1. No category

Det helsevitenskapelige fakultet
Bioingeniørutdanningen
Kull 2007
BACHELOROPPGAVE
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved
kapillærelektroforese
Dato: 3. juni 2010
Skrevet av:
Linda Therese Høyer
Lisa Kristiansen
Anette Christin Iversen
Forord
Vi er tre bioingeniørstudenter som har utført vår avsluttende Bacheloroppgave ved
Laboratoriemedisin på Universitetssykehuset Nord Norge (UNN). Her har vi
arbeidet med å etablere en metode for kvantitering av M-komponent ved
kapillærelektroforese.
Vi har også fått være med på å utvikle et dataprogram som gjør det mulig å overføre
nødvendige resultater fra en annen seksjon til vår pc for utregning av nye resultater,
og lagd standardkommentarer til utsvaring i det elektroniske labsystemet DIPS Lab.
Oppgaven vår tar utgangspunkt i en tidligere skrevet Bacheloroppgave hvor
problemstillingen da var å undersøke om det er mulig å kvantitere M-komponent
ved hjelp av kapillærelektroforese, og om metoden ga reproduserbare svar.
Resultatet ble at kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese er mulig
og at svarene er reproduserbare hvis kvantiteringen foregår etter tydelige
retningslinjer. (1)
Kvantitering av M-komponent er av meget stor interesse for klinikerne ved UNN
som fram til nå har forholdt seg til et kvalitativt svar i sykdomsutredning og
oppfølging. Sykehuset Buskerud var det første til å prøve ut dette i 2003 og har
brukt denne metoden siden den gang. Nettopp fordi dette har vært så etterspurt har
det vært en veldig spennende prosess å være en del av. Vi vil derfor rette en stor
takk til fagområde immunologi for at de har tatt så godt i mot oss og delt
arbeidsplassen sin med oss, til overbioingeniør Astrid-Elisabeth Christiansen
Hanssen som har vært vår faglige veileder der, og til fagområde klinisk biokjemi for
å ha analysert totalprotein på prøvene våre. Vi vil også takke ass.lege Ingvild
Jenssen Lægreid for innføring i emnet og hjelp til kliniske spørsmål underveis. I
tillegg fortjener vår dataekspert Oddvar Gamst en takk, så vel som produktansvarlig
Fredrik Spone hos Bergman Diagnostika og alle andre som har bidratt.
Tromsø, 3. juni 2010
Sammendrag
I denne oppgaven har vi etablert en metode for kvantitering av M-komponent ved
kapillærelektroforese, og sett på nytteverdien av denne metoden. Under prosessen
har vi vært involvert i utviklingen av et dataprogram for overføring av arbeidslister.
Ved hjelp av dette programmet overføres totalprotein-verdier automatisk fra
fagområde klinisk biokjemi til Capillarys 2, i stedet for å legge verdier inn manuelt.
I tillegg har vi vært med på å utarbeide standardkommentarer for utsvaring av Mkomponent-resultater. Vi har studert endringer i sykdomsforløpet ved hjelp av
svarhistorikk til utvalgte pasienter i form av elektroforesediagrammer. Det er ingen
tvil om at kvantitering av M-komponent er en fordel for både pasient og kliniker,
både når det gjelder vurdering av prognose og effekt av behandling. Som en følge av
dette blir det lettere å sette en diagnose og følge sykdomsforløpet. I etterkant av
studiet ved den tidligere bacheloroppgaven, har UNN i samarbeid med
Rikshospitalet validert metoden. Etter å ha samkjørt dataprogrammet og
standardkommentarene med analysen, er metoden nå klar for rutinemessig bruk.
Innholdsfortegnelse
Innhold
side
1.0 Innledning
1
2.0 Teori
2.1 Immunglobuliner
2
2.2 M-komponent
3
2.3 Sykdommer
4
2.4 Kapillær elektroforese
5
2.5 Retningslinjer for kvantitering
2.5.1 Grensesetting
8
3.0 Materiale og metoder
3.1 Utvelgelse av prøvemateriale
11
3.1.1 Utstyr
12
3.1.2 Reagenser og kontroller
12
3.1.3 Grenseverdier for kontroll
12
3.1.4 Fremgangsmåte
12
3.2 Kvantitering av totalprotein
4.0 Resultater
13
14
4.1 kontroll
15
4.2 Pasient 096 10487
16
4.3 Pasient 096 10491
17
4.4 Pasient 096 10492
19
4.5 Pasient 096 10496
21
4.6 Pasient 096 10500
22
4.7 Pasient 096 10504
23
4.8 Pasient 096 10508
24
4.9 Pasient 096 10513
26
4.10 Tabell
29
5.0 Diskusjon
30
5.1 Pasient 096 10487
30
5.2 Pasient 096 10491
30
5.3 Pasient 096 10492
31
5.4 Pasient 096 10496
31
5.5 Pasient 096 10500
31
5.6 Pasient 096 10504
31
5.7 Pasient 096 10508
32
5.8 Pasient 096 10513
32
5.9 Standardkommentarer
33
5.10 Nytteverdi
33
5.11 Grensesetting
33
5.12 Identifisering av immunglobuliner
34
5.13 Videreutvikling
34
6.0 Konklusjon
36
Litteraturhenvisning
Vedlegg
!
!
!
!
!
!
!
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
1.0 Innledning
Plasmaceller produserer normalt immunglobuliner. Ved for eksempel en infeksjon
vil det i noen tilfeller skje en feil som fører til at det dannes kloner som igjen deler
seg, og som alle produserer samme type immunglobulin uten at det er behov for det.
Det er dette som er M-komponent. Påvisning av M-komponent vil allikevel ikke si
det samme som at en tilstand diagnostiseres. Det gir derimot en mistanke om cancer,
og er en del av utredning og oppfølging. (3,4)
Etterspørselen av å kvantitere M-komponent har vært stor, og derfor har vi på
bakgrunn av tidligere studier (1) gjort et forsøk på å innføre en metode som gjør
denne prosessen lettere. Vår problemstilling er da; ”Etablering av metode for
kvantitering av M-komponent ved hjelp av kapillærelektroforese”.
Som en del av metode-etableringen har vi bistått IT-avsvarlig i utviklingen av et
dataprogram som skal gjøre arbeidet mer automatisert. Dette er med på å redusere
risikoen for menneskelige feil, noe som ofte er tilfelle ved manuell innlegging av
analysesvar.
I etterkant av den tidligere Bacheloroppgaven, ”Kvantitering av M-komponent” (1),
har seksjon for immunologi på UNN samarbeidet med Rikshospitalet via e-post for
å verifisere definerte regler for grensesetting. Ut fra dette ble det klart at UNN og
Rikshospitalet satte tilnærmet like grenser. Vi har tatt utgangspunkt i dette arbeidet
ved vår grensesetting.
Alle prøvene våre er analysert i rutinen tidligere, og disse resultatene har vi brukt for
å vurdere sykdomsforløp og effekt av behandling. Det er tidligere utført
immunotyping på noen av disse prøvene for å identifisere immunglobuliner. Vi har
brukt resultater fra denne metoden for å sette klare grenser på M-komponent. I
tillegg må totalprotein analyseres for å kunne kvantitere M-komponent.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
1
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
2.0 Teori
2.1 Immunglobuliner
Immunglobuliner (Ig) er proteiner som befinner seg i blodet. Disse er også kalt
antistoffer og har en livsviktig betydning i forsvaret mot infeksjoner i kroppen.
Immunglobulinene kan deles inn i 5 klasser; IgG, IgA, IgM, IgE og IgD, hvor hver
av disse har ulik funksjon og egenskaper. (2)
Figur 1: Struktur for immunglobuliner. (14)
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
2
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
2.2 M-komponent
M-komponent er monoklonale immunglobuliner i blodet, som produseres av
plasmaceller. Plasmaceller utvikles fra B-lymfocytter og er en del av kroppens
immunforsvar. I beinmargen utvikles B-lymfocytter fra stamceller. B-celler har
membranbundne antigenreseptorer som er immunglobuliner. Etter
antigenstimulering, deler B-cellene seg og noen av dem utvikles til plasmaceller.
Disse plasmacellene vil fortsette å danne immunglobulin/antistoff med samme
spesifisitet som den aktiverte lymfocytten hadde opprinnelig som antigenreseptor.
(16)
Figur 2: Differensiering av B-celler. (17)
Ved for eksempel en infeksjon vil normale plasmaceller som produserer
immunglobuliner reagere med bakterie eller virus. Plasmacellen deler seg og blir til
mange celler som danner samme type immunglobuliner. Når infeksjonen er over blir
noen av cellene til hukommelsesceller, mens resten av cellene dør. Ved feil i denne
prosessen vil ikke cellene dø, men forsetter å dele seg slik at det dannes mange like
celler (klon) uten at det er behov for det. Disse cellene vil da dele seg i ulik
hastighet, avhengig av hvor aggressiv sykdommen er, og danne unormale mengder
av samme type immunglobulin. Det er dette som kalles M-komponent og brukes
som markør for å stille diagnose.(3,4)
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
3
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
2.3 Sykdommer (5,6,15)
M-komponent kan som nevnt påvises ved flere ulike sykdommer, men den vanligste
tilstanden er monoklonal gammopati av usikker betydning (MGUS), som utgjør 50
% av tilfellene. Dette er pasienter med påvist M-komponent, ofte tilfeldig, men som
ikke oppfyller kravene for myelomatose, Waldenstrøm, amyloidose eller annen
lymfoproliferativ sykdom. Pasienter med MGUS kan utvikle annen
lymfoproliferativ sykdom i ca. 1 % av tilfellene per år, og da har det delvis en
sammenheng med størrelsen på M-komponenten. I løpet av ca. en tiårs periode er
risikoen for progresjon cirka lik mengde M-komponent i for eksempel g/L.
Pasientene må utredes for å utelukke myelomatose og lymfom, og kontrolleres
hyppig de første årene. Det finnes ingen behandling for MGUS.
Myelomatose, eller benmargskreft, kommer av ukontrollert vekst av klonale
plasmaceller i benmarg. Plasmacellene produserer vanligvis mange typer antistoffer,
men ved myelomatose dannes det mye av kun èn type immunglobulin. Dette går ut
over de andre typene antistoffer, så vel som andre typer hvite blodceller, og gjør at
kroppens infeksjonsforsvar svekkes. I tillegg påvirkes dannelsen av røde blodceller
og blodplater og det utvikles anemi og blødning. Sykdommen er progressiv. Den
kan diagnostiseres før man utvikler symptomer, noe som kan ta inntil 3 år. Cellegift
og høydose-behandling med autoimmun stamcellestøtte (HMAS) kan forlenge
levetiden til pasienten, men sykdommen er i utgangspunktet uhelbredelig. Stabil
mengde M-komponent eller fullstendig remisjon etter behandling gir bedre
prognose.
Ved kreftsykdommen Morbus Waldenstrøm dannes det lymfoplasmocytoide celler i
benmargen som videre danner monoklonale immunglobuliner av type IgM. Økte
mengder fører til hyperviskositet i serum, forstørret milt, neuropati og koagulopati.
Sykdommen har et langsomt forløp med få symptomer. Pasienten behandles med
cellegift og gjennomsnittlig overlevelse er 5 år.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
4
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) og lymfomer er klonale B-cellesykdommer som
kan ha funn av M-komponent. Sykdommenes forløp varierer. Pasienten oppfølges
og behandles etter behov.
2.4 Kapillær elektroforese (7,8,9,10)
Ved kapillær elektroforese benyttes en væskefase til separasjon av proteiner.
Instrumentet inneholder 8 silicakledde kapillærer som er fylt med en
elektrolyttbuffer som er positivt ladet. På grunn av dette vil bufferen utligne den
negative ladningen i kapillærveggen. I kapillærene injiseres prøvematerialet og i et
elektrisk felt separeres molekylene elektrokinetisk når spenningen blir slått på.
Denne separeringsteknikken er basert på elektroosmotisk flow (EOF). Positivt
ladede ioner i bufferen vil tiltrekkes av kapillærveggen samtidig som de tiltrekkes
av katoden. Dette fører til EOF, som er en sterkere tiltrekningskraft enn det
elektriske feltet. Molekyler som i utgangspunktet tiltrekkes den positivt ladede
anoden, vil da vandre mot den negativt ladede katoden.
Figur 3: EOF fører til at alle molekylene tiltrekkes mot katoden. (11)
Serumproteinene vil vandre med seks forskjellige hastigheter mot elektroden, og de
proteinene som egentlig tiltrekkes anoden vil vandre langsommere enn de andre.
Dermed kan proteinenes forskjellige vandringshastigheter avleses som seks fraksjoner;
albumin, !-1, !-2, "-1, "-2 og #. Disse fraksjonene avleses ved absorpsjonsfotometri og
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
5
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
man vil kunne se variasjonen av absorbansen til disse fraksjonene i et
elektroforesediagram. Diagrammene studeres nøye visuelt og hvis det er tatt tidligere
prøver av samme pasient, kan man studere historikken og sammenligne tidligere
resultater.
Figur 4: Elektroforesediagram. Eksempel av et normalt elektroforesebilde av de ulike
fraksjonene. Fra venstre mot høyre: Albumin, !-1, !-2, "-1, "-2 og #. (12)
Immunglobulinene befinner seg i #-regionen, men IgA kan også oppstå i "-2 regionen.
Dermed er det i disse områdene man må være oppmerksom på unormale topper. Mkomponenten kan enten oppstå som en høy smal topp i hele #-regionen, eller oppstå
som en ekstra topp i tillegg til den normale kurven.
Det er kun det patologiske området til M-komponenten som det er ønskelig å kvantitere.
Ved hjelp av instrumentets dataprogram er det mulig å markere dette området. Ved å
legge inn total protein verdien for hver enkelt prøve, beregnes det hvor stor Mkomponenten er i g/l (mengde protein).
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
6
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Figur 5: Eksempel på prøve med påvist M-komponent (pasient nr 10489).
Et problem som kan diskuteres er hvor man skal sette grenser for M-komponent. Dette
kan ha mye å si på mengde protein. Men dette må vurderes fra prøve til prøve, og det er
viktig at man også studerer immunotypingen av prøven for å være sikker på hvor Mkomponenten er. Dette diskuteres nærmere under ”Grensesetting”.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
7
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
2.5 Retningslinjer for kvantitering
2.5.1 Grensesetting
I en tidligere Bacheloroppgave (1) ble det vurdert hvordan grensene ved kvantitering av
M-komponent skal settes. Det ble konkludert med at grensen må settes der kurven
endrer stigningsgrad. Mengde immunglobulin som skal kvantiteres er det som avviker
fra det normale. Grensesettingen kan ha stor betydning for resultatet og ved å markere
det området hvor M-komponenten ligger, finner vi ut hvor stor den er. Dersom man er
usikker på hvilken del av kurven som skal avgrenses, kan man se på en tidligere
identifisering av M-komponenten, eventuelt hvor grenser er satt på tidligere prøver. Det
kan forekomme at pasienter får påvist to M-komponenter, det er da mulig å kvantitere
begge disse. For at man skal få svaret i g/l må man ha resultatet fra totalproteinanalyseringer. Har man ikke dette resultatet kommer svaret ut i %, og det er ikke
ønskelig ettersom mengden immunglobulin i blodet kan endre seg uten at det betyr
endring av mengde M-komponent. Topper kvantitert til < 0,3 g/L blir ikke gitt ut med
nøyaktig mengde fordi så små topper kan være vanskelig å kvantitere. Dersom et
resultat er enten 0,1 g/L eller 0,2 g/L antas det at forskjellen ikke har noen stor klinisk
betydning, og resultatet gis derfor ut som < 0,3 g/L.
Figur 6: Bildet til venstre viser korrekt grensesetting, mens bildet til høyre illustrerer
feil måte å sette grense på (1).
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
8
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Immunotyping blir analysert på prøver hvor det er påvist en M-komponent. Prøven
inkuberes med anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, anti-kappa og anti-lambda, og det som er
til stede vil reagere og felles ut. Deretter utføres en ny elektroforese hvor Mkomponenten da identifiseres ved å studere bilde fra immunotypingen, for å se hva som
har forsvunnet. Immunotyping utføres på nye pasienter og ellers hvert 5. år. (18)
Figur 7: Immunotyping av immunglobulin (10513).
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
9
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Første bilde i figur 7 er en referansekurve. Denne er videre lagt over de andre fem
kurvene for å se om disse avviker fra normalen. I bilde 3 og 6 ser man tydelig avvik fra
referansekurven. Her er høyre del av toppen borte. Ved kvantitering kan man ved hjelp
av immunotypingen se hvordan grensene skal settes. Ut i fra dette kan M-komponenten
identifiseres som en IgA lambda.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
10
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
3.0 Materialer og metoder (10)
3.1 Utvelgelse av prøvemateriale
24 positive M-komponentprøver ble samlet inn til vår studie av bioingeniører på
fagområdet, og frosset ned ved -20 °C på TT-rør. Prøvene ble tatt på serumglass. Til
disse prøvene laget vi egne barkoder slik at anonymiteten til pasientene ble ivaretatt.
Prøvene ble merket med et fiktivt navn og fødselsdato.
Prøver som var tydelig lipemiske, hadde for lite prøvemateriale eller hemolyse skulle
ekskluderes, siden dette kan påvirke analysesvarene på Capillarys 2. Det var ikke
nødvendig å ekskludere noen av prøvene brukt i denne studien.
Figur 8: Bilde av instrumentet Capillarys 2 fra Sebia. (13)
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
11
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
3.1.1 Utstyr:
-
Capillarys 2, modell 1019 (Sebia, Cedex-France)
-
Stativ til prøver.
-
Kontroller levert til Capillarys 2.
-
Fortynningsbrønner.
3.1.2 Reagenser og kontroller:
-
Capillarys Protein(e) kit som inneholder reagensfilter, buffer og vaskeløsning.
-
Ionebyttet vann.
-
Capiclean LOT 14018/20, med utløpsdato 2010/01. Datoen er godkjent.
-
Natriumhypoklorittløsning.
-
Sebia normalt kontrollserum LOT 24078/20, med utløpsdato 2012/07.
3.1.3 Grenseverdier for kontroll:
-
!-2: 3,0 – 5,8 %
-
": 11,8 – 17,8 %
3.1.4 Fremgangsmåte:
-
Vannbeholderen fyltes med ionebyttet vann, før PC og instrumentet ble slått på.
-
På PC startet man programmet Phoresis, hvor man deretter justerte reagens og
væskenivå.
-
Kontrollen ble gjort klar og satt i rack 0 med fortynningsbrønner.
-
Kontrollen ble analysert og godkjent.
-
Prøvene ble satt i rekkefølge i rack og analysert.
-
Totalprotein-verdiene ble lagt inn manuelt på arbeidslisten i programmet til
Capillarys 2. Dette fordi dataprogrammet for overføring av disse resultatene ikke
var ferdigutviklet.
-
Hver enkel M-komponent ble kvantitert ved å markere de ønskede områdene.
Resultatene ble skrevet ut, og ved å se på tidligere historikk til de forskjellige
prøvene, ble disse sammenlignet.
Det ble ikke gjort noen endringer på den originale framgangsmåten (vedlegg).
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
12
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
3.2 Kvantitering av total protein
Denne analyseringen ble ikke utført av oss, men av de ansatte på Laboratoriemedisin,
fagområde klinisk biokjemi. Analyseringen ble gjort på instrumentet Modular P 800.
Siden analysering av total protein blir gjort ved en annen seksjon, vil vi derfor ikke gå
noe mer inn på denne metoden og fremgangsmåten (vedlegg)
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
13
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
4.0 Resultater
Her presenteres resultater for M-komponent i form av elektroforesediagrammer. Vi har
sammenlignet våre resultater med tidligere analyserte prøver fra samme pasient for å se
på sykdomsforløp og virkning av behandling. Vi har valgt ut 8 diagrammer som tydelig
viser fordelen med å kvantitere M-komponent framfor å klassifisere de ulike
immunglobulinene. Resten av prøveresultatene er vedlagt. Kun historikk etter 2007 er
tatt med i oppgaven til sammenligning, da prøver før dette er analysert på et annet
instrument. For å kunne sette grenser ved kvantitering har vi i noen tilfeller brukt
immunotyping for å se hvor M-komponenten ligger. Dette er ikke tidligere utført på alle
prøvene og derfor har vi ikke presentert resultater fra immunotypingen til alle
eksemplene. I tillegg er det ikke alltid nødvendig å bruke immunotyping for å avgrense
en M-komponent. Ved å følge definerte retningslinjer for grensesetting var det greit å
avgrense M-komponenten ved kvantitering. Dette er generelt en vurderingssak ettersom
M-komponenten varierer i størrelse og form fra pasient til pasient.
Vi analyserte en kontroll på Capillarys 2 for å kvalitetssikre våre analyseresultater.
Kontrollen injiseres i de 8 kapillærene slik at resultatet presenteres som 8
elektroforesediagram. I programmet til Capillarys 2 sjekket vi at kontrollene var
innenfor referanseområdet for !-2-regionen og "-regionen. I tillegg sjekket vi om alle
kontrollene var like ved å legge en kontroll som referansekurve over de andre.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
14
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
4.1
Figur 9: Bildet viser et eksempel på en kontrollkurve.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
15
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
4.2
Figur 10: Pasientnummer 10487 sammenlignet med et tidligere resultat fra mai 2009,
hvor den laveste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
Figur 11: Pasientnummer 10487 kvantitert etter gjeldende regler for grensesetting.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
16
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Pasient 10487 har fått påvist to komponenter, hvor den ene er vanskelig å kvantitere på
grunn av størrelsen. Den har en verdi på 0,1 g/L. Topp nummer to har en M-komponent
som er kvantitert til 8,5 g/L. Dette er beregnet ut fra en totalproteinverdi på 71,1 g/L.
4.3
Figur 12: Pasientnummer 10491 sammenlignet med et tidligere resultat fra april 2008,
hvor den høyeste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
Hos pasient 10491 ser vi en tydelig økning av M-komponent fra april 2008 til vår
analysering i 2010. Vi ser også en markant økning allerede fra april 2008 til november
2008.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
17
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Figur 13: Pasientnummer 10491 sammenlignet med et tidligere resultat fra
november 2008, hvor det også er påvist M-komponent. Den høyeste toppen
representerer resultatet fra vår analysering.
Figur 14: Pasientnummer 10491. Her er M-komponenten kvantitert etter gjeldende
grensesetting.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
18
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Diagrammet ovenfor viser kvantitering gjort i henhold til regler for grensesetting.
Ved å legge inn resultatet for totalprotein i programmet får vi i stedet for et resultat i
%, en eksakt mengde protein i g/L. For prøve 10491 er totalprotein 71,7 g/L, og da
er M-komponenten beregnet til 13,3 g/L.
4.4
Figur 15: Pasientnummer 10492 sammenlignet med et tidligere resultat hvor den
høyeste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
Ovenfor ser vi at M-komponenten har steget fra analysering september 2008 til nå.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
19
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Figur 16: Pasientnummer 10492 sammenlignet med et tidligere resultat hvor den
laveste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
Diagrammet over viser nedgang av M-komponent siden januar 2010.
Figur 17: Pasientnummer 10492 kvantitert etter gjeldende regler for grensesetting.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
20
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Etter kvantitering ved hjelp av verdien til totalprotein på 80,3 g/L, er Mkomponenten ved vår analysering beregnet til 17,7 g/L.
4.5
Figur 18: Pasientnummer 10496 sammenlignet med et tidligere resultat hvor den
høyeste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
For pasient 10496 ser vi en økning i M-komponent fra analysering februar 2008
sammenlignet med vår analysering.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
21
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Figur 19: Pasientnummer 10496 kvantitert etter gjeldende regler for grensesetting.
Men en totalproteinverdi på 66,6 g/L er M-komponenten ved kvantitering 11,0 g/L.
4.6
Figur 20: Pasientnummer 10500 kvantitert etter gjeldende regler for grensesetting.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
22
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Ovenfor viser diagrammet til pasientnummer 10500 en påvist M-komponent som er
kvantitert til 1,6 g/L ut fra en totalproteinverdi på 64,8 g/L
4.7
Figur 21: Pasientnummer 10504 sammenlignet med et tidligere resultat hvor den
høyeste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
Diagrammet ovenfor, for pasientnummer 10504, viser en økning av M-komponent
fra analysering november 2009 til vår analysering. Her ser vi også at Mkomponenten befinner seg i !-2 fraksjonen, noe som av og til er tilfelle.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
23
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Figur 22: Pasientnummer 10504 kvantitert etter gjeldende regler for grensesetting.
Etter kvantitering ved hjelp av verdien til totalprotein på 70,3 g/L, er Mkomponenten ved vår analysering beregnet til 2,7 g/L.
4.8
Figur 23: Resultat av vår analysering for pasientnummer 10508.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
24
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
I diagrammet ovenfor ser vi at M-komponenten denne gangen befinner seg i både !2 og "- fraksjonen. Dette er første analysering for denne pasienten og vi har derfor
ingen analyseringer å sammenligne med.
Figur 24: Pasientnummer 10508 kvantitert etter gjeldende regler for grensesetting.
Ved kvantitering av denne prøven må vi ta med begge toppene for å få med hele Mkomponenten. En totalproteinverdi på 78,5 g/L, gir da en samlet M-komponent på
20,7 g/L.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
25
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Figur 25: Pasientnummer 10508 kvantitert som to separate topper. Eksemplet viser
hvordan mye av M-komponenten på denne måten ikke blir kvantitert.
4.9
Figur 26: Pasientnummer 10513, sammenlignet med et tidligere resultat fra april
2009, hvor den høyeste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
26
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
For pasient 10513 ser vi en økning av M-komponent fra april 2009 til vår
analysering.
Figur 27: Pasientnummer 10513 sammenlignet med et tidligere resultat fra januar
2010, hvor den laveste toppen representerer resultatet fra vår analysering.
Videre ser vi fra analysering januar 2010 at det er en nedgang av M-komponent.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
27
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Figur 28: Pasientnummer 10513 kvantitert etter gjeldende regler for grensesetting.
Til slutt er M-komponenten kvantitert til 5.9 g/L, når verdien for totalprotein er 67,4
g/L. Komponenten befinner seg i !-2-regionen. Det ser man ofte ved identifisert IgA.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
28
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
4.10
Tabell 1: Oversikt over identifisert immunglobulin og kvantitert M-komponent.
Pasient
nr.
Komponent
IgG kappa /
10487 IgM
10491 IgA kappa
10492 IgG kappa
10496 IgG kappa
10500 IgG kappa
10504 IgG kappa
10508 IgM lambda
10513 IgA lambda
Referanseverdi
IgG, IgM, IgA, Kvant. Kvant.
g/L g/L g/L g/L
g/L
17,0 1,5 0,7
2,9 0,1 17,6
22,8 0,2 0,5
12,9 0,1 0,2
10,0 0,9 0,8
10,0 0,6 1,3
3,2 33,0 0,2
2,8 0,2 6,7
7,0- 0,4- 0,716,0 2,3 4,0
8,5 0,1 (10%)
14,7
17,7
11,0
1,6
2,7
20,7
5,9
% av total
Ig
50,0
83,5
77,7
85,2
16,2
27,4
62,6
88,4
Tabell over viser påvist komponent for de ulike pasientnumrene, og forholdet mellom
mengde immunglobulin og kvantitert komponent. Kvantitering av immunglobuliner er
gjort i rutinen ved UNN og ikke i anledning vår studie.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
29
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
5.0 Diskusjon
Det ble samlet inn 24 pasientprøver som var positive på M-komponent. Dette antallet
valgte vi for å ha et representativt utvalg, i tillegg til å få tre fulle prøverack slik at
reagensene ble best mulig utnyttet. Ingen av våre prøver ble ekskludert på grunn av
interferens. I resultatet vårt har vi presentert 8 av 24 pasientprøver, og lagt resterende
som vedlegg. Disse 8 prøvene ble valgt for å få vist hvordan toppene kan variere fra
pasient til pasient, og belyse de ulike problemstillingene man møter på ved
grensesetting.
5.1 Pasient 10487
Første elektroforesediagram viser vårt analyseresultat på pasienten sammenlignet med
et resultat fra tidligere analysering av samme pasient med M-komponent. Det kan se ut
som det er en nedgang i M-komponent, men det er mest sannsynlig skjedd en
forskyvning av kurven. Behandlingen har dermed ikke påvirket noen nedgang på Mkomponent. I praksis ville man ha diskutert kurven med lege for å få innspill.
Ved å studere resultatet av identifiseringen av immunglobuliner som er gjort tidligere i
rutinen, ser man at !-regionen inneholder to M-komponenter. M-komponenten som er
identifisert som en IgM kappa, kvantiterte vi til en verdi på 0,07 g/L. Siden størrelsen på
M-komponenten er så liten, vil den være vanskelig å kvantitere. Den andre Mkomponenten, identifisert som en IgG kappa, ble kvantitert til 8,5 g/L. I rutinen vil
resultatet til den første M-komponenten bli svart ut med standardkommentar ”Mkomponent påvist. Klassifiseres som IgM Kappa. Kvantitering <0,3 g/L. Mkomponenten er for liten til å kvantiteres nøyaktig”. Den andre vil bli svart ut som ”Mkomponent påvist. Klassifiseres som IgG Kappa. Kvantitering: 8,5 g/L”.
5.2 Pasient 10491
I figur 11 har vi sammenlignet vårt analyseresultat for pasientnummer 10491 med en
tidligere analysering fra april 2008. Vi ser her en betydelig økning av M-komponent til
vår analysering utført mai 2010.
Videre har vi sammenlignet med en analysering gjort i november 2008. Også her ser
man en markant stigning i M-komponent. Hvis man deretter sammenligner
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
30
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
analyseringen gjort i april med analyseringen i november 2008, ser man at Mkomponenten har hatt en liten økning bare noen måneder senere.
Ut fra kvantiteringen vil M-komponenten bli svart ut som ” M-komponent påvist.
Klassifiseres som IgA Kappa. Kvantitering: 13,3 g/L”.
5.3 Pasient 10492
Resultatet for pasientnummer 10492 viser at M-komponenten hadde en økning fra
september 2008 til januar 2010. Deretter ser vi at det har vært en nedgang i Mkomponenten fra januar 2010 til vår analysering mai 2010. Det betyr at behandlingen
pasienten har fått, har fungert. Ut fra kvantiteringen vil M-komponenten bli svart ut som
” M-komponent påvist. Klassifiseres som IgG Kappa. Kvantitering: 17,7 g/L”.
5.4 Pasient 10496
For pasientnummer 10496 ser vi at det har skjedd en markant økning fra analysering
gjort i februar 2008 til vår analysering i mai 2010. Dette kan tyde på at eventuell
behandling ikke har hatt noen effekt. M-komponenten svares ut med
standardkommentar ” M-komponent påvist. Klassifiseres som IgG Kappa. Kvantitering:
11,0 g/L”.
5.5 Pasient 10500
Pasientnummer 10500 har ingen svarhistorikk å sammenligne med. M-komponenten vil
bli svart ut som ” M-komponent påvist. Klassifiseres som IgG Kappa. Kvantitering: 1,6
g/L”.
5.6 Pasient 10504
Fra analysering i november 2009 ser vi at M-komponenten har økt fram til vår
analysering. I dette tilfellet befinner M-komponenten seg i !-2 regionen.
M-komponenten vil etter kvantitering bli svart ut som ” M-komponent påvist.
Klassifiseres som IgG Kappa. Kvantitering: 2,7 g/L”.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
31
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
5.7 Pasient 10508
Denne pasienten har ingen tidligere historikk som vi kan sammenligne med, dermed
viser det første diagrammet kun vårt resultat. M-komponenten befinner seg i både i !-2
og "-regionen og derfor har vi tatt med begge toppene ved kvantitering. Denne Mkomponenten er vanskelig å sette klare grenser på og dermed vil den bli litt overestimert
hvis man ser på resultatet fra immunotypingen (se vedlegg). Hvis man derimot
kvantiterer toppene hver for seg vil M-komponenten bli veldig underestimert og derfor
vil dette være ukorrekt måte å kvantitere på.
Ut fra kvantiteringen vil M-komponenten bli svart ut som ” M-komponent påvist.
Klassifiseres som IgM Lambda. Kvantitering: 20,7 g/L. M-komponentens plassering i
elektroforesediagrammet gjør at kvantiteringen er beheftet med noe usikkerhet. Dette
kan føre til overestimering”.
5.8 Pasient 10513
For pasientnummer 10513 ser man en betydelig økning av M-komponent fra
analysering utført i april 2009 fram til januar 2010. Fra januar til vår analysering i mai
2010 har M-komponenten hatt en nedgang. Behandlingen har da hatt positiv effekt. Ut
fra immunotypingen, ser vi tydelig hvor man kan sette grenser ved kvantitering. For
denne pasienten befinner M-komponenten seg i !-2 regionen. Kvantiteringen av Mkomponenten vil svares ut som ” M-komponent påvist. Klassifiseres som IgA lambda.
Kvantitering: 5,9 g/L”.
I dag har avdelingen ingen tidligere resultat i mengde g/L fra kvantitering av Mkomponent å sammenligne med, det kan kun gjøres visuelt ved å sammenligne
elektroforesediagrammer. Når analysen er blitt ordentlig innført og blitt en del av
rutinen, vil man etter hvert kunne gå tilbake på tidligere resultat for å få et kvantitativt
svar på hvor mye M-komponenten har endret seg.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
32
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
5.9 Standardkommentarer
Det er blitt utarbeidet standardkommentarer for utgivelse av svar. Veldig små topper
kan være vanskelig å kvantitere. Dersom for eksempel kvantiteringen viser et resultat på
<0,3 g/L vil svaret gis ut som ”M-komponent påvist. Klassifiseres som IgM Kappa.
Kvantitering <0,3 g/L. M-komponenten er for liten til å kvantiteres nøyaktig”. Disse
standardkommentarene er fortsatt under utarbeiding, slik at det kan forekomme
endringer etter hvert. Blant annet diskuteres det om det skal kommenteres en eventuell
nedgang eller økning siden forrige analysering.
5.10 Nytteverdi
Ut fra kurvene under resultater kan vi se nytteverdien av å bruke denne metoden.
Tidligere har legen bare fått kommentarer om at en M-komponent er påvist, ikke hvor
stor M-komponenten er eller om det er noen endring siden sist. M-komponenten har
også tidligere blitt beskrevet som sterk eller svak. Ved kvantitering får legen ut svaret i
g/l, man kan da se om det er endring i mengde. Tidligere har legen fått samme svar
uansett hvor stor komponenten er, selv om laboratoriepersonell kan se at det har skjedd
en endring siden forrige analyse. Til nå har klinikerne benyttet seg av andre parametre
for å se prognose og effekt av behandling.
Kvantitering av M-komponent gjør det mulig å:
-
bedre oppfølging av pasienter
-
følge sykdomsutvikling; se endringer/tilbakefall tidligere enn før.
-
se hvordan pasienter responderer på behandling
-
gi en diagnose
-
delta i studier for utprøving av nye medisiner
5.11 Grensesetting
I vår oppgave tok vi utgangspunkt i de definerte reglene for grensesetting som var satt i
en tidligere studentoppgave (1) og ved et samarbeid mellom UNN og Rikshospitalet.
Ved hjelp av resultater fra deres studie satte vi, i fellesskap, grenser ved kvantitering.
Ved god nok opplæring i grensesetting vil det ikke utgjøre stor forskjell i kvantitering
fra bioingeniør til bioingeniør.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
33
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
M-komponent er det patologiske området. Total Immunglobulin er både det patologiske
området og de normale immunglobulinene. Derfor er det viktig å kunne skille mellom
disse når man skal kvantitere.
I programmet til Capillarys 2 settes det kun rette linjer ved kvantitering, noe som kan
føre til under/overestimering av M-komponenten. Dermed er grensesetting en
vurderingssak i mange tilfeller siden toppene varierer.
5.12 Identifisering av immunglobuliner
Tidligere har klinikerne kun forholdt seg til tallverdier fra kvantitering av
immunglobuliner, i stedet for mengde M-komponent. Ut fra verdiene til kvantitert
immunglobulin (tabell 1), kan det se ut som at pasientnummer 10496 og 10500 har
omtrent lik størrelse. Ser man da på kvantitert M-komponent, er forskjellen mye større
enn antatt. Pasientnummer 10496 ble kvantitert til 11.0 g/L, mens pasientnummer
10500 ble 1,6 g/L.
5.13 Videreutvikling
Figur 29: Dataprogrammet til Capillarys 2.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
34
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
Slik som dataprogrammet er per i dag, vil man få informasjon om alle prøver som det er
rekvirert totalprotein på. Det er ønskelig og kun få inn prøver på arbeidslisten, hvor det
er rekvirert totalprotein og kvantitering av M-komponent. Dette skal avdelingen jobbe
videre med. I tillegg skal det jobbes med å få lagt inn analysene totalprotein og
kvantitering av M-komponent i DIPS som en ”pakke”. Målet med dette er at begge skal
rekvireres når kvantitering av M-komponent bestilles. I tillegg skal fagområdet gå til
anskaffelse av barkodeleser, slik at prøvene kan scannes direkte inn i arbeidslisten på
Capillarys 2.
I dag kvantiteres M-komponent etter vurdering av en bioingeniør og resultater
diskuteres i samråd med lege. Avgrensing av M-komponent er en vurdering som gjøres
av bioingeniøren som analyserer prøvene. Det kan være en idé at dette dobblesjekkes av
en annen bioingeniør på fagområdet for å sikre riktig kvantitering.
Vi foreslår også at eksemplene som er beskrevet i studiet vårt brukes som veiledning
når metoden tas i bruk i rutinen.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
35
Etablering av metode for kvantitering av M-komponent ved kapillærelektroforese
.
6.0 Konklusjon
Når vi satte grenser ved kvantitering, tok vi utgangspunkt i de definerte reglene for
grensesetting fra en tidligere studie (1) og et samarbeid gjort mellom UNN og
Rikshospitalet. Siden kvantitering av M-komponent er validert tidligere, satte vi grenser
i fellesskap. Ved god nok opplæring i dette, vil det ikke utgjøre noen stor forskjell
uansett hvem som utfører kvantiteringen.
Når analysen etter hvert er blitt en del av rutinen, vil man kunne vurdere tidligere
resultater med siste analysering for å få et kvantitativt svar på hvor mye Mkomponenten har endret seg.
Før har legen kun fått et kvalitativt svar på M-komponent, og benyttet andre parametre
for å vurdere prognose og effekt av behandling. Ved å få et kvantitativt svar vil det bli
lettere å se om M-komponenten har endret seg siden forrige analysering. Dette vil også
gjøre det lettere å sette en diagnose og følge sykdomsforløpet til pasienten. Dermed har
dette stor klinisk nytteverdi.
Metoden er nå automatisert og etablert slik at den kan tas i bruk i rutinen ved UNN.
Kandidatnr 127241, 128505 og 128506
36
Litteraturhenvisninger
1. Kvantitering av M-komponent. Bacheloroppgave
http://www.bioingenior.org/bachelor_report/2008/AAC.pdf. (24.05.10)
2. Immunglobulin. Store Norske Leksikon
http://www.snl.no/.sml_artikkel/immunglobulin (24.05.10)
3. M-komponent. Lægehåndbogen.
http://www.laegehaandbogen.dk/default.aspx?document=1092 (24.05.10)
4. M-komponent. Clinical Chemistry.
http://www.clinchem.org/cgi/content/abstract/46/8/1230 (24.05.10)
5. Myelomatose. Norsk Helseinformatikk.
http://nhi.no/sykdommer/blod/beinmargssykdommer/myelomatose-1082.html
(24.05.10)
6. Myelomatose, diagnostik og behandling. Nordisk referenceprogram.
http://www.nordicmyeloma.org/content/no/pdf/referenceprogrammer/referenceprogram_2001.pdf
(24.05.10)
7. Gjersengen, T.I. Kapillærelektroforese - brukt som rutineanalyse av
serumproteiner. Bioingeniøren 2006: 8:6-9.
8. Capillarys 2, ref: 1222, Instruction Manual. Release 5xx. 2006/05
9. Capillarys protein(e) 6. Ref: 2003.Sebia 2009/04
10. Kapillær elektroforese – utførelse. Universitetssykehuset Nord-Norge.
Laboratoriemedisin, fagområde immunologi. Tromsø 2010.
11. Capillary electrophoresis. Absolute Astronomy.
http://www.absoluteastronomy.com/topics/Capillary_electrophoresis. (24.05.10)
12. Normal Serum protein electrophoresis. MEDgle.
http://www.medgle.nl/rw/procedures/Serumeiwit%20elektroforese (24.05.10)
13. Capillarys 2. Sebia electrophoresis
http://www.sebia-usa.com/products/capillarys.html. (24.05.10)
14. Immunglobuliner. Immunosensors
http://www.karstenfaehnrich.de/Immunosensors/immunosensors.htm (24.05.10)
15. MGUS. UpToDate.com.
http://uptodateonline.com/online/content/topic.do?topicKey=plasma/4412&selec
tedTitle=1%7E30&source=search_result (24.05.10)
16. B-celle. Store Norske Leksikon. http://www.snl.no/.sml_artikkel/lymfocytt
(02.06.10)
17. B-celler. Web-Books. http://www.webbooks.com/eLibrary/Medicine/Physiology/Immune/B_Cells.htm (02.06.10)
18. Capillarys Immunotyping. Ref: 2003.Sebia 2009/04
Vedlegg
Immunotyping utført på tidligere prøve fra pasient 10487. Immunotyping identifiserte
M-komponenten til en IgG Kappa og en svak IgM Kappa.
Immunotyping utført på tidligere prøve fra pasient 10508. M-komponenten er
identifisert som en IgM Lambda.
Immunotyping utført på tidligere prøve fra pasient 10513. Immunotypingen identifiserte
M-komponenten som en IgA Lambda.
Resterende resultater
Pasientnummer 10486 sammenlignet med et tidligere resultat fra april 2010, hvor den
mest markerte toppen representerer resultatet fra vår analysering.
M-komponent kvantitert til 39,8 g/L.
Pasientnummer 10486. M-komponenten er identifisert som en IgA Lambda.
Vår analysering sammenlignet med et resultat fra april 2010.
M-komponent kvantitert til 3,8 g/L.
Pasientnummer 10488. M-komponenten er identifisert til en IgG Kappa.
Pasientnummer 10489 sammenlignet med en analysering fra oktober 2009.
M-komponenten kvantitert til 8,9 g/L.
Immunotypingen identifiserte M-komponenten som en IgM Lambda.
Pasientnr 10490 sammenlignet med en analysering gjort januar 2010.
M-komponenten kvantitert til 0,9 g/L.
Pasientnr 10493 sammenlignet med en analysering gjort i februar 2008.
M-komponenten kvantitert til 15,7 g/L.
Pasientnr 10495 sammenlignet med en analysering gjort i januar 2008.
M-komponenten kvantitert til 1,6 g/L.
M-komponenten kvantitert til 2,6 g/L.
Pasientnr 10498 sammenlignet med en analysering gjort i februar 2008.
M-komponenten kvantitert til 7,2 g/L.
M-komponenten kvantitert til 8,0 g/L.
Pasientnr 10502 sammenlignet med en analysering fra februar 2010.
M-komponenten kvantitert til 4,5 g/L.
M-komponenten kvantitert til 29,3 g/L.
Pasientnummer 10503. M-komponenten er identifisert som en IgA Lambda.
M-komponenten kvantitert til 5,8 g/L.
Pasientnr 10506 sammenlignet med en analysering gjort oktober 2009.
M-komponenten kvantitert til 8,4 g/L.
Vår analysering av pasientnr 10509 sammenlignet med en analysering gjort april 2009.
M-komponenten kvantitert til 7,3 g/L.
Vår analysering av pasientnr 10509 sammenlignet med en analysering gjort august
2009.
M-komponenten kvantitert til 1,7 g/L.
M-komponenten kvantitert til 2,8 g/L.