1. No category

Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Univerzitetni študijski program Kemija
Izbirni sklop analizna in anorganska kemija
Avtomatizirana analiza
Seminar 2011
Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar
Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza
(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in
inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu
napake ali druge nepravilnosti.
Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
VESNA VOJSKA
Analiza inhibitorjev matričnih metaloproteinaz (MMP)
z Elektroforezno mikroanalizno metodo (EMMA)
Predmet: Avtomatizirana Analiza
Mentor: prof.dr.Boris Pihlar
Ljubljana, 29.05.2011
1.UVOD:
Matriks metaloproteinaze (MMP) so endoproteinaze, ki sodelujejo pri razgradnji zunajceličnega matriksa. Njihovo
nenadzorovano povečanje in aktivnost posameznih MMP so opazili pri številnih vnetjih in rakavih obolenjih, zato
inhibicija MMP predstavlja novo terapevtsko možnost v boju s temi boleznimi. Ker pa poznamo veliko naravnih
inhibitorjev, je za ugotavljanje njihove učinkovitosti na MMP potrebno opraviti številne raziskave, te pa trajajo dolgo
in so v večini neekonomične zaradi velike porabe dragih vzorcev. Zato so raziskovalci težili k odkritju analizne metode,
ki bi bila še vedno učinkovita, a cenejša in hitrejša. Kot primerna tehnika se je pokazala elektroforezna mikroanalizna
metoda (EMMA) s florescenčnim detektiranjem. Kot modelna encima so si izbrali MMP-2 in MMP-9, ki sta bila
obravnavana kot obetavna za zdravljenje rakavih obolenj.
1
2. MATRIKS MELALOPROTEINAZE (MMP) :
Matrične metaloproteinaze (MMP) sodelujejo pri preoblikovanju in razgradnji ekstracelularnega
matriksa v naravnih fizioloških procesih, kot so embrionalni razvoj, razmnoževanje, remodeliranje
tkiva, kot tudi v bolezenskih procesih, kot sta artritis in metastaza.
Slika 1: Prikaz MMP razgradnje membrane [1]
V normalnem fiziološkem stanju delovanje teh encimov strogo nadzorujejo endogeni tkivni
zaviralci metaloproteinaz (TIMP). Če pa je razdrto ravnotežje med MMP in njihovimi inhibitorji,
lahko pride do prekomerne degredacije zunajceličnega matriksa, kar omogoča invazijo, metastaze,
in angiogenezo tumorskih celic. Zato so raziskave MMP v zadnjem času še toliko bolj zanimive,
saj bi lahko dobro poznavanje inhibicije njihovega delovanja pripomoglo k diagnosticiranju in
zdravljenju rakavih in drugih obolenj. Predklinični rezultati zatiranja raka z MMP modeli so bili
tako prepričljivi, da so pričeli tudi s kliničnimi analizami. Upanje za uporabo MMP je na koncu
propadlo zaradi hudih neželenih učinkov, povzročenih zaradi pomankanja selektivnosti njihovega
delovanja. Kasneje so odkrili, da so bile nekatere MMP vpletene v proces napredovanja tumorja,
nekatere MMP pa so služile kot gostitelji za obrambo proti tumorju. Ta dvojna vloga MMP pri raku
v veliki meri pojasnjuje neuspeh inhibitorjev MMP v kliničnih poizkusih. [1], [2], [3]
MMP-2 in MMP-9 so vpletene v proces razgrajevanja kolagena tipa IV in V, največja strukturna komponenta osnovnih
membran. MMP-2 igra pomembno vlogo pri vaskularni ureditvi in odzivu na vnetja, za MMP-9 pa študije na opicah
kažejo, da je vpletena v IL-8-inducirano mobilizacijo krvotvornih matičnih celic iz kostnega mozga, študije opravljene
na miših pa kažejo vlogo pri remodeliranju tkiva, ki je povezano z tumorjem. [2], [4]
3. METODE RAZISKOVANJA:
ZIMOGRAFIJA:
Zimografija je še posebej uporabna metoda za odkrivanje dejavnosti različnih izoencimov MMP v bioloških vzorcih.
Največji prednosti te tehnike sta specifičnost in občutljivost, ki sta višji kot pri fluorometričnih metodah.
Pomanjkljivost pa je, da ni primerna za hiter sken inhibitorjev MMP zaradi zapletenega procesa. [5]
KAPILARNA ELEKTROFOREZA (CE):
Kapilarna elektroforeza predstavlja privlačno alternativo za encimske analize zaradi visokih izkoristkov separacije,
hitre analize in nizke porabe vzorcev ter reagentov. Poleg tega, da je dobra tehnika ločevanja, CE ponuja tudi možnost
2
za inkapilarno analizo encimov, njihovo ločevanje in detekcijo, vse v eni kapilari. S stališča instrumentalizacije je
preprosta tehnika. Za njeno izvedbo potrebujemo vir visoke napetosti, dve elektrodi, anodi in katodni rezervoar,
kapilaro, detekcijski sistem in sistem za zapis ter obdelavo signala z detektorja. Separacija je enostavna in temelji na
razlikah v hitrosti potovanja nabitih delcev. Kar pa kliče po izboljšanju tehnike je detekcija, saj majhni volumski
pretok onemogoča uporabo klasičnih detektorjev uporabnih za HPLC. Najpogostejša je UV-VIS detekcija, pri kateri je
prednost predvsem univerzanost, problem pa je nizka občutljivost (meja zaznave: 10-13 -10-16), kar je posledica zelo
kratke poti svetlobe . Če za detekcijo uporabimo florescenco, je tu meja zaznave primerna: 10-15 -10-17.
Kljub slabši občutljivosti, je CE zelo razširjena metoda, saj omogoča analizo velikega števila skupin analitov (npr.
amino kisline, peptide, glikoproteine, nukleotide, oligonukleotide,...).[1],[6]
ELEKTROFOREZNA MIKROANALIZNA METODA (EMMA):
Slika 2: Prikaz EMMA analize[1]
Elektroforezna mikroanaliza (electrophoretically mediated microanalysis-EMMA), se uspešno uporablja za študij encimske
kinetike in opazovanje zaviranja encimskega delovanja. Prednosti te metode so popolna avtomatizacija metode in
miniaturizacija vzorca (lahko iniciramo že vzorce nanoliterskih dimenzij). Ko jo kombiniramo s fluorescenčno
detekcijo, omogoča zaznavo izredno nizke koncentracije analitov v majhnem obsegu vzorca, poleg tega pa so tudi
zmanjšane motnje iz drugih sestavin v vzorcu. Če komponente vzorca ne florescirajo same, nanje pred, med ali po
ločitvi vežemo posebne kromofore, ki omogočajo detekcijo.[1]
4. EKSPERIMENTALNI DEL:
V zadnjem času je več naravnih sestavin pokazalo velike možnosti za inovativno zdravljenje obolenj, ker delujejo kot
selektivni zaviralci MMP. Take spojine so na primer: oleinske kisline (OA), resveratrol, kvercetin in glukozamin sulfat.
Ti znani MMP inhibitorji so bili zato v tej študiji uporabljeni za oceno učinkovitosti razvitih metod. Kot modelna
encima pa so izbrali MMP-2 in MMP-9.
Najprej so izvedli meritve z EMMA metodo, nato pa opravili še CE offline analizo, da bi preverili učinkovitost
metode.[1]
OPIS APARATURE:
Za vse elektroforezne poizkuse so uporabili
instrument HP3DCE, ki je bil opremljen s
standardno kaseto HP vsebujoč kvarčno kapilaro
dolžine 60 cm z notranjim premerom 75
mikronov. Kapilara je bila termostatirana pri 25 °
C in priklopljena na Argos 250B fluorescenčni
detektor. Optično načelo fluorescenčnega
detektorja je prikazano na sliki 3. Po filtriranju je
svetloba Hg-Xe svetilke vodena do kapilare po
sdsdsdsdsds Slika 3: florescenčni detektor[1] d
fdfdfdfdfdfdoptičnih vlaknih in fokusirana v
3
detekcijsko ssdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsokence. Fluorescenčna svetloba, ki jo oddaja analit,
je ujeta v notranjost kapilare in vodena vzdolž nje do kremenskega stožca in prek filtra do fotopomnoževalke. [1]
IZVEDBA ANALIZE EMMA S FLORESCENČNO DETEKCIJO:
Sistem EMMA je bil razvit skupaj s short-end injiciranjem in hitrim preklapljanjem polaritete. Najprej so kapilaro
napolnili z ločevalnim pufrom. Uporabili so 50 mM Tris pufra, ker je znano, da MMP deluje optimalno pri pH 7.5.
Nato so vbrizgali v izstopni del kapilare raztopine encimov, substrata in inhibitorja.,natančneje (-50 mbar za 3 s) z
encimsko raztopino, (-50 mbar za 3 s) s substratom z raztopino inhibitorja in spet enako raztopine encima. Po vsakem
injiciranju so izstopni konec kapilare potopili v vodo, da bi prepreči prenos vzorca (0,02 min). Za mešanje se je
vbrizgalo pozitivni potencial 5 kV za 5 sekund in se nato obrnilo polariteto na -5 kV za 5 sekund. S tem se ustvarjajo
gibanja podobna mehanskemu stresanju, ta izboljšujejo kakovost mešanja in povečajo konvekcijo reaktantov. Ločitev
lahko izvedemo z napetostjo -30 kV, saj MMP cepi substrat v negativno nabiti MCA-Pro-Leu-Gly-OH in pozitivno
nabiti Leu-DPA-Ala-Arg-NH2, in zaradi različnih elektroforeznih mobilnosti pride do ločitve. Med koraki je bila
kapilara izpirana z DMSO in BGE. Za inhibitorske poskuse so pripravili 60 µL zmes, ki vsebuje 10 µL inhibitorske
raztopine, 10 µL substratne raztopine, 10 µL IS, in 30 µL pufra Tris (5 mM, pH 7,5) v mini CE štopovnik, v drugega
pa raztopino 20 µL MMP. EMMA s fluorescenčno detekcijo razvita za in vitro karakterizacijo inhibitorjev MMP je
prikazana na sliki 4.
Slika 4: Prikaz metode EMMA [avtorska]
Ugotovili so, da z uporabo filtrov namesto monokromatorja, dobijo večjo intenzivnost svetlobe, s čemer je izboljšana
občutljivost instrumenta. Zato so za vzbujanje uporabili širokopasovni filter (240-400 nm), emisijo svetlobe pa merili s
cutoff filterom (> 418 nm).[1]
REZULTATI:
-Čas analize:
Da smo pospešili analizo, smo uporabili short-end
injiciranje.
Slika 5a prikazuje tipičen elektroforogram za EMMA
s fluorescenčno detekcijo za online hidrolize MMP s
short-end injiciranjem. Substrat ima nizko
fluorescenco in migrira pred fluorescenčnimi
produkti. IS, fluorescein je bil uveden v raztopino
substrata z namenom kontrole nihanja v inicjiranju.
Ločitev je bila dosežena v 70 sekundah. V primerjavi
z normalnim injiciranjem pri vstopu kapilare (slika
5b), je ta tehnika 3-4-krat zmanjšala čas analize in
1,5-2 krat povečala občutljivost. [1]
Slika 5: Elektroforogram EMMA analize[1]
-Učinek RPS: Preverjali so tudi vpliv hitre menjave
polaritet (RPS) na nastajanje produkta. Ugotovili so,
da velja linearnosst le za prvih 20 sekund, zato so za
nadaljne študije inhibitorjev RPS izvajali 20 sekund.
4
-Ponovljivost: Izvedli so tri sklope meritev, katerim so določili migracijski čas in relativne površine vrhov. RSD
(relativne standardne devijacije) vrednosti so bile nižje od 2,3% za migracijske čase in do 5,0% za relativne površine
vrhov.
-Vpliv koncentracije:
Slika 6: vpliv koncentracije na zaviralni učinek
Inhibitor polifenol katehin EGCG je naravni inhibitor, ki smo ga dobili z izolacijo iz zelenega čaja (polifenol katehin
izoliran iz zelenega čaja). Elektroforogram na sliki 6 ponazarja vpliv koncentracije na zaviralni učinek, EGCG, na
MMP-9 hidrolizo. Kot lahko opazimo, se površina vrha fluorescenčnih produktov povečuje s povečanjem koncentracije
EGCG. [1]
-Kinetika:
Za študij kinetike so si izbrali dva referenčna inhibitorja
(EGCG in OA) za analizo vpliva na MMP-9 in MMP-2.
Za oceno zaviralnega mehanizma in kinetične konstante
(Km), so injicirali različne raztopine substratov v rangu 550 µM, vsebujoč naraščujoče koncentracije inhibitojev (0,
20 in 60 nm) in naredili Michaelis-Mentenov graf. Ker je
iz Michaelis-Mentenovega grafa težko odčitati točno
vrednost za Vmax, ker se krivulja približuje asimptoti
Vo=Vmax zelo počasi, Michaelis-Mentenovo enačbo
lineariziramo. Z linearizacijo dobimo Lineweaver-Burkov
graf za EGCG in OA, ki je prikazan na sliki 7.
Slika 7: Lineweaver-Burkov graf za OA [1]
Iz grafa odčitamo naklon premice in odsek na ordinatni ali
abscisni
osi ter
izračuna
mo po Lineweaver-Burkovi enačbi Vmax in Km. Povišane vrednosti
na y osi (zmanšanje Vmax) in zmanjšanje vrednosti na x-osi (višji
Km), ob višjih koncenracijah inhibitorja kažejo na mešani tip
inhibicije OA pri zaviranju MMP-2 (slika 7a). V primeru EGCG
pride do povečanja na y-osi (zmanšan Vmax) in nespremenjenih
vrednosti na x-osi (isti Km) pri višjih koncentracijah inhibitorja, kar
kaže, da EGCG deluje kot nekompetitivni inhibitor za MMP-9 (slika
7B). Vzorci zaviralnih reakcij za EGCG in OA so se skladali z
rezultati predhodno narejenih analiz. Km vrednosti za MMP-2 in
MMP-9 online hidrolize so povzete v tabeli 1, skupaj z vrednostmi
objavljenimi v literaturi.[1], [7]
Slika 7B: Lineweaver-Burkov
graf za EGCG[1]
5
-Vpliv vrste MMP:
Za nadaljnje poizkuse (IC50 vrednosti) so uporabili višje koncentracije EGCG (200 nM-2 mM) in fiksne koncentracije
substrata in encima. IC50-vrednosti (koncentracija inhibitorja, ki daje 50% zaviranje) so bile 59,7 µM za MMP-2 in
31,5 µM za MMP-9. Ta rezultat pomeni, da je zaviralni učinek EGCG na MMP-2 šibkejši od tistega, na MMP-9.
Pridobljene IC50 vrednosti iz eksperimenta in tiste znane iz literature so podane v tabeli 1. RSD vrednosti za vse tri
analize so bile nižje od 2,7% za čas migracije in niso presegle 7,1% za relativne površine vrha. Zaviralni učinek EGCG
na MMP-2 je bil šibkejši od tistega, na MMP-9. [1]
5. KVANTITATIVNA
METOD:
PRIMERJAVA
ONLINE
IN
OFFLINE
Primerjava med vrednosti, določenimi z EMMA in z drugimi tehnikami iz literatur, je bila precej težka, saj so bili tam
uporabljeni različni substrati, viri encimov, in testni pogoji, proti EMMA raziskavam. Iz tega razloga, so izvedli še
offline CE test za določitev Km in IC50-vrednosti z enakimi encimi, substratom in isto koncentracijo inhibitorjev za
EMMA določanje. Rezultati offline analize so navedeni v Tabeli 1. [1]
Vidimo, da so Km vrednosti določene
z EMMA metodo višje od tistih, pridobljenih iz offline CE
testom. Vendar so te razlike majhne. Za razliko od Km vrednosti pa je 2-2.5-kratna razlika v vrednostih IC50 z offline
tehniko, ki odraža bolj močan zaviralni učinek. To je lahko posledica dejstva, da je bil zaviralec predhodno inkubiran z
encimom v offline stanju. V EMMA metodi inhibitor raztopimo z substratom in dodamo encim. Razlike v vrednostih
IC50 med online (pretočno ravnotežje) in offline (statično ravnovesje) postopkom so opazili tudi v drugih raziskavah.
Ponovljivost metode EMMA je relativno nizka, saj da visoke vrednosti RSD za relativne površine vrhov, zato je v tem
primeru boljše uporabiti offline CE analizo. [1]
Za potrditev delovanja metode so izvedli poskuse še z znanimi MMP inhibitorji kot so, EGCG, OA, kvercetin,
doksiciklin, resveratrol, glucosamin,... Učinek teh zaviralcev pri 600 µM na MMP-2 in MMP-9 so primerjali, odstotki
zaviranja za te naravnih sestavine, so prikazani v tabeli 2. Kot lahko vidimo, se učinek inhibitorjev spreminja z uporabo
različnih izoencimov MMP. EGCG in OA sta najmočnejša zaviralca, medtem ko resveratrol deluje le na MMP-2.
6
Jakost inhibitorjev se zmanšuje v vrsti za MMP-2 OA> EGCG> kvercetin> doksiciklin> glukozamin sulfat>
resveratrol, medtem ko je za MMP-9 EGCG> OA> kvercetin> doksiciklin > glukozamin sulfat. Zaviralne lastnosti teh
spojin so bile določene tudi z offline testom CE. Ugotovljeno je bilo, da so skladne z EMMA testom. Torej, lahko
vidimo, da je EMMA s fluorescenčno detekcijo zelo primerna za začetni pregled velikega števila spojin za MMP
zaviranja.
6.ZALJUČEK:
EMMA s fluorescenčno detekcijo se je izkazala za koristno analizno tehniko za karakterizacijo inhibitorjev MMP.
Prednosti pred konvencionalnimi metodami so hitra analizna, v celoti avtomatizirana in miniaturizirana poraba
vzorcev. Uporaba EMMA metode v kombinaciji s fluorescenčno detekcijo, uspešno izboljša občutljivost analize in
omogoča delo s še mnjšimi količinami vzorcev (približno 0,87 fmol encima je potrebnega za vsako analizo). Ko so
metodo EMMA kombinirali še s short-end injiciranjem, se je znižal tudi čas analize. Če primerjamo, smo za celotno
online hidrolizo, ločitev in detekcijo porabili le 70s, za klasične metode, pa je v povprečju potebna 1 ura dela. Ta
metoda je bila razvita na splošnem MMP substratu, da tako mogoča razširitev analize aktivnosti in selektivnosti
inhibitorjev tudi na druge MMP izoencime.
7
6.VIRI IN LITERATURA:
[1]-Xin Hai, Xu Wang, Mohamed El-Attug, Erwin Adams, Jos Hoogmartens, and Ann Van Schepdael
In-Capillary Screening of Matrix Metalloproteinase by Electrophoretically Mediated Microanalysis with
Fluorescence Detection
Anal. Chem. 2011, 83, 425–430
[2]-^ "Entrez Gene: MMP2 matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa
gelatinase, 72kDa type IV collagenase)".
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch
=4313.
[3]- Andrea Page-McCaw, Andrew J. Ewald & Zena Werb
Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling
Nature Reviews Molecular Cell Biology 8.221-223 (March 2007)
[4]-a
b
"Matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV
collagenase)"
[5]-http://www.biologyonline.org/articles/metabolic_mapping_proteinase_activity/zymography.html
[6]-R. Kuhn and S. Hoffstetter-Kuhn.
Capillary Electrophoresis: Principles and Practice
Springer-Verlag, Berlin, 1993
[7]-Robert Kuhelj
Biokemija v praksi:načela in tehnike
3. izd.- Ljubjana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo,2003
8