1. No category

FUNKCIJSKA GENOMIKA
FUNCTIONAL GENOMICS
PROTEOMIKA - PROTEOMICS
Molekulska medicina:
• molekulske osnove
bolezni
• molekulska daignostika
• gensko zdravljenje
• drugi terapevtski pristopi
Klasičen pogled / pristop
Normalen gen
Normalen
protein
Normalna
lastnost
mutacija
Spremenjen
protein
Spremenjena
lastnost
Mutiran gen
Pri “enostavnih boleznih” preiskujemo enega ali nekaj genov / proteinov.
Številne bolezni so zapletene (večgenske večfaktorske); primer: rak.
Mutacije
onkogenov in
zaviralnih
genov.
Predhodne
mutacije DNApopravljalnih
genov.
Mutacije v
„genih
gospodarjih“
so vzrok
anveploidnosti
Anevpoidnost
kot posledica
naključnega
dogodka med
celično
delitvijo.
Tukaj so predstavljene 4 hipoteze nastanka in razvoja raka, ki zajemajo različna sosledja molekulskih
dogodkov (genske mutacije in posledice) in vpletenih komunikacijskih / metabolnih poti.
Scientific American, 2004
(Ena od hipotez nastanka in razvoja raka (hipoteza 4 iz predhodne slike)
Genske variante (polimorfizmi) in fenotip – primer: tvorba delitvenega vretena / segregacija kromosomov
?
?
V nek celičen fenotip je lahko vključenih na desetine ali stotine genov ( z majhnimi posameznimi učinki) oz. njihovih proteinskih produktov;
vsakega si npr. predstavimo kot vozliček v komunikacijski / metabolni mreži. Ta je tukaj ponazorjena kot teniška mreža (levo) oz. njena
različica (desno) – raven posameznih proteinov (vozličkov) se zaradi majhih genskih razlik (polimorfizmov) pri dveh posameznikih razlikuje; v
tem pogledu je tudi odboj teniške žogice (ta je zunanji vpliv, v konkretnem primeru n.pr. hormonska spodbuda) med dvema mrežama
(posameznikoma) razlikuje. Posledica so razlike v fenotipu; v primeru raka različna nagnjenost do nastanka bolezni.
FUNKCIJSKA GENOMIKA
Celico
obravnava
kot
sistem
sočasne
(kvalitativno
in
kvantitativno)
navzočnosti
bioloških molekul ter njihovih komunikacij
(preplet molekulskih dogodkov) v preučevanih
fizioloških razmerah.
Svet “omik”:
• transkriptomika
• proteomika
• metabolomika
• interaktomika / sistemska biologija
Za sočasno preučevanje velikega števila molekul in
molekulskih dogodkov so bila in so v razvoju nova
orodja ter eksperimentalni pristopi – diferenčno
preučevanje pri iskanju bioloških označevalcev
patogeneze.
Zanima nas razlika in ključni “igralci” teh razlik.
“Normalno fiziološko stanje”
N
“Bolezen”
T
Vsaka točka mikoromreže (DNA-čipa) vsebuje
določeno število molekul gensko-specifične
sonde (oliogonukleotid, PCR amplikon...).
Zaradi možnosti primerjanja je število
(koncentracija) sond v vseh točkah enako.
Pri proteinski mikromreži so sonde npr.
specifična protitelesa.
Tukaj je nazorno prikazana uporaba ekspresijskega DNA-čipa (mikromreže) pri diferenčnem
preučevanju dveh fizioloških stanj kvasovje S. cerevisiae – v navzočnosti (aerobioza) oz. v
odsotnosti kisika (anaerobioza). Pričakujemo razlike v izražanju (nekaterih) genov.
Genske /
proteinske
gruče.
Primer identifikacije
molekulskih podskupin
raka z analizo
transkriptoma oz.
proteoma (DNA-čip /
proteinska mikromreža)
Z uporabo kvasnega dvohibridnega sistema lahko
ugotovimo, s katerimi proteini
interagirata / komunicirata in s tem
odkrijemo njuno komunikacijsko
oz. metabolno mrežo. Katerikoli
protein v tej mreži je tudi lahko
potencialna tarča pri razvoju
biološkega zdravila.
TRANSKRIPTOMIKA – PROTEOMIKA - METABOLOMIKA
TRANSCRIPTOMICS – PROTEOMICS - METABOLOMICS
PROTEOMIKA vs. TRANSCRIPTOMIKA
Pristopi genomike in transkriptomike so še vedno enostavnejši.
Vendar:
Proteini so dejanski “igralci” celične zgradbe in delovanja.
Od transkriptoma do proteoma dejansko lahko poteče mnogo sprememb.
“Celični proteom”
Pri zapletenih (kompleksnih) boleznih nas zanima sistemsko (globalno) stanje
in prepletanje sistemskih (globalnih) dogodkov.
“Normalno”
“Spremenjeno”
“Celični proteom”: komunikacijska mreža
Pristopi genomike in proteomike.
Pri analizi proteomov je
pomembna vrsta in kvaliteta
izhodiščnega materiala (tkiva,
celice), iz katerih pripravimo
proteinske ekstrakte / frakcije.
Tkiva
Tkivne celice
Celične kulture
Izbira vzorca
(celičnega tipa)
Heterogenost celičnih tipov v biološkem vzorcu.
LASERSKA MIKRODISEKCIJA
(“LASER-CAPTURE” MICRODISSECTION, LCM)
pred
potem
sortirane
celice
Priprava tkivnih / celičnih homogenizatov
Potter-Elvehjem homogenizator
Tekoči dušik - terilnica
Francoska preša
Električni:
mlinčki,
aspiracijski
mešalci, nožki.
sekalci ...
Ultrazvok
Ekstrakcija / frakcioniranje
proteinov
Gradientno frakcioniranje
proteinov
Gradientno frakcioniranje
proteinov
Amonsulfatna precipitacija
proteinov iz raztopine
proteinov po frakcioniranju.
Dializa proteinskega vzorca (raztopine proteinov)
po amonsulfatni precipitaciji.
Sledi nadaljnje prečiščevanje / ločevanje proteinov z uporabo kromatografskih metod.
Velikostno-izključevalna kromatografija: gelska filtracija - molekulsko sito
Sigma Aldrich
Ionsko-izmenjevalna
kromatografija
Izključitvena
kromatografija
Afinitetna
kromatografija
Afinitetna kromatografija
Immobilized metal-affinity chromatography
(IMAC)
Nosilci (matrice) s 4 koordinativnimi vezmi vežejo kovinske
ione, peta je prosta za a. k. proteina, ki ga ločujemo.
Kovinski ioni, imobilizirani na nosilcu: Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+
Iminodiacetic acid (IDA)
Nickel-nitrilotriacetic acid (Ni2+-NTA)
Co2+–carboxylmethylaspartate (Co2+-CMA)
Najboljša vezava: histidin (6-histidinski rep).
Spiranje.
Elucija: pH gradient ali dodatek prostega imidazola.
Imunoafinitetna kromatografija
Obratna imunoafinitetna kromatografija
Protiserum
- Nosilec
- Antigen
Nespecifična
protitelesa
Specifična
protitelesa
HPLC – visokozmogljivostna tekočinska kromatografija
Vrste tekočinske kromatografije:
- Ionsko-izmenjevalna: stacionarna faza – površinski naboj nasproten naboju ionov vzorca (ionski oz.
ionizabilni vzorci). Ioni z močnejšim nabojem se močneje vežejo in potujejo počasneje. Mobilna faza je pufer z
določenim pH in ionsko močjo.
- Adsorpcijska: stacionarna faza je adsorbent (npr. silikagel). Ločevanje poteka po načelu ponavljajočih se
stopenj adsorpcija-desorpcija.
- Velikostno-izključitvena: v koloni je porozen material z določeno velikostjo por. Večje molekule potujejo
hitreje, manjše pa zaostajajo v porah.
Dva tipa ionsko-izmenjevalne kromatografije: (A) normalna (stacionarna faza je zelo polarna (npr. silikagel), mobilna pa nepolarna (npr.
n-heksan ali tetrahidrofuran); (B) z obratno fazo (stacionarna faza je nepolarna (hidrofobna), mobilna pa polarna (npr. voda/metanol ali
acetonitril). Hidrofobne molekule tu potujejo počasneje.
High-performance liquid
chromatography (or high-pressure
liquid chromatography, HPLC)
)
(1) Solvent reservoirs, (2) Solvent degasser, (3) Gradient valve, (4) Mixing vessel for delivery of the mobile phase,
(5) High-pressure pump, (6) Switching valve in "inject position", (6') Switching valve in "load position", (7) Sample
injection loop, (8) Pre-column (guard column), (9) Analytical column, (10) Detector (i.e. IR, UV), (11) Data
acquisition, (12) Waste or fraction collector.
Hitra tekočinska proteinska kromatografija - Fast protein liquid chromatography
(FPLC)
FPLC je namenjena izključno proteinom in
ima zaradi velikega izbora kolon številne
aplikacije. Za razliko od HPLC je tukaj tlak
pufra razmeroma majhen (pod 5 barov),
hitrost pretoka pa višja (1-5 ml/min). Metoda
omogoča analizo majhnih (mg količine / 5ml volumen) in velikih (kg količine / litrski
volumni).
AKTA FPLC
Vnaprej pripravljene (komercialne) kolone za: ionsko-izmenjevalno
kromatografijo, gelsko filtracijo (izključitveno kromatografijo),
hidrofobno kormatografijo, afinitetno kromatografijo. Uporabne so tudi
pri HPLC, pod pogojem, da tam z nižamo pritisk do max. 3-4 MPa
(435-580 psi).
IEF: Izoelektrično fokusiranje
Amfoliti so
amfoterne
molekule, ki
vsebujejo kisle
in bazične
skupine; pri
določenem pH
so v obliki ionov
dvojčkov
(zwitterioni).
Poliamfoliti,
poliamini...
SDS-PAGE: poliakrilamidna gelska elektroforeza
SDS: C12H25NaO4S (natrijev dodecil sulfat)
2D elektroforeza je izhodiščna tehnika preiskave proteomov.
(razdelitev vzorca: frakcije za delne preiskave)
Alternativne tehnike po 2D-elektroforezi.
Diferenčna 2D-elektroforeza poteka vzporedno na dveh gelih: preiskovani & referenčni
vzorec
proteinov.
3
3
10
3
10
10
• Fiksiranje gela, barvanje – Sypro,
razbarvanje gela.
• Prekritje gelov (N / T), selekcija,
izrez diferenčno izraženih proteinov
(lis).
•Specifična “in gel" triptična
razgradnja (digestija; Asn, Lys).
• Ekstrakcija peptidov.
Programi za obdelavo 2D-gelov
Analysis problems:
It can be very difficult to compare the results of two
experiments to yield a differential expression
profile:
Can be severe warping of gel due to
uneven coolant flow
voltage leaks
tears in gel
Can be problems with normalisation of
background
spot intensity
Can be differences in sample preparations.
Z3 system (Compugen) - http://www.2dgels.com/
Melanie3 (SIB) - http://us.expasy.org/melanie/
ProteomWeaver (Definiens) - http://www.proteomweaver.com/
PDQuest (Bio-Rad) - http://www.biorad.com/
Delta2d (Decodon) - http://www.decodon.com/
1. Gel matching, or “registration”, is the process of
aligning two images to compensate for warp.
Some packages still require the user to identify
corresponding spots to help with gel matching.
The Z3 program from Compugen has a fully-automated
gel matching algorithm:
define set of small, unique rectangles.
compute optimal local transformations for
rectangles.
Interpolate to make smooth global transformation.
Note that this makes use of spot shape, streaks, smears
and background structure, which other programs discard.
2. Once the gel images have been matched, the program
automatically detects spots. Algorithms are generally based on
Gaussian statistics.
3. Spot Quantitation: The positions of detected spots are calibrated
to give a pI / mW pair for each protein.
A value for the expression level of the protein can be calculated from
the overall spot intensity.
Some programs do not quantitate each gel separately, but calculate
relative intensity pixel by pixel. This may be a more accurate approach.
The user can set threshold values for the detection of differential
expression. This helps reduce the amount of information displayed at
once.
4. Annotation: Some systems allow semi-automatic annotation of spots,
5. Multiexperimental Analysis: One useful
based on a database of proteins listing their pI / mW values.
Proteins of interest can also be excised from the gel and sent on to mass
spectrometry for definitive identification. The ProteomeWorks system from
Bio-rad offers such an integrated solution for 2D-PAGE and MALDI.
feature of modern programs is the ability to collate
data from many runs of the same experiment.
Spots which only appear in one gel are likely to be
artifacts, and are removed from the analysis.
This is an excellent way to reduce noise and
enhance weak signals.
P. Oledzki, J. Pinney, A.Sivakumar: Proteomics, 2013
Namesto prekritja dveh gelov lahko
preiskavo opravimo z 2D elektroforezo v
enem gelu, z različno obarvanima
vzorcema.
Označevanje
diferenčno
izraženih
proteinov.
Izrez diferenčno izraženih
proteinov.
In-gel digestion
The in-gel digestion primarily comprises the four steps
destaining, reduction and alkylation (R&A) of the cysteines
in the protein, proteolytic cleavage of the protein and
extraction of the generated peptides.
Edman degradation
A method of sequencing amino acids in a peptide.
Phenylisothiocyanate is reacted with an uncharged terminal amino group, under mildly alkaline conditions,
to form a cyclical phenylthiocarbamoyl derivative. Then, under acidic conditions, this derivative of the
terminal amino acid is cleaved as a thiazolinone derivative. The thiazolinone amino acid is then selectively
extracted into an organic solvent and treated with acid to form the more stable phenylthiohydantoin (PTH)amino acid derivative that can be identified by using chromatography or electrophoresis. This procedure
can then be repeated again to identify the next amino acid. A major drawback to this technique is that the
peptides being sequenced in this manner cannot have more than 50 to 60 residues (and in practice, under
30). However, it only uses 10 - 100 picomoles of peptide for the sequencing process.
Mass spectrometry:
Ionization:
ESI: electro spray ionization - a high voltage is applied to a liquid to create an aerosol.
MALDI: matrix-assisted laser desorption/ionization - MALDI is thought to be a three-step
process. First, the sample is mixed with a suitable matrix material and applied to a metal plate.
Second, a pulsed laser irradiates the sample, triggering ablation and desorption of the sample
and matrix material. Finally, the analyte molecules are ionized by being protonated or
deprotonated in the hot plume of ablated gases, and can then be accelerated into whichever
mass spectrometer is used to analyse them.
Mass analysis:
TOF MS: time-of-flight
FT_ICR: Fourier transform ion cyclotron resonance
Peptide mass fingerprinting: for protein identification
Tandem mass spectrometry: for de novo sequencing
MS peptidno profiliranje: primerjanje ugotovljenih peptidnih fragmentov (molekulskih mas) s
podatki (peptidnimi frgamenti) iz podatkovne baze.
MS a.k. sekvenciranje: podfrakcioniranje peptidnih fragmentov v
tandemskem masnem spektrometru in določanje molekulskih
mas fragmentov, ki se razlikujejo za eno a.k.
Prikaz zaporedja tehnik proteinske biokemije in proteomike:
http://www.childrenshospital.org/cfapps/research/data_admin/Site602/mainpageS602P0.html
http://www.childrenshospital.org/cfapps/research/data_admin/Site602/mainpageS602P0.html
PRIMER
IDENTIFIKACIJE
N/T
(MS peptidno
profiliranje)
•2D-DIGE
•DeCyder analiza
‘Gene Scan’-a
•MALDI TOF/MS
N
T
•Podatkovne baze
No. Apparent MW
1
85511
2
110162
3
29338
4
42483
5
20146
6
56644
7
131245
8
24085
9
56714
10
53881
11
53510
12
61235
13
82989
14
6342
15
62092
16
159855
17
42183
18
33121
19
23204
20
18315
pI Mascot search
7,6
Q8TAQ6
6,6 AAF78764
8,5
I52962
9,8 AAD42055
5,4
Q8NA28
6,1
S55507
6,3
Q96Q05
9,6
Q8TBA8
5,3
Q9H6T2
5,7
1CW3A
5,5 K2C8_HUMAN
8,9
Q8NA64
5,6
Q9Y6D9
12
Q96Q56
5,2 CAA82315
7,3 AAD02178
6,5
Q12792
8,8
Q8N9D0
5,4
4PGTB
5,2 CAA57764
V ratio
-6,06
-4,94
-4,74
3,06
3,56
2,87
-3,21
2,79
-5,58
4,37
13,03
-5,13
3,24
2,99
-2,83
-2,78
-2,74
-2,78
2,95
-2,63
Protein ID
Aconitase 2, mitochondrial
Homo sapiens vitamin D receptor-interac...
FBRNP
Homo sapiens NADH-ubiquinone oxidored...
Hypothetical protein FLJ35906 (BAC04101 un...
protein disulfide-isomerase (EC 5.3.4.1) ER60 prec.
Hypothetical protein KIAA1882 (Fragment).
Hypothetical protein (BAC05381 unnamed protein...
Hypothetical protein FLJ21915 (AAH17115 POL...
mitochondrial aldehyde dehydrogenase complete...
Keratin, type II cytoskeletal 8 (Cytokeratin 8)
Hypothetical protein FLJ35804 (XP_351191 simi...
Mitotic checkpoint protein isoform MAD1a
Mitochondrial ribosomal protein L2 (Fragment).H.sapiens mRNA for cytokeratin 9
Homo sapiens synaptojanin 2B mRNA, partial cds
Protein tyrosine kinase 9 (EC 2.7.1.112)
Hypothetical protein FLJ37706 (sr278 gene). (AAH...
glutathione s-transferase (EC 2.5.1.18) mutant
H.sapiens mRNA for thiol-specific antioxidant
Primer: rezultat kombinirane proteomske analize (2D-PAGE / MS) - diferencialno izraženi
proteini pri intestinalni obliki gastričnega adenokarcinoma.
Združevanje
identificiranih
proteinov v
gruče (po
biološki vlogi).
Seveda pa nas zanima, kateri proteini interagirajo oz. imajo komunikacijske povezave.
Kvasni dvo-hibridni sistem je metoda za določevanje interakcij proteinov.
e.g. Cytosceletal
signaling
Cdh1
MYL6, CLDN18 - t.j.
YES1, ACTB, RHOA
TMSL3, PIK3C2A
RDX, PDGFA, PFN1,
TMSB4X, ITGB4,
a.c.
cdc42
Primer ugotovitve
interakcije dveh
preiskovanih
proteinov (obarvano
zeleno), ki ju nato
umestimo v poznano
komunikacijsko
mrežo.
V naslednjem koraku poskušamo najti majhne molekule –
pospeševalce ali zaviralce (odvisno od namena) takega
proteina oz. njihovih partnerjev: načrtovanje in razvoj
ciljnih (bioloških) zdravil.
Diagnostika:
Primer dveh bolnikov z
adenokarcinomom želodca;
na levi sta genski/proteomski
gruči njune normalne
želodčne sluznice, na desni
pa njunih tumorjev. Razlika
na desni nakazuje zelo
različni gruči nad/podizraženih genov/proteinov in
s tem različni molekulski poti
razvoja bolezni.
Systems’ analysis
(transcriptome /proteome)
of
Diffuse Large B-cell
Lymphoma
Plate-forme Puces-à-ADN Gif/Orsay
PROTEIN MICROARRAYS
Example: Development protein biochip for cancer diagnosis
Principle of function of protein chips
Proteins to be
investigated
Protein probes (e.g. antibodies) corresponding to
different proteins attached on solid support
Različne izvedbe proteinskih mikromrež (čipov), odvisno od namena/potrebe.
Different Kinds of Protein Arrays
SENSORICS
Antibody Array
Antigen Array
Ligand Array
Detection by: SELDI MS, fluorescence, SPR,
electrochemical, radioactivity
Najbolj pogosto uporabljeni pristopi izdelave proteinskega bio-čipa.
Standardna izvedba proteinskega čipa z diagnostičnimi protitelesi. Za detekcijo
oz. identifikacijo vezave liganda v tem primeru potrebujemo še sekundarno
protitelo.
Lahko pa se poslužimo tudi enostavnejše, spodaj prikazane izvedbe; v tem
primeru lahko izvedemo diferenčno preiskavo, s proteinskim izvlečkom dveh
vrst tkiv, kjer proteine obarvamo z dvemi različnimi fluorescentnimi barvili.
Nekaj nadaljnih slik prikazuje našo izvedbo (po stopnjah)
protitelesnega bio-čipa za detekcijo vezave ligandov (proteinskih
antigenov) z metodo površinske plazmonske resonance (SPR).
PROTEIN BIOCHIP
1. Immobilization of
protein («capture
agent») on chip
surface.
2. Ligand binding with
corresponding
molecule from the
sample (analyte).
3. Detection and
analysis.
Antibodies
Proteins of
cancer tissue
from biopsy
SPR
-no labeling
-real time
IMMOBILIZATION OF
ANTIBODIES ON CHIP SURFACE
• Availability of
binding sites
(orientation)
•
•
•
•
High density
High specific activity
Uniform kinetic rates
Intact binding
affinities
• Stability
IMMOBILIZATION OF PROTEINS
Možni načini imobilizacije sond (proteinov vezalcev, npr. protiteles) na površino mikromreže.
A/ RANDOM
IMMOBILIZATION
B/
BIMOLECULAR
INTERACTION
HYDROPHOBIC
SURFACES (van
der Waals,
hydrophobic and
hydrogen bonding
interactions)
Using an
intermediate
protein that binds
to the Fc region of
antibodies
(Protein G, A)
C/ SPECIFIC
IMMOBILIZATION
Chemical
functional groups
A/ RANDOM IMMOBILIZATION
(physical adsorption)
HYDROPHOBIC SURFACES
-polystyrene
-gold
-nitrocellulose
-poly-lysine-coated glass
Advantages:
+ simple to perform
+ no modification of the protein
for its attachment to the surface
Disadvantages:
- Denaturation->
inactivation
- Heterogenous
adsorption (clustering
of proteins in patches)
- Steric hindrance
- Steric blockage of the
receptor’s active sites
- Direct chemical
modification of the
antigen-binding site
B/ BIMOLECULAR INTERACTION
•Protein A (Staphylococcus aureus)
•Protein G (Streptococcus sp.)
Bind Fc region of IgG.
Advantages:
+ antibodies are immobilized in an
oriented way
+ higher fraction of active antibodies
+ no modification/labelling of
antibodies
Disadvantages:
- low surface density
- instability of the antibodyintermediate protein interaction
C/ SPECIFIC IMMOBILIZATION
-amine coupling (-NH2) lysine side chain
N-hydroxysuccinimide (NHS) ester)
-thiol coupling (-SH)
-aldehyde coupling (-CHO)
-immobilization of His-tagged proteins (proteins
containing poly-histidine sequence) onto Ni2+chelating surfaces
-biotin:streptavidin coupling (the strongest known
non-covalent interaction between protein and
ligand)
CLEANING OF THE GOLD
SURFACE
• PIRANHA
1:3 (v/v):
- H2O2 (30%)
- H2SO4 conc.


NON-HOMOGENOUS SURFACE
(large surface)
PROBLEMS WITH SALTS, DUST
» SAM «
Self-Assembled Monolayer of Thiols
on Gold
80% 11-Mercapto-1-undecanol
Ethanolic solution
20% 16-Mercaptohexadecanoic acid
COOH
Incubation time: 18h
COOH
COOH
COOH
OH OH OH OH OH
OH OH OH OH
COOH
Spacer: 4 C
OH OH
gold
glass
OH OH OH OH
OH OH OH OH
ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss
OH OH
BIOTIN
• Vitamin H (essential for
every living cell)
• MW 244 Da
• High affinity to the
streptavidin (Ka ~ 1015 M-1)
STREPTAVIDIN
AVIDIN: glycoprotein from
chicken egg white
STREPTAVIDIN:
non-glycosylated protein
from Streptomyces avidinii)
EXTRAVIDIN:
• Tetrameric protein (4x13kDa)
• Each monomer binds one
molecule of biotin.
• Various biochemical
applications.
BIOTIN-STREPTAVIDIN
COMPLEX
•
Extremely high binding affinity
Ka~ 1015 M-1
STABILITY:
<132°C
pH 2-13
For immobilizing biotinylated proteins
onto streptavidin coated surfaces
BIOTINYLATION OF THE SAM
(NHS modify a treminal carboxyl group to an
amine reactive NHS ester)
Biotin-PEO-Amine (water soluble biotinylation reagent
containing polyethylene oxide (PEO) spacer arm and a
terminal primary amine).
EDC-NHS
activation
OH OH
OH OH OH OH
OH OH OH OH
OH OH OH OH OH
OH OH OH OH
SAM
GOLD
GLASS
ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss
OH OH
FORMATION OF
STREPTAVIDIN MONOLAYER
1 ng mm2
SAM
GOLD
GLASS
ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss
Vezava
biotiliniranega
protitelesa na
streptavidinsko
podlago.
VHH
SAM
GOLD
GLASS
ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss
VHH
Interakcija proteina iz proteinskega vzorca z na
mikromreži pritrjenim specifičnim protitelesom
preko alosteričnih konformacijskih sprememb
vpliva na plazmon (elektronski oblak nad zlato
površino), kar se odrazi v uklonu odbojnega žarka
v prizmi – kvantitativna senzorika.
SAM
GOLD
GLASS
ssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss
IMMOBILIZATION OF
BIOTINYLATED ANTIBODIES
•
ANTIBODIES: biotinylated using NHS-activated biotin and then
immobilized onto streptavidin coated suraces
SPOTTING
• Qiagen Bio Robot 8000 (70 spots)
• Piezzo spotter (1000 spots)
• Problem with evaporation (small volumes 100 pL/spot)
• 1% trehalose
• 50% glycerol
• Spot uniformity
TECHNICAL QUESTIONS OF ANTIBODY
MICROARRAY EXPERIMENT:





No simple method for protein amplification.
Complex and heterogeneous structure.
Solubility and stability issues .
Antibody-antigen interaction is defined by a
broad range of specificity and affinity (it is
difficult to obtain large set of highly specific
antibodies).
For many proteins there are no available
antibodies.
POSSIBLE TECHNICAL PROBLEMS
OF ANTIBODY MICROARRAY
EXPERIMENT:
• Binding activity is decreased (the receptor is
randomly immobilized in many different
orientations).
• Protein activity becomes heterogenous (steric
effects, conformational changes and chemical
microenvironment).
Ker je se je že po krajšem času uporabe proteinska mikromreža zasušila, v
tej obliki ne pride v poštev za laboratorijsko diagnostiko. Zato je bilo
potrebno spremeniti pristop za njeno izgradnjo.
Nov pristop v tehnologiji proteinskih bio-čipov (DAPA).
cDNA chip = matrix
In vitro transcription &
translation
Protein chip = copy
Izdelamo cDNA-čip (mikromrežo), na katerem so sonde
fragmenti cDNA specifičnih protiteles. Tak bio-čip je zelo
stabilen in ga lahko daljši čas hranimo pri +4 0C. V trenutku
potrebe ga uporabimo kot matrico za izdelavo mikromreže z
ustrezajočimi protitelesi – z uporabo sistema DAPA:
kombinirane in vitro transkripcije in translacije.
PREPARATION OF ANTIBODIES
CAMELIDNA (kamele, lame)
težkoverižna PROTITELESA
VHH:
• ena domena, majhna velikost (15 kDa)
• dobro rekombinantno izražanje v E.coli
• topna in stabilna
• enostavnejša uporaba ( vs. scFv)
50 %
50 %
Occurrence of HCAbs in serum
[IgG] ~ 5-10 mg/ml
IgG1
Llama glama :
55 à 75%
Camel dromedarius : 50%
IgG2
IgG3
25 à 45%
50%
• Absence of
interactions sites
Structure of
conventional and heavy chain Ab
160kD
50kD
95kD
30kD
Conventional IgG
Heavy chain IgG
Variable Heavy chain
of a Heavy chain
antibody
15kD
Nanobodies = VHH - CAMELIDAE ANTIBODIES
•Single domain antibodies
•Variable domains of heavy chain antibodies
•High specificity and high affinity
•High temperature resistant
Unique features of VHH domains
 High expression yields
5-10mg/L in E. coli
9,3mg/l/OD660 or ~250mg secreted by liter of Saccharomyces yeast culture
 Highly soluble and stable, single domain Ig fold
80 à 100% retained binding activity after 1 week incubation 37°C
Good thermal resistance up to 90°C
Resistance against denaturing reagents (urea, guanidium…)
Generation of Ag-specific, high-affinity binders
Kd nanomolar range
Recognition of unique conformational epitopes with the
dominant involvement of its long CDR3
 close homology to human VH fragments
Structural representation
Human VH
camelid VHH
CDR2
CDR1
CDR3
Sequence difference between
VH and VHH
VG
L
W
37 44 45 47
F
Y
E
R
V
G
L
W
VH
VL
scFv
VHH
Daljša polarna CDR3 domena VHH prekriva hidrofobno ogrodje nanoprotiteles, zato so ta topna
in jih enostavno pridobivamo s tehnologijo rekombinantne DNA (n.pr. s fagnim prikazom), za
razliko od netopnih oz. slabše topnih VH konvencionalnih protiteles.
IMMUNIZATION with
human gastric cancer
proteins (cell homogenate/fractions)
3x
3 months
- 106 cancer cells separated with laser
ISOLATION
of leucotytes
mRNA
isolation
AMPLIFICATION
of VHH specific
genes
COLLECTING the blood
(100 ml) 15 days after
immunization
Peptidomimetic (biotin)
-N (Nanotag; 15 aa)
-C (SBP; 38 aa)
-N and C (Streptag 2)
EXPRESSION
in E. coli
IZDELAVA KNJIŽNICE REKOMBINANTNIH PROTITELES
Odvzem
krvi
Osamitev limfocitov
Ekstrakcija mRNA
Amplifikacija
variabilnih domen
Produkcija
variabilnih domen
2. Phage Production
Fusion protein (VH and VHH)
Bacteriophage
1.Construction
of recombinant
libray
(PCR, ligation,
transformation)
3. Affinity selection
6. Amplification
Immobilized
antigen
Phage Display
Cycle
Amplification/Selection
4. washing
5. Elution
Identification of
positive clones by
ELISA colony lifts
Specific
phages
Nonspecific
phages
SELEKCIJA PROTITELES, SPECIFIČNIH PROTI PROTEINOM TUMORJA
Mešana knjižnica laminih VHH/VH
Fagni prikaz na kolonah z imobiliziranimi
proteinskimi izvlečki iz TUMORJA vs.
NORMALNEGA tkiva
I.
N
II.
T
Eluiranje
nezadržanih
fagov
Eluiranje
specifično
vezanih fagov
Eluiranje
specifično
vezanih fagov
T
N
Eluiranje
nezadržanih
fagov
Reamplifikacija fagov
Zbrana protitelesa VH/VHH
SEQUENCE
DIVERSITY
SEQUENCES
UNIQUE
VHH:VH
Before
selection
100 %
42%:58%
1st
100 %
33% : 33%
2nd
100 %
89% : 11%
3rd
85 %
80% : 20%
CYCLES
Micro-dot ELISA
40.000 spots
104
cancer : normal
AUTOMATIZATION
Spotting from the medium
DIFFERENCE
New protein
markers
Diagnosis
Labeled VHH antibody
MS
-MALDI-TOF
-ESI-MS/MS
2-D
electrophoresis
SPR
-affinity
-kinetics
Primeri uporabe rekombinantnih protiteles
VH in VHH
Gene
RAB32
RARG
RASA1
Protein
role
Gene IDName
Gene sequence
Acc. No. Ref.
(coding for) (description)
Availability
Protein
Name
10981 RAB32, member
Homo
RASsapiens
oncogene
NM_006834
RAB32,
familymember
11784320
RAS oncogene family (RAB32), mRNARAB32_HUMAN Ras-related pro
5916 retinoic acid receptor,
Homo sapiens
gamma
NM_000966
retinoic acid 1655630
receptor, gamma (RARG), mRNA.
RRG1_HUMAN Retinoic acid r
5921 RAS p21 protein
Homo
activator
sapiens
(GTPase
NM_002890
RAS p21
activating
proteinprotein)
activator (GTPase activating protein) 1 (RASA1), transcript
RASvariant
p21 prote
1, m
Protein PossibleRole Expression
Stage
Acc. No.
localisation
a lt. l. in in
GCGCin GC
Ref.
3-D? Availability
OMIM
vesicle transport
Mitochondrial
downNP_006825 12186851 1KY3 http://au.expasy.org/c
is a receptor forNuclear
retinoic acid. This metabolite
down-has profound
NP_000957
effects on vertebrate development.
http://au.expasy.org/c
180190
Retinoic a
21 protein activator 1
NP_002881
Antibody Name
Acc. No.
Ref.
Availability
Identifikacija novih
biooznačevalcev –
dopolnjevanje
podatkovnih baz
Izdelava
diagnostičnih
biočipov.
Ker je produkt predhodno prikazane
proizvodnje nanoprotiteles vedno tudi par
nanoprotitelo : proteinski antigen, lahko
pristopimo k
preučevanju
možnosti
ciljanega zdravljenja.
Hvala za
pozornost!