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Aus der Medizinischen Klinik IV/4 für Nephrologie der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. Kai-Uwe Eckardt
Gentherapie durch systemische Thrombospondin-2 Überexpression im chronischen
mesangioproliferativen Glomerulonephritis Modell der Ratte
Inaugural-Dissertation
Zur Erlangung der Doktorwürde
an der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von Marlene Haslbeck
aus Nürnberg
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h. c. Jürgen Schüttler
Referent:
Priv.-Doz . Dr. Christoph Daniel
Korreferent:
Prof. Dr. Kerstin Amann
Tag der mündlichen Prüfung:
06. Juni 2012
Gentherapie durch systemische Thrombospondin-2 Überexpression im chronischen
mesangioproliferativen Glomerulonephritis Modell der Ratte
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
S. 1
Summary
S. 4
Einleitung
S. 6
Material und Methoden
S. 15
Ergebnisse
S. 25
Diskussion
S. 43
Bibliographie
S. 49
Abkürzungsverzeichnis
S. 60
Danksagung
S. 61
Lebenslauf
S. 62
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1. Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Bereits 10 % der westlichen Bevölkerung leiden an einer chronischen Nierenerkrankung,
deren Ätiologie von postinfektiös, autoimmun bis chronisch degenerativ im Rahmen eines
Diabetes mellitus oder einer arteriellen Hypertonie reicht. In jedem Fall führt die
Erkrankung zu progredienter Fibrosierung und damit fortschreitendem Verlust der
Nierenfunktion. Die klassisch medikamentösen Behandlungsregime führen im besten Fall
zu einer verlangsamten Progression der Erkrankung, und oft kann das Endstadium der
dialysepflichtigen Niereninsuffizienz nicht verhindert werden. Hieraus ergibt sich die
Notwendigkeit des speziell antifibrotischen Therapieansatzes, etwa im Rahmen einer
Gentherapie. Den wichtigsten profibrotischen Wachstumsfaktor stellt das extrazelluläre
Zytokin Transforming Growth Factor β (TGF-β) dar, welches in der Niere vor allem durch
Thrombospondin-1 (TSP-1) aktiviert wird.
TSP-1 wird im adulten Gewebe nur im
Bedarfsfall bei Verletzung und Inflammation im Rahmen der Wundheilung exprimiert.
Thrombospondin-2 (TSP-2) kann ebenso wie TSP-1 an den latenten TGF-β-Komplex
binden, ihn jedoch nicht aktivieren, und ist so in der Lage, die TSP-1 vermittelte TGF-βAktivierung kompetitiv zu inhibieren. Im mesangioproliferativen Glomerulonephritismodell in der Ratte konnte bereits gezeigt werden, dass bei einer akuten Glomerulonephritis
eine Überexpression von TSP-2 im Rahmen einer Gentherapie zu einer Reduktion der
Aktivierung von TGF-β und damit zu einer Verminderung der Fibrosierung führt.
Zielsetzung dieser Arbeit ist es, die antifibrotische Wirkung einer TSP-2 Überexpression
auch im chronischen Modell der Glomerulonephritis zu überprüfen.
Material und Methoden
Ratten erhielten sieben Tage nach Uninephrektomie der rechten Niere eine hohe Dosis antiThy-1 Antikörperlösung i.v. zur Induktion einer chronischen Glomerulonephritis.
20 Wochen nach der Nephritisinduktion wurden randomisiert zwei Gruppen unterteilt.
Gruppe A bekam eine Gentherapie mit TSP-2, während Gruppe B ein Kontrollplasmid
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erhielt. Die Expressionsplasmide wurden dazu in den Oberschenkelmuskel injiziert und
mittels Elektroporation transfiziert. Nach Versuchsende wurden die verbliebenen linken
Nieren entnommen, prozessiert und Paraffinschnitte angefertigt. Immunhistochemisch
wurden Färbungen nach der Avidin-Biotin-Methode mit 17 verschiedenen Primärantikörpern durchgeführt, um unter anderem Fibrose, Inflammation und Proliferation
untersuchen zu können. Desweiteren entstanden drei Immunfluoreszenzfärbungen und eine
PAS-Färbung nach Gridley. In der histologischen Auswertung wurden für jede Biopsie
40 bis 60 kortikale glomeruläre Anschnitte oder mindestens 20 tubulointerstitielle Gesichtsfelder evaluiert. Ausgewertet wurde durch Auszählen der positiv gefärbten Zellen, mit Hilfe
verschiedener
Score-Systeme
Bestimmung
der
und
Nierenfunktion
eines
Imagequantifizierungsprogrammes.
wurden
die
Proteinurie,
Kreatinin-
Zur
und
Harnstoffkonzentrationen in Serum und Urin regelmäßig bestimmt. In der statistischen
Analyse wurden Durchschnittswerte mit Standardabweichung angegeben. Statistische
Signifikanz wurde anhand des Student`s t-tests bestimmt.
Ergebnisse
Die Untersuchung der Proteinurie im Verlauf der Glomerulonephritis zeigte, dass nach
Therapiestart trotz identischer Behandlung der Versuchstiere ein sehr heterogener Grad an
Nierenschädigung
erzielt
wurde.
Deshalb
wurden
sowohl
Kontroll-
als
auch
Therapiegruppe noch einmal in jeweils eine Gruppe mit leichter und starker Proteinurie
unterteilt. Nach dem Therapiestart verschlechterte sich die Proteinurie in den mit
Kontrollplasmid behandelten Tieren nicht, dagegen war in den TSP-2 behandelten Tieren
eine Progression zu beobachten. Zur Korrelation der funktionellen Daten mit den
Veränderungen im Parenchym wurden nach Versuchsende die entnommenen Nieren der
Ratten histologisch ausgewertet. Wie erwartet führte die TSP-2 Therapie zwar zu einer
leicht verminderten TGF-β Aktivierung, steigerte aber entgegen der Hypothese die
Glomerulosklerose. Eine vermehrte Podozytenschädigung bei Progression der Glomerulonephritis und die Fibrosierung der Niere zeigte sich unbeeinflusst von einer TSP-2
Therapie. Die TSP-2 Therapie veränderte weder die renale Kapillarisierung noch die
Expression von TSP-1 bei schwerer glomerulärer Schädigung. Unerwarteterweise führte die
TSP-2 Therapie zu einer verstärkten Inflammation.
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Schlussfolgerungen
Im Gegensatz zu der Studie am akuten Modell der Glomerulonephritis, welche deutliche
und sehr positive Effekte der TSP-2 Therapie nachwies, konnten nach spätem Therapiestart
im
chronischen
Glomerulonephritismodell
keine
positiven
Effekte
auf
den
Krankheitsverlauf beobachtet werden. TSP-2 Gentherapie konnte die Progression einer
etablierten Glomerulonephritis weder aufhalten noch verlangsamen.
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2. Summary
Background
Already ten percent of the population in the western world suffer on chronic kidney
diseases, with an etiology ranging from post-infectious, autoimmune to chronic
degenerative in the context of diabetes mellitus or hypertension. Generally chronic disease
results in progressive fibrosis and subsequent loss of renal function. The current medical
treatment leads at best to decelerated progression of the renal disease, but the end-stage
renal disease often cannot be prevented. There is the need for a specific antifibrotic
treatment. In kidney disease, the most important profibrotic cytokine is Transforming
Growth Factor β (TGF-β), which is mainly activated by Thrombospondin-1 (TSP-1). TSP-1
is only expressed in response to injury and inflammation during wound healing.
Thrombospondin-2 (TSP-2) is also able to bind the latent TGF-β complex, but lacks the
ability to activate. Therefore TSP-2 is able to inhibit TSP-1 mediated TGF-β activation. In a
rat model for mesangial proliferative glomerulonephritis it was shown, that systemic
overexpression of TSP-2 resulted in reduced TGF-β activity and fibrosis. In this study
overexpression of TSP-2 was tested as an antifibrotic therapy in a chronic kidney disease
model.
Material and methods
Chronic glomerulonephritis was induced by injection of a high dose anti-Thy-1 antibody
seven days after uninephrectomy of the right kidney. Twenty weeks after nephritis induction
the animals were randomized divided into two groups. Group A received gene therapy
using TSP-2 overxpressing plasmid and group B recieved a control plasmide transfected by
muscle electroporation. At the end of the study the remaining left kidneys were removed,
processed, embedded in paraffin and cut into 4µm slices. Kidney sections were analyzed by
immunhistology using the avidin-biotine method and 17 different primary antibodies.
Immune fluorescence and PAS staining after Gridley were also performed. For histological
analysis 40 to 60 glomerular sections or at least 20 tubulointerstitial fields of view were
evaluated in every biopsy. The evaluation included counting of positive stained cells,
scoring of positive stained area and computer-assisted image quantification. Kidney
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function was periodically analyzed by evaluation of proteinuria, serum creatinine and serum
urea during the study. Results were presented using mean and standard deviation.
Statistically significance was tested by student`s t-test.
Results
Proteinuria was analyzed for several times after treatment in rats with chronic
glomerulonephritis showing a high variability. Therefore both therapy groups were divided
in a subgroup of lower and a subgroup of higher proteinuria. After therapy start proteinuria
remains on the same level in groups treated with control plasmid. In contrast, proteinuria
further progressed in nephritic rats treated with the TSP-2 plasmid. Functional data were
correlated with histologic changes in kidney biopsies analyzed at the end of the study. As
expected, treatment with TSP-2 slightly reduced TGF-β activation. However, glomerular
sclerosis was significantly increased in this group. Neither podozyte damage nor TSP-1
expression and renal fibrosis were not affected by the treatment. Surprisingly TSP-2
therapy also did not change capillary growth but augmented inflammation. So it could be
proved, that the performed gene therapy cannot neither stop nor decelerate the progression
of an established glomerulonephritis.
Conclusion
In contrast to early TSP-2 treatment in the acute glomerulonephritis model, systemic TSP-2
gene therapy starting after chronic glomerulonephritis has established, failed to ameliorate
glomerulonephritis.
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Einleitung
Die Prävalenz chronischer Nierenerkrankungen nimmt stetig zu und aktuellen Berichten zu
Folge sind bereits 10% der westlichen Bevölkerung betroffen. Ursächlich für das häufige
Auftreten sind steigendes Lebensalter und Nierenschädigungen, die durch Diabetes,
Adipositas und arterielle Hypertonie entstehen (Coresh, Astor et al. 2003). Unabhängig von
der Genese schreitet die Erkrankung auf ähnliche Weise fort. Ein wichtiges
Charakteristikum stellt die progrediente Fibrosierung dar, welche sich histologisch in zwei
Kompartimenten
der
Niere
manifestiert.
So
laufen
Glomerulosklerose
und
tubulointerstitielle Fibrosierung zeitgleich ab. Maßgeblich für den Verlauf innerhalb der
Glomeruli ist die Zerstörung und der Verlust von Podozyten und Mesangiumzellen (Kriz,
Gretz et al. 1998). Die Schlüsselrolle im Interstitium spielen dagegen aktivierte
Fibroblasten
und
Myofibroblasten,
welche
vermehrt
proliferieren
und
durch
Proteinsynthese die extrazelluläre Matrix verdichten (Rodemann and Muller 1991). Folge
ist eine langsamer, doch stetig fortschreitender Verlust der Nierenfunktion, der meist über
einen großen Zeitraum hinweg symptomfrei verläuft (Khwaja, El Kossi et al. 2007).
Ursachen dieser Nierenfunktionsstörungen sind vielfältig. Grob unterteilen lässt sich das
Feld in entzündliche und primär nicht-entzündliche Erkrankungen. Entzündliche Prozesse
sind unter anderem bedingt durch Mikroorganismen oder Autoimmunphänomene, wie das
bei Lupus erythematodes, Morbus Wegener oder postinfektiös der Fall sein kann. Die
primär nicht-entzündlichen Erkrankungen wie arterielle Hypertonie und Diabetes mellitus
verursachen ebenfalls renale Schädigungen, die im Anfangsstadium meist unbemerkt
bleiben.
Betrachtet man jedoch die Entwicklung der Nierenschädigung im zeitlichen Verlauf, so
wird man feststellen, dass diese, ganz gleich welcher Genese, auf ähnlich charakteristische
Weise fortschreitet (Klahr, Schreiner et al. 1988; Border and Noble 1994).
So wandern in das Gebiet der Schädigung Leukozyten, wie Lymphozyten, Granulozyten
und Makrophagen ein. Auch Thrombozyten infiltrieren das Gewebe. Es kommt zur
vermehrten Expression von Wachstumsfaktoren und profibrotischen Zytokinen, unter
anderem auch von Transforming growth factor β (TGF-β), so dass Zellen hyperplasieren
und proliferieren. Mehr und mehr extrazelluläre Matrix lagert sich in den feinen Strukturen
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ab, funktionelles Gewebe wird durch Fibroblasten ersetzt und verschlechtert so die
Stoffwechselleistung. Die Fibrose schreitet voran und bildet so die gemeinsame Endstrecke
jedweder Nierenschädigung (Border and Noble 1994).
Therapie chronischer Nierenerkrankungen
Eine speziell antifibrotische Therapie chronischer Nierenerkrankungen ist zurzeit noch
nicht verfügbar, sodass die aktuellen Behandlungsstrategien begrenzt sind und sich auf eine
adäquate
Einstellung des Blutzuckerspiegels und die Blutdruckregulation erstrecken.
Medikamentös stützt sich die Hypertonietherapie vor allem auf Inhibitoren des ReninAngiotensin-Aldosteron-Systems, wie ACE-Hemmer und AT1-Antagonisten. Diese zeigten
in Bezug auf die Nierenschädigung die größten Erfolge (Remuzzi, Perico et al. 2005).
Unabhängig von der Blutdruckregulation wirken diese nephroprotektiv, da sie
Angiotensin II inhibieren, und dadurch auch dessen agonistische Wirkung auf TGF-β
(Mezzano, Ruiz-Ortega et al. 2001). Doch bergen diese klassischen Behandlungsstrategien
chronischer Nierenerkrankungen noch deutlich Potential zur Weiterentwicklung in sich, da
in vielen Fällen das Fortschreiten der Erkrankung nur verlangsamt und nicht verhindert
werden kann. Da eine effiziente antifibrotische Therapie zurzeit, wie erwähnt, noch nicht
vorhanden ist, kommt es somit bei bis zu 50% der Patienten mit mesangioproliferativer
Glomerulonephritis zur terminalen Niereninsuffizienz (Coppo et al. J. Nephrol 2005).
Definiert ist diese als eine Verminderung der Nierenleistung auf 15% und weniger, was
einer glomerulären Filtrationsrate von unter 15ml/min/1,73m2 entspricht (Renz-Polster,
Krautzig; Basislehrbuch Innere Medizin, 2008). Die Maßnahmen, die in diesem Stadium
ergriffen werden, nämlich eine Nierenersatztherapie, sind aufwendig, teuer und vermindern
die Lebensqualität des Patienten gewaltig.
Es handelt sich hierbei um die Therapie mittels Dialyse oder gar um eine
Nierentransplantation.
Die Dialyse bedeutet für den Patienten eine massive Einschränkung seiner bisherigen
Lebensgewohnheiten, da er bei hochgradiger Niereninsuffizienz alle zwei bis drei Tage die
mehrstündige Prozedur über sich ergehen lassen muss. Auch ist die täglich aufzunehmende
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Flüssigkeitsmenge genau festgelegt und bei der Auswahl der Nahrungsmittel gibt es strikte
Vorschriften, um ein Entgleisen des Elektrolythaushaltes zu vermeiden.
Eine Nierentransplantation ist nicht weniger konfliktbehaftet. Eine passende Spenderniere
zu finden, ist dabei nur der erste Schritt. Nach erfolgreicher Transplantation ist trotz aller
Vorkehrungen und Medikamente eine Abstoßung möglich. Diese ist lebensbedrohlich und
erfordert ein unverzügliches Eingreifen. Stößt der Körper das fremde Organ zunächst nicht
ab, so muss der Patient jedoch zur Vermeidung dieser Situation lebenslang
immunsuppressive Medikamente einnehmen. Diese haben viele Nebenwirkungen, die sich
von
harmlos
unangenehmen
Begleiterscheinungen,
wie
Haarausfall
oder
Gingivahyperplasie bis zu der Entstehung eines malignen Tumors erstrecken können.
Zudem entwickelt sich vielfach eine chronische Transplantatnephropathie, die wiederum
mit einer Fibrosierung des Organs verbunden ist.
Es liegt somit auf der Hand, dass das Maß an Behandlungsmöglichkeiten noch nicht voll
ausgeschöpft ist und Therapien wünschenswert wären, die keine Dauerbelastung des
Patienten beinhalten und die bis dato verminderte Lebensqualität des Patienten nicht noch
mehr beeinträchtigen.
Eine mögliche Strategie ist es, TGF-β als den wichtigsten Mediator der Fibroseentwicklung
direkt zu inhibieren. In Tierstudien wurden bereits mit Erfolg TGF-β Antikörper (Han,
Hoffman et al. 2000; Isaka, Tsujie et al. 2000), lösliche TGF-β Rezeptoren des Typs II
(Isaka, Akagi et al. 1999) und des Typs III (Vilchis-Landeros, Montiel et al. 2001), der
natürlich vorkommende TGF-β Inhibitor Decorin (Border, Noble et al. 1992; Isaka, Brees et
al. 1996), das TGF-β latency-associated-protein (LAP) (Bottinger, Factor et al. 1996), das
inhibierend wirkende Signalmolekül SMAD 7 (Kanamaru, Nakao et al. 2001) und die
Inhibierung der TGF-β Aktivierung (Yevdokimova, Wahab et al. 2001) untersucht. Unter
all diesen therapeutischen Möglichkeiten ist die Behandlung mit einem TGF-β Antikörper
die am besten geprüfte. Doch als alleinige Therapie scheint diese eine Fibrosierung nur
verlangsamen zu können. Es stellt sich hier die Frage, ob beispielsweise eine
Kombinationsbehandlung aus einem ACE-Hemmer bzw. einem AT1-Antagonisten mit
einem TGF-β Antikörper die progrediente renale Fibrosierung sogar stoppen könnte, da
somit an unterschiedlichen Stellen der Fibroseentstehung gleichzeitig eingegriffen würde
(Yu, Noble et al. 2002).
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Als Ausblick auf die Zukunft lässt sich an dieser Stelle desweiteren auf den
Therapieversuch mit Rapamycin in experimentellen Studien verweisen. Rapamycin ist ein
Immunsuppressivum, das durch mTor-Inhibition die T-Zellaktivierung hemmt. Es konnte
gezeigt werden, dass Rapamycin die Glomerulosklerose, tubuläre Atrophie, interstitielle
Fibrose und Inflammation im Nierenmassenreduktionsmodell und in der diabetischen
Nephropathie reduzieren konnte (Diekmann, Gutierrez-Dalmau et al. 2007).
Als weiteren Ansatz der antifibrotischen Therapie ist die Überexpression anti-fibrotisch
wirkender Gene zu nennen. Bei dieser inzwischen nicht mehr rein experimentellen
Behandlungsoption werden mit Hilfe eines Elektroporators, der ein elektrisches Feld
erzeugt,
die
Zellmembranen
permeabel
gemacht
und
auf
diesem
Weg
ein
Überexpressionsplasmid in die Zellen eingebracht.
Auf diesem Weg war es z.B. möglich, eine systemische Thrombospondin-2 Überexpression
zu erzielen, die im Tiermodell der akuten mesangioproliferativen Glomerulonephritis die
fortschreitende Zellproliferation, die Entzündung, TGF-β Aktivierung und Fibrose hemmen
konnte (Daniel, Wagner et al. 2009).
Der Einfluss von TGF-β
Der Transforming Growth Factor β ist ein extrazelluläres multifunktionelles Zytokin mit
Signalmolekülfunktion (Massague 1998). Er spielt eine wichtige Rolle in der embryonalen
Entwicklung und bei der Zelldifferenzierung, ist aber auch ein Wachstumsfaktor, der
profibrotisch, d.h. zu einer Akkumulation extrazellulärer Matrix und fortschreitenden
Fibrosierung im Rahmen chronischer Nierenerkrankungen führt (Sharma and Ziyadeh
1994).
TGF-β gehört zu einer Superfamilie von mehr als 30 Mitgliedern, deren Aufgaben
unterschiedlich sind. Nicht in jeder Situation bewirkt TGF-β eine Wachstumsstimulation
und fördert beispielsweise die Wundheilung oder die Differenzierung von Blutzellen
(Massague 1998); Es kann auch, zum Teil durch Aktivierung anderer Zytokine,
wachstumshemmend und immunsuppressiv wirken (Padgett, St Johnston et al. 1987).
Sezerniert wird TGF-β als inaktiver Prozytokin-Komplex, bestehend aus dem eigentlichen
TGF-β-Protein, welches nicht kovalent an das latency-associated-protein (LAP) und auf
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verschiedene Arten an das latente TGF-β-Bindungsprotein gebunden ist (Bitzer, Sterzel et
al. 1998).
Bevor TGF-ß seine Wirkung durch Bindung an seinen Rezeptor entfalten kann, muss auf
extrazellulärer Ebene der Prozytokin-Komplex aktiviert werden. TGF-β kann durch
unterschiedliche Faktoren/Mechanismen wie pH-Veränderungen, γ-Bestrahlung, reaktive
O2-Spezies, Plasmin, Calpain und Cathepsin aktiviert werden (Lawrence 1996; Ribeiro,
Poczatek et al. 1999). In der Niere ist Thrombospondin-1 ein wichtiger Aktivator (Hugo
and Daniel 2009).
Von den drei TGF-ß-Rezeptortypen bilden die Rezeptoren des Typs I und II die
Untereinheiten des eigentlichen TGF-β-Rezeptors. Als Transmembranproteine werden sie
durch Ligandenbindung zum Rezeptor. TGF-β-Rezeptor III reguliert lediglich die
Zugänglichkeit des Rezeptors (Massague, Cheifetz et al. 1990).
Zur Signaltransduktion erfolgt nach der Phosphorylierung von SMAD 2 oder SMAD 3 eine
Dimerisierung des phosphorylierten SMAD mit SMAD 4. Dieses Dimer transloziert in den
Zellkern, wirkt dort als Transkriptionsfaktor und induziert unter anderem profibrotische
Zielgene (Heldin, Miyazono et al. 1997).
Über diesen Signalweg kommt es bei chronischen Nierenerkrankungen zu einer vermehrten
Ablagerung extrazellulärer Matrix, die eine Fibrosierung bewirkt.
Es scheint plausibel, dass eine Suppression von TGF-β im Fall der Nierenfibrose einen
positiven Effekt hat. Eine Studie zeigt jedoch, dass TGF-β knock-out Mäuse wenige
Wochen nach der Geburt an einer schweren generalisierten Entzündungsreaktion
versterben. Eine komplette Suppression sollte demnach nicht das therapeutische Ziel sein.
Entscheidend ist eine genaue Regulierung und eine spezifische Kontrolle lokaler
Überproduktion von TGF-β (Bitzer, Sterzel et al. 1998).
Thrombospondine
Thrombospondine
(TSPs)
bilden
eine
Familie
multifunktionaler
extrazellulärer
Glykoproteine, welche durch Hormone und Zytokine reguliert werden. Sie sind vermehrt
exprimiert in der Embryogenese, vor allem in dem sich entwickelnden Herzen, der Niere,
der Muskulatur, den Knochen und dem heranreifenden Gehirn. Im gesunden adulten
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Gewebe sind TSPs wesentlich geringer exprimiert und werden nur in Situationen der
Verletzung und Inflammation im Rahmen der Wundheilung vermehrt sezerniert (Bornstein
2001).
Die
Thrombospondin-Familie
besteht
aus
fünf
Mitgliedern.
Bei
den
beiden
Thrombospondinen der Untergruppe A, TSP-1 und TSP-2, handelt es sich um
Homotrimere, während die Thrombospondine 3 bis 5 dagegen Homopentamere sind. In der
Niere wurde bislang nur für die Thrombospondine 1 und 2 eine pathophysiologische Rolle
untersucht (Hugo and Daniel 2009).
Thrombospondin-1
Thrombospondin-1, ein 420 kDA großes, in verschiedenen Erkrankungsmodellen
hochreguliertes Glykoprotein ist an vielen unterschiedlichen biologischen Prozessen, wie
der Blutgerinnung, der Angiogenese, der Apoptose und der Immunregulation beteiligt.
Exprimiert
wird
TSP-1
in
einer
Vielzahl
von
Zellarten
wie
Thrombozyten,
Gefäßmuskelzellen und Zellen des Nierengewebes wie Mesangiumzellen, Podozyten,
Endothelzellen und Zellen des Tubulointerstitiums (Bornstein 2001). Im gesunden
Nierenkortex kommt es kaum vor, wird aber im Fall einer Glomerulonephritis
hochreguliert. Es befindet sich dann vor allem am Ort der Inflammation und
Gewebsverletzung und wird dort durch verschiedene renale Zellen und Entzündungszellen
exprimiert (Bornstein 2001). Es gilt auch als wichtiger Aktivator von TGF-β. Mit seiner
RFK-Sequenz kann TSP-1 an das „latency associated protein“ des latenten TGF-β Komplex
und über die WSXW-Sequenz an das reife TGF-β binden (Young and Murphy-Ullrich
2004). Erst dadurch wird das profibrotische Zytokin TGF-β aktiviert und kann seine
Wirkung entfalten. Als „early response gene“ wird es durch Zytokine wie PDGF oder FGF2
aktiviert, und vor allem im Bedarfsfall exprimiert (Hugo and Daniel 2009). Ein Fehlen von
TSP-1 wirkte sich in experimentellen Tiermodellen für eine Glomerulonephritis
(Hochegger, Knight et al. 2004) und diabetischen Nephropathie (Daniel, Schaub et al.
2007) jeweils günstig auf den Krankheitsverlauf aus. TSP-1 defiziente Mäuse zeigten eine
bessere Nierenfunktion und verminderte Akkumulation von Matrix. Andererseits konnte in
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Wundheilungsstudien festgestellt werden, dass die Heilung in diesen Tieren verzögert und
die Entzündung wesentlich langsamer abklingt (Agah, Kyriakides et al. 2002).
Im renalen Ischämie/Reperfusionsmodell wirkte TSP-1 proapoptotisch, so dass auch in
diesem Modell ein Fehlen von TSP-1 zu einer verbesserten Nierenfunktion führte (Thakar,
Zahedi et al. 2005).
Die unterschiedlichen Wirkungen von TSP-1 beruhen auf der komplexen Molekülstruktur
und
deren
unterschiedlichen
Domänen.
Neben
der
aminoterminalen
Heparanbindungsregion, einer Prokollagen-ähnlichen Region mit intermolekularen
Disulfidbrücken, drei properdin-ähnlichen Typ 1 repeats, drei epidermal-growth-factorähnlichen Typ 2 repeats besitzt das Molekül eine Calcium-sensitive Typ 3 Domäne. TSP-1
kann mit verschiedenen anderen Proteinen interagieren, zum Beispiel durch die Bindung an
Rezeptoren wie CD36, αυβ3-Integrin und CD47 oder an andere Moleküle wie
Heparansulfat, Calreticulin, Lipoprotein-receptor-related protein (Punekar, Zak et al. 2008).
Thrombospondin-2
Das multifunktionale Glykoprotein Thrombospondin-2 spielt eine Rolle bei der
Zellanheftung
und
–migration,
der
Proliferation
und
der
Regulation
der
Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Bornstein 2001). In einem GBM-GlomerulonephritisModell zeigten Mäuse, denen TSP-2 fehlt, eine beschleunigte und vergrößerte
Entzündungsantwort. Gezeigt werden konnte dies an dem vermehrten Einstrom von CD4und CD8-positiven T-Zellen, sowie an der Infiltration durch Monozyten/Makrophagen.
Fibrinablagerung im Glomerulum und Matrix-Remodeling, begleitet von erhöhter MMP2Aktivität konnten ebenfalls beobachtet werden (Vogelbacher, Wittmann et al. 2007).
Es wirkt außerdem stark antiangiogenetisch und kann ebenso wie Thrombospondin-1 an
den latenten TGF-β-Komplex binden, ihn jedoch nicht aktivieren, und ist so in der Lage,
die Thrombospondin-1 vermittelte TGF-β-Aktivierung kompetitiv zu inhibieren. Gezeigt
worden ist dieser Zusammenhang bereits im Tiermodell der experimentellen akuten antiThy-1-Glomerulonephritis. Hier wurde beobachtet, dass eine Überexpresssion von TSP-2
zu einer Reduktion der Aktivierung von TGF-β und damit zu einer Verminderung der
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Akkumulation von Matrix führt. Zusätzlich wurde der Verlauf der Nephritis auch noch
durch
eine
Reduktion
der
Zellproliferation,
der
Inflammation
und
der
Mesangiumzellaktivierung nach TSP-2 Therapie begünstigt (Daniel, Wagner et al. 2009).
Anti-Thy1-Modell
Zur Entwicklung einer antifibrotischen Therapie bedarf es eines Kollektivs aus einer
Mindestanzahl nicht allzu weit fortgeschrittener und sich im selben Stadium befindlicher
Nierenerkrankungen. Eine Studie am Menschen scheint schwierig, da die Nierenerkrankung
meist spät diagnostiziert wird und die Teilnehmer dieser Studie sehr unterschiedliche
Ausgangsbedingungen hätten.
Auch aus ethischen Gesichtspunkten ist eine Therapieentwicklung, deren Ausgang
ungewiss ist, am Menschen so nicht vertretbar. Als Alternative steht das Tiermodell zur
Verfügung.
Die häufigste Glomerulonephritis in der westlichen Welt ist die mesangioproliferative IgANephritis (Border 1994).
Ein etabliertes Modell dieser Erkrankung ist die Anti-Thy1-Nephritis in der Ratte. Nach
einer Komplement-vermittelten Lyse der Mesangiumzellen, vermittelt durch Antikörper
gegen das Thy1-Antigen, kommt es zu einer Infiltration durch Entzündungszellen, gefolgt
von Reparaturmechanismen und Fibrosierung. Deshalb eignet sich dieses Modell gut, um
therapeutische Effekte auf Inflammation, Matrixakkumulation und Zellproliferation
darzustellen (Daniel, Wagner et al. 2009). Um eine chronische Erkrankung zu erzielen,
wird vor Krankheitsinduktion eine Niere entfernt und eine hohe Dosis des Antikörpers
eingesetzt.
Zielsetzung
Nachdem im akuten Glomerulonephritis-Modell der Verlauf der Erkrankung durch
Gentherapie mit TSP-2 bezüglich Fibroseentwicklung und Inflammation günstig zu
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beeinflussen war (Daniel, Wagner et al. 2009), soll in dieser Arbeit die TSP-2 Gentherapie
in einem chronischen Nierenerkrankungsmodell untersucht werden. Es soll überprüft
werden, ob die Überexpression von TSP-2 in der chronischen anti-Thy1 Nephritis die
Progredienz der Erkrankung durch seine anti-inflammatorische Wirkung und kompetitive
Hemmung der TSP-1 vermittelten Aktivierung von TGF-β verlangsamen oder stoppen
kann.
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Material und Methoden
Das Tiermodell
Für alle Versuche wurden männliche Sprague Dawley-Ratten (Charles River, Sulzfeld,
Deutschland) mit einem Gewicht zwischen 140g und 160g verwendet. Die Tiere wurden
mit Standard Rattenfutter (Altromin 1324, Spezialfutterwerke GmbH, Lage, Deutschland)
und Leitungswasser ad libidum gefüttert. Auch wurde der Tag-Nacht-Rhythmus der Tiere
der aktuellen Jahreszeit angepasst.
Vor der Induktion der experimentellen mesangioproliferativen Glomerulonephritis erfolgte
zunächst eine Uninephrektomie der rechten Niere. Sieben Tage später wurden die Tiere mit
4mg/kg Körpergewicht Anti-Thy 1 Antikörperlösung (Klon ER4G, Matthew Wright)
perfundiert.
Für die Gasnarkose wurde Isofluran verwendet. Bei Narkoseeintritt wurde die
Antikörperlösung in die Schwanzvene injiziert.
Nach Versuchsende wurde die verbliebene linke Niere entnommen, indem der Bauchraum
über einen Längsschnitt eröffnet und nach Durchtrennung der V. und A. renalis das Gewebe
vollständig entfernt wurde. Die Tiere ließ man nach zusätzlicher Eröffnung ausbluten und
beide Lungen durch einen Lungenschnitt kollabieren. Das Nierengewebe wurde mit PBS
gespült und mit Methyl Carnoy`s Lösung (MVL) und Paraformaldehyd (PAF) 3% (w/v)
fixiert.
Experimentelles Design
20 Wochen nach der Nephritisinduktion wurden die Tiere randomisiert in zwei Gruppen
aufgeteilt. Hierfür wurde als Marker für das Ausmaß der Schädigung die Proteinurie
bestimmt und eine gleichmäßige Verteilung der Versuchstiere auf die Gruppen angestrebt.
Die anschließende Gentherapie mit dem Plasmid pUb TSP-2 bekam Gruppe A, während
Gruppe B das Kontrollplasmid pUb Lux erhielt. Das Applikationsverfahren stellte in beiden
Fällen die Elektroporation dar.
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Nachdem unter Äthernarkose der Oberschenkel des Tieres rasiert worden war, wurde die
Haut sorgfältig desinfiziert und die oberste Hautschicht mit einer Schnittlänge von 1,5cm
bis 2,0cm aufgeschnitten. Die Haut wurde abgelöst und der Hinterbeinmuskel freipräpariert.
Um das Gewebe für das Plasmid permeabel zu machen, wurden zunächst 1mg
Hyaluronidase, gelöst in 100µl PBS intramuskulär injiziert. Nach zwei Stunden wurden
dann 35µg Plasmid, gelöst in 100µl PBS appliziert. Fünf Minuten später wurde eine
Elektrode auf dem Muskel positioniert, und es erfolgte eine Elektroporation à sechs Pulse
mit 100V und 50ms Pulsdauer und einem Intervall von 950ms. Anschließend wurde die
Wunde mit Einzelknopfnaht verschlossen.
Uninephrektomie
Nephritisinduktion
27w
t
Versuchsende (30w)
0d
7d
5w
9w
21w
27w
t
Start Gentherapie
Stoffwechselkäfig
Gewinnung des Urins und des Serums
Zur Gewinnung des Serums wurde Blut aus der Schwanzarterie entnommen und dann für
zwei Minuten bei 5000 rpm zentrifugiert und bei -70°C gelagert. Um den Urin zu sammeln,
wurden die Tiere einzeln in Stoffwechselkäfigen untergebracht, sodass der Urin vom Kot
getrennt aufgefangen werden konnte. Die Tiere hatten Zugang zu dem gewohnten Futter
und Wasser. Der Urin wurde ebenfalls bei -70°C gelagert.
Gewebsprozessierung und Anfertigen der Paraffinschnitte
Sofort nach der Entnahme der Biopsien wurden die Nieren mit PBS gespült und das
Nierenparenchym von der Nierenkapsel isoliert. Die Gewebe wurden in einzelne Stücke
- 17 -
unterteilt, mit Biopsienummern versehen und für 24h von jedem Tier jeweils in MethylCarnoys (MC) ( 60% (v/v) Methanol, 30% (v/v) Chloroform, 10% (v/v) Eisessig, Lagerung
bei 4°C) bei Raumtemperatur fixiert. Die Prozessierung des Gewebes erfolgte in
aufsteigender Methanolreihe (70% (v/v), 80% (v/v), 2x 96% (v/v)) für jeweils 40 Minuten
bei Raumtemperatur und verblieben über Nacht in dem III. Methanol. Alle weiteren Schritte
erfolgten im Brutschrank bei 60°C. Initial wurden die Gewebe im Methanol für eine Stunde
auf 60°C erwärmt, dann für eine Stunde in einem Methanol-Paraffin-Gemisch (1:1) und
schließlich dreimal für jeweils zwei Stunden in Paraffin inkubiert. Die Gewebe verblieben
über Nacht im letzten Paraffin und wurden am nächsten Tag mit Hilfe eines
Paraffinspenders aufgeblockt.
Die Gewebsschnitte wurden in 4µm Schichtdicke mit einem Schlittenmikrotom angefertigt.
Die Gewebeblöcke wurden mit Eis gekühlt, um optimale Schnitterfolge zu erzielen. Mit
Hilfe eines feuchten Blättchens Papier wurde der Schnitt in ein geheiztes Wasserbecken
transferiert. Durch die Wärme glättete sich das Gewebe, und das durch den Schnitt
gestauchte Gewebe gewann sein Form zurück. Anschließend wurden die Schnitte auf
Objektträger gezogen und für 30 Minuten bei 58°C im Brutschrank gebacken.
Immunhistochemie
Für alle durchgeführten Färbungen wurde zur Lokalisation von zellulären Antigenen die
Avidin-Biotin-Methode
–eine
Immunperoxidase-Färbemethode–
angewandt.
Diese
Methode basiert auf der Fähigkeit des Eiweißglykoproteins Avidin, 4 Moleküle des
Vitamins Biotin zu binden.
Für die Färbungen wurden vier Reagenzien verwendet. Ein Primärantikörper, der spezifisch
das zu bestimmende Antigen erkennt, ein Sekundärantikörper, der mit Biotin konjugiert ist
(Kreuzreaktionen beachten) und an den Primärantikörper binden kann und ein Peroxidasekonjugierter Avidin-Komplex. Das Avidinmolekül bindet mit seinen freien Stellen an das
Biotin des Sekundärantikörpers. Das Antigen wird schließlich mit Hilfe des PeroxidaseEnzyms, das ein geeignetes Chromogen umsetzt, sichtbar gemacht.
Zur Vorbereitung auf die Färbungen wurden die Gewebeschnitte in Xylol 3 x 5 Minuten
deparaffiniert und in absteigender Alkoholreihe in Ethanol 100% 3 x 3 Minuten und
- 18 -
Ethanol 95% (v/v) 2 x 2 Minuten rehydriert. Endogene Peroxidasen, die unspezifische
Hintergrundfärbungen hervorrufen können, wurden durch Inkubation für 20 Minuten in 3%
(v/v) H2O2/ Methanol geblockt. Anschließend wurden die Schnitte mit TBS gewaschen. Die
Gewebe wurden mit einem Fettstift auf dem Objektträger umfahren, um ein Verlaufen der
Antikörperlösung zu vermeiden. Die Inkubationen wurden in feuchten Kammern
durchgeführt. Alle Antikörper wurden mit 1% (v/v) BSA/TBS verdünnt. Der
Primärantikörper wurde je nach Optimierungsergebnis verdünnt auf das Gewebe
aufgetragen und bei 4°C über Nacht inkubiert. Sekundärantikörper wurden jeweils 1:500
verdünnt aufgetragen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf dem Gewebe belassen.
Die Inkubation mit der Avidin-Peroxidase (Verdünnung 1:2000) erfolgte im Anschluss
ebenfalls über 30 Minuten bei Raumtemperatur. Um ungebundenen Antikörper zu
entfernen, wurden die Schnitte zwischen den Inkubationen 3 x 3 Minuten mit TBS
gewaschen. Die Färbung mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB) wurde nach Herstelleranleitung
mit dem DAB Substrat Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) durchgeführt.
Für die Nachweise zytosolischer Antigene wurde die braune Farbreaktion ohne Nickel
angewandt. Es wurde mit Hämatoxylin III nach Gill (3 Sekunden) gegengefärbt, und die
Schnitte wurden anschließend zum Bläuen 10 Minuten unter fließendem Wasser belassen.
In aufsteigender Alkoholreihe (2 x 95% (v/v), 3 x 100% (v/v) wurden die Färbungen für
jeweils 2 Minuten dehydriert. Nach restloser Entfernung des Alkohols in Xylol 5 x 5
Minuten wurden die Schnitte mit Entellan eingedeckt.
Die folgenden Primärantikörper wurden in dieser Studie verwendet:
-
ED-1, ein muriner IgG1 monoklonaler Antikörper (mAb) gegen ein Antigen im
Zytoplasma von Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen (Linaris,
Wertheim-Bettingen, Germany)
-
α-sm-Aktin (Klon 1A4), ein muriner IgG2a mAb gegen α-glattes Muskel-Aktin
zur Identifizierung von aktiviertem MC (DAKO)
-
Ein polyklonaler Kaninchenantikörper gegen Kollagen I (Biogenesis, UK)
-
Ein polyklonaler Ziegenantikörper gegen Kollagen IV (Southern Biotechnology
Associates, Inc., Birmingham, UK)
- 19 -
-
Ein polyklonaler Kaninchen-IgG-Antikörper gegen humanes TGF-β 2 (Santa
Cruz Biotec)
-
Ein muriner IgG1 mAb gegen das „rat endothelial cell antigen“ (RECA-1), ein
spezifischer Antikörper gegen Endothelzellen RECA-1 (Serotec LTD, Oxford,
UK)
-
JG-12, ein monoklonaler Maus-IgG-Antikörper gegen Rattenendothelzellen
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. D. Kerjaschki)
-
P-Smad
2/3,
ein
polyklonaler
Kaninchen-IgG-Antikörper
gegen
die
phosphorylierte Form von Smad 2/3- Proteinen (Santa Cruz Biotec)
-
Ein muriner IgG1 mAb gegen Thrombospondin-1 (Klon A 6.1, Dunn
Labortechnik GmbH, Asbach, Germany)
-
PAI-1, ein Kaninchenantikörper gegen die an der Blutgerinnung beteiligten
Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren (Santa Cruz Biotec)
-
Ein muriner Antikörper gegen CD45R, einem B-Zell-Antigen (BD Pharmingen)
-
Ein
muriner
Antikörper
gegen
MHC
II,
einem
Oberflächenantigen
immunkompetenter Zellen (AbD Serotec)
-
OX-8, ein Mausantikörper, gewonnen aus der Zellkultur
-
Ein Kaninchen-Antikörper gegen das extrazelluläre Glykoprotein Fibronektin
(Labvision, Fremont, CA USA)
-
Ein muriner IgG1-Antikörper gegen Synaptopodin, ein Aktin-assoziiertes
Protein in Neuronen und Podozyten (Progen, Heidelberg, Germany)
-
PCNA, ein IgG2a-Mausantikörper gegen einen Proliferationsmarker (DAKO)
-
Ein muriner IgG-Antikörper gegen Desmin, einem Zytoskelettelement von
Muskelzellen (DAKO)
Die folgenden Sekundärantikörper wurden in dieser Studie verwendet:
-
biotinylierter Anti-Maus IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)
-
biotinylierter Anti-Ziege IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)
-
biotinylierter Anti-Kaninchen IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA,
USA)
- 20 -
Weitere verwendete Materialien:
-
Meerrettich-Peroxidase Avidin D (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA,
USA)
-
Blocking Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)
-
DAB Substrat Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)
-
Fettstift zum Umranden der Biopsien (DAKO)
-
Hämatoxylin III nach Gill als Gegenfärbung (Merck)
-
Perjodsäure (Roth)
Optimierungen ergaben folgende Verdünnungen für die Primärantikörper:
-
Kollagen I
1:20
-
Kollagen IV
1:200
-
α-sm-Aktin
1:30
-
TGF-β2
1:200
-
TSP-1
1:20
-
ED-1
1:500
-
PCNA
1:50
-
RECA-1
1:30
-
P-Smad 2/3
1:400
-
JG-12
1:30
-
PAI-1
1:100
-
CD45R
1:500
-
MHC II
1:250
-
OX-8
1:1
-
Fibronektin
1:200
-
Synaptopodin
1:50
-
Desmin
1:50
- 21 -
Grundsätzlich wurde zu jeder Färbung eine Positivkontrolle durchgeführt, d.h. eine Färbung
mit einem Gewebe, in dem das gesuchte Antigen sicher vorhanden war.
Immunfluoreszenz-Färbungen
Wie in den immunhistochemischen Färbungen wurden die Gewebeschnitte zunächst in
Xylol 3 x 5 Minuten deparaffiniert und in absteigender Alkoholreihe in Ethanol 100% 3 x 3
Minuten und Ethanol 95% (v/v) 2 x 2 Minuten rehydriert. Anschließend wurden die
Schnitte mit TBS gewaschen und mit einem Fettstift umfahren. Der Primärantikörper,
verdünnt in 1% (v/v) BSA/TBS, wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur auf dem Gewebe
belassen. Ebenso wurde mit dem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper verfahren.
Schließlich wurden die Schnitte noch mit in TBS (1:2000) verdünntem DAPI 10 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Zwischen den einzelnen Schritten und abschließend wurden
die Gewebe für jeweils 3 x 3 Minuten in TBS gewaschen. Eingedeckt wurde mit Mowiol
und die Schnitte anschließend im Kühlschrank aufbewahrt.
Optimierungen ergaben folgende Verdünnungen der Primärantikörper:
-
MHC II
1:50
-
Ox 8
1:1
-
Synaptopodin 1:50
Perjodsäure-Schiff-(PAS)-Färbung nach Gridley
Mit Perjodsäure-Schiff-Reagenz (PAS) können glykogenhaltige Bestandteile der Zellen
angefärbt werden, da Kohlenhydrate mit Perjodsäure oxidieren. Die entstehenden
Aldehydgruppen
ergeben
mit
fuchsinschwefliger
Säure
(Schiffsreagenz)
eine
- 22 -
charakteristische Rotfärbung. Nach Diastasevorbehandlung (Amylase) wird Glykogen
gespalten,
sodass
nur
noch
Glykopeptide,
Glykoproteine,
Mukoproteine,
Mukopolysaccharide, ungesättigte Fette und Phospholipide eine Farbreaktion mit PAS
ergeben, d.h. Glykogen, Schleim, Pilze und BM werden fuchsinrot gefärbt. Die
Deparaffinierung und die Rehydrierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt,
anschließend erfolgte eine Behandlung mit 2% (v/v) Perjodsäure für 15 Minuten. Vor der
Färbung mit Schiff´schem Reagenz (25 Minuten) wurden die Schnitte 2 x 3 Minuten mit
ddH2O gewaschen. Gegengefärbt wurde mit Hämatoxylin (3 Sekunden), und das Bläuen
erfolgte anschließend unter fließendem Wasser (10 Minuten). Zum Abschluss wurde die
Dehydrierung, die Klärung in Xylol und das Eindecken, wie oben beschrieben,
durchgeführt.
Histologische Auswertungen
Grundsätzlich wurden alle Schnitte blind, d.h. ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit,
ausgewertet. Für jede Biopsie wurden 40-60 kortikale glomeruläre Anschnitte oder
mindestens 20 tubulointerstitielle Gesichtsfelder (400-fache Vergrößerung) evaluiert.
Insgesamt wurden verschiedene Bewertungstechniken, die sich nach der jeweiligen Färbung
richteten, durchgeführt.
Bei individuell angefärbten Zellen wurden die positiven Zellen gezählt und der Mittelwert
gebildet. Dies wurde für CD45R, PCNA, ED1 und CD8 in jeweils 20 tubulointerstitiellen
Gesichtsfeldern und 40-50 beurteilten Glomeruli durchgeführt. Positiv gefärbte Zellen in
der PAI-1 Färbung wurden in den Glomeruli (30-40) gezählt, sowie MHC II positive Zellen
im Tubulointerstitium (20 Gesichtsfelder). Die PAI-1 gefärbten Schnitte wurden zusätzlich
noch durch ein Score-System in 40 Glomeruli pro Schnitt ausgewertet. Score 0 bedeutete
ein paar wenige angefärbte Podozyten, Score 1 viele Podozyten kräftig angefärbt, Score 2
die Anfärbung auch anderer Zellen, Score 3 vermehrte und Score 4 massive Anfärbung
auch anderer Zellen im Glomerulum. Auf die gleiche Art wurden je 40 Glomeruli in der
TGF-β Färbung beurteilt.
- 23 -
Die Podozytenschädigung wurde desweiteren noch durch die Podozytenauszälung in je 30
Glomeruli in der Synaptopodin-Färbung in Fluoreszenz herausgearbeitet.
Die glomeruläre und tubulointerstitielle Expression von Thrombospondin-1 wurde
semiquantitativ bestimmt und reflektiert die Veränderungen der Fläche und der Intensität
der glomerulären Färbung (0= keine bis sehr schwache Färbung, 1= schwache Färbung mit
weniger als 25% des glomerulären Schlingenkonvoluts mit fokal vermehrter Färbung, 2=
25-49% des glomerulären Schlingenkonvoluts mit fokal vermehrter Färbung, 3= 50-75%
des glomerulären Schlingenkonvoluts mit fokal vermehrter Färbung, 4= mehr als 75% des
glomerulären Schlingenkonvoluts mit starker Färbung). Ein ähnliches Scoresystem wurde
für die Auswertung der Desminfärbung in wiederum je 50 Glomeruli angewandt. Nur
galten in diesem Fall die Prozentzahlen der im Randbereich der Glomeruli angefärbten
Areale. Es zeigte sich in unserer Studie, sowie in früheren Untersuchungen, dass dieses
Bewertungssystem reproduzierbare Ergebnisse bei verschiedenen Auswertern liefert, und
dass
die
Ergebnisse
sehr
gut
mit
den
Imagequantifizierungsprogrammen korrelieren.
Ergebnissen
von
Morphometrie-
Es erfolgte weiterhin mit Hilfe eines
Imagequantifizierungsprogrammes, dem Metavue Imaging System (Visitron Systems
GmbH, Puchheim, Germany), die Ermittlung der durchschnittlichen, glomerulären und
tubulointerstitiellen Fläche, die sich immunhistochemisch für Kollagen IV, Kollagen I, smAktin und Fibronektin anfärben ließ.
Der peritubuläre Verlust und/oder die Regeneration des peritubulären Endothels wurden mit
einem Kapillarrarefizierungsindex erfasst. Pro Tier wurden 15 tubulointerstitielle
Gesichtsfelder ausgewertet und der prozentuale Anteil der Reca negativen Quadrate von
100 Quadraten pro Gesichtsfeld bestimmt. Um die glomeruläre Kapillarrarefizierung
beurteilen zu können, wurden in einem Score-System je 40 Glomeruli bewertet. Hierbei
bedeutete Score 0 einen gesunden Zustand, Score 1 bis 25%, Score 2 bis 50%, Score 3 bis
75% und Score 4 bis 100% Endothelzellverlust.
In den PAS gefärbten Biopsieschnitten wurden zweierlei Schädigungsindices zur
Bewertung von jeweils 50 Glomeruli pro Gewebsschnitt angewandt. Glomerulosklerose
wurde
als
segmentaler
oder
globaler
Kollaps
der
Kapillaren
mit
vermehrter
Matrixablagerung auf einer Skala von 0 bis 4 definiert (0= normal, 1= ein kleiner Fokus, 2=
<25%, 3= 26-50%, 4= >50% der beteiligten glomerulären Fläche). Als weiteren Marker der
- 24 -
glomerulären Schädigung wurde die Adhäsion der Glomeruli an die Bowman-Kapsel
mittels eines ähnlichen Scoresystems in Prozent der Anhaftungen angegeben.
In der P-smad 2/3 Färbung wurde der Anteil der positiv gefärbten Zellkerne in Relation zu
allen vorhandenen Zellkernen in je 30 Glomeruli bestimmt, und damit auch die
durchschnittliche glomeruläre Zellzahl ermittelt.
Weitere Untersuchungen
Die Proteinbestimmung im Urin erfolgte mit dem BioRad Protein Assay (BioRad,
München, Deutschland) und mit BSA als Standard (Pierce, Bonn, Deutschland). Zu jeweils
20µl der Probenlösung oder Standard wurde in einer Mikrotiterplatte (96 Tröge) 200µl
Färbelösung (0,1% (v/v) Coomassie G250 / 5% (v/v) Ethanol / 10% (v/v) Phosphorsäure)
gegeben.
Nach
10
Minuten
Mikrotiterplattenphotometer
bei
Inkubation
einer
wurde
Wellenlänge
von
der
Proteingehalt
595nm
bestimmt.
im
Die
Proteinmenge in den Proben wurde nach einer Eichreihe mit 10-500µl BSA/ml ermittelt.
Als Referenz dienten 200µl des jeweiligen proteinfreien Puffers.
Der Kreatininwert im Serum und im Urin, sowie der Harnstoffwert wurden mit Hilfe eines
Autoanalyzers gemessen (Beckmann Instruments GmbH, München, Deutschland).
Statistische Analyse
Alle Werte wurden als Durchschnittswerte mit Standardabweichung angegeben. Statistische
Signifikanz (definiert als p<0,05) wurde anhand des Student´s t-tests bestimmt.
- 25 -
Ergebnisse
Induktion einer chronischen Glomerulonephritis führt zu einer heterogenen
Ausbildung der Erkrankung
Am siebten Tag nach der Uninephrektomie wurde zur Induktion der Glomerulonephritis die
anti-Thy1 Antikörperlösung injiziert. Bis zum Beginn der Gentherapie in Woche 21 nach
Versuchsbeginn wurden von den Versuchstieren vier Mal der Urin gesammelt und
anschließend die Proteinurie als Marker der Nierenfunktion untersucht. Hierfür wurde in
den 21 Wochen die Proteinurie gemessen. Es stellte sich heraus, dass die Tiere trotz
gleicher Behandlung nicht denselben Grad an Schädigung ihrer Nieren erlitten. Da die
Werte der Proteinurie sehr variabel waren, wurden die Tiere einer Gruppe jeweils in eine
Untergruppe mit niedriger Proteinurie und eine mit hoher Proteinurie unterteilt. Bei der
Untergruppe mit niedriger Proteinurie lagen die Werte bei Therapiestart für die 24h
Proteinurie unter 100mg und bei der 2. Gruppe jeweils über 100mg.
So entstanden vier Untergruppen:
1. Kontrollgruppe mit leichter Proteinurie
2. Kontrollgruppe mit starker Proteinurie
3. Therapiegruppe mit leichter Proteinurie
4. Therapiegruppe mit starker Proteinurie
Um nach Therapiestart die Veränderung dieses Nierenfuntionswertes weiterhin zu
beobachten, wurde noch zwei Mal die Proteinurie gemessen.
- 26 -
400
Kontrolle leichte
leichte Proteinurie
Kontrolle
Proteinurie
TSP-2
leichte
Proteinurie
TSP2 schwere Proteinurie
300
Kontrolle leichte
schwereProteinurie
Proteinurie
Kontrolle
TSP-2schwere
schwere Proteinurie
TSP2
Proteinurie
200
100
w
o
30
w
o
27
w
o
21
w
o
9
5
w
o
0
1w
o
24h Proteinurie [ mg ]
Proteinurie
Zeitpunkt
Abb.1: Verlauf der Proteinurie im Modell der chronischen anti-Thy1 Nephritis. Nach
Induktion der Glomerulonephritis wurden die Tiere an 6 verschiedenen Zeitpunkten für 24h
in Stoffwechselkäfige gesetzt, um Urin zu sammeln. Nach Bestimmung der Proteinurie
erfolgte die Randomisierung in die 4 Gruppen und der Therapiestart erfolgte 20 Wochen
nach Krankheitsinduktion.
Ratten, die in der 20. Woche nach Krankheitsinduktion als Tiere mit geringer Proteinurie
(<100mg/24h) eingruppiert wurden, zeigten zwar bereits in der akuten Krankheitsphase
eine Woche nach Induktion eine leicht verminderte Proteinurie, diese sank jedoch bis zur 5.
Woche fast auf eine Proteinausscheidung gesunder Tiere ab. Trotzdem stieg die Proteinurie
bis zur 21. Woche nach Versuchsbeginn wieder an und zeigte von diesem Zeitpunkt an
nahezu keine Progression. Eine Behandlung mit TSP-2 Überexpression veränderte die
Proteinurie in den „Niedrigproteinurie-Gruppen“ nicht (Abb. 1). Im Gegensatz dazu zeigte
sich in den Gruppen mit hoher Proteinurie eine unerwartete Veränderung in den
gemessenen Werten. In der Kontrollgruppe war das Maximum der Proteinurie bereits zum
Start der Gentherapie in der 21. Woche nach Versuchsbeginn erreicht. Dagegen stiegen die
mittleren Proteinuriewerte der mit TSP-2 therapierten Ratten um 20,4 % von 233 auf 293
mg/24h im selben Zeitraum an (siehe Abb.1).
Um zu überprüfen, ob die erhobenen funktionellen Daten der Nieren mit den
Veränderungen im Nierenparenchym korrelieren und die unerwartete Datenlage erklärt
- 27 -
werden könne, wurden nach Versuchsende die entnommenen Nieren der Ratten
24h Proteinurie [mg]
histologisch ausgewertet.
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Abb. 2: Korrelation von
Proteinurie
und
Glomerulosklerose.
Die
gemessenen
Proteinuriewerte
zum Endpunkt der Studie wurden
für alle Versuchstiere mit der
ermittelten
Glomerulosklerose
korreliert.
3.5
Glomerulosklerose [Score]
Glomerulosklerose wird durch TSP-2 Therapie verstärkt
Die Sklerosierung der Glomeruli ist eng mit der Proteinurie verknüpft, da sie als
maßgebliche Ursache der Proteinurie gilt. Dies konnte auch in dieser Studie gezeigt
werden, in der die Glomerulosklerose positiv mit einem Anstieg der Proteinurie korreliert
(Abb. 2). Zum Nachweis der Glomerulosklerose wurde eine PAS-Färbung durchgeführt,
welche anhand verschiedener Scoresysteme ausgewertet wurde.
TS
P
SP
K
TL
P
LP
0.0
0.6
0.4
0.2
0.0
TS
P
0.5
*
SP
1.0
0.8
K
1.5
1.0
TL
P
2.0
Glom. mit Anhaftung an der Bowmankapsel
LP
2.5
K
Glomerulosklerose [Score]
Glom. mit Anhaftung an der Bowmankapsel [%]
b)
K
Glomerulosklerose [score 0-4]
a)
- 28 -
Schwerst geschädigte Glomeruli
25
20
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
15
10
5
TS
P
SP
K
TL
P
LP
0
K
Schwerst geschädigte Glomeruli [%]
c)
Abb.3:Pathologische Veränderungen im Modell der chronischen anti-Thy1 Nephritis.
Anhand einer PAS-Färbung wurden mit Hilfe von semiquantitiven Scores a) die
Glomerulosklerose, b) die Anhaftung an die Bowmankapsel und c) der Prozentsatz stark
geschädigter Glomeruli ermittelt. Bezüglich der Anhaftung an der Bowmankapsel zeigte
sich zwischen der Kontroll- und der Therapiegruppe in der Selektion der Tiere mit leichter
Proteinurie ein signifikanter Unterschied (Signifikanzniveau <0,02).
In den Gruppen der schwächer geschädigten Nieren zeigt sich zwar im GlomeruloskleroseScore (Abb. 4) und im Score „schwerst geschädigter Glomeruli“ kein wesentlicher
Unterschied zwischen Kontroll- und Therapiegruppe (siehe Abb. 2a und c), dagegen besteht
in der Auswertung der Glomeruli mit Anhaftung an die Bowman-Kapsel in der
leichtproteinorischen Gruppe eine um 43,6 % geringere Schädigung in der Gruppe der
Kontrolltiere (siehe Abb. 2b).
Bei Tieren mit stärker geschädigten Nieren sind keine signifikanten Effekte einer TSP-2
Gentherapie
bezüglich
der
glomerulären Schädigung zu sehen. In allen drei
Schädigungsparametern zeigten die TSP-2 therapierten Tiere nur eine leichte Tendenz zu
einer stärkeren Sklerosierung der Glomeruli. Im Fall des Glomerulosklerose-Scores beläuft
sich der Unterschied nominell auf 14,0%, bei der Anhaftung an die Bowman-Kapsel auf
14,3% und im Score „schwerst geschädigter Glomeruli“ auf 21,9%.
Es bleibt zu konstatieren, dass eine Therapie mit TSP-2 verstärkt zur Sklerosierung, also
einer irreversibelen Schädigung der Glomeruli führt.
- 29 -
Score 0
Score 4
Abb.4: Glomerulosklerose im chronischen anti-Thy1 Modell. Die Glomerulosklerose
wurde an PAS-gefärbten Nierenbiopsien mit Hilfe eines semiquantitativen Scoring Systems
evaluiert. In gesunden Glomeruli findet sich nur wenig PAS-positive Anfärbung. Dagegen
zeigen Glomeruli mit ausgeprägter Glomerulosklerose (Score 4) eine massive
Akkumulation an PAS-positiver Matrix.
Unbeeinflusst von einer TSP-2 Therapie zeigt sich eine vermehrte
Podozytenschädigung bei Progression der Glomerulonephritis
Da durch die Glomerulosklerose auch die Podozyten geschädigt werden und damit
maßgeblich mitverantwortlich für die Entstehung einer Proteinurie sind, wurde speziell
auch deren Schädigung untersucht. Es wurde nicht nur eine Färbung für den Podozyten
Marker Synaptopodin durchgeführt, sondern auch eine Desminfärbung. Desmin gilt als
Marker für die Schädigung von Podozyten, da es ein Protein ist, das nur im Falle der
Schädigung durch Podozyten exprimiert wird.
- 30 -
1.0
0.5
TS
P
d)
Synaptopodin-positive Zellen
pro glomerulus
c)
SP
0.0
K
TS
P
K
TL
P
K
SP
0
1.5
K
5
2.0
TL
P
10
Desmin
b)
LP
15
LP
Verminderung der Podozyten
Glomeruläres Desmin [Score 0-4]
Synaptopodin
a)
15
10
5
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Desmin-positive Podozyten [Score]
24h Proteinurie [mg]
e)
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0.0
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
Synaptopodin-positive Zellen pro Glomerulus
Abb.5: Podozytenschädigung im chronischen anti-Thy-1 Modell nach TSP-2
Gentherapie. Unabhängig von der Behandlung zeigen Ratten mit einer hohen Proteinurie
eine verminderte Anzahl an Synaptopodin positiven Zellen im Glomerulum (a), während
Podozyten vermehrt den Schädigungsmarker Desmin exprimieren(b). Dabei korreliert eine
verminderte Anzahl von Synaptopodin positiven Zellen mit einer verstärkten podozytären
Desmin Expression (c). Eine typische Anfärbung für Synaptopodin mittels
Immunfluoreszenzfärbung (rote Fluoreszenz) und gleichzeitiger Anfärbung der Kerne
mittels DAPI (blaue Kernfärbung) ist gezeigt (d). Der Verlust von Synaptopodin positiven
Zellen korreliert mit der Höhe der Proteinurie (e).
- 31 -
Beim Vergleich des Podozytenverlustes konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen
Kontroll- und Therapiegruppe, sowohl in der Gruppe der schwachen als auch in der Gruppe
der starken Proteinurie festgestellt werden. Es fällt jedoch ins Auge, dass in den stärker
geschädigten Versuchstieren auch der Verlust an den Podozyten deutlich größer ist. In der
Synaptopodinfärbung, welche die Verringerung der Podozytenzahl nachweist, liegt der
Unterschied in der Kontrollgruppe bei 44,1% und in der Therapiegruppe bei 51,6% (siehe
Abb. 4 links). Ein starker Verlust an Podozyten korreliert hoch signifikant (p = 0,0) mit
einer hohen Proteinurie. Die Auswertung der Desminfärbung zeigt ein ähnliches Bild. Der
Unterschied in der Expression dieses Podozytenschädigungsmarkers zeigt in der
Kontrollgruppe eine um 75,0% und in der Therapiegruppe um 61,1% geringere Expression
in der leichter geschädigten Gruppe (siehe Abb. 4 rechts).
Man kann somit feststellen, dass es mit zunehmender Progredienz der experimentellen
Glomerulonephritis zu einer vermehrten Podozytenschädigung kommt, die von einer TSP-2
Therapie nicht beeinflusst wird.
Die Nierenfibrose wird durch die TSP-2 Therapie nicht beeinflusst
TGF-β führt zu einer stark vermehrten Produktion zahlreicher EZM-Moleküle wie
Kollagenen und Fibronektin, die in einer Narbenbildung und Fibrosierung der Niere
resultieren. Zahlreiche immunhistologische Färbungungen von Matrixmolekülen dienten
der Erfassung dieses Schädigungsparameters.
LP
SP
20
10
0
e)
Glomeruläres Fibronectin
40
30
20
10
0
TS
P
30
SP
Glomeruläres Kollagen IV
K
SP
TS
P
K
c)
TL
P
0
TL
P
2
LP
4
K
6
LP
SP
TS
P
K
TL
P
K
Kortikales Kollagen I [% begrenzter Fläche]
8
LP
SP
TS
P
K
a)
K
LP
TL
P
K
Glomeruläres Kollagen I [% begrenzter Fläche]
10
Kortikales Kollagen IV [% begrenzter Fläche]
TS
P
K
SP
TL
P
LP
K
Glom eruläres Kollagen IV [% begrenzter Fläche]
Glomeruläres Kollagen I
Kortikales Fibronectin [% begrenzter Fläche]
TS
P
K
TL
P
K
Glomeruläres Fibronectin [% begrenzter Fläche]
- 32 b)
Kortikales Kollagen I
25
20
15
10
5
0
d)
Kortikales Kollagen IV
40
30
20
10
0
f)
Kortikales Fibronectin
15
10
5
0
- 33 g)
h)
Kollagen I
Kollagen IV
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
Abb.6: Die Matrixakkumulation nach TSP-2 Gentherapie im chronischen anti-Thy1
Nephritis Modell. Kollagen I (a, b, g), Kollagen IV (c, d, h) und Fibronektin (e, f) wurden
mittels immunhistologischer Anfärbung (braune Anfärbung) and nachfolgender
computergestützter Image-Quantifizierung in den Glomeruli (a, c, e) und im Kortex (b, d, f)
analysiert. Beispielhaft ist die Anfärung für Kollagen I (g) und Kolagen IV (h) in
erkrankten Nieren gezeigt.
In der Kollagen I Färbung zeigt sich glomerulär eine etwas verminderte Expression in den
TSP-2 therapierten Gruppen. Die TSP-2 bedingte glomeruläre Reduktion beläuft sich im
Fall der niedrigeren Schädigung auf 53,9% und im Fall der höhergradigen
Nierenschädigung auf 20,7% (siehe Abb.6a). Kortikal betrachtet zeigt sich dies jedoch
nicht, und es lässt sich nur festhalten, dass es in den stärker geschädigten Gruppen auch zu
einer stärkeren Expression von Kollagen I kam (Kontrollgruppe 28,9%, Therapiegruppe
49,7% höhere Kollagen I Expression).
In der Kollagen IV Färbung zeigen sich sowohl glomerulär als auch kortikal nur minimale
Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen (siehe Abb. 6c und d).
In der Fibronektinfärbung zeigt sich sowohl glomerulär als auch kortikal eine tendenziell
verminderte Expression in den TSP-2 behandelten Therapiegruppen. Glomerulär beläuft
sich die TSP-2 bedingte Reduktion in den Gruppen der leichten Proteinurie auf 30,0% und
in den Gruppen der stärkeren Proteinurie auf 20,5%. Im Kortex sind diese beobachteten
Reduktionen vergleichbar (siehe Abb.6e und f).
- 34 -
Bei der Entwicklung einer mesangioproliferativen Glomerulonephritis kommt es vor allem
in der akuten Phase zu einer erhöhten Proliferation. Weiterhin zeigte TSP-2 in früheren
Experimenten anti-proliferative Eigenschaften. Deshalb wurde die proliferative Aktivität
mit Hilfe eines immunhistologischen Nachweises des Proliferationsmarkers PCNA
untersucht. Hier zeigt sich glomerulär und kortikal lediglich, dass es bei stärkerer
Schädigung der Nieren zu einer vermehrten Proliferation kommt. Ganz deutlich wird dies
vor allem in der kortikalen Färbung, bei der die Proliferation in den Tieren mit hoher
Proteinurie im Vergleich zu den Tieren mit niedriger Proteinurie in der Kontrollgruppe um
76,1% und in der TSP-2 Therapiegruppe um 92,6% höher liegt (siehe Abb. 6h).
Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass eine TSP-2 Therapie die Matrixakkumulation
nicht wesentlich beeinflusst.
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
0
K
LP
TS
P
SP
K
K
TL
P
0
50
TS
P
2
100
SP
4
150
K
6
Tubulointerstitielles PCNA
TL
P
Tubulointerstitielles PCNA
8
LP
Glomeruläres PCNA
b)
Glomeruläres PCNA
a)
-
Abb.7: Einfluss einer TSP-2 Therapie auf die Proliferation im chronischen anti-Thy1
Modell. Dargestellt ist die Anzahl der der PCNA-positiven Zellen pro Glomerulus (a) und
pro Gesichtsfeld (b).
- 35 -
Die TSP-2 Therapie kann die TGF-β Aktivierung nur teilweise inhibieren
Bevor der Wachstumsfaktor TGF-ß profibrotisch wirken kann, muss er zunächst aktiviert
werden. TSP-2 kann als kompetitiver Inhibitor der TSP-1 vermittelten TGF-ß Aktivierung
wirken. Deshalb wurde zunächst die Gesamt-TGF-ß Expression immunhistologisch
untersucht und die Phosphorylierung des TGF-ß Signaltransduktionsmoleküls smad 2 oder
3 sowie die Expression des TGF-ß-Zielgens PAI-1 als indirekte Indikatoren für aktives
TGF-ß untersucht.
*
60
40
20
0
TS
P
TS
P
SP
K
TL
P
K
LP
0.0
80
SP
0.5
100
K
1.0
Glomeruläres p-smad 2,3
K
LP
TGF-beta 2
1.5
p-smad 2,3 negative Zellen [%]
b)
2.0
TL
P
TGF-beta 2
a)
PAI-1
1.5
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
1.0
0.5
TS
P
SP
K
TL
P
LP
0.0
K
Glomeruläres PAI-1 [Score 0-4]
c)
Abb.8: Einfluss einer TSP-2 Therapie auf die TGF-β-Aktivierung. Das Gesamt-TGF-ß
wurde mit Hilfe einer immunhistologischen Anfärbung für TGF-β-2 und einer
semiquantitativen Analyse evaluiert (a). Der prozentuale Anteil P-smad2/3 positiver Zellen
(b) und die semiquantitative Evaluierung von glomerulärem PAI-1 wurden ermittelt(c).
- 36 -
Bezüglich des prozentualen Anteils an P-smad2/3 positiven Zellen zeigte sich zwischen der
Kontroll- und der Therapiegruppe in der Selektion der Tiere mit leichter Proteinurie ein
hoch signifikanter Unterschied (Signifikanzniveau <0,01).
Die Expression von Gesamt-TGF-ß2 wird durch eine TSP-2 Therapie nicht beeinflusst,
dagegen konnte man feststellen, dass die Expression von TGF-β bei stärkerer
Nierenschädigung vermehrt war (Kontrollgruppe: 3,2 fach stärkere Expression,
Therapiegruppe: 2.8 fach stärkere Expression) (siehe Abb. 8a).
Eine TSP-2 Gentherapie in der nephritischen Gruppe mit geringer Proteinurie zeigte eine
geringe, aber signifikante Reduktion der P-smad 2/3 positiven Zellen. Dagegen war der
Anteil dieser Zellen in Tieren mit hoher Proteinurie nicht durch eine TSP-2 Therapie
beeinflusst (Abb. 8b). Im Gegensatz dazu zeigt sich in der PAI-1 Färbung ein deutlicher
Unterschied in Bezug auf die Expression zwischen leichter und schwerer Schädigung der
Niere
(Kontrollgruppe:
2,5
fach
stärkere
Expression
bei
leichter
Schädigung,
Therapiegruppe: 4,9 fach stärkere Expression bei leichter Schädigung), zum anderen hat die
TSP-2 Therapie hier einen größeren inhibitorischen Effekt in der Gruppe mit stärkerer
Schädigung (siehe Abb. 8c).
So scheint eine TSP-2 Gentherapie die TGF-β-Aktivierung nur teilweise inhibieren zu
können.
Vermehrte Expression von TSP-1 bei schwerer glomerulärer Schädigung
Als wichtiger Aktivator von TGF-β wird im Folgenden auch die Expression von TSP-1 in
den unterschiedlichen Gruppen dargestellt.
- 37 -
0.2
0.0
-0.2
TS
P
TS
P
SP
K
K
TL
P
-0.02
0.4
SP
0.00
0.6
K
0.02
0.8
TL
P
0.04
Tubulointerstitielles TSP-1
LP
0.06
Tubulointerstitielles TSP-1
0.08
LP
Glomeruläres TSP-1
b)
K
Glomeruläres TSP-1
a)
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
Abb.9: Einfluss einer TSP-2 Therapie auf die TSP-1-Expression im chronischen antiThy1 Modell. Die TSP-1 Expression wurde mittels immunhistologischem Nachweis und
anschließender semiquantitativer Quantifizierung in Glomeruli (a) und im
Tubulointerstitium (b) untersucht (Score 0-3).
TSP-1 wird nach Verletzung schnell hochreguliert. In dieser Studie sieht man, dass TSP-1
bei einer Glomerulonephritis mit starker Proteinurie noch nachweisbar ist, während es in
Nierenbiopsien mit geringerer Schädigung sowohl glomerulär als auch tubulointerstitiell
nicht angefärbt wird (Abb. 9). Eine kompensatorische Regulation durch TSP-2 Gentherapie
ist nicht zu beobachten.
TSP-2 Therapie führt zu keiner veränderten Kapillarisierung
TSP-1 wirkt unter anderem auch als anti-angiogenetischer Faktor. In diesem
Zusammenhang wurde auch seine Wirkung auf die Kapillarisierung der Niere in unserem
Modell untersucht.
- 38 b)
30
20
10
TS
P
0
SP
TS
P
SP
K
TL
P
0
40
K
1
50
TL
P
2
Tubulointerstitielles Reca
LP
3
K
Kapillarreduktion [Reca-Score 0-4]
Glomeruläres Reca
K
LP
Kapillarreduktion [Reca-Score 0-4]
a)
0
TS
P
4
1
SP
3
2
K
2
3
TL
P
1
4
LP
0
Glomeruläre Kapillarreduktion [Score 0-4]
Kortikales sm-Actin
K
24h Proteinurie [mg]
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Kortikales sm-Actin [% begrenzter Fläche]
d)
c)
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
Abb.10: Einfluss einer TSP-2 Therapie auf die Kapillarisierung während einer
chronischen anti-Thy1 Nephritis. In Abb. a) und b) ist die Auswertung der
immunhistologischen Reca-1 Färbung in Glomeruli (a) und im Tubulointerstitium (b)
dargestellt. Die glomerulären Daten wurden mittels eines Scores und die Auswertung der
peritubulären Kapillaren durch die
Auszählung innerhalb eines Gittersystems
quantifiziert. Der glomeruläre Kapillarverlust korreliert positiv mit der Proteinurie (c). Die
Auswertung einer sm-Aktin-Färbung erfolgte mit Hilfe eines Image-QuantifizierungsProgramms (d).
- 39 -
In gesunden Glomeruli lassen sich eine Vielzahl an Kapillaren durch den Endothelzellspezifischen Marker RECA-1 anfärben (Abb. 11a). Nach einer glomerulären Schädigung
kommt es zu einem Verlust dieser Kapillaren (Abb. 11b). In dieser Färbung zeigte sich
sowohl glomerulär als auch tubulointerstitiell kein signifikanter Effekt der TSP-2 Therapie
auf die Kapillarisierung (Abb. 10a, b). Lediglich glomerulär lässt sich eine vermehrte
Reduktion der Kapillarisierung in den Gruppen stärkerer Schädigung nachweisen
(Abb. 10a). Eine höhere Proteinurie korreliert auch mit einem erhöhten Kapillarverlust
(r=0,83; p=0,0001; Abb. 10c).
In der sm-Aktin-Färbung, in welcher Gefäßmuskelzellen und Myofibroblasten angefärbt
werden, zeigt sich eine mit Zunahme der Erkrankung gesteigerte Positivität für sm-Aktin.
Dies spiegelt eine Zunahme an interstitiellen Myofibroblasten wider und deckt sich mit den
Daten für Kollagen I, das ebenfalls von diesem Zelltyp gebildet wird (Abb. 10d, 6b).
Score 0
Score 4
Abb.11: Kapillarisierung in der chronischen anti-Thy1 Nephritis. RECA-1 positive
Kapillaren wurden immunhistologisch sichtbar gemacht (braune Färbung) und mit Hilfe
eines semiquantitativen Score-System analysiert.
TSP-2 Therapie beeinflusst die Inflammation nicht
Als letzter Punkt wurde auch die Infiltration mit Entzündungszellen eingehend untersucht,
da in der akuten anti-Thy-1 Nephritis eine TSP-2 Gentherapie einen anti-inflammatorischen
- 40 -
Effekt gezeigt hat. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die im akuten anti-Thy1 Modell
gewonnen
wurden,
konnte
in
der
chronischen
antiThy1 Nephritis
kein
b)
20
10
TS
P
0
SP
TS
P
SP
K
TL
P
K
LP
0.0
30
K
0.5
40
TL
P
1.0
Tubulointerstitielles ED1
LP
1.5
K
Glomeruläres ED1
ED1-positive Zellen pro Gesichtsfeld
a)
40
20
TS
P
0
SP
TS
P
SP
K
TL
P
LP
0.0
60
K
0.2
80
TL
P
0.4
Tubulointerstitielles CD8
LP
0.6
K
Glomeruläres CD8
CD8-positive Zellen pro Gesichtsfeld
d)
c)
K
CD8-positive Zellen im glomerulären Durchschnitt
ED1-positive Zellen im glomerulären Durchschnitt
inflammatorischer Effekt einer TSP-2 Gentherapie nachgewiesen werden.
anti-
- 41 -
40
20
TS
P
SP
0
K
TS
P
SP
K
K
TL
P
0.00
60
TL
P
0.05
80
LP
0.10
Tubulointerstitielles CD45R
K
0.15
Tubulointerstitielles CD45R
f)
Glomeruläres CD45R
LP
Glomeruläres CD45R
e)
KLP: Kontrolle leichte Proteinurie
TLP: TSP-2 leichte Proteinurie
KSP: Kontrolle schwere Proteinurie
TSP: TSP-2 schwere Proteinurie
THP: TSP2 high proteinuria
Abb.12: Einfluss einer TSP-2 Therapie auf den Einstrom von Entzündungszellen
während der chronischen anti-Thy1 Nephritis. Mittels immunhistologischer
Nachweisverfahren wurden ED-1 positive Makrophagen (a, b), CD8a positive T-Zellen (c,
d) und CD45R positive B-Zellen (e, f) dargestellt. Dabei wurden Glomeruli (a, c, e) und
Kortex (b, d, f) getrennt analysiert.
In der ED1-Färbung, in welcher Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen
dargestellt werden können, zeigt sich vor allem in der Gruppe der stärkeren Proteinurie eine
unerwartete Verdoppelung der ED1 positiven Zellen in der TSP-2 Therapiegruppe, die das
Signifikanzniveau knapp verfehlt (siehe Abb. 12a und b).
In der CD8 Färbung wurden ebenfalls in der Gruppe der stärkeren Schädigung mehr CD8
positive T-Lymphozyten nachgewiesen, eine Beeinflussung durch TSP-2 Therapie konnte
jedoch nicht gezeigt werden (Abb. 12c, d).
In einer CD45R-Färbung zeigte sich vor allem tubulointerstitiell eine deutlich höhere
Anzahl an B-Zellen in den hochproteinurischen Gruppen. Hier ließen sich in beiden
Gruppen bis zu 14,7 fach mehr B-Zellen im Vergleich zu den Tieren mit niedriger
Proteinurie nachweisen (Abb. 12f). Es lässt sich insgesamt kein signifikanter Effekt einer
TSP-2 Therapie auf die Inflammation festmachen. Tendentiell zeigten TSP-2 behandelte
Tiere eine unerwartete Tendenz zu erhöhter Inflammation.
- 42 -
Abb. 13: CD 8 Färbung in der
chronischen anti-Thy1 Nephritis:
Die
Aufnahme
einer
Immunfluoreszenzfärbung
zeigt
die peritubuläre Lokalisierung von
CD8a positiven T-Zellen
- 43 -
Diskussion
In den westlichen Industrienationen stellt die mesangioprolferative Glomerulonephritis die
häufigste Form der Glomerulonephritis dar (Khwaja, 2007). Wie die meisten chronischen
Nierenerkrankungen führt diese im Verlauf zu einem progressiven Umbau von
funktionellem Nierengewebe in Narbengewebe, der letztendlich auch zu einem
Nierenversagen führt. Trotz intensiver Bemühungen existiert bis heute keine spezielle antifibrotische Therapie, die ein Fortschreiten des Nierenfunktionsverlustes aufhalten kann
(Daniel, 2003).
Dass TGF-ß wesentlich an der Fibroseentwicklung beteiligt ist, konnte bereits in
zahlreichen Studien sowohl in experimenteller Hinsicht als auch in Obduktionsstudien am
Menschen bewiesen werden (Border, 1992; Tamaki, 2003).
Um seine Rolle bezüglich der renalen Fibrosierung wahrnehmen zu können, muss TGF-ß
zunächst aktiviert werden. Neben verschiedenen möglichen Mechanismen (Munger, 1997),
zeigte sich TSP-1 als der bedeutende Aktivierungsmechanismus in der Niere, sowohl in der
experimentellen, mesangioproliferativen Glomerulonephritis (Daniel, 2003, Daniel, 2004)
als auch in der diabetischen Nephropathie (Daniel, 2007).
TSP-1 wird im Bedarfsfall der Nierenschädigung hochreguliert (Hotchkiss, 2006;
McGregor, 1994) und bietet somit einen idealen Angriffspunkt für die Therapie der durch
TSP-1 vermittelten TGF-β-Aktivierung ausgelösten renalen Fibrose.
TSP-1 wurde bereits in verschiedenen Studien als Angriffspunkt der antifibrotischen
Therapie gewählt. So zeigte der Einsatz von „antisense phosphorothioate oligonucleotides“
gegen TSP-1 eine TSP-1 Synthesehemmung. Dies wiederum führte zu einer reduzierten
Aktivität von TGF-β und damit zu einer verminderten Fibrose (Daniel, 2003).
Dass das Fehlen von TSP-1 im Fall eine Glomerulonephritis zu deutlich weniger
Proteinurie als Zeichen der renalen Fibrose sowie weniger Inflammation führt, konnte in
einer Studie zur anti-GBM Glomerulonephritis am Mausmodell gezeigt werden
(Hochegger, 2004).
Es ist bekannt, dass das zu TSP-1 homologe Protein TSP-2 ebenfalls an TGF-β binden, es
jedoch im Gegensatz zu diesem nicht aktivieren kann (Hugo, 2009).
- 44 -
Somit ist eine Therapie mit TSP-2 als kompetitivem Inhibitor zu der TSP-1 vermittelten
TGF-β Aktivierung möglich.
So könnten durch die therapeutische TSP-2 Überexpression im Gegensatz zu der totalen
Blockierung von TSP-1 oder TGF-β die weiteren Funktionen von TSP-1, wie zum Beispiel
die Funktion als Angiogeneseinhibitor unbeeinflusst bleiben (Lawler, 2004).
Diese Gentherapie mit einem TSP-2 überexprimierenden Plasmid war bereits im akuten
Modell der experimentellen Glomerulonephritis erfolgreich, das heißt, es konnte eine
verminderte TGF-ß Aktivierung, Matrixakkumulation und Inflammation festgestellt werden
(Daniel et al. 2009).
Um eine langfristige Genexpression von TSP-2 gewährleisten zu können, musste TSP-2 in
einen Vektor kloniert werden, der nicht so schnell stummgeschaltet wird wie ein viraler
Promoter. Die Verwendung eines Ubiquitinpromoters erlaubt eine langanhaltende
Expression über mehrere Wochen und Monate (Gill et al.).
Eine Gentherapie bietet zum einen Chancen, birgt zum anderen jedoch auch gewisse
Risiken. Es handelt sich um eine schnell und kostengünstig durchzuführende Therapie, die
nicht auf die Compliance seitens des Patienten angewiesen ist. Das heißt, der Patient hat
keine regelmäßige Tabletteneinnahme, welche aufgrund von Unachtsamkeit oder
persönlichen Unverträglichkeiten dann doch nicht konsequent durchgeführt wird. Als Arzt
hat man damit die Kontrolle über die Therapie. Diese ist jedoch, einmal appliziert, nicht
weiter regulierbar. Sie wirkt, obwohl nicht lebenslang, doch für einige Wochen oder
Monate, während derer ein Eingriff in die Therapie nicht möglich ist.
Eine Gefahr stellt überdies die potentielle Bildung von Antikörpern dar, welche selbst
durch genaues Auswählen der Kompatibilität des Donors mit dem Akzeptor nicht mit
Sicherheit ausgeschlossen werden kann.
Die Gentherapie wirkt nicht nur symptomatisch, sondern wirkt ursächlich und endgültig.
Ziele können ein Gentransfer, ein Abschalten einzelner Gene oder auch eine Genreparatur
sein (Laurence, 2009). Für die Genübertragung gibt es unterschiedliche Wege. Führt man
die Therapie ex vivo durch, muss zuerst Zellmaterial entnommen, dies mit dem neuen
genetischen Material beladen und anschließend wieder dem ursprünglichen Donor
zurückgegeben werden. Ein Verfahren in vivo beinhaltet stets die Verwendung von
Vektoren. Diese Art der Gentherapie wird am Menschen bereits durchgeführt. Ein Beispiel
- 45 -
hierfür ist die Verwendung eines viralen Vektors, einer Transduktion, im Falle der
angeborenen Erkrankung SCID. Es handelt sich hierbei um einen schweren kombinierten
Immundefekt, bei dem keinerlei Immunantwort mehr stattfindet. Dies bedeutet für die
Betroffenen ein Leben in Quarantäne. Durch eine Gentherapie, welche aufgrund der
Lebensdauer der Leukozyten mehrmals pro Jahr durchgeführt werden muss, ist das
Schicksal der fortwährenden Isolation aufgehoben (Rosenecker, 2007).
Patienten mit chronischer Nierenerkrankung haben ebenfalls eine eingeschränkte
Lebensqualität, welche durch die andauernde Medikamenteneinnahme und deren
Nebenwirkungen noch vermindert wird. Der Vorteil einer Gentherapie wäre hier auch die
lokale Wirksamkeit ohne die systemischen Wirkungen, welche jede pharmakologische
Intervention mit sich bringt.
Wichtig für die Kalkulation der potentiellen Risiken einer Gentherapie, wie Entartung oder
Inflammation (Laurence, 2009) sind weitere Studien vorerst am Tiermodell, um den Benefit
der Therapie richtig einschätzen zu können.
In unserer Studie gelang es, die Korrelation histologischer renaler Veränderungen mit
Nierenfunktionsparametern aufzuzeigen. Die Schwere der Erkrankung, das heißt die Stärke
der Beeinträchtigung der Nierenfunktion zeigt sich am deutlichsten an der Höhe der
Proteinausscheidung im Urin. Es konnte gezeigt werden, dass bei Tieren mit erhöhter
Proteinurie
auch
eine
vermehrte
Glomerulosklerose,
Podozytenverlust
und
Kapillarrarefizierung zu beobachten sind. Diese Zusammenhänge sind im Hinblick auf
humane Glomerulonephritiden bereits bewiesen worden (Taheri, 2009).
Die humane Glomerulonephritis wird, wie die meisten Nierenerkrankungen am Menschen
erst spät diagnostiziert, sodass die betroffenen Patienten bereits eine gewisse renale
Fibrosierung ausgebildet haben. Um zu überprüfen, ob sich eine TSP-2 Überexpression
auch positiv auf den Verlauf einer bereits etablierten Erkrankung auswirkt, wurde eine
TSP-2 Gentherapie in einem chronischen anti-Thy-1 Modell untersucht. Schließlich sollten
die Ergebnisse der Studie im Hinblick auf die Erkrankung am Menschen relevant sein.
Die Ergebnisse dieses Modells ergaben ein heterogenes Bild, da die TSP-2 Gentherapie die
gemessenen Erkrankungsparameter in Abhängigkeit vom Stadium der Nierenerkrankung
veränderte.
- 46 -
TSP-1
wurde
bei
schwerer
glomerulärer
Schädigung
vermehrt
exprimiert.
In
Zusammenhang damit konnte auch eine vermehrte Expression von TGF-β, welches durch
TSP-1 aktiviert wird, im Fall stärkerer Nierenschädigung nachgewiesen werden. Die TSP-2
Therapie zeigte auf die Gesamt-TGF-β Expression keine Auswirkung. Betrachtet man
jedoch die indirekten Indikatoren für aktives TGF-β, so zeigt sich in den Therapiegruppen
bezüglich der P-smad 2/3 Expression eine Verbesserung in den leichter geschädigten
Fällen. Bezogen auf die Expression von PAI-1 hatte die TSP-2 Therapie einen größeren
inhibitorischen Effekt in der Gruppe mit stärkerer Schädigung.
Auf Kapillarisierung und Fibrosierung, gemessen an der Ausprägung der Kollagen-,
Fibronektin- und PCNA-Expression hatte die Therapie keinen Einfluss. Eher begünstigend
wirkte sie dagegen auf Inflammation, Sklerosierung und Podozytenschädigung.
Im direkten Vergleich zu unserer Studie am chronischen Modell der Glomerulonephritis
steht die Studie am akuten Modell, welche eindrückliche Ergebnisse lieferte. Hier führte die
TSP-2 Gentherapie zu einer deutlich reduzierten TGF-β Aktivierung, Fibrosierung und
Inflammation (Daniel, 2009).
Es gilt nun zu untersuchen, welche Faktoren maßgeblich zu den Limitierungen im
chronischen Modell der Nephritis führten.
Im Gegensatz zum akuten Modell der Erkrankung, bei welcher experimentelle Schädigung
der Niere sowie TSP-2 Therapie am selben Tag durchgeführt wurde (Daniel, 2009), wurde
in unserem Modell erst nach 20 Wochen therapiert. Zu diesem Zeitpunkt war die
Nierenfunktion, gemessen an der Proteinurie während 24 Stunden, bereits deutlich
reduziert. Es ist damit von einer bereits etablierten renalen
Fibrose und Sklerose
auszugehen, was einer chronischen Nierenschädigung entspricht. Es stellt sich die Frage, ob
in diesem Fall die Fibrosierung und Inflammation so weit fortgeschritten war, dass eine
therapeutische Intervention auf Genebene schlicht fast nichts mehr bewirken konnte.
Bereits deutlich etablierte Veränderungen kann eine Gentherapie nicht rückgängig machen.
Der Effekt dieser Art der Therapie besteht zum größten Teil darin, ein laufendes Geschehen
zu stoppen und die Progression zu verhindern. Setzt die Therapie jedoch früh genug ein,
können erst kurz bestehende krankhafte Prozesse vollständig ausheilen.
Die Therapie chronischer Glomerulonephritiden wurde bereits in anderen Studien erforscht.
Ebenfalls am Modell der anti-Thy 1 Nephritis zeigte sich unter dem Einsatz des
- 47 -
Immunsuppressivums Everolimus eine deutlich reduzierte Glomerulosklerose sowie eine
verminderte interstitielle Fibrose (Wittmann, 2008). Einen ähnlich positiven Effekt zeigte
die Therapie mittels Inhibition des proinflammatorischen Zytokins PDGF (Boor, 2007).
In unserer Arbeit verlief die Glomerulonephritis ebenfalls chronisch progressiv und stellte
nicht ein akutes Krankheitsgeschehen, wie in der Vergleichsstudie zum akuten Modell, dar.
Während eine akute Glomerulonephritis auch ohne Gentherapie ausheilt, ist im Falle einer
chronisch progredienten Erkrankung wie der chronischen anti-Thy1 Nephritis eine spontane
Ausheilung nicht zu erwarten (Shimizu, 1982).
Zusätzlich kam es in unserer Studie zu einer sehr heterogenen Ausbildung der Nephritis
und obwohl wir die geplanten zwei Gruppen (Therapie und Kontrolle) noch weiter
unterteilten, war die Varianz der Schädigung groß. Dies führte zu starken Unterschieden in
der Auswertung der einzelnen Parameter und somit zu einer Mittelung der Werte in der
Statistik. So konnte ein gutes Ansprechen auf die Therapie bei einem einzelnen, eventuell
weniger stark geschädigten Tier keinen Effekt in der Statistik bedeuten, wenn sich in der
gleichen Gruppe ein Tier mit derart stark fortgeschrittener Erkrankung befand, für welches
jede Therapie zu spät kam.
Wie oben beschrieben, waren wir gezwungen, die bestehenden Gruppen aufgrund der
Streuung der Schädigungsparameter noch weiter zu unterteilen, was zu einer stark
reduzierten Gruppengröße führte. Für ein statistisch valides Ergebnis ist das nicht die beste
Ausgangssituation. Es bedeutet damit auch eine stärkere Betonung der einzelnen Tiere und
kann dazu führen, dass ein eigentlich positiver Therapieeffekt in einer Untergruppe durch
einen einzigen Therapieversager zunichte gemacht wird.
Das grundsätzliche Problem in der Therapie der chronischen Glomerulonephritis ist die
Tatsache, dass es bislang keine effektive und zugleich sinnvoll durchzuführende
antifibrotische Therapie gibt. Die Gabe von Zytokin-blockierenden Antikörpern (Boor,
2007) oder der Einsatz von z.B. PDGF-Aptameren (Floege, 1999) sind mögliche Ansätze
einer antifibrotisch wirksamen Therapie.
Möglich ist sicher die kompetitive Inhibition der TGF-β Aktivierung durch die Gabe von
TSP-2. Zu bedenken bleibt hier, dass diese Option nicht nur lebenslang und aufwendig
durchzuführen ist, sondern auch immense Kosten verursachen würde. Gerade aufgrund
dieser Situation scheint eine Gentherapie, welche zwar nicht einmalig, jedoch in
- 48 -
Abhängigkeit von den transfizierten Zellen alle paar Wochen bis Monate durchgeführt
wird, eine praktikable Alternative.
In dieser Studie am experimentellen anti-Thy 1 Modell in der Ratte, welches eine
chronische humane Glomerulonephritis imitierte, konnten wesentliche Zusammenhänge
einer chronischen Nierenerkrankung aufgezeigt werden. Es konnte die Korrelation
zwischen funktionellen Parametern der Nierenfunktion wie zum Beispiel der Proteinurie
sowie histologischen renalen Veränderungen nachgewiesen werden.
Es bleibt jedoch zu konstatieren, dass das eigentliche Ziel unserer Arbeit, nämlich der
Nachweis der Verbesserung einer chronischen Glomerulonephritis durch eine TSP-2
Gentherapie nicht erreicht werden konnte.
- 49 -
Bibliographie
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- 60 -
Abkürzungsverzeichnis:
α-sma
α-smooth muscle Aktin
Abb.
Abbildung
Ag
Antigen
AK
Antikörper
BM
Basalmembran
DNS
Desoxyribonucleinsäure
ED-1
Antikörperklon zur Erkennung des Rattenhomologon von humanen
Makrophagen/Monozyten
EZM
extrazelluläre Matrix
GBM
Glomeruläre Basalmembran
GN
Glomerulonephritis
IgG
Immunglobulin G
JG-12
Antikörperklon zur Markierung von Rattenendothelzellen
KG
Körpergewicht
MAb
monoclonal antibody
mAK
monoklonaler Antikörper
MPGN
membranoproliferative Glomerulonephritis
Ox-7
Antikörperklon zur Markierung des Ratten-Thy1-Antigen
PAF
Paraformaldehyd
pAK
polyklonaler Antikörper
PAS
Perjodsäure-Schiff-Reagenz
PBS
phosphat-buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PCNA
Proliferating cell nuclear antigen
PDGF
Platelet-derived growth factor
RECA
rat endothelial cell specific monoclonal antibody
RT
Raumtemperatur
TGF-β
Transforming Growth Factor β
TOR
Target of RAD
TSP
Thrombospondin
VEGF
vascular endothelial growth factor
- 61 -
Danksagung
Für vielfache Unterstützung und Förderung danke ich besonders Herrn PD Dr. rer. nat.
Christoph Daniel und Herrn Prof. Dr. med. Christian Hugo.
Desweiteren bedanke ich mich für die technische Unterstützung bei Frau Ilona Winter.
- 62 -
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Marlene Haslbeck,
geboren am 06.10.1984 in Nürnberg,
ledig
Schulbildung:
1991-1995
1995-2002
Sept. 2002-Juni 2004
Juni 2004
Grundschule am Fürreuthweg in Nürnberg
Wolfram-von-Eschenbach-Gymnasium in Schwabach
Sigmund-Schuckert-Gymnasium in Nürnberg
Allgemeine Hochschulreife
Auslandsaufenthalt:
Sept. 2004-Juli 2005
Aufenthalt in Italien als Au Pair
Hochschulstudium:
WS05/06- WS11/12
August/September 07
Oktober 2011
Studium der Humanmedizin an der FAU Erlangen
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Berufstätigkeit:
Januar 2012-dato
Assistenzärztin am Klinikum Nürnberg, Neurologie