1. No category

Pahanlaatuisten eturauhassolujen tunnistusmenetelmän
kehittäminen soluviljelytekniikoita käyttäen
Unna Leinonen
Syventävien opintojen kirjallinen työ
Tampereen yliopisto
Lääketieteen yksikkö
Dosentti Oksalan ryhmä
Elokuu 2015
Tampereen yliopisto
Lääketieteen yksikkö
Kirurgian apulaisprofessori Oksalan tutkimusryhmä
Unna Leinonen:
Pahanlaatuisten eturauhassolujen tunnistusmenetelmän
kehittäminen soluviljelytekniikoita käyttäen
Kirjallinen työ, 24 sivua
Ohjaajat: Kir. ap. prof. Niku Oksala ja LT Antti Roine
Elokuu 2015
Avainsanat: polyamiinit, spermiini, DENSpm, keinonenä, eturauhassyöpä
Polyamiinit ovat ryhmä ornitiinista lähtöisin olevia haihtuvia molekyylejä. Aitotumallisten solujen
yleisimmät polyamiinit ovat putreskiini, spermidiini ja spermiini. Ne ovat välttämättömiä solun
normaalille kasvulle ja toiminnalle. Niiden monimutkainen metabolia ja määrän tiukka säätely
viittaavat siihen, että polyamiinit ovat elintärkeitä solun elossa pysymiselle. Poikkeamat
polyamiinimetabolian säätelyssä voivat johtaa useisiin sairauksiin.
Eturauhassyöpä on suomalaisten miesten yleisin syöpä. Suomen syöpärekisterin mukaan vuonna
2013 uusia eturauhassyöpiä todettiin 5043, mikä vastaa 30.7 % kaikista uusista miesten syövistä.
Ennuste eturauhassyövästä parantumiselle on parempi kuin monissa muissa syövissä. Taudin
aikainen toteaminen parantaa ennustetta huomattavasti. PSA, prostataspesifinen antigeeni, on
yleisesti käytössä oleva merkkiaine. PSA ei kuitenkaan erota hyväennusteista hitaasti etenevää
syöpää aggressiivisesta taudinkuvasta.
Tämän tutkimuksen tarkoituksena on kehittää elektroniseen nenään perustuvaa teknologiaa
pahanlaatuisten eturauhassolujen tunnistamiseksi soluviljelytekniikoita käyttäen.
Tutkimuksessa hajuja analysoitiin Environics Oy:n valmistamalla ChemPro 100 –
kaasuanalysaattorilla ja tutkimusryhmämme kehittämällä näytteenottojärjestelmällä. Aineiston
perusteella selvitettiin, eroavatko DENSpm-solusalpaajalla käsiteltyjen eturauhassyöpäsolujen ja
hyvänlaatuisten eturauhassolujen hajut toisistaan. Tämä polyamiinianalogi pumppaa solusta ulos
polyamiineja. Mikäli keinonenä tunnistaa solulinjojen eroavaisuuden lisääntyneen, voisi se viitata
polyamiinien olevan syövän hajun lähteenä.
Saatujen tulosten perusteella DENSpm näyttää vaikuttavan pahanlaatuisen eturauhassolulinjan
aineenvaihduntaan, mikä heijastuu solujen hajuun. Mediumin haju ei kuitenkaan muutu.
Tämä viittaa siihen, että DENSpm:n polyamiinien ulospumppausta aiheuttava vaikutus ei ole
suoraan hajumuutoksen takana ja näin ollen polyamiinit eivät tällä perusteella keskeisesti selitä
solulinjojen hajueroa. DENSpm:n lisäys muuttaa LNCaP:n, muttei EP-156T:n hajua.
Tämän tutkimuksen tulokset eivät tue polyamiinien roolia ”syövän hajua” selittävinä molekyyleinä
soluviljelyolosuhteissa.
SISÄLLYSLUETTELO
1. Polyamiinit
1.1 Rakenne
1.2. Polyamiinien rooli normaalissa solun aineenvaihdunnassa
1.3 Polyamiiniaineenvaihdunta syövässä
1.4. DENSpm, sen rooli onkologiassa
1
2
4
5
2. Elektroniset nenät
2.1. Toimintaperiaate
2.2. Sovellukset syöpädiagnostiikassa
6
8
3. Tutkimushypoteesit
9
4. Aineisto ja menetelmät
4.1. Soluviljelmät
4.2 ChemPro 100
4.3. Mittausjärjestely
10
11
11
5. Tulokset
12
6. Pohdinta
23
7. Johtopäätökset
24
8. Lähteet
25
1. Polyamiinit
1.1 Rakenne
Polyamiinit ovat kaikissa soluissa esiintyviä orgaanisia yhdisteitä, joilla on solun toiminnassa
vaihtelevat roolit. Ne ovat vesiliukoisia, alifaattisia kationeja, joilla on ainakin kaksi aminoryhmää
(-NH2). Elimistön pH:ssa polyamiinit ovat täysin protonisoituneissa muodoissaan (keskimääräinen
pKa ≈10). Ne sitoutuvat solun negatiivisesti varautuneisiin komponentteihin, esimerkiksi DNA:han,
RNA:han, proteiineihin sekä solukalvon fosfolipideihin. (Casero & Marton 2007.)
Aitotumallisissa soluissa polyamiinit säätelevät spesifisten geenien ilmentymistä. Ne ovat
välttämättömiä solun jakautumiselle, kasvulle ja erilaistumiselle. Lisäksi polyamiineja tarvitaan
solun normaaliin toimintaan, kuten DNA:n synteesiin ja stabiliteettiin, transkription säätelyyn,
ionikanavien säätelyyn, proteiinien fosforylaatioon, ekstrasellulaaritilan korjaamiseen ja solujen
välisiin liitoksiin. Runsaista vaikutustavoistaan johtuen ne ovat elintärkeitä myös
sikiönkehitykselle. (Gerner & Meyskens 2004, Moinard ym. 2005, Soda 2011.)
Aito- ja esitumallisten solujen yleisimmät polyamiinit ovat voimakkaan hajuinen putreskiini (kaksi
aminoryhmää), jota on etenkin mätänevässä lihassa (putrefaction [engl] = mätänemisprosessi).
Spermidiinillä (kolme aminoryhmää) taas vaikuttaa olevan keskeinen rooli solujen ikääntymisen ja
oksidatiivisen stressin ehkäisyssä (Eisenberg ym. 2009). Pisin nisäkkäiden polyamiineista,
spermiini (neljä aminoryhmää) löydettiin spermasta jo vuonna 1678. Spermiini sitoutuu solun
DNA- ja RNA- kierteisiin vetysidoksin stabiloiden niitä. Spermiinin voimakas haju on
tunnusomainen spermalle (Wang J-Y & Casero RA 2006.). Nisäkkäillä nämä polyamiinit johdetaan
ureakierron välituotteesta, ornitiinista. Polyamiiniaineenvaihduntaan tarvittavat entsyymit löytyvät
kaikista kudoksista. Polyamiineja saadaan myös ravinnosta, etenkin punaisesta lihasta sekä
juustoista. Myös elimistön oma mikrobifloora suolistossa tuottaa polyamiineja. (Gerner &
Meyskens Jr 2004.)
Eturauhanen on ainoa ihmisen kudoksista, jonka tuottamista polyamiineista suurin osa on
tarkoitettu ensisijassa eritettäväksi solusta ulos (spermaan), eikä käytetä eturauhasen omassa
aineenvaihdunnassa. Eturauhanen syntetisoi suuret määrät polyamiineja, kaikkein eniten spermiinia.
Harrisonin jo vuonna 1931 tekemässä tutkimuksessa todettiin eturauhasen sisältävän
kymmenkertaisen määrän toiseksi eniten polyamiineja sisältävään haimaan nähden. (Harrison 1931,
Mi ym. 1998.)
1.
1.2. Polyamiinien rooli normaalissa solun aineenvaihdunnassa
Kuva 1: Polyamiinimetabolia, alkuperäinen kuva: Roine, 2014. Lyhenteet: PT=polyamiinitransportteri, ODC=
ornitiinidekarboksylaasi, SSAT= spermidiini/spermiini N1-asetyylitransferaasi, SMO= spermiinioksidaasi, APAO= N1asetyylipolyamiinioksidaasi; DAX= diamiinieksportteri.
Polyamiinien kierto on monimutkainen ja tarkoin säädelty prosessi. Ureakierron välivaiheen,
ornitiinin, dekarboksylaatio ODC:n avulla putreskiiniksi on polyamiiniaineenvaihdunnan
ensimmäinen vaihe. Putreskiiniin liitetään spermidiinisyntaasin avulla propyyliaminoryhmä, jolloin
tuloksena on spermidiini. Spermidiiniin lisätään edelleen propyyliaminoryhmä spermiinisyntaasin
avulla, minkä seurauksena muodostuu spermiini.
2.
Propyyliaminoryhmät saadaan S-adenosyylimetioniinista (SAM). Reaktioon tarvitaan ensin SAMin
dekarboksylaatio AMD:n (S-adenosyylimetioniinidekarboksylaasin) avulla. Tämä tuottaa
dekarboksyloituneen S-adenosyylimetioniinin, joka luovuttaa propyyliaminoryhmänsä.
Spermidiinin ja spermiinin metaboliitit ovat asetyloituja tai diasetyloituja. SSAT
(spermidiini/spermiini N1-asetyylitransferaasi) monoasetyloi spermidiinin ja joko mono- tai
diasetyloi spermiinin, jolloin tuloksena saadaan N1-asetyylispermidiini, N1-asetyylispermiini tai
N1,N12-diasetyylispermiini. Reaktioon tarvittava asetyyliryhmä otetaan asetyyli-CoA:sta.
Asetyloiduilla polyamiineilla on kaksi vaihtoehtoista hajoamisreittiä. Solu voi pumpata ne ulos
diamiinieksportterin kautta, jolloin ne lopulta erittyvät virtsaan. Asetyloitujen polyamiinien
huomattava piirre on niiden pysyvyys ja säilyminen virtsassa. Näin ollen ne ovat hyviä
merkkiaineita. Toisaalta asetyloidut muodot toimivat myös substraatteina N1asetyylipolyamiinioksidaasille (APAO). Reaktiossa lopputuloksena on joko putreskiini tai
spermidiini, riippuen lähtöaineesta. Näissä hapetusreaktioissa vapautuu vetyperoksidia, joka
puolestaan aiheuttaa solulle oksidatiivista stressiä. (Soda 2011, Gerner & Meyskens 2004.)
Kirjallisuuslähteistä riippuen putreskiinin ja spermidiinin hapetusreaktion entsyymi on nimeltään
DAO (diamiinioksidaasi), PAO (polyamiinioksidaasi) tai APAO (N1-asetyylipolyamiinioksidaasi).
Nämä entsyymit lienevät isoentsyymejä. Tässä työssä niitä käsitellään kuin yhtä entsyymiä.
Polyamiinien tuotanto ja hajottaminen ovat tarkasti kontrolloituja prosesseja. Liian vähäinen
polyamiinipitoisuus estää solun kasvua ja normaalia toimintaa, kun taas liian suuri pitoisuus ohjaa
solua apoptoosiin ja solun transformaatioon. Solun polyamiinipitoisuus riippuu voimakkaasti
solusyklin vaiheesta. Säätely tapahtuu pääasiassa ODC:n ja AMD:n pitoisuutta muuttamalla. Myös
arginaasi on merkittävässä asemassa.
ODC:n ilmentyminen solussa on voimakkainta solusyklin myöhäisessä G1-vaiheessa (kasvuvaihe)
ja aikaisessa S-vaiheessa (DNA:n replikaatio). ODC:lla on erittäin lyhyt puoliintumisaika (noin 10
minuuttia), joten nopeat pitoisuusvaihtelut ovat mahdollisia. ODC tuhoutuu proteasomi 26S:n
välityksellä, jonne se kulkeutuu ODC-antitsyymiin kiinnittyneenä. Solun korkea
polyamiinipitoisuus lisää antitsyymin mRNA:n translaatiota.
3.
ODC:n kilpailevaa inhibiittoria, DFMO:a (α-difluorometyyliornitiinia), käytetään lääkkeenä muun
muassa Pneumocystis carinii – infektioissa, Länsi-Afrikan unitaudin myöhäisvaiheessa, Chagan
taudissa, leichmaniasiksessa sekä malariassa. (Bettuzzi ym. 1999, Casero & Marton 2007.)
S-adenosyylimetioniinidekarboksylaasin (AMD:n) määrä kasvaa solunjakautumisen käynnistävien
yhdisteiden, mitogeenien läsnä ollessa. Samalla lisääntyy myös tämän entsyymin stabiliteetti.
Polyamiinien pitoisuus vaikuttaa AMD:n aktiivisuuteen. Se lisää putreskiinia ja vähentää
spermidiiniä sekä spermiiniä. (Hölttä 1990.)
Polyamiinien asetylaatio SSAT:n avulla on rajoittava reaktio polyamiinien hajoamisessa ja
muuntautumisessa. SSAT:n pitoisuus lisääntyy solunsisäisen polyamiinipitoisuuden kasvaessa, mikä
auttaa estämään liiallisen polyamiinipitoisuuden haitalliset vaikutukset. (Moinard ym. 2005.)
1.3 Polyamiiniaineenvaihdunta syövässä
Syövässä kasvainkudos kasvaa tervettä kudosta nopeammin. Koska polyamiinit ovat välttämättömiä
solujen jakautumiselle ja kasvulle, niillä on tärkeä rooli syövän synnyssä, kasvamisessa sekä
hoidoissa. Polyamiinimetabolia onkin häiriintynyt syövässä. Monet syöpälääkkeet tähtäävät
polyamiinien biosynteesin hidastamiseen.
Rintasyöpäkudoksessa on havaittu 4–6 –kertaisia pitoisuuksia, paksusuolen syövässä 3-4 – kertaisia
polyamiinipitoisuuksia terveeseen kudokseen verrattuna. Myös munuaissyövässä,
virtsanjohdinsyövissä ja rakkosyövissä muodostuu huomattavasti enemmän polyamiineja
terveeseen verrokkikudokseen nähden. (Saunders & Wallace 2010.) Eniten syntyy spermiiniä, sitten
spermidiinia ja diamiineja. Spermiini/spermidiini – suhde ei kuitenkaan poikkea normaalien solujen
vastaavasta. (Koide ym. 1990).
Eturauhaskudoksessa polyamiinien metaboliaa säätelee pääasiassa kaksi entsyymiä: arginaasi ja
diamiinioksidaasi (DAO). Arginaasi katalysoi ornitiinin synteesiä argitiinista, DAO katalysoi
spermiinin ja spermidiinin oksidaatiota putreskiiniksi. Molempien entsyymien määrät ovat
lisääntyneet viisinkertaisiksi eturauhassyövässä verrattuna hyvänlaatuiseen eturauhasen
liikakasvuun. Hyvänlaatuisessa eturauhasen liikakasvussa kudos tuottaa runsaasti spermiinia ja
hieman vähemmän spermidiinia. Tämä muutos kuvastaa eturauhassolukon muuntautuneen
proliferaatiovaiheesta erilaistuneempaan muotoon. Eturauhassyövässä spermiinimäärät ovat
4.
puolestaan selkeästi alhaisempia. Syövässä solut ovat enemmän proliferaatiovaiheessa ja
normaalitoiminta häiriintynyt. (Koide ym 1990, van der Graaf ym. 2000, Keskinege ym. 2001,
Kawakita ym. 2006, Saunders & Wallace 2010.)
Syöpäsoluille tyypillistä on ornitiinidekarboksylaasin sekä AMD:n suuri aktiivisuus ja polyamiinien
runsaus. Onkogeeneillä (ras, src, neu) transformoiduissa soluissa ODC:n aktiivisuus on pysyvästi
kohonnut ja normaali solusyklin mukana kulkeva vaihtelu kadonnut. Onkogeenien ilmentymisen
jälkeen ODC:n mRNA:n määrä ja entsyymin aktiivisuus lisääntyvät voimakkaasti ennen solujen
morfologista transformaatiota. (Hölttä 1990.)
Eturauhassyöpäsoluilla tehdyssä tutkimuksessa synteettinen putreskiinianalogi kykeni estämään
syöpäsolujen kasvun aiheuttamalla niissä apoptoosia spesifisten proteaasien, kaspaasien,
välityksellä. (Russo ym. 2007.). Polyamiinisynteesin aktivaattorit puolestaan estävät
eturauhassyöpäsolujen proliferaatiota polyamiinivälitteisesti. (Kee ym. 2004.)
Potilaan veren ja virtsan polyamiinipitoisuudet kasvavat useissa syövissä. Mikäli syöpäleikkaus
onnistuu, ja kasvain saadaan poistettua kokonaan, eritteiden polyamiinimäärät normalisoituvat.
Vastaavasti syövän uusiessa polyamiinipitoisuudet kasvavat. (Kawakita & Hiramatsu 2006.)
Kuten aikaisemmin todettiin, virtsaan eritetyt polyamiinien metaboliitit ovat asetyloituja tai
diasetyloituja. Näiden pitoisuus vaikuttaa lupaavalta merkkiaineelta useissa syövissä ja niillä
näyttää olevan ennusteellista merkitystä taudin kannalta. (Hiramatsu ym. 1997, Nakayama ym.
2012.)
1.4. DENSpm, sen rooli onkologiassa
Polyamiinianalogit ovat luontaisten polyamiinien kaltaisia molekyylejä, jotka pääsevät solujen
sisään ja täydentävät solunsisäistä polyamiinipoolia. Solun sisään kertyvät analogit eivät saa aikaan
solun kasvua tai erilaistumista, vaan ne rajoittavat polyamiinien tuotantoa edistäviä ODC:a ja
dcSAM:ia, indusoivat katabolisia entsyymejä SSAT:ia, APAO:a ja SMO:a, ja näin ollen vähentävät
solunsisäistä polyamiinipitoisuutta. (Wolff ym. 2003, Tian ym. 2012.)
5.
Kuva 2: DENSpm (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)
Kuva 3: Spermiini (http://www.wikiwand.com/fi/Spermiini)
N1,N11–dietyylinorspermiini, eli lyhyemmin DENSpm, on spermiinianalogi. Se on hyvin potentti
SSAT-entsyymin indusoija, nostaen entsyymin aktiivisuutta 200-1000 -kertaiseksi, mikä aiheuttaa
soluissa apoptoosin. Se vaurioittaa syöpäsolujen mitokondrioita vapauttamalla sytokromi C:tä
sytoplasmaan ja aktivoiden kaspaasivälitteiset transduktiot. DENSpm:n aiheuttaman SSATentsyymin yli-ilmenemisen on todettu olevan syynä glioblastoomasolujen irtaantumiseen ja
apoptoosiin. Ornitiinidekarboksylaasin aktiivisuus vähenee DENSpm:n vaikutuksesta ja tämäkin
vähentää solunsisäistä polyamiinimäärää. DENSpm:lla on todettu olevan syöpää estäviä vaikutuksia
monilla eri solutyypeillä. (Tian ym. 2012.)
DENSpm:a on käytetty tutkimusasetelmissa erilaisten syöpien hoidossa. Rintasyöpäpotilailla
todettiin otoskooltaan melko pienessä kokeessa analogin olevan varsin siedetty ja turvallinen
potilaalle pieninä annoksina (Wolff ym. 2003). DENSpm yhdistettynä jo pidempään käytössä
olevien syöpälääkkeiden kanssa (esimerkiksi fluorourasiili ja oksaliplatiini) aiheuttaa lisääntynyttä
solukuolemaa. Yhdistelmä lisää SSAT:n aktiivisuutta sekä tehostaa lääkkeiden vaikutuksia.
(Saunders & Wallace 2010). DENSpm:n yhdistäminen sädehoitoon kolorektaalisyövän hoidossa
vaikuttaa lupaavalta yhdistelmältä solutason tutkimuksessa. (Qutob ym. 2000.)
2. Elektroniset nenät
2.1. Toimintaperiaate
Ihmisen nenän yläosassa on molemmin puolin hajuepiteeliä n. 2-3 cm2 alueella. Hajuepiteelin päällä
on limaa, johon haihtuvat hajua tuottavat molekyylit tarttuvat ja liukenevat. Hajujen
reseptoriproteiineja on ihmisellä vain tuhat, mutta tästä huolimatta kykenemme erottamaan
kymmeniä tuhansia eri hajuja. Ihmisen nenä ei haista suinkaan kaikkia haihtuvia eli volatiivisia
aineita. Vesihöyry ja häkä ovat esimerkkejä aineista, jotka eivät aiheuta aistimusta.
6.
Reseptorit ovat järjestäytyneet tarkasti. Aivojen hermoverkot yhdistävät järjestäytyneistä
reseptoreista tulevaa tietoa. Hajuaistimus riippuu siitä, mistäpäin epiteeliä impulssi tulee ja miten
moneen reseptoriin odoranttimolekyylillä on affiniteettia.
Koirien hajuaisti on tunnetusti ihmisen vastaavaa huomattavasti parempi. Hajuepiteelin pinta-ala
koiralla on noin kolmekymmentä kertaa suurempi kuin ihmisellä ja reseptoriproteiineja siinä on
noin 1000. Lisäksi värekarvoja soluissa on kaksinkertaisesti ihmisiin verrattuna. (Greenberg &
Haraway 1998.) Erinomaisen hajuaistinsa takia vainukoiria on käytetty yli sadan vuoden ajan
työvälineinä niin sotilas- kuin pelastustoiminnassa. Esimerkkeinä työtehtävistä ovat ihmisten
löytäminen raunioista, eksyneiden jäljittäminen, rikollisten tunnistaminen, huumeiden ja räjähteiden
etsiminen. (Lesniak ym. 2008.)
Keinonenän periaate on tunnistaa haju samoin kuin biologisen nenän. Ensimmäinen keinonenä eli
kemiallinen hajuanalysaattori oli Persaudin ja Doddin vuonna 1982 kehittelemä
puolijohdesensoripohjainen laite, jolla kyettiin erottamaan erilaisia hajuja. Tyypillisesti
elektronisessa nenässä on useita erilaisia mittauskennoja. Sensoriformaatteina voivat olla
polymeerit, joilla on erilaiset palautuvat fysiokemialliset ominaisuudet ja herkkyydet volatiivisille
aineille. Toisia formaatteja ovat metalli-oksidi -sensorit, joiden johtuminen muuttuu volatiivien
mukaan. Osassa keinoneniä on lisäksi pii-kenttä. Myös pietsosähköisiä kiteitä tai optisia sensoreita
on käytössä näissä laitteissa. (Turner & Magan 2004.)
Kiinnostuksen kohteena oleva haju on harvoin ilman taustahajua. Elektroniset hajuanalysaattorit
analysoivat kaikki hajut, jolloin haasteena on erottaa merkitykselliset hajut merkityksettömistä.
Näin ollen mittauskennoista saatu data analysoidaan sumeaa logiikkaa käyttäen matkien
hermoverkon toimintaa. Lääketieteellisissä tutkimuksissa pyritään esimerkiksi tunnistamaan syövän
hajun kemiallinen hahmo. (Kermany ym. 1998, Kermany ym. 1999.)
Laitemalleja on useita, mutta kaikissa on samat kolme toimintoa. Haihtuva kaasu liikkuu
tunnistusmatriisin ylitse, sensorien johtamiskyky muuttuu ja lähettää signaalin. Tällä tavoin saatu
tieto kootaan ja lopulta tuotetaan tulos.
Elektronisia neniä on käytetty niin huumeiden, räjähteiden ja taistelukaasujen sekä ruuan
pilaantumisen ja tautien havaitsemiseen. Näissä tilanteissa tarvitaan herkkää laitetta, joka tunnistaa
hajun pieninä pitoisuuksina.
7.
2.2. Sovellukset syöpädiagnostiikassa
Koska syöpäkasvaimet tuottavat runsaasti voimakkaan hajuisia polyamiineja, on hajuaistin
käyttäminen tautidiagnostiikassa luontevaa. Haihtuvien orgaanisten yhdisteiden analysointi on
kuitenkin monimutkaista, eikä siihen ole ollut yksinkertaisia laitteita.
Käsitys siitä, että syövällä on tunnistettava haju, esitettiin ensi kerran Lancetissa julkaistussa
kirjeessä vuonna 1989. Siinä kuvattiin tapaus, jossa omistajansa kanssa sairaalaan tullut koira
osoitti määrätietoista kiinnostusta potilaan jalassa olevaan ihomuutokseen. Kyseinen ihomuutos
osoittautui myöhemmin melanoomaksi. (Williams & Pembroke 1989.)
Ensimmäisenä syövän tunnistamiseen opetettuja koiria käytettiin keuhkosyövän
hajudiagnostiikassa. Koirat kykenevätkin tunnistamaan monia eri syöpätyyppejä. Koirien
laajamittainen käyttö diagnostisina välineinä ei kuitenkaan sovellu sairaalaoloihin muun muassa
hygieniasyistä. Lisäksi koirien kyky tunnistaa syöpäpotilaat heikkenee ajan myötä hajuaistin
tottuessa.
Massaspektrometri on erittäin tarkka ennalta määritettyjen yksittäisten molekyylien tunnistamisessa
ja mittaamisessa. Sen sijaan sitä ei ole suunniteltu tunnistamaan vaihtelevia VOC-yhdistelmiä.
Massaspektometrin käyttö on kallista. Näytteiden analysointi on työlästä ja aikaa vievää. Näin ollen
massaspektrometriaa ei käytetä kovinkaan laajasti. (Wilson & Manuela 2011.)
Keinonenillä saadut tutkimustulokset ovat lupaavia. Pienehkö kannettava elektroninen nenä
havaitsee eron keuhkosyöpäpotilaan ja terveen verrokin uloshengitysilmassa. Machadon johtamassa
tutkimuksessa vuonna 2005 elektroninen nenä erotti 71.4 prosentin herkkyydellä ja 91.9 prosentin
tarkkuudella 14 keuhkosyöpäpotilasta verrokeista. (Machado ym. 2005.)
Monet keinonenää hyödyntävistä tutkimuksista keskittyvät keuhkosyöpään ja sen aiheuttamiin
muutoksiin uloshengitysilmassa. Itse syöpäkasvaimen hajua ei ole analysoitu, hengitysilman
volatiivisiin aineisiin vaikuttavat monet muutkin muuttujat.
Aikaisemmin on jo osoitettu, että elektroninen nenä kykenee erottamaan kasvatetuista solulinjoista
malignit benigneistä (Roine ym. 2012) ja lisäksi, että eturauhassyöpä voidaan erottaa
hyvänlaatuisesta liikakasvusta virstanäytteen kaasufaasia haistellen (Roine ym. 2014). Verrattuna
8.
massaspektometriin elektroninen nenä tunnistaa laajemman joukon haihtuvia orgaanisia yhdisteitä.
Elektronisen nenän etuina ovat myös laitteen helppokäyttöisyys ja kyky analysoida
valmistelemattomia näytteitä normaalissa ilmanpaineessa. Sen käyttö on huomattavasti halvempaa
ja laitekoko sallii helpon liikuttelun. (Wilson & Manuela 2011.)
Viime vuosina elektronista nenää on käytetty etenkin keuhkosyövän ja melanooman tunnistamiseen.
(Di Natale ym. 2003, Machado ym. 2005, D’Amigo ym. 2008, Dragonieri ym. 2009, D’Amigo
2010.)
3. Tutkimushypoteesit
Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, eroavatko eturauhassyöpäsolujen ja hyvänlaatuisten
eturauhassolujen hajut toisistaan ja miten polyamiinieritystä lisäävä DENSpm vaikuttaa solujen ja
niiden mediumien hajuun. Voimakkaat muutokset mediumin hajussa viittaisivat polyamiinien
keskeiseen rooliin ”syövän hajun” taustalla olevina molekyyleinä. Syöpäsoluina käytettiin LNCapsoluja ja verrokkeina EP-156T-soluja.
Tässä tutkielmassa keskitytään selvittämään seuraavia hypoteeseja:
1a. LNCaP ja EP-156T –solujen hajut eroavat toisistaan 0 h kohdalla.
1b. LNCap ja EP-156T -solujen hajut eroavat toisistaan 96 h kohdalla.
2a. LNCaP –solujen haju muuttuu välillä 0 h - 96 h
2b. EP-156T –solujen haju muuttuu 0 h - 96 h
3a. LNCap -solujen mediumin haju muuttuu välillä 0 h – 96 h
3b. EP-156T -solujen mediumin haju muuttuu välillä 0 h – 96 h
4a. LNCaP –solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 0 h kohdalla.
4b. EP-156T -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 0 h kohdalla.
5a LNCaP -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 96 h kohdalla.
5b EP-156T -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 96 h kohdalla.
9.
4. Aineisto ja menetelmät
4.1. Soluviljelmät
LNCaP-solut ovat peräisin levinnyttä eturauhaskarsinoomaa sairastaneelta valkoihoiselta mieheltä.
Etäispesäke oli vasemmassa supraklavikulaarisessa imusolmukkeessa. Vastaavasti EP-156T -solut
ovat lähtöisin 66-vuotiaan potilaan eturauhasesta ja ne ovat telomeraasi-immortalisoituja. EP-156T
solut käyttäytyvät kuten eturauhasen tyvisolut (Kogan ym. 2006). Molempia solulinjoja on käytetty
paljon vastaavissa tutkimusasetelmissa.
Solulinjat kasvatettiin tuottajan ohjeiden mukaan (LNCaP: American Type Culture Collection –
LGC Standards, Teddington, YK, sekä EP-156T: V Rotter; Weizmann Institute of Science, Rehovot,
Israel). Viljelyissä käytettiin 100 x 20 mm soluviljelymaljoja (NUNC, International, NY, USA).
Maljalle lisättiin 10 ml viljelynestettä, joka LNCaP-soluille oli RPMI-1640 medium
(BioWhitaker/Lonza, Verviers, Belgia) lisättynä 10 % standardoitua naudan sikiön seerumia
(HyClone Laboratories, Inc., UT, USA) ja 2 mM L-glutamiinia (BioWhiteker/Lonza). EP-156Tsolujen kasvatusneste puolestaan oli seerumitonta keratinosyyttiä (Gibco, Life Technologies, Ltd,
Paisley, YK), johon lisättiin 1 % standardoitua naudan sikiön seerumia (HyClone) sekä 5 ng/ml
natriumseleniittiä (Sigma-Aldrich, MO, USA), 5 ng/ml epidermaalista kasvutekijää (Invitrogen Inc.
Helsinki, Suomi), 50 μg/ml naudan aivolisäkeuutetta (Invitrogen) ja 10 nM dihydrotestosteronia
(A2570-000, Steraloids, Inc. RI, USA).
Analysoitavat näytteet kerättiin, kun kasvu ylsi 80 % konfluenssiin. LNCaP-solut saavuttivat tämän
kattavuuden noin neljässä vuorokaudessa, vastaavasti EP-156T-solut 6 vuorokaudessa.
Kasvatusaine (=medium) kerättiin ja jäädytettiin (-80 °C). Solut käsiteltiin trypsiinillä ja
sentrifugoitiin (200 x g, huoneenlämmössä). Tämän jälkeen solut pestiin fosfaattipuskuroidulla
suolaliuoksella ja sentrifugoitiin uudelleen. Muodostuneet solupelletit pakastettiin -80
celsiusasteessa. Kontrollinäytteiksi edellä mainitulla tavalla käsiteltiin myös pelkkää mediumia.
Molemmista solulinjoista tehtiin näin 2 x 5 viljelmän sarjaa. Toista sarjaa käsiteltiin DENSpmsolunsalpaajalla. Näytteet kerättiin 0 h ja 96 h kohdalla. Tässä tutkimuksessa käsiteltiin ainoastaan
DENSpm:llä käsiteltyjä näytteitä, jolloin aineistoksi muodostui 20 solu- ja 20 mediumnäytettä.
10.
4.2 ChemPro 100
Tässä tutkimuksessa käytettiin suomalaisen Environics Oy:n valmistamaa ChemPro 100 kaasuanalysaattoria. Kyseessä on Open Loop Ion Mobility Spectrometry eli IMS. Analysaattori
liitettiin kannettavaan tietokoneeseen, jossa oli Windows UIP -ohjelmisto. Tämä laitteisto
mahdollistaa kemiallisen spektrin tallentamisen reaaliajassa myöhempää analysointia varten.
IMS-tekniikalla volatiiviset molekyylit luokitellaan niiden varauksen, massan sekä liikkuvuuden
mukaan. Molekyylien liikkumiskykyyn vaikuttavat sen koko ja muoto. IMS-tekniikka hyödyntää
ionien ja ilmamolekyylien välisiä törmäyksiä ja mittaaminen voidaan suorittaa normaalissa
ilmanpaineessa. ChemPro 100 -laitteessa käytetään Am-241-säteilylähdettä, joka ionisoi laitteeseen
imetyt molekyylit. Ilmanäytteen ionisoinnin jälkeen ionit ohjataan virtausputkeen, joka on eristetty
ympäröivästä ilmasta. Virtausputkessa on tasainen heikko sähkökenttä, joka poikkeuttaa ioneja
kohti putken seinämillä olevia detektoreja. Törmäykset muihin molekyyleihin hidastavat ionien
liikettä. Osa molekyyleistä osuu detektoreihin aiheuttaen sensoreihin sähköisiä signaaleja, joiden
perusteella saadaan tietoa ionivarauksen identiteetistä ja konsentraatiosta.
Ioni-molekyylireaktiosarjan seurauksena näytemolekyyli, jossa on korkea protoniaffiniteetti, reagoi
kosteassa ilmassa protonitransferin vaikutuksesta positiivisesti varautuneeseen ioniin.
Selektiivisyyttä voidaan muokata lisäämällä virtauskaasuun ammoniakkia, asetonia tai
klooriyhdisteitä tai muita vastaavia aineita. Aineet, joissa on elektroninsieppausominaisuuksia,
kuten halogenoidut yhdisteet, voidaan tunnistaa potentiaalisen inversion ja negatiivisten ionien
kautta. Toinen usein käytetty vaihtoehto on UV-fotoionisointi, missä tutkitaan riittävän alhaisen
ionisaatiopotentiaalin yhdisteitä. Se soveltuu mittaamiseen tilanteissa, joissa molekyylien
ionisaatiopotentiaali on alhaisempi kuin 8-12 eV.
4.3. Mittausjärjestely
Tutkimusnäytteet asetettiin lasisille petrimaljoille (halkaisija 10 cm), jotka oli peitetty
parafiinikalvolla. Tasaantumisajan jälkeen laite otti imuilmanäytteen (gasous headspace) kanyylin
kautta ja korvausilma kanavoitiin paksulla neulalla.
11.
Kokeet suoritettiin laminaarivirtauskaapissa (Kojair) siten, että petrimaljat olivat vesihauteessa (37
°C) ja niiden annettiin tasaantua 10 minuutin ajan. Laitteella mitattiin keraamisissa kennoissa (16
kpl) ja kaasujen havaitsemiseen tarkoitetuissa erillisissä puolijohdekennoissa (2 kpl) sähkökentän
ylläpitämiseen vaadittavan virran (pA), mikä muuttuu hiukkasten koon ja varauksen mukaan.
Puolijohdekanavat jätettiin analyysin ulkopuolelle. 16-kanavainen aineisto analysoitiin käyttäen
Matlab-ohjelmistoa (Mathworks, Natick, MA). Tiedot analysoitiin Tampereen teknillisessä
yliopistossa. Pienillä aineistoilla moniulotteinen data edellyttää dimensioreduktiota.
Dimensioreduktiossa käytettiin pääkomponentti analyysia (principal component analysis, PCA) ja
moniulotteista skaalausta (multidimensional scaling, MDS).
Kuvat ja luokittelut on tehty sekä MDS- että PCA-reduktiolla. Ristivalidaatio suoritettiin leave one
out -menetelmällä. Menetelmän periaatteena on arvioida kuinka yleistettävä malli tulosten
perusteella saadaan.
5. Tulokset
Aineisto on tutkittu kesäkuussa 2012.
Tutkimusaineistossa on yhteensä 40 näytettä. Jokaista hypoteesia varten tutkittiin 10 näytettä, missä
on 5 kumpaakin vertailtavaa tulosta. Muuttujia on 16, joten tulosten luokittelua varten tarvittiin
dimensioreduktio.
Kuvat ja luokittelut on tehty sekä MDS- että PCA-reduktiolla. Kuvat on redusoitu kahteen
ulottuvuuteen ja luokitteluissa on tehty leave one out-ristiinvalidoinnit dimensioilla 2-5.
12.
Hypoteesi 1a: LNCaP ja EP-156T –solujen hajut eroavat toisistaan 0 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
20
30
20
20
20
20
3
20
10
20
10
20
20
4
10
20
10
20
10
20
5
10
10
20
10
10
10
6
20
NA
0
0
10
10
KA
16
18
14
12
14
16
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 15 (vaihteluväli eri menetelmillä 10-14), joten luokittelu
onnistuu hyvin. Tämä voidaan todeta myös silmämääräisesti.
13.
Hypoteesi 1b: LNCap ja EP-156T -solujen hajut eroavat toisistaan 96 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
10
NA
10
10
0
0
3
10
NA
10
10
30
30
4
30
NA
30
30
0
0
5
0
NA
20
20
0
0
6
10
NA
20
20
0
0
KA
12
NA
18
18
6
6
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 12 (vaihteluväli 6-18 %) eli erottelu onnistuu hyvin ja
toteutuu myös silmämääräisesti. AREA-MDS ei onnistunut.
14.
Hypoteesi 2a: LNCaP –solujen hajut eroavat toisistaan 0 h ja 96 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
30
30
70
80
30
40
3
20
20
20
20
40
40
4
20
20
20
20
30
30
5
30
30
20
20
30
30
6
40
50
40
40
50
50
KA
28
30
34
36
36
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 33 (vaihteluväli 28-38 %) eli luokittelu onnistuu
kohtalaisesti. Hypoteesi 2a toteutuu, eli solujen haju muuttuu hieman.
15.
38
2b: EP-156T –solujen hajut eroavat toisistaan 0 h ja 96 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
80
NA
80
NA
60
60
3
90
NA
90
NA
70
70
4
70
NA
50
NA
90
70
5
70
NA
70
NA
30
40
6
60
NA
60
NA
30
30
KA
60
NA
60
NA
30
30
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 45 (vaihteluväli 30-60 %) eli luokittelu onnistuu heikosti. .
Hypoteesi 2b ei toteudu. Solujen hajut eivät eroa toisistaan.
16.
Hypoteesi 3a: LNCap -solujen mediumin haju muuttuu välillä 0 h – 96 h.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
50
50
50
50
30
40
3
50
50
40
60
50
40
4
70
70
60
70
30
30
5
20
50
10
10
30
40
6
30
30
20
10
30
40
KA
44
50
36
40
34
38
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 40 (vaihteluväli 34-50 %) eli luokittelu onnistuu heikosti.
Tämä hypoteesi ei toteudu. LNCap -solujen mediumin haju ei muutu 96 tunnissa.
17.
Hypoteesi 3b: EP-156T -solujen mediumin haju muuttuu välillä 0 h – 96 h.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
40
NA
40
40
40
50
3
50
NA
40
80
60
60
4
50
NA
50
40
60
50
5
60
NA
40
60
60
50
6
70
NA
70
70
70
60
KA
54
NA
48
58
58
52
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 54 (vaihteluväli 48-58 %) eli luokittelu ei onnistu.
Hypoteesi ei siis toteudu. EP-156T -solujen mediumin haju ei muutu 96 tunnissa.
18.
Hypoteesi 4a: LNCaP –solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 0 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
30
30
20
30
10
20
3
30
40
30
30
10
10
4
30
30
40
40
10
0
5
40
40
20
40
0
0
6
10
0
10
10
0
10
KA
28
28
24
30
6
8
Virheluokitteluprosentti on 21 (vaihteluväli 6-30 %) eli luokittelu onnistuu kohtalaisesti. LNCAP solujen ja niiden mediumin hajut eroavat jonkin verran toisistaan 0 h kohdalla.
19.
Hypoteesi 4b: EP-156T -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 0 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
0
0
0
0
10
20
3
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
5
0
NA
0
0
0
0
6
0
NA
0
0
0
0
KA
0
NA
0
0
2
4
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 1 (vaihteluväli 0-4 %) eli luokittelu onnistuu erinomaisesti.
Hypoteesi on tosi. EP-156T -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 0 h kohdalla.
20.
Hypoteesi 5a: LNCaP -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 96 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
60
50
60
50
30
40
3
80
80
80
80
20
30
4
70
60
70
60
40
40
5
40
50
50
50
50
40
6
60
50
50
50
50
50
KA
62
58
62
58
38
32
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 52 (vaihteluväli 32-63 %) eli luokittelu ei onnistu.
LNCap -solujen ja niiden mediumin hajut eivät eroa toisistaan lainkaan 96 h kohdalla.
21.
Hypoteesi 5b: EP-156T -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat toisistaan 96 h kohdalla.
AREA
NORM
z-score
D
PCA
MDS
PCA
MDS
PCA
MDS
2
0
NA
0
0
0
0
3
10
NA
10
0
0
0
4
10
NA
0
0
0
0
5
0
NA
0
0
10
0
6
10
NA
10
10
10
10
KA
6
NA
4
2
4
2
Virheluokitteluprosentti on keskimäärin 4 (vaihteluväli 2-6 %) eli luokittelu onnistuu erinomaisesti.
Hypoteesi on tosi. EP-156T -solujen ja niiden mediumin hajut eroavat 96 h kohdalla toisistaan.
22.
6. Pohdinta
Tärkeimpänä tuloksena on, että terveet solut ja syöpäsolut eroavat toisistaan hajun perusteella. Ero
on suurempi 0 h kohdalla kuin 96 h kuluttua. Toinen löydös oli, että molempien solulinjojen hajut
eroavat mediumiensa hajusta 0 h kohdalla. Tulosten perusteella DENSpm muuttaa LNCaPin hajua,
mutta hyvänlaatuisten EP-156T -solujen hajuun se ei vaikuta. Solujen mediumin haju ei näytä
muuttuvan DENSpm:n vaikutuksesta.
Kuten aikaisemmin todettiin, syövässä solut ovat proliferaatiovaiheessa. Eturauhassyövässä
arginaasin ja DAO:n pitoisuudet kasvavat. Molempien vaikutuksesta lisääntyvät alempiarvoiset
polyamiinit, putreskiini ja spermidiini. Spermiinin tuotanto kiihtyy vasta solun erikoistumisen
myötä, syöpäsolu ei erikoistu ja näin ollen eturauhassyöpäsoluissa on matala spermiinipitoisuus.
Terveissä soluissa (EP-156T) spermiinipitoisuus on korkea ja ylimäärä spermiiniä pumpataan
aktiivisesti ulos solusta. Näin ollen DENSpm:n vaikutus solujen toimintaan ei ole todennäköisesti
ole yhtä merkittävä kuin syöpäsoluihin. Syöpäsoluissa (LNCaP) spermiinipitoisuudet ovat
lähtökohtaisesti matalia, jolloin DENSpm:n vaikutuksesta spermiinin määrä laskee niin matalaksi,
että solu ei enää selviydy vaan ajautuu apoptoosiin. DENSpm:n vaikutuksesta runsaasti lisääntynyt
SSAT-entsyymin toiminta saa aikaan myös vetyperoksidien lisääntymisen, joka oksidatiivisen
stressin kautta tuhoaa solua ja saa aikaan lopulta apoptoottisen solukuoleman. On siis mahdollista,
että DENSpm:n lisäyksen aiheuttama muutos LNCaP:n hajuun ilmentää apoptoosiin ja
sytotoksisuuteen liittyviä muutoksia, jotka eivät EP-156T-soluissa ilmene, eikä niiden haju näin
ollen muutu.
DENSpm:n lisääminen ei 96 tunnin viljelyn aikana muuttanut merkittävästi muuttanut mediumin
hajua kummankaan solulinjan kohdalla, vaikka polyamiinien määrän mediumissa pitäisi
lisääntyneen SSAT-aktiivisuuden vuoksi olla selvästi kohonnut. Tämä löydös ei tue hypoteesia
polyamiineista ”syövän hajun” taustalla olevina molekyyleinä, vaan syöpään liittyvä haju selittyy
todennäköisesti muilla tekijöillä.
Bartolazzin ym. tekemässä tutkimuksessa todettiin, että jokaisella kasvaintyypillä on oma
kemiallinen hajunsa (Bartolazzi ym. 2010). Koska tämän tutkimuksen tulokset eivät tue
polyamiinien roolia ”syövän hajua” selittävinä molekyyleinä, on jatkossa syytä suunnata katse
oksidatiiviseen stressiin ja apoptoosiin liittyviin pieniin, epäspesifeihin molekyyleihin.
23.
7. Johtopäätökset
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia elektronisella nenällä, eroavatko hyvän- ja pahanlaatuinen
eturauhassolulinja toisistaan ja millaisia muutoksia DENSpm:n lisääminen 96 tunnin inkuboinnin
ajaksi aiheuttaa soluihin ja niiden mediumeihin. Saatujen tulosten perusteella DENSpm näyttää
vaikuttavan pahanlaatuisen eturauhassolulinjan aineenvaihduntaan, mikä heijastuu solujen hajuun.
Mediumin haju ei kuitenkaan muutu. Tämä viittaa siihen, että DENSpm:n polyamiinien
ulospumppausta aiheuttava vaikutus ei ole suoraan hajumuutoksen takana ja näin ollen polyamiinit
eivät tällä perusteella selitä solulinjojen hajueroa.
24.
8. Lähteet
Bartolazzi A, Santonico M, Pennazza G, Martinelli E, Paolesse R, D’Amico A, Di Natale C. A
sensor array and GC study about VOCs and cancer cells. Elsevier, Sensors and Actuators 2010;
B146: 483–488.
Bettuzzi S, Davalli P, Astancolle S, Pinna C, Roncaglia R, Boraldi F, Tiozzo R, Sharrardc M, Corti
A. Coordinate Changes of Polyamine metabolism regulatory proteins During the Cell Cycle of
Normal Human Dermal Fibroblast. FEBS Lett, 1999; 1:18-22.
Casero RA Jr, Marton LJ. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other
hyperproliferative diseases. Nature reviews. 2007 May; 6:373-390.
D'Amico A, Bono R, Pennazza G, Santonico M, Mantini G, Bernabei M, Zarlenga M, Roscioni C,
Martinelli E, Paolesse R, Di Natale C. Identification of melanoma with a gas sensor array. Skin Res
Technol. 2008 May;14(2):226-236.
D’Amico A, Pennazza G, Santonico M, Martinelli E, Roscioni C, Galluccio G, Paolesse R,
Di Natale C. An investigation on electronic nose diagnosis of lung cancer. Lung Cancer. 2010 May;
68(2):170–176.
Di Natale C, Macagnano A, Martinelli E, Paolesse R, D'Arcangelo G, Roscioni C, Finazzi-Agrò A,
D'Amico A. Lung cancer identification by the analysis of breath by means of an array of nonselective gas sensors. Biosens Bioelectron. 2003 Sep;18(10):1209-1218.
Dragonieri S, Annema JT, Schot R, van der Schee MP, Spanevello A, Carratú P, Resta O, Rabe KF,
Sterk PJ. An electronic nose in the discrimination of patients with non-small cell lung cancer and
COPD. Lung Cancer. 2009 May;64(2):166-170.
Eisenberg T, Knauer H, Schauer A, Büttner S, Ruckenstuhl C, Carmona-Gutierrez D, Ring J,
Schroeder S, Magnes C, Antonacci L, Fussi H, Deszcz L, Hartl R, Schraml E, Criollo A, Megalou
E, Weiskopf D, Laun P, Heeren G, Breitenbach M, Grubeck-Loebenstein B, Herker E, Fahrenkrog
B, Fröhlich KU, Sinner F, Tavernarakis N, Minois N, Kroemer G, Madeo F. Induction of autophagy
by spermidine promotes longevity. Nat Cell Biol. 2009 Nov; 11(11):1305-1314.
Gendron KB, Hockstein NG, Thaler ER, Vachani A, Hanson CW. In vitro discrimination of tumor
cell lines with an electronic nose. Otolaryngol Head Neck Surg. 2007; 137(2):269-273.
Gerner EW, Meyskens FL Jr. Polyamines and cancer: old molecules, new understanding. Nature
Reviews. 2004 Oct; 4: 781-792.
Greenberg G, Haraway MM. Comparative Psychology: A Handbook. 1998:388.
van der Graaf M, Schipper RG, Oosterhof GO, Schalken JA, Verhofstad AA, Heerschap A. Proton
MR-spectroscopy of prostatic tissue focused on the detection of spermine, possible biomarker of
malignant behavior in prostate cancer. Magma 2000; 10(3): 153-159.
Harrison GA. Spermine in human tissues. Biochem. J. 1931; (25):1885–1892.
Hiramatsu K, Sugimoto M, Kamei S, Hoshino M, Kinoshita K, Iwasaki K, Kawakita M. Diagnostic
and prognostic usefulness of N1,N8-diacetylspermidine and N1,N12-diacetylspermine in urine as
25.
novel markers of malignancy. J Cancer Res Clin Oncol. 1997; 123(10):539-545.
Hiramatsu K, Takahashi K, Yamaguchi T. N1,N12–Diacetylspermine as a sensitive and specific
novel marker for early- and late-stage colorectal and breast cancers. Clin Cancer Res. 2005 Apr;
11:2986-2990.
Hölttä E. Polyamiinit ja solujen kasvu. Duodecim. 1990; 106:278-287.
Kawakita M, Hiramatsu K. Diacetylated derivatives of spermine and spermidine as novel promising
tumor markers. J Biochem. 2006 Mar; 139(3):315-22.
Kee K, Foster BA, Merali S, Kramer DL, Hensen ML, Diegelman P, Kisiel N, Vujcic S, Mazurchuk
RV, Porter CW. Activated polyamine catabolism depletes acetyl-CoAA pools and suppresses
prostate tumor growth in TRAMP mice. J Biol Chem. 2004; 279(38): 40076-40083.
Kermany BG, Schiffman SS, Nagle HT. A novel method for reducing the dimensionality in a sensor
array. IEEE Trans Instr Meas. 1998;47:728–741.
Kermany BG, Schiffman SS, Nagle HT. Using neural networks and genetic algorithms to enhance
performance in an electronic nose. IEEE Trans Biomed Eng. 1999;46:429–439
Keskinege A, Elgun S, Yilmaz E. Possible implications of arginase and diamine oxidase in prostatic
carcinoma. Cancer Detect Prev. 2001; 25(1):76-79.
Koide T, Sakai S, Kawada Y, Hara A, Sawada H. Detection of polyamines by a new enzymatic
differential assay. (8) Studies on tissue polyamine concentrations in patients with genitourinary
malignant diseases. Hinyokika Kiyo. 1990; 36(10):1109-1116.
Kogan I, Goldfinger N, Milyavsky M, Cohen M, Shats I, Dobler G, Klocker H, Wasylyk B, Voller
M, Aalders T, Schalken JA, Oren M,, Rotter V. hTERT-Immortalized Prostate Epithelial and
Stromal-Derived Cells: an Authentic In vitro Model for Differentiation and Carcinogenesis. Cancer
Res. 2006 Apr.66: (7); 3531-3540.
Lesniak A, Walczak M, Jezierski T, Sacharczuk M, Gawkowski M, Jaszczak K. Canine Olfactory
Receptor Gene Polymorphism and Its Relation to Odor Detection Performance by Sniffer Dogs.
Journal of heredity, 2008; 99:518-527.
Machado RF, Laskowski D, Deffenderfer O, Burch T, Zheng S, Mazzone PJ, Mekhail T, Jennings
C, Stoller JK, Pyle J, Duncan J, Dweik RA, Erzurum SC. Detection of lung cancer by sensor array
analyses of exhaled breath.. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005; 171(11):1286-1291.
Mi Z, Kramer DL, Miller JT, Bergeron RJ, Bernacki R, Porter CW. Human prostatic carcinoma cell
lines display altered regulation of polyamine transport in response to polyamine analogs and
inhibitors. The Prostate. 1998; 34:51-60.
Moinard C, Cynober L, de Bandt JP. Polyamines: metabolism and implications in human diseases.
Clinical nutrition 2005; 24:184-197.
Nakayma Y, Takayuki T, Minagawa N, Yamaguchi K. The clinical usefulness of urinary N1,N12diacetylspermine (DiAcSpm) levels as a tumor marker in patients with colorectal cancer, Oncol
Lett. 2012 May; 3(5): 970–974.
26.
Pegg AE: Perspectives in cancer research. Polyamine metabolism and its importance in neoplastic
growth as a target for chemotherapy. Cancer Res. 1988; 48:751-774.
Pledgie A, Huang Y, Hacker A, Zhang Z, Woster PM, Davidson NE, Casero RA Jr. Spermine
Oxidase SMO(PAOh1), not N1-acetylpolyamine oxidase PAO, is the primary source of cytotoxic
H2H2n in polyamine analogue-treated Human breast cancer cell lines. J Biol Chem. 2005;
280:39843-39851.
Qutob SS, Proulx D, Mesak FM, Ng CE. Effects of N1,N13-diethylnorspermine (DENSpm) and Xradiation treatment on human colorectal tumor clones with varying x-radiation and drug responses.
Radial Res. 2005 Apr; 163(4):357-363.
Roine A, Tolvanen M, Sipiläinen M, Kumpulainen P, Helenius MA, Lehtimäki T, Vepsäläinen J,
Keinänen TA, Häkkinen MR, Koskimäki J, Veskimäe E, Tuokko A, Visakorpi T, Tammela TL,
Sioris T, Paavonen T, Lekkala J, Helle H, Oksala NKJ.. Detection of smell print differences between
nonmalignant and malignant prostate cells with an electronic nose. Future Medicine. 2012; 8(9),
1157-1165.
Roine A, Veskimäe E, Tuokko A, Kumpulainen P, Koskimäki J, Keinänen TA, Häkkinen M,
Vepsäläinen J, Paavonen T, Lekkala J, Lehtimäki T, Tammela TL, Oksala NKJ. Detection of
Prostate Cancer by an Electronic Nose: A Proof of Principle Study. J Urology. 2014 July 2014;
192(1):230–235.
Russo A, Piovani M, Clericuzio M, Lombardo L, Tabasso S, Chamy MC, Vidari G, Cardile V, VitaFinzi P, Garbarino JA. Putrescine-1,4-dicinnamide from Pholiota spumosa (Basidiomycetes)
inhibits cell growth of human prostate cancer cells. Phytomedicine. 2007; 14(2-3):185-191.
Röck F, Barsan N, Weimar U. Electronic nose: current status and future trends. Chem Rev.
2008;108:705-725.
Saunders FR, Wallace HM. On the natural chemoprevention of cancer. Plant Physiology and
Biochemistry. 2010; 48:621-626.
Simon H-U, Haj-Yehia A, Levi-Schaffer F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis
induction. Apoptosis 2000; 5:415-418.
Soda K. The mechanisms by which polyamines accelerate tumor spread. Journal of Experimental &
Clinical Cancer Research 2011; 30:95.
Suomen syöpärekisteri: www.cancer.fi/syoparekisteri
Tian Y, Wang S, Wang B, Zhang J, Jiang R, Zhang W. Overexpression of SSAT by DENSpm
treatment induces cell detachment and apoptosis in glioblastoma. Oncol Rep. 2012 Apr; 27(4):12271232.
Teti D, Visalli M, McNair H. Analysis of polyamines as markers of (patho)physiological conditions.
J of Chromatography B 2002; 781:107-149.
Thomas T, Balabhadrapathruni S, Gallo MA, Thomas TJ. Development of polyamine analogs as
cancer therapeutic agents. Oncol Res. 2002; 13(3):123-135.
27.
Turner APF, Magan N. Electronic noses and disease diagnostics. Nature Reviews volume 2. 2004
Feb; 161-166.
Wang J-Y, Casero RA. Polyamine cell signaling. Humana Press. 2006; 91-95.
Williams H, Pembroke A. Sniffer dogs in the melanoma clinic? Lancet. 1989 Apr; 8640:734.
Wilson AD, Manuela B. Advances in electronic nose technologies developed for biomedical
applications. Sensors 11. 2011; 1105-1176.
Wolff AC, Armstrong DK, Fetting JH, Carducci MK, Riley CD, Bender JF, Casero RA Jr.,
Davidson NE. A phase II study of the polyamine analog N1,N11-diethylnorspermine (DENSpm)
daily for five days every 21 days in patients with previously treated metastatic breast cancer. Clin
Cancer Res. 2003 Dec 1; 9:5922-5928.
28.