1. No category

NUORET TUTKIJAT 2015
Biokemian laitos
NUORET TUTKIJAT 2015
Ida Alm-Ndiaye
Niklas Ekman
Riitta Haataja
Anna Haavisto
Kaisa Halme
Teppo Heimo
Pekka Heljakka
Marke Hovi
Rosita Johansson
Joni Juvonen
Annika Järvinen
Antti Kulmala
Susanna Lammi
Anna-Maija Lempainen
Annika Lyytikäinen
Moona Miettinen
Reijo Niemi
Johanna Paasio
Tiina Pasma
Antti Pihlava
Jonna Pörsti
Anssi Rantasalo
Essi Ruohisto
Johanna Salo
Anita Santana Sanchez
Elina Taipalus
Minna Tuovinen
Aleksi Uusitupa
Karlo Villa
Mira Virkki
Markus Virtanen
1
NUORET TUTKIJAT 2015 -ESITELMÄT
Tiistai 17.3.2015 - perjantai 20.3.2015
Alkaen kello 12.15
Arcanum Arc1-Sali
POSTERINÄYTTELY
Tiistai 17.3.2015 - perjantai 20.3.2015
Arcanum ala-aula
POSTERITAPAHTUMA
Keskiviikko 18.3.2015 13.35 -15.00
Arcanum ala-aula
EVÄITÄ TYÖELÄMÄÄN -PUHEENVUOROT
Torstai 19.3. klo 15.55
Perjantai 20.3. klo 14.35
Arcanum Arc1-sali
LOPPUSANAT
Perjantai 20.3.2015 kello 15.10
2
Tiistai 17.3.2015
Sessio I
Puheenjohtaja: Kati Thiel
Viikon avaus 12.15
Prof. Eevi Rintamäki
Molekulaarisen kasvibiologian professori
12.25
Anita Santana Sanchez MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA
Potential of native microalgae strains grown in wastewater for biodiesel
production in the Nordic climate
12.45
Essi Ruohisto MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA
Quest for the interaction partners of flv4-sll0218-flv2 operon-encoded proteins
in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
13.05 – 13.25 TAUKO 20 minuuttia
TIISTAI 17.3.2015 13.25 – 14.45
Sessio II
Puheenjohtaja: Jarmo Käpylä
13.25
Elina Taipalus BIOKEMIA
Soluväliaineen vaikutus eturauhassyöpäsolujen lääkeaineherkkyyteen
13.45
Jonna Pörsti BIOKEMIA
Prk-proteiinien aktiivisuuden tai ilmenemisen eston vaikutukset
Caenorhabditis elegans –sukkulamadoissa
14.05
Reijo Niemi BIOKEMIA
Fagolysosomaalisten hapettavien aineiden toksisuus E. colia kohtaan
3
14.25
Moona Miettinen BIOKEMIA
Parechovirustyyppien 1 ja 3 pH-riippuvainen endosytoosi
14.45 – 15.05 TAUKO 20 minuuttia
TIISTAI 17.3.2015 15.05 – 16.15
Sessio III
Puheenjohtaja: Maaria Kortesniemi
15.05
Antti Väisänen
Luonnontieteiden Akateemisten Liitto LAL ry
”Katsaus bioalan työllisyyteen ja työelämässä tarvittavat taidot”
15.35
Rosita Johansson ELINTARVIKEKEHITYS DI
Uuden kananmunajalosteen tuotekehitys
15.55
Kaisa Halme ELINTARVIKEKEHITYS FM
Kauran beetaglukaanin vaikutus puolukan aistittavaan laatuun
4
KESKIVIIKKO 18.3.2015 12.15 – 13.35
Sessio IV
Puheenjohtaja: Leenamaija Mäkilä
12.15
Mira Virkki ELINTARVIKEKEHITYS DI
Omenan fenoliset yhdisteet siiderin valmistusprosessissa
12.35
Karlo Villa ELINTARVIKEKEHITYS DI
Nestemäisen hiilidioksidiuuttomenetelmän mallintaminen ja mausteuutteiden
analyysiin tarkoitetun kaasukromatografisen menetelmän kehittäminen
12.55
Riitta Haataja ELINTARVIKEKEHITYS DI
Flavonolien biosynteesi tyrnin (Hippophaë rhamnoides L.) marjoissa
13.15
Johanna Paasio ELINTARVIKEKEHITYS DI
Suolan korvaaminen leivässä – vaikutus makuun ja miellyttävyyteen
KESKIVIIKKO 18.3.2015 13.35 -15.00
Posterisessio
Arcanum ala-aula
Opiskelijat postereidensa äärellä
Tarjoilua
5
KESKIVIIKKO 18.3.2015 15.00 – 16.20
Sessio V
Puheenjohtaja: Juhani Aakko
15.00
Aleksi Uusitupa ELINTARVIKEKEMIA
Kasvi- ja marjauutteiden antioksidanttikapasiteetin määritys TRAPmenetelmää käyttäen
15.20
Tiina Pasma ELINTARVIKEKEMIA
Prosessoidun maidon ja raakamaidon aiheuttamat vatsaoireet ja aterian
jälkeinen aineenvaihdunta tutkimushenkilöillä
15.40
Johanna Salo ELINTARVIKEKEMIA
Sinisten perunoiden antosyaniinit ja aterianjälkeinen glykemia
16.00
Markus Virtanen ELINTARVIKEKEMIA
Mausteiden ja yrttien haihtuvien yhdisteiden aistiminen
6
TORSTAI 19.3.2015 12.15 – 13.15
Sessio VI
Puheenjohtaja: Henna Päkkilä
12.15
Anna Haavisto BIOTEKNIIKKA DI
Lihasperäiselle kreatiinikinaasille spesifisen immunomäärityksen suunnittelu
ja automatisointi
12.35
Minna Tuovinen BIOTEKNIIKKA DI
Mikropartikkelit kiintokantajina potilasläheisessä hepatiitti B -määrityksessä
12.55
Marke Hovi MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA
DIAGNOSTIIKKA
Lysosomaalisten kertymäsairauksien seulonnassa käytettävän
reagenssikomponentin valmistusprosessin karakterisointi
13.15 - 13.35 TAUKO 20 minuuttia
TORSTAI 19.3.2015 13.35 – 14.35
Sessio VII
Puheenjohtaja:Markus Vehniäinen
13.35
Pekka Heljakka BIOTEKNIIKKA DI
Upkonvertoivien nanopartikkelien luminesenssin tehostaminen orgaanisten
kromoforien avulla
13.55
Joni Juvonen BIOTEKNIIKKA DI
Panossyöttökasvatusprosessin automatisointi
14.15
Anssi Rantasalo BIOTEKNIIKKA DI
Modular and tunable gene expression system for Saccharomyces cerevisiae
14.35-14.55 TAUKO 20 minuuttia
7
TORSTAI 19.3.2015 14.55 – 16.20
Sessio VIII
Puheenjohtaja: Susanne Lahdenperä
14.55
Anna-Maija Lempainen BIOTEKNIIKKA DI
Kelaattikomplementaatioon perustuvan integroidun DNA:n monistus- ja
detektointimenetelmän kehitys
15.15
Annika Järvinen BIOTEKNIIKKA DI
Munasarjasyöpäspesifisen diagnostiikkamäärityksen kehittäminen: CA125lektiinimääritys
15.35
Antti Pihlava BIOTEKNIIKKA DI
Upkonvertoivien nanopartikkelileimojen erottelumenetelmät
15.55 Aluminpuheenvuoro
Petri Susi
Turun yliopisto, Biolääketieteen laitos, Virusoppi
8
PERJANTAI 20.3.2015 12.55 – 13.15
Sessio IX
Puheenjohtaja: Heidi Hyytiä
12.15
Ida Alm-Ndiaye MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA
DIAGOSTIIKKA
Veritäpläpohjaisen fragiili X -testauksen pystyttäminen
12.35
Annika Lyytikäinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA
DIAGNOSTIIKKA
Heterogeeninen upkonvertoiviin nanopartikkeleihin perustuva
immunomääritys sydänspesifiselle troponiini I:lle
12.55
Antti Kulmala MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA
DIAGNOSTIIKKA
Fab-fragmentin DNA-sekvenssin vaikutus Escherichia colin kasvuun ja tuottoominaisuuksiin
13.15 – 13.35 TAUKO 20 minuuttia
9
PERJANTAI 20.3.2015 13.35 – 15.25
Sessio X
Puheenjohtaja: Janne Leivo
13.35
Teppo Heimo MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA
DIAGNOSTIIKKA
Rekombinanttivasta-aineen affiniteetin parantaminen suunnatun evoluution
avulla
13.55
Susanna Lammi MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA
DIAGNOSTIIKKA
Faaginäyttötekniikalla uusia vasta-aineita luustolihasperäiselle troponiini I:lle
14.15
Niklas Ekman MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA
DIAGNOSTIIKKA
Eksosomispesifisten vasta-aineiden kehittäminen eturauhassyövän seulontaan
14.35 Alumnipuheenvuoro
Olli Sjövall
Terveysvalvonnan johtaja, Pyhäjärviseudun ympäristötoimisto, Säkylä kunta
15.10 Loppupuheenvuoro
Prof. Eevi Rintamäki
Molekulaarisen kasvibiologian professori
10
Potential of native microalgae strains grown in wastewater for biodiesel
production in the Nordic climate
Anita Santana Sanchez
Supervisors: Ph.D. Fiona Lynch & Ph.D. Yagut Allahverdiyeva-Rinne
MOLECULAR PLANT BIOLOGY
The imminent depletion of fossil fuels and their significant contribution to
environmental pollution have increased the need for new alternatives which are clean,
sustainable and renewable. Microalgae have been shown to be a promising biodiesel
feedstock, predicted to outperform traditional energy crops on an area basis. An
exceptional adaptability to changes in environmental conditions is an advantage
towards a more efficient and inexpensive production of biodiesel. Drastic seasonal
variations in temperature and daylight availability are characteristic for Nordic
climates. The screening of Nordic native microalgae strains to find well-adapted
organisms may potentially reduce the energy input in the cultivation process.
We have assessed eight native Finnish microalgae strains, using synthetic municipal
wastewater as a low-cost nutrient source, for their lipid and biomass productivity
coupled with nutrient removal ability. A one-step in situ transesterification method
was employed to maximize the coverage of lipids detected in the whole microalgal
biomass. These lipids were converted to Fatty Acid Methyl Esters (FAME) and
identified by GC/MS analysis.
Native Finnish green algae UHCC0027 stood out as the best candidate for dual
application in wastewater nutrient removal and as a biodiesel feedstock, having high
lipid content and suitable fatty acids composition (C16:0, 20.8%; C18:1, 25.29%;
C18:2, 15.76%; C18:3, 24.29%). However; further optimizations of cultivation
conditions are needed to meet economically feasible biofuel production using this
native strain.
Keywords: Native microalgae, biodiesel, wastewater
11
Quest for the interaction partners of flv4-sll0218-flv2 operon-encoded proteins in
cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
Essi Ruohisto
Supervisor: PhD, docent Natalia Battchikova
MOLECULAR PLANT BIOLOGY
Oxygenic photosynthesis creates a highly oxidizing intracellular environment and
therefore several photoprotective mechanisms have evolved to safeguard the
photosynthetic machinery from oxidative stress. Recently, the flv4-sll0218-flv2 operon
was shown to have a role in photoprotection in cyanobacteria. The operon encodes
flavodiiron proteins Flv4 and Flv2 along with a small hydrophobic protein (Sll0218 in
Synechocystis sp. PCC 6803) with unknown function. It is strongly suggested that Flv2
and Flv4 form a heterodimer which is capable of rapid electron transfer from FMN
moiety of Flv2 to diiron centre of Flv4 and safeguards photosystem II activity by
sequestering the excess of electrons from the photosynthetic chain. Sll0218 has been
shown to be associated with so far unidentified large protein complex. The exact
photoprotection mechanisms of Flv4/Flv2 heterodimer and function of Sll0218 remain
to be clarified.
The aim of our study was to elucidate the interaction partners of flv4-sll0218-flv2
operon-encoded proteins by purifying the proteins with affinity chromatography. For
that purpose C- and N- termini of Flv2 and Flv4 were tagged with either FLAG-tag or
STREP-tag. Further, His6-tag was attached to C-terminus of Sll0218 but this approach
resulted in a loss of Flv2 production. Stable expression was obtained only for NFLAG-Flv4, C-STREP-Flv2 and Sll0218-His6. However, purification of tagged Flv2
and Flv4 with standard affinity chromatography method proved to be inefficient. We
speculate that attached tags might be enclosed inside the putative Flv2/Flv4
heterodimer, and thus binding to corresponding affinity resin is obstructed.
Nevertheless, Flv2/Flv4 heterodimer formation got further support from our results as
the presence of Flv2 protein was verified in N-FLAG-Flv4 preparation by immunoblot
analysis. Purification of Sll0218-His6 was more successful, but the interaction partners
of this protein remain to be elucidated. Next we will reintroduce Flv2 into a system
that expresses Flv4 and Sll0218-His6 in order to study further the possible interactions
of these proteins.
Keywords: flavodiiron proteins, Sll0218, flv-operon, photoprotection, affinity
chromatography
12
13
Soluväliaineen vaikutus eturauhassyöpäsolujen lääkeaineherkkyyteen
Elina Taipalus
Ohjaajat: FM Marjaana Ojalill ja prof. Jyrki Heino
BIOKEMIA
Syöpäkasvaimen mikroympäristön tiedetään vaikuttavan syövän etenemiseen ja
invaasioon. Mikroympäristössä syöpäsolujen aktivoimat fibroblastit tuottavat liukoisia
tekijöitä ja muokkaavat soluväliainetta siten, että mikroympäristö muuttuu syövän
etenemisen kannalta edulliseksi. Tätä dynaamista ympäristöä pidetään yhtenä syynä
eturauhassyövän lääkeresistenttiyden kehittymiseen. Mikroympäristön arvellaan myös
ylläpitävän kantasolunkaltaista solupopulaatiota, joka eturauhassyöpäsoluilla
tunnistetaan α2β1-integriinin, CD44:n ja CD133:n korkean ilmentymisen perusteella.
Erikoistyössä tutkittiin, miten eturauhaskudoksesta eristettyjen fibroblastien tuottama
soluväliaine
vaikuttaa
DU145-eturauhassyöpäsolujen
lääkeaineherkkyyteen.
Fibroblastien tuottaman soluväliaineen, kollageeni I:n tai fibronektiinin päällä
kasvavat DU145-solut altistettiin doketakseli-syöpälääkkeelle ja eloonjääneet solut
havaittiin kolorimetrisesti. Eloonjääneiden solujen α2-integriinin ja CD44:n
ilmentymistasot analysoitiin lisäksi virtaussytometrisesti. Lopuksi määritettiin α2integriinin ilmentymiseen perustuvien α2Matala ja α2Korkea alapopulaatioiden
doketakseliherkkyys.
Fibroblastien tuottaman soluväliaineen ei havaittu suojaavan DU145-soluja
doketakselilta in vitro: lääkkeen sytotoksisuutta kuvaavat IC50-arvot olivat sekä
soluväliaineella että yksittäisillä soluväliaineen proteiineilla 18 – 20 nM.
Lääkekäsittelystä eloonjääneet solut ilmensivät kuitenkin tilastollisesti merkitsevästi
enemmän α2-integriiniä ja CD44:ää (P < 0.05, parittainen t-testi). Vastaavasti α2Korkea
alapopulaatiossa CD44:n ilmentyminen oli lisääntynyt ja doketakselikäsittelystä
eloonjääneiden solujen määrä hieman suurentunut. Tämä viittaa siihen, että vaikka
suurin osa syöpäsoluista on soluväliaineesta riippumatta herkkiä doketakselille, pieni
α2Korkea/CD44Korkea fenotyypin solupopulaatio jää henkiin ja mahdollisesti edistää
doketakseliresistenttiyttä. Lääkeresistenttiyden ja α2-integriinin lisääntyneen
ilmentymisen välisen yhteyden vuoksi tutkimukset kohdistuvat jatkossa α2-integriinin
ja soluväliaineen vuorovaikutuksen selvittämiseen.
Asiasanat: Eturauhassyöpä, soluväliaine, doketakseliherkkyys, α2Korkea/CD44Korkea
14
Prk-proteiinien aktiivisuuden tai ilmenemisen eston vaikutukset Caenorhabditis
elegans -sukkulamadoissa
Jonna Pörsti
Ohjaajat: Dos. Päivi Koskinen, FM Niina Santio
BIOKEMIA
Prk-proteiinit (engl. Pim-related kinase) ovat sukkulamadoista löydettyjä nisäkkäiden
Pim-kinaasien ortologeja. Pim-kinaasit ovat onkogeenisiä seriini/treoniiniproteiinikinaaseja, joiden aktiivisuutta soluissa säädellään pääasiassa transkription
kautta. Niitä ilmennetään liiallisesti niin kiinteissä kuin hematologisissa kasvaimissa,
jolloin niiden yliaktiivisuus edistää syöpäsolujen liikkuvuutta ja elinkykyä. Siksi Pimkinaasit ovatkin lupaavia syöpälääkekehittelyn kohteita. Pienimolekyyliset Piminhibiittorit estävät myös Prk-proteiinien aktiivisuutta, joten niiden avulla voidaan
tutkia Pim-ortologien säätelemiä, evolutiivisesti konservoituneita fysiologisia ilmiöitä.
C. elegans –sukkulamadon kahden Prk-proteiinin toimintaa tutkittiin aluksi in vitro.
Prk2- ja Prk1c-kinaaseja tuotettiin E. coli –bakteerisoluissa GST-fuusioproteiineina.
Proteiinien ilmentymistä tarkastettiin SDS-PAGE –geeliajomenetelmällä ja niiden
fosforylaatiokykyä tutkittiin radioaktiivisen ATP:n (isotooppi 32P) avulla. Positiivisena
kontrollina käytettiin ihmisen Pim1 –kinaasia, kinaasien substraattina NFATc1transkriptiotekijää. Sitten Prk-proteiinien inhibition fysiologisia vaikutusta tutkittiin
sukkulamadoilla kemotaksiakokein, joissa joko käytettiin Pim-inhibiittoreita tai
hiljennettiin Prk-proteiinien tuotantoa RNA-interferenssin avulla. Hiljennyksen
onnistumisen varmistamiseksi ja Prk2-proteiinin ilmentymisalueiden tunnistamiseksi
suunniteltiin GFP-Prk2 –fuusiokonstrukti, joka on tarkoitus siirtää sukkulamatoihin
mikroinjektiolla. Vastaavalla GFP-Prk1-konstruktilla on jo osoitettu, että Prk1 ilmenee
hermostossa ja suolistossa.
Tutkimuksessa havaittiin, että Prk2-kinaasi toimii Pim-kinaasin tavoin in vitro.
Kaikkien Pim-perheen jäsenten aktiivisuutta inhiboiva pyrrolokarbatsoliyhdiste
DHPCC-9 vähentää sekä Prk2:n autofosforylaatiota että NFATc1-substraatin
fosforylaatiota. Kemotaksiakokeet osoittivat, että se myös heikentää sukkulamatojen
hajuaistia. Sen sijaan Pim3-spesifiset bentsoatsuleeniyhdisteet eivät merkittävästi
vaikuttaneet Prk2:n aktiivisuuteen tai sukkulamatojen kemotaksiaan. RNAhiljennyksestä saatiin vaihtelevia tuloksia, minkä takia olisi hyvä osoittaa
hiljennyskonstruktien toimivuus GFP-Prk –fuusioproteiinien avulla.
Asiasanat: Pim-kinaasit, Prk (Pim related kinase), Caenorhabditis elegans, kemotaksia
15
Fagolysosomaalisten hapettavien aineiden toksisuus E. colia kohtaan
Reijo Niemi
Ohjaajat: FM Janne Atosuo, Dos. Esa-Matti Lilius
BIOKEMIA
Fagosytoosi on prosessi, jossa immuunijärjestelmän solut–keskeisimpinä neutrofiilit,
monosyytit ja makrofagit–ottavat sisäänsä ja tuhoavat patogeenejä. Fagosyytti ympäröi
kohteensa solukalvollaan ja ottaa sen sisään sytoplasmaan fagosomiksi kutsutun
vakuolin sisällä. Sytoplasmassa fagosomi yhdistyy antimikrobiaalisia aineita
sisältäviin lysosomeihin ja rakkuloihin muodostaen fagolysosomin, jossa kohde
tuhotaan joko hapesta riippuvaisissa tai riippumattomissa prosesseissa.
Happiyhdisteistä keskeisiä ovat NADPH-oksidaasin valmistamasta superoksidista
dismutaatioreaktiolla muodostuva vetyperoksidi (H2O2) ja myeloperoksidaasin (MPO)
valmistama hypokloriitti (HOCl), joiden toimintaa tässä tutkittiin.
H2O2:n, HOCl:n ja MPO:n tehoa tarkasteltiin eri konsentraatioilla ja
bakteeripitoisuuksilla ja eri pH-arvoissa. Koeorganismina käytettiin Photorhabdus
luminescensin lusiferaasigeeneillä transfektoituja Escherichia coli K12 -soluja, joiden
bioluminesenssia seuraamalla saatiin tietoa tappoprosessin etenemisestä. Hapettavien
aineiden mahdollisesti indusoimaa ohjelmoitua solukuolemaa tutkittiin leimaamalla E.
colin genomi radioaktiivisella tymidiinillä, erottamalla pilkkoutunut DNA ehjästä, ja
vertaamalla fraktioiden radioaktiivisuutta.
Yhdisteiden tappokäyrissä havaittiin eroja, jotka saattavat viitata erilaisiin
tappomekanismeihin. H2O2-pitoisuuden kasvu johti tehokkaampaan tappoon, kun taas
HOCl-konsentraation kasvulla ei ollut vaikutusta. HOCl:llä suurempi bakteeripitoisuus
heikensi tappoa, kun taas H2O2:lla bakteeripitoisuus ei vaikuttanut merkittävästi
tappotehoon. MPO-reaktioissa tappo oli korkeilla pH-arvoilla H2O2:n kaltaista, mutta
tehostui merkittävästi alemmilla pH-arvoilla, mikä viittaa MPO:n inhibitioon korkeissa
pH:issa. H2O2-tappoon pH ei vaikuttanut merkittävästi, mutta HOCl:llä alempi pH
tehosti tappoa huomattavasti. Ohjatun solukuoleman markkerina käytetyn DNA:n
pilkkoutumisen tutkiminen on vielä kesken.
Asiasanat: fagosytoosi, Escherichia coli, ohjelmoitu solukuolema, myeloperoksidaasi
16
17
Parechovirustyyppien 1 ja 3 pH-riippuvainen endosytoosi
Moona Miettinen
Ohjaajat: FM Pirjo Merilahti, Dos. Petri Susi
BIOKEMIA
Ihmisen parechovirukset (HPeV) kuuluvat pikornaviruksiin ja niistä tunnetaan tällä
hetkellä 16 genotyyppiä. Ne ovat positiivissäikeisiä RNA-viruksia, joiden genomi on
noin 7300 emästä pitkä ja se on pakattu ikosahedraaliseen proteiinikuoreen.
Parechovirukset aiheuttavat pääasiassa lieviä ruuansulatuskanavaan tai hengitysteihin
kohdistuvia oireita, mutta myös aivokalvontulehduksia ja vakavia yleisinfektioita,
etenkin pienillä lapsilla. Osa viruksista läpäisee solukalvon suoraan fuusioitumalla,
mutta valtaosa tarvitsee endosytoosia. Endosytoosissa virus sitoutuu solupinnan
reseptoriin, minkä jälkeen solukalvolta kuroutuu sytoplasman puolelle vesikkeli
(endosomi), jossa virus kulkeutuu replikaatiopaikkaansa. Endosytoosimekanismit
vaihtelevat solu- ja viruskohtaisesti. Endosytoosi voi olla esimerkiksi
klatriinivälitteistä, makropinosytoosia, kaveoliiniin tai lipidilaittoihin liittyvää.
Endosomit kulkeutuvat ja muokkautuvat liikkuessaan solulimassa, jolloin muun
muassa niiden sisäinen pH voi laskea. Tämän ajatellaan olevan oleellista joidenkin
virusten, kuten parechovirusten, infektiokyvylle
Tässä erikoistyössä parechovirustyyppien 1 ja 3 pH-riippuvaista endosytoosia tutkittiin
inhibitiokokeiden avulla. Infektiokokeiden avulla valittiin käyttöön HeLa Ohio ja
A549-solulinjat, joita molemmat virustyypit infektoivat. Käytössä oli kymmenen
erilaista inhibiittoria, jotka vaikuttavat eri tavoilla endosomeihin tai niiden
kulkeutumiseen solussa. Osa oli muun muassa vakuolaarisen H+ATPaasin estäjiä,
kuten bafilomysiini A1 ja konkanamysiini A, osa ionoforeja, esimerkiksi monensiini ja
nigerisiini. Muilla mekanismeilla toimii muun muassa käytetyt amantadiini,
niklosamidi ja klorokiini. Soluille lisättiin inhibiittoria, jonka annettiin vaikuttaa
määrätty aika, minkä jälkeen lisättiin joko HPeV-1:ä tai HPeV-3:ä. Inhibiittorin
pitoisuus pidettiin koko ajan vakiona. Inhibiittorien vaikutusta infektioon tutkittiin
fluoresenssimikroskoopin avulla. Immunofluoresenssissa käytettävät vasta-aineet
puhdistettiin soluaffiniteettipuhdistuksella HeLa Ohio -soluilla.
Tutkimuksissa havaittiin, että käytetyillä pitoisuuksilla inhibiittorit vaikuttavat
parechovirusten infektioihin aiheuttamatta solutoksisuutta. Osalle inhibiittoreista pitää
vielä optimoida sopiva käyttöpitoisuus. Tutkimuksessani selvitän vielä toimivien
inhibiittorien tarkkoja vaikutuskohteita ja sitä, mihin vaiheeseen infektioita yhdiste
vaikuttaa sekä onko parechovirustyyppien 1 ja 3 välillä huomattavia eroja.
Asiasanat: parechovirus, endosytoosi, inhibiittori, infektio
18
Uuden kananmunajalosteen tuotekehitys
Rosita Johansson
Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja FT Jukka Kaitaranta
ELINTARVIKEKEHITYS DI
Kananmunan tuotekehitystyö ei Suomessa ole pysynyt muun elintarviketeollisuuden
tahdissa. Kuitenkin jalostevalikoimaa kasvattamalla voitaisiin parantaa myös
kuorimunatuotannosta syntyvän hävikin uudelleenhyödyntämismahdollisuuksia. Yksi
kananmunajalosteiden tuotekehitystä hillinnyt tekijä on kananmunan lämpöherkkyys
ja sen seurauksena kananmunan rakenteessa tapahtuvat irreversiibelit muutokset, jotka
rajoittavat lämpökäsittelymenetelmien hyödyntämistä mikrobiologisen laadun
takaamisessa.
Tämän työn tavoitteena oli selvittää, voidaanko kananmunaa ja erityisesti sen
valkuaista
pääraaka-aineena
hyödyntämällä
kehittää
proteiinipitoinen
kananmunajaloste. Tätä varten ideoitiin salaattijuustokuutioiden tavoin käytettävä
valkuaistuote, jonka tuotekehitysprosessi sisälsi muun muassa tuotteen
valmistusteknisten ratkaisujen kartoittamista sekä erilaisten aromi- ja
maustevaihtoehtojen testaamista. Lisäksi tuotekehitystyön yhteydessä selvitettiin
korkeapainepastöroinnin vaikutuksia koaguloituneen valkuaisen sekä mahdollisten
aromi- ja mausteyhdistelmien aistittavaan laatuun. Työn lopuksi valikoitujen
tuotekehitysversioiden miellyttävyyttä ja hyväksyttävyyttä selvitettiin aistinvaraisen
arvioinnin kuluttajatestein (70 arvioijaa; 73 % naisia, 27 % miehiä), joissa
mielenkiinnon kohteena olivat näytteiden ulkonäön, hajun, maun ja rakenteen tuttuus,
miellyttävyys ja voimakkuus, arvioijien taustamuuttujat ja kulutustottumukset sekä
tuotekonseptin markkinapotentiaali. Näytteinä käytettiin neljää tuotekehitysversiota
sekä kahta maustamatonta, erilaisiin liemipohjiin pakattua valkuaisnäytettä.
Työstä saatujen tulosten perusteella korkeapainepastörointia voidaan pitää
potentiaalisena vaihtoehtona koaguloituneen valkuaisen säilyvyysajan pidentämiselle.
Kuitenkin aistittavassa laadussa raportoidut muutokset rajaavat käytettävissä olevaa
paine- ja käsittelyaikahaarukkaa. Kuluttajatestien perusteella tuotekonsepti yleisesti
koettiin kiinnostavaksi, minkä lisäksi tuotekehitysversioista erityisesti kahdella
todettiin olevan jo sellaisenaan markkinapotentiaalia. Valkuaisesta valmistetut
salaatinlisukkeet herättivät kuluttajatestiin osallistuneissa arvioijissa selvää
kiinnostusta, minkä perusteella voitaisiin ennustaa myös muunlaisille
kananmunajalosteille olevan kysyntää.
Asiasanat: valkuainen, tuotekehitys, korkeapainepastörointi, aistittava laatu
19
Kauran beetaglukaanin vaikutus puolukan aistittavaan laatuun
Kaisa Halme
Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen, prof. Baoru Yang
ELINTARVIKEKEHITYS FM
Puolukan vuosittainen satomäärä on yli 250 miljoonaa kiloa, josta poimitaan vain noin
5-10 %. Terveysvaikutusten tiedostamisesta huolimatta maun karvaus ja astringoivuus
vaikuttavat puolukan hyödynnettävyyteen merkittävästi. Puolukassa on paljon sekä
kuitua että fenolisia yhdisteitä. Fenoliset yhdisteet toimivat antioksidantteina ja niillä
on havaittu olevan myös antimutageenisia, antikarsinogeenisia ja antimikrobisia
ominaisuuksia. Kauran ja ohran beetaglukaanille on myönnetty EU:n hyväksymät
terveysväittämät, joiden mukaan se alentaa aterianjälkeistä glukoositasoa ja veren
rasvapitoisuutta. Yli 3 grammaa kauran beetaglukaania vuorokaudessa alentaa myös
veren LDL- ja kokonaiskolesterolia.
Työn tavoitteena on tarkastella kauran beetaglukaanin vaikutusta puolukkamehun
aistinvaraisiin ominaisuuksiin. Puolukkamehusta valmistetaan näytteitä 35 % - 100
%:n konsentraatioilla, joissa on eri pitoisuuksilla lisättynä beetaglukaania sekä erilaisia
muita kaupallisia sakeuttamisaineita, kuten pektiiniä, ksantaani- ja guarkumia.
Mehuun lisättävän beetaglukaanin molekyylien koko on tärkeä, sillä viskositeetti
riippuu liukoisuudesta, konsentraatiosta sekä beetaglukaanin molekyylipainosta.
Korkean molekyylipainon beetaglukaani tuottaa paremman viskositeetin kuin alhaisen
molekyylipainon samalla konsentraatiolla mitattaessa. Mehun eri pitoisuuksiin lisätään
kahta eri beetaglukaanivalmistetta, ensimmäinen on suuren molekyylipainon
beetaglukaani ja toinen pienen. Näistä suoritetaan aistinvaraiset laadunarvioinnit sekä
Turun AMK:n kanssa yhteistyössä reologisia mittauksia kuten viskositeettiin ja
elastisuuteen liittyviä testejä. Lisäksi mehuista selvitetään fenoliset yhdisteet
spektrofotometrisin menetelmin.
Tuotekehityksen onnistuessa kyseessä olisi täysin kotimainen mehujuoma, jossa on
vain puhtaita luonnon omia raaka-aineita ilman sokeria. Ravitsemuksellisesti
tuotteessa on yhdistetty antioksidanttivaikutus, suoliston toimintaa edistävä kuitu sekä
kolesterolia ja veren glukoositasoa alentava vaikutus.
Asiasanat: aistittava laatu, beetaglukaani, puolukka, reologia, viskositeetti
20
21
Omenan fenoliset yhdisteet siiderin valmistusprosessissa
Mira Virkki
Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja dos. Jukka-Pekka Suomela
ELINTARVIKEKEHITYS DI
Siideri on fermentoitu alkoholijuoma, joka koostuu pääasiassa vedestä, sokerista,
orgaanisista hapoista, fenolisista yhdisteistä ja haihtuvista yhdisteistä. Fenolisilla
yhdisteillä voi olla vaikutusta siiderin aistittaviin ominaisuuksiin, kuten karvauteen ja
astringoivuuteen. Lopputuotteen fenolisten yhdisteiden profiiliin vaikuttavat
omenalajike, omenan kypsyysaste sekä siiderin valmistusprosessi. Työn tavoitteena on
selvittää eri omenalajikkeiden, eri kypsyysasteisten omenien ja valmistusprosessissa
käytettyjen hiivojen vaikutusta omenasiiderin fenolisten yhdisteiden koostumukseen
sekä pitoisuuksiin. Työssä selvitetään erityisesti fermentoinnin vaikutusta siiderin
fenolisiin yhdisteisiin.
Tutkimus tehdään yhteistyössä CCFFT:n (Competence Center of Food and
Fermentation Technologies, Tallinna, Viro) kanssa. Työssä sovelletaan
mustaherukkamehun fenolisten yhdisteiden analysointiin käytettyä menetelmää
omenasiidereille. Omenasiiderin fenoliset yhdisteet kerätään talteen uuttamalla
etyyliasetaatilla ja yhdisteet määritetään kvalitatiivisesti sekä kvantitatiivisesti.
Yhdisteet erotetaan ja analysoidaan nestekromatografialla. Uuttomenetelmän ja
nestekromatografisen menetelmän kehitys tapahtuu ensin kaupallisilla siidereillä sekä
eri omenalajikkeilla. Varsinaisten siiderinäytteiden valmistus ja aistittavan laadun
analyysit tapahtuvat Virossa. Yhdisteitä tunnistetaan massa- ja UV-spektrien sekä
vertailuyhdisteiden ja kirjallisuuden perusteella.
Ensimmäisten tulosten perusteella kaupallisista siidereistä löytyi erityisesti
klorogeenihappoa ja muita kahvihapon johdannaisia sekä flavonoleja ja flavan-3-oleja.
Kaupallisilla siidereillä analysoidut näytteet olivat liian laimeita kvantitatiiviseen
analyysiin, joten uuttomenetelmä vaatii kehitystä ennen varsinaisten näytteiden
analysointia. Aiemmissa tutkimuksissa havaittiin erityisesti kversetiinin johdannaisten
ja klorogeenihapon pitoisuuksien vaihtelevan omenalajikkeesta riippuen. On
oletettavissa, että fermentointi vaikuttaa lopputuotteen fenolisten yhdisteiden
pitoisuuksiin.
Asiasanat:
omena,
massaspektrofotometri
siideri,
fenoliset
22
yhdisteet,
nestekromatografia,
Nestemäisen hiilidioksidiuuttomenetelmän mallintaminen ja mausteuutteiden
analyysiin tarkoitetun kaasukromatografisen menetelmän kehittäminen
Karlo Villa
Ohjaajat: FM Marika Kalpio, Prof. Baoru Yang, prof. Heikki Kallio
ELINTARVIKEKEHITYS DI
Nestemäinen hiilidioksidi (LCO2) on houkutteleva vaihtoehto mausteiden
aromikomponenttien uutossa käytettäväksi liuottimeksi. Turun yliopiston
elintarvikekemian osastolla on tutkittu LCO2-menetelmällä tuotettuja mausteuutteita
1980-luvulta lähtien. Ympäristöystävällisyyden ja myrkyttömyyden lisäksi LCO2:n
etuja ovat selektiivisyys aromaattisia yhdisteitä kohtaan ja prosessissa käytettävät
alhaiset lämpötilat. Haasteena on kuitenkin uutossa käytettävän paineastian sisällä
vallitsevien olosuhteiden määrittäminen ja prosessin seuraaminen.
LCO2-uutteiden analysointi kaasukromatografilla (GC) edellyttää uutteiden
komponenttien fraktiointia niiden haihtuvuuden mukaan. Jos uutteita ei fraktioida,
herkästi haihtuvat komponentit eluoituvat ja huonosti haihtuvat komponentit jäävät
kolonniin heikentäen sen suorituskykyä. Fraktioimattomia uutteita voidaan analysoida
laitteistolla, jossa kolonni on jaettu venttiilillä preparatiiviseen ja analyyttiseen osaan.
Diplomityön tarkoituksena on valmistaa mausteuutteita korianterista ja oreganosta
vaihtelemalla prosessin olosuhteita kuten liuottimen määrää, uuttoaikaa sekä
liuottimen tiheyttä. Fraktioimattomien uutteiden koostumus analysoidaan liekkiionisaatiodetektorilla varustetulla kaasukromatografilla. Analyysissä hyödynnetään
uutteille kehitettävää menetelmää. Uutteiden koostumusten perusteella muodostetaan
malli, joka kuvaa valittujen komponenttien saantoa prosessin parametrien funktiona.
Asiasanat: soxhlet-uutto, mausteuute, nestemäinen hiilidioksidi, kaasukromatografia
23
Flavonolien biosynteesi tyrnin (Hippophaë rhamnoides L.) marjoissa
Riitta Haataja
Ohjaajat: MMT Anssi Vuorinen ja prof. Baoru Yang
ELINTARVIKEKEHITYS DI
Tyrni (Hippophaë rhamnoides L.) on karuja ja niukkaravinteisia olosuhteita hyvin
kestävä piikikäs pensaskasvi. Luonnonvaraisena kasvavat tyrnit esiintyvät laajalla
alueella Euraasian mantereella ja luontaisten kasvupaikkojen lisäksi se menestyy myös
viljelykasvina. Tyrnin marjat sisältävät runsaasti fenolisiin yhdisteisiin luokiteltuja
flavonoideja, joilla on tutkitusti todettu olevan terveyttä edistäviä vaikutuksia.
Flavonoidien ryhmään kuuluvat flavonolit ovat viime aikoina olleet monipuolisesti
tutkimuksen kohteena. Etenkin tyrnin hedelmälihassa esiintyy flavonoleista erityisesti
kversetiiniä,
isoramnetiinia,
myrisetiiniä
ja
kamferolia.
Suomalaisista
luonnonkannoista on jalostettu kestävät sekä runsassatoiset tyrnilajikkeet Tytti ja
Terhi.
Diplomityön tutkimuskohteena ovat Tytti- ja Terhi-tyrnilajikkeista vuosina 2012 ja
2013 kerätyt marjat, joiden sisältämien flavonolien muodostumista selvitetään
geenitasolla. Näytteet on kerätty kasvukauden aikana viikoittain Kittilästä ja Turusta.
Työn tarkoituksena on tutkia kuinka eri kehitysvaiheessa olevien marjojen tiettyjen
biosynteesigeenien ilmenemistasot muuttuvat ja kuinka eri lajike sekä kasvuympäristö
vaikuttavat näiden geenien ilmenemistasoihin. Marjoista on eristetty sekä
hedelmälihan
että
siementen
kokonais-RNA
CTAB-puskurilla
ja
litiumkloridisaostuksella.
Eristetty
RNA
syntetisoidaan
cDNA:ksi
käänteistranskriptaasireaktiolla
ja
cDNA:sta
määritetään
flavonolien
biosynteesigeenien
ilmenemistasot
kvantitatiivisella,
reaaliaikaisella
polymeraasiketjureaktiolla (engl. quantitative real-time polymerase chain reaction,
qPCR).
Tutkimus on vasta alussa, joten lopullisia tuloksia ei ole vielä esitettävänä. Työ on
aloitettu etsimällä tyrnin transkriptomista kiinnostuksen kohteena olevien flavonolien
biosynteesigeenejä
lituruohon
vastaavien
geenien
koodaamien
aminohapposekvenssien perusteella. Valittujen geenien ilmenemistasojen qPCRanalyysiin on suunniteltu ja testattu toimivia alukkeita. Lopullisten tulosten odotetaan
vahvistavan oletusta, että valittujen geenien ilmenemistasot muuttuvat lajikkeen,
kasvukauden ja -ympäristön mukaan. Lisäksi tiettyjen geenien yhtäaikainen
ilmentyminen voisi viitata siihen, että ne ovat saman geneettisen säätelyn alla.
Asiasanat: tyrni, Hippophaë rhamnoides L., fenoliset yhdisteet, flavonolit, geenien
ilmenemistaso
24
MAAHOVI OY
Vedenkäsittelyä
vuodesta
1965
25
Suolan korvaaminen leivässä – vaikutus makuun ja miellyttävyyteen
Johanna Paasio
Ohjaajat: ETM Kristiina Tuukkanen, FT Oskar Laaksonen, dos. Antti Knaapila, prof.
Baoru Yang
ELINTARVIKEKEHITYS DI
Ruokasuolan eli natriumkloridin liiallisen käytön on todettu aiheuttavan terveydellisiä
haittoja, mm. lisääntyneen riskin sairastua sydän- ja verisuonitauteihin. Suolan
saantisuositus Suomessa on 5 g/vrk, joka ylittyy väestötasolla. Runsaimmat
suolansaannin lähteet ovat vilja- ja lihavalmisteet. Suolan saannin vähentämiseksi on
kiinnitetty huomiota yhä enemmän leivän suolapitoisuuteen. Tässä työssä tutkittiin
yhteistyössä Fazerin tutkimusyksikön kanssa suolan korvaamista ja sen vaikutusta
vehnäleivän suolaisuuden aistimiseen sekä leivän maun miellyttävyyteen.
Tutkimukseen valittiin koemalliksi vehnävuokaleipä NaCl-pitoisuuksilla 1,2 %
(normaalisuolainen); 0,6 % ja 0,3 %. Korvaaviksi ainesosiksi valikoitui esikokeiden
perusteella kuivattu timjami ja suppilovahverojauhe pitoisuuksilla 0,2–0,3 %.
Korvaavia ainesosia lisättiin 0,6 % ja 0,3 % NaCl-leipiin. Suolan maun korvaamista
tutkittiin
analyyttisellä
tutkimusmenetelmällä
koulutetun
10-henkisen raadin avulla. Leipien hajun, maun ja kokonaisuuden miellyttävyyttä
tutkittiin kuluttajaraadin avulla. Kuluttajaraatiin osallistui 89 vapaaehtoista 20–74 vuotiasta (naisia 71 %) koehenkilöä. Muita tarkasteltavia ominaisuuksia olivat leivän
suolaisuuden sopivuus ja ostohalukkuus.
Analyyttisen tutkimuksen perusteella timjami ja suppilovahverojauhe eivät pystyneet
jäljittelemään suolan makua. Maun kokonaisvoimakkuus timjamia sisältäneissä
leivissä
ei
kuitenkaan
eronnut
normaalisuolaisesta
verrokkinäytteestä.
Kuluttajatutkimuksen perusteella 0,6 % NaCl-timjamileipä oli kokonaisuudeltaan
miellyttävämpi kuin saman NaCl-pitoisuuden omaava verrokkileipä (p<0,05), eikä
eroa havaittu normaalisuolaiseen leipään. Kuluttajista 33 % ostaisi kaikkein
todennäköisimmin 0,6 % NaCl-timjamileivän ja 30 % normaalisuolaisen leivän.
Kuvailevassa mieltymyskartoitus (PLS) -analyysissa kokonaismiellyttävyys korreloi
voimakkaammin maun kokonaisvoimakkuuden kanssa kuin pelkän suolaisen maun
voimakkuuden kanssa. Tulosten perusteella timjamilla on mahdollista korvata puolet
normaalisuolaisen vehnäleivän suolasta leivän miellyttävyyden tai ostohalukkuuden
kärsimättä.
Asiasanat: suolan korvaaminen, vehnäleipä, timjami, mieltymyskartoitus
26
Kasvi- ja marjauutteiden antioksidanttikapasiteetin määritys TRAP-menetelmää
käyttäen
Aleksi Uusitupa
Ohjaajat: Dos. Jukka-Pekka Suomela ja Prof. Baoru Yang
ELINTARVIKEKEMIA
Hengittämämme ilman happi on välttämätöntä ihmisille ja hapenkulutuksen
seurauksena ihmisen kehossa tapahtuu monia entsymaattisia ja ei-entsymaattisia
reaktioita, joissa syntyy reaktiivisia happiyhdisteitä. Antioksidanttien tarkoitus
elimistössä on neutralisoida näitä haitallisia reaktiivisia happiyhdisteitä. Suuret
pitoisuudet reaktiivisia happiyhdisteitä voivat altistaa erilaisille sairauksille, kuten
erityyppisille syöville, sydän- ja verisuonitaudeille ja ikääntymiselle. Kasveista
eristettyjä antioksidantteja voidaan lisätä elintarvikkeisiin parantamaan tuotteiden
laatua.
Männyn petusta, pakurikäävästä, mustaherukan marjoista ja lehdistä eristettiin uutteita
eri alkoholipitoisuuksilla 1 % etikkahapossa tai ilman etikkahappoa, joista määritettiin
antioksidanttikapasiteetit TRAP-menetelmää käyttäen (Total Radical-Trapping
Antioxidant Parameter). TRAP-menetelmä perustuu luminometriaan, jossa NaH2PO4 –
Na2HPO4- puskurissa AAPH (2,2'-atsobis (2-amidinopropaani) dihydrokloridi) tuottaa
keinotekoisia peroksidiradikaaleja, jotka hapettavat luminolista luminoliradikaaleja.
Muodostuneet luminoliradikaalit tuottavat valoa, joka voidaan havaita luminometrillä.
Näyteuutteiden antioksidantit estävät kemiluminesenssia tietyn ajan, mikä on suoraan
verrannollinen
näytteen
antioksidanttikapasiteettiin.
Näytteiden
antioksidanttikapasiteetteja verrataan Trolox-standardeilla saatuihin kapasiteetteihin,
minkä
tuloksena
voidaan
määrittää
kvantitatiivisesti
näytteiden
antioksidanttikapasiteetit.
Suurimmat antioksidanttikapasiteetit saatiin männyn petusta ja mustaherukan lehdistä.
Pienimmät antioksidanttikapasiteetit olivat mustaherukan marjalla ja pakurikäävällä.
Uuttoliuoksen etanolipitoisuus tai etikkahapon käyttö uuttamisessa ei vaikuttanut
mustaherukan marjojen tai pakurikäävän antioksidanttikapasiteettiin. Männyn petun ja
mustaherukan lehden antioksidanttikapasiteetti oli parempi uutettaessa 30 % etanolissa
1 % etikkahapolla, kun puolestaan 90 % etanolissa ilman happoa uutetuilla oli parempi
antioksidanttikapasiteetti kuin hapollisilla uutteilla. Petulla ja mustaherukan lehdellä
oli korkeimmat kokonaisfenolipitoisuudet, mikä on yhteydessä suurempiin
antioksidanttikapasiteetteihin.
Asiasanat: antioksidanttikapasiteetti, TRAP, trolox, luminometria
27
Prosessoidun maidon ja raakamaidon aiheuttamat vatsaoireet ja aterian
jälkeinen aineenvaihdunta tutkimushenkilöillä
Tiina Pasma
Ohjaajat: dos. Kaisa Linderborg, FM Anu Nuora ja prof. Heikki Kallio
ELINTARVIKEKEMIA
Viime aikoina mediassa on ollut paljon esillä kiista maidon homogenoinnista ja
homogenoidun maidon aiheuttamista vatsavaivoista. Jotkut kertovat saavansa
vatsaoireita homogenoidusta maidosta, mutta voivansa juoda homogenoimatonta
maitoa. Maidon homogenointi saa aikaan proteiinien erilaisen jakautumisen
rasvapisaroiden ja vesifaasin välillä verrattuna homogenoimattomaan maitoon.
Ongelmana aikaisemmissa kliinisissä kokeissa on ollut se, että todetut vatsaoireet
perustuvat henkilön omaan kertomukseen, jolloin vaivojen objektiivinen todentaminen
on vaikeaa.
Kliinisen ravitsemustutkimuksen tarkoituksena oli selvittää homogenoidun ja
pastöroidun eli prosessoidun maidon sekä homogenoimattoman ja pastöroimattoman
eli niin sanotun raakamaidon aiheuttamia vatsavaivoja sekä aterianjälkeistä
aineenvaihduntaa sellaisilla henkilöillä, jotka kokevat voivansa nauttia raakamaitoa,
mutta eivät prosessoitua maitoa. Ravitsemustutkimukseen osallistui 7 tervettä
tutkimushenkilöä. Tutkimushenkilöt nauttivat 12 tunnin paaston jälkeen satunnaisessa
järjestyksessä kahtena eri tutkimuspäivänä kuitupitoisen patukan ja joko 4 dl
raakamaitoa tai 4 dl prosessoitua maitoa. Aterian yhteydessä nielaistiin myös
SmartPill-kapseli. SmartPill on kapseli, joka mittaa ruoansulatuskanavan pH:ta,
painetta ja lämpötilaa. Tutkimushenkilöiden kokemat vatsaoireet todennettiin
oirepäiväkirjan avulla. Maitoaterioiden jälkeistä aineenvaihduntaa tutkittiin
vertaamalla veren glukoosi-, insuliini- ja triasyyliglyserolipitoisuuksia. SmartPillkapselin dataa verrattiin henkilön raportoimiin vatsaoireisiin. Tutkimuksen toisena
tavoitteena oli selvittää, korreloiko SmartPill-kapselin mittaama paine suolistossa
tutkimushenkilöiden kokemiin vatsaoireisiin.
Tutkimuksessa saatiin viitteitä siitä, että prosessoitu maito ja raakamaito
käyttäytyvät ruuansulatuskanavassa eri tavoin. Tämä näkyi erityisesti veren
triasyyliglyseroli- ja glukoosipitoisuuksissa. Suuresta hajonnasta ja pienestä otoksesta
johtuen erot eivät kuitenkaan ole tilastollisesti merkitseviä. Prosessoidun maitoaterian
jälkeen tutkimushenkilöt kokivat enemmän vatsaoireita kuin raakamaitoaterian
jälkeen, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. SmartPill-kapselin tietojen osalta
tulosten käsittely on kesken.
Asiasanat: homogenointi, pastörointi, raakamaito, vatsavaivat, SmartPill
28
29
Sinisten perunoiden antosyaniinit ja aterianjälkeinen glykemia
Johanna Salo
Ohjaajat: FM Marika Kalpio, MMT Anssi Vuorinen, dos. Kaisa Linderborg ja prof.
Heikki Kallio
ELINTARVIKEKEMIA
Antosyaniinit ovat luontaisia flavonoidiväriaineita, joiden värit vaihtelevat punaisesta
siniseen. Kemialliselta rakenteeltaan ne ovat glykosyloituja flavyliumkationeja, jotka
eroavat toisistaan hydroksi- ja metoksiryhmien, sokeriryhmien sekä alifaattisen ja
aromaattisten happojen määrän ja sijainnin perusteella. Antosyaniineilla on havaittu
terveyttä edistäviä ominaisuuksia.
Tässä erikoistyössä tutkittiin tummansinisen Synkeä Sakari -perunalajikkeen
antosyaniinikoostumusta ja siitä valmistetun keitetyn survoksen vaikutusta
aterianjälkeiseen glykemiaan ja insulinemiaan verrattuna keltaisesta perunasta
valmistettuun survokseen ja mustikkakiisseliin. Tutkimushenkilöt (n=13) nauttivat
antosyaniini- ja tärkkelyspitoisuuksien suhteen vakioituja aterioita yksöissokotetussa
vaihtovuorotutkimuksessa satunnaisessa järjestyksessä. Aterian jälkeen heiltä kerättiin
plasma- ja virtsanäytteitä tietyin väliajoin.
Tutkimusaterioiden antosyaniinit ja fenoliset hapot tunnistettiin UHPLC-DAD-ESIMS -menetelmällä. Antosyaniinipitoisuus määritettiin HPLC-DAD:lla sekä vapaat
sokerit
ja
orgaaniset
hapot
GC-FID:lla.
Antosyaniinien
ja
niiden
aineenvaihduntatuotteiden aterianjälkeistä kertymistä virtsaan aloitettiin tutkia
kehittämällä näytteiden esikäsittely- ja UHPLC-ESI-MS/MS -menetelmiä.Sininen
perunasurvos sisälsi asyloituja peonidiinin, petunidiinin ja malvidiinin glykosideja.
Sininen ja keltainen perunasurvos sisälsivät klorogeenihappoa ja kahvihappoa.
Keltaisessa perunasurvoksessa oli siniseen perunaan verrattuna enemmän glukoosia ja
vähemmän sakkaroosia. Sininen perunasurvos aiheutti pienemmän glykeemisen
kuorman kuin mustikkakiisseli ja pienemmän insuliinikuorman kuin keltainen
perunasurvos tai mustikkakiisseli. Glukoosi- ja insuliinipitoisuuksissa oli merkitseviä
eroja 20 ja 40 minuuttia aterian jälkeen.
Tutkimus antaa viitteitä siitä, että antosyaniinipitoiset perunalajikkeet ovat
glykeemisiltä ominaisuuksiltaan keltaisia perunoita edullisempia. Tämä on erityisen
merkittävää, koska perunat ovat tärkeä osa suomalaista ruokavaliota, ja toistuvat
korkeat aterianjälkeiset veren glukoosi- ja insuliinipitoisuudet ovat yhteydessä moniin
elintasosairauksiin.
Asiasanat: sininen peruna, antosyaniini, kromatografia, glykemia
30
Mausteiden ja yrttien haihtuvien yhdisteiden aistiminen
Markus Virtanen
Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja dos. Antti Knaapila
ELINTARVIKEKEMIA
Suurin osa ruoan mausta muodostuu hajuaistimuksista. Hajujen aistimisessa esiintyy
paljon yksilöllistä vaihtelua, jonka taustalla vaikuttavat monenlaiset eri tekijät, kuten
perintötekijät, sukupuoli ja aiempi kokemus hajusta. Elintarvikkeiden ortonasaalisti eli
nuuhkaisemalla havaittua hajua kutsutaan aromiksi.
Erikoistyön tavoitteena oli kartoittaa mausteiden ja yrttien sekä hajuyhdisteiden
aromien aistimista sekä selvittää kokemusten yksilöllisten erojen syitä. Työ toteutettiin
kutsumalla vapaaehtoisia henkilöitä aistinvaraisiin arviointeihin Funktionaalisten
elintarvikkeiden kehittämiskeskuksen aistilaboratorioon.
Tutkimukseen osallistui yhteensä 126 (naisia 74 %, miehiä 26 %) henkilöä.
Osallistujat olivat 25–61-vuotiaita. Heiltä kerättiin taustatietoja, kuten halukkuutta
kokeilla uusia ruokia, tutkimusta varten laaditun kyselylomakkeen avulla.
Aistinvaraisessa arvioinnissa tutkittavat arvioivat 12 mausteen/yrtin miellyttävyyttä ja
tuttuutta sekä lisäksi yrittivät tunnistaa näytteen. Hajuyhdisteistä (12 näytettä) he
arvioivat voimakkuutta ja miellyttävyyttä sekä yrittivät nimetä tai kuvailla näytteen
aromia.
Miellyttävimmäksi mausteeksi tai yrtiksi arvioitiin kaneli ja vähiten miellyttäväksi
kumina. Tutuimpana pidettiin kanelia ja vähiten tuttuna meiramia. Parhaiten
tunnistettiin valkosipuli (99 %) ja huonoiten fenkoli (29 %). Hajuyhdisteistä
parhaimpana pidettiin vanilliinia (vanilja) ja huonoimpana 1-okten-3-olia (sieni).
Parhaiten tunnistettiin allyylidisulfidi (87 %), joka on valkosipulin tuoksun
pääkomponentti ja huonoiten kanelialdehydi (21 %), joka on kanelin haihtuva yhdiste.
Naiset arvioivat useimmat hajut miellyttävämmäksi kuin miehet (p<0.05). Kyvyllä
tunnistaa hajuja ja halulla kokeilla uusia ruokia oli positiivinen yhteys hajujen
miellyttävyysarvioihin (p<0.05). Tutkittavat olivat hyvin tietoisia hajuaististaan, sillä
kun he pitävät hajua tuttuna, niin he myös tunnistivat sen.
Asiasanat: mausteet, yrtit, hajuyhdisteet, aromi, miellyttävyys
31
Lihasperäiselle kreatiinikinaasille spesifisen immunomäärityksen suunnittelu ja
automatisointi
Anna Haavisto
Ohjaajat: FT Teemu Korpimäki ja FT Tanja Savukoski
BIOTEKNIIKKA DI
Duchennen lihasdystrofia (engl. Duchenne muscular dystrophy, DMD) on lähes
pelkästään pojilla ilmenevä lihasrappeumatauti, joka johtaa kuolemaan noin 25 vuoden
iässä. Noin yksi 3500 pojasta sairastaa DMD:tä. Taudin aiheuttaa X-kromosomissa
sijaitsevan dystrofiinigeenin mutaatio, jonka seurauksena toimivaa, lihaksia
koossapitävää dystrofiinia ei tuotu. Taudille kehitteillä olevat hoidot ovat niin pitkällä,
että DMD:n vastasyntyneiden seulonnan aloittamista harkitaan. DMD:n seulonnassa
analyyttina olisi mahdollista käyttää lihasperäistä kreatiinikinaasia (engl. creatine
kinase MM isoform, CK-MM), jota päätyy vereen moninkertaisesti tavalliseen
verrattuna lihassolujen hajotessa. Perinteisesti kreatiinikinaasia on mitattu
entsyymiaktiivisuusmäärityksillä, jotka mittaavat kaikkia kreatiinikinaasimuotoja
(CK-MM, CK-MB ja CK-BB).
Työn tarkoituksena oli kehittää kuivatuista veritäplistä tehtävä CK-MM:lle spesifinen
kaksipuoleinen immunomääritys, joka olisi siirrettävissä PerkinElmerin
automaattiselle
GSP®
Genetic
Screening
Processor
-analysaattorille. Työ suoritettiin kolmessa vaiheessa. Ensimmäiseksi vertailtiin
kaupallisesti saatavilla olevien CK-MM-vasta-aineiden affiniteetteja biosensorilla.
Seuraavassa vaiheessa pystytettiin manuaalinen kaksipuoleinen immunomääritys
käyttäen ensimmäisessä vaiheessa valittuja vasta-aineita ja optimoitiin
immunomäärityksen parametreja. Lopuksi immunomääritys sovitettiin GSP-laitteelle.
Biosensorimittausten ja manuaalisten immunomääritysten tulosten perusteella valittiin
kaksi potentiaalista leimavasta-ainetta ja yksi sitojavasta-aineeksi sopiva vasta-aine.
Niitä käytettäessä määritys on melko spesifinen CK-MM:lle, sillä CK-BB ei tuottanut
lainkaan signaalia ja CK-MB:n signaali oli alle 10 % CK-MM:n signaalista. GSPlaitteella mitattaessa DMD:tä sairastavien (n = 10) CK-MM-pitoisuuksien mediaani oli
7591 ng/ml (vaihtelu 1493–13360 ng/ml) ja terveiden vastasyntyneiden (n = 8) 164,8
ng/ml (107,9–263,0 ng/ml). Määrityksen dynaamista aluetta ei vielä selvitetty, mutta
alustavien mittausten perusteella se kattaa terveiden vastasyntyneiden pitoisuudet ja
sairaiden pitoisuudet ainakin 8770 ng/ml asti, mikä mahdollistaa sairaiden
erottumisen. Määritys vaikuttaa siis sopivalta DMD:n seulontaan vastasyntyneiltä.
Asiasanat: Duchennen lihasdystrofia, immunomääritys, kreatiinikinaasi, dystrofiini
32
33
Mikropartikkelit kiintokantajina potilasläheisessä
hepatiitti B -määrityksessä
Minna Tuovinen
Ohjaajat: DI Merja Lahdenranta, FM Teppo Salminen ja FM Etvi Juntunen
BIOTEKNIIKKA DI
Heterogeenisissa diagnostisissa immunomäärityksissä sitojavasta-aineet kiinnitetään
tavallisesti määrityskaivon pintaan eli kiintokantajaan. Mikropartikkelit voivat toimia
kiintokantajina ja ne voivat olla materiaaliltaan esimerkiksi lateksia, tai polystyreeniä,
kuten tässä määrityksessä. Mikropartikkelien etuja ovat suurempi sitoutumispinta-ala
pienessä tilavuudessa sekä nopeampi reaktiokinetiikka verrattuna muihin
kiintokantajiin,
kuten
esimerkiksi
mikrotiitterilevyjen
polymeerikaivoihin.
Mikropartikkelien pintaa voidaan muokata lisäämällä siihen funktionaalisia ryhmiä.
Tämän lisäksi vasta-aineita voidaan sitoa pintaan välillisesti hyödyntämällä
esimerkiksi biotiinin ja streptavidiinin (SA) välistä vahvaa sidosta.
Diplomityössä käytettiin Turun yliopistossa kehitettyä uudenlaista potilasläheiseen
diagnostiikkaan sopivaa määritysalustaa ja mallianalyyttina oli hepatiitti B -viruksen
pinta-antigeeni (HBsAg). Määritysalusta perustuu mikropartikkelikiintokantajiin ja
niiden keräämiseen suodattimelle. Määrityksessä mikropartikkelien SA-pintaan
sidottiin biotinyloitu Tb-leimattu sekundaarileima sekä biotinyloitu sitojavasta-aine.
Tämän jälkeen määritysalustalle lisättiin pinnoitetut mikropartikkelit, HBsAg-analyytti
sekä Eu-leimattu tunnistusvasta-aine. Inkubaation jälkeen mikropartikkeleihin
sitoutunut analyytti ja siihen sitoutunut leimavasta-aine kulkeutuivat pesupuskurin ja
paineen avulla suodattimelle, josta signaali mitattiin. Sitoutumaton analyytti sekä
leima kulkeutuivat suodattimen läpi. Eu-leimoista mitattava signaali riippuu analyytin
määrästä ja Tb-leimoista syntyvä signaalia käytetään kompensoimaan vaihtelevasta
mikropartikkelimäärästä johtuvaa vaihtelua.
Hepatiitti B -määritys toimi parhaiten käytettäessä Eu-nanopartikkeleita leimana.
Määrityksen herkkyys uudella määritysalustalla oli parhaimmillaan 0,4 ng/ml ja SAmikrotiitterilevyllä vastaavasti 0,04 ng/ml. Herkkyyttä rajoittava tekijä uudella
määritysalustalla on rinnakkaisten näytteiden välinen korkea vaihtelu. Määrityksen
tulokset kuitenkin osoittavat potilasläheiseen testaukseen suunnitellun määritysalustan
toimivan kliinisesti merkittävässä määrityksessä.
Asiasanat: Mikropartikkelit, potilasläheinen diagnostiikka, hepatiitti B
34
Lysosomaalisten kertymäsairauksien seulonnassa käytettävän
reagenssikomponentin valmistusprosessin karakterisointi
Marke Hovi
Ohjaaja: FM väit. Jaana Kantola, PerkinElmer Wallac Oy
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Lysosomaaliset kertymäsairaudet (engl. Lysosomal Storage Disorder, LSD) ovat
joukko eteneviä, usein kuolemaan johtavia sairauksia, jotka johtuvat lysosomaalisten
entsyymien puuttumisesta tai niiden alentuneesta aktiivisuudesta. PerkinElmer kehittää
kittiä, jota voidaan käyttää apuna kuuden LSD –sairauden: Gaucherin taudin,
Niemann-Pickin taudin (tyypit A ja B), Pompen taudin, Krabben taudin ja
mukopolysakkaridoosi I:n seulonnassa vastasyntyneiden väritäplänäytteistä. Kitillä
voidaan määrittää entsyymien aktiivisuus kvantitatiivisella entsymaattisella
määrityksellä, jota mitataan tandemmassaspektrometrialla.
Erikoistyön tarkoituksena oli karakterisoida valmistusprosessi ja laadunvalvonta kitin
reagenssikomponentille, joka sisältää kuusi synteettistä LSD -entsyymin substraattia,
kuusi entsyymituotteen kaltaista, stabiilia isotooppileimattua sisäistä standardia (IS)
sekä natriumoleaattia kuivattuna. Komponentin valmistuksen päävaiheita ovat raakaaineiden punnitus, liuotus ja yhdistäminen kantaliuokseksi, valmiin liuoksen annostelu
pulloihin, kuivaus sekä valmiin komponentin laadunvalvonta.
Karakterisoinnin aikana testattiin erilaisia tapoja liuottaa ja yhdistää raaka-aineita,
sekä kuivata kantaliuosta. Puhdas metanoli toimi raaka-aineiden liuotuksessa
metanoli-vesiseoksia paremmin, joten se valittiin liuottimeksi kantaliuoksen
valmistukseen. Kuivaukseen valittiin haihdutin, jonka toiminta perustuu liuoksen
kiehuttamiseen alipaineessa. Kuivuminen oli liian hidasta menetelmässä, jossa
kantaliuos
jätettiin
haihtumaan
itsestään.
Komponentille
kehitettiin
massaspektrometrinen laadunvalvontamenetelmä, jossa ei tehdä entsyymimääritystä.
Laadunvalvontamenetelmän toistettavuus todettiin riittämättömäksi ja komponentin
laadunvalvonnan kehitystä jatkettiin entsymaattisella MSMS -määrityksellä.
Karakterisoinnin aikana valmistettujen erien sisäinen hajonta ja erien välinen
toistettavuus oli hyvä ja komponentit todettiin toimiviksi entsymaattisessa LSD –
määrityksessä. Komponentin laadunvalvonnan hyväksyntärajojen määrittelyä
jatketaan ja karakterisoitu valmistusprosessi tullaan validoimaan PerkinElmerin Turun
tuotantoon.
Asiasanat: Lysosomaaliset kertymäsairaudet, tandemmassaspektrometria
35
Upkonvertoivien nanopartikkelien luminesenssin tehostaminen orgaanisten
kromoforien avulla
Pekka Heljakka
Ohjaajat: FM Satu Lahtinen ja prof. Tero Soukka
BIOTEKNIIKKA DI
Upkonvertoivat nanopartikkelit (engl. upconverting nanoparticles, UCNP) ovat
lantanidi-ioneja sisältäviä epäorgaanisia leimoja, jotka kykenevät muuntamaan
matalaenergisen 980 nm viritysvalon korkeaenergiseksi näkyväksi valoksi. Tämän
ominaisuuden avulla mittausalue voidaan erottaa taustahäiriötä aiheuttavasta
autofluoresenssista. Lantanidi-ionit kuitenkin absorboivat viritysvaloa heikosti.
Partikkelien luminesenssia voidaan tehostaa absorboivien ionien määrää lisäämällä,
mutta se kasvattaa partikkelin kokoa. Viritysvalon absorptiota voidaan mahdollisesti
parantaa kiinnittämällä partikkelien pintaan 808 nm aallonpituudella virittyviä
orgaanisia kromoforeja, jotka toimivat valoa tehokkaasti keräävinä antennirakenteina.
Kromoforit virittävät UCNP:n energiansiirron kautta ja mahdollistavat luminesenssin
tehostumisen.
Diplomityössä tutkittiin erilaisia tapoja pinnoittaa nanopartikkeli siten, että kromofori
voitiin kiinnittää siihen pysyvästi. Tavoitteina olivat myös pinnoitetun partikkelin
vesiliukoisuus sekä samanaikaisesti sen suojaaminen veden aiheuttamalta
luminesenssin
sammuttavalta
vaikutukselta.
UCNP:n
emissio
mitattiin
spektrofluorometrillä käyttäen 808 nm ja 980 nm lähi-infrapunalasereita
virityslähteinä.
Työssä kehitettiin kaksi pinnoitusmenetelmää, jotka mahdollistivat partikkelin
virittämisen kromoforin kautta 808 nm aallonpituudella. UCNP pinnoitettiin
polyakryylihapolla (PAA) tai poly(maleiinianhydridi-alt-1-oktadekaani):lla (PMAO),
johon kromofori kiinnitettiin adsorptiolla. Partikkelin luminesenssi 808 nm
viritysaallonpituudella ei kuitenkaan tehostunut verrattuna viritykseen 980 nm
laserilla. PMAO-pinnoituksella 808 nm laserilla viritettäessä mitattu signaali jäi 2,7
kertaa heikommaksi ja PAA-pinnoitetun UCNP:n emissio jäi noin 40 kertaa
heikommaksi. Menetelmät eivät suojanneet partikkelia veden luminesenssia
sammuttavalta vaikutukselta ja kromoforien avulla herkistetty upkonversio toimi vain
käyttämällä liuottimena raskasta vettä.
Asiasanat: upkonvertoiva nanopartikkeli, energiansiirto, kromofori
36
37
Panossyöttökasvatusprosessin automatisointi
Joni Juvonen
Ohjaajat: FM Markus Vehniäinen ja prof. Tero Soukka
BIOTEKNIIKKA DI
Tutkimuskäyttöön tarkoitettujen rekombinanttiproteiinien tuottaminen fermentoimalla
on yleinen menetelmä bioteollisuudessa. Mikrobit kasvatetaan biologisessa
reaktorissa, joka tarjoaa kontrolloidun kasvuympäristön ja sopivat tuotto-olosuhteet
halutulle tuotteelle. Eräs fermentointimuodoista on korkeatuottoinen ja pitkäkestoinen
panossyöttökasvatus, jossa saavutetaan panoskavatusta merkittävästi korkeampi
solutiheys jatkamalla panosvaiheen jälkeen kasvua rajoittavan substraatin syöttöä.
Laboratoriomittakaavassa fermentorikasvatusten tilavuudet vaihtelevat muutamasta
litrasta kymmeniin ja niissä kasvatusta seurataan sekä ohjataan joko fermentorista tai
tietokoneesta. Tyypillisessä fermentointiprosessissa operaattori tarkkailee muun
muassa vaahdonkorkeutta sekä käynnistää pumppuja olosuhteiden muuttuessa.
Tällaiset tehtävät ovat teollisen mittakaavan laitteistoissa usein automatisoituja.
Diplomi-insinöörityön tarkoituksena oli päivittää kahden Turun yliopiston
biotekniikan laboratoriossa sijaitsevan BioFlo® -sarjan pöytäfermentorin MS-DOS pohjainen tietokoneohjausohjelma nykyaikaiseksi ja lisätä siihen etäseuranta ja ohjaus. Lisäksi vaahdonestoaineen ja indusorin lisäykset haluttiin automatisoida
panossyöttökasvatuksessa. Fermentorien ohjaukseen kirjoitettiin Visual Basic .NET
ohjelmointikielellä uusi pääkäyttöliittymä ja sen rinnalle etäkäyttöliittymä, joka
keskusteli pääkäyttöliittymän kanssa yliopiston sisäisessä verkossa. Tuottoprosessin
automatisointi toteutettiin käyttöliittymän sisäisellä ohjelmointiympäristöllä, joka
mahdollisti pumppujen, sekoitusnopeuden ja lämpötilan säätöarvojen ohjelmoinnin.
Vaahdonkorkeuden tunnistuksessa käytettiin web-kameraa, jonka ottamasta kuvasta
erotettiin vaahdonkorkeus kuvankäsittelyn avulla.
Koekasvatuksilla osoitettiin päivitetyn ohjausohjelman toimivan panos- ja
panossyöttömuodoilla.
Uuden käyttöliittymän avulla pystyttiin tummien
kasvatusliuosten vaahdonkorkeutta mittaamaan riittävällä tarkkuudella, mutta
ongelmia aiheuttivat vaaleammat kasvatusliuokset, joista vaahtoa oli vaikea tunnistaa.
Lisäksi käyttöliittymä mahdollisti automaattisen vaahdonestoaineen ja indusorin
lisäyksen, fermentorin lämpötilan ja sekoitusnopeuden säädön etänä sekä kasvatuksen
seuraamisen web-kameran suoratoistosta.
Asiasanat: fermentori, konenäkö, panossyöttökasvatus
38
Modular and tunable gene expression system for Saccharomyces cerevisiae
Anssi Rantasalo
Supervisors: PhD Dominik Mojzita, PhD Jussi Jäntti
BIOTECHNOLOGY (TECH.)
Typical methods for metabolic engineering of microbial strains include expression of
heterologous genes involved in the production of desired compound(s). This might
however lead to metabolic imbalances where substrates and intermediates are
consumed and produced at suboptimal rate. Metabolic imbalances might decrease the
flux through the production pathway which underlies the importance of pathway
optimization.
The optimization of production pathways requires tools to control enzyme levels in a
cell. However, the lack of well-defined and predictable tools for tuning enzyme levels
limits the expansion of biobased compounds production. In order to tackle this
problem, we developed a genetic tool for simultaneous control of transcription levels
of multiple genes. The system utilized modular DNA parts which were assembled into
functional devices allowing precise control of expression of multi-gene encoded
pathways.
The system functions as a transcription amplifier in which input signal is modulated to
output signal. The input signal was a trigger for expression of a synthetic transcription
factor (sTF) which is a fusion protein of DNA binding domain (DBD) and activation
domain (AD). DBD recognized a specific binding site upstream of a core promoter of
the target gene(s), and the AD of the sTF recruited transcription machinery which
triggered the expression of the target gene(s) (output signal).
The system was established to monitor the expression of fluorescent GFP and
mCherry reporter proteins. The expression level of these target genes were tuned by
changing the number sTF binding sites in the output promoter and by using different
yeast’s core promoters having different expression strengths. The expression levels of
reporters were tested by fluorescent measurements.
The expression range of the system spanned from minimal expression activity up to
the level of the yeast’s strongest native promoters. Based on these observations we
believe that this system can be applied in industrial or in academic applications as it
provides wide range of expression levels and could be precisely fine-tuned.
Keywords: synthetic biology, pathway optimization, yeast expression system
39
Kelaattikomplementaatioon perustuvan integroidun DNA:n monistus- ja
detektointimenetelmän kehitys
Anna-Maija Lempainen
Ohjaaja: FM Susanne Lahdenperä
BIOTEKNIIKKA DI
Kelaattikomplementaatio perustuu kahteen, itsessään ei-fluoresoivaan koettimeen,
jotka sitoutuessaan lähekkäin samaan vastinjuosteeseen muodostavat fluoresoivan
kokonaisuuden. Kehittämässäni menetelmässä kohdesekvenssi monistetaan
polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ja havainnoidaan paikkaspesifisesti reaktiokammion
pinnalla ilman pesuvaiheita tai reaktiokammion avausta. Pintadetektio mahdollistaa
usean eri analyytin määrittämisen käyttäen vain yhdenlaista leimaa.
Polypropyleenilastujen
pinta
aktivoitiin
primaarisilla
aminoryhmillä
(diaminosykloheksaani (DACH), allyyliamiini (AA), aminopropyylitrietoksysilaani
(APTES) tai aminopropyylitrimetoksysilaani (APTMS)) ja atsidifunktionalisoitiin,
minkä jälkeen reaktiokammion pintaan kiinnitettiin 5’-alkyynimodifioitu
antennaligandikoetin
kuparikatalysoidulla
atsidi-alkyyni
sykloadditiolla.
Hybridisaatioliuoksessa kullekin monistustuotteelle oli spesifinen Eu3+-kelaattikoetin.
Aikaerotteinen fluoresenssi mitattiin reaktiokammion alueelta 10 × 10 rasterina.
Paras signaali-tausta-suhde saatiin antennakoetinkonsentraatiolla 1,67 µM. Koska
primaariset aminoryhmät häiritsevät PCR:ää testattiin erilaisia pienimolekulaarisia
yhdisteitä (Tween, glysiini, butyynihappo ja alkyyni-polyetyleeniglykoli5-happo)
pinnan blokkaamiseen. Testattaessa pinnan ja antennakoettimen välisen kiinnityksen
lämpöstabiilisuutta DACH-, AA- ja APTES-pinnoilla signaali-tausta-suhde pysyi
hyvänä 40 PCR-syklin jälkeenkin. Menetelmän analyyttinen herkkyys (määriteltynä
taustasignaalina lisättynä kolme kertaa taustan keskihajonnalla) oli DACH:lla 0,02
nM, AA:lla 0,01 nM, APTES:lla 0,03 nM ja APTMS:lla 0,21 nM.
Kelaattikomplementaatioon perustuva integoitu monistus- ja detektointimenetelmä on
lupaava uusi menetelmä nukleiinihappodiagnostiikan alalla. Paikkaspesifisen
pintadetektoinnin ansiosta sillä saattaisi olla potentiaalia monianalyyttimääritykseksi,
joka voisi haastaa tällä hetkellä käytössä olevat, eri fluoroforien mittaukseen
perustuvat menetelmät.
Avainsanat: kelaattikomplementaatio, PCR, monianalyyttimääritys, pintadetektio,
integroitu DNA määritys
40
41
Munasarjasyöpäspesifisen diagnostiikkamäärityksen kehittäminen: CA125lektiinimääritys
Annika Järvinen
Ohjaajat: FT Kamlesh Gidwani, prof. Kim Pettersson
BIOTEKNIIKKA DI
Munasarjasyöpä, joka on usein oireeton ennen leviämistään, on naisten vaarallisin
gynekologinen syöpä. CA125 on glykoproteiini ja ainoa käytössä oleva biomerkkiaine
munasarjasyövän havaitsemiseen. CA125:lla on huono herkkyys munasarjasyövälle
ennen oireiden ilmaantumista. CA125:n viitearvo on 35 U/ml, mutta tämän ylittäviä
pitoisuuksia ei voida suoraa yhdistää syöpään, sillä CA125 on todettu olevan koholla
myös maksasairauden, endometrioosin, munasarjakystan tai ovulaatiokierron takia.
Munasarjasyöpään liittyvässä CA125:ssä on todettu poikkeamia glykosylaatiossa,
minkä vuoksi glykosylaatiomuutokset voisivat olla kannattavia diagnostisia kohteita
munasarjasyövän tutkimisessa.
Diplomityön tavoitteena oli kehittää munasarjasyövän varhaiseen havaitsemiseen
spesifinen diagnostiikkatesti, joka perustui CA125 glykoproteiinin muuttuneeseen
glykosylaatioon ja lektiinien hyödyntämiseen sitojamolekyyleinä. Työssä käytettiin
neljästä eri kudoksesta olevaa CA125:tä. Lähteinä olivat munasarjasyövän (OvCan)
OVCAR3-solulinjassa tuotettu CA125, sekä istukasta (Pla) eristetty ja maksakirroosin
(LC) ja itusolukasvaimen (IT) normaalista kudoksesta peräisin oleva CA125.
Detektiossa verrattiin kymmentä eri kasvilektiiniä, jotka olivat konjugoitu joko Eu3+kelattiin tai Eu3+-nanopartikkeliin. Lektiinejä hyödyntävän määrityksen suorituskykyä
verrattiin immunomääritykseen, jossa käytettiin CA125:n eri etitoopit tunnistavaa
monoklonaalista vasta-ainetta (Mab).
Suurin osa työssä käytetyistä lektiininanopartikkeleista tunnistivat spesifisesti istukasta
eristetyn CA125:den. Wisteria floribunda (WFA) oli ainoa lektiini, joka antoi 3-4 kertaisesti korkeamman signaalin munasarjasyövän kanssa verrattuna muihin CA125lähteisiin, mutta sen tausta nousi korkeaksi. Muiden lektiinien kanssa ongelmaksi
muodostui myös korkea tausta sekä vähäinen ero eri CA125-lähteiden välillä. Eu3+nanopartikkelien käyttö leimana paransi lektiinien affiniteettia CA125glykaanivarianttien kanssa. Työssä kehitettyä määritystä CA125-WFA lektiininanopartikkelille voitaisiin tulevaisuudessa käyttää erottamaan munasarjasyöpä
hyvänlaatuisista tapauksista jo olemassa olevan CA125-immunomäärityksen kanssa.
Asiasanat: munasarjasyöpä, CA125, lektiini, Eu3+-nanopartikkeli
42
Upkonvertoivien nanopartikkelileimojen erottelumenetelmät
Antti Pihlava
Ohjaajat: FT Terhi Riuttamäki, FM Riikka Arppe
BIOTEKNIIKKA DI
Upkonvertoivat nanopartikkelileimat ovat epäorgaanisia, lantanideilla seostettuja
partikkeleja. Bioanalytiikan kannalta nämä leimat ovat erityisen mielenkiintoisia siksi,
että niitä virittävällä lähi-infrapunasäteilyllä voidaan välttää useassa luminesenssiin
perustuvassa detektiomenetelmässä ongelmaksi muodostuva autofluoresenssi, sekä
viritysvalon sironta ja absorptio biologiseen näytemateriaaliin. Tämän tutkimuksen
tarkoituksena oli selvittää erilaisten erottelu- ja analyytisten menetelmien sopivuutta
upkonvertoivien
nanopartikkelien
erotteluun
partikkeliaggregaateista
ja
valmistusreagensseista siirryttäessä suuremman tuotannon mittakaavaan. Nykyisen
sentrifugointiin perustuvan erottelun mittakaava ei ole tarkoitukseen riittävä, eikä se
poista mahdollisia aggregaatteja partikkelimonodispersion joukosta.
Tutkimuksen aikana puhdistettiin ja karakterisoitiin karboksyloiduilla silikakerroksella
pinnoitettuja sekä streptavidiini-konjugoituja upkonvertoivia nanopartikkeleja.
Erottelumenetelmistä
tutkimuksen
kohteena
olivat
korkean
gradientin
magneettierottelu (HGMS), geelisuodatus ja eri huokoskoon suodattimien läpi
ajaminen. Partikkelierien aggregoitumistaipumusta tutkittiin polyakryyliamidi- ja
agaroosigeelielektroforeesilla. Nanopartikkelipitoisuudet määritettiin luminesenssiintensiteetin perusteella ja partikkelien koko ja aggregaatio arvioitiin
läpäisyelektronimikroskoopin avulla.
Upkonvertoivat nanopartikkelit saatiin eroteltua vapaasta streptavidiinista sekä
HGMS-, että geelisuodatus-menetelmillä, mutta partikkelisaannot (saannot <50%)
jäivät hyvin pieniksi verrattuna nykyisin käytössä olevaan sentrifugaalivoimiin
perustuvaan menetelmään (saannot >95%). Filtterisuodatus (∅ 0,22 ja 0,1 µm) soveltui
aggregaattien poistamiseen laimeista partikkelisuspensioista, mutta konsentroidut
suspensiot vaatisivat ruiskusuodatinta erityisemmän välineistön suodattimien
tukkeutumisen minimoimiseksi. Agaroosigeelielektroforeesi vaikuttaa käytännölliseltä
ja edulliselta tavalta selvittää nanopartikkeleiden aggregaatiota. Jatkotutkimuksissa on
selvitettävä HGMS-menetelmän magneettikentän voimakkuuden riittävyys
nanokokoistenpartikkelien kaappaamiseen, sekä partikkelien mahdollinen epätoivottu
vuorovaikutus erottelumatriisien kanssa.
Asiasanat: Upkonvertoivat nanopartikkelit, geelisuodatus, HGMS, geelielektroforeesi,
filtterisuodatus
43
Veritäpläpohjaisen fragiili X -testauksen pystyttäminen
Ida Alm-Ndiaye
Ohjaajat: FT Tuomas Nikula ja dos. FT Harri Hakala
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGOSTIIKKA
Fragiili X (frax) -oireyhtymä on yleisin kehitysvammaisuuden perinnöllinen syy.
Oireyhtymä periytyy X-kromosomissa, ja sen aiheuttaa sytosiini-guaniini-guaniiniemäskolmikon (CGG) monistuminen X-kromosomin Fragile X mental retardation 1
(FMR1) -geenin promoottorialueella. FMR1-alleelit voidaan luokitella (CGG)ntoistojen määrän mukaan neljään ryhmään : normaali (5–44), harmaa alue (45–54),
epästabiili esimutaatio (55–200) tai täysmutaatio (yli 200). Esimutaatiotapauksissa
toistojakso voi laajentua täysmutaatioksi jo yhden sukupolven aikana. Esimutaation
kantajilla on havaittu monenlaisia oireita. Esimerkiksi osalla kantajanaisista on
munarauhasen toiminnanhäiriöitä ja erityisesti miehillä on riski sairastua
neurologiseen rappeumasairauteen. Täysmutaatiotapauksessa FMR1-promoottorialue
metyloituu epänormaalisti ja geeni inaktivoituu. Täysmutaatiota kantavilla miehillä on
aina frax-oireyhtymä, kun taas naisilla toisen terveen X-kromosomin suojavaikutus
yleensä lieventää oireita sekä täys- että esimutaatiotapauksissa. Oireyhtymän
yleisyyden, laajan oirekirjon ja lääkekehityksen edistymisen takia kiinnostus
vastasyntyneiden ja kantajien seulontaa kohtaan on kasvanut.
Erikoistyön tavoitteena oli pystyttää veritäpläpohjainen automatisoitu DNAeristysmenetelmä, joka soveltuu frax-oireyhtymän ja sen kantajien testaukseen
PerkinElmerin FragilEaseTM-PCR-määrityksen kanssa. Kokonaisuudessaan testaus
koostui DNA-eristyksestä, FragilEaseTM-PCR:stä, PCR-tuotteen puhdistuksesta ja
monistustuotteiden havainnoinnista kapillaarigeeli-elektroforeesilla. Jokaista vaihetta
optimoitiin veritäplätestaukseen sopivaksi.
Frax-testaus todistettiin toimivaksi sekä aikuisten että vastasyntyneiden veritäplillä.
Halkaisijaltaan 3,2 mm veritäplistä eristettyjen DNA-näytteiden epäpuhtauksista ja
alhaisista pitoisuuksista huolimatta FragilEaseTM-PCR:ssä onnistuttiin monistamaan
(CGG)n-alueet pienentämällä eristysnäytteiden reaktiotilavuutta ja nostamalla PCRsyklimäärää. Pisin testattu monistusalue oli 200 toistojaksoa. Lisäksi muokkaamalla
DNA-eristysvaihetta ja muuttamalla PCR-tuotteen puhdistusmenetelmää onnistuttiin
nostamaan lopullista saantoa. Veritäpläpohjaisen frax-testauksen osoitettiin soveltuvan
niin vastasyntyneiden kuin kantajien seulontaan.
Asiasanat: Fragiili X -oireyhtymä, veritäplä, DNA-eristys, PCR
44
45
Heterogeeninen upkonvertoiviin nanopartikkeleihin perustuva immunomääritys
sydänspesifiselle troponiini I:lle
Annika Lyytikäinen
Ohjaajat: FM Nina Sirkka, FM Riikka Arppe, prof. Tero Soukka
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Epäorgaaniset upkonvertoivat nanopartikkelit (engl. upconverting nanoparticles,
UCNP) koostuvat kiteisestä isäntämateriaalista ja siihen seostetuista lantanidi-ioneista.
Upkonversiossa lähi-infrapunavalolla tapahtuvaa vähintään kahden fotonin absorptiota
vaativaa viritystä seuraa emissio viritysaallonpituutta lyhyemmällä aallonpituudella.
Sydänperäinen troponiini-I (engl. cardiac troponin I, cTnI) on kliinisesti merkittävä
merkkiaine. Herkkä cTnI-määritys auttaa akuutin sepelvaltimotautikohtauksen
havaitsemista ja siten oikean hoidon nopeaa aloitusta. Autofluoresenssi ei häiritse
upkonversioluminesenssin mittausta ja siksi UCNP-leiman käyttö, ja lantanidi-ionien
viritys pienikokoisella diodilaserilla sallivat herkän immunomäärityksen kehittämisen,
jossa voidaan käyttää edullisia ja yksinkertaisia mittalaitteita.
Hydrofobiset UCNP:t pinnoitettiin perinteisesti hydrofiilisellä silikalla tai
vaitoehtoisesti eri kokoisilla polyakryylihapoilla. cTnI:tä spesifisesti tunnistava vastaaine konjugoitiin kovalenttisesti UCNP:n pintaan sulfo-NHS/EDC-aktivoinnilla.
Vasta-aineella konjugoituja UCNP-leimoja käytettiin heterogeenisessä kaksipuolisessa
cTnI-immunomäärityksessä ja upkonversioluminesenssi mitattiin kuivista kaivoista
levylukijalla. Käytettyjä menetelmiä optimoitiin UCNP:n epäspesifisen sitoutumisen
vähentämiseksi
ja
analyyttisen
herkkyyden
parantamiseksi.
Kehitetyn
immunomäärityksen toimivuutta testattiin terveiden henkilöiden plasmanäytteillä,
joihin oli lisätty tunnettu cTnI-pitoisuus.
UCNP:n pinnoitus alhaisen molekyylipainon polyakryylihapolla vähensi selvästi
kaivon sisäistä vaihtelua sekä paransi määrityksen toistettavuutta ja analyyttistä
herkkyyttä silikapintaiseen UCNP-leimaan verrattuna. Parhaalla sitojavasta-aineiden,
leimavasta-aineen ja -inkubointipuskurin yhdistelmällä kehitetyn immunomäärityksen
analyyttinen herkkyys oli alle 1,2 ng/l CV:n ollessa alle 10 %. Tutkimus osoitti, että
UCNP-leimalla on mahdollista havaita erittäin alhaisia cTnI-pitoisuuksia.
Plasmanäytteiden cTnI-sannoissa oli eroja valituilla määritysolosuhteilla, joten
toimiva immunomääritys vaatii vielä olosuhteiden lisäoptimointia.
Asiasanat: upkonvertoivat nanopartikkelit, polyakryylihappopinnoitus, heterogeeninen
immunomääritys, cTnI
46
Fab-fragmentin DNA-sekvenssin vaikutus Escherichia colin kasvuun ja tuottoominaisuuksiin
Antti Kulmala
Ohjaajat: FT Tuomas Huovinen, FT Eeva-Christine Brockmann, FT Urpo
Lamminmäki
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Synonyymisillä kodoneilla tarkoitetaan kodoneja, jotka ovat erilaisia, mutta koodaavat
samaa aminohappoa. Synonyymisten mutaatioiden, eli kodonin vaihtaminen samaa
aminohappoa koodaavaan toiseen kodoniin, on pitkään ajateltu olevan yhdentekeviä,
mutta synonyymit muutokset DNA-sekvenssissä voivat kuitenkin vaikuttaa
esimerkiksi proteiinin laskostumiseen ja proteiinin toimintaan solussa. Eri organismit
käyttävät synonyymisiä kodoneja eri frekvensseillä. Tätä ilmiötä kutsutaan
kodonikäytön poikkeamaksi. Kodonikäytön poikkeamien on osoitettu olevan tärkein
yksittäinen prokaryoottien geeniekspressioon vaikuttava tekijä, ja usein proteiineja on
hankala tuottaa vieraassa isännässä, jos kodonikäytön poikkeamat ovat liian suuria.
Erilaisia kodonioptimointistrategioita on kehitetty näiden ongelmien ratkaisemiseksi.
Kodonikäyttöä optimoitaessa on otettava huomioon lisäksi erilaiset paikalliset
muuttujat, jotka lisäävät optimoinnin monimutkaisuutta.
Työn lähtökohtana oli synteettinen ihmisen vasta-aineen Fab-fragmentin geeni. Geeni
oli optimoitu kahdella eri strategialla, jotka tuottivat eri DNA-sekvenssit, mutta saman
aminohapposekvenssin. Toinen varianteista tuotti aktiivista Fab-fragmenttia, toinen ei.
DNA-sekvenssin vaikutuksen tutkimiseksi, toimivan geenin osia korvattiin
toimimattoman variantin vastaavalla osalla. Kaikkiaan seitsemän geenivariantin kykyä
ilmentää Fab-fragmenttia sekä liukoisena proteiinina että filamenttifaagin pinnalla
vertailtiin. Lisäksi tutkittiin varianttien vaikutusta isäntäsolun kasvukinetiikkaan.
Muunneltuja variantteja verrattiin alkuperäiseen toimivaan varianttiin.
Faagituotossa havaittiin Fab-fragmentin kevyen ketjun DNA-sekvenssin
synonyymisten muutosten vaikuttavan faagien immunoreaktiivisuuteen. Erityisen
olennainen oli kevyen ketjun vakioisen alueen muuttaminen, joka myös aiheutti 45 %
laskun faagien kokonaismäärässä. Liukoista proteiinia tuotettaessa kevyen ketjun
vakioisen alueen muutos laski Fab-määrän tasolle, jota ei voitu mitata. Tämän lisäksi,
avoimen lukukehyksen alun kodonien synonyymiset mutaatiot aiheuttivat 86 % laskun
aktiivisen liukoisen proteiinin määrässä verrattuna alkuperäiseen toimivaan varianttiin.
Asiasanat: Kodonikäyttö, geenioptimointi, Escherichia coli
47
Rekombinanttivasta-aineen affiniteetin parantaminen suunnatun evoluution
avulla
Teppo Heimo
Ohjaajat: FT Ramkrashan Kasera, FT Urpo Lamminmäki
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Plasmodium -suvun itiöloiset aiheuttavat malariaa, joka on maailmanlaajuisesti yksi
suurimmista kuolemaan johtavista taudeista ja leviää Anopheles -suvun hyttysten
välityksellä. Suurin ongelma malarian hoidossa on viivästynyt tai väärä diagnoosi.
Yleisin ja vaarallisin malariaa aiheuttava laji on P. falciparum. Ainoastaan P.
falciparumin on havaittu erittävän tartunnan saaneen verenkiertoon HRPII-antigeenia,
joka voidaan havaita paitsi verestä myös jopa virtsasta. Nopean ja tarkan HRPIIantigeeniin perustuvan malariadiagnostiikan kehittäminen vaatii korkealaatuisia
HRPII-spesifisiä vasta-aineita.
Työssä pyrittiin parantamaan synteettisestä vasta-ainekirjastosta eristetyn HRPIIspesifisen Fab-vasta-ainefragmentin sitomisvoimakkuutta suunnatun evoluution
avulla. Vasta-ainegeeniin tehtiin satunnaismutaatioita selektiivisellä RCA menetelmällä kahdella eri strategialla: virhealttiilla PCR:llä (EP-PCR) mutatoituja
mega-alukkeita tai oligonukleotidi-kohdennettua mutageneesiä käyttäen. EP-PCR:llä
substituutiomutaatioita pyrittiin saamaan aikaan eri puolille vasta-aineen kevyen- (VL)
ja raskaanketjun (VH) variaabeliosia koodaavia geenejä. Oligonukleotidikohdennetulla menetelmällä substituutioita, lyhyitä insertioita ja deleetioita
kohdennettiin VL- ja VH-osien hybervariaabelialueille. Mutatoiduista vastaainefragmenttigeeneistä
valmistettiin
geenikirjastot,
jotka
rikastettiin
faaginäyttötekniikalla.
EP-PCR:llä mutatoidut VL- ja VH-ketjut eivät toimineet tehokkaasti samanaikaisesti
mega-alukkeina selektiivisessä RCA -menetelmässä. Lisäksi EP-PCR:ssä mutaatioaste
jäi pieneksi kaikissa testatuissa reaktio-olosuhteissa. Oligonukleotideihin perustuvalla
strategialla tuotetut kirjastot sen sijaan sisälsivät halutunlaisia mutaatioita ja kattoivat
myös kirjastolle suunnitellun teoreettisen diversiteetin. Faaginäyttötekniikalla
rikastettujen kirjastojen HRPII-sitomisaktiivisuus oli voimakkaasti kasvanut. Jatkossa
seulotaan yksittäisiä klooneja sitomisaktiivisuuden määrittämiseksi.
Asiasanat:
faaginäyttötekniikka,
Plasmodium falciparum, malaria
vasta-ainemuokkaus,
48
satunnaismutageneesi,
Faaginäyttötekniikalla uusia vasta-aineita luustolihasperäiselle troponiini I:lle
Susanna Lammi
Ohjaajat: FT Eeva-Christine Brockmann, FT Tanja Savukoski, FM Heidi Hyytiä
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Troponiinit I, T ja C ovat poikkijuovaisten lihasten (sydän- ja luustolihakset)
rakenneproteiineja, jotka säätelevät lihasten supistumista. Sydän- ja luustolihasten
vaurioitumisen seurauksena troponiineja vapautuu verenkiertoon, josta niitä pystytään
mittaamaan immunomääritysten avulla. Koska troponiinit I ja T ovat erilaisia
luustolihaksissa (engl. skeletal troponin, skTn) ja sydänlihaksessa (engl. cardiac
troponin, cTn), pidetään niitä varsin spesifisinä merkkiaineina. cTnI ja cTnT ovat
vakiinnuttaneet asemansa sydäninfarktin merkkiaineina. Toisaalta skTnI:tä pidetään
mahdollisena merkkiaineena luustolihassairauksien diagnosoinnissa, mutta tutkimusta
asiasta on vähän. Kaupallisia skTnI-määrityksiä ei ole, eikä tällä hetkellä markkinoilla
ei ole juurikaan skTnI-spesifisiä vasta-aineita.
Työn tarkoituksena oli etsiä faaginäyttötekniikan avulla uusia skTnI:n tunnistavia
vasta-aineita, jotka mahdollistaisivat herkän skTnI-immunomäärityksen kehittämisen.
Vasta-aineet rikastettiin Turun yliopistossa valmistetusta synteettisestä vastaainekirjastosta. Rikastetut sitojat kloonattiin tuottovektoriin ja scFv-sitojavasta-aineita
(engl. single chain variable fragment) tuotettiin Escherihia coli -bakteereissa. Sitojista
parhaat seulottiin mittaamalla niiden aktiivisuus skTnI:tä ja ristireaktiivisuus cTn:tä
vastaan immunomäärityksissä.
Alustavien tulosten perusteella vasta-ainekirjastoista rikastui sitojia, jotka tunnistavat
skTnI:n. Suurin osa näistä sitojista vaikuttaisi olevan myös sellaisia, jotka eivät
merkittävästi ristireagoi cTn:n kanssa. Lupaavimmat sitojat sekvensoidaan ja
karakterisoidaan tarkemmin, jonka jälkeen ne kloonataan Fab-fragmenteiksi.
Kloonatut vasta-aineet tuotetaan ja niiden toimivuutta testataan skTnIimmunomäärityksissä. Kehitettävien määritysten avulla voitaisiin mitata skTnIpitoisuudet terveiden ja sairaiden verestä ja tätä kautta tutkia skTnI:n asemaa
kliinisenä merkkiaineena.
Asiasanat: faaginäyttötekniikka, immunomääritys, luustolihasperäinen troponiini I,
vasta-aine
49
Eksosomispesifisten vasta-aineiden kehittäminen eturauhassyövän seulontaan
Niklas Ekman
Ohjaajat: FM Janne Leivo, FT Urpo Lamminmäki
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Eturauhassyöpä on miesten toiseksi yleisin syöpä maailmanlaajuisesti. Sen
diagnosoinnissa yleisimmin käytettävä merkkiaine, prostataspesifinen antigeeni
(PSA), ei ole spesifinen pelkästään syövälle, vaan kohonneet arvot voivat johtua myös
eturauhasen hyvälaatuisesta liikakasvusta. Tämän takia PSA-mittaukset voivat johtaa
ylidiagnosointiin ja turhiin hoitoihin. Eturauhassyövälle tarvitaan spesifisempiä
merkkiaineita diagnosoinnin ja taudin seurannan parantamiseksi.
Eksosomit kuuluvat solujen erittämiin nanokokoisiin vesikkeleihin ja niiden on
havaittu sisältävän samoja RNA- ja proteiinimolekyylejä kuin solut, joista eksosomit
ovat lähtöisin. Tästä syystä eksosomit ovat mielenkiintoinen lähde uusille
biomerkkiaineille.
Tutkimuksessa pyrittiin seulomaan vasta-ainekirjastosta sellaisia vasta-aineita, jotka
sitoutuvat spesifisesti eturauhassyöpäperäisiin eksosomeihin. Eksosomit eristettiin
eturauhassyöpäpotilaiden antamista virtsanäytteistä, jotka oltiin jaoteltu neljään
ryhmään syövän aggressiivisuutta kuvaavan Gleason scoren perusteella. Lisäksi
eristettiin eksosomit näytteistä, jotka olivat peräisin eturauhasen hyvälaatuista
liikakasvua sairastavilta sekä terveiltä.
Vasta-ainekirjastosta seulottiin vasta-aineita eri eksosomeille faaginäyttötekniikan
avulla. Eksosomit kiinnitettiin streptavidiinillä päällystettyjen magneettisten
partikkelien pintaan biotinyloidulla vasta-aineella, joka sitoutuu yleiseen
eksosomaaliseen transmembraaniproteiini-CD9:ään. Selektioita tehtiin kolme
kierrosta. Kunkin kierroksen päätteeksi seulotusta faagipopulaatiosta monistettiin
vasta-aineiden geenit polymeraasiketjureaktiolla käyttäen alukkeita, jotka
mahdollistavat geenien sekvensoinnin Illuminan MiSeq-laitteistolla.
Tutkimus jatkuu geenikirjastojen sekvensoinnilla ja sekvenssidatan analysoinnilla.
Tarkoituksena on löytää vasta-aineita, jotka rikastuvat seulonnoissa vain
syöpäperäisillä eksosomeilla. Tällaisen vasta-aineen löytyminen voisi mahdollistaa
myös uuden merkkiaineen löytymisen.
Asiasanat: eturauhassyöpä, eksosomi, vasta-ainekirjasto, faaginäyttötekniikka
50
NUORET TUTKIJAT 2015 KIITTÄÄ
ABACUS Diagnostica
Apetit
DHR Finland Oy, Innotrac Diagnostics
Fazer
Hidex
HyTest
Immuno diagnostic Oy
Kaivogen
Luonnontieteiden Akateemisten Liitto
LVI-insinööritoimisto Alfa Oy
Maahovi Oy
Medix Biochemica
Oligomer Oy
PerkinElmer
Tekniikan akateemiset
Turku Science Park
NUORET TUTKIJAT 2015 verkossa:
http://www.utu.fi/fi/yksikot/sci/yksikot/biokemia/laitos/NT/Sivut/home.aspx
51