1. No category

Partikelfiltrering med
fotosyntetiserende bakterier
Projekt Forskerspirer 2013 – NAT
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
Indhold
Problemformulering ...................................................................................................................................... 3
Afgrænsning: ................................................................................................................................................. 4
Modellen............................................................................................................................................................ 4
Metode: ............................................................................................................................................................. 5
Atomic Force Microscopy .......................................................................................................................... 6
Photolitography ......................................................................................................................................... 5
Live/Dead staining ..................................................................................................................................... 6
CO2 optagelse ............................................................................................................................................ 6
Forsøg/ fremgangsmåde ................................................................................................................................... 7
Budget Materialer: .................................................................................................................................... 7
Tidsramme ................................................................................................................................................. 8
Konklusion/perspektivering .............................................................................................................................. 8
Kontakter ........................................................................................................................................................... 9
Litteraturliste ..................................................................................................................................................... 9
Bilag 1. ............................................................................................................................................................. 11
Side 2 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
I en verden, hvor der hver dag bliver offentliggjort nye alarmerende resultater om den globale opvarmnings
indvirkning på klodens liv, er det vigtigt at ændre vor levestil. Der er langt mellem opfindelsen af nye
revolutionerende energikilder, der ikke er skadelige for livet på jorden og er realiserbart på industriel skala.
Indtil denne bliver opfundet og implementeret, må der i stedet findes andre løsninger for at gøre livet
tåleligt. De energikilder der benyttes i industrien og i motorparken er ikke optimale, da de er kilde til stor
udledning af partikler som CO2, SNOXs og tungmetaller. Luftforurening er et stort problem i mange større
byer, hvor man i de værste tilfælde kan observere skyer af smog, der dækker byerne. I Danmark indføres
landsdækkende og lokale tiltag for at forbedre luften for borgerne og nedbringe partikelindholdet i luften1,
men hvad hvis man kunne udnytte de stationære objekter, som byerne er fyldt med, til at opsætte
elementer, der på organisk vis kunne rense luften?
En mulig kandidat til at rense luften er cyanobakterier, som driver deres metabolisme gennem
fotosyntesen, hvor de reducerer CO2 til sukker-molekyler. Diversiteten af organismer på jorden er enorm,
men alle organismer kræver tre basis ting: en energi kilde, en elektron donor, samt en carbon kilde.
Cyanobakterier har solen som energi kilde, deres elektron donor er vand, og carbon kilden er CO2. Solens
energi bruger cyanobakterien til at splitte H2O til hydrogen og ilt, hvor hydrogenet bliver brugt i en
reaktion, der reducere CO2 til kulhydrater mens de frigiver oxygen molekylerne som et rest-produkt.
Cyanobakterien er en af de ældste organismer på jorden og menes at være skaberen af en iltindeholdende
jord. Med dens indhold af klorofyl a er den i stand til at udføre fotosyntese på lige fod med eukaryoter, og
er dermed sin egen energiforsyning. 2
Jeg har valgt at arbejde med dette projekt fordi jeg ved projekt Forskerspirers start havde undersøgt ”måskunst” i min fritid, og i den forbindelse blev jeg fascineret af ideen om at udvikle en overfladebehandling,
som ville være i stand til at optage større mængder CO2 fra luften i mere systematisk form.
Problemformulering
Projektet arbejder ud fra problemformuleringen:
Er det muligt at opbygge et system, som optager CO2, og dermed renser luften, ved brug af cyanobakterier?
Formål
Formålet med projektet er at finde en metode, hvorpå man ved brug af organisk materiale, cyanobakterier,
vil kunne udnytte naturlige systemer til at rense for CO2 i områder særligt udsat for luftforurening.
1
http://www.mst.dk/NR/rdonlyres/1C0DEF03-CDDA-4D7F-BA73E63B0132420F/0/Luftkvalitetsplanrenereluftibyerne_26_10_09.pdf
2
http://www.ucmp.berkeley.edu/bacteria/cyanointro.html
Side 3 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
Det ønskes derfor at undersøge, hvorvidt det er muligt at integrere de levende celler i et kunstigt system,
hvori de skal overleve og udføre den fotosyntetiske proces.
Derfor beskæftiger projektet sig med at teste effektiviteten af systemet til at fjerne CO2 og hvorvidt cellerne
kan overleve i det kunstige miljø.
Afgrænsning:
Projektet beskæftiger sig udelukkende med at konstruere et system, hvori cyanobakterierne kan overlevere
og optage CO2 fra luften til udførsel af deres fotosyntetiske metabolisme.
Der tages ikke højde for hvad restprodukterne fra systemet kan anvendes til, eller hvordan andre
komponenter af bilers udledning påvirker systemet.
Jeg har valgt at arbejde med cyanobakterier, da de som organisme naturligt laver fotosyntese. En
overvejelse var at bruge alger, da de har en meget høj absorption af CO2, men i forhold til bakterierne
danner algerne mere biomasse. Begge blev valgt frem for at skulle manipulerer med en organisme, for at
den ville have alle de specielle ønskede færdigheder, hvilket ville kræve stort arbejde med at sikre udtryk af
korrekte enzymer og tilføjelse af nødvendige næringsstoffer. Inden for emnet er der forsket en del i at
indfange organismer i sol-gel3, men dette fungerer indtil videre bedst i vand, og i udtørret tilstand falder
enzymaktiviteten markant (Fennouh et al. 2000).
Modellen
Systemet er således konstrueret, at
kanalernes vægge har et hæld på 5°, og en
dybde på 10µm4, bredden på kanalen vil
være ca. 0.5 cm, mens længden på kanalen
ikke er så vigtig, men i et pilotprojekt ca. 10
cm. Dette laves på en glasplade, med den
grund at det benyttede materiale binder
Illustration 1 Egen tegning er Ikke i korrekt størrelses forhold.
Til venstre ses modellen forfra, hvor det sorte er kanalvæggene, og det blå
bakteriekanalerne.
Til højre ses modellen fra siden. Her kan man se den grå overflade til
højre, som er glaspladen, hvorpå modellen er lavet. Modellen er
konstrueret med et hæld på ca. 5° for at der er mulighed for at lave et
tapningssystem bag på glaspladen. Forrest ses tyndfilmen, den lyserøde
flade.
3
4
stærkt til glas.
Tykkelsen af tyndfilmen, der skal over
kanalerne vil i en optimerings fase
bestemmes, så filmen vil have en tykkelse
En kemisk metode hvorved enkeltstående molekyler samles i en opløsning.
Højden på kanalerne kan ikke være større end længden på tippen af cantileveren (se under), da den ellers vil brække.
Side 4 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
der er stiv nok til ikke at falde ned i kanalerne.
Fordelen ved at benytte det samme materiale til kanaler og filter er at det binder utroligt hårdt til hinanden
(Weibel et al. 2007).
Metode:
For at teste systemet vil jeg gennemløbe følgende delforsøg:
•
•
•
Benytte soft-lithography til at skabe bakteriekanalerne og den tyndfilm med huller i som skal lægges
over kanalerne.
o Disse skal så testes med Atomic Force Microscopy
Undersøge cellernes overlevelse over tid ved brug af Live/Dead stain (SYTO9/propidium iodide) og
konfokal laser scannings mikroskopi.
Undersøge i hvilket omfang de overlevende celler optager CO2 og hvorledes optaget ændres over tid.
Photolitography
Photolitography er en metode, hvor man med lys kan overføre et mønster til et materiale, her
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS)5. De 3 hovedstadier i denne metode er coating, exposing og developing. Det
materiale man ønsker at overfører et mønster til, coates først med Hexamethyldisalizane (HMDS) som gør
overfladen hydrofobisk. Dernæst kan primeren (photoresisten) påføres i vakuum under rotation for at opnå
den ønskede tykkelse. Når overfladen er klar, udsættes den for UV lys gennem en maske med det ønskede
mønster. Afhængig af typen af photoresist vil enten det positive eller negative mønster nu fremkomme i
photorisist laget. I developing fasen nedsænkes elementet i en kemisk væske hvor det ubelyste
photorisistlaget opløses. (Weibel et al. 2007, illustration bilag 1).
Photolitography metoden vil blive brugt til at lave master pladen til støbning af PDMS tyndfilmen med 200
nm huller i. Denne form for photolitography kendt som soft-lithography vil blive brugt til at fremstille
tyndfilmen, der fungere som låg til kanalerne samt PDMS-laget med kanalerne. Det er nødvendigt at
hullerne i tyndfilmen er fordelt korrekt og har den rigtige størrelse for at bakterierne kan optage lys og luft,
men samtidig ikke kan komme ud. Tyndfilmen får dermed to funktioner, i) filter ii) diffusion af ilt og CO2 ind
til cellerne.
Hældet på kanalerne dannes under soft-lithografien ved at ændre vinklen hvorpå photoresisten udsættes
for lys (Han et al. 2003). Hældet lader væsken i kanaler løbe så det senere vil være muligt at tappe og
påfylde kanalerne, men samtidig vil det være muligt at opbevarer større mængder væsker, som fx vil være
nyttigt i varme og tørre perioder.
5
Poly(dimethylsiloxane), et elastisk silicone polinomium, som er meget udbredt i industrien, bl.a. i kontaktlinser
(Weibel et al. 2007)
Side 5 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
Atomic Force Microscopy
Atomic Force Microscopy fungerer ved at en cantilever med en nålespidstip (diameter <10 nm og en
længde på 12-18μm) på undersiden bevæger sig skiftevis frem og tilbage henover en overflade som den
enten kan være i konstant kontakt med (”contact mode”), eller cantileveren kan være i konstant vibration
for at holde en konstant afstand til prøven (”tapping mode”). I dette projekt benyttes contact mode da
prøverne er hårde. En laser afspejles på cantileverens overflade og en ændring i højden på prøven når
cantileveren scanner overfladen, vil udgøre en ændring af laserens afspejling som registreres af en
detektor, og det er dermed muligt at tegne et tre-dimensionelt billede af overfladen.6
Scanningen af de skråoverflade vil ikke være et problem, da den kan hejses lidt.
Denne metode vil blive benyttet til at sikre dybden på bakterie-kanalerne skabt ved soft-lithografi er
korrekt, samt at fremstillingen af tyndfilmen er vellykket (Alessandrini and Facci, 2005).
Live/Dead staining
For at undersøge om bakterierne kan overleve i kanalerne benyttes konfokal laser scanning mikroskopi
(Stephens and Allan, 2003) sammen med en Live/Dead farvning. Live/Dead farvning består af SYTO9 og
propidium iodede nukleinsyre farver. SYTO9 trænger over cellemembranen og binder til DNA og RNA,
hvorefter cellen vil lyse grønt. Propium iodide trænger kun ind over ødelagte cellemembraner og binder til
DNA og RNA i den døde celle, og lyser rødt. Der skal udtages en ny prøve til hvert prøvetidspunkt eftersom
Live/Dead staining binder til nukleinsyrer i cellen, og de vil derfor dø efter tid7 (Ibis). Disse prøver vil blive
udtaget ved tappestedet på kanalerne.
Forsøget vil kunne udføres i steril-filteret vand fra hanen. Tyndfilmen med 200 nm huller, vil kunne fungere
som steril-filter under applikation, og dermed filtrere bakterier fra regnvand, og herved sikre, at der kun er
en type bakterie i systemet, så cyanobakterierne ikke bliver udkonkurreret.
CO2 optagelse
For at undersøge CO2 optag og O2 udledning fra de overlevende celler behøves et lukket system som
indeholder en oxygen måler, i form af en O2 MikroOptode (Revsbech et al. 2009), som vil kunne måle
oxygen indholdet ved brøndene. I det lukkede kammer vil sammensætningen og koncentrationen af luften
være kendt ved start, og det vil derfor være muligt at beregne mængden af omdannet CO2 ved at benytte
forholdet mellem CO2 og O2 i fotosyntesen (et omdannet CO2 molekyle er lig et O2 molekyle)8. Endvidere vil
det være oplagt at teste hvad konstant lys, konstant mørke og en dag/nat cyklus har af indvirkning på
6
Se tekst 1.
Se uddybende http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp07007.pdf
8
6 CO2 + 12 H2O → C6H12O6 + 6 O2
7
Side 6 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
cellernes CO2 omdannelses evne. Målinger vil løbende blive foretaget ved brøndene og dernæst blive
ekstrapoleret til at dække hele modellen.
Forsøg/ fremgangsmåde
Først skabes et setup af et array af kanaler skabt med photolitography. Disse undersøges med AFM. I disse
placeres bakterierne i en opløsning med glukose9, hvorefter tyndfilmen påsættes (efter at den ligeledes er
blevet testet med AFM). Nu kan Live/Dead stain og CO2 optag undersøges efter overstående metoder.
Budget
Materialer:
Produkt
Pris10
Cyanobakterie opløsning
Propidium iodid
SYTO9
PDMS
Photoresist
Cantilevers (3 stk)
I alt
414.72
260.64
2.351.00
298.80
881.99
324.27
4531.42 kr.
Udstyr:
Til forsøget skal der benyttes bl.a. O2 MicroOptoden fra Unisense, og andet specialiseret måleudstyr. Dette
og andet udstyr vil være muligt at låne efter aftale med mikrobiologisk institut og iNANO ved Aarhus
Universitet.
Transport:
Transport til Århus fra Odense x antal gange
Andet:
Et mindre budget uforudsete udgifter må indberegnes.
I alt vil projektet have et samlet budget på ca. 10.000 kr.
9
Glukoses tilstedeværelse modvirker krystaldannelse, så blanding ikke fryser i koldt vejr. DMSO (Dimethyl sulfoxide)
kan også benyttes, men vil på lang sigt blive dyrt og danner en ubehagelig lugt når cellerne vokser heri.
10
Priser oplyst på lifetechnoligies.com, spmtips.com/afm-tip-hq-csc17-al-bs og sigmaaldrich.com d. 24/10-13
Side 7 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
Tidsramme
Fase 2 kan begynde når fase 1 er afsluttet. Fase 3 og 4 kan påbegyndes samtidig, da man fra systemet
udtager celleprøver til Live/dead staining, mens man til tidspunktet t, foretager en måling af oxygen over x
antal af brønde, som derefter ekstrapoleres til hele opstillingen. Med et fungerende tappesystem, vil det
være muligt at tappe celleprøver, selvom opstillingen er i et kammer.
Fase
Hensigt
Fase 1
Skabelse af brønde array og tyndfilm
Fase 2
ATM test på begge overflader
Fase 3
Live/Dead staining
Fase 4
CO2 optag
Sammenlagt tid ca. 33 dage.
Tid
2 dage
1 dag
30 dage11
30 dage
Konklusion/perspektivering
Efter at systemet er testet vil det næste arbejde omhandle at udvikle systemet med et tapningssystem af
kanalerne sådan at kanalerne vil blive tømt for en del af den dannede biomasse (cyanobakterierne), og
muligheden for at tilføje ekstra vand og næringsstoffer.
I det videre arbejde vil det også være vigtigt at se på resultaterne fra lys/mørke forsøgene der blev
foretaget. Her vil man kunne se om bakterierne har brugt ”mørke-tiden” til at omdanne kulhydraterne til et
andet stof, samt om der er en ”opstarts-tid” ved dag/nat cyklussen, hvor cellerne ikke er så effektive, som
ved konstant sollys.
Dette projekt vil kunne anvendes til ophængning på bygninger og her rense luften for CO2. Projektet som
det fremstilles her skal ses som et pilot projekt, og kan videreudvikles i mange retninger.
Det første skridt vil være at udbygge systemet således at man fx ville have mulighed for indbygge det i
byggematerialer som benyttes til at beklæde bygningen, således at det både vil være mere æstetisk at se
på, samtidig med at man ikke skulle bekymre sig om placering ift. ydre påvirkning såsom berøring,
ekskrementer fra forskellige dyrs indflydelse på overfladen og bedre beskyttelse i forhold til vejret og
materialerne systemet er bygget af.
Samtidig vil det være nærliggende at undersøge hvorledes man kan udnytte det biomateriale som
bakterierne producerer bedst muligt (Skjånes et al. 2007)
Ny forskning i forbindelse med udvikling af biobrænsel ser også på fotosynterende bakterier som mulige
stor producenter af billigt sukker12. Her kunne en evt. brug af bakterierne fra systemet også tænkes.
11
12
Samtlige prøver opstartes på samme tid, hvorefter prøverne udtages ved 0, 24, 72, 240 og 720 timer.
http://www.technologyreview.com/news/423442/engineered-organisms-for-making-cheap-sugar/page/2/
Side 8 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
Kontakter
Morten Hyldgaard
Ph.d. studerende iNANO, Århus Universitet
Katrine Heinsvig Kjær
Post doc. Institut for Fødevarer, Århus Universitet
Litteraturliste
Artikler :
Alessandrini A and Facci P (2005). AFM: A versatile tool in biophysics. Meas. Sci. Technol. 16 (2005) R65R92.
Fennouh S, Guyon S, Livage J og Roux C (2000). Sol-Gel Entrapment of Escherichia coli. Journal of Sol-Gel
Science and Technology 19, 647-649, 2000.
Han M, Lee W, Lee SK, og Lee SS (2004). 3D microfabrication inclined/rotated UV lithography. Sensors and
Actuators A: Physical, Vol:101, issue 1.
Revsbech NP, Larsen LH, Gundersen J, Dalsgaard T, Ullao O og Thamdrup B (2009). Determination of ultra
low oxygen minimum zones by the STOX sensor. Limnol. Oceanogr.: Methods 7, 2009, 371-381.
Skjånes K, Lindblad P og Muller J (2007). BioCO2 – A multidisciplinary, biological approach using solar energy
to capture CO2 and H2 and high value products. Biomolecular Engineering 24 (2007) 405-413.
Stephens D and Allan V (2003). Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging. Science April 2003, vol:
300.
Weibel D, DiLuzio W and Whitesides G (2007). Microfabrication meets microbiology. Nature March 2007,
vol:5.
Andre tekster:
Tekst 1: Hyldgaard, M., 2010, Master thesis, ”A Study on the Antimicrobial Mode of Action of
Monocaprylate”, side 97-100.
Websider:
http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp07007.pdf (info om live/dead stain)(Besøgt d. 18/10-13)
Side 9 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Mulernes Legatskole
http://www.mst.dk/NR/rdonlyres/1C0DEF03-CDDA-4D7F-BA73E63B0132420F/0/Luftkvalitetsplanrenereluftibyerne_26_10_09.pdf (miljø tiltag)(Besøgt d. 18/10-13)
http://www.technologyreview.com/news/423442/engineered-organisms-for-making-cheap-sugar/page/2/
(sukker til brændsel)(Besøgt d. 24/10-13)
http://www.ucmp.berkeley.edu/bacteria/cyanointro.html (cyanobakterier)(Besøgt d. 17/10-13)
http://www.youtube.com/watch?v=1bxf9QRVesQ (video om photolitografi) (Besøgt d. 9/10-13
Side 10 af 11
NAT
Forskerspirer 2013
Ester Maria Gill
Bilag 1.
Taget fra Wiebel et al. 2007
Side 11 af 11
Mulernes Legatskole