KROMATOGRAFIAN PERUSTEET
Outi Itkonen
Sairaalakemisti, dos.
HUSLAB
5.2.2015
O. Itkonen
1
LABQUALITYDAYS 2015
KROMATOGRAFIA
• χρῶμα chroma “väri"
• γράφειν graphein “kirjoittaa“
• alan uranuurtajat Archer John Porter
Martin ja Richard Laurence Millington
Synge 1940 -1950 luvulla
– kasviuutteiden erottaminen
paperikromatografialla
5.2.2015
Outi Itkonen
wikipedia.org
2
LABQUALITYDAYS 2015
PERIAATE
• molekyylien erottaminen toisistaan partition perusteella,
eli miten ne jakautuvat kahden eri faasin välillä
• jakautuminen on tasapainotila, dynaaminen prosessi
waters.com
5.2.2015
Outi Itkonen
3
LABQUALITYDAYS 2015
TERMISTÖÄ
• kromatografi
– laitteisto, jolla kromatografia tehdään
• kromatogrammi
– erotusprosessin graafinen esitys
knauer.net
agilent.com
5.2.2015
Outi Itkonen
4
LABQUALITYDAYS 2015
TERMISTÖÄ
• kiinteä (stationääri) faasi
– liikkumaton faasi, joka on yleensä
kiinnitetty johonkin toiseen materiaaliin,
esim. levylle, putken sisäseinämään tai
partikkeleihin
• liikkuva (mobiili) faasi
– neste tai kaasu, joka sisältää myös
näytteen ja liikkuu haluttuun suuntaan
eichrom.com
galleryhip.com
5.2.2015
Outi Itkonen
5
LABQUALITYDAYS 2015
TERMISTÖÄ
• Resoluutio
– kahden vierekkäisen piikin erottuminen
• Pohjaluku (N)
– kuvaa kolonnin (kromatografiasysteemin)
erotuskykyä
Shimadzu.com
5.2.2015
Outi Itkonen
6
LABQUALITYDAYS 2015
TERMISTÖÄ
• Retentio - eluutio
– adsorptio – desorptio -prosessi
1. tasapainotus
2. adsorptio
3. resorptio
mukailtu:Satu Mikkola 2006
5.2.2015
Outi Itkonen
7
TASO- JA
KOLONNIKROMATOGRAFIA
5.2.2015
O. Itkonen
8
LABQUALITYDAYS 2015
TASOKROMATOGRAFIA
• Ohutlevykromatografia (TLC)
– lasi-, alumiini- tai muovilevy päällystetty kiinteällä faasilla
– kiinteänä faasina silika (SiO2), aluminioksidi tai selluloosa
• Paperikromatografia
– kiinteänä faasina paperi
• Liikkuva faasi nestemäinen
5.2.2015
Outi Itkonen
spectrumlabs.com
9
LABQUALITYDAYS 2015
OHUTLEVYKROMATOGRAFIA
•
•
•
•
Seoksen komponenttien erotus ja tunnistus
Reaktion seuranta
Puhdistusprosessin fraktioiden analyysi
Puhdistetun yhdisteen puhtauden analyysi
expertsmind.com
5.2.2015
Outi Itkonen
10
LABQUALITYDAYS 2015
OHUTLEVYKROMATOGRAFIA
• Kiinteä faasi, esim. silika on
erittäin polaarista
– dipoli-dipoli- ja H-sidoksia
– polaariset yhdisteet liikkuvat
hitaasti
• Liikkuva faasi pooliton
– poolittomat yhdisteet liikkuvat
nopeammin
instructables.com
5.2.2015
Outi Itkonen
11
LABQUALITYDAYS 2015
OHUTLEVYKROMATOGRAFIA
• Täplät visualisoidaan
– värjäämällä jodilla tai spesifillä
värireagenssilla
– UV-valolla
• Retentiofaktori (Rf) = täplän
kulkema matka / liuosrintaman
kulkema matka lähtöpisteestä
• Syntyvän/vastasyntyneen lapsen
keuhkojen kypsyys
lapsivesinäytteestä/imulimasta 2dimensionaalisella TLC:llä
5.2.2015
Outi Itkonen
lipidlibrary.aocs.org
12
LABQUALITYDAYS 2015
KOLONNIKROMATOGRAFIA
• Kiinteä faasi kolonnissa, jonka läpi
liikkuva faasi kulkee
• Kaasukromatografia (GC)
• Nestekromatografia (LC)
5.2.2015
Outi Itkonen
13
LABQUALITYDAYS 2015
KAASUKROMATOGRAFIA (GC)
• Myös kaasu-nestekromatografia (GLC)
• Yhdisteen puhtauden tutkiminen
• Seoksen komponenttien tunnistaminen
sfu.ca
5.2.2015
Outi Itkonen
14
LABQUALITYDAYS 2015
KAASUKROMATOGRAFIA
• Inertti kantajakaasu kuten He, N2, H2
– paine, virtausnopeus
• Näyte
– termisesti stabiili
– haihtuva tai
– johdoksenmuodostus
• silylointi, alkylointi, asylointi
sigmaaldrich.com
5.2.2015
Outi Itkonen
15
LABQUALITYDAYS 2015
GC-KOLONNEISTA
• pakatut kolonnit
– terästä tai lasia
– 1,5-10 m pituus, 2-4 mm i.d.
• kapillaarikolonnit
– 10-100 m pituus, 0,1-0,5 mm i.d.
– usein piioksidista valmistettuja ja
polyimidillä päällystettyjä
– kiinteänä faasina viskooseja
polymeerejä (polysiloksaaneja,
polyfenolieettereitä jne.)
– dimetyylipolysiloksaani, trifluoropropyylimetyylipolysiloksaani, jne
– lukuisia muita kiinteitä faaseja
labtraining.com
thermofisher.com
5.2.2015
Outi Itkonen
16
LABQUALITYDAYS 2015
KAASUKROMATOGRAFIA
• Detektori
–
–
–
–
massaspektrometri (MS)
liekki-ionisaatiodetektori (FID)
termisen johtavuuden detektori (TCD)
ECD, NPD, FPD, muu
• GCxGC
• Kliinisissä laboratorioissa
–
–
–
–
5.2.2015
shimadzu.com
alkoholi- ja glykolimyrkytyksen diagnostiikka
virtsan orgaanisten happojen analytiikka
lääke- ja huumausaineiden (varmistus)analytiikka
sterolien analytiikka
Outi Itkonen
17
LABQUALITYDAYS 2015
KAASUKROMATOGRAFIA
• Esim. virtsan orgaaniset hapot
aineenvaihduntasairauksien diagnostiikassa
Kamijo et al., Ped.Research 1997:42:569.
5.2.2015
Outi Itkonen
18
LABQUALITYDAYS 2015
NESTEKROMATOGRAFIA
• LC, HPLC, UPLC/UHPLC/RR-HPLC
• kiinteä faasi (adsorbentti) kolonnissa, liikkuvana
faasina (eluenttina) neste
• isokraattinen tai gradienttiajo
intechopen.com
5.2.2015
Outi Itkonen
19
LABQUALITYDAYS 2015
NESTEKROMATOGRAFIA
• yhdisteiden puhdistaminen, erottaminen,
tunnistaminen ja pitoisuusmittaus
5.2.2015
Outi Itkonen
20
LABQUALITYDAYS 2015
NESTEKROMATOGRAFIAN JAOTTELU
• nano-, kapillaari-, microbore/micro-,
semimicro/narrowbore/microbore-,
preparatiivinen LC
• HPLC: 5-25 cm, i.d. 2-4 mm, 3-5 µm
– ensimmäiset laitteistot 1970-luvulla
– max paine 400 bar
inertsil.eu
• UHPLC: i.d. 1.0-2.1 mm, sub-2-µm
– paine ≥1000 bar
– ens. laitteisto 2004
analytical-sales.com
5.2.2015
Outi Itkonen
preparativehplscsystem.com
21
LABQUALITYDAYS 2015
KOLONNIN PARTIKKELIT
• partikkelit tavallisimmin silikaa tai
polymeeriä
• kiinteäytimiset vs. huokoiset
partikkelit
• monoliittikolonnit
– kiinteä faasi yksi yhtenäinen huokoinen
kappale
i28.tinypic.com
5.2.2015
Outi Itkonen
22
LABQUALITYDAYS 2015
NP JA HILIC -KROMATOGRAFIA
• Normaalifaasi-LC (NP-LC)
– silika, dioli-, amino (NH2) ja syano (CN) -faasit
– liikkuva faasi pooliton tai keskipoolinen
• HILIC-LC eli hydrofiilinen
interaktiokromatografia
epharmacist.com
sepscience.com
5.2.2015
Outi Itkonen
23
LABQUALITYDAYS 2015
RP-KROMATOGRAFIA
• Käänteisfaasi-LC (RP-LC)
– silikaan tai polymeeriin sidottuja
poolittomia faaseja (C18, C8, C4), myös
CN ja NH2
– liikkuva faasi on poolisempi kuin kiinteä
faasi
mn-net.com
sepscience.com
5.2.2015
Outi Itkonen
24
LABQUALITYDAYS 2015
MUITA KROMATOGRAFIOITA
• ioninvaihtokromatografia
– ionisidos
• affiniteettikromatografia
– reversiibeli (spesifinen) sidos
• geelisuodatus (size exclusion
chromatography)
– molekyylin kolmiulotteinen koko
ivtnetwork.com
5.2.2015
Outi Itkonen
25
LABQUALITYDAYS 2015
RASKAUSTESTI
masalamommas.com
Madeleine Prince
Ball, 2013
5.2.2015
Outi Itkonen
26
LABQUALITYDAYS 2015
YHTEENVETO
interchopen.com
5.2.2015
Outi Itkonen
27
- YHDISTEIDEN PARTITIO KAHDEN
ERI FAASIN VÄLILLÄ
- KOMPONENTTIEN TUNNISTUS JA
PITOISUUSMITTAUS SEOKSESTA
- TÄRKEÄ TEKNIIKKA KLIINISESSÄ
LABORATORIOSSA!
2/12/2015
O. Itkonen
28