‫אבחון מולקולארי של מחלות‬
‫לימפופרוליפרטיביות‬
‫דבורה סהר‬
‫מעבדה המטולוגית‬
‫רמב"ם‬
‫• לימפוציטים הם תאים בעלי תפקידים חשובים‬
‫במערכת החיסון‪.‬‬
‫• לימפוציטים מסוג ‪ B‬מייצרים נוגדנים‪.‬‬
‫• לימפוציטים מסוג ‪ T‬מבטאים על גבי הממברנה‬
‫שלהם חלבון )‪T- Cell Receptor (TCR‬‬
IgH rearrangement
14 ‫כרומוזום‬
At the junction sites of the V, D, and J gene segments, deletion and
random insertion of nucleotides occurs during the rearrangement
process, resulting in highly diverse junctional regions.
.‫טעויות בתהליך זה הן לימפומגניות‬
Control of
rearrangement
through chromatin
accessibility.
‫• מרבית הממאירויות הלימפואידיות הן קלונליות‪,‬‬
‫כלומר מכילות תאים ממוצא משותף אשר עבר‬
‫אותו ‪ rearrangement‬בגנים לאימונוגלובולינים‬
‫או בגנים ל‪. T cell receptor (TCR) -‬‬
‫• ב‪ 25–30%-‬מהמקרים גם ניתן לזהות בהן‬
‫טרנסלוקציות ספציפיות‪.‬‬
‫• כל אלה יכולים לשמש כסמנים מולקולריים‬
‫לקלונליות‪.‬‬
‫‪Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936‬‬
‫‪Leukemia (2003) 17, 2257–2317‬‬
‫דוגמאות לטרנסלוקציות הגורמות‬
‫לשפעול אונקוגנים בלימפומות‬
‫• )‪ t(14;18‬בלימפומה פוליקולרית – ביטוי יתר של ‪BCL-2‬‬
‫• )‪ t(11;14‬ב‪ -Mantle Cell Lymphoma-‬ביטוי יתר של ‪BCL- 1‬‬
‫• )‪ t(8;22) , t(2;8) , t(8;14‬ב‪ - Burkitt’s Lymphoma -‬ביטוי יתר של‬
‫‪MYC‬‬
‫המשותף לכל הטרנסלוקציות הללו‪:‬‬
‫•מעורבות הגן ‪ IGH‬על כר' ‪( 14‬או הגנים לשרשרות הקלות)‪.‬‬
‫• אובדן הבקרה על ביטוי של גנים ביטוי יתר של חלבון נורמלי‬
‫ציטוגנטיקה‬
‫ אבחון מעבדתי‬- t(14;18)
PCR
MWM
S
S
Pos
Neg
FISH
Bcl2 locus (18q21,labelled red), overlaps IGH
locus (14q32, labelled in green) giving a signal
of fusion (yellow).
Detection of t(14;18)(IgH/BCL2)
in follicular lymphoma by PCR
‫חסרונות ה‪ PCR-‬בזיהוי טרנסלוקציות בלימפומה‬
‫• באמצעות ציטוגנטיקה ניתן לזהות בכ‪ 75%-‬ממקרי‬
‫לימפומה פוליקולרית )‪ t(14;18‬בקשרי הלימפה המעורבים‪.‬‬
‫• לעומת זאת באמצעות ‪ PCR‬ניתן לזהות את הטרנסלוקציה‬
‫רק ב‪.50-70%-‬‬
‫• זיהוי הטרנסלוקציות ב‪ Burkitt’s lymphoma-‬אינו נעשה‬
‫באופן שגרתי באמצעות ‪ PCR‬משום שנקודות השבר‬
‫משתרעות על פני רצף ארוך מדי‪.‬‬
‫מה עושים כשאין סמן מולקולרי ספציפי‬
‫לסוג הממאירות?‬
‫• מנצלים את התהליך הביולוגי הטבעי‪ ,‬החיוני‬
‫להתפתחות הלימפוציטים‪ ,‬היוצר טביעת אצבעות‬
‫מולקולרית ייחודית לכל לימפוציט‪.‬‬
‫• ‪ Rearrangement‬של הגנים לאימונוגלובולינים‬
‫(בתאי ‪) B‬‬
‫• או בגנים ל‪( T cell receptor (TCR) -‬בתאי ‪) T‬‬
PCR reactions for IgH
In DNA samples from a specimen without lymphocytes, no
rearranged Ig/TCR genes are to be expected.
T-cell receptor (TCR) gene rearrangement
‫• בזכות השונות הרבה של ה‪, Ig/TCR rearrangements-‬‬
‫מספר הנוגדנים או ה‪ TCR-‬השונים מוערך בסדר גודל של ‪! 1012‬‬
‫• הסיכוי ששני לימפוציטים שונים יהיו בעלי ‪ rearrangement‬זהה‪ ,‬זניח‪.‬‬
‫• לפיכך‪ ,‬מצב בו קיימים לימפוציטים רבים בעלי ‪ rearrangement‬זהה‬
‫מעיד על קלונליות‪ ,‬כלומר תא יחיד שהפך לשבט תאים כמותו‪,‬‬
‫לרוב בגלל שהפך לממאיר‪.‬‬
Genetic Analyzer
GeneScan analysis of Ig/TCR products.
GeneScan® is a sophisticated software program that converts raw data
to analyzed data through the application of a size standard, a matrix
file, and specific parameter settings.
GeneScan® software sizes peaks using the internal size standard
added to the sample prior to separation
‫‪GeneScan analysis of Ig/TCR products.‬‬
‫בדגימה מלימפוציטים תקינים יווצרו תוצרי ‪PCR‬‬
‫רבים ושונים‪ ,‬שיראו התפלגות גאוסית –עדות‬
‫לפוליקלונליות‪.‬‬
‫בדגימה מלימפוציטים לא תקינים‪ ,‬ייראה פיק ברור‬
‫אחד‪ ,‬הנגזר מתוצרי ‪ PCR‬רבים בעלי אורך זהה –‬
‫עדות למונוקלונליות‪.‬‬
‫התוצאה הנפוצה ביותר בליפומה היא תערובת‬
‫של מונוקלונליות עם תבנית פוליקלונלית‪.‬‬
‫זה ייראה כפיק דומיננטי על רקע עקומת גאוס‪.‬‬
‫• מרבית הלימפוציטים עוברים ‪ rearrangements‬בשני האללים של‬
‫הגנים ל‪ Ig-‬או ‪.TCR‬‬
‫• לכן‪ ,‬שני פיקים קלונליים משקפים לרוב מצב של‬
‫‪biallellic rearrangement‬‬
‫‪Molecular clonality testing for lymphoma‬‬
‫‪captodayonline.com‬‬
‫• דר' ‪ Groenen‬הינה חברה בקבוצת ‪ , EuroClonality‬אשר פיתחה‪,‬‬
‫בצעה וולידציה ויצרה הנחיות לשימוש‬
‫ב‪ EuroClonality/BIOMED-2 multiplex PCR kit -‬המשווק בעולם‬
‫ע"י החברה האמריקאית ‪. InVivoScribe‬‬
‫• היא אומרת שהפתולוגים מסוגלים לאבחן ממאירויות במרבית‬
‫המקרים‪ ,‬ורק ב‪ 10-15%-‬מהמקרים החשודים ללימפומה יש צורך‬
‫בבדיקות העזר המולקולריות לבדיקת קלונליות‪.‬‬
InVivoScribe Primers for IgH Rearrangement
IdentiCloneTM T Cell Receptor Gamma Gene
Rearrangement Assay 2.0
For Identification of T Cell Clonality
For in vitro Diagnostic Use
‫‪Considerations for the use of formalin-fixed‬‬
‫‪and paraffin-embedded (FFPE) tissue‬‬
‫‪specimens for clonality analysis‬‬
‫• ביופסיות נלקחות לעתים קרובות ע"י צוות רפואי שאינו‬
‫מודע לחשיבות של שיטות השימור שלהן‪.‬‬
‫• לשינויים בתנאי הקיבוע של הדגימות (תמיסות שונות‪,‬‬
‫משך הקיבוע) יש השפעה משמעותית על תוצאות‬
‫הבדיקה‪.‬‬
‫• קביעת איכות ה‪ DNA-‬המופק חיונית לצורך פרשנות נכונה‬
‫של תוצאות הבדיקה‪.‬‬
Quality control of DNA
Target
Product Size
FR1
310-360
FR2
250-295
FR3
100-170
TCR G
159-207
‫‪Different patterns of B cell clonality‬‬
‫נוכחות תאי ‪ B‬או ‪T‬‬
‫מועטים בדגימה (כמו‬
‫למשל בעור)‪ ,‬עלולה‬
‫ליצור אמפליפיקציה‬
‫שתיצור רושם מוטעה‬
‫של קלונליות‪-‬‬
‫פסאודוקלונליות‪.‬‬
‫‪Different patterns of B cell clonality‬‬
‫תגובה חיסונית דומיננטית עשויה ליצור פיקים מרובים שחוזרים על‬
‫עצמם בדופליקטים‬
‫‪EuroClonality Guidelines‬‬
‫• ‪ EuroClonality‬ממליצה מאד על שימוש באינפורמציה‬
‫ההיסטופתולוגית ועל זו של ה‪flow-cytometry-‬‬
‫(לצורך הערכת מספר הלימפוציטים הנורמליים בדגימה‪,‬‬
‫ביחס למספר הלימפוציטים החשודים ללימפומה)‪.‬‬
‫• יש לעשות אינטגרציה של המידע המורפולוגי‪,‬‬
‫האימונופנוטיפי והקליני‪ ,‬עם תוצאות הבדיקות‬
‫המולקולריות‪.‬‬
Correlation of TCR- PCR
results
and histologic evaluation
in skin and
corresponding lymph node.
SK
SK
LN
LN
‫‪Interpretation of clonality: not a strictly quantitative‬‬
‫‪approach‬‬
‫• אנו ערים לכך שכמה קיטים מסחריים ממליצים על‬
‫קריטריונים כמותיים לצורך הגדרת פיק חיובי‪.‬‬
‫• לדעתנו אין זה נכון לקבוע חיוביות של פיקים עפ"י יחס‬
‫הגדלים שלהם‪ ,‬משום שה‪ PCR-‬אינו כמותי‪.‬‬
 “The test has a degree of subjectivity in how
it’s interpreted.
 It doesn’t produce a strict yes or no answer.”
James R. Cook, MD, molecular hematopathology section head in the Robert J.
Tomsich Pathology and Laboratory Medicine Institute, Cleveland Clinic.
‫‪Limitations and pitfalls of molecular clonality studies‬‬
‫• רגישות מוגבלת עלולה להפריע לזיהוי קלונים קטנים (פחות‬
‫מ‪.)5-10%-‬‬
‫• ‪ Ig/TCR rearrangements‬אינם סמנים ל‪:lineage-‬‬
‫• ‪ TCR gene rearrangements‬מתרחשים לעתים קרובות‬
‫בממאירויות של תאי ‪ B‬לא‪-‬בוגרים‪ ,‬כמו ‪ ,B-ALL‬אך גם‬
‫בממאירויות של תאי ‪ B‬בוגרים‪.‬‬
‫• ‪ IgH rearrangements‬מתרחשים גם בממאירויות של‬
‫תאי ‪ , T‬אם כי בתדירות פחותה‪.‬‬
‫‪T‬‬
‫‪Ig‬‬
‫‪rearrangements‬‬
‫‪B‬‬
‫‪TCR‬‬
‫‪rearrangement‬‬
‫‪Assessment of clonality‬‬
‫•אבחנה של ממאירות לימפואידית אינה יכולה‬
‫להתבסס על קלונליות בלבד‪.‬‬
‫•התוצאות צריכות להיות מפורשות בזהירות‪ ,‬היות‬
‫שקיימים מצבים זיהומיים בהם נצפית קלונליות‪.‬‬
‫‪BM involvement‬‬
‫• קביעת מעורבות לשד העצם בלימפומה צריכה‬
‫להיקבע במקביל לביופסיה לצורך השוואת‬
‫הפיקים‪.‬‬
‫• ללא התיחסות לביופסיה שעל פיה נעשתה‬
‫האבחנה‪ ,‬קשה ואף מסוכן לקבוע קלונליות‪.‬‬
‫‪Dr. Ton Langerak‬‬
‫תודות‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫לאנשי ‪EUROCLONALITY‬‬
‫לדר' גלית שריג‪ ,‬מנהלת המעבדה ההמטולוגית ברמב"ם‬
‫לצוות המטולוגיה מולקולרית ברמב"ם‬
‫לכל הגופים שתרמו לטובת קיום יום עיון בנושא מונוקלונליות‬
‫(שלצערי לא יתקיים)‪ :‬האיגוד ההמטולוגי‪ ,‬האגודה למלחמה בסרטן‪,‬‬
‫חברות מדיסון‪ ,‬יאנסן‪ ,‬רוש‪ ,‬רניום‪ ,‬ג'נטק‪. INVIVOSCRIBE ,‬‬
‫לועדה המארגנת של כנס אילמ"ר‬