Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Univerzitetni študijski program Kemija
Izbirni sklop analizna in anorganska kemija
Avtomatizirana analiza
Seminar 2012
Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar
Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza
(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in
inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu
napake ali druge nepravilnosti.
Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Regulacija nivojev kisika v mikrofluidni napravi
AVTOR: Žiga Rožman
MENTOR: prof. dr. Boris Pihlar
POVZETEK
Mikrofluidne naprave, ki so izdelane iz poli(dimetilsiloksana) (PDMS), so zmožne
prepuščati pline in se uporabljajo za natančno on-chip regulacijo kisika. Vendar,
lahko v PDMS napravah pervaporacija hitro pripelje do dramatičnih sprememb v
osmotskem tlaku raztopine. V članku je raziskana nova metoda za nadzorovanje
kisika, z uporabo prej uravnoteženih vodnih raztopin. Uporabili so jih v plinsko
nadzorovanih kanalih, ki uravnavajo vsebnost kisika v mirujočih mikrofluidnih testnih
komorah. Za uravnoteženje vsake kontrolne raztopine pred vstopom so uporabili offchip izmenjevalnik plina. Tako se zmanjšajo problemi, ki nastanejo zaradi
pervaporacije. Integriran PDMS kisikov senzor dovoljuje sprotne natančne meritve
kisika v mikrofluidni komori. Dobljene meritve so bile v skladu z napovedanimi iz
metode končnih elementov.
1. UVOD
In vitro študije so pokazale, da nivo kisika vpliva na celično rast, izraz encimov in
razlikovanje med matičnimi celicami. Poleg tega pa naj bi naravno prisotni gradienti
kisika regulirali funkcije pravega tkiva, vplivali na razvoj celic in izzvali nastanek
angiogeneze. Novi pristopi k in vitro regulaciji nivojev kisika v celičnih kulturah bi
lahko izboljšali razumevanje odvisnosti celice od kisika. Pri celicah v tkivu sesalcev je
parcialni tlak kisika med 3% in 9% (PO2= 0,03 atm – 0,09 atm), pri konvencionalnih
celičnih kulturah v inkubatorju pa je tlak 21% (PO2= 0,21 atm). Razvili so različne
hipoksične komore, s katerimi so znižali nivo kisika v celični kulturi in vitro. Vendar pa
predstavljata čas, potreben za gojišče, da doseže ravnotežje in nezmožnost
generiranja gradienta kisika omejitev za uporabo takšne komore.
Polidimetilsiloksan spada v skupino polimernih spojin organosilikatov, ki se pogosto
imenujejo silikoni. PDMS je najbolj razširjen organski polimer na podlagi silicija in je
še posebej znan po svoji nenavadni reoloških (tokovnih) lastnostih. Plinsko
prepustne poli(dimetilsiloksan) (PDMS) mikrofluidne naprave ponujajo alternativni
pristop k obstoječim metodam za regulacijo kisika. Z izkoriščanjem pasivne difuzije
zunanjega kisika, ki se ga prečrpa skozi kontrolni kanal, za uravnoteženje (preko
PDMS) z raztopljenim kisikom v sosednjih fluidnih kanalih se doseže regulacija kisika
v napravi. Glede na majhno razdaljo med kanali in visoko prepustnost kisika skozi
PDMS se ravnotežje lahko vzpostavi zelo hitro (v nekaj sekundah). Poleg tega, pa se
lahko preko naprave generira gradient kisika z uporabo različne kisik-dušik zmesi.
Takšna metoda je sicer boljša, vendar trenutna oblika dovoljuje signifikantno
pervaporacijo vode skozi PDMS.
Pervaporacija je separacijska metoda, s katero lahko ločimo zmes raztopin z delno
uparitvijo skozi nepropustno ali propustno membrano. Vodna raztopina v fluidni
komori lahko hitro izhlapi in preide PDMS pri celičnih kulturah sesalcev, saj je
temperatura vzdrževana pri 37 °C, kar se kaže kot dramatično povečanje
osmolarnosti tekočine. Ta problem se potencialno zaostruje ob nameščenju
kontrolnega kanala napolnjenega s plinom v bližino fluidnega kanala za nadzor plina.
Da bi zaobšli problem, se sesalske celice pogostokrat kultivirajo v napravi, ki je pod
neprekinjenim tokom. Vendar pa to preprečuje gojenje celic, ki so občutljive na
strižno napetost, kar omejuje potencialno uporabnost mikrofluidnih metod.
Slika 1 Shema mikrofluidne naprave za on-chip regulacijo
V trenutno študiji so pokazali nov pristop k reguliranju kisika na mikrofluidnem čipu.
Prej uravnotežene vodne raztopine z različnimi koncentracijami kisika so prečrpali
skozi kanale za nadzor plina, da bi uravnali nivoje kisika v sosednjih mirujočih
komorah. Ravnotežje skozi večino PDMS je dalo hiter nadzor nad raztopljenimi
koncentracijami kisika. Za sprotno in neprekinjeno nadzorovanje spreminjajočih
nivojev kisika v fluidni komori so v PDMS napravo integrirali senzor za kisik, ki so ga
razvili v njihovem laboratoriju. Poleg tega so vodne raztopine so v nadzornih linijah
zamenjale vodo izgubljeno zaradi pervaporacije. Medtem ko različne tehnike ločeno
obravnavajo regulacijo kisika in pervaporacije, so v študiji z uporabo nadzornih linij
napolnjenih z vodo demonstrirali sposobnost, da hkrati regulirajo kisik in tako
zmanjšajo izhlapevanje.
2. REZULTATI IN DISKUSIJA
On-chip regulacijo nivoja kisika so dosegli s pomočjo off-chip plinskega izmenjevalca.
Vodo so črpali skozi plinski izmenjevalec kjer se je uravnotežila z nivojem kisika.
Hitro uravnoteženje z nastavljeno PO2 točko sta omogočila kratka difuzijska razdalja
(debelina stene cevke 100 µm) in visoka prepustnost teflonskih cevke za kisik (990
barrer). Pri toku 700 µL/min se je nivo kisika v tekočini popolnoma uravnotežil v času,
ko je tekočina zapustila plinski izmenjevalec. Uravnoteženje so določili tako, da so
nadzorovali nivoje kisika v tekočini na izhodu plinskega izmenjevalca.
V tla mikrofluidne naprave so vgradili senzorsko folijo. Tankoplastno folijo za
zaznavanje kisika so razvili s pomočjo fosforescentnega barvila platinov
tetrakis(pentafluorofenil)porfirin. Intenziteta emisije iz folije je dušena v prisotnosti
kisika. Ko je bila uvedena manjša količina raztopljenega kisika, se je nivo kisika v
napravi uravnotežil s pomočjo difuzije, nadzorovali pa so ga sproti s kisikovim
senzorjem. Glede na to, da je bila prostornina tekočine v mikrofluidni napravi majhna,
lahko pervaporacija hitro spremeni koncentracijo topljenca, kar potencialno vpliva na
celične kulture eksperimenta. Spremembe koncentracije topljenca so spremljali s
pomočjo intenzitete emisije dekstrana, konjugiranega z rodaminom.
Slika 2 Efekt pervaporacije vode med delovanjem. (a) Povečevanje fluorescentne intenzitete dekstrana, konjugiranega z
rodaminom, zaradi pervaporacije (pri črpanju vlažnega zraka). (b) On-chip regulacija parcialnega tlaka z uporabo
kontrolnih linij napolnjenih z vodo (O), in vlažnega toka plina (●).
Kadar so skozi kontrolne linije črpali topel vlažen plin, so lahko opazili povečevanje
rodaminske fluorescence s časom v mirujoči tekočinski komori. To je bilo v skladu s
črpanjem sveže rodaminske raztopine v komoro, s katero so nadomestili tekočino
izgubljeno zaradi pervaporacije. Pervaporacijski efekt so ublažili tako, da so skozi
kontrolne linije črpali toplo vodo, pri tem pa niso zaznali povišanja intenzitete
rodamina. Efekt kontrolnih linij napolnjenih z vodo je analogen vključitvi specifično
oblikovanega vodnega rezervoarja za preprečevanje pervaporacije.
Slika 3 Hiter PO2 on-chip odziv. (a) Mikrofluidna naprava s faznim kontrastom (levo) in PO2 (desno), kaže pozicijo fluidne
komore z dvema kontrolnima linijama. (b) Ustaljevanje ravnotežja kisika v kontrolnih linijah in mirujoči komori.
Z zniževanjem PO2 v kontrolnih linijah, se lahko znižajo nivoji kisika v fluidni komori. S
pomočjo tanke senzorske folije, so lahko nadzorovali prostorske spremembe PO2 po
celotni napravi. Stalne ravni PO2 v kontrolnih linijah so dosegli v 2 minutah po
zamenjavi zraka z N2 v plinskem izmenjevalcu. Nivoji kisika v tekočinski celici so se
uravnotežili počasneje in dosegli stalno raven v 8 minutah. Na tak način so dosegli
0,03 atm – 0,05 atm PO2 po celotni napravi, kar zagotavlja fiziološko pomembno
kisikovo okolje.
Slika 4 Uravnoteženje PO2. (a) Uravnoteženje kisika po napravi z določenimi PO2 točkami v vodnih raztopinah. (b) Gradient
kisika po napravi, dobljen z nasprotnima tokoma vode z zrakom in vode z dušikom.
3. ZAKLJUČEK
Natančna regulacija nivoja kisika je kritična v veliko primerih (razumevanje kako kisik
vpliva na funkcije in odziv celice). Plinsko prepustne PDMS bazirane mikrofluidne
naprave ponujajo prednost zaradi hitrega in natančnega nadzora nivoja kisika,
vendar lahko neprestano delovanje povzroči pervaporacijo in dramatične spremembe
v osmotskem tlaku. Namesto črpanja plinov direktno skozi napravo, se skozi
kontrolne linije črpa voda z različnimi koncentracijami raztopljenega kisika ter se tako
doseže regulacija kisika. Uporaba kontrolnih linij napolnjenih z vodo bistveno ublaži
pervaporacijo. Na takšen način lahko vzdržujemo fiziološke nivoje kisika ali pa
ustvarimo gradient kisika. Z integracijo kisikovega senzorja v tla naprave je
omogočeno sprotno nadzorovanje parcialnega tlaka kisika po celotni napravi, kar
služi kot orodje za razumevanje vpliva spremembe nivoja kisika na širjenje po
sistemu.
4. LITERATURA
-Peter C. Thomas, Srinivasa R. Raghavan, and Samuel P. Forry, Regulating
Oxygen Levels in a Microfluidic Device; Anal. Chem. 2011,83,8821-8824
-http://en.wikipedia.org/wiki/Pervaporation
-http://en.wikipedia.org/wiki/Polydimethylsiloxane