1. No category

Biosensoreiden uudet sovellusalueet
teollisuuden mittauksissa
Vesa Virtanen
Biotekniikan laboratorio
Kajaanin yliopistokeskus
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Miksi kiinnostus biosensoreihin?
Biosensorit ovat:
• Tärkeitä työkaluja kliinisessä ja ympäristö diagnostiiikassa, lääkemonitoroinnissa, ruoan turvallisuuden tarkkailussa ja sodankäynnin varoitussysteemeissä (turvallisuus)
• Tärkeitä laitteita tarjoten yksinkertaisuutta sekä
analyyttisessä laboratoriossa että kentällä.
• Selektiivinen, nopea ja herkkä instrumentti
kemiallisten ja biokemiallisten kohdeyhdisteiden
määrittämiseen
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Biosensoreiden markkinaosuus
$7.3 miljardia 2003
10.2 miljardia2007
Kasvuvauhti noin
10.4%
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
MIKÄ ON BIOSENSORI?
“Klassinen” Määritelmä
Bio tunnistava Muunnin
elementti
Signaalin
ulostulo
Entsyymit
Sähkökemiallinen
Vasta-aineet
Optinen
Vastaanottajat Magneettinen
Kokonainen solu ...
...
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
BIOSENSORIT- Historia
•
•
•
•
•
•
1956: Oxygen electrode (Clark)
1962: Enzyme electrode
1972: Commercial glucose sensor (YSI)
1975: Microbe-based biosensor
1983: Surface plasmon resonanse (Biacore)
1987: Screen printed enzyme electrode
(MediSens)
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Biosensori sovelluksia
•
•
•
•
Terveydenhoito ja diagnostiikka
Ruoan laadun määrittäminen
Ympäristön saastuttajien määrittäminen
Teollisuuden prosessikontrollit
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Tavoite
• Kehittää biosensoreita ja menetelmiä,
joilla voidaan spesifisesti määrittää
haluttuja biomolekyylejä ja metalleja
liittyen ihmisfysiologisiin ja vesi- sekä
ympäristömittauksiin useita eri
tekniikoita hyväksi käyttäen.
• Kehittää mittalaite, jossa
hyödynnetään yo. menetelmiä
V V 20.4.2010 Analytiikkapäivät,
Kokkola
Pintaplasmoni resonanssi biotunnistus
(SPR)
•Erittäin herkkä menetelmä
•Voi olla pieni ja kannettava
• Reaali aikainen analyysi,
ei leimaamistarvetta
Reflection coefficie
1.0
TYPICAL REAL TIME SPR SENSORGRAM
Association
Dissociation
Regeneration
Ir
R=
Refractive Units
Baseline
Sensor surface
Ii
R

Time
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Sähkökemiallinen Biotunnistus
Kannettava Potentiostat
Screen printed electrode
V V 20.4.2010 Analytiikkapäivät,
Kokkola
SPR:n ja sähkökemiallisten tekniikoiden
yhdistäminen samaan
Portable Potentiometer
Spreeta flow-cell and
housing
Screen Printed Electrode
Spreeta sensor
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Kannettavan laitteen kehitys
•Useita määritysalueita
•Näytekammio ja näytteen
käsittely
+Potentiometer
•Näytteen jakaminen
useampaan linjaan
•Näytteen siirto
määritysalueille
• Yhteistyö muiden toimijoiden
kanssa
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
ENTSYYMI BIOSENSORi
Pesticides
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Magneettisten kuulien hyödyntäminen
Magnetic bead
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Magneettisten kuulien tuottamat
edut
•
•
•
•
Ei riipu diffuusio asteesta
Esikonsentrointi ja näytteen puhdistus
Sensori voidaan uudelleenkäyttää
Voidaan käyttää useanlaisten
reseptoreiden kanssa (esim. DNA probes,
polymeeri reseptorit jne.)
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Immunosensori: suora analyytin
detektointi
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Integroidun nestevirtauspiirin
yhdistäminen
•Reservoir filled with NaSO4
R2=0.9714
100
•Sample chambers filled
Flow rate (µl/min)
80
Electrode connectors
for electrochemical
pump
60
40
20
80mm
0
0
Double sided
Adhesive
gasket tape
4
Direct current (mA)
Gold sensing
surface
25mm
6mm
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
2
6
8
Ihmisfysiologiset muutokset
ja biomarkkerit
• Pitkäaikaisessa fyysisessä rasituksessa tapahtuu fysiologisia
muutoksia ihmiskehon “biologisessa kemiassa”
• (esim. Kortisoli, Laktaatti, a-Amylaasi, vasta-aineet, Proteiinit,
Elektrolyytit)
• Näiden yhdisteiden pitoisuus voi antaa hyvän yleiskuvan yksilön
terveydestä, kunnosta ja suorituskyvystä
• Useat yhdisteet relevantteja sekä liikuntateknologisiin että
terveydenhuollollisiin määrityksiin
• Nämä yhdisteet voidaan mitata verestä, seerumista ja virtsasta.
V V 20.4.2010 Analytiikkapäivät,
Kokkola
Ihmisfysiologiset mittaukset;
Miksi sylki ?
• Helppo, ei-invasiivinen näytteenotto aiheuttamatta
stressiä ja epämiellyttävyyttä yksilölle (esim. Pienet
lapset ja vanhukset, verisuonten vaikea löytäminen)
• Hyvä korrelaatio veri- ja seeruminäytteisiin.
Kiinnostavat yhdisteet
Vasta-aine IgA, IgG
a-Amylaasi
C-Reaktiivinen proteiini
(CRP)
Indikoi tulehduksia ja immunologisia muutoksia
liittyy anaerobiseen kynnykseen ja stressistä
palautumiseen
Tulehduksen biomarkkeri
Kortisoli
Stressistä palautuminen ja ylirasitus
Laktaatti
Anaerobinen ja aerobinen kynnys
Insuliini
Ravinnollinen glykeminen indeksivaste ja
resistanssi
V V 20.4.2010 Analytiikkapäivät,
Kokkola
Biosensorikehitys, ihmisfysiologia
Optinen
Suface Plasmon Resonace
Sähkökemiallinen
(Screen Printed Electrodes)
Sylki IgA
Kortisoli
CRP
α-Amylaasi
Lääkeaineet
Laktaatti
IgG
Insuliini
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
SPR Samanaikainen C-reaktiivisen
proteiinin (CRP) ja Kortisolin määrittäminen
120
%Incremental change
of Refractive Index (RI)
100
80
60
40
20
Cortisol
CRP
Fitted curve for cortisol(5)
Fitted crve for CRP
0
1E-6
1E-5
1E-4
1E-3
0.01
0.1
1
[µg/L]
Spreeta SPR laitteella
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Syljen L-Laktaatin määrittäminen
LAKTAATTI + O2
H2O2
µA
O-
O
+
LOX
H2O -------> PURYVIINIHAPPO +
-O
O
0.0
+
HO
o
O
2
PB (rid)
+
H2O2
CH3
CH3
2)
+
H2O2
PB (ox)
+
e-
OH-
Intensity of Current(uA)
1)
-0.5
-1.0
-1.5
0
Graphite modified with Prussian blue
50
100
150
200
time(s)
Kalibrointi sensorigrammi käyrät
PalmSens laitteelta saatuna
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
s
Laktaatin määrittäminen
1.2
y = 3,2249x + 0,01
2
R = 0,9986
1
Intensity of current(uA)
Intensity of current(uA)
1.2
0.8
0.6
0.4
0.2
y = 3.369x + 0.0532
R2 = 0.9989
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
[Lactate](mM)
Inter electrode
repeatability n=5
0
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
[Lactate](mM)
Intra electrode
repeatability, n=3
LOD: 0.01mM
Working range: 0.01 – 0.30mM
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Reaalinäytteen tyypillinen pitoisuus 0.1-3.0mM
0.35
Printattu elektrodi modifioituna
nano-komposiitti materiaalilla
Sol-Gel Matrix
LDHMB+
Si
O
CNT
Si
O
MB+
O
MB+
O
O
CNT
O
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Si
CNT
O
O
LDH
Si
MB+
O
LDH Si
Si
MB+
Electrode
Configuration
O
O
LDH
Si
O
Sol-gel matrix
O
CNT
O
MB+
Si
MB+
LDH = Laktaatti
dehydrogenaasi
MB = Meldola
Blue
CNT + Mediator + LDH
Screen-printed electrode
Sol-Gel modifioituna hiilinanoputkilla
(CNT)
1200
CNT1 = jauheessa
1000
CNT2 = suspendoituna
DMF:ään
600
600
400
MB/SolGel
MB+CNT1/SolGel
200
MB+CNT2/SolGel
0
0
1
2
3
4
NADH (mM)
5
6
MB+CNT2/SolGel
500
400
I (nA)
I (nA)
800
MB+CNT1/SolGel
300
MB/SolGel
200
100
0
Herkkyyden parantuminen
Arvinte, A., Sesay, A. M., Virtanen, V., and Bala, C.
V V 20.4.2010
ELECTROANALYSIS 20 (2008) 2355-2362
Analytiikkapäivät, Kokkola
Sol-Gel modifioituna hiilinanoputkilla
(CNT)
CNT1 = jauheessa
CNT2 = suspendoituna
DMF:ään
•:(a) MB-SWNT-SG/SPE, (b) MB-SG/SPE ja (c) SWNT-SG/SPE; E=-50 mV;.
Herkkyyden parantuminen
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Arvinte, A., Sesay, A. M., Virtanen, V., and Bala, C.
ELECTROANALYSIS 20 (2008) 2355-2362
α-Amylaasin määrittäminen
β-D-Glucose
Mutarotase
GOD
Prussian Blue
OH-
α-D-Glucose
ePB
(ox)
H2O2
Gluconic
Acid
Maltotriose
(G3)
+
Maltose
(G2)
β-D-Glucose
Maltopentose
α-Amylase
O2
α-GD
PB
(red)
α-D-Glucose
+
β-D-Glucose
Maltose
(G2)
+
Maltotriose
(G3)
Reaktioketju
Micheli,L., Caprio, F., Mahosenaho, M., Sesay, A., Palleschi, G. , and Virtanen, V. (2010)
•A disposable biosensor for the determination of alpha-amylase in human saliva
Microchimica Acta, in press
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Tuloksia α-Amylaasille
800
y = 3,0705x
R2 = 0,9799
700
600
Current (nA)
500
400
U/ml
Amylase
Lineare
(U/ml
Amylase)
300
200
100
0
0
50
100
150
U/ml Amylase
Saman elektrodin
toistettavuus, n=4
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
200
250
α-Amylaasi biosensori parametrit
LOD
mM
0,01mM
Working range
(mM)
0,O1-0,30
Average RSD%
INTRA ELECTRODE
Average RSD%
INTER ELECTRODE
7%
10%
Sensitivity
A*cm-2/mM*
26
Glukoosi
Maltoosi
Maltotrioosi
α-Amylaasi
Lineaarisuus
(R2)
0.998
0.993
0.998
0.998
Alue
0.05 –
1mM
1-100mM
10-100mM
10-230 U/ml
LOD
0,05mM
1mM
20 mM
15 U/ml
Aikuisnäytteen keskiarvo 92.4 U/ml
Micheli,L., Caprio, F., Mahosenaho, M., Sesay, A., Palleschi, G. , and Virtanen, V. (2010)
•A disposable biosensor for the determination of alpha-amylase in human saliva
Microchimica Acta, in press
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Sähkökemiallinen sensori vs kaupallinen kit
•vertailukuvaaja sähkökemiallisen sensorin ja kaupallisen kitin antamista
tuloksista verrattuna laskettuihin arvoihin
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Vesi ja Ympäristömittaukset
elektrokemiallisilla menetelmillä
Raskasmetallien (Pb, Cd, Zn, Cu, Ni, Co, Mn jne)
elektrokemiallisen määrityksen edut verrattuna muihin
tekniikoihin (AAS, ICP):
-Nopeus
-Herkkyys
-Selektiivisyys
-Yksinkertaisuus
-Edullisuus
-Online-mittaus
-Soveltuvuus kenttäkäyttöön Copyright PalmSens
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Kiinnostavat yhdisteet
Raskasmetalli ionit
(Pb, Cu, Ni, jne....)
Teollisuuden prosessivedet–
Ympäristösovellukset
bakteerit
Teollisuuden prosessivedet–
Ympäristösovellukset
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Differential pulse anodic stripping
voltammetry (DPASV)
• Perustuu metalli-ionin pelkistämiseen elohopea(Hg)päällysteiselle elektrodille sopivalla potentiaalilla Ered,
jolloin muodostuu amalgaami-yhdiste:
Mx+ + x·eM0 (Hg)
M = esim. Pb, Cd, Zn, Cu, Mn
• Skannattaessa potentiaalialue anodisesti metallit
hapettuvat kullekin ominaisessa potentiaalissa Eox
• Yhdellä mittauskerralla jopa 4-6 analyytin määritys
• Samaa elektrodia voidaan käyttää useita kertoja
Kaupalliset analysaattorit yleensä yhdelle metallille!
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Cu, Pb: Square wave anodic stripping
voltammetry (SWASV)
0 ppb
24
• Kuparin ja lyijyn määrittäminen samasta
20
näytteestä
50 ppb
100 ppb
200 ppb
16
dt/dE, s/V
500 ppb
12
I. Tothill et all
8
4
0
0
-0,2
-0,4
Potential, V
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
-0,6
-0,8
Kuparin elektrokemiallinen
määrittäminen vesinäytteestä.
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Menetelmä: Square wave voltammetry
Elektrodi: Mercury+Methocel -coated SPE
Kuparin lineaarisuus
Copper content vs. peak area
Peak area VuA
2,5
R2 = 0,9996
2
1,5
1
0,5
0
-0,5 0
0,1
0,2
0,3
0,4
Copper content ppm
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
0,5
0,6
Ni, Co: Differential Pulse Adsorptive
stripping voltammetry (DPAdSV)
• Menetelmä käytössä tietyille metalleille (esim. Ni ja Co),
jotka eivät muodosta amalgaamia elohopean kanssa
→ tarvitaan lisäksi kompleksinmuodostaja
(dimetyyliglyoksimi, DMG):
Ni2+ + 2 DMGH2 + 2 e- → Ni(DMG)2
muodostunut kompleksi adsorboituu elektrodille
• Kehittämistarpeet:
- Elektrodeissa käytetty elohopea korvaaminen
vähemmän myrkyllisellä yhdisteellä, esim. vismutilla (Bi)
→ hapenpoistoa ei tarvita
-kompleksinmuodostajaksi nioksimi
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Entsyymin inhibitioon perustuva
nikkelin (Ni2+) määritys
• Sarkosiini oksidaasi -entsyymi pilkkoo
sarkosiinin tuottaen samalla vetyperoksidia
• Vetyperoksidi mitataan Prussian Blue –
modifioidulla elektrodilla
• Nikkeli inhiboi entsyymiä, jolloin
vetyperoksidia muodostuu vähemmän
Entsyymi
Ni2+
sarcosine + H2O + O2 → glysiini + formaldehydi + H2O2
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Vesi- ja Ympäristö sovellutukset;
Tulevaa
• Sensoreiden kehitys kaivosten
poístovesien metallipitoisuuksien
monitorointiin
• Myös muut vedet
• Myös eloperäiset määritykset vesistä
• Bakteerien määrittäminen
• On-line määrittäminen
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Tulevaisuuden
biosensorisovellukset
• Henkilökohtaiset point-of-care laitteet
• Dynaamiset non-invasiiviset ja invasiiviset
sensorit
• Henkilökohtaiset terveys ja fitness
monitorit
• Interaktiiviset ympäristösensorit ja
aktiiviset suojauslaitteet
• Teollisten prosessien tarkkailu ja säätö
• Uudet sovellusalueet
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
Ympäristösensorit / Minewater
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola
•
Sähkökemiallisten ja biosensorien
kehitys kaivos- ja ympäristövesien
metallipitoisuuksien
määrittämiseen
•
Minewater/TEKES Vesi-ohjelma
2009-2011
•
Yhteishanke Moniwaterin kanssa
(VTT vetoinen)
•
Partnerit: Mila, TTY,SYKE, MIKES,
Outotech, Agnico-eagle,
Pyhäsalmi Mine, Labtium, EHPtekniikka
V V 20.4.2010
Analytiikkapäivät, Kokkola