vpada ˇzogica (slika 41). Za to, da izvedemo ustrezen poskus ter da dobimo smiselno reˇsitev, moramo dodatno zahtevati v1 > 2v2 . Ob upoˇstevanju ustrezne smeri premikanja ˇzogice in ploˇsˇce v zvezi (41) dobimo u1 = 2v2 − v1 . (42) V tem primeru je hitrost ˇzogice po trku u1 manjˇsa kot hitrost ˇzogice pred trkom v1 . Kinetiˇcna energija ˇzogice se torej zmanjˇsa 58 1 1 1 m1 u21 = m1 (2v2 − v1 )2 < m1 v12 . 2 2 2 (43) Ta primer ustreza neelastiˇcnemu Stokesovemu sipanju. Slika 40: Ploˇsˇca je v skrajni legi in miruje. Hitrost ˇzogice po odboju je enaka hitrosti ˇzogice pred odbojem. Primer ustreza Rayleighjevem sipanju. V tretjem primeru naj se ploˇsˇca giblje v smeri proti ˇzogici (slika 42). Ob upoˇstevanju ustrezne smeri premikanja ˇzogice in ploˇsˇce v zvezi (41) dobimo u1 = −(2v2 + v1 ), (44) kjer vidimo, da bo hitrost ˇzogice u1 po trku veˇcja kot je bila hitrost pred ˇ trkom v1 . Zogici se torej poveˇca kinetiˇcna energija 1 1 1 m1 u21 = m1 (2v2 + v1 )2 > m1 v12 . 2 2 2 Po analogiji ta primer ustreza neelastiˇcnemu anti-Stokesovemu sipanju. 59 (45) Slika 41: Zgornja slika prikazuje hitrost ˇzogice in ploˇsˇce pred trkom in spodnja slika po trku. V prikazanem primeru se hitrost ˇzogice zmanjˇsa, kar ustreza Stokesovemu sipanju. Iz prikazanih primerov ugotovimo, da vpeljani pedagoˇski mehanski model omogoˇca opis in razumevanje elastiˇcnega in neelastiˇcnega Ramanovega sipanja z osnovnim fizikalnim znanjem centralnega proˇznega trka. Pri tem je moˇzno vse tri primere teoretiˇcno izvesti pri nihajoˇci ploˇsˇci. 60 Slika 42: Zgornja slika prikazuje hitrost ˇzogice in ploˇsˇce pred trkom in spodnja slika po trku. V prikazanem primeru se hitrost ˇzogice poveˇca, kar ustreza anti-Stokesovemu sipanju. 61 8 Zakljuˇ cek V diplomskem delu smo postavili laboratorijski sistem za ramansko mikroskopijo. Najprej se je bilo potrebno seznaniti z delovanjem ramanske spektroskopije, z delovanjem optiˇcnega mikroskopa in spektrometra in s tem, kako postaviti optiˇcne elemente, da lahko opazujemo Stokesovo sipanje. Opazovali smo organske snovi v bliˇznjem infrardeˇcem obmoˇcju. Po seznanitvi z delovanjem optiˇcnega mikroskopa in spektrometra je bilo potrebno ustrezno namestiti optiˇcne elemente in ostale komponente, da smo opazovali ramanski spekter. Zatem nas je zanimalo, kakˇsen je opazovani spektralni obseg naˇsega sistema. Ko smo postavili sistem za ramansko mikroskopijo, smo izmerili spektre organskih snovi in jih primerjali s priˇcakovanimi spektri. Izmerjeni spektri so se lepo ujemali v primerjavi s priˇcakovanimi spektri. Prav tako smo posneli mikrospektroskopsko sliko raztopin. Za primerjavo smo uporabili ˇze postavljeni komercialni ramanski mikrospektrometer. Tam smo poleg spektrov topil posneli tudi spekter polistirenskega filma in polistirenskih kroglic, ter ju prav tako primerjali s priˇcakovanimi spektri. Posneli smo tudi mikrospektroskopsko sliko polistirenskih kroglic. S tem smo pokazali uporabnost ramanske mikrospektroskopije za karakterizacijo kemijskih lastnosti opazovanih vzorcev na mikroskopski skali. Na koncu podajamo ˇse preprost mehanski model, s katerim bi lahko predstavili elastiˇcno in neelastiˇcno Ramanovo sipanje v uˇcnem procesu. 62 Literatura [1] P. J. Larkin, IR and Raman Spectroscopy: The Principles and Spectral Interpretation, Elsevier Inc., Oxford, 2011 [2] A. F. Goncharov, Raman Spectroscopy at High Pressures, International Journal of Spectroscopy, 2012, 1-16 (2012) [3] http://www.spectroscopyonline.com/spectroscopy/Articles/LowResolution-Raman-Spectroscopy-in-Science-Educa/ArticleStandard/ Article/detail/673399 (13.4.2013) [4] C. V. Raman, K. S. Krishnan, A New Type of Secondary Radiation, Nature, 121, 501-502 (1928) [5] R. Horn, Script to Lecture Raman Spectroscopy, Berlin, Fritz-Haber Institute of MPG, 2009. [6] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e6/Sir CV Raman.JPG (27.3.2013) [7] J. J. Bohning, T. N. Mistra, M.Choudhury, The Raman effect, Calcutta, American Chemical Society and Indian Association for Cultivattion of Science, 1998. [8] http://www.horiba.com/scientific/products/raman-spectroscopy/ history/ (1.4.2013) [9] N. B. Colthup, L. H. Daly, S. E. Wiberley, Introduction to Infrared and Raman Spectroscopy, Academic Press, Boston, 1990 [10] S. Chandra, Molecular Spectroscopy, Alpha Science, Oxford, 2009 [11] W. Demtr¨oder, Laser Spectroscopy Volume 2: Experimental Techniques, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Berlin, 2008 [12] J. Strnad, Fizika 2. del Elektrika. Optika, DMFA, Ljubljana, 2005 [13] http://users.abo.fi/mhotokka/mhotokka/lecturenotes/ms.html (25.7.2013) 63 [14] E. Smith, G. Dent, Modern Raman Spectroscopy: A Practical Approach (John Wiley Sons, Chichester, 2005) [15] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/37/Ethanol-2Dflat.png (30.7.2013) [16] R. Alexander, Advantages of Raman Spectroscopy when analyzing Materials Through glass or Polymer Containers and in Aquesous Solution, PerkinElmer, Zdruˇzene Drˇzave Amerike, 2008 [17] http://img.bhs4.com/44/6/44601248935f489062feaa31dc7c30f7f84b3d53 large.jpg (5.9.2013) [18] http://www.gcsescience.com/cyclohexane.gif (5.9.2013) [19] https://sl.m.wikipedia.org/wiki/Slika:Polystyrene formation.PNG (30.7.2013) [20] http://www.chem.ualberta.ca/ mccreery/images/Photo%20raman%20 intensity%20standard/polystyrene.jpg (30. 7. 2013) [21] T. Dieing, O. Hollricher, J. Toporski, Confocal Raman Microscopy, Springer, Berlin, 2010 [22] C. Palmer, Diffraction Grating Handbook, Newport Corporation, New York, 2005 [23] Andor Technology, CCD Detectors: Course Notes, Andor Technology, 2003 [24] J. Strnad, Fizika 4. del Molekule. Kristali. Delci, DMFA, Ljubljana, 2005 [25] http://www.semrock.com/FilterDetails.aspx?id=LP02-785RS-25 (18.5.2013) [26] http://www.semrock.com/FilterDetails.aspx?id=LL01-785-12.5 (18.5.2013) [27] http://www.semrock.com/FilterDetails.aspx?id=FF757-Di01-25x36 (17.6.2013) [28] Horiba Jobin Yvon Inc, iHR, Fully Automated Imaging Spectrometer: User Manual, HORIBA Jobin Yvon, 2006 64 [29] http://www.horiba.com/fileadmin/uploads/Scientific/Documents/ OSD/OSD0020256BIDDLN.pdf (4. 10. 2013) [30] http://www.mss.gov.si/fileadmin/mss.gov.si/pageuploads/podrocje/ ss/programi/2008/Gimnazije/UN FIZIKA strok gimn.pdf (25. 8. 2013) [31] W. R. C. Somerwille et al., High performance Raman spectroscopy with simple optical components, American Journal Physics, 78 , 671- 677 (Julij 2010) 65 Zahvala Za pomoˇc, nasvete in ideje pri izdelavi diplomskega dela se zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Borisu Majaronu in somentorju dr. Zoranu Arsovu. Zahvala gre tudi kolegici Ani Varlec in njeni mentorici prof. dr. Maji Remˇskar za pomoˇc pri uporabi komercialnega ramanskega mikroskopa na Reaktorskem centru v Podgorici. Zahvala gre tudi druˇzini in prijateljem, ki so mi med ˇstudijem stali ob strani v dobrem in slabem. 66 Izjava o avtorstvu Spodaj podpisani Grega Celcar, rojen 27. 4. 1987 v Rakiˇcanu, potrjujem, da je predloˇzena diplomska naloga z naslovom ”Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo” plod mojega samostojnega dela in da sem pri njenem pisanju upoˇsteval doloˇcbe Pravilnika o diplomski nalogi. Grega Celcar Ljubljana, 12. maj 2014 67
© Copyright 2024