1. No category

PROCESO REDES
EN SALUD
PUBLICA
Método de ensayo para la
identificación de siete serotipos de
Salmonella por PCR múltiple en
tiempo real a partir de cultivo
Código: MEN-R01.001.5030-001
Elaborado por:
Miguel Angel Diaz Osório
Bacteriólogo M.Sc.
Fecha: 2011/06/15
1.
Revisado por:
Kelly Alejandra Orozco Vargas
Bacterióloga contratista
Fecha: 2011/07/11
1 de 22
Página
Versión Nº : 00
Fecha próxima
revisión: 2013/05
Aprobado por:
María Elena Realpe Delgado
Coordinadora
Grupo
Microbiología
Fecha: 2014/08/29
OBJETIVO
Establecer los requisitos básicos para la realización de una buena identificación de los
serotipos de Salmonella por PCR múltiple en tiempo real a partir de cultivo.
2.
ALCANCE
Este instructivo aplica para todos los profesionales de la salud que elaboran en los
laboratorios del Grupo de Microbiología. SRNL.
3.
RESPONSABILIDAD
Profesionales del Grupo Microbiología Red.
4.
DEFINICIONES
PCR en Tiempo Real (qPCR): técnica molecular que permite la detección y cuantificación de
ácidos nucléicos, teniendo en cuenta la emisión de fluorescencia durante los ciclos de la
reacción como indicador del producto de amplificación.
Fluoróforo (reportero): molécula que emite una señal fluorescente cuando es excitada por un
rayo de luz a una longitud de onda determinada.
Aceptor (Quencher): molécula con capacidad para adsorber la emisión de fluorescencia de un
reportero cuando se encuentran en proximidad.
Sondas TaqMan: secuencia específica de nucleótidos marcada en el extremo 5’ con un
fluoróforo y en el extremo 3’ con un aceptor. Es uno de los principales sistemas de detección de
fluorescencia para la amplificación de ADN. Este tipo de sondas se hidrolizan por la actividad
de una exonucleasa 5' que poseen ciertas polimerasa durante PCR.
Iniciadores: secuencia corta de nucleótidos que da inicio a la síntesis (polimerización) de una
hebra complementaria de ADN.
Ruido de Fondo (Background): señal de fluorescencia remanente que se detecta en las
reacciones donde no hay amplificación del fragmento de interés.
Línea Umbral (Threshold Line): es el nivel de detección o el punto en el cual una reacción
alcanza una intensidad de fluorescencia sobre el ruido de fondo. Esta línea se ubica en la fase
exponencial de la curva de amplificación.
1
Ciclo Umbral (Ct): es el número del ciclo en el cual la fluorescencia generada en una reacción
cruza la línea umbral. Esto es inversamente proporcional al logaritmo del número de copias
iniciales en la muestra. También llamado Cp (Punto de corte) en la terminología de LightCycler.
Objeto de Compensación de Color (OCC): es una función del programa LightCycler480® que
ayuda corregir o eliminar el entrecruzamiento de la señal de fluorescencia para observar solo
una señal específica en cada uno de los canales de detección.
5. CONDICIONES GENERALES
•
Para el desarrollo de las actividades se debe cumplir con las normas de bioseguridad
MNL-A05.001.5030-001 y las Buenas Prácticas de Laboratorios.
•
La placa multipozos se debe mantener siempre sobre una toalla de papel, nunca la
coloque directamente sobre una superficie. Con un marcador resalte los números y
letras que hay en los bordes de la placa multipozos.
•
Cubra la placa multipozos con la lámina de plástico sellante y presiónela suavemente
con el sellador.
•
Limpie con alcohol etílico al 70% la cámara de flujo laminar, micropipetas, vortex y
centrifuga, luego, coloque la placa multipozos sobre una toalla de papel, guantes,
puntas blancas, amarillas y una gradilla para colocar los tubos eppendorf de 0,2ml y
1,5ml necesarios dentro de la cámara de flujo laminar y deje encendida la luz
ultravioleta por 15 minutos.
•
Deje que la IQTM Multiplex Powermix, el agua grado reactivo PCR, los iniciadores con
sus respectivas sondas TaqMan y el control positivo de la mezcla a ensayar alcance la
temperatura ambiente antes de utilizarlos.
•
Trabaje sin luz blanca dentro de la cámara de flujo laminar para proteger las sondas
TaqMan (evita la degradación), además, no es necesario que mantenga la master mix,
los iniciadores y las sondas TaqMan en hielo, puede trabajar estos reactivos a
temperatura ambiente.
6. MATERIALES Y REACTIVOS
• Cultivo del aislamiento de Salmonella en agar infusión cerebro corazón de 14 -18 horas
• Puntas amarillas de 100 µl
• Puntas blancas de 10 µl
• Tubos de 0,2 y 1,5 ml (Eppendorf)
• Placas de 96 pozos para PCR tiempo real (Roche- 4729692001)
2
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Método de ensayo para la
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Salmonella por PCR múltiple en
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Elaborado por:
Miguel Angel Diaz Osório
Bacteriólogo M.Sc.
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Bacterióloga contratista
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Fecha próxima
revisión: 2013/05
Aprobado por:
María Elena Realpe Delgado
Coordinadora
Grupo
Microbiología
Fecha: 2014/08/29
• Láminas de plástico para sellar las placas multipozos de PCR tiempo real (Roche4729757001)
• Gradilla para tubos de 0,2ml y 1,5 ml
• Guantes desechables
• IQTM Multiplex Powermix (BioRad 172-5849)
• Solución de trabajo de iniciadores y sondas TaqMan (10 µM) (Biosearch Technologies)
• Toallas de papel
• Agua grado reactivo para PCR
• Agua destilada estéril
7. EQUIPOS
•
Micro centrífuga
•
Equipo de PCR en tiempo real LightCycler 480 II (Roche).
•
Cámara de flujo laminar-PCR
•
Congelador a -20°C y -70°C
8. TOMA E IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
N/A
9. CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA
N/A
10. DESCRICIÓN DE LA TECNICA
Extracción ADN por el método de lisis cruda por ebullición “Boiling”
• Durante todo el procedimiento de extracción trabaje con guantes.
3
•
Tomar 2 colonias del cultivo en agar BHI del aislamiento de Salmonella con asa estéril y
resuspéndalas en 100 μl de agua destilada estéril, mezcle en vortex por 20 segundos para
preparar una suspensión homogenea.
•
Colocar la suspensión a temperatura de 95°C por 10 minutos utilizando el programa
“Boiling” del termociclador MJMini (BioRad – CA, USA).
•
Centrifugue a 13.000 r.p.m por 5 minutos.
•
Separe el sobrenadante sin tomar el sedimento en otro tubo de 0,2 ml y conserve la
muestra a -20°C hasta su uso en la PCR.
PCR múltiple en tiempo real para identificar siete serotipos de Salmonella a partir de
cultivos
Para identificar el serotipo en un aislamiento de Salmonella debe utilizar las mezclas de
identificación (Tabla 1) en el orden que se ha establecido en el diagrama de flujo (Figura 1). En
la preparación las mezclas de reacción tenga en cuenta la concentración de cada uno de los
iniciadores en las mezclas de identificación (Tabla 2), la concentración de las sondas TaqMan
para todas las mezclas es de 100 nM. De acuerdo con el número de aislamientos a procesar
incluyendo el control positivo y negativo calcule los volúmenes de cada reactivo para la mezcla
BDE según la tabla
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Fecha próxima
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María Elena Realpe Delgado
Coordinadora
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Fecha: 2014/08/29
Tabla 1. Mezclas de los iniciadores y sondas TaqMan para la identificación de siete serotipos
de Salmonella
Númer
o
1
2
3
4
5
6
Mezcla
Iniciador
sonda
rfbJ
D.wzx
BDE
E.wzx
invA
C1.wzx
C2.rfbj
C1C2Z10
fliC.Z10
invA
fliC.i
fliCeh
TypSP
fljB.1,2
invA
fliC.d
Ty
wcdB
invA
Sdf.1
En
fliC.g
invA
fliC.eh
fliC.enx
BraeNHad
fljB.1,2
invA
Fluoróforo
FAM
CFO 560
CFR610
Q 670
FAM
CFO 560
CFR 610
Q 670
CFO 560
CFR 610
FAM
Q 670
FAM
CFO 560
Q 670
FAM
CFR 610
Q 670
CFR 610
CFO 560
FAM
Q 670
Serogrupo/antígeno/
serotipo
B, D y E
C1, C2 y antígeno Z10
Typhimurium
Saintpaul
y
Typhi
Enteritidis
Braenderup,
Hadar
Newport
y
5
CFO 560: Cal Fluor Orange 560
CFR 610: Cal Fluor Red 610
Q 670: Quasar 670
6
Figura 1. Diagrama de flujo para la utilización de las mezclas de iniciadores y sondas TaqMan en la identificación de siete serotipos de Salmonella enterica
Cultivo de
Salmonella enterica
Mezcla BDE
Mezcla C1C2Z10
Positivo
grupo
D
C1
C2
Z10
Mezcla TypSP
Mezcla En
Mezcla Ty
g,m;Sdf-I
d;Vi
i;1,2
Mezcla BraeNHad
e,h;e,n,x
e,h;1,2
e,n,x
i;e,h
B
Saintpaul
Typhimurium
Enteritidis
Typhi
E
Negativo
grupo
Salmonella no grupo B, C1, C2, D, E
Positivo
grupo
Braenderup
Newport
Hadar
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Serogrupo
Positivo
No olvide realizar el mapa donde indique la posición y orden de las muestras de ADN de
aislamientos y controles que se adicionarán en la placa multi-pozos. (Figura 2)
Tabla 2. Concentración de los iniciadores en las mezclas para la identificación de los siete
serotipos de Salmonella
Número
Mezcla
Concentración de los
iniciadores (nM)
1
BDE
rfbJ
600
D.wzx
400
E.wzx
600
invA
200
2
C1C2Z10
C1.wzx
600
C2.rfbj
400
fliC.Z10
500
invA
200
3
TypSP
fliC.e,h
500
fliC.i
500
fljB1,2
400
invA
300
4
Ty
fliC.d
500
wcdB
400
invA
200
5
En
Sdf.1
300
fliC.g
300
invA
500
6
BraeNHad
fliC.e,h
500
fljB.enx
500
fljB.1,2
600
invA
300
Tabla 3. Mezcla de reacción BDE
Reactivo
Volumen
(µl)
Concentración
Master mix
rfbJ
D.wzx
Iniciadores
(c/u)
E.wzx
invA
Sondas TaqMan (c/u)
Agua PCR
Total
10
1,2
0,8
1,2
0,4
0,2
2,2
19
1X
600 nM
400 nM
600 nM
200 nM
100 nM
-
Número de
reacciones (3)
Volumen (µl)
30
3,6
0,6
3,6
1,2
0,6
9,6
57
Procedimiento para la PCR múltiple en tiempo real
•
Seleccione en la placa multipozos ya sea con un punto ó línea los pozos para el control
positivo, control negativo y los aislamientos a ensayar. Utilice para esto un marcador
delgado.
•
Agite en vortex por unos segundos los iniciadores, sondas TaqMan, IQTM Multiplex
Powermix y el agua de PCR antes de utilizarlos, luego, centrifugue mediante un pulso para
permitir que la solución baje.
•
Dependiendo del volumen total de la mezcla de reacción a preparar, marque un tubo de
0,2ml ó 1,5ml con el nombre de la mezcla a ensayar.
•
Prepare la mezcla de reacción agregando el respectivo volumen de los reactivos en el
siguiente orden:
o Agua PCR
o IQTM Multiplex Powermix
o Iniciadores
o Sondas TaqMan
•
Agite en vortex la mezcla de reacción por 5 segundos y centrifugue mediante un pulso.
•
Levante cuidadosamente la lámina sellante de los pozos donde va a adicionar la mezcla de
reacción y coloque 19 µl de la mezcla de reacción en cada uno los pozos de la placa,
iniciando por el control positivo y terminando con el control negativo, por último, adicione
1µl de agua PCR al pozo del control negativo.
•
Cubra nuevamente los pozos con la lámina sellante utilizando una punta amarilla sin
presionar fuertemente.
•
Envuelva la placa multipozos con la toalla de papel y coloque una tapa para protegerla de
la luz directa. No olvide mantener la placa multipozos sobre la toalla de papel.
•
Encienda el equipo de tiempo real.
•
Adicione 1 µl de ADN del control positivo y de los aislamientos a los pozos previamente
marcados, realice esta operación al lado de un mechero. En este paso tenga cuidado
cuando levante y cierre la lámina sellante.
•
Asegure que los pozos están bien tapados con el sellador de la lámina y coloque la placa
multipozos en la bandeja del equipo de tiempo real.
Programación del equipo de tiempo real. [LightCycler 480 II]
•
Iniciar el programa LightCycler480® software release 1.5.0 a través del icono que se
encuentra en el escritorio.
•
Dentro del programa se debe crear un nuevo experimento haciendo clic en el ícono new
experiment.
•
En la ventana new experiment de clic en la opción Apply Template y en la carpeta
Templates seleccione el archivo PCR salm Run Protocol para establecer las condiciones
de reacción.
Nota: En la pestaña Run Protocol podrá visualizar y configurar las temperaturas y ciclos de la
reacción de PCR.
•
En la sección Subset Editor seleccione los pozos de la placa que utilizará para los
controles positivo y negativo y los aislamientos que se analizarán en la PCR. Para esto
tenga en cuenta el mapa realizado anteriormente. Identifique con un nombre esta placa
haciendo clic en clic en
.
•
Luego, en la sección Sample Editor identifique cada uno de los pozos que fueron
seleccionados en el plato con el nombre respectivo de los controles y el código de los
aislamientos.
•
Guarde la configuración del nuevo experimento con la opción del icono
. No olvide
colocar el nombre del ensayo y la fecha.
•
Abra la bandeja del equipo de tiempo real para cargar la placa multi-pozos, tenga cuidado
de colocarla de la forma correcta y luego ciérrela.
•
Seleccione experiment nuevamente y ubíquese en la pestaña de Data y de clíc en el icono
de Star Run para dar inicio al programa de PCR en tiempo real.
•
Luego de finalizar el programa de termociclado, el programa mostrará un mensaje de run
complete. Abra de nuevo la bandeja, retire la placa multipozos y apague el equipo de
tiempo real.
11. CONTROLES INTERNOS
Los controles internos son mezclas de ADN de los siguientes serotipos:
Salmonellan Typhimurium
Salmonella Saintpaul
Salmonella Braenderup,
Salmonella Newport
Salmonella Hadar
Salmonella Enteritidis
Salmonella Typhi
12. LIMITACIONES
Solo se identifican siete de los 2579 serotipos de Salmonella existentes
13. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Lectura e interpretación de los resultados de PCR en tiempo real
•
Diríjase a la sección Analysis para ver los resultados del ensayo utilizando la opción Abs
Quant/fit points. En la ventana Create new analysis seleccione el nombre de la placa en
la opción subset.
•
Seleccione la pestaña de Noise Band para observar la curva logarítmica de fluorescencia
que tiene la forma característica de curva sigmoidea.
La presencia o ausencia de un gen o secuencia que identifica un factor antígeno en un
aislamiento se determina con el análisis de la curva de fluorescencia y la obtención del Ct
(Cycler threshold) o ciclo umbral. Para esto, debe inicialmente configurar la línea umbral
(threshold line) en la grafica logarítmica de fluorescencia de la siguiente forma:
•
Seleccione los pozos de los controles y los aislamientos que va a analizar con la mezcla
ensayada.
•
Active el objeto de compensación de color haciendo clic en la opción Color Comp. Escoja
el archivo PCR salm OCC 2 (CC).
•
Elija la combinación de filtros para el fluoróforo que desea analizar en la opción Filter
Comb. Por defecto, siempre encontrará la combinación FAM (465-510).
Nota: en la combinación de filtros para el fluoróforo CFR 610 especialmente en la mezcla BDE,
se debe tener cuidado de no confundir el ruido de fondo que generan los aislamientos que son
positivos para el grupo D con una curva fluorescencia para el grupo E. Esto se debe a lectura
cruzada -Crosstalk- que existe entre los filtros para CFO 560 y CFR 610.
• Configure el valor de desviación estándar para el fluoróforo seleccionado utilizando la
opción Noiseband (STD) Mult y coloque el valor de desviación estándar en la celda
STD Multiplier. Tenga en cuenta la tabla de desviaciones estándar para cada uno de
los fluoróforos en las mezclas utilizadas (Tabla 4).
• Calcule el Ct con la opción Calculate.
Luego de este procedimiento, verifique que la línea umbral se ubica por encima del ruido de
fondo que genera el control negativo y las muestras que no amplificaron y en la zona media de
la amplificación logarítmica de las curvas del control positivo y de las muestras positivas.
Observe el ejemplo del Resultado de la mezcla BDE del control positivo y negativo (Anexo 1).
Utilice el panel de muestras junto con la grafica logarítmica para Identificar los aislamientos que
son positivos para un grupo o factor antígeno teniendo en cuenta la presencia de Ct y la curva
de fluorescencia y negativos por la ausencia de Ct. Tenga en cuenta que todos los aislamientos
que son Salmonella deben amplificar para el control interno de reacción gen invA.
14. EMISIÓN DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos de cada una de las mezclas ensayadas se deben consignar en el
cuaderno de registro REG-R01.001.5030.043, colocando la fecha de realización del ensayo, el
grupo, los factores antigénicos identificados y la firma de quien realizó la prueba.
15. EXAMENES COMPLEMENTARIOS
N/A
Tabla 4. Desviaciones estándar para los fluoróforos utilizados en las mezclas de identificación
de siete serotipos de Salmonella
Númer
o
1
2
3
4
5
6
Mezcla
Fluoróforo
FAM
CAL Fluor Orange 560
BDE
CAL Fluor Red 610
Quasar 670
FAM
CAL Fluor Orange 560
C1C2Z10
CAL Fluor Red 610
Quasar 670
CAL Fluor Orange 560
CAL Fluor Red 610
TypSP
FAM
Quasar 670
FAM
Ty
CAL Fluor Orange 560
Quasar 670
FAM
En
CAL Fluor Red 610
Quasar 670
CAL Fluor Red 610
CAL Fluor Orange 560
BraeNHad
FAM
Quasar 670
Valor desviación
estándar
(STD multiplier)
57
57
60
60
57
57
33
65
20
20
100
40
40
40
40
25
25
25
40
40
120
50
•
Después de conocer el resultado de la mezcla BDE realizar la mezcla de reacción TypSP
(Tabla 5) para detectar las flagelinas que definen el serotipo del aislamiento de Salmonella
Tabla 5. Mezcla de reacción TypSP
Reactivo
Volumen
(µl)
Concentración
Master mix
fliC.i
fliCeh
Iniciadores
(c/u)
fljB.1,2
invA
Sondas TaqMan (c/u)
Agua PCR
Total
10
1,0
1,0
0,8
0,6
0,2
1,4
19
1X
500 nM
500 nM
400 nM
300 nM
100 nM
-
Número de
reacciones (3)
Volumen (µl)
30
3,0
3,0
2,4
1,8
0,6
4,2
57
16. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
LightCycler 480 II Instrument Operator´s Manual, Roche 2008
17. CONTROL DE REGISTROS
CONTROL DE REGISTROS
ARCHIVO DE GESTION
IDENTIFICACION
COD
NOMBRE
ORDENACIO
N
DOCUMENTA
L
RESPONSAB
LE
REGR01.00
1.5030043.
Cuaderno de
registro
Salmonella spp
Se ordena
cronológicame
nte
El profesional
responsable
del programa
LUGAR
TIEMPO
DE
RETENCIO
N
Archivo de
Salmonella spp
Satélite
3 años
ARCHIVO CENTRAL
METODO
UTILIZA
DO
Se
mantiene
en el
archivo
de
gestión
de
Microbiol
ogía
hasta que
pase al
archivo
central
ARCHIVO
HISTÓRICO
RESPONSAB
LE
TIEMP
O
METODO
UTILIZADO
Secretaria del
Grupo de
Microbiología
5 años
Eliminación
18. CONTROL DE REVISION.
VERSION
00
FECHA
APROBACION
AA
MM
DD
201
03
09
1
DESCRIPCIÓN
Creación de documento
19. ANEXOS.
Anexo 1. Resultado mezcla BDE del control positivo
A
B
C
D
A
B
C
Fluoróforo
FAM
CFO560
CFR610
Identifica
Grupo B
Grupo D
Grupo E
C(t)
20.3
19
20.7
Quasar670
InvA
20.8