Mass Spectrometer (MS)
(484.1.4024 :המעבדה לקביעה כמותית של תרופות (מספר קורס Quantitative analysis of drugs- student's laboratory גז כרומטוגרף – ספקטרומטרייאת מסות Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS) ניתן לראות באתר האינטרנטPower Point -מצגת ב (www.bgu.ac.il/HL) .High Learn בתוכנית .) (משרד08-647-9354 'להתקשר לשמעון טל e-mail: [email protected] או : בעיות- Gas Chromatography • ,GC-MSהנה הטכניקה האנליטית האולטימטיבית לגילוי, זיהוי וכימות של חומרים נדיפים או הניתנים לנידוף. • GC-MSמשמש במגוון רחב ביותר של תעשיות כימיות, פטרוכימיות ,מזון ,בדיקות סביבתיות ,אנליזה פורנסית, אנליזה של תרופות ,בדיקות רפואיות ,בקרת תהליכים כימיים ומחקר. • בדיקת GC-MSמהווה הוכחה קבילה משפטית. Gas Chromatography • משמש להפרדת חומרים מתערובת. • התערובת מוזרקת עוברת נידוף וכל חומר יוצא ומובל בקולונה ע"י גז. פאזה נחה = קולונה המכילה שיכבה מיקרוסקופית של נוזל או פולימר פאזה נעה = גז אינרטי דוגמת הליום ,חנקן או מימן • החומרים מופרדים ע"פ תגובה עם הקולונה בזמנים שונים .נתונים נוספים המשפיעים על ההפרדה :קצב זרימת הגז והטמפרטורה. • זמן השהייה בקולונה תלוי בפולריות של החומר בהשוואה לזו של הקולונה .ספיחה של החומר לקירות הקולונה או לחלקיקים המשמשים מארז בקולונה. פקטורים המשפיעים על הפרדת החומרים בGC - • נדיפות החומר :חומרים בעלי נקודת רתיחה (נידוף) נמוכה יעברו מהר יותר דרך קולונת ה GC -מאשר חומרים בעלי נקודת רתיחה גבוהה. • פולאריות החומרים :חומרים פולאריים ינועו יותר באיטיות ,במיוחד אם קולונת הGC - אף היא פולארית. • טמפרטורת הקולונה :הגדלת טמפרטורת הקולונה מאיצה את יציאת החומרים בתערובת. • פולאריות החומר הארוז בקולונה :בדרך כלל כל החומרים ינועו באיטיות על קולונה פולארית,עם זאת חומרים פולאריים ינועו אף יותר לאט מהאחרים. • קצב זרימת הגז דרך הקולונה :הגברת מהירות הזרימה של הגז המוביל מגבירה את מהירות תנועת החומרים העוברת דרך הקולונה. • אורך הקולונה :ככל שהקולונה ארוכה יותר כך יעוכבו החומרים המצויים בה וזמן רב יותר יידרש לשם מעבר דרך הקולונה .קולונות ארוכות הינן טובות יותר להפרדה יעילה. באופן כללי הפקטור העיקרי הנלקח בחשבון בהפרדת חומרים ב GC -הוא נקודת הרתיחה של החומרים השונים .הפקטור השני הנלקח בחשבון הוא פולאריות החומרים השונים. Diagram of a gas chromatograph Flame Ionization (FID) Thermal Conductivity Detector (TCD) Mass Spectrometry (MS) השפעת העלאת הטמפרטורה בקולונה על הפרדת חומרים )Mass Spectrometer (MS • ספקטרומטריית מסות הינה שיטה המשמשת לאנליזה כימית ,חקר תגובות בפאזה גזית ,קביעת מסות אטומיות וכן לקביעת שכיחויות של איזוטופים. • במכשיר זה מולקולות החומר הנבדק עוברות יינון וחלקן מתפרק לשברים (פרגמנטים) ,הן טעונים והן לא טעונים .היונים מאופיינים ע"י יחס מסה-למטען ) (m/zויציבות יחסית. • ההתפרקות מתרחשת תוך שבירת קשרים כימיים ולעיתים תוך יצירת קשרים כימיים חדשים. השיטה הנפוצה ביותר ליינון מולקולות החומר ( )Mהיא פגיעה בעזרת אלומת אלקטרונים בעלי אנרגיה של כ:7000 kJ/mol - M+. + 2eכאשר M+הוא היון המולקולרי. M + e- )Mass Spectrometer (MS • מס-ספקטרומטריה הינה חקר השפעת אנרגית היוניזציה על המולקולה. • היונים החיוביים המתקבלים מואצים לאזור בו נוכח שדה מגנטי או שדה חשמלי. • ליונים בעלי יחס מסה למטען ) (m/zשונה מסלולים שונים בשדות הללו ולכן ניתן להפרידם ולקבוע את יחס ה (m/z)-עבור כל אחד ואחד מהם וכן לקבוע את מספריהם (שכיחויותיהם) היחסיים. The Mass Spectrum of Methane דוגמא:ספקטרום המסות של מתאן 100 Base peak M+ = 16 Molecular ion [C12H4]+. הפיק הגבוהה ביותר בספקטרום מכונה base peakוכל שאר הפיקים מצוינים יחסית אליו. הפיקים מצוינים כקווים אנכיים. תהליך יצירת הפרגמנטים נוצר ע"פחוקיות כימית פשוטה הניתנת לחיזוי. היונים הנוצרים ישקפו את הקטיוניםאו הרדיקלים הקטיונים היציבים ביותר. הפיק בעל המשקל המולקולארי הגבוהה ביותרבדרך כלל מיצג את "מולקולת האם" ),(parent moleculeפחות אלקטרוןM +1 = 17 , והוא מכונה היון המולקולארי [C13H4]+. ).molecular ion (M+ m/z C 86 H M+ = 15 C12H3+ [C12H2]+. C12H+ 16 8 1.11 H 3 12 13 14 15 16 17 H Relative ion intensity ספקטרום מסות הוא דיאגרמה (תרשים) אשר על ציר ה X-שלה נמצא היחס ) (m/zשל כל יון ויון ואילו השכיחויות היחסיות של היונים נמצאות על ציר ה Y-של הדיאגרמה. H [C12]+. )Mass Spectrometer (MS למרות תהליך יצירת היונים בדוגמא ואיבוד חלק גדול מהחומר, עדיין טכניקת ה MS-נחשבת רגישה מאוד ורק כמויות זעומות של חומר משמשות לבסוף לאנליזה. • במקרה של דוגמא מוצקה החומר מונח על חוד של פין מתכת בתוך אזור תחת וואקום גבוהה .במקרה זה הדוגמא עוברת נידוף או המראה למצב הגזי ,בדרך כלל בעזרת חימום. • גזים ונוזלים מוחדרים דרך צינורית מעבר ) (inletעם בקרת זרימה והמולקולה במצב הגזי עוברת יינון על ידי מקור יוניזציה (בהתאם למכשיר) ולאחר מכן ממשיכה לקראת אפיון באנליזאר (בהתאם למכשיר) . Mass Spectrometer (MS) :ספקטרומטר כולל שלושה חלקים-כל מס 1) Ionizer 2) Ion (or mass) Analyzer 3) Detector Mass Spectrometer (MS) – Ionization techniques 1. Electron Impact (EI) 2. Chemical Ionization (CI) 3. Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) 4. Electrospray Ionization (ESI) 5. Fast Atom Bombardment (FAB) 6. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) MS- Ionization techniques ייצור יונים מולקולריים ע"י יינון אלקטרוני )1) Electron Impact (EI • כמות האנרגיה המושקעת זהה לאנרגית היוניזציה ,המסופקת ע"י יינון אלקטרוני ומובילה ליצירת הצורה הרדיקלית (מתקבל הצורון . (M +. • האלקטרונים נוצרים ע"י חוט להט של טונגסטאן ומואצים בשדה אלקטרוני של 70 eV דרך תא יוניזציה מהפילמנט ללוכד ,תחת שליטה של שדה מגנטי .האלקטרונים מגיבים עםמולקולות החומר המנודף. • האינטריאקציה בין האלקטרונים לחומר גורמת לסילוק אלקטרון (לעיתים שניים) מהרמה הערכית )( .(valence orbitalsלעיתים נדירות נילכד אלקטרון במולקולה). •M + e- → M- M + e- → M+• + 2e- electron capture Electron pair formation 1000 times less likely Energy transfered to ion radical EI יינון אלקטרוני אידיאלי • • אנרגית היוניזציה הנדרשת למרבית המולקולות היא.8 - 12 eV : עודף אנרגיה עשוי להוביל לפירוק קשרים במולקולה המיוננת. אספקת אנרגיית היינון ב EI -היא .70 eV ניצולת היונים תלוייה באנרגיה המושקעת. בהשקעה של 70 eVבאזור המישורי הרבה יותר קל ליצר ספטרא של יונים יציבים באופן רציף. MS- Ionization techniques ייצור יונים מולקולריים ע"י יינון כימי )2) Chemical Ionization (CI • • • במקום שהינון יווצר ע"י שדה חשמלי חזק העשוי לפרק את המולקולה לפרגמנטים שונים ,משלבים את הדוגמא עם יונים של גז ) (electron-poor speciesהנוצרים לאחר הפגזה עם אלקטרונים. היון של הגז תורם יון מימן לדוגמא וזאת ע"מ לייצב עצמו. הדוגמא המיוננת (בתוספת יון מימן – )H+עוברת לזיהוי דרך הספקטרומטר. התנאים הדרושים: עודף גדול ) (104:1של הגז ) (Rביחס לדוגמא )( .(Mדוגמא לגז.)R = methane(CH4) :-שימוש באנרגיה אלקטרונית גבוהה )(500 eVובתנאי לחץ בתחום .10-150 Pascal . • היון הראשוני שנוצר בגז הצפוף הואR+ : • יונים ראשוניים מגיבים בתהליך התנגשות עם מולקולות גז נוספות ליצירת קטיונים . R+ + R RH+ + (R - H). שניוניים ע"י העברת מימן. R + e- • יון מתאן ) ,(CH5+בעל מימן נוסף ,משמש כחומצת לואיס ,ומגיב באופן חזק עם מולקולות אורגניות בסביבתו וזאת בלחץ של 20 pascalבלבד. ריאקציות אפשריות של גז עם דוגמא בשיטת הCI - MS- Ionization techniques )3) Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI • בשיטת ה APCI -זרם של דוגמא נוזלית עובר בצורת תרסיס בעזרת לחץ אויר (זרם חנקן בעל עוצמה) ממכשיר ה HPLC -לגלאי ה.MS - • תרסיס ,טיפות נוזל ,עובר בלחץ אטמוספרי דרך צינורית קוורץ מחוממת ).(5000C • הטיפות מכוונות לאלקטרודת פריקה ).(1-3.5 kV • האלקטרודה ממוקמת בסמוך לחריץ קטן המוביל לאזור וואקום גבוהה הכולל אנליזר. • יונים הנוצרים בטיפות הנוזל מגיבים עם החומר הנבדק. • מולקולות שעברו פרוטונציה או דה-פרוטונציה נוצרים בדומה לCI - ) [M+H]+ (posetiveאו )[M-H]- (negetive MS- Ionization techniques )4) Electrospray Ionization (ESI זרם נוזלי של הדוגמא נכנס כתרסיסדרך צינור נימי קטן (פלדת אל-חלד) המצוי במתח קבוע של .4 kV נוצרות טיפות נוזל טעונות. היונים נוצרים ע"י מנגנון נידוף כךשהחלקיקים המיוננים עוברים הלאה לתוך המס-ספקטרא לזיהוי. היתרון של השיטות APCIוESI - הינה בכך שהם אפשרו קבלת מס-ספקטרא לחומרים פולאריים שאינם נדיפים. בשיטת ה ESI -ניתן לבצע אנליזה גם למקרו-מולקולות (חלבונים ,פולימרים ,אוליגונוקלאוטידים וכו') מאחר וישנה אפשרות לטעינה מרובה. טכניקת הפרדת יונים • כיצד נוכל להבחין בין יחסים שונים של מסה-למטען )(m/zבצורה ניסיונית? • מאבחן-יונים ) (mass-analyzerהינו רכיב במס-ספקטרומטר המאפשר לבצע סלקציה לפי ערכי m/zמסוימים. לאחר יצירת היונים במקור היינון ,הם מואצים לתוך המס-אנלייזר ע"י שדה אלקטרוני. • בחירת מאבחן-היונים תלוי ב: • • • • הרזולוציה הנדרשת טווח המסות קצב סריקה מגבלות החשיפה היישום נקבע ע"פ אופי הכימיקל או החומר הביו-כימי. לכל סוג אנלייזר ישנו מאפיין הפעלה שונה ,בחירת האנלייזר המתאים לעיתים מצריכה למידה של החומר )Mass Spectrometer (MS Types of mass/charge analyzers אנלייזר רציף דומה לפילטר או מונוכרומטור המשמש לספקטרוסקופיה אופטית. אנלייזר רציף מעביר m/zבודד לגלאי והמס-ספקטרא מתקבלת ע"י סריקת האנלייזר דרך ערכי m/zשונים. כאשר נבחר m/zבודד ,כל שאר היונים בערכי m/zשונים נעלמים, מה שמוריד את ערך ה(S/N -יחס סיגנל לרעש) ומאפשר המשכיות אנליזה ברגישות גבוהה. סוגים: Sector quadrupole אנלייזר פעימות אוסף מס-ספקטרום מלא המתקבל מפעימה בודדת של יונים ,בעת ובעונה אחת. מה שמביא לידי עלייה גדולה בערך .S/N סוגים: )Time of flight (TOF Ion cyclotron resonance quadrupole ion trap. )Mass Spectrometer (MS Magnetic sectors analyzer • • העיקרון הוא מעבר היונים דרך עקומת מגנט המפריד יונים ע"פ התנע והמטען. מכשירי ה magnetic sector -הינם בעלי רזולוציה גבוהה ובעלי טווח מסות גבוהה יותר מאנליזרים אחרים דוגמת ,quadrupoleעם זאת הם דורשים משאבות וואקום חזקות ולעיתים קצב הסריקה הוא איטי יותר. טווח המסות המקובל ב magnetic sector -הוא , 5000 m/zאך יכול להיות מורחב עד ל.30,000 m/z - Ion selection The Mass Spectrometer Magnetic field B Focusing slits Accelerating voltage m/z = B2r2e/2V Where m = mass, e = electron charge, z = # of charges/ion r = radius of curvature V (1-10keV) Increase B Focused ion M+ Ion M+ Ionizing voltage Radius r Sample inlet Low vacuum Detector Electric sectors / double focusing Mass Specs • מכשירי ה magnetic sector -משולבים לעיתים בסדרה עם electric sectorלקבלת רזולוציה גבוהה . • ה electric sector -כולל שתי עקומות דרכן מוזרם מתח חשמלי ידוע המכוון את היון במעבר באנלייזר .המתח הנקבע קובע את מסלול היון בעקומת האנלייז. -רדיום מסלול היון נקבע ע"פ: • ה electric sector -לא יפריד יונים להם אנרגיה קינטית זהה. • במכשיר המשולב )(electric sector + magnetic sectorישנה שונות באנרגיות הקינטיות של היונים הנוצרים במקומות שונים ומשום כך ישנו יתרון בשילוב של השניים ע"מ להגדיל את הרזולוציה. • למעשה ה electric sector -משפר את הרזולוציה של הmagnetic sector - ע"י הפחתת הפיזור של האנרגיה הקינטית של היונים השונים. • בדרך כלל במכשיר משולב יופיע ה electric sector -לפני ה. magnetic sector - )Mass Spectrometer (MS quadrupole analyzer זהו האנלייזר הנפוץ ביותר בשימוש.היתרונות הן: • קומפקטי. • קצב סריקה מהיר. • יעילות שידור גבוהה. • עוצמת וואקום נמוכה או בינונית. • מכשיר זול ,אחזקה פשוטה. רזולוציה של.1 m/z units : טווח מסות :ניתן למצוא מ 1000m/z-ועד . 4000m/z • האנלייזר כולל ארבעה מוטות ( )quadrupoleשל אלקטרודות המסודרים מסביב אחד מעל השני. • כאשר היוים נעים דרך ה ,quadrupole -הם מסוננים לפי ערך ה m/z -שלהם כך שרק ערך בודד של m/zיוכל לעבור לגלאי ביציאה מהאנלייזר. • הערך m/zהעובר דרך האנלייזר ) (resonant ionנקבע ע"י ה radio frequency (RF) -וה DC voltage -שהועברו לאלקטרודות. עקרון פעולה של quadrupole RF/DC voltageמייצר שדה של תנודות במרחב הפועל כמסנן להעברת ערך ה m/z -הנבחר. ארבע אלקטרודות המחוברים בזוגות, פוטנציאל RFמסופק בין זוגות האלקטרודות מערכת מורכבת של תנועות יוצרת גל תלת ממדי )(3D מחזור שני :היונים החיוביים נדחקים בצורה מאונכת מחזור ראשון :היונים החיוביים נדחקים בצורה מאוזנת שדה קוודרופולי מעביר יונים נבחרים דרך אמפליטודות של גלים תלת ממדיים )Mass Spectrometer (MS Time-of-flight (ToF) Mass Analyzers האנלייזר של TOFמפרידיונים ע"פ זמן המסע שלהם בתוך שפופרת . • במכשיר ה TOF -יונים חיוביים נוצרים באופן מחזורי ע"י הפגזה של הדוגמא עם :פולסים מהירים של אלקטרונים ,יונים שניוניים או פוטונים הנוצרים בהקרנת לייזר. • היונים הנוצרים מואצים ע"י פולסים של שדה אלקטרוני בערך של 103 to 104 Vלהם תדירות זהה לזו של פולסי היוניזציה ,אם כי בפיגור מה מאחור. • החלקיקים המואצים עוברים לתוך שפופרת סחף בה שדה פנוי .אורך שפופרת הסחף הוא בטווח של . 0.5 – 3.0 meters • לכל היונים הנכנסים לשפופרת ישנה את אותה אנרגיה קינטית .מהירות היונים בשפופרת משתנה ביחס הפוך למסה שלהם ,כאשר החלקיקים הקלים מגיעים לגלאי מוקדם מאלו הכבדים. Two kinds of ToF analyzers – Linear time-of-flight mass spectrometer – Reflectron time-of-flight mass spectrometer תכונות של אנלייזר :TOF • מאוד פשוט ,דורש שדה חשמלי ולא מגנטי. • לא יעיל במסות נמוכות ,פחות מ.500 - • יעילות העברת יונים גבוהה ,מעט מגבלות בתהליך הזיהוי בגלאי. • אין גבול עליון של ( m/zיתרון במקרו-מולקולות). Theory of ToF analyzers מאחר וכל היונים מואצים דרך אותו מרחק ע"י אותו כוח לפני הכניסה לשפופרת ה,TOF -לכולם ישנה אותה אנרגיה קינטית. -יונים קלים יותר ינועו מהר יותר לאחר האצת היונים ,הם ניכנסים לשפופרת הטיסה ) (ToF tubeונסחפים דרך השפופרת ע"יהמהירות שהם צברו. • יונים בעלי ערך m/zנמוך יגיעו לגלאי ראשונים. • המס-ספקטרא מתקבל ע"י מדידת הסיגנל ע"י הגלאי כפונקציה של הזמן. • מאחר ומדובר באנלייזר פעימות מתקבלים ערכי S/Nגבוהים ,מאחר וכל היונים מזוהים בו זמנית. יישום שיטת המס-ספקטרא על ביו-מקרומולקולות הטכניקות המשמשות כיום לאנליזה של ביו-מקרומולקולות: • ESI-MS: Electrospray Ionization Mass Spectrometry • MALDI-MS: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry מס-ספקטרומטריה של פולימרים הייתה בלתי אפשרית ממספר סיבות: .1החומר אינו נדיף. .2היה צורך לבצע תחילה פירוק של המולקולה הגדולה ורק אחר כך לנסות ולזהות. שיטת ה MALDI -שפותחה ע"מ לתת תשובה לאנליזה של מקרומולקולות שימשה בעיקרלקבלת משקל מולקולרי ,רצפים או דרגת ניקיון עבור חלבונים ,פפטידים ואוליגונוקלאוטידים. במקרה של פולימרים ניתן היה לקבל:את המשקל המולקולרי המוחלט. אינפורמציה מיבנית ,יחידות חוזרות ,קבוצות פונקציונליות וכדו'. סקירה כללית של MALDI-MS מס-ספקטרוסקופיה של .Time-of-flight תהליך היוניזציה מתבצע ע"י פולסים שללייזר למשך ננו-שניה. השיטה משלבת שימוש במטריקס בו משולבתהדוגמא לשם יינון יעיל. תפקיד המטריקס ):(matrix בידוד החומר הנבדק למניעת פירוק. בליעת האנרגיה מהלייזר. העברת האנרגיה למולקולה ללא הרס המולקולה(מכונה גם יוניזציה רכה). הגברת קצב היוניזציה של החומר הנבדק.חומרי מטריקס המצויים בשימוש: Block diagram of MALDI- Linear TOF MS בחינה במס-ספקטרא במקביל לקבלת MS1, MS2, MS3 אנליזת MSבמקביל ) (Tandem MS or MS/MSמשמשת בעיקר לקבלת אינפורמציה מבנית על החומר הנבדק. תחילה מקבלים ספקטרא המהווה ,MS1ממנו בוחרים יונים ראשונים,המהווים את "יוני האם" ).(parent ions "יון אם" ,בעל ערך m/zמסויים ,עובר הלאה לפרגמנטציה נוספת במס-ספקטראומתקבל ספקטרום המהווה MS2ומכונה "יוני הבת" ). (daughter ions -למעשה ניתן להתייחס ל MS1 -כאל מקור יוני עבור .MS2 MS1 MS2 דוגמאות מס-ספקטרא ) (EIלחומרים שונים- סיווג ע"פ קבוצות פונקציונליות אלכוהול: יון מולקולת האלכוהול הינו קטן או כלל לא ניראה .בדרך כלל מתרחש ביקוע הקשר C-C הסמוך לחמצן .באלכוהול מתבצע איבוד של מולקולת מים. דרך יצירת היון באלכוהול: H H O O אלדהיד: ביקוע של הקשרים בסמוך לקבוצת הקרבוניל גורמת לאיבוד מימן (משקל מולקולארי פחות )1 או לאיבוד של ( CHOיון מולקולארי פחות .)29 דרך יצירת היון באלדהיד: H H O O אלקאנים: באלקאנים היון המולקולארי מופיע ,אך בעוצמה נמוכה .הפרגמנטציה כוללת קבוצה של פיקים, בהפרש של 14יחידות ,המיצגים איבוד של מתילן ) (CH2בכל פעם ולבסוף קבוצת מתיל. דרך יצירת היון באלקאנים: אמידים: אמידים ראשוניים מראים base peakלפי תהליך של שיחלוף , McLaffertyכמתואר מטה. אמינים: הפיק של היון המולקולארי באמין הראשוני הינו מספר אי-זוגי. ביקוע-אלפא לחנקן הינו ביקוע מקובל באמינים. באמין שניוני הפיק של היון המולקולארי אף הוא מספר אי-זוגי.פיק הבסיס ) (base peakנוצר לאחר ביקוע של הקשר C-Cהסמוך לקשר .C-N דרך יצירת היון באמין: N H N H ארומטים: הפיקים של היון המולקולארי בארומטים הוא חזק ובולט עקב המבנה היציב. חומצה קרבוקסילית: בחומצות עם שרשרת קצרה ,הפיקים הבולטים הינם אלו לאחר איבוד של 17( OHפחות יחידות) ו( COOH -פחות 45יחידות) וזאת עקב הביקוע של הקשרים בסמוך ל. C=O - דרך יצירת היון בקרבוקסיל: O O OH אסתר: פרגמנטים מופיעים לפי ביקוע הקשר הסמוך לקשר ( C=Oאיבוד קבוצת אלקוקסי )–OR ,ושיחלוף ממני. דרך יצירת היון באסתר: O O O אתר: פרגמנטציה מתרחשת בעמדה אלפא לאטום החמצן ( קשר C-Cהסמוך לחמצן). דרך יצירת היון באתר: O O הלידים: הנוכחות של אטומי כלורין או ברומין מזוהה בדרך כלל ע"פ הפיקים של האיזוטופים השונים. קטונים: הפיקים העיקריים בפרגמנטציה נוצרים מביקוע של קשרי C-Cהסמוכים לקבוצת הקרבוניל. דרך יצירת היון בקטון: O O
© Copyright 2024