Linkki julkaisuun - UEF Electronic Publications - Itä

ULTRASUODATUSMENETELMÄ BAKTEERIEN JA
VIRUSTEN SAMANAIKAISEEN KONSENTROINTIIN
SUURISTA VESITILAVUUKSISTA
Sallamaari Siponen
Pro gradu -tutkielma
Ympäristötiede
Itä-Suomen yliopisto, Ympäristötieteen laitos
Elokuu 2014
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta
Ympäristötiede
Sallamaari Siponen: Ultrasuodatusmenetelmä bakteerien ja virusten samanaikaiseen
konsentrointiin suurista vesitilavuuksista
Pro gradu -tutkielma: 82 sivua
Tutkielman ohjaajat: FT Tarja Pitkänen, FT dos. Eila Torvinen, FT dos. Ilkka Miettinen
Elokuu 2014
________________________________________________________________________
Avainsanat: ultrasuodatus, konsentrointi, talousvesi, bakteerit, virukset
TIIVISTELMÄ
Vesimikrobiologisessa analytiikassa käytetään yleisesti melko pieniä vesinäytetilavuuksia.
Yleisimmin käytetty kalvosuodatusmenetelmä ei ole erityisen tehokas suurten
vesinäytetilavuuksien tutkimisessa. Näytetilavuus on yleisesti 100 ml tai erikoistapauksissa
muutamia litroja vettä. Näistä tilavuuksista ei välttämättä havaita pieninä lukumäärinä vedessä
esiintyviä
tautia-aiheuttavia
mikrobeja,
joiden
havaitseminen
esimerkiksi
talousvedentuotannon turvallisuuden arvioinnissa ja vesivälitteisten epidemioiden
selvitystilanteissa olisi tärkeää.
Tässä työssä tutkittiin ultrasuodatusmenetelmän soveltuvuutta eri mikrobiryhmien
samanaikaiseen konsentrointiin suurista vesitilavuuksista. Työssä otettiin käyttöön
ristivirtaustekniikkaan perustuva ultrasuodatuslaitteisto. Laitteiston toimintaa testattiin ja
bakteerien ja virusten konsentroinnin suhteellista saantoa selvitettiin ensin laboratorioolosuhteissa ja pilot-mittakaavan vesilaitoksella näytevedellä, jossa oli tunnettu lukumäärä
Escherichia coli -bakteeria, somaattisia ja F-spesifisiä kolifageja tai norovirusta. Satojen
litrojen ultrasuodatusta testattiin vesilaitoksilla pohja- ja pintaveden näytteenotossa ja
verkostovedestä epidemiatilanteessa. Ultrasuodatusnäytteestä ja pulloihin otetusta samasta
näytevedestä määritettiin ympäristöstä peräisin olevien tai suolistoperäistä saastumista
ilmentävien mikrobien lukumääriä.
Laitteiston suodatusnopeus vaihteli 550-1200 ml/min ja paine 0,7-1,1 baarin välillä. E. coli bakteerin saanto oli 10-71 %, F-spesifisten kolifagien saanto 4-19 % ja somaattisten kolifagien
saanto 16-42 %. Yhden suoritetun kokeen perusteella saanto norovirukselle oli 5 %.
Kenttäkokeissa saatiin suodatettua 236-1070 litraa alle vuorokaudessa. Tutkimuksen
kohdemikrobeja todettiin sekä ultrasuodatusmenetelmällä että pulloihin otetuista näytteistä.
Suodatinpatruunan tai laitteiston rakenne voi aiheuttaa mikrobien kiinnittymisen
suodatinpatruunaan, minkä arveltiin heikentävän ristivirtausmenetelmän saantoa.
Vastavirtahuuhtelun testaaminen tunnistettiin jatkotutkimustarpeeksi, koska se voi olla tehokas
menetelmä suodatinpatruunaan kiinnittyneiden mikrobien huuhteluun suodattimelta.
Ultrasuodatusmenetelmällä voidaan konsentroida suuren tilavuuden vesinäyte erilaisissa
kenttäolosuhteissa. Mikrobien havaitsemistodennäköisyys on suurempi 1000 litran tilavuudesta
50 %:n saannolla verrattuna alle litran tai jopa kymmenen litran näytetilavuuteen 100 %:n
saannolla. Menetelmän tehokkuutta erilaatuisten näytevesien mikrobikonsentrointiin ja käyttöä
yhdessä molekyylibiologisten menetelmien kanssa on tutkittava lisää.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry
Environmental Science
Sallamaari Siponen: Ultrafiltration method for simultaneous concentration of bacteria and
viruses in large water volumes
Master’s thesis: 82 pages
Supervisors: Tarja Pitkänen PhD, Eila Torvinen PhD doc., Ilkka Miettinen PhD doc.
August 2014
________________________________________________________________________
Keywords: ultrafiltration, concentration, drinking water, bacteria, viruses
ABSTRACT
Water sample volumes for microbial analysis are usually rather small. Membrane filtration is
one of the most used methods and it is not very effective for analysing large water volumes. A
sample volume is usually 100 ml and in some special cases few litres of water. Microbial
numbers may be so small that they are not detected in these volumes. It is important to detect
also small numbers of microbes when assessing safety of water supply or during water outbreak
investigations.
The goal of this study was to test ultrafiltration as a method for concentrating bacteria and
viruses simultaneously from large water volumes. An ultrafiltration apparatus was built and the
recovery of bacteria and viruses was tested in a laboratory and a pilot-scale water treatment
plant with water samples with known numbers of Escherichia coli bacteria, F-spesific
coliphages, somatic coliphages or norovirus. Ultrafiltration for filtrating hundreds of litres of
ground water and surface water was tested at water treatment plants and of tap water during a
waterborne outbreak. Microbes of environmental or feacal origin were analysed from water
samples using ultrafiltration method and bulk water sampling.
Filtration rate ranged from 550 to 1200 ml/min and pressure from 0.7 to 1.1 bar. Recoveries for
E. coli -bacteria, F-spesific coliphages, somatic coliphages and norovirus were 10-71 %, 4-19
%, 16-42 % and 5 % respectively. The ultrafiltration sample volumes varied from 236 to 1070
litres and were filtrated in less than 24 hours. The targeted microbes were detected with the
ultrafiltration and the bulk water sampling method. The construction of the ultrafilter or the
apparatus was assumed to have an effect on microbes causing low recovery due to the
attachment of microbes on the filter. Backflushing the ultrafilter should be tested in the future
since it could effectively detach the microbes from the filter.
It was found that ultrafiltration method can be used to concentrate large water volumes on-site.
For example, with sample volume of 1000 litres and recovery of 50 %, the detection probability
of microbes is higher than with the sample volume of some litres with recovery of 100 %.
Microbial concentration efficiency of the ultrafiltration method with different water samples
should be further tested. Also the use with secondary concentration and molecular
microbiolology detection methods together with the ultrafiltration should be investigated in
detail.
ESIPUHE
Tein Pro gradu -tutkielmani kokeellisen osuuden Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen
Ympäristöterveyden osastossa Vesi ja terveys -yksikössä vuoden 2012 aikana. Tutkielma on
osa
Vesihuoltolaitosten
kehittämisrahaston
rahoittamaa
projektia
”Tehostettu
vesiturvallisuuden monitorointi: Pikamittausmenetelmä elinkykyisten E. coli -bakteerien
havaitsemiseen”, joka toteutettiin yhteistyössä Kuopion Veden, Savonia-ammattikorkeakoulun
ja sosiaali- ja terveysministeriön kanssa.
Kiitän ohjaajiani FT Tarja Pitkästä, FT dosentti Eila Torvista ja FT dosentti Ilkka Miettistä
kärsivällisestä ohjauksesta ja kannustuksesta. Haluan kiittää myös Tiina Heiskasta, Tarja
Rahkosta, Ari Kauppista, Pia Räsästä, Maija Nykästä ja koko muuta Vesi ja terveys -yksikön
henkilökuntaa avusta tämän työn suorittamisessa. Kiitoksen ansaitsevat myös Tero Kuhmonen
ja Eero Antikainen Savonia-ammattikorkeakoululta, Markku Lehtola Kuopion Vedeltä, Ari
Kainulainen Siilinjärven kunnalta ja Aki Artimo, Osmo Puurunen ja Jorma Paavola Turun
Seudun Vedeltä.
Kiitos myös perheelleni ja ystävilleni tärkeästä tuesta ja kannustuksesta.
Kuopiossa 27.8.2014
Sallamaari Siponen
LYHENTEET
CC = Chromocult Coliform Agar
DAPI = 4’,6-diamidino-2-phenylindole
MF = Membrane filtration, kalvosuodatus
NaPP = Natriumpolyfosfaatti
PEG = Polyetyleeniglykoli
PFU = Plaque forming unit, plakin muodostava yksikkö
PMY = Pesäkkeen muodostava yksikkö
RCF = Centrifugal rotation force, keskipakoisvoima
RPM = Rounds per minute, kierrosta minuutissa
STM = Sosiaali- ja terveysministeriö
TSA = Tryptone soya agar, tryptooni-soija-agar
TSB = Tryptone soya broth, tryptooni-soija-liemi
TSC = Tryptoosi-sulfiitti-sykloseriini-agar
UF = Ultrafiltration, ultrasuodatus
WHO = World Health Organization, Maailman terveysjärjestö
WSP = Water safety plan, vesiturvallisuussuunnitelma
SISÄLLYS
Esipuhe .................................................................................................................. 5
Lyhenteet ............................................................................................................... 6
1
Johdanto .......................................................................................................... 9
2
Kirjallisuuskatsaus........................................................................................ 11
2.1
Talousveden mikrobiologinen turvallisuus ............................................................... 11
2.2
Vesiepidemiat ja niiden syyt...................................................................................... 12
2.3
Talousveden mikrobiologisen laadun valvonta ja hallinta ........................................ 14
2.3.1
Suomen lainsäädäntö .......................................................................................... 15
2.3.2
WSP eli vesiturvallisuussuunnitelma ................................................................. 19
2.3.3
Talousveden mikrobiologisen laadun valvonnan haasteita ................................ 20
2.3.4
Laajennettu mikrobiologinen analytiikka talousveden laadun arviointiin ......... 21
2.4
Vesinäytteiden konsentrointitekniikat mikrobiologisia tutkimuksia varten .............. 25
2.4.1
Suodattaminen mikrobeja pidättävää materiaalia käyttäen ................................ 26
2.4.2
Sentrifugointi ...................................................................................................... 28
2.5
Ultrasuodatusmenetelmä ........................................................................................... 30
2.5.1
Ultrasuodatuksen toteutus .................................................................................. 31
2.5.2
Käytännön sovellutukset .................................................................................... 35
3
Työn tavoitteet .............................................................................................. 37
4
Aineisto ja menetelmät ................................................................................. 38
4.1
Ultrasuodatusmenetelmä ja laitteisto ......................................................................... 38
4.1.1
Ultrasuodatuslaitteisto ........................................................................................ 38
4.1.2
Ultrasuodatuksen esivalmistelut ......................................................................... 39
4.1.3
Näytteen suodatus ultrasuodatuslaitteistolla ...................................................... 40
4.2
Testimikrobit ............................................................................................................. 41
4.2.1
Bakteeri- ja virusliuosten valmistus ................................................................... 41
4.2.2
Bakteerien määritys vesinäytteistä ..................................................................... 43
4.2.3
Virusten määritys vesinäytteistä......................................................................... 44
4.2.4
Heterotrofisen pesäkeluvun ja kokonaissolulukumäärän määritys .................... 45
4.3
Ultrasuodatusmenetelmän saantokokeet laboratorio-olosuhteissa ............................ 46
4.3.1
Laboratoriokoeasetelmat .................................................................................... 46
5
6
7
4.4
Koe pilot-mittakaavan vesilaitoksella ....................................................................... 49
4.5
Ultrasuodatusmenetelmän testaus kenttäolosuhteissa ............................................... 51
4.5.1
Testaus esikäsitellyllä pintavedellä .................................................................... 52
4.5.2
Testaukset pohjavedenottamoilla ....................................................................... 53
4.5.3
Testaus verkostovedellä vesiepidemiatilanteessa............................................... 53
Tulokset ........................................................................................................ 54
5.1
Suodatusnopeuden testaus laboratorio-olosuhteissa .................................................. 54
5.2
Saantokokeet .............................................................................................................. 55
5.3
Koe pilot-mittakaavan vesilaitoksella ....................................................................... 58
5.4
Kenttäkokeet .............................................................................................................. 58
Tulosten tarkastelu........................................................................................ 63
6.1
Ultrasuodatusmenetelmän toiminta ........................................................................... 63
6.2
Bakteerien ja virusten konsentrointitehokkuus.......................................................... 65
6.3
Ultrasuodatusmenetelmän toimintakyky erilaisissa kenttäolosuhteissa .................... 68
Johtopäätökset .............................................................................................. 71
Lähdeluettelo ....................................................................................................... 72
9
1
JOHDANTO
Juomaveden
turvallisuus
on
perusedellytys
yhteiskunnan
normaalien
toimintojen
ylläpitämiseksi. Tautia-aiheuttavat mikrobit ovat yksi talousveden turvallisuutta uhkaava tekijä.
Jo pieni taudinauheuttajamikrobien lukumäärä saastuneessa talousvedessä voi aiheuttaa suuren
ihmismäärän samanaikaisen sairastumisen eli juomavesivälitteisen epidemian. Talousveden
saastumisen
ehkäisemiseksi
raakaveden
laadun,
vesilaitosten
toiminnan
ja
vedenjakeluverkoston tiiveyden turvaaminen on tärkeää. Uusia uhkia juomaveden
turvallisuudelle aiheuttavat ilmastonmuutoksen mukanaan tuomat sään ääreisilmiöt. (WHO
2011)
Veden saastumista ilmentävien mikrobien ja varsinaisten tautia aiheuttavien mikrobien pienet
lukumäärät osittain puhdistetuissa vesissä ja saastuneessa verkostovedessä aiheuttavat haasteita
niiden havaitsemiseen. Nykyään näytteet tutkittavasta vedestä otetaan pulloihin tai
kanistereihin ja tutkittu näytetilavuus on sadasta millilitrasta muutamiin litroihin vettä. Näistä
tilavuuksista pieniä mikrobilukumääriä ei välttämättä havaita. Pienten lukumäärien
havaitsemiseksi näytetilavuuden tutkittavasta vedestä tulisi olla riittävän suuri. Suuren
vesitilavuuden tutkiminen on nykyisillä menetelmillä aikaa vievää ja kallista. On kuitenkin
tilanteita, joissa suuren tilavuuden tutkiminen kannattaa. Esimerkiksi talousveden laadun
entistä paremmaksi turvaamiseksi tehtävä tuotantoketjun uhkien tunnistaminen ja riskien
arviointi edellyttävät arviota mikrobien lukumäärästä raakavedessä ja poistumasta
tuotantoprosessin aikana (Vesiopas 2013). Vesiepidemiatilanteessa mahdollisesti erittäin
pienien mikrobilukumäärien tutkiminen on tärkeää veden saastumiseen johtaneiden syiden
selvittämiseksi, jotta vastaavanlaisen tilanteen toistuminen voidaan estää.
Mikrobien määritysmenetelmissä voidaan käsitellä vain melko pieniä tilavuuksia näytevettä.
Sen vuoksi vesimikrobiologisia analyysejä varten veden mikrobit on ensin konsentroitava
pienempään tilavuuteen. Tilavuuden pienentäminen näytteenottopaikalla on hyödyllistä
näytteen kuljetuksen kannalta. Suuren vesitilavuuden näytteenottoon ja tutkimiseen on
kehitetty
soveltuvia
suodattamalla.
konsentrointimenetelmiä,
Konsentrointiin
tarkoitetuissa
joilla
näytetilavuutta
suodatusmenetelmissä
pienennetään
näytetilavuudesta
suodatetaan pois vettä mikrobeja menettämättä, jolloin tutkittavan näytteen tilavuus pienenee.
Suuren näytetilavuuden suodatuksessa ongelmia voivat aiheuttaa suodatukseen kuluva aika ja
suodatinmateriaalin tukkeutuminen.
10
Ultrasuodatuksen suodatinkalvon huokoskoko on alle sata nanometriä eli pienempää
kokoluokkaa kuin suurin osa mikrobeista, mikä mahdollistaa eri mikrobiryhmien
samanaikaisen konsentroinnin. Suuren tilavuuden ultrasuodatusmenetelmässä on käytetty
pieneen tilavuuteen ontoiksi kuiduiksi pakattuja suuren pinta-alan kalvoja, jotka mahdollistavat
tehokkaan suodattuvuuden eikä suodatin heti tukkeudu. Ultrasuodatusmenetelmällä on voitu
suodattaa satoja ja tuhansia litroja vettä siten, että mikrobit jäävät suodattimeen tai
tilavuudeltaan pienentyneeseen eli konsentroituneeseen näytteeseen kalvon toiselle puolella.
(Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005, Lindquist ym. 2007) Menetelmää varten ei ole
saatavilla valmiita laitteistoja, vaan ne on valmistettava itse saatavilla olevista tarvikkeista.
Valmistetun ultrasuodatuslaitteiston ja -menetelmän toimivuutta erilaisissa vesissä on testattava
ennen käyttöönottoa.
11
2
2.1
KIRJALLISUUSKATSAUS
TALOUSVEDEN MIKROBIOLOGINEN TURVALLISUUS
Hyvä talousveden laatu on ihmisten terveyden edellytys. Vaikka hyvälaatuista talousvettä olisi
yleensä saatavilla, vesi voi saastua, jos sen laatua ei pystytä turvaamaan tarpeeksi hyvin.
Saastunut talousvesi voi aiheuttaa suuren ihmismäärän samanaikaisen sairastumisen, ja sen
vuoksi vedenlaadun jatkuvasta turvallisuudesta on huolehdittava myös yllättävissä ja
muuttuvissa tilanteissa. (WHO 2011)
Merkittävä talousveden turvallisuutta uhkaava tekijä on veden saastuminen ulosteperäisellä
materiaalilla, joka sisältää tautia aiheuttavia mikrobeja. Ihmisten tai eläinten suolistosta peräisin
olevat taudinaiheuttajamikrobit aiheuttavat yleisimmin suolistoinfektioita. Talousveden
turvallisuutta voivat uhata myös iho- ja hengitystieinfektioita aiheuttavat mikrobit.
Mikrobiologisten uhkien lisäksi talousveden turvallisuutta voivat uhata kemiallinen tai
radiologinen saastuminen ja talousveden kemiallisessa desinfioinnissa mahdollisesti syntyvät
terveydelle haitalliset yhdisteet. (WHO 2011) Tässä tutkielmassa talousveden turvallisuutta
tarkastellaan mikrobiologiselta kannalta.
Veden saastumisen ennaltaehkäisy on tehokas tapa turvata talousveden laatu. Vedenlaatu on
turvattava raakavedestä lähtien veden käyttäjän hanaan asti. Käytetty raakavesi ja tuotetun
veden ja kuluttajien määrä vaikuttavat käytännön toimiin, joilla vedenlaatu turvataan. (WHO
2011) Talousvettä voidaan tuottaa pohjavedestä tai pintavedestä. Vedenpuhdistusprosessit
vaihtelevat mekaanisista käsittelyistä kemiallisiin ja biologisiin prosesseihin. Raakavedestä
poistetaan hiukkasia, orgaanista ainesta ja epäorgaanisia yhdisteitä, ja veden happamuutta
voidaan säätää. (Manahan 2004) Erityisesti talousveden tuottamiseen käytettävät pintavedet
käsitellään perusteellisesti humusaineiden ja taudinaiheuttajien poistamiseksi ja pintavedestä
valmistettu talousvesi lisäksi desinfioidaan aina ennen jakelua. Pohjavesi on puhtaampaa, joten
sitä ei tarvitse yleensä käsitellä yhtä paljon kuin pintavettä. Vedenlaatu voi muuttua
verkostossakin, mikä täytyy ottaa huomioon vedenlaadun ja toiminnan arvioinnissa.
Vesilaitokselta lähtevä vesi saattaa viipyä pitkiäkin aikoja verkostossa ja mikäli olosuhteet ovat
mikrobikasvustolle suotuisat tai verkostoon tulee ulkoapäin epäpuhtauksia, vesi voi muuttua
huonolaatuiseksi ja jopa terveydelle haitalliseksi. (WHO 2011)
12
Suomessa pääosa talouksista kuuluu vesijohtoverkoston piiriin. On paljon muutamien
kotitalouksien vesiosuuskuntia ja pieniä ja keskisuuria talousvesilaitoksia, jotka käyttävät
pohjavettä talousveden lähteenä. Suurten vesilaitosten valmistamasta talousvedestä vuonna
2008 46 % valmistettiin pintavedestä, 41 % pohjavedestä ja loppuosa tekopohjavedestä
(Zacheus 2010). Suomessa pintavedestä valmistettu talousvesi desinfioidaan aina ennen
jakeluverkostoon pumppaamista (THL 2014). Pohjavesi on Suomessa hyvälaatuista eikä sitä
aina käsitellä tai desinfioida ennen verkostoon pumppaamista (Hatakka ym. 2001, Miettinen
ym. 2001).
Suomessa talousveden valvontanäytteissä on todettu vain harvoin suolistoperäistä saastumista
ilmentäviä Escherichia coli (E. coli) -bakteereita tai suolistoperäisiä enterokokkeja. Sen sijaan
koliformisia bakteereita ja tavanomaisesta poikkeavia heterotrofisia pesäkelukuja havaitaan
hieman useammin. Ne voivat ilmentää talousveden puhdistuksen häiriöitä, verkoston
olosuhteita tai talousveden pintavesisaastumista. Havaitut mikrobiologiset laatuvirheet
talousvedessä liittyvät usein pohjavesilaitosten jakamaan talousveteen, joka voi olla käsittelyn
puuttumisen vuoksi laadultaan haavoittuvampaa kuin pintavedestä valmistettu desinfioitu
talousvesi. (Zacheus 2010)
2.2 VESIEPIDEMIAT JA NIIDEN SYYT
Vesiepidemialla tarkoitetaan tapausta, jossa vähintään kaksi henkilöä on saanut samanlaatuisen
sairauden juotuaan samaa alkuperää olevaa vettä, ja missä epidemiologisesti kyseinen vesi
voidaan todeta sairauden lähteeksi (Hatakka ym. 2001). Suomessa ja länsimaissa eniten
vesiepidemioita ovat aiheuttaneet suolistoinfektioita aiheuttavat mikrobit (Hrudey ja Hrudey
2007, Zacheus ja Miettinen 2011). Merkittävä riski vesiepidemian puhkeamiselle syntyy, jos
talousvesi saastuu pinta- tai jätevedellä, tai jos eläinten ulosteita tai eläimiä pääsee talousveden
joukkoon. Veteen päässyt ulosteperäinen materiaali voi sisältää taudinaiheuttajamikrobeja.
(Deere ym. 2001, Pitkänen 2010, Schijven ym. 2010)
Vaikka talousveden laatu on yleisesti ottaen Suomessa hyvä, raportoidaan vesiepidemioita silti
vuosittain (Zacheus ja Miettinen 2011, THL 2014). Vuosina 1998–2009 Suomessa raportoitiin
67 vesiepidemiaa, joissa kirjattiin yhteensä 27 000 sairastunutta henkilöä (Zacheus ja Miettinen
2011). Yksittäisissä epidemioissa sairastuneiden määrä on vaihdellut joistakin kymmenistä
13
useisiin tuhansiin ihmisiin. Yleisimpiä oireita ovat olleet ripuli, pahoinvointi, vatsakivut ja
kuumeilu. On arvioitu, että sairauden lyhytkestoisuuden vuoksi keskimäärin vain joka sadas
sairastunut hakeutuu lääkärin hoitoon, joten vesivälitteisissä epidemioissa sairastuneiden
todellinen määrä on huomattavasti suurempi. Suurin osa vesiepidemioista on liittynyt
pohjavedestä valmistettuun talousveteen ja näistä tapauksista suuri osa on ollut
vesiosuuskuntien ja yksityiskaivojen veden aiheuttamia epidemioita. (Valvira 2009, Zacheus ja
Miettinen 2011)
Merkittävimpiä vesivälitteisiä taudinaiheuttajia Suomessa ovat olleet norovirus ja
kampylobakteeri (Miettinen ym. 2001). Vesivälitteisiä epidemioita Suomessa ja muualla
maailmassa ovat aiheuttaneet myös Salmonella-bakteerit, Giardia- ja Cryptosporidiumalkueläimet, enteropatogeeniset E. coli -bakteerit ja useat tautia-aiheuttavat virukset (Hatakka
ym. 2001, Hrudey ja Hrudey 2007, Pitkänen 2010). Monet vesiepidemioita aiheuttaneista
mikrobeista, kuten virukset ja alkueläimet, säilyvät hyvin vedessä ja niillä on pieni infektiivinen
annos. 1-10 infektoivaa yksikköä voi aiheuttaa sairastumisen. (Nel ja Weyer 2004, Theron ja
Cloete 2004). Siten pienikin määrä näitä mikrobeja talousvedessä riittää infektion
aiheuttamiseen (Aakko ym. 2000, Lecler ym. 2004). Monissa vesiepidemioissa epidemian
aiheuttaja on kuitenkin jäänyt selvittämättä. Useissa selvittämättömissä tapauksissa epidemian
aiheuttajaa ei ole syystä tai toisesta lainkaan tutkittu tai vesinäytteiden kerääminen on
tapahtunut liian myöhään. Selvittämättömät vesiepidemiat ovat olleet usein tapauksia, joissa on
vain vähän sairastuneita. (Zacheus ja Miettinen 2011, Pitkänen 2013). Itse asiassa
vesiepidemiatilanteiden havaitseminen on hankalaa ja tehotonta monissa maissa (Miettinen
2009). Suomessa on hyvä järjestelmä vesiepidemioiden havaitsemiseksi ja tiedon keräämiseksi
(Zacheus ja Miettinen 2011). Vesiepidemioiden huomaaminen ja tutkiminen olisi tärkeää
talousveden mikrobiologista laatua uhkaavien tekijöiden tunnistamiseksi. Tutkimuksesta
saatavia tietoja voidaan käyttää apuna muun muassa valvontatoiminnan suunnittelussa ja uusien
epidemioiden ehkäisyssä (Hatakka ym. 2001).
Monet raportoiduista vesiepidemioista ovat saaneet alkunsa yksityisten vesijärjestelmien tai
pienten kunnallisten vesilaitosten jakamasta pohjavedestä, joka on ollut pintavesien tai
jätevesien saastuttamaa (Miettinen ym. 2001, Hrudey ja Hrudey 2004, Hrudey ja Hrudey 2007).
Se, että pohjavesilaitosten jakamaa talousvettä ei yleensä desinfioida, lisää epidemioiden
todennäköisyyttä, sillä desinfiointi alentaa tehokkaasti taudinaiheuttajien määrää vedessä
(Aakko ym. 2000, Hatakka ym. 2001). Sulamisvedet ja rankkasateet vedenottamoalueella
14
lisäävät veden saastumisriskiä, mikäli tulviva vesi voi päästä vedenottokaivoihin (Thomas ym.
2006, Cann ym. 2013).
Pintavesilaitosten jakamaan talousveteen liittyneet vesiepidemiat ovat yleensä aiheutuneet
riittämättömästä desinfiointikemikaalin annostuksesta tai vedenjakeluverkostossa sattuneesta
veden saastumisesta esimerkiksi putken rikkoutumisen vuoksi. Rankkasateiden aiheuttama
maa-aineksen ja mikrobien huuhtoutuma tai jätevedenpuhdistamon ongelmatilanteessa
tavanomaista suurempi mikrobikuorma yläjuoksulta voi saastuttaa raakaveden niin pahoin, että
talousvesilaitoksen puhdistustehokkuus ei ole enää riittävä. (Smeets ym. 2006, Thomas ym.
2006, Vesiopas 2013) Puutteet vedenkäsittelyssä voivat johtua myös teknisistä ongelmista ja
väärin mitoitetusta puhdistusprosessien poistotehokkuudesta. Vesiepidemioihin johtaneita
vedenkäsittelyn ongelmia ovat olleet muun muassa huono koagulaatio, sekoitus tai
flokkulaatio, suodattimien takaisinhuuhtomisen puuttuminen, heikko suodatus tai liian pieni
klooriannos (Deere ym. 2001, Brunkard ym. 2011). Vesiepidemioiden välttämiseksi
erityistilanteisiin ja uhkiin olisi osattava varautua. Puhdistustehokkuuksien pitäisi olla riittävät
myös ongelmatilanteissa tai raakaveden laadun heikennyttyä (Pitkänen ym. 2011, Pitkänen
2013).
2.3 TALOUSVEDEN MIKROBIOLOGISEN LAADUN VALVONTA JA HALLINTA
Talousveden laadunvalvonnalla varmistetaan terveellisen veden jakelu veden käyttäjille.
Maailman terveysjärjestö (WHO, World Health Organization) tuottaa talousveden laadusta
kansainvälisiä ohjeita, joita voidaan käyttää pohjatietona säädettäessä kansallisia lakeja ja
standardeja. Talousveden laatuun liittyvä ohjeistus on koottu WHO:n oppaaseen Guidelines for
drinking water quality, jota päivitetään määrävälein ja joka on vapaasti ladattavissa WHO:n
verkkosivuilta (WHO 2011). WHO:n ohjeiden tavoitteena on taata ihmisille heidän
terveydelleen turvallisen talousveden saanti. Talousvedestä seurataan fysikaalisia, kemiallisia
ja mikrobiologisia muuttujia, joista voidaan havaita veden laadun muutokset ja mahdolliset
ongelmat vedenlaadussa. Valmiin talousveden laadunvalvonnan lisäksi talousveden hyvän
laadun turvaamiseen kuuluvat raakaveden, talousveden tuotannon ja jakelun valvonta ja veden
laatua uhkaavien tekijöiden tunnistaminen ja hallinta.
Talousveden
laadunvalvonnassa
käytettävät
mikrobiologiset
muuttujat
ilmaisevat
talousvedessä esiintyessään veden käyttäjien välittömiä terveysriskejä (THL 2014).
15
Mikrobiologinen laadunvalvonta keskittyy mikrobiologiseen analytiikkaan eli valittujen
mikrobien esiintymisen tai lukumäärien valvontaan. Normaaliolosuhteissa kaikkien
mahdollisten
taudinaiheuttajamikrobien
määrittäminen
vesinäytteistä
ei
ole
tarkoituksenmukaista, taloudellisesti kannattavaa eikä mahdollista (Isomäki ym. 2006,
Pitkänen 2008). On suositeltavaa tutkia veden laatua usein yksinkertaisella testillä kuin harvoin
useilla eri testeillä tai monimutkaisilla testeillä (van Lieverloo ym. 2007, WHO 2011). Siksi
talousveden
mikrobiologisessa
valvonnassa
käytetään
yleisimmin
suolistoperäisiä
indikaattoribakteereita, joita on kaikkien lämminveristen eläinten suolistossa. Nämä
indikaattorit ilmentävät veden ulosteperäistä saastumista, jolloin veteen on voinut päästä
indikaattoribakteerien ohella myös taudinaiheuttajamikrobeja (Edberg ym. 2000, Isomäki ym.
2006, THL 2014). E. coli -bakteeri ja suolistoperäiset enterokokit ilmentävät suolistoperäistä
saastumista. Koliformiset bakteerit voivat olla peräisin suolistosta mutta myös ympäristöstä.
Clostridium perfringens -bakteeri ja etenkin sen itiöt säilyvät koliformisia bakteereja paremmin
ympäristössä.
C.
perfringens
-bakteeri
edustaa
siten
paremmin
sellaisia
taudinaiheuttajamikrobeja, jotka säilyvät ympäristössä pidempään. C. perfringens voi
säilyvyytensä vuoksi olla peräisin ympäristöstä eikä aina ilmennä vasta tapahtunutta
ulosteperäistä saastumista (Edberg ym. 2000, Pitkänen 2010).
2.3.1 Suomen lainsäädäntö
Suomessa veden laatua koskevat säädökset on määritelty terveydensuojelulaissa 763/1994
(Valtioneuvosto 1994b) ja terveydensuojeluasetuksessa 1280/1994 (Valtioneuvosto 1994a).
Sosiaali- ja terveysministeriön asetus talousveden laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista
461/2000 (STM 2000) perustuu ihmisten käyttöön tarkoitetun veden laadusta annettuun
neuvoston direktiiviin 98/83/EY (Euroopan unionin neuvosto 1998). Talousvesiasetus koskee
vesilaitoksia, jotka toimittavat vettä vähintään 10 m3 päivässä tai vähintään 50 henkilön
tarpeisiin, ja elintarvikealan yritysten tuotteiden valmistamiseen käyttämää vettä. Pienempiä
talousvesilaitoksia ja yksityiskaivoja sekä kunnan terveydensuojeluviranomaisen päätöksen
nojalla elintarvikealan yritysten tuotteiden valmistamiseen käyttämää vettä koskee asetus
401/2001 pienten yksiköiden talousveden laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista (STM
2001).
Talousvesiasetus 461/2000 ja pikkuasetus 401/2001 määrittelevät talousveden kemialliset ja
mikrobiologiset laatuvaatimukset ja laatusuositukset. Mikrobiologiset laatuvaatimukset ja -
16
suositukset on esitetty Taulukossa 1. Talousveden mikrobiologisissa laatuvaatimuksissa on
annettu sallittu enimmäistiheys E. coli -bakteerille ja suolistoperäisille enterokokeille. Vedestä
tulee määrittää myös Clostridium perfringens -bakteeri, jos raakavesi on pintavettä tai
tekopohjavettä. Asetukset sisältävät myös koliformisten bakteerien ja heterotrofisen
pesäkeluvun laatusuositukset. Lisäksi pulloissa ja säiliöissä myytävälle talousvedelle on
annettu erikseen tavanomaista vettä tarkemmat laatuvaatimukset. Enimmäistiheys E. coli bakteerille, suolistoperäisille enterokokeille ja Pseudomonas aeruginosa -bakteerille on 0
pmy/250 ml pullovettä. Lisäksi pullovedelle asetetut pesäkeluvun enimmäistiheydet ovat 100
pmy/ml 22 °C:ssa ja 20 pmy/ml 37 °C:ssa.
Taulukko 1. Talousveden mikrobiologiset laatuvaatimukset ja -suositukset
Laatuvaatimukset
Laatusuositukset
Mikrobiologinen muuttuja
Enimmäistiheys
STM:n asetus
Escherichia coli
0 pmy/100 ml
461/2000, 401/2001
Suolistoperäiset enterokokit
0 pmy/100 ml
461/2000, 401/2001
Koliformiset bakteerit
0 pmy/100 ml
461/2000, 401/2001
Clostridium perfringens
0 pmy/100 ml
461/2000
Heterotrofinen pesäkeluku
Ei epätavallisia
461/2000
muutoksia
Talousvesiasetusten mukaan talousveden laadunvalvonta on kuntien terveydensuojeluviranomaisten vastuulla ja sen tulee olla jatkuvaa (STM 2000). Talousveden laadun
valvontatutkimuksia on tehtävä sitä tiheämmin, mitä enemmän vettä tuotetaan tai mitä
useammalle käyttäjälle vettä jaellaan. Tutkimustiheyttä on lisättävä, mikäli on syytä epäillä
ongelmia veden laadussa. Laadunvalvonnan tutkimustiheys voi vaihdella talousvettä tuottavan
laitoksen koosta riippuen yhdestä kerrasta kolmessa vuodessa yli kolmeen sataan kertaan
yhdessä vuodessa. Talousvesilaitokset tarkkailevat myös itse tuottamansa veden laatua
käyttötarkkailussaan.
Myös
elintarvikeyritykset
valvovat
käyttämänsä
veden
laatua
omavalvonnassaan. Suurten vesilaitosten ja pienten raakavettä käsittelevien vesilaitosten on
tarkkailtava myös raakaveden laatua veden käsittelyn riittävyyden varmistamiseksi.
Talousveden tuotantoon tarkoitetun pintaveden laatuvaatimuksia ja tarkkailua säätää
valtioneuvoston päätös 366/1994 (Valtioneuvosto 1994c).
Talousvesiasetuksen 461/2000 mukaan talousveden valvontatutkimuksissa käytetään SFS-ENstandardeja tai niiden puuttuessa ISO-standardien mukaisia määritysmenetelmiä tai
17
menetelmiä, jotka määritystarkkuudeltaan ja luotettavuudeltaan vastaavat näitä menetelmiä.
Sosiaali- ja terveysalan lupa- ja valvontavirasto Valvira on julkaissut yhdessä Terveyden ja
hyvinvoinnin laitoksen kanssa ohjeistuksen terveydensuojelulain alaisten asetusen mukaisissa
valvontatutkimuksissa käytettävistä mikrobiologisista määrityksistä ja niiden tekemiseen
hyväksyttävistä menetelmistä (Taulukko 2.) (Valvira 2014). Valvontatutkimuksia tekevillä
laboratorioilla tulee olla asianmukainen laatujärjestelmä ja niiden tulee hyväksyttää toimintansa
ennen valvontatutkimuksien suorittamisen aloittamista (Valvira 2014).
18
Taulukko 2. Asetuksen 461/2000 mukaiseen talousveden mikrobiologiseen valvontaan
Suomessa hyväksytyt tutkimusmenetelmät (Valvira 2014).
Muuttuja
Koliformiset bakteerit
Koliformiset bakteerit
Koliformiset bakteerit
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Suolistoperäiset
enterokokit
Pseudomonas
aeruginosa
Pseudomonas
aeruginosa
Heterotrofinen
pesäkeluku 22 ºC
Heterotrofinen
pesäkeluku 36 ºC
Clostridium
perfringens
(mukaan lukien itiöt)
Clostridium
perfringens
(mukaan lukien itiöt)
Standardi
SFS-EN ISO 9308-1
+ AC (2010)
Menetelmän periaate
Kalvosuodatusmenetelmä laktoosi -2,3,5trifenyylitetrazoliumkloridi (LTTC) kasvualustaa käyttäen
SFS 3016(2011)
Kalvosuodatusmenetelmä Les Endo kasvu-alustaa käyttäen
ISO 9308-2 (2012)
MPN-menetelmä (todennäköisin
lukumäärä) QuantiTray-liuskaa käyttäen
SFS-EN ISO 9308-1 Kalvosuodatusmenetelmä laktoosi -2,3,5+ AC (2010)
trifenyylitetrazoliumkloridi (LTTC) kasvu-alustaa käyttäen
SFS 3016(2011)
Kalvosuodatusmenetelmä Les Endo kasvu-alustaa käyttäen
ISO 9308-2 (2012)
MPN-menetelmä (todennäköisin
lukumäärä) QuantiTray-liuskaa käyttäen
SFS-EN ISO 7899Kalvosuodatusmenetelmä Slanetzin ja
2(2000)
Bartleyn kasvatusalustaa ja sappi-eskuliiniatsidi agaria käyttäen
SFS-EN ISO 16266 Kalvosuodatusmenetelmä Cetrimide
(2008a)
nalidixic acid agar (CN) -kasvualustaa
käyttäen
SFS-EN ISO 16266 Standardimenetelmän
varmistustestien
(2008a), muunneltu
muunnos
SFS-EN ISO 6222
Maljavalumenetelmä hiivauuteagaria
(1999)
käyttäen
SFS-EN ISO 6222
Maljavalumenetelmä hiivauuteagaria
(1999)
käyttäen
m/CPKalvosuodatusmenetelmä Membrane
agar/STMa461_2000 Clostridium perfringens (m-CP) (2000)
agarmaljaa käyttäen
ISO 14189 (2013)
Kalvosuodatusmenetelmä tryptoosisulfiitti-sykloseriini (TSC) -agarmaljaa
käyttäen. Standardiluonnoksen ISO/CD
6461-2:2002 mukainen menetelmä on
hyväksyttävä menetelmä siihen saakka
kunnes SFS-EN ISO 14189 vahvistetaan
19
2.3.2 WSP eli vesiturvallisuussuunnitelma
Talousveden laadunvalvonta on keskittynyt viime vuosina Euroopassa valmiin talousveden
laadun valvontaan (Euroopan unionin neuvosto 1998). WHO ohjeistaa laajentamaan
talousveden laadunvarmistuksen koko talousveden tuotantoketjuun. Pyrkimyksenä on vähentää
talousveden saastumisriskiä arvioimalla ja hallitsemalla talousveden tuotantoon ja jakeluun
liittyviä riskejä (Bartram ym. 2001, WHO 2011). Käytännössä talousvedentuottajat laativat
itselleen
WHO:n
ohjeistuksen
mukaisen
WSP:n
(Water
Safety
Plan)
eli
vesiturvallisuussuunnitelman, mikä on tarkoitus sisällyttää myös Suomen lainsäädäntöön (STM
ja THL 2014).
Vesiturvallisuussuunnitelma (WSP) ja siihen liittyvät toiminnot on esitetty Kuvassa 1. WSP:ssä
talousveden
tuotannon
turvallisuutta
ja
uhkia
arvioidaan
järjestelmällisesti
ja
yksityiskohtaisesti aina raakavedestä ja sen ympäristöstä veden käsittelyn ja jakelun kautta
kuluttajalle asti. Vesiturvallisuussuunnitelma koostuu kolmesta osa-alueesta, jotka ovat
talousvesijärjestelmän arviointi, toiminnallinen valvonta ja hallintajärjestelmät ja tiedonvaihto.
Vesiturvallisuussuunnitelmaa ohjaavat vedenlaadun terveysperusteiset tavoitteet, niiden
toteutuminen ja kansanterveysvaikutukset ja riippumattoman tahon valvonta. Järjestelmän
arvioinnissa ja toiminnallisessa valvonnassa voidaan käyttää tukena mikrobiologisia,
kemiallisia ja radiologisia mittauksia (WHO 2011).
Kuva 1.Vesiturvallisuussuunnitelmiin liittyvät toiminnot. (WHO 2011)
20
Kaikkien
vesilaitosten
tulisi
ajoittain
tehdä
talousvesijärjestelmän
riskinarviointi.
Riskinarvioinnissa selvitetään toimenpiteet eri kriisitilanteita varten ja laaditaan suunnitelmat
eri ongelmatilanteita ja mahdollisia vahinkoja varten. Riskinarviointiin kuuluvat vaaran
tunnistaminen, annosvasteen eli annoksen ja vaikutuksen suhteen arviointi, ihmisten
altistumisen arviointi ja riskin karakterisointi eli riskin suuruuden arviointi. Mikrobiologiseen
riskinarviointiin on kehitetty avuksi kvantitatiivinen riskinarviointimenetelmä QMRA
(quantitative microbial risk assessment). Menetelmän avulla lasketaan riskiarvio, joka antaa
numeerisen arvon riskin todellisesta suuruudesta (Vesiopas 2013). Lukuarvo auttaa
päätöksentekoa
valittaessa
Talousvesijärjestelmien
kahden
QMRA:ssa
tai
useamman
otetaan
riskinhallintavaihtoehdon
huomioon
tautia-aiheuttavien
välillä.
mikrobien
lukumäärä raakavedessä, mikrobien poistumistehokkuus eri käsittelyprosesseissa ja lukumäärä
valmiissa talousvedessä (Pitkänen ym. 2011). Infektioriskin arvioimiseksi tautia-aiheuttavien
mikrobien esiintyminen talousvedessä yhdistetään kulutustietoihin ja tautia-aiheuttavien
mikrobien annos-vasteeseen (Petterson ym. 2006, Meriläinen ym. 2012). Vesilaitos voi laskea
riskin suuruuden käyttämällä Opasnetissä Vesiopas-mallia, jossa riskin laskemista varten
syötetään tiedot raakaveden luokituksesta, tautia aiheuttavien mikrobien lukumääristä
raakavedessä, käytetyistä puhdistusprosesseista (myös desinfiointi), juodun veden määrästä
kuluttajaa kohti ja kuluttajien määrästä (Vesiopas 2013).
2.3.3 Talousveden mikrobiologisen laadun valvonnan haasteita
Craun (1997) vertasi erilaisten kunnallisten ja yksityisten talousvesijärjestelmien koliformisten
bakteerien valvontatuloksia tietoihin vesiepidemioista. Tutkimuksessa havaittiin, että vaikka
talousveden laatu olisi valvontamittauksissa koliformisten bakteerien osalta sallituissa rajoissa,
voi vesiepidemia silti uhata. Vain puolessa talousvesijärjestelmistä, joista oli välittynyt
vesiepidemia, koliformisia bakteereita oli todettu valvontamittauksisssa edeltävien kuukausien
aikana ennen epidemian puhkeamista. Koliformisten bakteerien positiivisten havaintojen
määrissä ei ollut havaittavissa eroa vesiepidemian aiheuttaneiden ja aiheuttamattomien
talousvesijärjestelmien välillä. Kirjallisuudessa on raportoitu useita muitakin tilanteita, joissa
mikrobiologisten muuttujien osalta vedenlaatu on ollut standardien mukaista ja kuitenkin vesi
on aiheuttanut vesiepidemian (Richardson ym. 1991, Hänninen ym. 2003). Syynä tällaisiin
havaintoihin voi olla tilanteeseen nähden vääränlainen ja viivästynyt mikrobiologinen
analytiikka. Esimerkiksi E. coli -bakteerin tiedetään menettävän elinkykynsä nopeammin kuin
monet taudinaiheuttajamikrobit, erityisesti klooratussa vedessä (Smeets ym. 2006, Pitkänen
21
ym. 2011). Tämän vuoksi on mahdollista, että vaikka E. coli -bakteeria ei löydetä,
taudinaiheuttajamikrobeja voi olla vedessä.
Pienillä vesilaitoksilla valvontanäytteitä otetaan harvemmin kuin suuremmilla, mikä heikentää
mahdollisuuksia havaita vedenlaadun muutoksia. Veden saastumiseen johtavat tapahtumat,
kuten rankkasateet ja lumien sulaminen kestävät usein vain vähän aikaa, jolloin myös
mikrobien esiintyvyys on yleensä lyhytkestoista ja vaihtelee olosuhteiden mukaan. On
epätodennäköistä, että vain harvoin otettavan valvontanäytteen avulla pystyttäisiin
todentamaan talousveden turvallisuus kaikkina vuodenaikoina. Tämän vuoksi tarvittaisiin
merkittävästi tiheämpiä mittauksia laadun heikkenemisen havaitsemiseksi. (van Lieverloo ym.
2007, Pitkänen 2010)
Nykyisin käytössä oleva näytetilavuus talousvedestä on yleensä 100 ml, koska talousveden
laatuvaatimukset mikrobien osalta on säädetty 100 ml:n tilavuutta kohti ja kyseisen tilavuuden
määritys
on
käytännöllistä
asetuksen
mukaisilla
menetelmillä.
Suolistoperäisten
indikaattoribakteerien määritystulokset käsitellystä ja puhdistetusta vedestä ja talousvedestä
ovat yleisesti alle määritysrajan eli näitä bakteereita ei todeta ja talousveden laatuvaatimukset
täyttyvät
(Zacheus
2010).
Erityistilanteissa,
kuten
vesiongelmatilanteissa
taudinaiheuttajamikrobien analysoimiseksi, ja vedenkäsittelyprosessien poistotehokkuuksien
arvioimiseksi,
on
tarpeen
käyttää
suurempia
tilavuuksia
kuin
rutiiniluontoisissa
valvontamittauksissa. Epäiltäessä talousveden saastumista E. coli -bakteeri ja suolistoperäiset
enterokokit voidaan määrittää suuremmasta tilavuudesta ja taudinaiheuttajia määritettäessä
näytetilavuuden on oltava useita litroja. (Valvira 2009) Tutkimuksissa riskinarvioinnin
tarkoituksia varten on puhtaistakin vesistä voitu saada mitattavia suolistobakteerituloksia, kun
analyysitilavuuksia on suurennettu satoihin tai jopa tuhansiin litroihin (Hijnen ym. 2000).
2.3.4 Laajennettu mikrobiologinen analytiikka talousveden laadun arviointiin
Suolistoperäistä saastumista ilmentävien indikaattoribakteerien lisäksi vedestä voidaan
määrittää indikaattoriviruksia, kuten kolifageja, ja myös varsinaisia taudinaiheuttajamikrobeja.
Taudinaiheuttajamikrobeja ovat
erilaiset
virukset,
bakteerit
ja
alkueläimet,
joiden
määrittäminen voi vaatia kallista ja aikaa vievää erikoisanalytiikkaa. Viljelymenetelmät
vaativat usein rikastuksen ja erottelevan eli selektiivisen kasvualustan käyttöä, jotta
taudinaiheuttajat saadaan eristettyä taustamikrobeista. Taudinaiheuttajien alhainen lukumäärä
22
vesinäytteessä vaikeuttaa mikrobien havaitsemista, vaikka mikrobeja olisi ollut tutkittavassa
vesijärjestelmässä riittävästi aiheuttamaan infektioita. (Theron ja Cloete 2004)
Viljelymenetelmien ohella monien mikrobien tutkimiseen on käytössä molekyylibiologisia
menetelmiä, joista on pyritty kehitettämään herkkiä ja spesifisiä. Molekyylibiologiset
menetelmät perustuvat kohdemikrobille spesifisen genomin osan havaitsemiseen ja
kvantitatiivisissa sovelluksissa genomin kopiolukumäärien määrittämiseen (Marlowe ym.
2000). Molekyylibiologiset menetelmät mahdollistavat yleisten terveyttä uhkaavien mikrobien
nopean ja spesifisen havaitsemisen (Girones ym. 2010). Useimmat molekyylibiologiset
menetelmät perustuvat nukleiinihappojen monistamiseen PCR-tekniikan (polymerase chain
reaction) avulla. Kvantitatiiviset PCR-menetelmät (qPCR) voivat olla näytetyypistä riippuen
herkempiä kuin esimerkiksi bakteerien havaitsemiseen käytettävät viljelymenetelmät tai
virusten plakkimenetelmät (Marlowe ym. 2000, Theron ja Cloete 2004, Girones ym. 2010)
Bakteerit
Kampylobakteerit, salmonella ja enterohemorraaginen E. coli (EHEC) ovat esimerkkejä
taudinaiheuttajabakteereista, jotka ovat aiheuttaneet vesivälitteisiä vatsatautiepidemioita
(Lecler ym. 2004). Taudin itämisaika tartunnasta taudin puhkeamiseen voi kestää päivästä
viikkoon (Rusin ym. 2000). Tautia-aiheuttava annos vaihtelee bakteereittan ja voi olla 1010 000 bakteeria. Vesivälitteisten suolistoinfektiota aiheuttavien bakteerien oireita ovat yleensä
vatsakipu, ripuli ja kuume. Suolistoinfektioiden oireisiin voi kuulua myös päänsärkyä ja
oksentelua ja infektioiden seurauksena voi esiintyä vakavampia oireyhtymiä. (Lecler ym. 2004)
Taudinaiheuttajabakteerien erilaiset ominaisuudet ja ympäristöolosuhteet vaikuttavat niiden
säilyvyyteen ja kulkeutumiseen ympäristössä (National Research Council 2004). Esimerkiksi
kampylobakteerit voivat säilyä kylmässä vedessä auringon valolta suojassa useita päiviä
(Patrone ym. 2013). Ympäristöolosuhteet, kuten desinfiointi ja ravinteiden puute, voivat
heikentää bakteerien elinkykyä ja viljeltävyyttä (Lecler ym. 2004, Pitkänen 2013).
Taudinaiheuttajabakteerien esiintyminen saadaan melko hyvin todettua vesinäytteistä
viljelymenetelmillä.
Taudinaiheuttajabakteerien
määritystä
varten
näyte
yleensä
konsentroidaan aluksi kalvosuodatusmenetelmällä (Josephson ym. 2000, SFS 2008b).
Bakteereita voidaan rikastaa epäselektiivisessä liemessä tai maljalla tai käyttää selektiivistä
kasvualustaa, jolla taustamikrobien kasvun määrää saadaan vähennettyä ja erotettua tutkittu
23
bakteeri paremmin (Josephson ym. 2000). Epäselektiivisen kasvualustan käytön etuna on, että
viljeltävyydeltään heikentyneet bakteerit kasvavat selekoivien aineiden poissa ollessa
todennäköisemmin. Epäselektiivisellä kasvualustalla kasvanut bakteeri voidaan tunnistaa
esimerkiksi entsyymi immunoanalyysillä (EIA) (Theron ja Cloete 2004). Bakteerit voivat olla
eläviä, mutta eivät havaittavissa viljelymenetelmillä. Vaikka bakteereita ei voida havaita
viljelymenetelmillä, ei voi varmasti sanoa, että ne eivät aiheuta infektioita. (National Research
Council 2004, Patrone ym. 2013) Viljelytulokset voidaan varmistaa PCR-menetelmillä
määrittämällä bakteerin sille ominaisia tunnettuja geenejä. PCR-menetelmiä varten bakteeria
voidaan ensin rikastaa kasvatusliemessä (Sails ym. 2002, Theron ja Cloete 2004). On kehitetty
myös menetelmiä, joilla voidaan määrittää esimerkiksi kampylobakteeri suoraan vesinäytteestä
tai näytteestä, josta on ensin konsentroitu talteen soluja ja eristetty DNA:ta. Menetelmiä elävien
ja kuolleiden bakteerisolujen erottamiseksi on myös kehitetty. (Pitkänen 2013)
Virukset
Tautia-aiheuttavia viruksia on sekä DNA-viruksia, kuten adenovirukset, ja RNA-viruksia,
kuten enterovirukset, A- ja E-hepatiittivirukset, norovirus, rotavirus ja astrovirus (Rusin ym.
2000, Nel ym. 2004). Monien suolistoperäisten virusten tautia-aiheuttava annos on alhainen,
tyypillisesti 1–10 infektoivaa yksikköä suolistoperäisesti saastuneessa vedessä riittää
aiheuttamaan taudin altistuneelle (Nel ja Weyer 2004). Virusten aiheuttaman taudin yleisin oire
on ripuli. Suolistovirukset voivat aiheuttaa myös voimakasta oksentamista ja flunssan oireita
ylähengityteissä ja kuumetta. Suolistovirusten itämisaika ja taudin kesto vaihtelevat
viruksittain. Norovirustartunnan oireet puhkeavat nopeasti 24–28 tuntia tartunnan jälkeen,
mutta tauti menee myös yleensä ohi jo 12 - 60 tunnissa. Voimakas ripuli ja oksentelu voivat
aiheuttaa elimistön kuivumistilan. (Rusin ym. 2000, Nel ja Weyer 2004) Hepatiitti-virusten
itämisaika on keskimäärin 40 päivää ja oireita, kuten vatsakipua, pahoinvointia, kuumetta ja
alipainoa, ei ole helppo tunnistaa hepatiitin aiheuttamaksi (Nel ym. 2004). Virukset eivät pysty
lisääntymään ympäristössä ilman isäntäsoluja, mutta säilyvät vesiympäristössä yleisesti ottaen
hyvin pitkään. Ne kestävät bakteereita paremmin fysikaalisia ja kemiallisia rasitteita, kuten
vedenpuhdistusprosesseja ja desinfiointia. Virukset ovat kooltaan mikrobeista pienimpiä ja
kokonsa vuoksi ne myös kulkeutuvat hyvin ympäristössä, myös maaperässä (Schijven ym.
2003, National Research Council 2004, Nel ym. 2004).
Virusten viljelymenetelmät ovat usein epäherkkiä ja kaikkia viruksia ei pystytä määrittämään
viljelymenetelmillä (Rusin ym. 2000). Sen vuoksi virusten havaitsemiseksi vesinäytteistä on
24
kehitetty molekyylibiologisia PCR-menetelmiä. Näytteestä on ensin eristettävä DNA tai RNA
puhtaaksi määritysmenetelmän reaktioita estävistä yhdisteistä. RNA-viruksia tutkittaessa
viruksen RNA:sta syntetisoidaan komplementaarinen DNA-juoste käänteiskopiointitekniikalla
ennen PCR-detektiota. (Rusin ym. 2000, Theron ja Cloete 2004, Girones ym. 2010) Tulosten
varmistamiseksi voidaan tehdä vielä nukleiinihappojen hybridisaatio ja/tai sekvensointi (CEN
ISO/TS 15216-1 2013) Laboratorioiden analyysivalmiudet virusten määrittämiseen ovat melko
rajallisia ja virusten tutkimiseen vaadittavaa erikoisanalytiikkaa on yleensä tarjolla ainoastaan
yliopistojen ja tutkimuslaitoksien laboratorioissa.
Vedenlaadun tutkimuksessa voidaan määrittää myös virusindikaattoreina bakteerien viruksia,
bakteriofageja. Kolifagit ovat E. coli -bakteerisoluja infektoivia bakteriofageja ja E. coli bakteerin viruksina ne ilmentävät myös ulosteperäistä saastumista. Kolifagit voidaan jakaa
ryhmiin sen mukaan, miten ne rakenteensa vuoksi infektoivat bakteerisolun. F-spesifiset
kolifaagit ovat DNA tai RNA-viruksia, jotka infektoivat F-tekijän omaavia E. coli bakteerikantoja niiden F-piluksen kautta. Somaattiset kolifaagit ovat DNA-viruksia, jotka
infektoivat E. coli -bakteerin niiden solukalvon kautta. (Rusin ym. 2000, US EPA 2001a)
Kolifagien määritys perustuu plakkimenetelmään. Näytettä inkuboidaan isäntä E. coli bakteerin läsnäollessa joko tryptoni-hiivauute-glukoosi-agarissa (SFS 2002) tai tryptoosisoijaagarissa (US EPA 2001a), jolloin näytteessä olevat kolifagit hajottavat bakteerikasvustoon
kirkkaita pyöreitä alueita, plakkeja. Plakkien määrä lasketaan ja kolifagien määrä näytteessä
ilmoitetaan plakin muodostavina yksikköinä, englanniksi plaque forming units (pfu). 100 ml:n
näytetilavuus on yleisesti käytetty ja erilaisille vesinäytteille on kehitetty eri menetelmiä.
Määritettäessä kolifageja pohja- ja talousvesistä voidaan käyttää plakkimenetelmän kanssa
rikastusmenetelmää, jolloin saadaan kvalitatiivinen tulos. (US EPA 2001b) Jätevesiä
analysoitaessa näytetilavuus maljalla voi olla alle millilitran.
25
Alkueläimet
Yleisimmin
vesivälitteisiä
tauteja
aiheuttavia
alkueläimiä
ovat
Giardia-suvun
ja
Cryptosporidium-suvun alkueläimet. Alkueläimet tarttuvat ihmisestä toiseen ulosteperäisen
tartunnan kautta ja ulosteperäisesti saastuneen talousveden kautta. Jo yksi alkueläin voi
aiheuttaa sairastumisen, jolloin oireita ovat yleensä ripuli, voimakkaat vatsakivut ja
pahoinvointi. (Nel ym. 2004) Alkueläimet ovat halkaisijaltaan useita mikrometrejä. Niitä
esiintyy pinta- ja jätevesissä ja koteloituneina kystamuodossa ne voivat säilyä pitkään
vahingoittumattomina erilaisissa olosuhteissa (Reynolds ja Pepper 2000, Nel ym. 2004).
Alkueläinten säilyvyyteen ja esiintymiseen ympäristössä vaikuttavat lämpötila, vuodenaika ja
maantieteellinen sijainti, suoja, kuten isäntä ja predaatio (National Research Council 2004).
Alkueläinten
kystat
saattavat
säilyä
vahingoittumattomina
joissakin
talousveden
desinfiointikäsittelyissä, joten niiden poistoon vedestä voidaan tarvita fysikaalisia operaatioita,
kuten suodatus (Reynolds ja Pepper 2000, Lecler ym. 2004).
Giardia- ja Cryptosporidium-suvun alkueläimien esiintymistä vedessä voidaan määrittää
immunofluoresenssimenetelmällä,
jossa
kystat
ja
ookystat
määritetään
immunofluoresenssimäärityksellä värjäämällä ja mikroskopoinnilla. Värjäyksessä (oo)kystat
värjätään kiinnittämällä niille spesifisen vasta-aineen avulla niihin fluoresoiva väriaine.
(oo)kystiin kiinnittynyt fluoresoiva väriaine voidaan havaita fluoresenssimikroskoopilla.
(Theron ja Cloete 2004, US EPA 2005, ISO 2006) Alkueläimien määrityksessä on käytetty
myös nukleiinihappojen määritykseen perustuvia molekyylibiologisia PCR-menetelmiä
(Rimhanen-Finne ym. 2002, Theron ja Cloete 2004).
2.4
VESINÄYTTEIDEN KONSENTROINTITEKNIIKAT MIKROBIOLOGISIA
TUTKIMUKSIA VARTEN
Mikrobien havaitsemiseksi talousvedestä tai talousveden raakavedestä vesinäytetilavuus täytyy
saada pienemmäksi mikrobiologisia analyysejä varten konsentroimalla (Pepper ym. 2000,
Theron ja Cloete 2004). Näytteenotossa ja konsentroinnissa mikrobit eivät saisi vahingoittua,
eikä niiden lukumäärä vähentyä tilavuuden pienentyessä. Vesinäytteitä voidaan konsentroida
suodattamalla ja sentrifugoimalla. Tekniikat perustuvat mikrobien kokoon, massaan ja
sitoutumispotentiaaliin. Suodatuksen ja sentrifugoinnin tehokkuutta voidaan lisätä muuttamalla
näytteen olosuhteita kemikaalien avulla. Eri tekniikoita voidaan yhdistää samanaikaisesti tai
peräkkäin parhaan lopputuloksen saamiseksi. Suodattamalla tai sentrifugoimalla tehdyn suuren
26
tilavuuden konsentroinnin jälkeen voidaan tarvittaessa tehdä toinen konsentrointi konsentraatin
tilavuuden pienentämiseksi. Jatkokonsentroinnin tarve riippuu näyteveden laadusta ja
tilavuudesta sekä käytetyistä menetelmistä. Esimerkiksi PCR-menetelmiä varten näytetilavuus
on vain joitakin mikrolitroja. Pienen tilavuuden konsentrointimenetelmiä voidaan käyttää
suoraan näytteissä, joiden mikrobilukumäärät ovat valmiiksi korkeita, kuten jätevesissä.
(Lindquist 2011)
Eri mikrobiryhmät ovat kooltaan, muodoltaan, sitoutumisominaisuuksiltaan ja säilyvyydeltään
erilaisia, minkä vuoksi eri mikrobeille käytetään yleensä eri konsentrointimenetelmiä (Theron
ja Cloete 2004). Eri mikrobiryhmien samanaikaiseen konsentrointiin soveltuvia menetelmiä on
tutkittu, mutta menetelmien saannot eri mikrobien suhteen ovat vaihdelleet (Payment ym. 1989,
Kfir ym. 1995, Polaczyk ym. 2007). Alkueläinten ja bakteerien konsentrointiin tarkoitetut
suuren tilavuuden menetelmät eivät sovi viruksille suuren huokoskoon vuoksi. Virusten
konsentroinnissa käytetään mikrokoon suodatusta, mutta silloin tarvitaan kemikaalilisäyksiä tai
pH:n säätöä, jotka eivät sovellu aina eri mikrobien konsentrointiin. (Theron ja Cloete 2004,
Lindquist ym. 2007, Polaczyk ym. 2007) Eri mikrobiryhmille sopiva konsentrointimenetelmä
olisi hyödyllinen ajan ja kustannusten säästämiseksi (Payment ym. 1989, Polaczyk ym. 2007).
2.4.1 Suodattaminen mikrobeja pidättävää materiaalia käyttäen
Suodatusmenetelmät perustuvat puoliläpäisevään kalvoon tai materiaaliin, joka päästää läpi
tiettyä kokoa tai molekyylimassaa pienemmät partikkelit ja estää sitä suurempien
partikkeleiden läpäisyn (SFS 2008b). Suodatustekniikat voidaan jakaa suodattimen
huokoskoon mukaan nano-, mikro- ja ultrasuodatukseen tai suodatinmateriaalin ja sen
rakenteen mukaan esimerkiksi kalvosuodatukseen ja patruunasuodatukseen. Mikrobien
määritysmenetelmissä suodatinmateriaali on yleensä huokoinen kalvo, jonka huokoset ovat
mikrobien kokoa pienempiä. Huokoskoko voidaan ilmoittaa huokosen halkaisijana
mikrometreinä tai molekyylipainohalkaisijan (MWCO, molecular weight cut-off) mukaan
daltoneina (Da). Suodattimen valinnassa on otettava huomioon mikrobien koon lisäksi tutkittu
tilavuus, suodatustehokkuus, materiaalin kerrostuminen suodattimeen ja ajan ja energian
käyttö. Mikrobien ja partikkelien ominaisuudet, kuten sähköinen pintavaraus, vaikuttavat
niiden materiaaleihin sitoutumiseen, jolloin sitoutumista voidaan hyödyntää tai ehkäistä eri
kemikaalien ja materiaalien avulla. Suodatinkalvon erilainen pakkaaminen vaikuttaa siihen
millaisella paineella suodatus tapahtuu ja miten paljon suodattimelle kerrostuu materiaalia. On
27
huomioitavaa, ettei suodatin rikkoudu tai mikrobit vahingoitu ja vahingoittuneina läpäise
suodatinta esimerkiksi liian kovassa paineessa. (Lindquist 2011) Yksinkertaisimmillaan vesi
voidaan suodattaa painovoiman avulla suodatinkalvon läpi, mutta suodattimen läpäisyyn
käytetään yleensä tehokkuuden parantamiseksi vakuumia tai pumppua.
Yleisesti käytössä olevassa kalvosuodatusmenetelmässä (membrane filtration, MF) käytetään
tasomaista suodatinkalvoa. Kalvosuodattimien valmistusmateriaaleina käytetään selluloosaasetaattia tai -nitraattia, polykarbonaattia tai polyvinyyliä. Bakteerien määrityksessä, kuten
indikaattoribakteerien kalvosuodatusmenetemässä, käytetään yleensä 47 mm halkaisijaltaan ja
0,2–0,45 µm huokoskooltaan olevaa suodatinkalvoa. (Pepper ym. 2000, SFS 2008b) Virusten
konsentroinnissa käytettään usein hyödyksi virusten adsorptiota varaukseltaan positiiviseksi tai
negatiiviseksi käsitellylle suodattimelle (Lukasik ym. 2000, Pepper ym. 2000, Ikner ym. 2012,
CEN ISO/TS 15216-1 2013). Alkueläinanalyysissä on käytetty halkaisijaltaan suurempaa, jopa
293 mm, kalvoa, jonka huokoskoko on 1 µm (Ongerth ja Stibbs 1987). Suodatuksen jälkeen
kalvo voidaan asettaa kiinteälle kasvualustalle maljalle tai rikastusliemeen (Pagel ym. 1982,
Theron ja Cloete 2004). Mikrobit voidaan myös irrottaa suodattimelta huuhtomalla eli
eluoimalla ne sopivaan liuokseen, kuten Legionella -bakteereita ja viruksia määritettäessä (ISO
1998, US EPA 2012, CEN ISO/TS 15216-1 2013).
Taudinaiheuttajia
määritettäessä
suodatuksessa
käytetään
usein
monimutkaisempia
suodatinpatruunoita, kun halutaan suodattaa suuri tilavuus. Myös patruunasuodatuksessa
suodatin on usein kalvomateriaalia, mutta se on pakattu suodatuspinta-alan suurentamiseksi
laskoksille, spiraalikierteelle tai ontoiksi kuiduiksi. Materiaali voi olla myös syväsuodatin
esimerkiksi vaahtomaisesta materiaalista. (Lindquist 2011) Negatiivisesti varautuneet virukset
voidaan suodattaa positiivisesti varattujen suodattimien läpi, käyttäen esimerkiksi NanoCerampatruunasuodatinta (Argonide, Sanford, Yhdysvallat) tai 1MDS Virosorb -patruunasuodatinta
(Cuno, Grou, Alankomaat). NanoCeram-suodattimen keskimääräinen huokoskoko on 2-3 µm,
mutta positiivisen varauksen vuoksi huokoskooksi muodostuu 0,2 µm (Argonide 2014). Ennen
varsinaista
suodatusta
samea
näyte
voidaan
suodattaa
polypropyleenisella
esisuodatinpatruunalla (Gilgen ym. 1997, Gibbons ym. 2010, US EPA 2012).
Nykyään Giardia- ja Cryptosporidium-alkueläinten eristämiseen vesinäytteistä käytetään
yleensä suodatinpatruunaa standardimenetelmän ISO 15553 (2006) ja menetelmän USEPA
1623 (2005) mukaisesti (US EPA 2005, ISO 2006, Edge ym. 2013, Widerström ym. 2014).
28
Käytettyjä suodatinpatruunoita ovat esimerkiksi Envirochek™ tai Envirochek™ HV (Pall Life
Sciences, New York, Yhdysvallat). Suodatinpatruunat on valmistettu hydrofiilisesta
polyeetterisulfoni-
tai
polykarbonaattikalvosta,
ja
niiden
huokoskoko
on
1
µm.
Konsentroinnissa voidaan käyttää myös vaahtomaisesta suodatinmateriaalista valmistettua
patruunaa Filta-Max® (IDEXX, Westbrook, Maine, Yhdysvallat). Patruunalle valmistaja on
antanut konsentroinnin vähimmäispaineeksi virtaaman aikaansaamiseksi 0,5 baaria ja
suositeltu paine on 5 baaria. Kaupallisia patruunoita edullisempia menetelmiä on testattu
taudinaiheuttajien suuren tilavuuden suodatukseen. Virusten konsentroinnissa esimerkiksi on
käytetty lasivillapatruunaa. (Gantzer ym. 1997, Lambertini ym. 2008) Elintarvikehygienian ja
jätevesien tutkimusmenetelmästä muunnellussa Moore swab -menetelmässä patruunaan
tehdään suodatin puuvillaharsosta taittelemalla (Bisha ym. 2011, McEgan ym. 2013, Sbodio
ym. 2013).
2.4.2 Sentrifugointi
Jos näytetilavuus on sopivan pieni, näyte voidaan konsentroida sentrifugoimalla. Pienen
mikrobilukumäärän omaavien vesien konsentrointia varten on kehitetty myös suuren tilavuuden
sentrifugointimenetelmiä, jolloin käytetään jatkuvaa virtausta. Kaikki sentrifugointimenetelmät
perustuvat tiheyksiltään erilaisten hiukkasten erottumiseen keskipakoisvoiman avulla
(Lindquist 2011). Sentrifugoinnissa käytetään usein hyödyksi kemikaaleja tiheysmuutosten ja
-erojen aikaansaamiseksi. Mikrobien erottamiseen voidaan myös käyttää voimakkaita
suhteellisia keskipakoisvoimia eli ultrasentrifugointia tai suodatinkalvoa sentrifuugiputkessa
(Ikner ym. 2012).
Bakteereita voidaan konsentroida pienestä tilavuudesta sentrifugoimalla ja liuottaa pelletti
eluointiliemeen (Khan ja Edge 2007). Bakteereita pienempien virusten konsentroinnissa
sentrifugoimalla käytetään usein kemikaaleja apuna etenkin, jos viruslukumäärä näytteessä on
pieni (Theron ja Cloete 2004, Ikner ym. 2012). Kemikaaleilla pyritään usein muuttamaan
tiheyttä siten, että mikrobit sedimentoituvat nopeammin sentrifugoitaessa näytettä. Esimerkiksi
polyetyleeniglykolisaostuksessa pH-neutraaliin näytteeseen lisätään polyetyleeniglykolia
(PEG) ja sentrifugoidaan näytettä, jolloin näytteen virukset laskeutuvat pohjalle (Lewis ja
Metcalf 1988, Theron ja Cloete 2004, CEN ISO/TS 15216-1 2013). Toisessa virusten
konsentrointimenetelmässä, orgaanisessa flokkuloinnissa, näytteeseen lisätään lihauutetta ja
pH säädetään happamaksi noin 3,5:een. Virukset muodostavat tällöin flokkeja lihauutteen
29
proteiinien kanssa ja painuvat sentrifugoitaessa pohjalle. (Katzenelson ym. 1976, Ikner ym.
2012) Alkueläinten määrityksessä on käytetty sentrifugointia yhdistettynä saostukseen
kalsiumkarbonaatin avulla (Vesey ym. 1993).
Sentrifugointi voidaan yhdistää myös ultrasuodatukseen. Viruksia määritettäessä voidaan
konsentrointi pienestä tilavuudesta tehdä sentrifugoimalla näyte ultrasuodatinkalvon läpi (Ikner
ym. 2012). Sentrifugoinnin aiheuttaman voiman vuoksi vesi ja ultrakokoisen suodatinkalvon
huokoskokoa pienemmät molekyylit läpäisevät kalvon ja laskeutuvat putken alaosaan.
Huokoskokoa suuremmat partikkelit, kuten virukset, eivät läpäise kalvoa ja jäävät sen pinnalle.
Tähän menetelmään on olemassa kaupallisia mikrokonsentraattoreita, kuten Centricon-100
(Millipore), Centriprep Concentrator 50 (Millipore), Microsep-100 (Pall Corporation) ja
Vivaspin (GE Healthcare) (Gilgen ym. 1997, Brassard ym. 2005, CEN ISO/TS 15216-1 2013).
Sentrifugointia voidaan käyttää virusten ja makromolekyylien erottamiseen ilman
suodatinkalvoa,
kun
käytetään
ultrasentrifugointia
eli
yli
100
000
x
g
keskipakoisvoimakkuuksia. Ultrasentrifugointiaika on usein tunteja, jotta pienet kevyet
mikrobit, kuten virukset, saadaan laskeutumaan näytteessä. Viruksia painavammat partikkelit
voidaan poistaa näytteestä sentrifugoimalla näytettä pienemmillä keskipakoisvoimmilla ennen
tai jälkeen ultrasentrifugoinnin. (Nordgren ym. 2009, Ammersbach ja Bienzle 2011, Ikner ym.
2012)
Sentrifugointia voidaan tehdä myös jatkuvalla virralla, jos mikrobikonsentraatio on pieni.
Alkueläinten
määritykseen
on
kehitetty
suuren
näytetilavuuden
konsentrointiin
jatkuvavirtaussentrifugointi -menetelmä (continuous flow centrifugation). Menetelmää on
testattu myös bakteerien konsentrointiin (Borchardt ja Spencer 2002, Bisha ym. 2011).
Konsentrointia voidaan käyttää laboratorion ulkopuolella ja hyödyntää näytteenottoon.
Säädettävä laitteisto menetelmään on kehitetty verisolujen erotuksessa käytetyn stationäärisen
differentiaalisen continuous flow centrifuge -menetelmän pohjalta (Zuckerman ym. 1999).
Näyte syötetään sentrifuugille letkupumpulla. Sentrifugoinnissa alkueläinten (oo)kystat
kerääntyvät pääasiassa seinämille ja vesi ohjataan poistoon. Seinämiltä (oo)kystat eluoidaan
talteen eluointiliuoksen ja ravistelun avulla. Zuckermanin ja Tziporin tutkimuksissa (2006)
näyte konsentroitiin astiaan alle 250 ml:n tilavuuteen. Nopeus oli noin 750 ml minuutissa ja
näytetilavuus 10-50 litraa. Näytteistä, joihin oli lisätty Cryptosporidium- ja Giardiaalkueläimiä,
saanto
oli
jatkuvavirtaussentrifugointimenetelmällä
Cryptosporidium-
30
alkueläimelle 60 % ja Giardia-alkueläimelle 67 %. Patruunasuodatusmenetelmällä (US EPA
1623) saanto oli Cryptosporidium-alkueläimelle 18 % ja Giardia-alkueläimelle 43 %
(Zuckerman ja Tzipori 2006).
2.5 ULTRASUODATUSMENETELMÄ
Ultrasuodatusta (Ultrafiltration, UF) käytetään lääketieteessä makromolekyylien, kuten
proteiinien, erottamiseen paine- tai pitoisuuseron avulla, elintarviketeollisuudessa proteiinien
käsittelyyn talousveden tuotannossa orgaanisen materiaalin ja mikrobien poistoon vedestä.
(Zamparo ja Comper 1990, Clever ym. 2000, Manahan 2004, Liikanen 2007, Nigam ym. 2008,
Kratzer
ym.
2014)
Vesimikrobiologiassa
sitä
on
käytetty
pienten
tilavuuksien
viruskonsentrointiin. Suuren tilavuuden ultrasuodatusmenetelmää on alettu kehittää
vesimikrobiologiseen tutkimuskäyttöön, koska on haluttu tehokkaampi menetelmä eri
mikrobiryhmien suuren tilavuuden konsentrointiin (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym.
2005). Menetelmällä pyritään konsentroimaan eri mikrobit samanaikaisesti, mikä nopeuttaa
niiden määritystä ja materiaalia kuluu vähemmän. Taudinaiheuttajamikrobien mahdollisimman
nopea todentaminen on erityisen tärkeää epidemiaepäilytilanteessa. Tällöin ei usein ennalta
tiedetä, mikä mikrobi tautia aiheuttaa, jolloin joudutaan määrittämään eri mikrobeja.
Samanaikaista konsentrointia voidaan hyödyntää myös muissa tilanteissa, joissa halutaan
määrittää suuri joukko eri mikrobeja (Hill ym. 2005).
Ultrasuodatusmenetelmä eroaa muista suuren tilavuuden konsentrointimenetelmistä erityisesti
ultrapieneltä huokoskooltaan, minkä vuoksi sen ajatellaan soveltuvan eri mikrobiryhmien
samanaikaiseen konsentrointiin. (Morales-Morales ym. 2003) Ultrasuodatusmenetelmässä
huokoskoko on 0,001-0,05 µm tai 1-500 kDa. (Lindquist ym. 2007) Vaikka näyteveteen tai
suodattimeen ei lisätä virusten sähköisiin vuorovaikutuksiin vaikuttavia aineita, virukset eivät
läpäise kalvon niitä pienempiä huokosia. (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005, Lindquist
ym. 2007) Sitoutumisominaisuudet on kuitenkin huomioitava, sillä osa mikrobeista voi sitoutua
suodattimelle muun muassa van der Waals -voimien tai hydrofobisen sitoutumisen avulla. Sen
vuoksi suodatinta voidaan käsitellä sitoutumisen ehkäisemiseksi tai eluoida mikrobien
irrottamiseksi. (Garin ym. 1993, Winona ym. 2001)
Ultrasuodatustamenetelmän kehityksessä on käytetty tasomaista ja patruunaan eri tavoin
pakattua kalvoa ja kalvomateriaalina on käytetty muun muassa selluloosa-asetaattia. (Garin ym.
31
1993, Winona ym. 2001) Suuren tilavuuden ultrasuodatusmenetelmässä käytetään nykyään
suodatinpatruunaa, jossa polysulfonista valmistettu kalvomateriaali on onttoina kuituina. (Hill
ym. 2005, Ikner ym. 2012) Onttokuitu-ultrasuodatusmenetelmä (HFUF, hollow-fiber
ultrafiltration) sopii suuren tilavuuden suodatukseen, sillä suodatinpatruunaan pakatuilla
ontoilla suodatinkalvokuiduilla mahdollistetaan suuri suodatuspinta-ala. Suuri pinta-ala ja
kalvoon nähden tangentiaalinen suodatus vähentävät veden sisältämän materiaalin
kerrostumista ja suodattimen tukkeutumista ja lisäävät siten suodatustilavuutta ja nopeutta.
(Morales-Morales ym. 2003, Lindquist 2011)
2.5.1 Ultrasuodatuksen toteutus
Suuren tilavuuden konsentrointiin sopivaa ultrasuodatusmenetelmää on kehitetty laitteiston,
onttokuituisen suodatinpatruunan valinnan ja esikäsittelyn osalta ja sitä on testattu eri
bakteereiden, virusten ja alkueläinten konsentrointiin. Myös erilaisten vesimatriisien,
näytetilavuuden ja suodatusnopeuden vaikutusta konsentrointiin ultrasuodatusmenetelmällä on
tutkittu.
Ultasuodatusmenetelmässä
on
tutkittu
kahta
päämenetelmää:
normaalimenetelmää
(englanniksi dead-end ultrafiltration, DEUF) ja tangentiaalista ristivirtausmenetelmää
(tangential ultrafiltration tai cross-flow ultrafiltration). Normaalimenetelmässä koko
näytevesitilavuus pakotetaan paineen avulla läpäisemään kuitujen suodatinmateriaali
kierrättämättä vettä, jolloin mikrobit ja huokosia suuremmat molekyylit jäävät kuituihin.
Suodatinpatruunalta mikrobit huuhdotaan vastavirtaan liuoksella, jonka tilavuus on usein 500
ml. (Smith ja Hill 2009, Leskinen ym. 2012) Ristivirtausmenetelmässä vesi virtaa
suodatinkuitujen suuntaisesta ja osa vedestä läpäisee suodatinmateriaalin eli kulkee
kohtisuoraan suodatinkuituun nähden sen läpi. Suodatinmateriaalin ohi tangentiaalisesti
virrannut suodattumaton vesi taas kierrätetään yleensä uudelleen suodattimelle, kunnes haluttu
tilavuus on kokonaan suodattunut. Ristivirtausmenetelmässä mikrobit konsentroituvat
kiertävään veteen eli konsentraattiin, jonka tilavuus lopuksi voi olla joitakin satoja millilitroja.
(Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005, Rhodes ym. 2011) Ristivirtausmenetelmässä
kalvon suuntaisesti kulkeva vesi ehkäisee suodatinkalvon tukkeutumista, mikä edesauttaa
suuren tilavuuden suodatusta normaaliultrasuodatukseen verrattuna. Suodattimelle kerrostuva
vähäinen materiaali voi myös parantaa suodatusta tukkimalla mikrobeja isommat aukot
suodattimessa. (Hijnen ym. 2000, Morales-Morales ym. 2003) Normaalimenetelmä on
32
kuitenkin yksinkertaisempi käyttää, joten sitä on kehitetty kentällä käytettäväksi ja
rutiinikäyttöön. (Smith ja Hill 2009, Leskinen ym. 2012)
Suodatusnopeutta ja painetta on tutkittu eri menetelmissä. Normaalimenetelmässä
suodatusnopeus voi olla 1-2 litraa minuutissa (Simmons ym. 2001, Smith ja Hill 2009).
Ristivirtaussuodatuksessa kokonaisvirtaus suodattimelle on ollut 1,7 litrasta yli neljään litraan
minuutissa, josta veden suodatusnopeus suodatinmateriaalin läpi on vaihdellut välillä 0,8 ja 1,2
litraa minuutissa. Myös korkean virtausnopeuden suodatusta yli kaksi litraa minuutissa on
tutkittu (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008). Hyvin nopeassa
suodatuksessa, nopeus yli kaksi litraa minuutissa, mikrobisaanto voi olla heikompi (Polaczyk
ym. 2008). Suodatuspaineen on raportoitu olleen tutkimuksissa noin yksi baari tai vähemmän
(0,4-1,1 bar) (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Rhodes ym. 2011). Painetta voidaan
seurata ennen tai jälkeen suodatinpatruunan (Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011). Paineen
seurannalla voidaan myös havaita suodattimen rikkoutuminen (Lindquist ym. 2007).
Paineeseen vaikuttavat suodattimen ja laitteiston rakenne, kuten letkut ja kiristimet ja
pumppausnopeus (Polaczyk ym. 2008, Smith ja Hill 2009).
Menetelmässä on käytetty ja vertailtu eri valmistajien suodatinpatruunoita. Käytetyt patruunat
ovat usein dialyysihoidossa käytettyjä malleja, koska niitä on ollut edullisesti saatavilla. (Hill
ym. 2005, Rhodes ym. 2011) Mikrobiologiseen käyttöön ei ole vielä kaupallisia ultrakoon
suodatinpatruunoita. Suodatinpatruunoiden pinta-alan ja rakenne-erojen on tutkittu vaikuttavan
suodatuspaineeseen. Smith ja Hill (2009) vertasivat neljää eri ultrasuodatuspatruunaa paineen,
virtaaman ja veden lämpötilan osalta. Freseniuksen valmistamalla suodatinpatruunalla Optiflux
F200NR oli testissä korkein paine, kun suodatusnopeus oli yli litra minuutissa ja paine nousi
eniten suodatusnopeutta nostettaessa. Asahi Kasei REXEED 21S ja 25S -suodatinpatruunoilla
paine oli yleensä ottaen pienin. Suuremman pinta-alan omaavalla suodatinmallilla paine voi
olla pienempi verrattuna saman valmistajan pienemmän pinta-alan suodattimeen. Käytettyjen
suodatinpatruunoiden pinta-ala on ollut 1,8-2,5 m2 (Hill ym. 2005, Smith ja Hill 2009).
Polaczyk ym. (2008) eivät huomanneet Freseniuksen Hemoflow F80A ja F200NR suodatinpatruunoiden eroilla olevan selvää vaikutusta mikrobisaantoon.
Kontaminaatioriskin
pienentämiseksi
ultrasuodatusmenetelmässä
käytetään
yleensä
letkupumppua (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008).
Normaaliultrasuodatuksessa voidaan käyttää muunlaista pumppua, jos pumpun läpi mennyt
33
vesi imetään suodattimelta eli se ei kulje enää suodattimelle tai pääse kontaminoimaan sitä enää
pumpun jälkeen (Lindquist 2011). Letkuina on käytetty usein platinavulkanoituja
silikoniletkuja, joiden sisähalkaisija on 6,4 mm (Hill ym. 2005, Hill ym. 2007, Polaczyk ym.
2008, Rhodes ym. 2011). Pumpun kohdalla tai suodattuneen veden letkuina on käytetty myös
paksumpaa sisähalkaisijaltaan 9,5-9,7 mm olevaa letkua (Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym.
2011). Pumpun kohdalla sisähalkaisijaltaan suuremmalla letkulla voidaan nostaa suodattimelle
menevän veden virtausnopeutta (Hill ym. 2007, Polaczyk ym. 2008).
Suodatuksen mikrobisaantoa voidaan parantaa vaikuttamalla mikrobien sitoutumiseen
esikäsittelemällä suodatin tai lisäämällä veteen kemikaaleja. Suodatinta on esikäsitelty ennen
suodatusta erilaisilla menetelmillä, joiden tarkoitus on ehkäistä mikrobien kiinnittymistä
suodattimeen. (Lindquist ym. 2007, Hill ym. 2010) Esikäsittely voi muokata fysikaalisesti
suodatinmateriaalin pintaa ja rakennetta tai muuttaa suodatinmateriaalin varausta.
Naudanseerumin ja NaPP:n käyttöä esikäsittelyliuoksina on tutkittu. (Morales-Morales ym.
2003, Hill ym. 2005, Polaczyk ym. 2008) Polyfosfaatit ovat hyvin negatiivisesti varautuneita
ja estävät mikrobien kiinnittymistä kalvolle muuttamalla mikrobien zeta-potentiaalia
negatiivisemmaksi. Esikäsittely voi estää myös mikrobien havaitsemista estävien yhdisteiden
kerääntymisen suodattimelle. (Winona ym. 2001) Esikäsittely vie kuitenkin aikaa ja lisää
kontaminaatioriskiä
(Hill
ym.
2005).
Pintavarauksiin
vaikuttavia
aineita,
kuten
natriumpolyfosfaattia (NaPP) voidaan lisätä näyteveteen esikäsittelyn sijaan tai lisäksi, minkä
on huomattu parantavan mikrobisaantoa (Hill ym. 2005). Näyteveteen voidaan myös syöttää
tiosulfaattia kloorin neutraloimiseksi (Polaczyk ym. 2008).
Suodatinpatruunalle jääneet mikrobit voidaan huuhtoa liuokseen, mikä on välttämätöntä
normaaliultrasuodatusmenetelmässä. Huuhtelu voidaan tehdä vastavirtaan suodatukseen
nähden tai ristivirtausmenetelmässä myös suodatuksen suuntaan. Huuhtelussa voidaan käyttää
eluointiliuosta tai suodattunutta vettä. (Hill ym. 2005, Polaczyk ym. 2008) Eluointiliuoksessa
on käytetty kemikaaleja, joita käytetään yleisesti laboratoriotutkimuksissa, kun halutaan
vaikuttaa mikrobien sitoutumiseen. (Morales-Morales ym. 2003, Méndez ym. 2004) NaPP
vaikuttaa hiukkasten ja virusten pintavarauksiin, Tween ehkäisee hydrofobisten sidoksien
syntymistä suodattimen ja mikrobien välille ja Antifoam-emulsiot estävät nimensä mukaisesti
vaahtoamista (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005). Suodatussuuntaan eluoitaessa
eluointiliuos tai sama tilavuus suodattunutta vettä voidaan pumpata kerran suodattimen läpi tai
kierrättää sitä suodattimella. Kierrätyksen aikana liuoksen tilavuutta voidaan pienentää
34
suodattamalla esimerkiksi 150-200 ml:aan tai estää veden suodattuminen patruunalta korkkien
avulla, jolloin liuoksen tilavuus pysyy samana eli usein 500 ml:na (Hill ym. 2007, Mull ja Hill
2009). Eluointi tehdään yleensä ilman paineen nostoa ja virtausnopeus voi olla pienempi kuin
varsinaisessa suodatuksessa (Lindquist ym. 2007). Vastavirtahuuhtelussa liuos pumpataan vain
kerran
suodatinmateriaalin
läpi
vastakkaiseen
suuntaan
suodatussuuntaan
nähden.
Vastavirtahuuhtelumenetelmää käytetään normaaliultrasuodatuksessa, mutta sitä voidaan
käyttää myös ristivirtaussuodatuksen lopuksi. (Polaczyk ym. 2008) Suodatinpatruunaa on
suodatuksen lopuksi myös puhallettu paineilmalla, jotta kaikki näyte mikrobeineen saadaan
patruunalta talteen (Hill ym. 2005). Ristivirtausmenetelmällä on saatu hyviä saantotuloksia
ilman eluointia, mutta eluoinnilla voidaan myös parantaa saantoa (Polaczyk ym. 2008). Hill
ym.
(2005)
huomasivat
ristivirtausmenetelmässä
vastavirtahuuhtelun
parantavan
mikrobisaantoa huomattavasti verrattuna suodatinpatruunan huuhtomatta jättämiseen.
Lindquist
ym.
(2007)
saivat
vastavirtahuuhtelulla
parempia
mikrobisaantoja
kuin
eluointiliuosta suodatussuuntaan kierrättämällä, mutta ero ei ollut merkittävä.
Ultrasuodatusmenetelmällä konsentroitua vesinäytettä voidaan menetelmästä riippuen
konsentroida pienempään tilavuuteen tai analysoida suoraan nykyisin käytössä olevilla viljelyja PCR-menetelmillä (Hill ym. 2007, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Knappett ym.
2011). Jatkokonsentrointina voidaan käyttää kappaleessa 2.4 kerrottuja suodatus- ja
sentrifugointimenetelmiä. Bakteereille voidaan käyttää perinteistä kalvosuodatusmenetelmää
tai sentrifugointia molekyylibiologisia menetelmiä varten. Virusten jatkokonsentrointina on
käytetty mikrokonsentraattoria eli sentrifugoinnin ja ultrasuodatuksen yhdistelmää, PEGsaostusta tai orgaanista flokkulaatiota. (Polaczyk ym. 2008, Mull ja Hill 2009, Hill ym. 2010,
Rhodes ym. 2011)
35
2.5.2 Käytännön sovellutukset
Ultrasuodatusmenetelmää on käytetty kymmenissä tieteellisissä tutkimuksissa. Sitä on käytetty
epidemiaselvityksessä esimerkiksi USA:ssa, talousveden ja sen raakavesien sekä uimavesien
laadun ja suolistoperäisten mikrobien esiintymisen tutkimuksessa, mikrobilähteiden
seurannassa tai jäljittämisessä (Microbial source tracking, MST) ja molekyylibiologisten
menetelmien tutkimuksessa (Santo Domingo ym. 2007, Hill ym. 2010, Hunter ym. 2011,
Ahmed ym. 2012).
Menetelmää on testattu pohjavesien ja talousvesien konsentrointiin näytetilavuuksilla 10 - 7500
litraa (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008, Hill ym.
2010).
Yleensä
näytetilavuus
on
kymmeniä
litroja
tai
sata
litraa
etenkin
normaalisuodatusmenetelmää käytettäessä (Hill ym. 2010, Knappett ym. 2011). Talousvettä
konsentroitaessa menetelmän on tutkittu toimivan kolifagien osalta aina 2000 litran tilavuuteen
saakka, mutta yli 2000 litran tilavuuksissa saannon on todettu heikentyvän huomattavasti
(Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007). Normaali- ja ristivirtausultrasuodatusta on käytetty ja
soveltuvuutta tutkittu myös uimavesille ja talousveden raakavesille. Pintavesien tutkittu
tilavuus on ollut kymmeniä litroja tai sata litraa. (Simmons ym. 2001, Mull ja Hill 2009, Gibson
ym. 2011, Leskinen ym. 2012)
Vesistä
on
tutkittu
ultrasuodatusmenetelmällä
sekä
indikaattorimikrobeja
että
taudinaiheuttajabakteereita, -viruksia ja -alkueläimiä (Hill ym. 2010, Gibson ym. 2011, Ahmed
ym. 2012, Wu ym. 2013, Griffin ym. 2014). Tutkimuksissa, joissa talousvesi- tai
pohjavesinäytteeseen
on
lisätty
tunnettu
lukumäärä
mikrobeja,
saannoksi
ultrasuodatusmenetelmällä on raportoitu 50–100 % (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007,
Polaczyk ym. 2008, Hill ym. 2009). Pintavesinäytteestä esimerkiksi Veenendaal ja BrouwerHanzens (2007) saivat 50 litran tilavuudesta saannoksi indikaattoribakteereille ja -viruksille ja
Giardia-alkueläimelle vähintään noin 80 %, mutta kampylobakteerille saanto oli keskimäärin
35 % ja Cryptosporidium-alkueläimille 67 %. Suuri osa saantotutkimusten tuloksista on saatu
molekyylibiologisilla menetelmillä. Konsentroinnin vaikutusta mikrobien viljeltävyyteen ei ole
paljon tutkittu. Suodattimen esikäsittelymenetelmät, eluointimenetelmät, kemikaalilisäykset
veteen ja suodatusnopeus voivat vaikuttaa eri mikrobeihin eri tavalla (Polaczyk ym. 2008, Wu
ym. 2013). Myös jatkokonsentrointimenetelmä vaikuttaa saantoon (Rhodes ym. 2011).
36
Veden laadun on huomattu vaikuttavan ultrasuodatuksen tehokkuuteen ja kaikkia eri
vedenlaadun tekijöiden vaikutuksia menetelmään ei vielä tunneta. Sameuden ja lämpötilan
vaikutusta ovat tutkineet muun muassa Smith ja Hill (2009). Kylmän veden suodatukseen
tarvitaan korkeampi paine kuin lämpimän. Saanto oli paras vesistä, jotka olivat vähiten sameita
(Smith ja Hill 2009). Ultrasuodatusta on käytetty joki- ja järvivesien konsentrointiin, joiden
sameus on ollut 3,6 ja 18,4 NTU (Mull ja Hill 2009). Hill ym. (2010) käyttivät onnistuneesti
ultrasuodatusta konsentroidessaan vesiä, joiden sameudet olivat 0,17 NTU ja 9,7 NTU. Veden
laadusta riippuen on mahdollista, että suodattimelle kertyy materiaalia, joka vahingoittaa
mikrobeja ja estää mikrobien havaitsemista (Morales-Morales ym. 2003).
Laboratorion ulkopuolelle soveltuvia ultrasuodatusmenetelmiä ja kuljetettavia laitteistoja on
kehitetty näytteenoton ja näytteen kuljetuksen helpottamiseksi (Kearns ym. 2008, Leskinen ym.
2012). Ultrasuodatuslaitteistot voivat olla laboratoriossa ja kenttäkäytössä osittain tai hyvin
pitkälle
automatisoituja,
esimerkiksi
näytevesiastian
pinnankorkeuden
säädön
tai
näytteenottoajan suhteen (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Kearns ym. 2008, Leskinen
ym.
2012).
Tehokas
suuren
tilavuuden
konsentrointi
ultrasuodatusmenetelmällä,
jatkokonsentrointi mikrolitratilavuuksiin sentrifugoimalla ja mikrobien havaitseminen
molekyylibiologisilla menetelmillä voivat yhdessä mahdollistaa mikrobien havaitsemisen
vedestä nopeasti ja tehokkaasti (Leskinen ym. 2009, Leskinen ym. 2012).
37
3
TYÖN TAVOITTEET
Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli ottaa käyttöön ristivirtausultrasuodatusmenetelmä, jota
voidaan käyttää vesiepidemiaselvitystyössä ja riskinarvioinnin apuna Suomen vesilaitoksilla.
Työn osatavoitteet olivat:

Testata menetelmän toimintaa ja bakteerien ja virusten konsentrointitehokkuutta
suurista vesitilavuuksista.
 Selvittää
menetelmän
kenttäolosuhteissa.
näytteenottoautomatiikan
toimintakykyä
erilaisissa
38
4
AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 ULTRASUODATUSMENETELMÄ JA LAITTEISTO
4.1.1 Ultrasuodatuslaitteisto
Ultrasuodatusmenetelmää varten rakennettiin oma laitteisto Savonia-ammattikorkeakoululla
(Kuopio) kirjallisuudessa esitettyjen menetelmäkuvausten pohjalta (Hill ym. 2005, Hill ym.
2007, Rhodes ym. 2011). Laitteiston toimintaperiaatteen kaavio on esitetty Kuvassa 2 ja
rakennettu laitteisto Kuvassa 3. Laitteistoon rakennettiin automaattinen pinnankorkeudensäätö
pitkäkestoisia suuren tilavuuden suodatuksia varten. Suodatinpatruunat olivat kertakäyttöisiä
Fresenius Helixone® High-Flux FX80 -dialysaattoreita (Fresenius Medical Care, Bad
Homburg, Saksa), joiden suodatuspinta-ala on 1,8 m2. Suodatinkalvon materiaali oli
polysulfonipolyvinyylipyrrolidonisekoitetta ja huokoskoko MWCO:na 5-100 kDa ja 3,3 nm,
suodatinkuitukalvon paksuus 35 µm ja kuidun sisähalkaisija 185 µm. Letkut olivat Pumpsilsilikoniletkua seinän paksuudeltaan 1,6 mm ja sisähalkaisijaltaan 8 mm (Watson Marlow
Tubing, Falmouth, Englanti). Suodatinpatruunan liittimien ja silikoniletkun liitoskohdassa
käytettiin muoviletkua ja suodatetun veden letkut olivat sisähalkaisijaltaan noin 4 mm ja mallia
AV-SN-Set-FMC (FA 514 SN C/FV 204 E) (Fresenius Medical Care, Bad Homburg, Saksa).
Laitteistossa käytettiin peristalttista Ecoline-pumppua VC-380 (Ismatec, Idex Health and
Science, Wertheim, Saksa) ja konsentraattisäiliönä oli viiden litran kanisteri (7270, Plastex,
Lohja, Suomi). Painemittari oli aluksi ilmatäytteinen, mutta se vaihdettiin öljytäytteiseen
laitteiston tärinän vuoksi. Ultrasuodatuslaitteiston toimintaa, suodatusnopeutta ja automatiikan
toimivuutta testattiin Savonia-ammattikorkeakoululla ennen varsinaisia kokeita.
39
Kuva
2.
Ultrasuodatuslaitteiston
kaaviokuva.
Kohta
1.
on
Ecoline-pumppu,
2.
suodatinpatruuna, 3. konsentraattisäiliö, 4. suodattunut vesi (astia tai viemäri), 5.
annostelupumppu, 6. NaPP-liuos,
a. painemittari
ja varoventtiili, b. kiristin,
c.
pinnankorkeusanturit, d. letkujen sulkijat
Kuva 3. Ultrasuodatuslaitteisto edestä ja ylhäältä katsottuna. Kohta 1 on Ecoline-pumppu, 2.
suodatinpatruuna, 3. konsentraattisäiliö, 4. suodattuneen veden letku, a. painemittaria ja
varoventtiili, b. kiristin, c. pinnankorkeusanturit, d. letkujen sulkijat
4.1.2 Ultrasuodatuksen esivalmistelut
Ultrasuodatuslaitteisto desinfioitiin ilman suodatinpatruunaa koetta edeltävänä päivänä
natriumhypokloriittiliuoksella, jonka klooripitoisuus oli noin 60 mg/l. Vaikutusaika oli
40
vähintään 20 minuuttia. Klooriliuosta kierrätettiin laitteessa siten, että liuos pääsi vaikuttamaan
laitteen kaikkien letkujen ja osien sisälle. Klooriliuos huuhdottiin laitteistosta kierrättämällä sen
läpi käänteisosmoosivettä Ecoline-letkupumpulla puoliteholla, joka vastaa noin nopeutta 1700
ml minuutissa. Desinfioinnin ja huuhtelun aikana laitteessa oli suodatinpatruunan tilalla
yksinkertainen muovinen välikappale. Muut osat olivat kiinni samalla tavalla kuin näytevettä
suodatettaessa. Ensimmäisessä kokeessa huuhteluvedestä mitattiin klooripitoisuus huuhtelun
riittävyyden varmistamiseksi (Chlorometer 1000 Palintest, Englanti).
Ennen laitteistoon kytkemistä suodatinpatruuna esikäsiteltiin mikrobien kiinnittymisen
ehkäisemiseksi Hillin (2005) mukaan kierrättämällä sen läpi 500 ml viisiprosenttista (v/v)
naudan seerumia viiden minuutin ajan. Naudan seerumi (Bovine serum 16170, Invitrogen,
Gibco, Yhdysvallat) laimennettiin viisiprosenttiseksi steriilillä deionisoidulla vedellä.
Naudanseerumiliuosta kierrätettiin suodatinpatruunassa kahden autoklavoidun silikoniletkun
avulla letkupumpulla (Watson-Marlow 520S, Englanti) 70 % teholla. Virtaamaa ei mitattu.
Seerumia ei pumpattu patruunan suodatinkuitujen läpi, vaan kuitujen suuntaisesti.
Kierrättämisen jälkeen patruunan reiät suljettiin korkeilla. Suodatinpatruunaa pyöritettiin
pyörittäjällä (FinePCR, Korea) nopeudella 3, 30 asteen kulmassa) 18–24 tuntia. Suodatin
huuhdottiin pumppaamalla Watson-Marlow 520S -pumpulla steriiliä vettä sen läpi 70 %:n
teholla. Suodatus aloitettiin tunnin sisällä suodattimen esikäsittelyn jälkeen.
4.1.3 Näytteen suodatus ultrasuodatuslaitteistolla
Näytevesi pumpattiin Ecoline-letkupumpulla (Kuvat 2 ja 3, kohta 1) näyteastiasta tai hanasta
suodatinpatruunaan (Kuvat 2 ja 3, kohta 2). Jos näytevesi otettiin paineellisesta hanasta,
järjestelmään liitettiin paineenalennusventtiili hanan ja pumpun väliin ennen sulkijaa.
Suodatinpatruunassa osa vedestä suodattui onttojen suodatinkuitujen kalvon läpi ja tuli ulos
erillisistä letkuista (Kuvat 2 ja 3, kohta 4) ja osa vedestä kulki suodattumatta kuitujen
suuntaisesti patruunan läpi konsentraattisäiliöön (Kuvat 2 ja 3, kohta 3), josta se lähti uudelleen
kiertoon, kun säiliö täyttyi. Järjestelmän painetta seurattiin painemittarista (Kuvat 2 ja 3, kohta
a), jonka yhteydessä oli varoventtiili. Jos paine nousi yli 1,5 baariin, vesi pääsi ulos
varoventtiilin kautta kulkeutumatta suodattimelle. Painetta säädettiin kiristimellä (Kuvat 2 ja 3,
kohta b). Konsentraattisäiliön seinämää vasten olevat vedenpinnan korkeutta optisesti mittaavat
anturit (Kuvat 2 ja 3, kohta c) säätelivät automaattisesti toimivia sulkijoita (Kuvat 2 ja 3, kohta
d). Kun veden pinta oli alemman pinta-anturin alapuolella, näytevesiletkun sulkija (Kuvassa 2
41
oikeanpuoleinen) oli auki ja suodattimelle virtasi uutta näytevettä. Konsentraattisäiliöltä
tulevan letkun sulkija (Kuvassa 2 vasemmanpuoleinen) oli silloin kiinni. Kun kanisteri täyttyi
eli pinnankorkeus nousi ylemmän pinta-anturin kohdalle, sulkijoiden asennot vaihtuivat, ja vesi
virtasi suodatinpatruunalle konsentraattisäiliöstä.
Osassa kokeista näyteveteen lisättiin NaPP:a (Merck, Darmstadt, Saksa), jotta mikrobit
pysyisivät näytevedessä eivätkä kiinnittysi suodatinmateriaaliin. Näyteveden NaPP:n
tavoitepitoisuus oli 0,01 % (v/v). Jos näytevesi suodatettiin kanisterista, NaPP-lisäys tehtiin
sekoittamalla NaPP ensin pieneen määrään näytevettä ja sekoittamalla liuos sitten koko
näytemäärään kanisteria voimakkaasti ravistelemalla. Jos lisäys tehtiin hanasta otettavaan
näyteveteen, NaPP-liuos (Kuva 2, kohta 6) syötettiin annostelupumpulla (Grunfos Alldos DME
19-6, Grundfos, Tanska) (Kuva 2, kohta 5) liittimen kautta näyteveteen siinä vaiheessa, kun
konsentroimatonta näytevettä pumpattiin suodatinpatruunalle. Annostelupumppu oli kytketty
sulkijoita säätelevään järjestelmään. Haluttu tilavuus näytevettä suodatettiin ja pumppu
pysäytettiin, kun konsentraattisäiliössä oli jäljellä noin 300 ml näytettä. Odotusajan
säästämiseksi laite voitiin myös käsin kytkeä suodattamaan konsentraattisäiliön vettä missä
vaiheessa tahansa siirtämällä pinta-antureita tai vaihtamalla letkujen paikkoja sulkijoissa.
Konsentraatin tilavuus mitattiin ja konsentraatti otettiin talteen.
Suodatinpatruunan huuhtelussa konsentroinnin jälkeen testattiin eri eluointimenetelmiä.
Huuhtominen tehtiin eluointiliuoksella, joka valmistettiin Hillin (2005) mukaan steriiliin
deionisoituun veteen ja se sisälsi tilavuusprosentteina 0,01 % Tween 80:aa (Sigma-Aldrich,
USA), 0,01 % NaPP:a ja 0,001 % antifoam Y-30:a (Sigma-Aldrich, USA). Huuhtomiseen
käytettiin myös suodatinpatruunan läpi suodattunutta vettä ja konsentraattia, johon sekoitettiin
huuhteluliuosta. Sekoitussuhde oli 1 osa huuhteluliuosta ja 9 osaa konsentraattia (Polaczyk ym.
2008).
4.2
TESTIMIKROBIT
4.2.1 Bakteeri- ja virusliuosten valmistus
Saantokokeissa näyteveteen lisättiin E. coli -bakteeria, F-spesifistä ja somaattista kolifagia tai
norovirusta. E. coli -bakteeriliuos valmistettiin viljelemällä syväjäästä ympäristöperäistä E. coli
-bakteerikantaa (THL-koodi 07v699/1) tryptoni-soija-agar-alustalle (TSA) (Oxoid, Englanti) ja
42
inkuboimalla alustaa kolme vuorokautta lämpötilassa 36 ºC. Kannan puhtaus tarkastettiin
silmämääräisesti ja alustalta siirrostettiin yksi erillispesäke steriilillä silmukalla 10 ml:aan
Preston-lientä (Nutrient Broth N:o 2, Oxoid, Englanti). Bakteerilientä inkuboitiin 24 tunnin ajan
ravistelijassa (Vibramax 100, Heidolph, Saksa) nopeudella 100 rpm lämpötilassa 36 ºC.
Inkuboinnin jälkeen 10 ml:n bakteeriliemi siirrostettiin 100 ml:aan Preston-lientä, jota
inkuboitiin taas 24 tuntia ravistelijassa nopeudella 100 rpm lämpötilassa 36 ºC. Inkuboinnin
jälkeen bakteerilientä sentrifugoitiin kahdessa fuugiputkessa 30 ml eli yhteensä 60 ml 10
minuuttia (Sigma 6-16K, Swing out -roottori 11150 + 13235, 3283 x g, 4500 rpm).
Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti dekantoitiin pois ja pelletit pestiin 15 ml:lla fysiologista
suolaliuosta eli 0,9 % (w/v) natriumkloridilla kaksi kertaa. Toisen pesun jälkeen supernatantti
pipetoitiin tarkasti pois ja molemmat pelletit liuotettiin 5 ml:aan testattavaa vettä ja yhdistettiin
10 ml:ksi. (Lehtola ym. 2007)
Kolifagien kasvatusta varten kasvatettiin menetelmäohjeen US EPA 1601 (2001) mukaisesti
omat isäntäbakteerikannat log-kasvuvaiheeseen kummallekin kolifagille. F-spesifistä kolifagia
varten silmukallinen isäntäbakteeria E. coli Famp (ATCC 700891) siirrostettiin 25 ml:aan
tryptoni-soija-lientä (TSB, Oxoid, Englanti), johon oli lisätty 250 µl ampisilliini/streptomysiini
(A/S) -antibioottia. Lientä inkuboitiin 37 ºC:ssa 18-24 h ravistelijassa (Vibramax 100 Heidolph,
100 rpm). Inkuboinnin jälkeen 250 µl isäntäbakteerilientä siirrostettiin 25 ml:aan TSB-lientä,
johon oli lisätty 250 µl (A/S) -antibioottia, ja inkuboitiin 37 ºC:ssa ravistelijassa noin 1,5 tuntia
log-kasvuvaiheeseen, jossa liemen absorbanssi aallonpituudella 520 nm oli 0,1-0,5.
Inkuboinnin jälkeen isäntää säilytettiin 4 ºC:ssa. Somaattista kolifagia varten kasvatettiin
isäntäbakteeria E. coli CN-13 (ATCC 700609) samalla tavalla kuin E. coli Famp
isäntäbakteeria paitsi antibioottina käytettiin nalidiksiinihappoa.
Log-kasvuvaiheen E. coli Famp isäntäbakteeriliemeen lisättiin F-spesifistä kolifagia (NCTC
12487) siten, että pitoisuudeksi saatiin noin 107 pfu/ml. Lientä inkuboitiin 37 °C:ssa viisi tuntia
ravistelijassa (100 rpm), minkä jälkeen lisättiin suhteessa 1:10 puhdasta kloroformia (Merck)
lopulliseen liuokseen, sekoitettiin ja säilytettiin 4 °C:ssa yön yli. Seuraavana aamuna liuoksesta
dekantoitiin nestefaasi, joka sentrifugoitiin (5000 x g, 20 minuuttia, 4 °C). Supernatantti otettiin
talteen ja suodatettiin vielä 0,45 μm Acrodisc-suodattimen (Pall corporation, Newquay,
Cornwall, UK) läpi. Kolifagiliuos säilytettiin 4 °C:ssa. Somaattisten kolifagien liuoksen
valmistuksessa
somaattista
kolifagia
(ATCC
13706-B1)
lisättiin
E.
coli
CN-13
isäntäbakteeriliemeen ja liuos valmistettiin samalla tavalla kuin F-spesifisten kolifagien liuos.
43
Norovirusliuos
valmistettiin
potilaan
ulostenäytteestä.
Näytettä
sentrifugoitiin
mikrosentrifuugiputkessa (10 000 x g, 2 min) ja supernatantti otettiin talteen ja säilytettiin -80
°C:ssa.
4.2.2 Bakteerien määritys vesinäytteistä
E. coli ja koliformiset bakteerit määritettiin näytteistä kalvosuodatusmenetelmällä tai
pintaviljelymenetelmällä käyttäen kromogeenistä Chromocult Coliform Agar -kasvualustaa
(CC) (Merck, Saksa) tai Chromocult Coliform Agar -kasvualustaa, johon oli lisätty antibiotteja
(CC-VK) (E.coli/Coliform Selective supplement, cefsulodin and vancomycin, Merck, Saksa).
Kalvosuodatusmenetelmässä käytetty suodatin oli GN-6 Metricel (Pall Corporation, USA).
Alustoja inkuboitiin lämpötilassa (36 ± 2) °C 18–24 tuntia. E. coli -bakteeri kasvaa CCalustalla sinisinä tai tumman violetteina ja muut koliformiset bakteerit punaisina pesäkkeinä.
Jos kyseessä oli näyte, johon ei ollut lisätty E. coli -bakteeria, alustoja inkuboitiin toinen
vuorokausi mikäli ensimmäisen vuorokauden jälkeen alustalla ei ollut tyypillisiä pesäkkeitä.
CC-alustalla, johon ei ollut lisätty antibioottia, tyypillisinä kasvaneet pesäkkeet varmistettiin
oksidaasi-,
kaasunmuodostus-,
β-glukuronidaasi-
ja
indolitesteillä
sekä
tarvittaessa
gramvärjäyksellä (Pitkänen 2010).
Clostridium perfringens -bakteerin itiöt määritettiin standardiluonnoksen (ISO/DIS 14189)
ISO/CD 6461-2 mukaisesti Tryptoosi-sulfiitti-sykloseriini-agar-kasvualustalla (TSC, Oxoid,
Englanti)
anaerobisesti.
Suodatinkalvo
(GN-6
Metricel,
Pall
Corporation,
USA)
lämpökäsiteltiin lämpötilassa 60 ºC 15 minuutin ajan ennen alustalle asettamista. Sulfiittia
pelkistävät klostridit kasvavat TSC-kasvualustalla mustina pesäkkeinä ja pesäkkeistä
varmistettiin C. perfringens-bakteerit hapan-fosfataasitestillä.
Suolistoperäiset enterokokit määritettiin standardin SFS-EN ISO 7899-2 mukaisesti käyttäen
kalvosuodatusmenetelmää ja Slanetz & Bartley -kasvatusalustaa (Slanetz & Bartley Medium,
Oxoid, Englanti). Enterokokit kasvavat alustalla vaaleanpunaisista tummanpunaisiin väriltään
olevina pesäkkeinä. Kasvualustoja inkuboitiin lämpötilassa (36 ± 2) °C 40-48 tuntia.
Suolistoperäiset enterokokit varmistettiin siirtämällä kalvo sappi-eskuliini-atsidialustalle
(Scharlau, Espanja) ja katsomalla mahdollinen tumman värin muodostus alustassa lämpötilassa
44 ºC kahden tunnin kuluttua.
44
4.2.3 Virusten määritys vesinäytteistä
F-spesifiset ja somaattiset kolifagit määritettiin näytteen oletetun kolifagilukumäärän mukaan
joko kvantitatiivisella kaksikerros- tai yksikerrosmaljausmenetelmällä (US EPA 2001b) tai
kvalitatiivisella rikastusmenetelmällä (US EPA 2001a) Kolifagien isäntäbakteerit kasvatettiin
log-kasvuvaiheeseen kappaleen 4.2.1 mukaisesti. F-spesifisen kolifagin isäntäbakteeri oli E.
coli Famp (ATCC 700891) ja antibiotti ampisilliini/streptomysiini. Somaattisen kolifagin
isäntäbakteeri oli E. coli CN-13 (ATCC 700609) ja antibiootti nalidiksiinihappo.
Kaksikerrosmaljausmenetelmässä (US EPA 2001b) valettiin menetelmän nimen mukaisesti
kaksi kerrosta. Näytteistä tehtiin 1:10 laimennossarja TSB-liemeen haluttuun laimennokseen
asti. Ensimmäinen kerros valettiin maljoille sulatetusta 1,5 % tryptoni-soija-agarista (TSA,
Oxoid, Englanti), jonka oli annettu temperoitua lämpöhauteessa 46,5 ºC:ssa ennen kuin siihen
lisättiin 1 ml antibioottia 100 ml:aa kohden. Valamisen jälkeen maljojen annettiin jähmettyä,
minkä jälkeen niitä kuivattiin 15 minuuttia laminaarissa. 0,7 % TSA, joka oli sulatettu,
temperoitu 46,5 ºC:ssa ja johon oli lisätty 1 ml antibioottia 100 ml:aa agaria kohden, jaettiin
lämpöhauteessa temperoituneisiin koeputkiin siten, että agaria oli 5 ml per koeputki.
Maljausvaiheessa jokaiseen koeputkeen lisättiin 100 µl log-kasvuvaiheen isäntäbakteeria ja 500
µl näytettä tai sen laimennosta ja liuos valettiin 1,5 % TSA-maljalle. Maljojen annettiin
jähmettyä puoli tuntia, jonka jälkeen niitä inkuboitiin 36 ºC:ssa 16-24 h. Inkuboinnin jälkeen
maljoilta laskettiin muodostuneet plakit.
Yksikerrosvalumenetelmässä (US EPA 2001b) 100 ml:aan näytevettä lisättiin 0,5 ml
magnesiumkloridia (4 M MgCl2). Tämän jälkeen näytevettä pidettiin kahdeksan minuuttia
vesihauteessa 36 ºC:ssa, sitten siihen lisättiin 10 ml log-kasvuvaiheen isäntäbakteeria (E. coli
Famp F-spesifisille ja E. coli CN-13 somaattisille) ja pidettiin 5 min vesihauteessa 46,5 ºC:ssa.
Näytevesi sekoitettiin 100 ml:aan sulatettua ja lämpötilassa 46,5 ºC temperoitua kaksinkertaista
TSA:a, johon oli lisätty 2 ml sopivaa antibioottia (A/S tai nalidiksiinihappo). Sekoittamisen
jälkeen näytevesiagarliuos valettiin viidelle 14 cm halkaisijaltaan olevalle maljalle. Maljoja
inkuboitiin 16-24 tuntia lämpötilassa 36 ºC, minkä jälkeen maljoilta laskettiin muodostuneet
plakit.
45
Kaksivaiheisessa rikastusmenetelmässä (US EPA 2001a) 100 ml:aan näytevettä lisättiin 1,25
ml magnesiumkloridia, 0,5 ml log-vaiheen isäntäbakteeria, 5 ml kymmenkertaista tryptonisoijaliemeä (TSB) ja 1 ml antibioottia. Sekoituksen jälkeen näytettä inkubointiin 16-24 tuntia
lämpötilassa 36 ºC. 1000 ml:n näytetilavuudesta tehtävässä rikastuksessa näytteeseen lisättiin
kymmenkertainen määrä kaikkia reagensseja ja isäntäbakteeria. Inkuboinnin jälkeen näytettä
pipetoitiin 16 x 10 µl agarmaljalle, joka sisälsi antibioottia ja isäntäbakteeria, ja inkuboitiin 1624 tuntia lämpötilassa 36 ºC. Inkuboinnin jälkeen maljalta laskettiin, monenko pisaran kohdalle
16 pisarasta oli muodostunut plakki.
Norovirusten määrityksessä näyte konsentroitiin joko adsorptio-eluutiomenetelmällä tai PEGsaostuksella. Adsorptio-eluutiomenetelmässä vesinäyte suodatettiin positiivisesti varatun
nylonsuodattimen läpi, ja suodattimelta virukset eluoitiin glysiinilihauutepuskuriin, jonka pH
oli 9,5. Puskuri jatkokonsentroitiin pienempään tilavuuteen mikrokonsentraattorilla (Vivaspin
2, Vivascience AG, Saksa) (Gilgen ym. 1997). Ultrasuodatusmenetelmällä konsentroidun
näytteen jatkokonsentrointina testattiin adsorptio-eluutio-menelmän lisäksi PEG-saostusta,
jossa virukset saostuvat erilleen vedestä polyetyleeniglykolin ja sentrifugoinnin avulla (Lewis
ja Metcalf 1988). Konsentroidusta näytteestä eristettiin RNA käyttäen kaupallista kittiä (High
Pure Viral RNA, Roche Molecular Biochemicals, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaan.
Eristetty nukleiinihappo säilytettiin lämpötilassa -75 ºC tai alle. Norovirukset määritettiin
reaaliaikaisella käänteiskopiointi-polymeraasiketjureaktio -menetelmällä (real-time RT-PCR)
(Rotor-Gene 3000 RealTime Thermal Cycler, Qiagen). Noroviruksen genoryhmät GI ja GII
määritetään näytteestä erikseen. (Kauppinen ym. 2014)
Adenovirusten määritetystä varten näyte konsentroitiin adsorptio-eluutio-menetelmällä, jota
käytettiin norovirusten määrityksessä. Adsorptio-eluutio-menetelmällä konsentroidusta
näytteestä DNA eristettiin käyttäen kaupallista kiitiä (High Pure Viral Nucleic Acid Kit, Roche
Molecular Biochemicals, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaan. DNA säilytettiin -75 ºC:ssa tai
kylmemmässä. Adenovirukset määritettiin real-time PCR -menetelmällä (Rotor-Gene 3000
RealTime Thermal Cycler, Qiagen) (Kauppinen ym. 2012).
4.2.4 Heterotrofisen pesäkeluvun ja kokonaissolulukumäärän määritys
Heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärä määritettiin pintaviljelynä R2A-alustoilla (Difco,
Ranska) (Reasoner ja Geldreich 1985) käyttäen seitsemän vuorokauden kasvatusaikaa 22
46
°C:ssa. Kokonaissolulukumäärä määritettiin DAPI-värjäyksellä. Bakteerisolut värjättiin
fluoresoivalla DAPI-väriaineella (4’6-diamidino-2-phenylindole, Merck, Saksa) ja solut
laskettiin epifluoresenssi-mikroskoopilla (Olympus BX51, Olympus Optical, Japani)
(Timberley ja Pepper 2000). DAPI värjää kaikki näytteen nukleiinihapot huolimatta siitä,
ovatko ne peräisin näytteessä olevista elävistä vai kuolleista mikrobeista.
4.3
ULTRASUODATUSMENETELMÄN SAANTOKOKEET LABORATORIOOLOSUHTEISSA
4.3.1 Laboratoriokoeasetelmat
Koevetenä ensimmäisessä saantokokeessa (Koe I, Taulukko 3) käytettiin Kuopion kaupungin
talousvettä, joka valmistetaan pintavedestä tekopohjavesikäsittelyn, saostuksen, flotaation,
pikahiekkasuodatuksen ja ja klooridesinfioinin avulla (Kuopion Vesi 2009). Vedestä
neutraloitiin kloori lisäämällä näytteeseen 1 ml 18 mg/ml natriumtiosulfaattiliuosta yhtä
näytevesilitraa kohden. Muissa saantokokeissa (Kokeet II – VII, Taulukko 3) käytettiin
Kuopion Veden Melalahden vedenottamon pohjavettä. Vesi haettiin 30 litran kanistereissa
pohjavedenottamolta ennen koetta ja sitä säilytettiin 1-2 vuorokautta lämpötilassa 4 ºC. Vedestä
määritettiin absorbanssi spektrofotometrilla (UV-1601 Shimadzu, Japani, aallonpituus 254
nm), pH ja sähkönjohtokyky (Multi 3430, WTW, Saksa), sameus (Turb 555 IR, WTW, Saksa),
rauta
(DR2800
menetelmä
8008,
Hach,
USA)
heterotrofinen
pesäkeluku
ja
kokonaissolulukumäärä.
Ultrasuodatuslaitteisto desinfioitiin ja suodatinpatruuna esikäsiteltiin, kuten kappaleessa 4.1.2
on kuvattu. Suodatus tehtiin kappaleessa 4.1.3 kuvatulla tavalla. Näyte pumpattiin Ecolineletkupumpulla suoraan kanisterista. Taulukossa 3 on esitetty eri kokeissa testatut mikrobit,
näytetilavuudet ja mikrobien syöttötapa, testatut suodatukseen vaikuttavat parametrit ja
eluointimenetelmä. Kokeissa V, VI ja VII (Taulukko 3) näyteveteen lisättiin NaPP:a kappaleen
4.1.3 mukaisesti. Jokaisen kokeen alussa suodatettiin varsinaisen näytteen tilavuuden verran
samaa näytevettä ilman mikrobilisäystä ja konsentraatti otetiin talteen. Suodatinta ei huuhdottu
tämän jälkeen ennen varsinaisen näytteen suodatusta. Esisuodatuksella varmistettiin, ettei
laitteesta tule kontaminaatiota näytteeseen.
Taulukko 3. Saantokokeissa testatut mikrobit, näytetilavuudet, mikrobien jatkuva tai
pulssittainen syöttö, testatut suodatukseen vaikuttavat parametrit ja eluointimenetelmä.
47
Koe
Mikrobit
Näytetilavuus ja
mikrobien
syöttö
10 litraa
jatkuva
mikrobien
syöttö
I
MS2- ja
ΨX174kolifagit
II
E. coli
III
E. coli
IV
MS2- ja
ΨX174kolifagit
30 litraa,
jatkuva
mikrobien
syöttö
V,
VI,
VII
MS2- ja
ΨX174kolifagit,
E. coli
30 litraa,
jatkuva
mikrobien
syöttö
26 litraa,
mikrobien
syöttö 4,7
litran
pulssina
23 litraa,
mikrobien
syöttö 4,7
litran
pulssina
Testattavat asiat
Eluointimenetelmä
-Paineen vaikutus
suodatusnopeuteen
-Virtaus
suodattimella
alhaalta ylöspäin
-Virtaus
suodattimella
alhaalta ylöspäin
Eluentti kerran läpi filtraattipään ollessa
auki
-Filtraattiletkujen
määrä
-Suodattimen
asennon vaikutus
suodatusnopeuteen
Neljä eluointia:
1. Eluentti kerran läpi filtraattipäiden
ollessa auki.
2. 500 ml filtraattia kerran läpi
filtraattipäiden ollessa auki.
3. Eluentti kerran läpi filtraattipäiden
ollessa kiinni, suodatin pyörittäjälle 40
min, jonka jälkeen pumppaus tyhjäksi.
4. 200 ml eluointiliuosta läpi filtraattipäät
kiinni, suodatin pyörittäjällä tunnin, jonka
jälkeen 300 ml eluenttia läpi
Kaksi eluointia:
1. 200 ml eluenttia läpi, pumppu
pysäytettiin ja suodatinta käänneltiin,
minkä jälkeen 300 ml eluenttia läpi.
2. Kuten 4. eluointi kokeessa III
-Suodattimen
kääntely ja paineen
lasku 0,2 baariin
suodatuksen aikana
-Suodatin
vaakatasossa
-Paineiskut
-Suodattimen
kääntely ja paineen
lasku 0,2 baariin
suodatuksen aikana
-Virtaus
suodattimella
ylhäältä alaspäin
-NaPP-lisäys
näyteveteen
Eluentti kerran läpi filtraattipään ollessa
auki
Kolme eluointia:
1. Konsentraattiin sekoitettiin eluenttia 1:9
ja kierrätettiin laitteistossa 5 min
filtraattipäät kiinni. (Polaczyk ym. 2008)
2. 500 ml eluenttia kierrätettiin
filtraattipäät auki, kunnes tilavuus 300 ml.
3. Kuten 4. eluointi kokeessa III
E. coli -bakteeriliuos valmistettiin kappaleen 4.2.1 mukaisesti ja valmistettua liuosta
laimennettiin testiveteen siten, että sen absorbanssilukema aallonpituudella 420 nm oli 0,300 0,320. Tämä absorbanssilukema vastasi E. coli -lukumäärää noin 2 x 108 pmy/ml.
Laimennetusta liuoksesta tehtiin testiveteen vielä satakertainen laimennos, jota lisättiin
konsentroitavaan testivesitilavuuteen 1 ml eli tavoitelukumäärä oli noin 2 x 106 pmy. F-
48
spesifisten kolifagien (MS2) liuos valmistettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti. Liuoksen TSBliemeen laimennettua satakertaista laimennosta lisättiin 100 µl näyteveteen kokeissa I ja IVVII (Taulukko 3). Somaattiset kolifagit (ΨX174) lisättiin samalla tavalla, poikkeuksena kokeet
VI ja VII, joissa somaattisten kolifagien laimennosta lisättiin näyteveteen 1 ml eli kymmenen
kertaa suurempi lukumäärä kuin kokeissa I - V. Norovirusliuos valmistettiin kappaleen 4.2.2
mukaisesti ja sitä lisättiin 80 µl 30 litran testivesikanisteriin. Osassa kokeista mikrobit lisättiin
koko näytetilavuuteen, jolloin niiden syöttö ultrakonsentraattorille oli jatkuvaa. Osassa kokeista
30 litran kanisterista otettiin viisi litraa eri kanisteriin ennen mikrobien lisäystä. Mikrobit
lisättiin viiteen litraan, joka syötettiin pulssina konsentroinnin välissä, kun 10 litraa mikrobeilla
ymppäämätöntä näytevettä oli konsentroitu.
Kokeiden testimikrobit ja näyteveden luontaisesti sisältämät mikrobit
ymppäämättömästä
näytevedestä
ultrasuodatuslaitteistolle
ja
syötetystä
sen
ultrasuodatetusta
mikrobeilla
ympätystä
määritettiin
konsentraatista,
näytevedestä
ja
sen
ultrasuodatetusta konsentraatista, ultrasuodattimen eluointiliuoksista, joilla suodatin oli lopuksi
huuhdottu ja suodattuneesta vedestä eli filtraatista. Konsentraatti ja eluaatit jaettiin eri
mikrobien määritysmenetelmiin huomioiden eri menetelmiin liittyvät näytetilavuustarpeet. E.
coli -bakteeri ja koliformiset bakteerit määritettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti CC-alustalla
ilman antibioottia. Ymppäämätön näytevesi ja sen ultrasuodatettu konsentraatti ja suodattunut
vesi eli filtraatti analysoitiin vain kalvosuodatusmenetelmällä, koska niissä ei oletettu olevan
koliformisia
bakteereita.
F-spesifiset
kolifagit
ja
somaattiset
kolifagit
määritettiin
kaksikerrosmaljausmenetelmällä, joka on kuvattu kappaleessa 4.2.3. Norovirus määritettiin
kappaleen 4.2.3 mukaisesti PEG-saostusta käyttäen. Heterotrofinen pesäkeluku ja
kokonaissolulukumäärä määritettiin kappaleen 4.2.4 mukaisesti.
Saantokokeissa mikrobiympin syöttöä, suodatuksen kulkua ja eluointia muutettiin parhaimpien
suodatusolosuhteiden
mikrobisaanto
löytämiseksi.
mahdollisimman
Tavoitteena
hyvällä
oli
saada
suodatusnopeudella.
mahdollisemman
Kokeissa
suuri
seurattiin
suodatusnopeutta ja painetta. Suodatusnopeutta mitattiin sekuntikellon ja mittalasin avulla.
Ensimmäisessä kokeessa tutkittiin paineen vaikutusta virtaamaan muuttamalla painetta
kiristimellä. Lopuissa kokeista paine säädettiin noin 0,9 baariin. Pumpun nopeuden vaikutusta
paineeseen ja suodatusnopeuteen tutkittiin kokeissa I - III (Taulukko 3). Pumppausnopeus oli
noin 1700 – 2720 ml/min. Kokeissa IV - VII pumppu oli puoliteholla, jolloin pumppausvirtaus
oli noin 1700 ml/min. Eluointi tehtiin laitteistossa pumppaamalla 500 ml:a eluointiliuosta
49
suodatinkuitujen suuntaisesti suodatinpatruunan läpi ilman kiristimellä luotua painetta, ellei
toisin mainita. Koe V toistettiin kaksi kertaa (kokeet VI ja VII). Kokeessa VII mukana oli myös
norovirusten saantotestaus.
Keskimääräinen suodatusnopeus laskettiin jakamalla koko suodatettu näytetilavuus
suodatukseen kuluneella ajalla. Näytteiden mikrobilukumäärät laskettiin kertomalla määritetty
mikrobilukumäärä näytteen tilavuudella. Lisättyjen mikrobien saantoprosentti laskettiin
jakamalla konsentraatin mikrobilukumäärä ultrasuodatuslaitteistolle syötetyn testimikrobeja
sisältävän näytteen mikrobilukumäärällä ja kerrottiin sadalla. Eluointien saannot laskettiin
samalla tavalla. Heterotrofisen pesäkeluvun ja kokonaissolulukumäärän saannot laskettiin eri
tavalla kuin ympättyjen mikrobien saannot, koska näytevedet sisälsivät luonnostaan mikrobeja.
Mikrobilukumäärät laskettiin yhteen konsentroimattoman nollanäytteen tilavuudesta ja
varsinaisen näytteen tilavuudesta ja saadusta summasta vähennettiin konsentroidun
nollanäytteen mikrobilukumäärä. Näin saatiin suodatuslaitteistolle syötetty lukumäärä, jota
verrattiin ultrasuodatusmenetelmällä saatuun lukumäärään.
4.4
KOE PILOT-MITTAKAAVAN VESILAITOKSELLA
Ultrasuodatusmenetelmää testattiin pilot-mittakaavan vesilaitoksella. Pilot-laitoksen vesi
valmistettiin
pintavedestä,
joka
puhdistettiin
koagulaatio-,
flotaatio-
ja
pikahiekkasuodatusmenetelmillä, ja puhdistetun veden pH säädettiin kalkin avulla. Kokeen
aikana järjestelmän UV-desinfiointi oli pois päältä ja kloorin syöttö siirrettiin siten, että
desinfiointi tapahtui vasta ultrasuodatuslaitteiston näytteenottokohdan jälkeen.
E. coli -bakteeria ja F-spesifisiä kolifageja lisättiin järjestelmän veteen pikahiekkasuodattimen
jälkeen ennen pH:n säätöä. E. coli -bakteeriliuos valmistettiin kuten kappaleessa 4.2.1 on
kuvattu ja liuosta laimennettiin pilot-laitoksen veteen siten, että liuoksen absorbanssilukema
aallonpituudella 420 nm oli 0,300-0,320 (vastasi noin lukumäärää 2 x 108 pmy/ml).
Laimennetusta liuoksesta tehtiin laimennossarja ja tuhatkertaista laimennosta lisättiin 2,5 ml
viiteen litraan pilot-laitoksen vettä. F-spesifisiä kolifageja lisättiin käyttämällä samaa
fagiliuosta kuin saantokokeissa (ks. kappale 4.2.1). Liuoksesta tehtiin tuhatkertainen laimennos
TSB-liemeen ja tätä laimennosta lisättiin 1 ml samaan viiden litran kanisteriin, johon E. coli bakteeri oli lisätty. Sekoittamisen jälkeen viiden litran vesimäärä sekoitettiin 15 litraan pilotlaitoksen vettä, jolloin kokonaistilavuudeksi tuli 20 litraa.
50
Pilot-laitoksen tuottaman veden konsentrointi ultrasuodatusmenetelmällä ja mikrobien syöttö
pilot-laitosjärjestelmään
aloitettiin
samanaikaisesti.
Ultrasuodatuslaitteisto
otti
konsentroitavaksi osan pilot-laitoksen tuottamasta vedestä ja suurin osa vedestä kulki
ultrasuodatuslaitteiston ohi astiaan, jossa vesi desinfioitiin kloorilla ennen viemäriin
pumppausta. Mikrobeja syötettiin järjestelmään 20 tuntia. Näytteen ultrasuodatusta jatkettiin
neljä tuntia mikrobien syöttämisen lopetuksen jälkeen eli ultrasuodatus kesti yhteensä 24 tuntia.
Ultrasuodatus tehtiin kappaleen 4.1.3 mukaisesti. Näyte pumpattiin laitteiston pumpulla eikä
paineenalennusventtiiiliä käytetty. Näyteveteen ei lisätty NaPP:a. Paine säädettiin noin 0,9
baariin. Vesi virtasi 45 asteen kulmassa olevan suodatinpatruunan läpi ylhäältä alaspäin.
Suodatuksen jälkeen suodatinpatruuna huuhdottiin kaksi kertaa. Ensimmäisessä huuhtomisessa
konsentraatin tilavuus mitattiin ja siihen sekoitettiin konsentraattisäiliössä eluointiliuosta
suhteessa 1 osa eluointiliuosta ja 9 osaa konsentraattia. Konsentraattieluenttiliuosta kierrätettiin
laitteistossa kiristin auki suodattuneen veden ulostuloaukot kiinni viisi minuuttia nopeudella
50. (Polaczyk 2008) Viiden minuutin jälkeen pumpun nopeus laskettiin 20:een ja
konsentraattisäiliöstä liuosta imevä letku nostettiin pinnankorkeuden yläpuolelle, jolloin liuos
tyhjeni
letkuista
ja
osittain
suodatinpatruunasta
konsentraattisäiliöön.
Konsentraattieluaattiliuoksen tilavuus mitattiin ja se otettiin talteen näytepulloon. Toinen
huuhtominen
tehtiin
samalla
tavalla,
mutta
konsentraattieluaattiliuoksen
tilalle
konsentraattisäiliöön kaadettiin 500 ml:aa eluointiliuosta. Toisen huuhtomisen jälkeen
eluointiliuoksen
tilavuus
mitattiin
ja
se
kaadettiin
toiseen
näytepulloon.
Konsentraattieluaattiliuos ja 500 ml:n eluaattiliuos sekoitettiin yhteen ja jaettiin eri mikrobien
määritysmenetelmiin huomioiden eri menetelmiin liittyvät näytetilavuustarpeet.
Ultrasuodatuksen aikana otettiin osanäytteitä pulloihin pilot-laitoksen veteen syötetystä
mikrobiympistä, pilot-laitoksen vedestä ennen mikrobin syötön aloitusta, mikrobien syötön
aikana
kolmena
eri
ajankohtana
ja
mikrobien
syötön
loputtua
astiasta,
josta
ultrasuodatuslaitteisto pumppasi veden. Yksi näyte mikrobien syötön aikana otettiin myös
hanasta, joka oli välittömästi mikrobien syöttöpisteen jälkeen ennen pH:n säätöä. Näytteistä E.
coli -bakteeri määritettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti käyttäen CC-alustaa, johon oli lisätty
antibioottia. F-spesifiset kolifagit määritettiin kappaleen 4.2.3 mukaisesti 100 ml:n
kvantitatiivisella menetelmällä.
51
4.5
ULTRASUODATUSMENETELMÄN TESTAUS KENTTÄOLOSUHTEISSA
Ultrasuodatusta kokeiltiin myös kenttäolosuhteissa, jolloin testattiin sitä miten järjestelmä
toimii todellisissa tilanteissa ja miten sen avulla kyetään havaitsemaan talousvedessä
mahdollisesti pieninä pitoisuuksina olevat mikrobit. Testauksessa näyteveteen ei lisätty
mikrobeja. Ultrasuodatuskokeita tehtiin pohjavedellä, esikäsitellyllä pintavedellä
ja
verkostovedellä. Ultrasuodatuslaitteisto desinfioitiin ja suodatin esikäsiteltiin, kuten on kuvattu
kappaleessa 4.1.2. Poikkeuksena verkostovesinäyte, jonka kohdalla suodatinpatruuna oli
esikäsittelyvaiheessa pyörittäjällä vain kolme tuntia. Laboratoriossa tehdyn esikäsittelyn ja
suodatuksen aloituksen välillä kului yli tunti aikaa välimatkojen vuoksi. Suodatin huuhdottiin
kentällä steriilillä vedellä Ecoline-letkupumpulla puoliteholla ennen suodatuksen aloitusta
korkeintaan yhdeksän tuntia esikäsittelyn jälkeen. Suodatus ja suodatinpatruunan huuhtelu
suodatuksen lopuksi tehtiin samalla tavalla kuin Pilot-mittakaavan vesilaitoksella. Suodatus on
kuvattu kappaleessa 4.1.3 ja suodatinpatruunan huuhtelu kappaleessa 4.4. Kokeiden
ultrasuodatusmenetelmällä kerättyjen näytteiden tilavuudet, suodatusajat, mahdollinen NaPPlisäys ja määritetyt mikrobit on esitetty Taulukossa 4.
Konsentraattieluaattiliuos jaettiin tasaisesti eri mikrobien määritysmenetelmiin huomioiden eri
menetelmiin liittyvät näytetilavuustarpeet. Näytevettä otettiin ultrasuodatuksen lisäksi
kanistereihin. Mikrobit määritettiin kanistereista ja ultrasuodatetusta näytteestä kappaleessa 4.2
kuvatuilla menetelmillä ja kanisterinäytteiden tuloksia verrattiin ultrasuodatusmenetelmällä
otettujen näytteiden tuloksiin. Bakteerit määritettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti. Esikäsitellystä
vedestä (Kokeet 1 ja 2, Taulukko 4) E. coli -bakteeri ja koliformiset bakteerit määritettiin
käyttäen CC-kasvualustoja sekä antibiootin kanssa että ilman, sekä suodattamalla ja
pintalevitysmenetelmällä.
määritettiin
vain
Muissa kokeissa E. coli -bakteeri ja koliformiset bakteerit
kalvosuodatusmenetelmällä
CC-alustalla
ilman
antibiottia.
Kalvosuodatusmenetelmällä kanisterinäytteistä pyrittiin suodattamaan mahdollisimman suuri
useiden litrojen näytetilavuus bakteerien havaitsemiseksi. Kanisterinäytteiden koliformisia
bakteereita
määritettäessä
myös
pienempiä
tilavuuksia
suodatettiin
kalvosuodatusmenetelmällä. F-spesifiset kolifagit määritettiin 100 ml:n kvantitatiivisella
menetelmällä, joka on kuvattu kappaleessa 4.2.3. Lisäksi kolifageja määritettiin kanisteriin
otetuista näytteistä kaksivaiheisella rikastusmenetelmällä, kuten on kuvattu kappaleessa 4.2.3.
Noro- ja adenovirukset määritettiin kuten kappaleessa 4.2.3 on kuvattu. Näytteiden
konsentrointimenetelmänä käytettiin adsorptio-eluutio-menetelmää. Esikäsitellyn pohjaveden
52
ultrasuodatusnäytteestä (Koe 4, Taulukko 4) tehtiin myös erikseen jatkokonsentrointi PEGsaostuksella.
Taulukko 4. Kenttäkokeiden suodatustavoite, natriumpolyfosfaatti (NaPP) -lisäys ja vedestä
määritetyt mikrobit.
Näytevesi
1 Esikäsitelty
pintavesi
2 Esikäsitelty
pintavesi
3 Käsittelemätön
pohjavesi
4 Esikäsitelty
pohjavesi
Tavoite
Yön yli
suodatus
NaPP-lisäys
Syöttö ennen
letkupumppua
Yön yli
suodatus
Syöttö
letkupumpun
jälkeen
Yön yli
suodatus
Ei lisätty
veteen
Yön yli
suodatus
Syöttö
letkupumpun
jälkeen
Suuren
Ei lisätty
tilavuuden
veteen
suodatus
vesiepidemia
-tilanteessa
5 Saastunut
verkostovesi
Tutkitut mikrobit
E. coli, koliformiset bakteerit,
C. perfringen, norovirus, adenovirus,
kolifagit, heterotrofinen pesäkeluku,
kokonaissolulukumäärä
E. coli, koliformiset bakteerit,
C. perfringen, adenovirus, kolifagit,
heterotrofinen pesäkeluku,
kokonaissolulukumäärä
E. coli, koliformiset bakteerit,
kolifagit, heterotrofinen pesäkeluku,
kokonaissolulukumäärä
E. coli, koliformiset bakteerit,
suolistoperäiset enterokokit,
C. perfringen, norovirus, kolifagit
heterotrofinen pesäkeluku,
kokonaissolulukumäärä
E. coli, koliformiset bakteerit,
norovirus, kolifagit
4.5.1 Testaus esikäsitellyllä pintavedellä
Esikäsitellyn
pintaveden
suodatusta
testattiin
Turun
Seudun
Veden
raakaveden
esikäsittelylaitoksella. Testivesi oli esikäsiteltyä jokivettä. Veden esikäsittely koostui
rumpusuotimilla siivilöinnistä ja kemiallisesta saostuksesta yhdistettynä kontaktisuodatukseen
hiekkasuotimissa.
Näyte
otettiin
paineellisesta
hanasta,
jolloin
käytettiin
paineenalennusventtiiliä. Kokeessa 1 hanan ja paineenalennusventtiilin välissä oli kiristimillä
kiinnitetty muoviletku ja kokeessa 2 korkeaa painetta kestävä letku kiinnitettiin hanaan ja
paineenalennusventtiiliin kierreliittimillä. NaPP-liuoksen syöttöletku oli kokeessa 1 liitetty
ultrasuodatuslaitteiston letkuun ennen letkupumppua ja kokeessa 2 pumpun jälkeen, kuten
kerrottu kappaleessa 4.1.3.
53
4.5.2 Testaukset pohjavedenottamoilla
Käsittelemättömän
pohjaveden
suodatusta
testattiin
Kuopion
Veden
Melalahden
harjupohjavedenottamolla. Ultrauodatuksessa näyte otettiin hanasta, jossa paine oli alle 1,2
baaria. Kokeessa käytettiin paineenalennusventtiiliä. Toinen suodatus tehtiin Siilinjärven
Koivuniemen harjupohjavedenottamolla. Harjupohjavedestä oli hiekkasuodatusmenetelmällä
poistettu
rautaa
ja
mangaania.
Näyte
otettiin
paineettomasta
hanasta
ilman
paineenalennusventtiiliä.
4.5.3 Testaus verkostovedellä vesiepidemiatilanteessa
Verkostovesinäyte suodatettiin tilanteessa, jossa verkostoveden epäiltiin saastuneen ja
aiheuttaneen epidemian Siilinjärven Vuorelassa (Jalava ym. 2014). Vuorelaan vesi tulee
Jälänniemen vedenottamolta. Verkostovettä laskettiin hanasta väliastiaan, josta se pumpattiin
ultrasuodatuslaitteistoon. Näytevettä suodatettiin vain vajaan viiden tunnin ajan, koska laitetta
ei voitu jättää näytteenottotilaan valvomatta. Näytteenottohetkellä oli myös alkamassa
verkostoveden tehostettu klooridesinifointi, joka olisi voinut haitata mikrobien havaitsemista,
mikäli näytteen keräämistä olisi jatkettu pidempään. Konsentraattiin lisättiin laboratoriossa
natriumtiosulfaattia (katso 4.3.1) veden mahdollisesti sisältämän kloorin neutraloimiseksi.
54
5
TULOKSET
5.1 SUODATUSNOPEUDEN TESTAUS LABORATORIO-OLOSUHTEISSA
Saantokokeissa II-VII (Taulukko 3) käytetyn pohjaveden fysikaaliset ja kemialliset
ominaisuudet sekä heterotrofinen pesäkeluku ja kokonaismikrobilukumäärä on esitetty
Taulukossa 5.
Taulukko 5. Saantokokeissa käytetyn pohjaveden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ja
heterotrofinen pesäkeluku ja kokonaissolulukumäärä.
SähkönSameus pH
Abs.
Rauta HeteroKokonaissolujohtokyky
(NTU)
254nm
(mg/l)
(µS/cm)
trofiset
lukumäärä
mikrobit
(solua/ml)
(pmy/ml)
Keskiarvo
Vaihteluväli
Mittausten
lukumäärä
107
101 - 112
4
0,03
6,6
0,023
0,03
0,01-
6,2-
0,0167-
0,01-
0,10
7,4
0,0273
0,07
5
5
4
4
660
40- 1840
5
21 000
6 10041 000
5
Laboratoriossa tehdyssä kokeessa I painetta ja suodatusnopeutta vaihdeltiin siten, että ne olivat
korkeintaan 0,9 baaria ja 800 ml/min. Muissa kokeissa paine vaihteli välillä 0,7–1,2 baaria ja
mitattu suodatusnopeus välillä 660–1200 ml/min. Taulukossa 6 on esitetty jokaisen kokeen
suodatustilavuus ja -aika ja keskimääräinen ja mitattu suodatusnopeus. Suodatusnopeus ja paine
vaihtelivat suodatuksen aikana joka kokeessa. Kokeiden laskennallinen suodatusnopeus eli
suodatetun näytteen tilavuus jaettuna kokonaissuodatusajalla vaihteli välillä 510–770 ml/min.
Vesi suodattui sitä nopeammin, mitä korkeampi paine oli. Paine muuttui suodatuksen eri
vaiheissa siten, että se kävi korkealla, kun laitteisto vaihtoi vedenoton konsentraattiastiasta
konsentroimattoman veden ottoon tai toisin päin. Silloin myös veteen sekoittui ilmaa. Kun laite
otti uutta näytevettä, paine oli alhaisempi ja nousi, kun laite alkoi kierrättää konsentroitua vettä.
Kiristimellä aiheutettu paine nousi, kun pumppausnopeutta nostettiin. Painetta ei voinut tarkasti
säätää yhteen lukuun. 0,5 baarin paineen nousu saattoi lähes kaksinkertaistaa suodatusnopeuden
660:sta 1200:aan ml/min. Pumppausnopeutta voitiin vaihtaa suodatusnopeuden muuttumatta,
kun paine pidettiin kiristimen avulla vakiona. Vesi ei suodattunut suodattimen läpi ilman
55
kiristimellä luotua painetta, kun pumppu pumppasi puoliteholla eli valmistajan mukaan noin
1700 ml/min.
Taulukko 6. Saantokokeiden näytetilavuudet, suodatusajat ja laskennalliset ja mitatut
suodatusnopeudet.
Näytetilavuu
Laskennallinen
Suodatusaika
Mitattu suodatusnopeus
Koe
s
suodatusnopeus
(min)
(ml/min)
(litraa)
(ml/min)
I
10,0
Ei tietoa
Ei voi laskea
240-800
II
30,4
47
550
1200
III
27,8
45
510
860
IV
30,0
49
610
660
V
30,1
54
560
750-1050
VI
30,4
40
750
930
VII
30,0
39
770
960-990
5.2
SAANTOKOKEET
Saantokokeissa
selvitettiin
eri
ultrasuodatus-
ja
eluointimenetelmien
vaikutusta
mikrobisaantoihin. Koe V toistettiin kaksi kertaa (Kokeet VI ja VII, Taulukko 3, kappale 4.3.1)
koetuloksen uusittavuuden testaamiseksi. Konsentraatin tilavuus oli 280-350 ml ja eluoinnista
saadun liuoksen tilavuus 500 ml lukuunottamatta kokeiden V-VII ensimmäistä eluointia, jossa
käytettiin konsentraattieluenttiliuosta huuhteluun, ja toista eluointia, jossa eluentin tilavuus
laski suodattumalla 300 ml:aan (Taulukko 3). Ultrasuodatuslaitteiston puhdistuskäsittelyjen
toimivuus testattiin suodattamalla sillä kokeen aluksi mikrobeilla ymppäämätöntä testivettä,
josta ei todettu kokeissa tutkittuja mikrobeja. Klooriliuoksen huuhtelun riittävyyden
testaamiseksi huuhteluvedestä mitattiin kerran klooripitoisuus, joka oli sidotun kloorin osalta
0,04 mg/l ja vapaan kloorin osalta 0,00 mg/l.
Taulukossa 7 on saantokokeissa veteen lisättyjen mikrobien lukumäärät, havaitut
mikrobilukumäärät konsentraatissa, ensimmäisessä ja toisessa eluoinnissa ja eluointien
jälkeiset saannot. R2A ja DAPI -menetelmillä määritetyt kokonaismikrobilukumäärät sisältävät
testivedessä luonnostaan olleet ja lisätyt bakteerit.
Kokeissa I-IV (Taulukko 7), joissa
konsentraatin ja ensimmäisen eluoinnin mikrobilukumäärät määritettiin erikseen, useimpien
saantotulosten kohdalla eluoinnin saanto oli suurempi kuin konsentraatin. Kaikissa kokeissa
yhden eluoinnin jälkeen E. coli -bakteerin saanto oli 10-71 %, F-spesifisten kolifagien saanto
14-19 % ja somaattisten kolifagien saanto 16-42 %, ja yhdessä kokeessa norovirukselle saanto
56
oli 5 % (Taulukko 7). R2A-menetelmän heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärän saanto oli
8-68 % ja DAPI-menetelmän kokonaissolulukumäärän saanto 8-84 %. Toinen ja kolmas
eluointi lisäsi E. coli -bakteerin saantoa 9-15 %, F-spesifisten kolifagien saantoa 3-25 % ja
somaattisten kolifagien saantoa 4-9 %. Kerran testattu neljäs eluointi (Koe III, Taulukko 3)
lisäsi E. coli -bakteerin saantoa 18 %. Noroviruksen osalta kokonaissaanto kahden eluoinnin
jälkeen oli vain 5 %, mutta kolmannen eluoinnin jälkeen 24 %. Kuvassa 4 on kolmen toistetun
kokeen saannot esitetty erikseen eri eluointikerroilta. R2A ja DAPI -menetelmien
saantotulokset vaihtelivat suhteessa E. coli -bakteerin ja kolifagien saantotuloksiin. Osassa
kokeista niiden saanto on parempi ja osassa huonompi kuin E. coli -bakteerin ja kolifagien
saanto.
100
90
80
Saanto (%)
70
3. eluointi
60
2. eluointi
50
Konsentraatti
+ 1. eluointi
40
30
20
10
0
V VI VII
E. coli
V VI VII
MS2
VII
V VI VII
Norovirus
ѰX174
Kuva 4. E. coli -bakteerin, F-spesifisten kolifagien (MS2), somaattisten kolifagien (ΨX174) ja
norovirusten saannot prosentteina konsentraatista ja ensimmäisestä eluoinnista yhteensä,
toisesta eluoinnista ja kolmannesta eluoinnista kolmessa toistetussa kokeessa.
57
Taulukko 7. E. coli -bakteerin, F-spesifisten kolifagien (MS2), somaattisten kolifagien
(ΨX174), norovirusten, heterotrofisen pesäkeluvun (R2A) ja kokonaissolulukumäärän (DAPI)
saannot konsentraatista (kons.), ensimmäisestä ja toisesta eluoinnista.
Mikrobilukumäärä (pmy/pfu/GC)
Kons.+1. Kons.+1.
Kons. + Kons. +
Mikrobit Lisätty
1.
eluointi eluointi 2.
eluoinnit eluoinnit
kokeittain veteen* Kons.
eluointi yhteensä yht. (%) eluointi yhteensä yht. (%)
I
1,1E+06 2,6E+04 1,6E+04 4,2E+04
4
Ei tehty
MS2
8,2E+04 3,4E+03 2,4E+04 2,8E+04
34
Ei tehty
ΨX174
3,8E+06 8,8E+05 1,0E+06 1,9E+06
49
Ei tehty
R2A
II
1,2E+06 9,3E+04 2,9E+04 1,2E+05
10
Ei tehty
E. coli
5,0E+07 2,7E+07 6,8E+06 3,4E+07
68
Ei tehty
R2A
1,9E+09 2,2E+08 1,7E+08 3,9E+08
20
Ei tehty
DAPI
III
1,4E+06 1,2E+05 1,7E+05 2,8E+05
20
1,3E+05 4,2E+05
30
E. coli
8,7E+07 3,3E+06 3,4E+06 6,7E+06
8
6,0E+06 1,3E+07
15
R2A
4,7E+08 1,3E+07 1,6E+08 1,8E+08
37
1,4E+08 3,2E+08
67
DAPI
IV
1,4E+07 4,7E+05 1,6E+06 2,1E+06
16
3,5E+06 5,6E+06
41
MS2
1,2E+05 1,8E+04 3,2E+04 5,0E+04
42
1,1E+04 6,0E+04
50
ΨX174
2,1E+06 3,3E+05 2,1E+05 5,3E+05
26
1,2E+05 6,6E+05
31
R2A
6,6E+08 7,3E+07 1,8E+08 2,5E+08
38
5,0E+08 7,6E+08
>100
DAPI
V
9,3E+05
6,7E+05
6,7E+05
71
1,3E+05 7,9E+05
85
E. coli
4,4E+07
8,1E+06
8,1E+06
19
1,7E+06 9,8E+06
22
MS2
2,4E+05
4,0E+04
4,0E+04
16
8,4E+03 4,8E+04
20
ΨX174
6,8E+06
2,5E+06
2,5E+06
37
4,0E+05 2,9E+06
43
R2A
3,2E+08
2,7E+08
2,7E+08
84
1,6E+09 1,9E+09
>100
DAPI
VI
1,4E+06
3,5E+05
3,5E+05
26
1,4E+05 4,9E+05
36
E. coli
3,5E+07
4,1E+06
4,1E+06
12
1,8E+06 5,9E+06
17
MS2
1,2E+06
2,3E+05
2,3E+05
19
9,0E+04 3,2E+05
27
ΨX174
9,4E+06
1,7E+06
1,7E+06
18
4,6E+05 2,2E+06
23
R2A
2,4E+09
1,9E+08
1,9E+08
8
1,9E+08 3,8E+08
16
DAPI
VII
1,0E+06
4,0E+05
4,0E+05
39
1,5E+05 5,5E+05
54
E. coli
4,7E+07
5,7E+06
5,7E+06
12
1,5E+06 7,2E+06
15
MS2
1,2E+06
2,0E+05
2,0E+05
16
6,0E+04 2,6E+05
20
ΨX174
6,6E+06
6,6E+06
5
6,6E+05 7,3E+06
5
Norovirus 1,4E+08
1,1E+07
1,6E+06
1,6E+06
15
5,7E+05 2,1E+06
20
R2A
2,5E+09
2,2E+08
2,2E+08
9
1,9E+08 4,0E+08
16
DAPI
*R2A ja DAPI; kokonaismikrobilukumäärät sisältäen testiveden luontaiset ja lisätyt bakteerit.
58
5.3
KOE PILOT-MITTAKAAVAN VESILAITOKSELLA
Kokeessa pilot-mittakaavan laitoksella suodatettiin 24 tunnin aikana 1436 litraa vettä. Paine oli
0,9–1,1 baaria ja keskimääräinen suodatusnopeus 997 ml/min. Nopeus vaihteli välillä 800-1200
ml/min. Pilot-laitos tuotti vettä 22 650 litraa eli ultrasuodatuksen näytemäärä oli noin 6 %
vuorokauden aikana tuotetusta kokonaisvesimäärästä. Pilot-laitosjärjestelmään syötetyn 20
litran mikrobiliuoksen E. coli -bakteerien lukumäärä oli 14 000 pmy/l ja F-spesifisten kolifagien
374 000 pfu/l. Mikrobeilla ympätyn pilot-laitoksen veden mikrobilukumääriä tutkittiin
ultrasuodatusmenetelmällä ja pulloon otetuista näytteistä ilman ultrasuodatusta. Pulloihin
näytteitä otettiin ultrasuodatuksen ja mikrobien syötön aikana kolmena eri ajankohtana, jolloin
vedessä oli E. coli -bakteereita 7 pmy/l, 5 pmy/l ja 3 pmy/l ja kolifageja 200 pfu/l, 190 pfu/l ja
270 pfu/l. Mikrobien syöttökohdan jälkeen olleessa näytteenottopisteessa E. coli -bakteerien
lukumäärä oli 4 pmy/l ja kolifagien lukumäärä 40 pfu/l hetkellä, jolloin mikrobien syöttö
lopetettiin. Ultrasuodatuksen konsentraatin ja eluentin yhteistilavuus oli 845 ml ja sen E. coli bakteerien lukumäärä oli 220 pmy, joka litraa kohden laskettuna on 260 pmy/l. Konsentraatin
F-spesifisten kolifagien lukumäärä konsentraatissa oli 21 000 pfu ja litraa kohden laskettuna
25 000 pfu/l.
Suodatinpatruuna värjäytyi konsentroinnin aikana oranssin ruskeaksi ja
konsentraatin sameus oli 11 NTU. Pilot-laitoksen veden sameus ei ole tiedossa. Veden
rautapitoisuus oli 0,06 mg/l ja konsentraatin 5,10 mg/l.
5.4
KENTTÄKOKEET
Kenttäkokeissa testattiin laitteen toimivuutta kenttäolosuhteissa, näyteveden suodatusnopeutta,
suolistoperäisten mikrobien esiintymistä vesissä ja mikrobisaantoja verrattuna laboratoriossa
käytettyihin rutiinimenetelmiin suuresta tilavuudesta. Taulukossa 9 on kokeiden näytevesien
fysikaaliskemialliset ominaisuudet. Taulukossa 10 on kokeiden suodatustilavuudet, -ajat,
niiden mukaan lasketut suodatusnopeudet ja natriumpolyfosfaatin lisäykset. Laitteella saatiin
suodatettua yli tuhat litraa alle vuorokaudessa. Laitteisto konsentroi veden ilman valvontaa
automaattisesti käynnistyksen jälkeen. Kenttäkokeessa 1 (Taulukko 10) esikäsitellyn veden
suodatuksen nopeutta ei voi laskea, koska näytevettä ottava letku rikkoutui liian kovan paineen
vuoksi, eikä rikkoutumisaikaa tiedetä. Letku korvattiin painetta kestävällä letkulla toista
suodatusta varten. Keskimääräinen suodatusnopeus 570 ml/min oli pienin kokeessa 4
esikäsitellyn pohjaveden suodatuksessa (Taulukko 10). Kolmessa muussa kokeessa (Kokeet 35, Taulukko 10) keskimääräinen suodatusnopeus oli 780-850 ml/min.
59
NaPP:n syöttö oli hieman alle tavoitellun 0,01 % (w/v) kokeissa 1, 2 ja 4 (Taulukko 10), joissa
sitä syötettiin näyteveteen. Esikäsitellyn veden ensimmäisessä kokeessa (Koe 1, Taulukko 10)
tasainen pumppaus ei onnistunut, koska letkupumppu häiritsi sen edellä olevan NaPP:n
annostelupumpun toimintaa. Myöhemmissä kokeissa annostelupumppu liitettiin laitteistoon
virtaussuunnassa letkupumpun jälkeen.
Taulukko 9. Kenttäkokeiden näytevesien fysikaalis-kemialliset ominaisuudet.
Näytevesi
1 Esikäsitelty
pintavesi
2 Esikäsitelty
pintavesi
3 Käsittelemätön
pohjavesi
4 Esikäsitelty
pohjavesi
5 Saastunut
verkostovesi
Sähkönjohtokyky
Sameus
(µS/cm)
(NTU)
pH
Abs
Rauta
254 nm
(mg/l)
84,4
0,15
6,3
0,484
0,01
81,0
0,11
6,8
0,480
0,01
108,8
0,01
6,3
0,025
Ei tiedossa
382
0,01
8,2
Ei tiedossa
0,02
Ei tiedossa
0,09
Ei tiedossa
0,115
Ei tiedossa
Taulukko 10. Kenttäkokeiden suodatustilavuudet, -ajat, laskennalliset suodatusnopeudet ja
natriumpolyfosfaatti (NaPP) -lisäys.
Näytevesi
Suodatustilavuus
Suodatusaika
(litraa)
1 Esikäsitelty
pintavesi
2 Esikäsitelty
pintavesi
3 Käsittelemätön
pohjavesi
4 Esikäsitelty
pohjavesi
5 Saastunut
verkostovesi
Suodatusnopeus
NaPP-lisäys
(ml/min)
329
Ei tiedossa
Ei tiedossa
0,04 %, syöttö
epätasainen
1070
21 h
850
0,009 %
988
21 h 5 min
780
Ei lisätty
807
23 h 44 min
570
0,005 %
236
4 h 55 min
800
Ei lisätty
Taulukoissa 11, 12 ja 13 on kenttäkokeiden mikrobitulokset. E. coli -bakteeria todettiin
molemmilla esikäsitellyn veden näytteenottokerroilla vain ultrasuodatusmenetelmällä (Kokeet
1 ja 2, Taulukko 11). Pohjavesistä (Kokeet 3 ja 4, Taulukko 11) E. coli -bakteeria ei todettu ja
saastuneesta verkostovedestä (Koe 5, Taulukko 11) E. coli -bakteereita todettiin samanlaiset
lukumäärät
perinteisellä
näytteenottomenetelmällä
ja
ultrasuodatusmenetelmällä.
60
Koliformisten bakteerien tulosten osalta näytteenottomenetelmien välillä ei ollut suurta eroa
(Taulukko 11). Koliformisia bakteereita todettiin esikäsitellystä vedestä ja saastuneesta
verkostovedestä, mutta ei pohjavesistä. C. perfringens -bakteerin itiöitä todettiin esikäsitellystä
vedestä
pieniä
lukumääriä
perinteisellä
näytteenottomenetelmällä,
mutta
ei
ultrasuodatusmenetelmällä (Kokeet 1 ja 2, Taulukko 11). Pohjavesistä ja verkostovedestä C.
perfringens -bakteerin itiöitä ei määritetty lukuun ottamatta esikäsitellyn pohjaveden
perinteisellä menetelmällä otettua näytettä, josta itiöitä ei todettu (Taulukko 11).
Esikäsitellystä vedestä eikä käsittelemättömästä pohjavedestä todettu F-spesifisiä kolifageja
(Kokeet 1-3, Taulukko 12). Esikäsitellystä pohjavedestä F-spesifisiä kolifageja todettiin litrasta
perinteisellä näytteenotto- ja määritysmenetelmällä, mutta ultrasuodatusmenetelmällä Fspesifisiä kolifageja ei todettu näytteestä (Koe 4, Taulukko 12). Saastuneesta verkostovedestä
F-spesifiset kolifagit määritettiin vain ultrasuodatusmenetelmällä ja niitä todettiin (Koe 5,
Taulukko 12). Somaattisia kolifageja todettiin esikäsitellyn pintaveden näytteenottokerroilla
molemmilla menetelmillä (Kokeet 1 ja 2, Taulukko 12). Muista näytevesistä somaattisia
kolifageja
ei
todettu.
Saastuneesta
verkostovedestä
ne
määritettiin
vain
ultrasuodatusmenetelmällä. Taudinaiheuttajaviruksia eli noro- ja adenoviruksia ei todettu
esikäsitellystä pintavedestä eikä esikäsitellystä pohjavedestä kummallakaan näytteenotto ja
konsentrointitavoilla. Käsittelemättömästä pohjavedestä viruksia ei määritetty. Saastuneesta
verkostovedestä ei todettu norovirusta. Ultrasuodatusmenetelmällä otettujen ja konsentroitujen
näytevesien heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärät olivat vain 2-10 % kanisteriin
otettujen näytevesien lukumääristä (Taulukko 13).
Kokonaissolulukumäärät olivat
ultrasuodatusmenetelmällä määritettyinä 18-55 % kanisterinäytteenoton lukumääristä.
Saastuneesta verkostovedestä heterotrofista pesäkelukua ja kokonaissolulukumäärää ei
määritetty (Koe 5, Taulukko 13).
61
Taulukko 11. Indikaattoribakteeritulokset perinteisellä näytteenotto- ja määritysmenetelmällä
ja ultrasuodatusmenetelmällä.
E. coli
Perinteinen menetelmä
Ultrasuodatusmenetelmä
1 Esikäsitelty pintavesi
Ei todettu
/5 110 ml
9 pmy
/ 10 000 ml
2 Esikäsitelty pintavesi
Ei todettu
/5 110 ml 9 pmyA
/ 10 000 ml
Ei todettu
/5 000 ml Ei todettu
/ 161 000 ml
3 Käsittelemätön pohjavesi
Ei todettu
/5 110 ml Ei todettu
/ 95 000 ml
4 Esikäsitelty pohjavesi
B
3 pmy
/100 ml
4 pmy
/ 100 ml
5 Saastunut verkostovesi
Koliformiset bakteerit
1 Esikäsitelty pintavesi
2 Esikäsitelty pintavesi
3 Käsittelemätön pohjavesi
4 Esikäsitelty pohjavesi
5 Saastunut verkostovesi
C. perfringens, itiöt
1 Esikäsitelty pintavesi
2 Esikäsitelty pintavesi
Perinteinen menetelmä
Ultrasuodatusmenetelmä
7 pmy
/100 ml
2 pmy
/ 100 ml
360 pmy
/100 ml 549 pmy
/ 100 ml
Ei todettu
/5 000 ml Ei todettu
/ 161 000 ml
Ei todettu
/5 110 ml Ei todettu
/ 95 000 ml
B
20 pmy
/100 ml
6 pmy
/ 100 ml
Perinteinen menetelmä
Ultrasuodatusmenetelmä
4 pmy
/10 000 ml Ei todettu
/ 25 600 ml
A
1 pmy
/10 000 ml Ei todettu
/ 112 000 ml
Ei määritetty
Ei määritetty
3 Käsittelemätön pohjavesi
Ei todettu
/1 000 ml
Ei määritetty
4 Esikäsitelty pohjavesi
Ei määritetty
Ei määritetty
5 Saastunut verkostovesi
A = Tulos arvio, koska lukumäärä alle luotettavan pesäkelaskennan rajan.
B = Tulos saatu Colilert-määritysmenetelmällä toisessa tutkimuslaboratoriossa (Jalava ym.
2014).
Taulukko 12. Kenttäkokeiden kolifagitulokset perinteisellä näytteenotto- ja
määritysmenetelmällä ja ultrasuodatusmenetelmällä.
F-spesifiset kolifagit
Perinteinen menetelmä
Ultrasuodatusmenetelmä
1 Esikäsitelty pintavesi
Ei todettu
/1 000 ml Ei todettu
/ 30 700 ml
2 Esikäsitelty pintavesi
Ei todettu
/1 000 ml Ei todettu
/ 113 000 ml
Ei todettu
/1 000 ml Ei todettu
/ 163 000 ml
3 Käsittelemätön pohjavesi
Todettiin
/1 000 ml Ei todettu
/ 86 000 ml
4 Esikäsitelty pohjavesi
Ei määritetty
2 pmy
/ 25 600 ml
5 Saastunut verkostovesi
Somaattiset kolifagit
1 Esikäsitelty pintavesi
2 Esikäsitelty pintavesi
3 Käsittelemätön pohjavesi
4 Esikäsitelty pohjavesi
5 Saastunut verkostovesi
Perinteinen menetelmä
Ultrasuodatusmenetelmä
Todettiin
/100 ml 0,5 pmy
/ 100 ml
Todettiin
/100 ml 0,05 pmy
/ 100 ml
Ei todettu
/1 000 ml Ei todettu
/ 163 000 ml
Ei todettu
/1 000 ml Ei todettu
/ 86 000 ml
Ei määritetty
Ei todettu
/ 26 500 ml
62
Taulukko 13. Pesäkelaskennan tulokset ja kokonaissolulukumäärä perinteisellä näytteenotto- ja
määritysmenetelmällä ja ultrasuodatusmenetelmällä.
Heterotrofinen pesäkeluku
Perinteinen menetelmä
Ultrasuodatusmenetelmä
1 Esikäsitelty pintavesi
4 600 pmy
/ ml 230 pmy
/ ml
A
2 Esikäsitelty pintavesi
7 400 pmy
/ ml 170 pmy
/ ml
20 pmy
/ ml
1 pmy
/ ml
3 Käsittelemätön pohjavesi
40 pmy
/ ml
4 pmy
/ ml
4 Esikäsitelty pohjavesi
Ei määritetty
Ei määritetty
5 Saastunut verkostovesi
Kokonaissolulukumäärä
Perinteinen menetelmä
Ultrasuodatusmenetelmä
1 Esikäsitelty pintavesi
290 000
/ ml 160 000
/ ml
2 Esikäsitelty pintavesi
680 000
/ ml 120 000
/ ml
13 000
/ ml
3 800
/ ml
3 Käsittelemätön pohjavesi
29 000
/ ml
13 000
/ ml
4 Esikäsitelty pohjavesi
Ei määritetty
Ei määritetty
5 Saastunut verkostovesi
A = Tulos arvio, koska lukumäärä alle luotettavan pesäkelaskennan rajan
63
6
TULOSTEN TARKASTELU
6.1
ULTRASUODATUSMENETELMÄN TOIMINTA
Ristivirtausmenetelmään
perustuva
ultrasuodatuslaitteisto
konsentroi
vesinäytteen
suodattamalla osan vedestä ultrasuodatinpatruunassa ja kierrättämällä suodattumatonta vettä
konsetraattisäiliön kautta uudelleen suodatinpatruunalle. Laitteisto konsentroi näytteen
automaattisesti
konsentraattisäiliön
pinnankorkeusanturoiden
automatiikan
ansiosta.
Pumppausnopeutta, painetta ja suodatusnopeutta pystytään haluttaessa säätämään suodatuksen
aikana. Pinnankorkeusanturoihin perustuvaa automatiikkaa ultrasuodatuksen yhteydessä ei ole
aikaisemmin raportoitu.
Ultrasuodatusmenetelmän toiminnan testauksessa kiinnitettiin huomiota suodatusnopeuteen.
Suuren tilavuuden konsentroimiseksi tehokkaasti, suodatuksen on oltava tarpeeksi nopeaa.
Muissa tutkimuksissa ristivirtaussuodatuksen kokonaispumppausnopeuden on raportoitu olleen
välillä 1700- yli 4000 ml/min, josta suodattuneen veden virtaama (eli suodatusnopeus) on ollut
800-1200 ml/min, joissakin kokeissa jopa yli 2000 ml/min. (Hill ym. 2005, Veenendaal ja
Brouwer-Hanzens
2007,
Polaczyk
ym.
2008,
Rhodes
ym.
2011)
Tässä
työssä
kokonaispumppausnopeutta testattiin ensimmäisessä kolmessa kokeessa välillä 1700-2720
ml/min ja lopuissa kokeista se päädyttiin pitämään noin 1700 ml/min. Suodatusnopeus oli
koetta I lukuun ottamatta 660-1200 ml/min. 30 litran näytetilavuuden suodatukseen kului aikaa
noin 45 minuuttia. Suodatusnopeus ja kokonaispumppausnopeus suodattimelle olivat tässä
työssä samanlaisia kuin muissa tutkimuksissa on raportoitu (Hill ym. 2005, Veenendaal ja
Brouwer-Hanzens 2007) ja joitakin tutkimuksia alhaisempia (Hill ym. 2007, Veenendaal ja
Brouwer-Hanzens 2007, Rhodes ym. 2011).
Suodatuksen aikaista painetta tutkittiin, koska sen huomattiin vaikuttavan suodatusnopeuteen.
Liian
korkea
paine
voi
vahingoittaa
mikrobeja,
aiheuttaa
niiden
kiinnittymisen
suodatinmateriaaliin tai mikrobit voivat jopa läpäistä suodatinmateriaalin (Rhodes ym. 2011).
Saantokokeissa laboratorio-olosuhteissa paine vaihteli suodatuksen aikana kaikissa kokeissa
välillä 0,7-1,2 baaria, joka on lähellä muissa tutkimuksissa raportoituja 0,4-1,1 baarin
suodatuspaineita (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008,
Rhodes ym. 2011). Julkaisuissa, joissa suodatuspaine on ollut yli 0,7 baaria, suodatusnopeuden
64
on raportoitu olleen yli 1500 ml/min (Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011). Tässä työssä
suodatusnopeus oli kuitenkin alle 1500 ml/min paineen ollessa yli 0,7 baaria.
Paineen huomattiin vaikuttavan herkästi suodatusnopeuteen. Painetta ja siten suodatusnopeutta
voitiin säätää kiristimellä tai pumppausnopeutta vaihtamalla. Pumppu päädyttiin pitämään
puoliteholla, jolloin nopeus oli noin 1700 ml/min, ja säätämään paine noin 0,9 baariin
kiristimen
avulla.
Tutkituista
nopeuksista
päädyttiin
alhaisempaan,
1700
ml/min,
pumppausnopeuteen, koska suodatusnopeus pysyi samana kiristintä säätämällä ja laitteisto
tärisi letkupumpun vuoksi voimakkaasti suuremmalla virtausnopeudella. Tärinän arvioitiin
nostavan riskiä letkujen irtoamiseen. Sama suodatusnopeus olisi voitu saada aikaan nostamalla
pumpun nopeutta ja löysäämällä kiristintä, siten, että paine pysyy noin 0,9 baarissa.
Suodatinpatruunalle pumpatun veden virtaamaa voisi Polaczykin ym. (2008) mukaan nostaa
myös halkaisijaltaan suuremman letkun avulla. Suuremman letkun vuoksi suurempi
vesitilavuus olisi samassa ajassa virrannut patruunalle, vaikka pumppausnopeus olisi ollut
puoliteholla. Kokeissa ei mitattu suodatinpatruunalle virtaavan veden eikä suodattimelta
uudelleen konsentraattisäiliöön virtaavan veden virtausnopeutta. Patruunan suuntaisesti
virtaava vesi voi estää materiaalin ja mikrobien kiinnittymistä suodatinpatruunaan (MoralesMorales ym. 2003), mutta virtaaman vaikutusta ei tässä tutkittu.
Paineen herkkä vaikutus suodatusnopeuteen voi johtua käytetyn Fresenius FX80suodatinpatruunan rakenteesta. Smith ja Hill (2009) totesivat kokeissaan tutkituista
ultrasuodatinpatruunamalleista Fresenius F200NR-mallin patruunan paineen nousevan eniten,
kun pumppausnopeutta nostettiin, jolloin myös suodatusnopeus kasvoi. Suurempi pinta-ala
vähentää paineen nousua ja Asahi Kasein Rexeed-mallin (pinta-aloiltaan 2,1 m2 ja 2,5 m2)
suodattimien paineen nousu oli tutkituista suodattimista pienin. Fresenius FX80 suodatinpatruunan pinta-ala oli 1,8 m2. Muissa tutkimuksissa pinta-ala on ollut 1,8-2,5 m2
(Polaczyk ym. 2008, Smith ja Hill 2009). Tässä työssä käytetystä suodatinpatruunasta ei ole
saatavilla
aiempia
julkaisuja
liittyen
käyttöön
vesimikrobiologisessa
analytiikassa.
Freseniuksen F200NR ja F80A -mallin suodatinpatruunoilla on saatu 50–100 %:n
mikrobisaantoja (Hill ym. 2005, Polaczyk ym. 2008). Suodatinpatruuna, jonka paine ei nouse
yhtä herkästi ja jonka pinta-ala on suurempi, olisi voinut soveltua menetelmään paremmin
(Smith ja Hill 2009).
65
Muut eivät ole raportoineet samanlaista paineen ja suodatusnopeuden vaihtelua suodatuksen
aikana kuin näissä kokeissa ilmeni. Paineen vaihtelu johtui todennäköisesti laitteiston
rakenteesta. Tutkimustietoa samanlaista laitteistoa, joka pinta-antureiden avulla vaihtaa välillä
ottamaan konsentroitua vettä ja välillä uutta näytevettä, ei ole vertailtavaksi. Vaihtelu paineessa
ja suodatusnopeussavaikeutti niiden seuraamista ja mittaustulosten vertailua kokeiden välillä.
Myös paineen ja suodatusnopeuden vaikutusten arviointi mikrobituloksiin oli suodatuksen
aikaisen vaihtelun vuoksi hankalaa.
6.2
BAKTEERIEN JA VIRUSTEN KONSENTROINTITEHOKKUUS
Ultrasuodatusmenetelmän saantotutkimuksissa eri mikrobeille on raportoitu kirjallisuudessa
saannoksi 50-100 % (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008, Hill ym.
2009). Tässä työssä saantokokeiden mikrobisaannot eivät olleet yhtä hyviä kuin kirjallisuudessa
on ultrasuodatusmenetelmällä raportoitu. E. coli -bakteerin saanto konsentraatista ja
ensimmäisestä eluoinnista viidessä kokeessa vaihteli välillä 10-71 %, F-spesifisten kolifagien
saanto välillä 4-19 % ja somaattisten kolifagien saanto välillä 16-42 %. Yhden suoritetun
kokeen perusteella saanto norovirukselle oli 5 %. Heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärä
ja
kokonaissolulukumäärän
määritykseen
käytettävän
saannot
vaihtelivat
DAPI-menetelmän
suuresti.
suoritusta
Kokonaissolulukumäärän
hankaloitti
suodatuksessa
konsentroituvan veden sisältämä materiaali, joka häiritsi solujen laskemista mikroskoopilla.
Hillin ym. (2005) kokeissa ristivirtaussuodatuksessa syötetyistä mikrobeista havaittiin yli 80 %
jo konsentraatista ennen huuhtelua. Kuitenkin suolistoperäisen Enterococcus faecalis bakteerin saanto oli joissakin olosuhteissa muista mikrobeista poiketen konsentraatissa alle 30
%. Tässä työssä erikseen analysoidut ensimmäisen eluoinnin näytteet sisälsivät lähes puolet tai
yli
puolet
ensimmäisen
kokonaislukumäärästä.
eluoinnin
Suuri
osa
ja
konsentraatin
mikrobeista
ei
yhteenlasketusta
siis
jäänyt
mikrobien
konsentraattiin
ristivirtausmenetelmän periaatteen mukaisesti.
Aiemmissa tutkimuksissa ei ole raportoitu useiden peräkkäisten eluointien tai muiden
huuhtelumenetelmien tuloksia. Tässä työssä eluointia tehtiin useita kertoja peräkkäin heikon
saannon vuoksi. Eluointi lisäsi mikrobisaantoa 3-25 % toisella, kolmannella ja neljännellä
eluointikerralla. Useiden eluointien tekeminen on kuitenkin aikaa vievää, minkä vuoksi
suodatusta tai ensimmäistä eluointia pitäisi saada tehokkaammaksi.
66
Saantokokeiden alhaiset mikrobilukumäärät konsentraatissa ja peräkkäisissä eluoinneissa
talteen saadut mikrobit viittaavat siihen, että mikrobit olivat kiinnittyneenä suodatinpatruunaan
eivätkä pysyneet kiertävässä konsentraatissa. Virtausnopeus suodatinmateriaalin suuntaisesti,
paine, sen vaihtelu ja vaihtelun aiheuttama ilman virtaus suodattimelle voivat vaikuttaa
mikrobien kiinnittymiseen suodattimelle. Nopeampi virtaama patruunan suuntaisesti voisi
ehkäistä mikrobien tarttumisen suodattimelle. (Morales-Morales ym. 2003, Rhodes ym. 2011)
Paineen ja suodatusnopeuden suodatuksen aikaisen vaihtelun ja saantokokeissa suodatuksen
aikana tehtyjen paineen ja virtauksen säätöjen vuoksi virtausnopeuden ja paineen eroja
kenttäkokeiden ja saantokokeiden välillä ei voi verrata. Niiden vaikutusta mikrobitulosten
eroihin ei siten voi arvioida.
Tässä työssä käytetyt huuhtelumenetelmät eivät olleet tarpeeksi tehokkaita irrottamaan
mikrobeja. Koska mikrobit mahdollisesti kiinnittyivät suodatinmateriaaliin eivätkä pysyneet
konsentraatissa, kuten ristivirtausmenetelmässä on tavoitteena, käytetty menetelmä muistuttaa
siltä
osin
enemmän
normaaliultrasuodatusta
eli
dead-end
-ultrasuodatusta.
Normaaliultrasuodatuksessa käytetty vastavirtahuuhtelu voisi olla tehokkaampi menetelmä
irrottamaan suodatinpatruunaan kiinnittyneet mikrobit eluointiliuokseen. (Smith ja Hill 2009,
Leskinen ym. 2012) Hillin ym. (2005) tutkimuksessa E. faecalis -bakteerin kokonaissaanto
ristivirtausultrasuodatus- ja vastavirtahuuhtelumenetelmällä oli yli 70 % vaikka saanto
konsentraatissa oli vain alle 30 %. Ristivirtausmenetelmää käytettäessä merkittävää eroa
mikrobisaannossa eluointimenetelmän ja vastavirtahuuhtelumenetelmän käytön välillä ei ole
huomattu. Suodatuksen suuntaisesti tehtävän eluointimenetelmän saantojen on kuitenkin
huomattu vaihtelevan enemmän kuin vastavirtahuuhtelun (Polaczyk ym. 2008).
Pilot-mittakaavan
vesilaitoskokeessa
vedestä
havaittiin
ultrasuodatusmenetelmällä
järjestelmään syötettyjä E. coli -bakteereita ja F-spesifisiä kolifageja. Pilot-laitoksen kokeessa
mikrobisaantoa ei voi laskea, koska koeasetelman vuoksi ultrasuodatuslaitteistolle
kulkeutuneiden mikrobien lukumäärää ei voi laskea. Suodatus aloitettiin yhtä aikaa mikrobien
syötön kanssa eikä tiedetä, miten kauan kului, että mikrobilukumäärä ultrasuodatuslaitteistolle
pumpatussa vedessä saavutti tason, jossa sen mittattiin olevan suodatuksen aikana. Mikrobien
syöttö lopetettiin neljä tuntia ennen ultrasuodatuksen lopetusta eikä tiedetä, miten
mikrobilukumäärä syötön lopetuksen jälkeen vedessä laski.
67
Kenttäkokeissa verrattiin mikrobihavaintoja ultrasuodatusmenetelmällä ja perinteisellä
näytteenotto- ja konsentrointimenetelmällä. E. coli -bakteerille ja koliformisille bakteereille
ultrasuodatusmenetelmä toimi yhtä hyvin tai paremmin kuin perinteinen menetelmä.
Somaattisia kolifageja havaittiin molemmilla menetelmillä. C. perfringens -bakteerin itiöitä ja
F-spesifisiä kolifageja ei havaittu ultrasuodatusmenetelmällä yhtä herkästi kuin perinteisillä
kanisterinäytteenotto- ja konsentrointimenetelmillä. Heterotrofisen pesäkeluvun tulokset olivat
ultrasuodatusmenetelmälle
heikommat.
Koliformisia
bakteereita
lukuun
ottamatta
indikaattorimikrobien lukumäärät näytteissä olivat hyvin pieniä, joten kvantitatiivista arviointia
menetelmien välillä ei voi tehdä.
Bakteerien ja virusten saannot ultrasuodatusmenetelmällä olivat erilaiset. Toistokokeissa V-VII
saanto oli korkein E. coli -bakteerille, toiseksi korkein somaattisille kolifageille ja alhaisin Fspesifisille
kolifageille.
Samansuuntaisia
tuloksia
saatiin
kenttäkokeissa,
joissa
pumppausnopeus ja ensimmäinen eluointi olivat samanlaisia kuin toistetuissa saantokokeissa.
Kokeissa I-IV, joissa E. coli bakteeri ja kolifagit eivät olleet samoissa kokeissa ja kokeissa
käytettiin eri suodatusolosuhteita ja eluointimenetelmää, saanto oli korkein somaattisille
kolifageille, toiseksi korkein E. coli -bakteerille ja alhaisin F-spesifisille kolifageille.
Somaattisten kolifagien saanto oli yhtä koetta lukuun ottamatta parempi kuin F-spesifisten
kolifagien. Myös kenttäkokeissa somaattisia kolifageja havaittiin ultrasuodatusmenetelmällä
herkemmin kuin F-spesifisiä kolifageja, kun ultrasuodatusmenetelmää verrattiin perinteiseen
näytteenotto- ja konsentrointimenetelmään. Kirjallisuudessa on raportoitu tuloksia, joissa
näiden F-spesifisten ja somaattisten kolifagien saantojen suhde vaihtelee molemmin päin.
Kirjallisuudessa E. coli -bakteerin ja kolifagien saannot ovat olleet hyviä eikä menetelmän
toistuvasti ole raportoitu olevan tehokkaampi bakteerien kuin virusten konsentrointiin tai
päinvastoin.
(Hill ym. 2007, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007) Erilaisilla
suodatusolosuhteilla ja eluointimenetelmällä voi olla erilainen vaikutus eri mikrobeihin, koska
eri mikrobien saannot olivat parempia eri saantokokeissa.
Saantokokeissa mikrobisaantojen tulokset vaihtelivat kokeittain riippuen suodatusolosuhteista
tai eluointimenetelmistä. Kokeissa oli monta eri tekijää, joita muutettiin parhaiden olosuhteiden
löytämiseksi, joten ei voida sanoa, mikä yksittäinen tekijä eri kokeissa on vaikuttanut
muutokseen
mikrobisaannossa.
Suodatusnopeuden,
eluointiliuoksen
kemikaalien,
natriumpolyfosfaatin lisäyksen, eluointimenetelmän, suodattimen asennon, kääntelyn tai ympin
määrän vaikutusta mikrobisaantoon ei voida erikseen arvioida näiden kokeiden perusteella.
68
E. coli -bakteerin osalta kenttäkokeiden tulokset olivat menetelmän tehokkuuden kannalta
parempia kuin saantokokeiden tulokset. Saantokokeiden ja kenttäkokeiden erot mikrobien
konsentrointitehokkuudessa voivat johtua vedenlaadusta ja suodatustilavuudesta. Saantojen on
huomattu vaihtelevan eri laatuisia vesiä suodatettaessa (Smith ja Hill 2009). Pilot-laitoksen vesi
värjäsi suodatinpatruunan oranssinruskeaksi suodatuksen aikana. Värjäytyminen johtui
todennäköisesti suodatinmateriaalin kertyneestä materiaalista, joka voi vaikuttaa saantoon.
Myös suodatustilavuuden on raportoitu vaikuttaneen saantoon (Veenendaal ja BrouwerHanzens 2007).
Tässä työssä käytetyillä mikrobien viljelymenetelmillä havaitaan vain elinkykyiset mikrobit.
Mikrobien viljeltävyyden tai elinkyvyn menetys voi olla yksi osasyy alhaisiin saantotuloksiin.
Elinkykyisetkin mikrobit voivat heikentyä siten, että niitä ei voida havaita viljelymenetelmillä
vaikka ne olisivat elossa. Ultrasuodatusnopeuden yli 2200 ml/min on huomattu laskevan
virusten saantoa, mikä voi johtua virusten vahingoittumisesta ja infektiokyvyn menetyksestä,
jolloin niitä ei saada havaittua viljelymenetelmillä (Rhodes ym. 2011). Molekyylibiologisilla
menetelmillä
voidaan
ultrasuodatuskokeiden
havaita
elävät
ja
näytteiden
E.
coli
kuolleet
mikrobisolut.
-bakteerien
lukumääriä
Tämän
työn
määritettiin
viljelymenetelmän lisäksi uudella PMA (propidium monoatsidi) -PCR -menetelmällä, joka
perustuu elävien solujen havitsemiseen ja erottamiseen kuolleista. Menetelmällä saatuja
tuloksia ei kuitenkaan esitetä tässä työssä.
Virukset voivat myös nopeassa suodatuksessa läpäistä suodatinmateriaalin (Rhodes ym. 2011).
Filtraatista ei todettu mikrobeja, joten alhaisten saantotuloksien syynä ei todennäköisesti ole se,
että mikrobit läpäisevät suodatinmateriaalin. Läpäisyn yhteydessä ne kuitenkin ovat voineet
menettää viljeltävyytensä, jolloin niitä ei havaita. Mahdolliset kloorijäämät laitteistossa voivat
myös vahingoittaa mikrobeja, jos huuhtelu ei ollut riittävä. Klooria ei mitattu joka kerta
huuhteluvedestä. Ymppäämättömän näyteveden suodatuksen jälkeen laitteiston voi viimeistään
olettaa huuhtoutuneen riittävästi.
6.3
ULTRASUODATUSMENETELMÄN TOIMINTAKYKY ERILAISISSA
KENTTÄOLOSUHTEISSA
Teknisesti ultrasuodatuslaitteisto toimi kenttäolosuhteissa samalla tavalla kuin laboratoriossa.
Suodatusajan ja -tilavuuden mukaan laskettu suodatusnopeus oli kenttäkokeissa samanlainen
69
kuin saantokokeissa. Kenttäkokeissa suodatus saattoi olla kuitenkin hitaampaa, koska
saantokokeiden suodatuksen kestoa lisäsivät hetkittäiset paineen alennukset ja tehdyt laitteiston
säädöt. Kenttäkokeissa suodatusnopeus oli 570 ml/min esikäsitellyn pohjaveden suodatuksessa
ja muissa 780-850 ml/min. Nopeus oli korkein esikäsittelyn veden ja verkostoveden
suodatuksessa. Alhaisen nopeuden (570 ml/min) pohjaveden suodatuksessa vesi ei tullut
pumpulle paineellisesta hanasta, joten vettä ei välttämättä riittänyt nopeampaan suodatukseen.
Suodatusnopeus on merkittävä tekijä, sillä näytteenottoon käytettävä aika on yleensä rajallinen.
Viimeistään mikrobien säilyvyys vedessä rajoittaa suodatuksen kestoa. Vettä saatiin
suodatettua tunnissa noin 50 litraa ja alle vuorokaudessa 1000 litraa eli 1 m3.
Otettaessa näyte paineellisesta hanasta letkujen ja liittimien on kestettävä painetta ja paine on
alennettava paineenalennusventtiilillä. Liian korkea paine voi läpäistä sulkijat ja täyttää
konsentraattisäiliötä. Toisaalta näytehanan paineen ja virtaaman on oltava riittävä tehokkaat
suodatusnopeuden saamiseksi. Paineen alle yhteen baariin alentava venttiili voi olla kallis ja
venttiilin rakenteen vuoksi siihen liittyy kontaminaatioriski. Paineeseen liittyviä ongelmia ei
ole,
jos
näyte
otetaan
ultrasuodatuslaitteiston
astiasta
välissä
pumppaamalla.
voisi
Sen
vuoksi
yksinkertaistaa
väliastia
käyttöä
hanan
ja
vaihtelevissa
näytteenottotilanteissa.
Laitteiston pystyi kuljettamaan näytteenottopaikalle ja automatiikan avulla ultrasuodatusta ei
tarvinnut valvoa, vaan se konsentroi vesinäytteen yön aikana. Laitteiston käyttö vaati
osaamista, mutta hyvän ohjeistuksen avulla esimerkiksi vesilaitoksen henkilökunta voisi ottaa
näytteen laitoksella. Paineellisen hanan aiheuttamat ongelmat tai letkuston rikkoutumisriskit on
minimoitava ennen näytteenottoa. Laitteiston käyttöhelppoutta voisi parantaa ja harkita
eluoinnin tekoa vasta laboratoriossa, jos laitetteen käyttöön kouluttautumaton henkilö tekee
suodatuksen näytteenottokohteessa (US EPA 2013). Normaalisuodatusmenetelmää käytetään
kenttätutkimuksissa
enemmän,
koska
siihen
riittää
yksinkertaisempi
laitteisto.
Normaalisuodatusmenetelmällä konsentroitava näytemäärä on kuitenkin pienempi, noin sata
litraa, kuin ristivirtausmenetelmällä, jolla tilavuus voi olla jopa yli 1000 litraa (Veenendaal ja
Brouwer-Hanzens 2007, Smith ja Hill 2009, Leskinen ym. 2012).
Suuren vesitilavuuden konsentrointi mahdollistaa pienten mikrobilukumäärien havaitsemisen
esimerkiksi veden puhdistusprosessin jälkeisestä vedestä. Tietoa veden mikrobilukumääristä
tarvitaan puhdistusprosessien tehokkuuksien laskemiseen, mikä auttaa, kun päätetään, mitä
70
prosesseja veden puhdistukseen tarvitaan riittävän turvallisuuden takaamiseksi (Pitkänen ym.
2011, Vesiopas 2013). Ultrasuodatusmenetelmällä vesilaitoksen prosessivedestä voidaan
konsentroida
suuri
tilavuus.
Näytteenotto
laitteistolla
vesiepidemiaepäilytilanteen
selvitystyössä on mahdollista, jolloin suuri analyysitilavuus parantaa taudinaiheuttajamikrobien
havaitsemista. Kanisterinäytteenottoa ja nykyisiä konsentrointimenetelmiä käytettäessä
näytetilavuus on muutamia litroja.
Tässä työssä ultrasuodatusmenetelmää verrattiin perinteiseen kanisterinäytteenottoon ja
konsentrointimenetelmiin. On huomioitava, että perinteisiä menetelmiä käytettäessä
kanistereihin otettiin kymmeniä litroja näytevettä, mikä on tavanomaista paljon suurempi
näytetilavuus.
Suuren
näytetilavuuden
kuljetus
ja
kalvosuodatus
laboratoriossa
ei
normaalitilanteissa kuitenkaan ole kustannustehokasta. Jos ultrasuodatusmenetelmän saantoa
saadaan parannettua, menetelmän avulla on mahdollista säästää kustannuksissa, kun
näytteenotto ja konsentrointi tapahtuvat samanaikaisesti eri mikrobiryhmille.
Mikrobien saannon osalta tässä työssä tutkittua ultrasuodatusmenetelmää on kehitettävä.
Esimerkiksi 50 %:n saanto ultrasuodatusmenetelmällä tuhannesta litrasta vastaa 500 litran
mikrobimäärää, kun saanto on 100 %. Jos menetelmää kehitetään mikrobisaannon osalta
tehokkaammaksi, voidaan suodatusaikaa lyhentää, kun pienempi tilavuus riittää. Esimerkiksi
epidemiatilanteessa näytteenotto on tehtävä mahdollisimman nopeasti ja tehokkaasti, jotta
mikrobit voidaan havaita ja talousvesijärjestelmä korjata ja desinfioida käyttöönottoa varten
(Pitkänen 2013).
Ohjelmiston avulla säädettäviä automaattisia ultrasuodatusnäytteenottimia on kehitetty
kenttäolosuhteisiin (Kearns ym. 2008, Leskinen ym. 2012). Automatiikan vuoksi
näytteenottoon tarvitaan entistä vähemmän työaikaa ja näytteitä voidaan ottaa tiheämmin.
Automatiikan avulla ultrasuodatusta olisi mahdollista käyttää tulevaisuudessa myös
vedenlaadun valvontaan erityistilanteiden ja prosessien tehokkuuksien arvioinnin lisäksi.
71
7
JOHTOPÄÄTÖKSET
Ultrasuodatusmenetelmällä saatiin konsentroitua 1000 litran näytetilavuus alle litran
tilavuuteen vajaassa vuorokaudessa. 30 litran suodatukseen kului aikaa noin 45 minuuttia.
Ultrasuodatusmenetelmällä konsentroidusta näytteestä havaittiin bakteereita ja viruksia.
Kenttäkokeissa käytetyllä menetelmällä saatiin satojen litrojen tilavuudesta konsentroitua
tehokkaasti E. coli -bakteeria ja koliformisia bakteereita. Menetelmää olisi kuitenkin
kehitettävä, jotta sen teho olisi yhtä hyvä sekä bakteerien että virusten konsentrointiin.
Ultrasuodatuslaitteisto toimi suodatuksen aloituksen jälkeen automaattisesti ilman valvontaa,
mikä mahdollistaa suuren näytetilavuuden keräämiseksi tarvittavan pitkän suodatusajan. Suuri
näytetilavuus
parantaa
mahdollisuutta
havaita
pienet
mikrobilukumäärät
vedessä.
Ultrasuodatusmenetelmällä voidaan konsentroida suuren tilavuuden näyte erilaisissa
kenttäolosuhteissa.
Menetelmän tehokkuutta erilaisten vesinäytteiden mikrobikonsentrointiin sekä soveltuvuutta
jatkokonsentrointi- ja havaitsemismenetelmiä varten tulisi selvittää jatkotutkimuksissa.
72
LÄHDELUETTELO
Aakko K., Haikala O., Hiisvirta L., Holopainen M., Kettunen R., Kurki J., ym. 2000.
Ympäristöterveyden erityistilanteiden opas. Sosiaali- Ja Terveysministeriön Oppaita 4, 33-52.
Ahmed W., Hodgers L., Sidhu J.P.S. ja Toze S. 2012. Fecal Indicators and Zoonotic Pathogens
in Household Drinking Water Taps Fed from Rainwater Tanks in Southeast Queensland,
Australia. Applied and Environmental Microbiology 78, 1. 219-226.
Ammersbach M. ja Bienzle D. 2011. Methods for assessing feline immunodeficiency virus
infection, infectivity and purification. Veterinary Immunology and Immunopathology 143, 3-4.
202-214.
Argonide.
2014.
NanoCeram
-patruunan
http://www.argonide.com/commercial/product-line/ 8.8.2014.
tuotetietoja.
Bartram J., ym. 2001. Harmonised assessment of risk management for water-related infectious
desease: an overview. Teoksessa: Fewtrell L and Bartram J. Water Quality: Guidelines,
Standards and Health, Assessment of risk and risk management for water-related infectious
disease. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 1-16.
Bisha B., Perez-Mendez A., Danyluk M.D. ja Goodridge L.D. 2011. Evaluation of Modified
Moore Swabs and Continuous Flow Centrifugation for Concentration of Salmonella and
Escherichia coli O157:H7 from Large Volumes of Water. Journal of Food Protection 74, 11.
1934-1937.
Borchardt M. ja Spencer S. 2002. Concentration of Cryptosporidium, microsporidia and other
water-borne pathogens by continuous separation channel centrifugation. Journal of Applied
Microbiology 92, 4. 649-656.
Brassard J., Seyer K., Houde A., Simard C. ja Trottier Y. 2005. Concentration and detection of
hepatitis A virus and rotavirus in spring water samples by reverse transcription-PCR. Journal
of Virological Methods 123, 2. 163-169.
Brunkard J., Ailes E., Roberts V., Hill V., Hilborn E., Craun G., ym. 2011. Surveillance for
waterbornedisease outbreaksassociated with drinking water---UnitedStates, 2007--2008. CDC,
Morbidity and Mortality Weekly Report 60, 12. 38-68.
Cann K.F., Thomas D.R., Salmon R.L., Wyn-Jones A.P. ja Kay D. 2013. Extreme water-related
weather events and waterborne disease. Epidemiology and Infection 141, 4. 671-686.
CEN ISO/TS 15216-1. 2013. Tekninen spesifikaatio, Microbiology of Food and Animal Feed.
Horizontal Method for Determination of Hepatitis A Virus and Norovirus in Food Using RealTime Rt-Pcr. Part 1: Method For Quantification (Corrected Version 2013-05-01).
Clever M., Jordt F., Knauf R., Räbiger N., Rüdebusch M. ja Hilker-Scheibel R. 2000. Process
water production from river water by ultrafiltration and reverse osmosis. Desalination 131, 3.
325-336.
73
Craun G., Berger P. ja Calderon R. 1997. Coliform bacteria and waterborne disease outbreaks.
Journal American Water Works Association 89, 3. 96-104.
Deere D., ym. 2001. Management Strategies. Teoksessa: Fewtrell L and Bartram J. Water
quality: Guidelines, Standards and Health, Assessment of risk and risk management for waterrelated infectious desease. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 257-288.
Edberg S., Rice E., Karlin R. ja Allen M. 2000. Escherichia coli: the best biological drinking
water indicator for public health protection. Journal of Applied Microbiology 88, 106S-116S.
Edge T.A., Khan I.U.H., Bouchard R., Guo J., Hill S., Locas A., ym. 2013. Occurrence of
Waterborne Pathogens and Escherichia coli at Offshore Drinking Water Intakes in Lake
Ontario. Applied and Environmental Microbiology 79, 19. 5799-5813.
Euroopan unionin neuvosto. 1998. Neuvoston direktiivi 98/83/EY ihmisten käyttöön
tarkoitetun veden laadusta.
Gantzer C., Senouci S., Maul A., Levi Y. ja Schwartzbrod L. 1997. Enterovirus genomes in
wastewater: Concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. Journal
of Virological Methods 65, 2. 265-271.
Garin D., Fuchs F., Crance J., Deloince R., Aymard M. ja Bartoli M. 1993. Validation of an
Ultrafiltration Process to Concentrate Viruses from Large Volumes of Water. Environmental
Technology 14, 4. 397-400.
Gibbons C.D., Rodriguez R.A., Tallon L. ja Sobsey M.D. 2010. Evaluation of positively
charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses,
adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology
109, 2. 635-641.
Gibson K.E., Opryszko M.C., Schissler J.T., Guo Y. ja Schwab K.J. 2011. Evaluation of Human
Enteric Viruses in Surface Water and Drinking Water Resources in Southern Ghana. American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene 84, 1. 20-29.
Gilgen M., Germann D., Luthy J. ja Hubner P. 1997. Three-step isolation method for sensitive
detection of enterovirus, rotavirus, hepatitis A virus, and small round structured viruses in water
samples. International Journal of Food Microbiology 37, 2-3. 189-199.
Girones R., Antonia Ferrus M., Luis Alonso J., Rodriguez-Manzano J., Calgua B., de Abreu
Correa A., ym. 2010. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of
molecular techniques. Water Research 44, 15. 4325-4339.
Griffin S.M., Brinkman N.E., Hedrick E.J., Rhodes E.R. ja Fout G.S. 2014. Comparison of
nucleic acid extraction and reverse transcription-qPCR approaches for detection of GI and GII
noroviruses in drinking water. Journal of Virological Methods 199, 0. 76-85.
Hänninen M., Haajanen H., Pummi T., Wermundsen K., Katila M., Sarkkinen H., ym. 2003.
Detection and typing of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli and analysis of indicator
organisms in three waterborne outbreaks in Finland. Applied and Environmental Microbiology
69, 3. 1391-1396.
74
Hatakka M., Loukaskorpi M. ja Pakkala P. 2001. Ruokamyrkytykset Suomessa vuonna 2000.
Elintarvikeviraston
Julkaisuja
8.
http://www.zoonoosikeskus.fi/attachments/ruokamyrkytykset/2000.pdf.
Hijnen W., Van Veenendaal D., Van der Speld W., Visser A., Hoogenboezem W. ja Van der
Kooij D. 2000. Enumeration of faecal indicator bacteria in large water volumes using on site
membrane filtration to assess water treatment efficiency. Water Research 34, 5. 1659-1665.
Hill V.R., Kahler A.M., Jothikumar N., Johnson T.B., Hahn D. ja Cromeans T.L. 2007.
Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric
microbes in 100-liter tap water samples. Applied and Environmental Microbiology 73, 13.
4218-4225.
Hill V.R., Mull B., Jothikumar N., Ferdinand K. ja Vinje J. 2010. Detection of GI and GII
Noroviruses in Ground Water Using Ultrafiltration and TaqMan Real-time RT-PCR. Food and
Environmental Virology 2, 4. 218-224.
Hill V.R., Polaczyk A.L., Kahler A.M., Cromeans T.L., Hahn D. ja Amburgey J.E. 2009.
Comparison of Hollow-Fiber Ultrafiltration to the USEPA VIRADEL Technique and USEPA
Method 1623. Journal of Environmental Quality 38, 2. 822-825.
Hill V., Polaczyk A., Hahn D., Narayanan J., Cromeans T., Roberts J., ym. 2005. Development
of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by
ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental
Microbiology 71, 11. 6878-6884.
Hrudey S.E. 2004. Safe Drinking Water. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta.
Hrudey S.E. ja Hrudey E.J. 2007. Published case studies of waterborne disease outbreaks Evidence of a recurrent threat. Water Environment Research 79, 3. 233-245.
Hunter D.M., Leskinen S.D., Magana S., Schlemmer S.M. ja Lim D.V. 2011. Dead-end
ultrafiltration concentration and IMS/ATP-bioluminescence detection of Escherichia coli
O157:H7 in recreational water and produce wash. Journal of Microbiological Methods 87, 3.
338-342.
Ikner L.A., Gerba C.P. ja Bright K.R. 2012. Concentration and Recovery of Viruses from
Water: A Comprehensive Review. Food and Environmental Virology 4, 2. 41-67.
ISO. 1998. Water quality - Detection and enumeration of Legionella, ISO 11731.
ISO. 2006. Water quality - Isolation and identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia
cysts from water, ISO 15553.
ISO. 2012. Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 2: Most
probable number method, ISO 9308-2.
ISO. 2013. Water quality - Enumeration of Clostridium perfringens - Method using membrane
filtration, ISO 14189.
75
Isomäki E. 2006. Pienten pohjavesilaitosten ylläpito ja valvonta Ympäristöopas. Suomen
ympäristökeskus. Vammala.
Jalava K., Rintala H., Ollgren J., Maunula L., Gomez-Alvarez V., Revez J., ym. 2014. Novel
microbiological and spatial statistical methods to improve strength of epidemiological evidence
in
a
community-wide
waterborne
outbreak.
PlosOne
9,
8.
1-13
http://www.plosone.org/article/fetchObject.action?uri=info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.p
one.0104713&representation=PDF.
Josephson K., ym. 2000. Cultural Methods. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C.
Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 213-234.
Katzenelson E., Fattal B. ja Hostovesky T. 1976. Organic flocculation: an efficient second-step
concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental
Microbiology 32, 4. 638-639.
Kauppinen A., Ikonen J., Pursiainen A., Pitkanen T. ja Miettinen I.T. 2012. Decontamination
of a drinking water pipeline system contaminated with adenovirus and Escherichia coli utilizing
peracetic acid and chlorine. Journal of Water and Health 10, 3. 406-418.
Kauppinen A., Martikainen K., Matikka V., Veijalainen A., Pitkanen T., Heinonen-Tanski H.,
ym. 2014. Sand filters for removal of microbes and nutrients from wastewater during a oneyear pilot study in a cold temperate climate. Journal of Environmental Management 133, 206213.
Kearns E.A., Magana S. ja Lim D.V. 2008. Automated concentration and recovery of microorganisms from drinking water using dead-end ultrafiltration. Journal of Applied Microbiology
105, 2. 432-442.
Kfir R., Hilner C., du Preez M. ja Bateman B. 1995. Studies evaluating the applicability of
utilising the same concentration techniques for the detection of protozoan parasites and viruses
in water. Water Science and Technology 31, 5–6. 417-423.
Khan I.U.H. ja Edge T.A. 2007. Development of a novel triplex PCR assay for the detection
and differentiation of thermophilic species of Campylobacter using 16S-23S rDNA internal
transcribed spacer (ITS) region. Journal of Applied Microbiology 103, 6. 2561-2569.
Knappett P.S.K., Layton A., McKay L.D., Williams D., Mailloux B.J., Huq M.R., ym. 2011.
Efficacy of Hollow-Fiber Ultrafiltration for Microbial Sampling in Groundwater. Ground
Water 49, 1. 53-65.
Kratzer A., Liebchen U., Schleibinger M., Kees M.G. ja Kees F. 2014. Determination of free
vancomycin, ceftriaxone, cefazolin and ertapenem in plasma by ultrafiltration: Impact of
experimental conditions. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the
Biomedical and Life Sciences 961, 97-102.
Kuopion
Vesi.
2009.
Hyvä
vesi
puhdas
ympäristö
https://www.kuopio.fi/c/document_library/get_file?uuid=52ba746b-3ada-4e78-b9af008099656186&groupId=518539 28.7.2014.
-esite.
76
Lambertini E., Spencer S.K., Bertz P.D., Loge F.J., Kieke B.A. ja Borchardt M.A. 2008.
Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of
glass wool filters. Applied and Environmental Microbiology 74, 10. 2990-2996.
Lecler H., ym. 2004. Microbial agents associated with waterborne diseases. Teoksessa: Cloete
T, Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing. Lontoo,
Yhdistynyt kuningaskunta. 1-54.
Lehtola M.J., Torvinen E., Kusnetsov J., Pitkanen T., Maunula L., von Bonsdorff C., ym. 2007.
Survival of Mycobacterium avium, Legionella pneumophila, Escherichia coli, and caliciviruses
in drinking water-associated biofilms grown under high-shear turbulent flow. Applied and
Environmental Microbiology 73, 9. 2854-2859.
Leskinen S.D., Kearns E.A., Jones W.L., Miller R.S., Bevitas C.R., Kingsley M.T., ym. 2012.
Automated dead-end ultrafiltration of large volume water samples to enable detection of lowlevel targets and reduce sample variability. Journal of Applied Microbiology 113, 2. 351-360.
Leskinen S.D., Harwood V.J. ja Lim D.V. 2009. Rapid dead-end ultrafiltration concentration
and biosensor detection of enterococci from beach waters of Southern California. Journal of
Water and Health 7, 4. 674-684.
Lewis G. ja Metcalf T. 1988. Polyethylene-Glycol Precipitation for Recovery of Pathogenic
Viruses, Including Hepatitis-a Virus and Human Rotavirus, from Oyster, Water, and Sediment
Samples. Applied and Environmental Microbiology 54, 8. 1983-1988.
Liikanen R. 2007. Kalvosuodatustekniikat – vaihtoehtoja veden- ja jätevedenkäsittelyyn.
Vesitalous 3. 7-10.
Lindquist H.D.A., ym. 2011. Taking the Hay Out of the Haystack: Collecting and Processing
Water Samples. Teoksessa: MacRae J. Environmental microbiology: Current technology and
water applications. Univ Chicago Press. Chigago, Yhdysvallat. 39-64.
Lindquist H.D.A., Harris S., Lucas S., Hartzel M., Riner D., Rochele P., ym. 2007. Using
ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies
globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. Journal of Microbiological
Methods 70, 3. 484-492.
Lukasik J., Scott T., Andryshak D. ja Farrah S. 2000. Influence of salts on virus adsorption to
microporous filters. Applied and Environmental Microbiology 66, 7. 2914-2920.
Manahan S.E. 2004. Environmental chemistry. 8 Edition. Lewis Publisher. Boca Raton, Florida,
Yhdysvallat.
Marlowe E., ym. 2000. Nucleic Acid-Based Methods of Analysis. Teoksessa: Maier R, Pepper
I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt
kuningaskunta. 287-317.
McEgan R., Rodrigues C.A.P., Sbodio A., Suslow T.V., Goodridge L.D. ja Danyluk M.D. 2013.
Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and
tangential flow filtration. Letters in Applied Microbiology 56, 2. 88-94.
77
Méndez J., Audicana A., Isern A., Llaneza J., Moreno B., Tarancón M.L., ym. 2004.
Standardised evaluation of the performance of a simple membrane filtration-elution method to
concentrate bacteriophages from drinking water. Journal of Virological Methods 117, 1. 19-25.
Meriläinen P., Pitkänen T. ja Miettinen I.T. 2012. Kvantitatiivinen mikrobiologinen
riskinarviointi (QMRA) Suomessa/Quantitative microbial risk assessment (QMRA) in Finland.
Vesitalous 3. 20-25.
Miettinen I.T., ym. 2009. Number of outbreaks of waterborne diseases attributable to drinkingwater and bathing water each year. Outbreaks of Waterborne Diseases, Fact Sheet 1.1.
European Environment and Health Information System (ENHIS), WHO. Eurooppa.
http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0009/96885/1.1.-Outbreaks-of-waterbornediseases-EDITED_layout_V03.pdf.
Miettinen I., Zacheus O., von Bonsdorff C. ja Vartiainen T. 2001. Waterborne epidemics in
Finland in 1998-1999. Water Science and Technology 43, 12. 67-71.
Morales-Morales H., Vidal G., Olszewski J., Rock C., Dasgupta D., Oshima K., ym. 2003.
Optimization of a reusable hollow-fiber ultrafilter for simultaneous concentration of enteric
bacteria, protozoa, and viruses from water. Applied and Environmental Microbiology 69, 7.
4098-4102.
Mull B. ja Hill V.R. 2009. Recovery and Detection of Escherichia coli O157:H7 in Surface
Water, Using Ultrafiltration and Real-Time PCR. Applied and Environmental Microbiology 75,
11. 3593-3597.
National Research Council. 2004. Indicators for waterborne pathogens. The National
Academies Press. Washington, Yhdysvallat.
Nel L., ym. 2004. Emerging infectious waterborne diseases: protozoan agents. Teoksessa:
Cloete T, Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing.
Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 89-99.
Nel L., ym. 2004. Emerging infectious waterborne diseases: viral agents. Teoksessa: Cloete T,
Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing. Lontoo,
Yhdistynyt kuningaskunta. 78-88.
Nigam M.O., Bansal B. ja Chen X.D. 2008. Fouling and cleaning of whey protein concentrate
fouled ultrafiltration membranes. Desalination 218, 1-3. 313-322.
Nordgren J., Matussek A., Mattsson A., Svensson L. ja Lindgren P. 2009. Prevalence of
norovirus and factors influencing virus concentrations during one year in a full-scale
wastewater treatment plant. Water Research 43, 4. 1117-1125.
Ongerth J. ja Stibbs H. 1987. Identification of Cryptosporidium Oocysts in River Water.
Applied and Environmental Microbiology 53, 4. 672-676.
Pagel J., Qureshi A., Young D. ja Vlassoff L. 1982. Comparison of four membrane filter
methods for fecal coliform enumeration. Applied and Environmental Microbiology 43, 4. 787793.
78
Patrone V., Campana R., Vallorani L., Dominici S., Federici S., Casadei L., ym. 2013. CadF
expression in Campylobacter jejuni strains incubated under low-temperature water microcosm
conditions which induce the viable but non-culturable (VBNC) state. Antonie Van
Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 103, 5. 979-988.
Payment P., Berube A., Perreault D., Armon R. ja Trudel M. 1989. Concentration of Giardia
lamblia cysts, Legionella pneumophila, Clostridium perfringens, human enteric viruses, and
coliphages from large volumes of drinking water, using a single filtration. Canadian Journal of
Microbiology 35, 10. 932-935.
Pepper I., ym. 2000. Environmental Sample Collection and Processing. Teoksessa: Maier R,
Pepper I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt
kuningaskunta. 177-194.
Petterson S., Signor R., Ashbolt N. ja Roser D. 2006. QMRA Methodology. Microrisk-projekti.
http://www.microrisk.com/uploads/microrisk_qmra_methodology.pdf.
Pitkänen T. 2008. Bathing water quality and microbiological methods. Ympäristö Ja Terveys 2.
16-19.
Pitkänen T., Meriläinen P. ja Miettinen I.T. 2011. Quantitative assessment of microbiological
risks transmitted by household water. Vesivälitteisten mikrobiologisten riskien kvantitatiivinen
arviointi. Vesitalous 3. 6-10.
Pitkänen T. 2010. Studies on the detection methods of Campylobacter and faecal indicator
bacteria in drinking water. National Istitute for Health and Welfare. Research 39, Helsinki.
http://www.thl.fi/thl-client/pdfs/e5b43e6a-021e-40a3-9381-3aa24f98e722.
Pitkänen T. 2013. Review of Campylobacter spp. in drinking and environmental waters.
Journal of Microbiological Methods 95, 1. 39-47.
Polaczyk A., Roberts J. ja Hill V. 2007. Evaluation of 1 MDS electropositive microfilters for
simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological
Methods 68, 260-266.
Polaczyk A.L., Narayanan J., Cromeans T.L., Hahn D., Roberts J.M., Amburgey J.E., ym. 2008.
Ultrafiltration-based techniques for rapid and simultaneous concentration of multiple microbe
classes from 100-L tap water samples. Journal of Microbiological Methods 73, 2. 92-99.
Reasoner D. ja Geldreich E. 1985. A New Medium for the Enumeration and Subculture of
Bacteria from Potable Water. Applied and Environmental Microbiology 49, 1. 1-7.
Reynolds K., ym. 2000. Microorganisms in the Environment. Teoksessa: Maier R, Pepper I and
Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 741.
Rhodes E.R., Hamilton D.W., See M.J. ja Wymer L. 2011. Evaluation of hollow-fiber
ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from
water. Journal of Virological Methods 176, 1-2. 38-45.
79
Richardson A., Frankenberg R., Buck A., Selkon J., Colbourne J., Parsons J., ym. 1991. An
Outbreak of Waterborne Cryptosporidiosis in Swindon and Oxfordshire. Epidemiology and
Infection 107, 3. 485-495.
Rimhanen-Finne R., Horman A., Ronkainen P. ja Hanninen M. 2002. An IC-PCR method for
detection of Cryptosporidium and Giardia in natural surface waters in Finland. Journal of
Microbiological Methods 50, 3. 299-303.
Rusin P., ym. 2000. Environmentally Transmitted Pathogens. Teoksessa: Maier R, Pepper I and
Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta.
447-489.
Sails A., Bolton F., Fox A., Wareing D. ja Greenway D. 2002. Detection of Campylobacter
jejuni and Campylobacter coli in environmental waters by PCR enzyme-linked immunosorbent
assay. Applied and Environmental Microbiology 68, 3. 1319-1324.
Santo Domingo J.W., Bambic D.G., Edge T.A. ja Wuertz S. 2007. Quo vadis source tracking?
Towards a strategic framework for environmental monitoring of fecal pollution. Water
Research 41, 16. 3539-3552.
Sbodio A., Maeda S., Lopez-Velasco G. ja Suslow T.V. 2013. Modified Moore swab
optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large
volume field samples of irrigation water. Food Research International 51, 2. 654-662.
Schijven J.F., Hassanizadeh S.M. ja Husman A.M.d.R. 2010. Vulnerability of unconfined
aquifers to virus contamination. Water Research 44, 4. 1170-1181.
Schijven J., de Bruin H., Hassanizadeh S. ja Husman A. 2003. Bacteriophages and Clostridium
spores as indicator organisms for removal of pathogens by passage through saturated dune sand.
Water Research 37, 9. 2186-2194.
SFS. 1999. Veden laatu. Viljeltävien mikro-organismien lukumäärän laskeminen. Pesäkelasku
siirrostamalla agar-ravintoalustaan, SFS-EN ISO 6222.
SFS. 2000. Veden laatu. Suolistoperäisten enterokokkien havaitseminen ja laskeminen. Osa 2:
Kalvosuodatusmenetelmä, SFS-EN ISO 7899-2.
SFS. 2002. Veden laatu. Bakteriofaagien havaitseminen ja laskeminen. Osa 1: F-spesifisten
RNA-bakteriofaagien laskeminen, SFS-EN ISO 10705-1.
SFS. 2008a. Veden laatu. Pseudomonas aeruginosan havaitseminen ja lukumäärän määritys.
Kalvosuodatustekniikka, SFS-EN ISO 16266.
SFS. 2008b. Veden laatu. Yleinen ohje mikro-organismien lukumäärien määrittämiseksi
viljelymenetelmällä, SFS-EN ISO 8199.
SFS. 2010. Veden laatu. Escherichia colin ja koliformisten bakteerien toteaminen ja
laskeminen. Osa 1: Kalvosuodatusmenetelmä, SFS-EN ISO 9308-1 + AC.
80
SFS. 2011. Veden laatu. Koliformisten
kalvosuodatusmenetelmällä, SFS 3016.
bakteerien
kokonaismäärän
määritys
Simmons O., Sobsey M., Heaney C., Schaefer F. ja Francy D. 2001. Concentration and
detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using
ultrafiltration and capsule filtration. Applied and Environmental Microbiology 67, 3. 11231127.
Smeets P., Rietveld L., Hijnen W., Medema G. ja Stenström T. 2006. Efficacy of water
treatment processes, Microrisk. Microrisk-Projektin Raportti .
Smith C.M. ja Hill V.R. 2009. Dead-End Hollow-Fiber Ultrafiltration for Recovery of Diverse
Microbes from Water. Applied and Environmental Microbiology 75, 16. 5284-5289.
STM. 2000. Sosiaali- ja terveysministeriön asetus 461/2000 talousveden laatuvaatimuksista ja
valvontatutkimuksista.
STM. 2001. Sosiaali- ja terveysministeriön asetus 401/2001 pienten yksiköiden talousveden
laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista .
STM ja THL. 2014. Suomi ottaa vesilaitoksissa käyttöön talousveden
riskienhallintajärjestelmän. http://www4.thl.fi/fi_FI/web/fi/tiedote?id=35857 7.8.2014.
Theron J., ym. 2004. Emerging microbiological detection techniques. Teoksessa: Cloete T,
Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing. Lontoo,
Yhdistynyt kuningaskunta. 155-175.
THL. 2014. Vesiepidemiat. http://www.thl.fi/fi/web/ymparistoterveys/vesi/vesiepidemiat
28.7.2014.
Thomas M., Charron D., Waltner-Toews D., Schuster C., Maarouf A. ja Holt J. 2006. A role of
high impact weather events in waterborne disease outbreaks in Canada, 1975-2001.
International Journal of Environmental Health Research 16, 3. 167-180.
Timberley M., ym. 2000. Microscopic techniques. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C.
Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 195-212.
US EPA. 2001a. Method 1601: Male-specific (F+) and Somatic Coliphage in Water by Twostep Enrichment Procedure.
US EPA. 2001b. Method 1602: Male-specific (F+) and Somatic Coliphage in Water by Single
Agar Layer (SAL) Procedure.
US EPA. 2005. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA.
US EPA. 2012. Method 1651: Measurement of enterovirus and norovirus occurence in water
by culture and RT-qPCR.
US EPA. 2013. Standard Operating Procedure for Performing Dead-end Ultrafiltration.
Revision 4.
81
Valtioneuvosto. 1994a. Terveydensuojeluasetus 1280/1994.
Valtioneuvosto. 1994b. Terveydensuojelulaki 763/1994.
Valtioneuvosto. 1994c. Valtioneuvoston päätös 366/1994 juomaveden valmistamiseen
tarkoitetun pintaveden laatuvaatimuksista ja tarkkailusta.
Valvira.
2009.
Ohje
Talousveden
laadun
turvaaminen
erityistilanteissa.
http://www.valvira.fi/files/ohjeet/erityistilannesuunnitelma2009_310309.pdf.
Valvira. 2014. Terveydensuojelulain mukaisissa tutkimuksissa käytettävät menetelmät. Ohje
nro
2.
http://www.valvira.fi/files/ohjeet/TESU/Terveydensuojelulain_mukaisissa_tutkimuksissa_kay
tettavat_menetelmat_140214.pdf.
van Lieverloo J.H.M., Mesman G.A.M., Bakker G.L., Baggelaar P.K., Hamed A. ja Medema
G. 2007. Probability of detecting and quantifying faecal contaminations of drinking water by
periodically sampling for E. coli: A simulation model study. Water Research 41, 19. 42994308.
Veenendaal H. ja Brouwer-Hanzens A. 2007. A method for the concentration of microbes in
large volumes of water. Techneau-projektin raportti. Techneau-projektin raportti.
http://www.techneau.org/fileadmin/files/Publications/Publications/Deliverables/D3.2.4.pdf.
Vesey G., Slade J., Byrne M., Shepherd K. ja Fricker C. 1993. A new method for the
concentration of Cryptosporidium oocysts from Water. Journal of Applied Bacteriology 75, 1.
82-86.
Vesiopas. 2013. http://fi.opasnet.org/fi/Vesiopas 7.8.2014.
WHO.
2011.
Guidelines
for
drinking
water
quality,
4
Edition.
http://www.who.int/water_sanitation_health/publications/2011/dwq_guidelines/en/ 20.6.2014.
Widerström M., Schönning C., Lilja M., Lebbad M., Ljung T., Allestam G., ym. 2014. Large
Outbreak of Cryptosporidium hominis Infection Transmitted through the Public Water Supply,
Sweden. Emerging Infectious Diseases 20, 4. 581-589.
Winona L., Ommani A., Olszewski J., Nuzzo J. ja Oshima K. 2001. Efficient and predictable
recovery of viruses from water by small scale ultrafiltration systems. Canadian Journal of
Microbiology 47, 11. 1033-1041.
Wu J., Simmons O. ja Sobsey M.D. 2013. Uncertainty analysis of the recovery of hollow-fiber
ultrafiltration for multiple microbe classes from water: A Bayesian approach. Journal of
Microbiological Methods 93, 3. 161-167.
Zacheus O. 2010. Talousveden valvonta ja laatu vuonna 2008, Yhteenveto
viranomaisvalvonnan tuloksista. Terveyden Ja Hyvinvoinnin Laitoksen Avauksia 18.
http://www.thl.fi/thl-client/pdfs/36e9255a-2e2c-409a-ac0f-d2239eccc439.
82
Zacheus O. ja Miettinen I.T. 2011. Increased information on waterborne outbreaks through
efficient notification system enforces actions towards safe drinking water. Journal of Water and
Health 9, 4. 763-772.
Zamparo O. ja Comper W. 1990. Model Anionic Polysaccharide Matrices Exhibit Lower
Charge Selectivity than is Normally Associated with Kidney Ultrafiltration. Biophysical
Chemistry 38, 1-2. 167-178.
Zuckerman U., Armon R., Tzipori S. ja Gold D. 1999. Evaluation of a portable differential
continuous flow centrifuge for concentration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts
from water. Journal of Applied Microbiology 86, 6. 955-961.
Zuckerman U. ja Tzipori S. 2006. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for
monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. Journal of
Applied Microbiology 100, 6. 1220-1227.