1. No category

NUORET TUTKIJAT 2016
Bajwa Azfar Ali
Haikonen Heta
Hakanen Marika
Kelanne Niina
Kerko Anssi
Kivimäki Laura
Koponen Annika
Kumpulainen Annamari
Kumpulainen Venla
Li Zhuoran
Mantziari Anastasia
Miihkinen Mitro
Mulaku Edita
Mäkilä Jenna
Nylander Merja
Nyqvist Aleksi
Petrova Natalija
Pyykkö Jonna-Kaisa
Raittola Auri
Ryödi Elina
Saarinen Fred
Saha Julia
Seppälä Tanja
Talvi Mikko
Taskinen Maria
Tenhu Elina
Terävä Joonas
Vainio Jiri
Wall Milla
Vanhatalo Sanja
Virtanen Mika
Vuorinen Eerika
VIIKON AVAUS
TIISTAI 15.3.2016 kello 1215
Arcanum Arc1
NUORET TUTKIJAT 2016 -ESITELMÄSESSIOT
TIISTAI 15.3.2016 - PERJANTAI 18.3.2016
alkaen kello 1215
Arcanum Arc1
NUORET TUTKIJAT 2016 -POSTERINÄYTTELY
TIISTAI 15.3.2016 - PERJANTAI 18.3.2016
Arcanum Ala-aula
POSTERISESSIO
KESKIVIIKKO 16.3.2016 13 35 -1440
Arcanum Ala-aula
LOPPUSANAT
PERJANTAI 18.3.2016 kello 1525
Arcanum Arc1
Painopaikka: Grano Oy, Turku
Painos: 200 kpl
Koonnut: Jukka-Pekka Suomela ja Mika Kaimainen
« I»
TIISTAI 15.3.2016 1215 – 1355
Viikon avaus 1215 – Seppo Sarimo, tapahtuman ”isä”
Puheenjohtaja: DI Niko Markkinen
« 1 » 1235
Eerika Vuorinen
Karpaloviinin ja -liköörin sakkautuminen
ELINTARVIKEKEHITYS (DI)
« 2 » 1255
Elina Tenhu
Tyrnin lehdistä valmistettu haudukejuoma - prosessoinnin vaikutus fenolisiin yhdisteisiin
ELINTARVIKEKEHITYS (DI)
« 3 » 1315
Niina Kelanne
Viinihiivan vaikutus mustaherukkaviinin kemialliseen koostumukseen – antosyaanit ja alkoholit
ELINTARVIKEKEHITYS (DI)
« 4 » 1335
Tanja Seppälä
Puolukkamehun ja -makeisten maun muokkaaminen
ELINTARVIKEKEHITYS (FM)
1355 – 1410 TAUKO 15 minuuttia
« II »
TIISTAI 15.3.2016 1410 – 1545
Puheenjohtaja: FM Vilja Siitonen
« 5 » 1410
Aleksi Nyqvist
Antibioottia tuottavan maaperäbakteerin metabolian muokkaus
BIOKEMIA
« 6 » 1430
Marika Hakanen
RIGVIRin ja echovirus 7 -virusisolaattien genomisekvensointi ja käyttö onkolyyttisessä
viroterapiassa
BIOKEMIA
« 7 » 1450
Maria Taskinen
MASTL-kinaasi rintasyöpäsolujen adheesion ja myosiinin kevytketjun fosforylaation säätelijänä
BIOKEMIA
« 8 » 1510
Mitro Miihkinen
Myosin-X: A molecular motor driving cancer cell invasion
BIOCHEMISTRY
1530 Alumnin puheenvuoro
« III »
KESKIVIIKKO 16.3.2016 1215 – 1335
Puheenjohtaja: FM Juhani Aakko
« 9 » 1215
Auri Raittola
Hajuaistin määrittäminen hajukynäsarjalla
ELINTARVIKEKEMIA
« 10 » 1235
Mika Virtanen
Härkäpapulisäyksen merkitys jauhelihapihvien aistittaviin ominaisuuksiin
ELINTARVIKEKEHITYS (FM)
« 11 » 1255
Anastasia Mantziari
The impact of storage conditions on the stability of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and
Bifidobacterium animalis subsp. lactis (Bb12) in human breast milk
FOOD DEVELOPMENT (M.Sc. tech.)
« 12 » 1315
Li Zhuoran
Using SPME-GC-MS combined with H2S sensor to analyse changes in head-space volatile
compounds during storage of packaged poultry samples
FOOD DEVELOPMENT (M.Sc. tech.)
POSTERISESSIO
KESKIVIIKKO 16.3.2016 1335 -1440
Arcanum Ala-aula
Opiskelijat postereidensa äärellä
Tarjoilua
« IV »
KESKIVIIKKO 16.3.2016 1440 – 1600
Puheenjohtaja: FM Matti Turtola
« 13 » 1440
Annika Koponen
X Comparison of cellular uptake of red blood cell and platelet originated extracellular vesicles into
PC-3 and HUVEC cells
BIOKEMIA
« 14 » 1500
Fred Saarinen
ErbB4:n JM-a CYT-1 - ja JM-a CYT-2 -alamuotojen yhteissignalointi
BIOKEMIA
« 15 » 1520
Elina Ryödi
Herpes simplex -viruksen neurovirulenssigeeni aktivoi eksosomien tuottoa epiteelisoluissa
BIOKEMIA
« 16 » 1540
Venla Kumpulainen
Characterization of long non-coding RNAs in regulatory T helper cell polarization
BIOCHEMISTRY
« V»
TORSTAI 17.3.2016 1215 – 1350
Puheenjohtaja: FM Antti Kulmala
« 17 » 1215
Mikko Talvi
Kemiantuotannon suodatusprosessien optimointi diagnostiikkateollisuudessa
BIOTEKNIIKKA (DI)
« 18 » 1235
Jenna Mäkilä
Antigeeniosoitustestin kehitys Clostridium difficile -infektiolle
BIOTEKNIIKKA (DI)
« 19 » 1255
Jiri Vainio
RNA:n tunnistukseen perustuvan helppokäyttöisen norovirustestin kehittäminen
BIOTEKNIIKKA (DI)
« 20 » 1315
Laura Kivimäki
Glykoproteiinispesifisten vasta-aineiden kehittäminen munasarjasyövän seulontaan
BIOTEKNIIKKA (DI)
1335 Alumnin puheenvuoro
FT Piia von Lode
1350 – 1405 TAUKO 15 minuuttia
« VI »
TORSTAI 17.3.2016 1405 – 1540
Puheenjohtaja: FM Marika Kalpio
« 21 » 1405
Annamari Kumpulainen
Paikkaisomerian vaikutus triasyyliglyserolien rasvahappojen imeytymiseen terveillä ja metabolista
oireyhtymää sairastavilla
ELINTARVIKEKEMIA
« 22 » 1425
Heta Haikonen
Lajikkeen vaikutus mustaherukan fenolisiin yhdisteisiin
ELINTARVIKEKEMIA
« 23 » 1445
Jonna-Kaisa Pyykkö
Sakeuttamisaineiden vaikutus vähäsokeristen mehutuotteiden sokerikoostumukseen ja uuden
analyysimenetelmän validointi
ELINTARVIKEKEMIA
« 24 » 1505
Merja Nylander
Flavonoliglykosidit ja aistittava laatu suomalaisissa ja virolaisissa tyrnimarjoissa (Hippophae
rhamnoides)
ELINTARVIKEKEMIA
1525 Alumnin puheenvuoro
Kaisa Halme
« VII »
PERJANTAI 18.3.2016 1215 – 1350
Puheenjohtaja: FM Kati Thiel
« 25 » 1215
Edita Mulaku
Synteettisen biologian sovellukset tehokkaampien syanotuottokantojen kehityksessä - RBS:n
vaikutus translaatiotehokkuuteen
BIOKEMIA
« 26 » 1235
Azfar Ali Bajwa
Calcium induced proteome changings in isolated chloroplasts of Arabidopsis thaliana
MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY
« 27 » 1255
Natalija Petrova
Design of synthetic biology tools in Synechocystis sp.PCC 6803: Evaluating the effect of gene order
in multi-gene operons
MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY
« 28 » 1315
Sanja Vanhatalo
Do the secreted molecules of the gut bacterium Faecalibacterium prausnitzii inhibit the fat
accumulation in hepatocytes in vitro?
MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY
1335 Alumnin puheenvuoro
FT Reetta Kettunen
1350 – 1405 TAUKO 15 minuuttia
« VIII »
PERJANTAI 18.3.2016 1405 – 1540
Puheenjohtaja: FM Satu Lahtinen
« 29 » 1405
Julia Saha
Homogeeninen PCR-monianalyyttimääritys XLA- ja SCID-oireyhtymille
BIOTEKNIIKKA (DI)
« 30 » 1425
Anssi Kerko
Puolijohdetransistoripohjaisen sensoritekniikan kehittäminen reaaliaikaiseen PCR-määritykseen
BIOTEKNIIKKA (DI)
« 31 » 1445
Milla Wall
Europium(III) akseptorina käänteisviritteisessä resonanssienergiansiirrossa
BIOTEKNIIKKA (DI)
« 32 » 1505
Joonas Terävä
Paksusuolen syövän CEA:lle spesifinen lektiininanopartikkelimääritys
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Loppusanat 1525 - Professori Baoru Yang
OSALLISTUJAKSI LÄÄKETUTKIMUKSEEN?
Clinical Research Services Turku – CRST Oy tuottaa tutkimuspalvelua
lääkkeitä, lääkinnällisiä laitteita ja terveysvaikutteisia elintarvikkeita
kehittäville toimijoille. CRST on toiminut vuodesta 1995 lähtien ja on Suomen
suurin ensivaiheen kliinisiä lääketutkimuksia tekevä keskus.
Tutkimuksissa testataan uusien sekä jo markkinoilla olevien lääkkeiden ja
elintarvikkeiden turvallisuutta ja tehoa. Kaikkiin tutkimuksiin liittyy
tutkittavalle tehtävä lääkärintarkastus ja laboratoriokokeita. Tutkimuslääkkeet
ja toimenpiteet ovat maksuttomia ja matkat korvataan. Jos tutkimus ei liity
sairauden hoitoon, maksetaan osallistumiskorvaus, jonka suuruus perustuu
tutkimuksessa käytettyyn aikaan ja vaivannäköön.
Etsimme tutkimuksiin osallistujiksi sekä potilaita että terveitä miehiä ja naisia.
Tutkimukseen osallistuminen edellyttää, että
· olet yli 18-vuotias
· olet tutkimukseen soveltuva terveydentilasi suhteen
· ymmärrät, että tutkimus on vapaaehtoinen ja että voit halutessasi
keskeyttää osallistumisesi.
Voit tutustua käynnissä oleviin tutkimuksiin internet-sivuillamme
www.crst.fi. Löydät meidät myös Facebookista https:
//www.facebook.com/CRSTturku#.
Jos kiinnostuit, voit ottaa yhteyttä myös sähköpostitse [email protected] ja
ilmoittautua CRST:n mahdollisten tutkittavien rekisteriin. Rekisteriin
ilmoittautuminen ei sisällä velvollisuutta osallistua tutkimuksiin.
https://www.facebook.com/CRSTturku#
«1»
Karpaloviinin ja -liköörin sakkautuminen
Eerika Vuorinen
Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja FM Marika Kalpio
ELINTARVIKEKEHITYS (DI)
Sakan muodostumista on tutkittu etenkin valkoviineissä. Yhdeksi ongelman
aiheuttajaksi on tunnistettu PR (pathogen-related)-proteiinit, etenkin taumatiinin (engl.
thaumatin) ja kitinaasin (engl. chitinase) kaltaiset proteiinit. On kuitenkin spekuloitu,
etteivät nämä proteiinit sakkaudu yksinään, vaan siihen voi vaikuttaa esimerkiksi jotkin
polyfenolit.
Pernod Ricardilla on havaittu ajoittain, että karpaloviineihin ja -likööreihin muodostuu
sakkaa. Tutkimukseni aiheena on selvittää syitä tähän ja mahdollisia tapoja, miten sen
muodostumisen voi ehkäistä tai poistaa. Sakkaa on todettu muodostuvan helpoiten
kylmässä, mutta ongelmallisinta on, mikäli sakkautumista tapahtuu huoneenlämmössä
eli olosuhteissa, joissa tuotteita myydään ja säilytetään.
Tutkimus aloitettiin selvittämällä sakan koostumusta. Viinistä, likööristä ja molempien
sakoista on analysoitu kokonaisproteiinipitoisuus Bradford- ja Biuret-menetelmillä.
Samoista
näytteistä
uutettiin
proantosyaniinit
ja
uutteet
analysoitiin
nestekromatografisesti
(HPLC)
sekä
normaaliettä
käänteisfaasilla.
Kokonaisproteiinipitoisuus saatiin selville Biuret-menetelmällä ja normaalifaasilla
proantosyaniiniprofiileissa nähtiin ero näytteiden välillä.
Työ jatkuu kehittämällä sekä proantosyaniinien uuttamista että normaalifaasi- HPLCmenetelmää,
jonka
jälkeen
yhdisteet
voidaan
mahdollisesti
tunnistaa
massaspektrometrilla. Myös muut fenoliset yhdisteet tullaan analysoimaan tarkemmin
nestekromatografilla ja proteiinit taas kaasukromatografilla.
Asiasanat: karpalo, likööri, proteiini, polyfenolit, sakka, viini
«2»
Tyrnin lehdistä valmistettu haudukejuoma - prosessoinnin vaikutus fenolisiin
yhdisteisiin
Elina Tenhu
Ohjaajat: M.Sc. (tech) Xueying Ma, FT Oskar Laaksonen ja prof. Baoru Yang
ELINTARVIKEKEHITYS (DI)
Tyrni (Hippophaë rhamnoides L.) on parhaiten tunnettu marjoistaan, mutta tyrnin
lehdistä voidaan valmistaa tyrnilehtihauduketta, joka on teen kaltainen juoma. Tyrnin
lehdet sisältävät enemmän fenolisia yhdisteitä, kuin marjat. Fenoliset yhdisteet
kuitenkin voivat hajota korkeissa 80–100 °C lämpötiloissa. Yksittäisistä
fenoliyhdisteistä tyrni sisältää muun muassa kversetiinin ja isoramnetiinin johdannaisia,
joilla on havaittu terveydelle edullisia antioksidatiivisia ja antimikrobiaalisia
vaikutuksia. Musta tee myös sisältää vastaavanlaisia kversetiinin johdannaisia, jotka
saavat aikaan suuta kuivattavaa suutuntumaa teessä. Työn tavoitteena on tunnistaa ja
määrittää, minkälaisia fenolisia yhdisteitä uuttuu lehdistä haudukkeisiin ja kuinka paljon
hyödyntäen erilaisia lehtien kuivatustekniikoita.
Tyrnilehdet on kuivattu mahdollisimman yksinkertaisilla tavoilla kylmäkuivaimessa,
huoneenlämmössä, sekä lämpökaapissa eri lämpötiloilla, joita ovat 80–90 °C, 60–70 °C
ja sekoituksella eri lämpötiloja. Lisäksi osa lehdistä on käsitelty vesihöyryssä, jonka
tarkoituksena on estää hapettavien entsyymien toiminta lehdissä. Tutkimuksessa on
mukana Terhi ja Tytti tyrnilajikkeet ja näytteinä ovat tyrnilehti-infuusio, sen jäännös ja
tuoreet lehdet. Fenoliset yhdisteet eristetään uuttamalla näytteet vesiasetoniliuoksella
sekä kylmäkuivaimella. Näytteet analysoidaan nestekromatografisilla menetelmillä
käyttäen HPLC-DAD ja HPLC-ESI-MS(/MS) -laitteistoja.
Tutkimus on vielä kesken, mutta alustavien analyysien perusteella Tytti ja Terhi
lajikkeissa ja kuivatusprosesseissa on pieniä eroavaisuuksia. Alustavasti tyrnin lehdistä
on tunnistettu muun muassa kversetiinin 3-O-rutinosidi ja 3-O-galaktosidi sekä
isoramnetiinin 3-O-rutinosidi ja 3-O-glukosidi. Terhi sisältää suuremman määrän
isoramnetiini-3-O-rutinosidi yhdistettä kuin Tytti. Yhdisteiden tunnistus varmistetaan
MS(/MS)-detektorilla. Verrattaessa infuusioita, jäännöksiä ja tuoreita lehtiä toisiinsa
huomataan, että infuusio sisältää vähiten fenolisia yhdisteitä verrattuna jäännökseen ja
tuoreisiin lehtiin.
Asiasanat: fenoliset yhdisteet, hauduke, HPLC, tee, tyrnin lehdet
«3»
Viinihiivan vaikutus mustaherukkaviinin kemialliseen koostumukseen –
antosyaanit ja alkoholit
Niina Kelanne
Ohjaajat: FM Marika Kalpio ja FT Oskar Laaksonen
ELINTARVIKEKEHITYS (DI)
Viiniä on valmistettu suunnitelmallisesti viinirypäleistä yli 7000 vuotta. Viiniä voidaan
valmistaa myös muista raaka-aineista kuin viinirypäleistä, jolloin niitä kutsutaan
hedelmäviineiksi. Suomessa viinirypäleiden kasvattaminen on haasteellista kylmän
ilmaston takia. Muiden marjojen, kuten mustaherukan, kasvattamiseen Suomen ilmasto
on sopiva. Viinit, jotka on valmistettu muusta kuin viinirypäleistä, ovat hedelmäviinejä.
Ammattimaisesti niitä valmistetaan Suomessa noin 200 000 litraa vuodessa.
Saccharomyces-suvun hiivalajit ovat käytetyimpiä hiivalajikkeita viinin valmistuksessa,
koska ne käyttävät ravintonaan useita sokereita ja niillä on korkea etanolitoleranssi.
Hiivalajien erojen tunteminen on tärkeää oikean lajin valitsemiseksi. Kaikki viinihiivat
eivät ole Saccharomyces-sukuisia, kuten työssä käytetty Torulaspora delbueckii
(Biodiva™).
Hiivalaji
vaikuttaa
fermentaationopeuteen,
etanolituotannon
sekundaaristen tuotteiden koostumukseen ja laatuun sekä viinin aromaattisiin
ominaisuuksiin.
Työssä valmistettiin 11 viiniä käyttäen kahta eri mustaherukkalajiketta, Mikaelia ja
LUKE:n lajike 15:ta, sekä neljää eri hiivalajiketta, Cross Evolution YSEO (S.
cerevisiae), Lalvin ICV-K1 (S. cerevisiae), Lalvin C (S. bayanus) sekä Biodiva™.
Viinit valmistettiin kolmea kotiviinireseptiä mukaillen. Käymisen edistymistä seurattiin
pH- ja Brix-mittauksin. Antosyaanien määrittämiseen käytettiin HPLC-DAD-laitteistoa
ja rakenneanalyysejä varten tullaan käyttämään UHPLC-DAD-MS-laitteistoa. Alkoholit
määritettiin GC-FID-laitteistolla.
Viineistä tunnistettiin kuusi antosyaania sekä alustavasti kaksi asyloitunutta
antosyaania. Lalvin C-hiiva saattaa muuttaa asyloituneiden antosyaanien
konformaatiota, mikä selvitetään UHPLC-DAD-MS:llä. Antosyaanien pitoisuuksiin
huomattiin vaikuttavan eniten marjalajike. Viininäytteistä tunnistettiin viisi alkoholia:
etanoli, metanoli, isoamyylialkoholi ja isobutanoli. T. delbrueckii yhdistettynä S.
cerevisiaehen huomattiin tuottavan suurimman pitoisuuden isoamyylialkoholia ja
isobutanolia. Alkoholien ilmenemiseen havaittiin vaikuttavan eniten hiivatyyppi.
Asiasanat: alkoholi, alkoholikäyminen, antosyaani, hedelmäviini, hiiva, kromatografia,
mustaherukka
«4»
Puolukkamehun ja -makeisten maun muokkaaminen
Tanja Seppälä
Ohjaajat: ETM Kristiina Tuukkanen, ETT Jussi Loponen ja FT Oskar Laaksonen
ELINTARVIKEKEHITYS (FM)
Puolukka on yleisin suomalainen metsämarja ja se sisältää bioaktiivisia yhdisteitä, kuten
polyfenoleja, vitamiineja ja kuituja. Puolukan käyttöä saattaa kuitenkin rajoittaa sen
hapan, karvas ja astringoiva maku. Työn tarkoituksena oli kokeilla erilaisia
elintarvikekelpoisia tekniikoita, joilla näitä makuja voidaan vaimentaa tai peittää.
Syklodekstriinit ovat glukoosiyksiköistä muodostuvia rengasmaisia molekyylejä, jotka
voivat sitoa sisäänsä karvaita molekyylejä. Gelatiinikäsittelyllä pyrittiin saostamaan
mehusta fenolisia yhdisteitä ja mahdollisesti vähentämään sen astringoivuutta.
Nostamalla pH:ta kokeiltiin, vaikuttaako nosto mehussa aistittavaan happamuuteen.
Menetelmiä sovellettiin kaupalliselle puolukkamehulle ja siitä valmistetuille
marmeladin kaltaisille makeisille. Tutkimus toteutettiin yhteistyössä Fazerin kanssa.
Käytettäviksi menetelmiksi valittiin esikokeiden perusteella syklodekstriinit,
gelatiinikäsittely, pH:n nostaminen natriumhydroksidilla, sekä niiden yhdistelmiä.
Käsittelyjen
vaikutuksen
arvioimiseksi
järjestettiin
mehuista
arvioinnit
kouluttamattomilla arvioijilla (n=40) ja makeisista koulutetulla raadilla (n=15x3).
Arviointien tuloksia tarkasteltiin McNemarin testillä, erilaisilla ANOVA-malleilla ja
pääkomponenttianalyysillä (PCA).
Gelatiinikäsitelty+syklodekstriini –mehua pidettiin mehunäytteistä useimmin
makeampana ja vähemmän happamana ja suuta kuivattavana kuin käsittelemätön mehu.
Arvioinneissa mukana ollut käsittelemättömästä mehusta valmistettu makeinen erosi
merkitsevästi mehusta kaikissa ominaisuuksissa, ollen makeampi ja vähemmän hapan,
karvas, suuta kuivattava ja kurtistava. Koulutetun raadin arvioinnissa käsitellyistä
mehuista valmistetut makeiset eivät eronneet huomattavasti käsittelemättömästä
mehusta valmistetuista tutkituissa ominaisuuksissa. Eri käsittelyjen välillä sen sijaan oli
joitakin tilastollisesti merkitseviä eroja. PCA-mallin perusteella pH-nostetut näytteet
korreloivat positiivisesti makeuden kanssa ja gelatiinikäsitelty+syklodekstriini -näyte
korreloi negatiivisesti jälkimaun ja kokonaismaun voimakkuuden kanssa.
Puolukkamehun ja –makeisten maun muokkaamisen haasteena on niiden voimakas ja
monimuotoinen maku. Tulosten perusteella tietyn ominaisuuden muokkaaminen voi
samalla korostaa tai peittää muita ominaisuuksia.
Asiasanat: maku, puolukka, marmeladi, syklodekstriini, gelatiini, pH
Kaikki alukeet, oligot, probet, PCR-primerit,
NextGen-oligot jne. nopeasti Oligomeristä,
Viikistä. 12 vuoden kokemuksella.
Mirus Bion kemiallisilla- ja elektroporaatioon
tarkoitetuilla transfektioreagensseilla onnistut
aina. Kysy ilmaisia näytteitä.
www.oligomer.fi
[email protected]
«5»
Antibioottia tuottavan maaperäbakteerin metabolian muokkaus
Aleksi Nyqvist
Ohjaaja: Dos. Mikko Metsä-Ketelä
BIOKEMIA
Mikrobien tuottamilla luonnonyhdisteillä on valtava vaikutus lääketieteeseen. Vuosien
1981 ja 2010 välillä hyväksytyistä lääkeaineista yli kolmasosa oli luonnoyhdisteitä tai
niiden synteettisiä johdannaisia. Nykyään bakteerien antibioottiresistenssin
kehittyminen on vakava ongelma ja siksi uusien lääkeaineiden löytäminen on todella
tärkeää. Tämä on kuitenkin haastavaa, sillä monia potentiaalisia yhdisteitä ei saada
tuotettua tarpeeksi suuria määriä tai ollenkaan laboratorio-olosuhteissa. Streptomycessuvun bakteerit ovat grampositiivisia maaperäbakteereja, joiden aktiivinen
sekundäärimetabolia muodostaa monia biologisesti aktiivisia luonnonyhdisteitä.
Erikoistyössä tutkittiin Streptomyces-sukuun kuuluvaa kantaa, joka tuottaa kahdesta
komponentista, I ja II, koostuvaa antibioottia sekä tuntematonta yhdistettä. Yhdisteiden
tuotto oli kuitenkin vähäistä tai olematonta normaaleissa kasvatusolosuhteissa, joten
bakteerin metaboliaa muokattiin reportteriohjatulla mutanttiselektiolla (RGMS).
Jokaiseen yhdisteeseen liittyen etsittiin geeni, jonka transkriptio on välttämätöntä
yhdisteen
muodostamiseksi.
Tämän
geenin
promoottorialue
kloonattiin
reportterikasettiin, jossa oli antibioottiresistenssigeeni ja xylE-reportterigeeni.
Reportterikasetti integroitiin Streptomyces-genomiin ja bakteerin metaboliaa muokattiin
sattumanvaraisella UV-mutageneesillä. Kasvatusmaljoilta seulottiin pesäkkeitä, jotka
olivat antibioottiresistenttejä ja muuttuivat XylE-määrityksessä keltaiseksi eli niissä
tutkitun yhdisteen tuotto oli aktivoitunut. Näille mutanteille tehtiin kasvatuskokeita ja
niiden tuottamat yhdisteet analysoitiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla
(HPLC).
Antibioottikomponenttien I ja II tuotto saatiin aktivoitua RGMS-menetelmällä. Kaikki
aktivoituneet mutantit tuottivat molempia yhdisteitä riippumatta siitä, kumpaa
promoottoria seulonnassa oli käytetty. Tämä viittaa siihen, että samat säätelyreitit
säätelevät molempien komponenttien tuottoa. Osa mutanteista ei tuottanut ollenkaan
oikeita yhdisteitä, vaikka niillä oli XylE-aktiivisuutta; tämä voi selittyä sillä, että
metabolia ei ole välttämättä samanlainen maljalla kuin liuoskasvatuksessa. Tutkimus
keskittyy jatkossa tuntematonta yhdistettä tuottavan geeniklusterin aktivointiin. Lisäksi
RGMS-menetelmää yritetään kehittää niin, että sitä voitaisiin hyödyntää suoraan
liuoskasvatuksissa.
Asiasanat: luonnonyhdisteet, sekundäärimetabolia, RGMS, Streptomyces
«6»
RIGVIRin ja echovirus 7 -virusisolaattien genomisekvensointi ja käyttö
onkolyyttisessä viroterapiassa
Marika Hakanen
Ohjaaja: FT Petri Susi
BIOKEMIA
Echovirus 7 (E-7) kuuluu pikornaviruksiin, jotka ovat pieniä ja vaipattomia viruksia,
joilla on ikosahedraalinen rakenne. E-7 on enterovirus, jonka positiivissäikeisen ja
yksijuosteisen RNA-genomin koko on noin 7500 emäsparia. Se käyttää
solureseptorinaan DAF-molekyyliä, jota ilmentyy useissa soluissa sekä erityisesti
syöpäsoluissa. Onkolyyttiset virukset tuhoavat syöpäsoluja viruksen lyyttisen kierron
ansiosta ja kohdistuvat spesifisesti soluihin, jotka ilmentävät viruksen käyttämää
reseptoria. Rigvir on onkolyyttinen, elävä, geneettisesti muokkaamaton, soluadaptoitu
echovirus 7, joka on Latviassa hyväksytty viruslääkkeeksi melanoomaa vastaan. Työssä
tutkittiin, miten Rigvir eroaa muista E-7-isolaateista genomiltaan ja infektiokyvyltään.
Kokeissa infektoitiin eri E-7-kantoja (Rigvir, E-7 Wallace ja 7 kliinistä isolaattia)
kymmeneen eri solulinjaan. Viruskannat tyypitettiin Sanger-sekvensoimalla.
Virusinfektiota ja virusten aiheuttamaa solutuhoa seurattiin mikroskooppisesti ja RTqPCR:n avulla. Työssä kehitettiin myös pitkä-PCR-menetelmä, jolla monistettiin koko
E-7:n genomi kloonattavaksi geenivektoriin. Virus-RNA:ta ja pitkä-PCR-tuotteita
käytettiin optimoimaan NGS-genomisekvensointimenetelmää, jolla pyrittiin näkemään
isolaattien välisiä eroja genomitasolla.
Rigvir ei eronnut infektiokyvyltään muista E-7-viruksista lukuun ottamatta SW480soluja. Yksikään viruksista ei infektoinut rintasyöpäsoluja. HeLa Ohio -soluja
infektoivat huonosti kaikki paitsi yksi kliinisistä E-7-isolaateista. Tyypityksessä selvisi,
että kolme käytetyistä isolaateista oli E-19-tyyppiä, jotka infektoivat hyvin
glioomasoluja. NGS-sekvensointi ajettiin kerran E-7-kannoista eristetyistä vRNApaloista, joista kaksi saatiin sopimaan verrokkina käytettyyn Wallace-sekvenssiin. Eroja
näkyi varsinkin 5’-pään alueella ja noin 6000 bp vastaavalla alueella. Vastaavia NGStuloksia odotetaan parhaillaan pitkä-PCR-tuotteista. Tutkimuksessa todettiin, että E7:llä on syöpäsoluja tuhoavia ominaisuuksia, mutta tulokset eivät osoittaneet Rigvirin
tuhoavan syöpäsoluja paremmin kuin muut E-7-isolaatit. Virusgenomeja tullaan
jatkossa analysoimaan tarkemmin mm. DAF-reseptorin sitoutumiskohdasta.
Asiasanat: E-7, Rigvir, NGS, onkolyyttinen virus, syöpä
«7»
MASTL-kinaasi rintasyöpäsolujen adheesion ja myosiinin kevytketjun
fosforylaation säätelijänä
Maria Taskinen
Ohjaajat: FT Elisa Närvä ja prof. Johanna Ivaska
BIOKEMIA
Rintasyöpä on suomalaisten naisten yleisin syöpä, johon sairastuu vuosittain noin 4000
suomalaista. Häiriöt solusyklin säätelyssä voivat saada solut jakautumaan
hallitsemattomasti, ja johtaa syövän syntymiseen ja kehittymiseen. Lisäksi solujen
adheesioon osallistuvien pintareseptoreiden, integriinien, säätely on muuttunut
syöpäsoluissa. Tämän takia solusyklin sekä adheesion säätelijöiden tutkiminen on tärkeä
osa syöpätutkimusta. MASTL (engl. microtubule associated serine/threonine kinaselike) on proteiini, joka tunnetaan solusyklin säätelijänä. Se edistää proteiinifosfataasi
2A:n (PP2A) inhiboimista ja solujen pääsyä mitoosiin fosforyloimalla substraattejaan
ENSA:a ja ARPP19:ta. Lisäksi MASTL:llä on nähty yhteys β1-integriinin inhibitioon
geneettisissä seulontakokeissa, ja MASTL:n on huomattu ilmentyvän voimakkaasti
etenkin rintasyöpäsoluissa.
Erikoistyöni tarkoituksena oli tutkia MASTL-kinaasin toimintaa ja vaikutusta
adheesioon. MASTL-geeniä hiljennettiin ja yli-ilmennettiin MDA-MB-231rintasyöpäsoluissa. MASTL:n vaikutusta solusykliin tutkittiin virtaussytometrialla, ja
vaikutusta adheesioon puolestaan tutkittiin reaaliaikaisen sähköisen impedanssin
monitoroimiseen perustuvan menetelmän sekä mikroskopian avulla. MASTL:n ja β1integriinin sijaintia soluissa tutkittiin fraktiointikokeiden ja konfokaalimikroskopian
avulla. Lisäksi tutkittiin MASTL:n vaikutusta myosiinin kevytketjun fosforylaatioon
Western blot- ja mikrokaavamenetelmien sekä konfokaalimikroskopian avulla.
Tutkimuksissa havaittiin, että MASTL:n hiljentäminen lisää merkittävästi MDA-MB231-solujen adheesiota kollageeniin. Hiljennettyjen solujen huomattiin myös olevan
normaaleja soluja suurempia, ja muodostavan vähemmän solunsisäisiä aktiinisäikeitä.
MASTL:n havaittiin esiintyvän interfaasin aikana sekä tumassa että sytoplasmassa, ja
MASTL:n sekä inaktiivisen β1-integriinin havaittiin esiintyvän samanaikaisesti solujen
kalvoröyhelöissä. Lisäksi MASTL:n hiljentämisen huomattiin vähentävän ja MASTL:n
yli-ilmentämisen lisäävän myosiinin kevytketjun fosforylaatiota (p-MLC, engl.
phosphorylated myosin light chain). Tämä viittaisi siihen, että MASTL-kinaasi säätelee
rintasyöpäsolujen adheesiota Rho/ROCK/p-MLC-signalointireitin ja mahdollisesti β1integriinien inhibition kautta.
Asiasanat: MASTL, solusykli, adheesio, integriini, myosiinin kevytketju
«8»
Myosin-X: A molecular motor driving cancer cell invasion
Mitro Miihkinen
Supervisors: Ph.D. Guillaume Jacquemet and Prof. Johanna Ivaska
BIOCHEMISTRY
In the process of metastasis, cancerous cells move away from the site of the primary
tumour to form multiple secondary tumours in other parts of the body, making it
impossible to treat the patient surgically. Metastasis is the leading cause of mortality
among cancer patients, formulating a need to study how cancer cells migrate, invade
human tissues and end up forming metastatic colonies in organs such as lungs, brain or
the liver.
Integrins are a class of transmembrane proteins that connect the ECM (extracellular
matrix) to actin cytoskeleton. Integrins can adopt inactive or active conformations that
will influence their ligand-binding affinity. During cell migration, cells use finger-like
protrusions called filopodia probe their environment. To probe the environment, cells
use motor proteins, such as myosin-X, to transport cargo to the tips of filopodia. a5b1
integrin is among the key adhesion molecules that myosin-X transports to the tip of the
filopodia to form nascent adhesions and stabilize the filopodia. After the formation of a
nascent adhesion, lamellipodia – a cellular structure formed by a network of actin
bundles – will advance, taking over the space that filopodia once occupied eventually
moving the cell into a new position.
Previous work has shown that myosin-X expression in patient samples correlates with
poor prognosis, cancer cell metastases and p53 mutation. However, there are still open
questions including: How are integrin brought to filopodia and how are they transported
along the filopodia ? In addition, what happens when myosin-X finally dissociates from
the integrin and is replaced by another proteins at the tip of the filopodia.
In this Pro Gradu work, using FACS (fluorescence activated cell sorting)-based integrin
activation measurements, I discovered that myosin-X expression inhibits integrin
activation in cancer cells. In addition, Proximity ligation assay experiments indicated
that myosin-X preferentially associates with inactive integrins. Together these data
indicate that binding to myosin-X locks the integrin in an inactive state. Further
experiments using state-of-the-art microscopy techniques and a newly developed
integrin binding assay support the observation that integrin–myosin-X interaction
happens between myosin and the pool of inactive integrin. Future experiments includes
high-resolution microscopy, such as electron and STED (stimulated emission depletion)
microscopy for a better spatial understanding of integrin transport along filopodia.
Keywords: Filopodia, cancer cell invasion, microscopy, integrin, protein-protein
interactions
«9»
Hajuaistin määrittäminen hajukynäsarjalla
Auri Raittola
Ohjaajat: prof. (vt) Kaisa Linderborg ja dos. Antti Knaapila
ELINTARVIKEKEMIA
Hajutestejä käytetään hajuaistin toiminnan testaamiseen tutkimuksessa ja
terveydenhuollossa sekä esimerkiksi elintarvikkeiden aistittavia ominaisuuksia
arvioivien raatien testaamisessa. Hajukynäsarja Sniffin' Sticks Extended on hajuaistin
mittaamiseen kehitetty testi. Testi koostuu kynnys-, erotus- ja tunnistustestistä (TDI,
sanoista threshold, discrimination ja idenfication). Kynnystestissä määritetään
fenyylietyylialkoholin ärsytyskynnys eli pienin pitoisuus, jonka tutkittava aistii.
Erotustestissä määritetään kohteen kyky erottaa hajuja toisistaan (16 sarjaa) ja
tunnistustestissä kohteen kykyä tunnistaa hajuja annettujen sanallisten vaihtoehtojen
avulla (16 ärsykettä). Näiden testien tuloksista saadaan yhteen laskemalla TDIpistemäärä.
Tässä tutkimuksessa testattiin 119:n henkilön hajuaisti hajukynäsarjalla. Heistä 85 (71
%) oli naisia ja 34 (29 %) miehiä. Osallistuneiden keski-ikä oli 31,9 vuotta ja
ikähaarukka oli 18–69 vuotta. Heistä 15 raportoi tupakoivansa. Hajutestin lisäksi
osallistujat täyttivät kyselylomakkeen, joka koski hajujen kokemista häiritsevinä ja
hajuista aiheutuvia fyysisiä oireita sekä hajujen vaikutusta ruuan, paikkojen,
kosmetiikan ja henkilöiden miellyttävyyteen. Osallistujia pyydettiin myös arvioimaan
oma hajuaistinsa asteikolla 0–10.
Tutkimuksessa todettiin, että hajuaistin itsearvio ei korreloinut TDI-pistemäärän kanssa.
Tämän perusteella henkilön kokemus omasta hajuaististaan olisi melko subjektiivinen.
Havaittiin myös, että naiset raportoivat kokevansa hajuja häiritseviksi useammin kuin
miehet (p=0,019). TDI-pistemäärään ei näyttänyt vaikuttavan sukupuoli, tupakointi tai
raportoidut ongelmat hajuaistissa. Sen sijaan havaittiin, että hajuaisti näyttää
huononevan iän myötä. Tätä väitettä tukevat myös aikaisemmat tutkimustulokset.
Lisäksi tarkasteltiin eri osien pistemäärien korrelaatiota keskenään. Kynnystesti ei
korreloinut kummankaan muun testin osan kanssa, mutta erotustestin ja tunnistustestin
tulokset korreloivat keskenään (r=0,22; p=0,019). Testin kannalta on hyvä, että sen
kaikkien osien tulokset eivät korreloi keskenään. Silloin saadaan laajempi kuva testatun
henkilön hajuaistista.
Työn toisessa osassa testille kehitetään jatko-osa, johon kutsutaan samat osallistujat
tulosten vertaamiseksi.
Asiasanat: hajuaisti, Sniffin' Sticks Extended, TDI-pistemäärä
« 10 »
Härkäpapulisäyksen merkitys jauhelihapihvien aistittaviin ominaisuuksiin
Mika Virtanen
Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen, FT Eila Järvenpää ja dos. Antti Knaapila
ELINTARVIKEKEHITYS (FM)
Härkäpapu (Vicia faba) on hernekasvien heimoon kuuluva palkokasvi, jota kasvatetaan
sekä ravinnoksi että rehuksi. Se sisältää noin 30 % proteiinia ja on kasviproteiinin
lähteenä lupaava kotimainen vaihtoehto soijapavulle, joka on maailman käytetyin
palkokasvilajike. Palkokasvit yksinään eivät kuitenkaan sisällä kaikkia välttämättömiä
aminohappoja, joten niiden ohella proteiinia on saatava myös muista lähteistä. Työn
tavoitteena on selvittää härkäpavun ja umamin lisäämisen vaikutusta jauhelihapihvien
aistittavien ominaisuuksien muuttumiseen, kun osa jauhelihasta korvataan.
Aistittavan laadun tutkimukset jaettiin kahteen vaiheeseen. Ensimmäisen osion
aistinvaraisissa arvioinneissa osallistujilta kysyttiin esikokeissa valituista näytteistä
sanallisia kuvailuja sekä miellyttävyyttä. Toisessa osassa koulutettiin 10-henkinen
analyyttinen arviointiraati. Raatilaiset osallistuivat koulutuksiin, joissa valittiin
arvioitavat ominaisuudet ja niille vertailunäytteet, sekä sovittiin arviointiasteikkojen
ankkuroinnista. Raati koulutettiin arvioimaan lihaisaa hajua, papumaista hajua,
rakeisuutta, tummuutta, suolaisuutta, umamia, rasvaisuutta, jauhoisuutta ja mehevyyttä.
Koulutuksen jälkeen raati osallistui arviointeihin, joissa näytteinä olivat kaksi
täysjauhelihapihviä, joista toiseen oli lisätty umamia lisäävää hiivauutetta, neljä
härkäpapupihviä, joissa jauhelihaa oli korvattu 25 % tai 50 % ja joissa osaan oli lisätty
hiivauutetta tai natriumglutamaattia, sekä soijapihvi, jossa korvausosuus oli 50 %.
Arvioinnit toistettiin kolme kertaa kullekin osallistujalle ja niissä käytettiin samoja
näytteitä satunnaistetussa järjestyksessä. Arviointien tuloksia tarkasteltiin
kolmisuuntaisella ANOVAlla (näyte, arvioija, toistot ja yhdysvaikutukset; p<0,05).
Härkäpapu lisäsi erityisesti jauhoista suutuntumaa ja vaalensi pihvien väriä. Rasvaisuus
ja mehevyys laskivat hieman verrattuna täysjauhelihapihveihin. Soijaa sisältänyt
jauhelihapihvi erosi muista näytteistä varsinkin papumaisen hajun sekä miedomman
umamin puolesta. Toisaalta 25 % korvatut härkäpapupihvit koettiin ensimmäisissä
arvioinneissa miellyttävämpinä kuin täysjauhelihapihvi tai 50 % korvatut pihvit.
Härkäpavun ominaisuudet vaikuttavat lupaavilta, mutta tuotekehitystä tarvitaan lisää.
Asiasanat: aistittava laatu, härkäpapu, jauhelihapihvi, proteiini, umami
« 11 »
The impact of storage conditions on the stability of Lactobacillus rhamnosus GG
(LGG) and Bifidobacterium animalis subsp. lactis (Bb12) in human breast milk
Anastasia Mantziari
Supervisors: M.Sc. Juhani Aakko and Ph.D. Himanshu Kumar
FOOD DEVELOPMENT (M.Sc. tech.)
Human breast milk is the optimal source of nutrition for neonates and is also a
continuous source of beneficial microbes that are important for the development of gut
microbiota and maturation of immune system. In some cases, breast milk can be
supplemented with probiotics to complement the health benefits of breastfeeding. For
instance, risk of necrotizing enterocolitis, which is the main cause of mortality in preterm infants, can be reduced by probiotic supplementation. Storage of human breast
milk for limited periods of time is often unavoidable, but little is known about how
storage conditions affect the breast milk microbiota and viability of probiotics. In this
study, we evaluated how different storage conditions affect the viability of two widely
used probiotics, Lactobacillus rhamnosus GG and Bifidobacterium animalis subsp.
lactis Bb12, in human breast milk.
Pooled breast milk samples were used as the study matrix. The breast milk was divided
into three groups: 1) supplementation with ~1x108 cfu/ml LGG; 2) ~1x108 Bb12 cfu/ml;
and 3) no supplementation. The samples were stored in room temperature for 6 hours,
+4οC for 6, 24 and 72 hours and -20οC for seven days after which the bacterial counts
were enumerated by culturing. The presence of LGG or BB12 was confirmed by
extracting DNA from isolated colonies and using polymerase chain reaction coupled
with strain-specific primers. In addition, the colonies from no supplementation group
were isolated for identification. All experiments were conducted in triplicate. Next,
bacterial DNA from the milk samples will be extracted and used for quantitative PCR to
confirm these results.
Overall, there was no difference in the viable cell counts of probiotics between the
different time points. Our results indicate that LGG and Bb12 remained stable during
the study period. This work serves as a basis for further studies on the stability of
probiotics in human breast milk.
Keywords: breast milk, probiotic supplementation, cold storage, viability
Abbreviations: LGG: Lactobacillus rhamnosus GG; Bb12: Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
« 12 »
Using SPME-GC-MS combined with H2S sensor to analyse changes in head-space
volatile compounds during storage of packaged poultry samples
Li Zhuoran
Supervisors: Doc. Jukka-Pekka Suomela and Ph.D. Mika Kaimainen
FOOD DEVELOPMENT (M.Sc. tech.)
Fresh poultry is commonly consumed food item. However, it is quite easily spoiled by
microorganism and has a short shelf life. The main problem for both sellers and
consumers is that due to different initial quality and different storage conditions, fresh
poultry may vary on shelf life. Thus it is hard to know their exact condition and wrong
estimation of due date may cause unnecessary waste or even food poisoning. Therefore,
it is meaningful to develop a more accurate and scientific way for detecting the
freshness conditions of poultry along the storage.
The aim of this thesis is to analyse the types and amount of volatile compounds formed
during storage of poultry samples and find the correlation between the head-space total
volatile compounds intensity with the freshness of poultry samples. The fresh poultry
samples are stored under modified atmosphere packaging (MAP, 50% CO 2+50% N2) at
4 ̊C. Also black currant pressed residue will be added on several samples as a natural
preservative to see its effect on the shelf life of poultry. The method used in this study is
Solid phase micro extraction-Gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS).
Microbiological test and sensory evaluation will be done on the same batch of samples
and the results will be used as the freshness reference.
GC-MS profiles of the samples are compared to the microbiological test results and
sensory evaluation results to find the correlation between total volatile compounds
intensity and the freshness of poultry samples. H2S sensors will be embedded in several
samples and the data obtained by sensors will also be compared with the GC-MS results
to test its accuracy and try to establish the correlation between sensor data and poultry
freshness. The further application of the results may be developing of a monitoring
system for the whole supply chain of poultry meat, which can analyse the freshness of
poultry products in real time.
Keywords: SPME-GC-MS, volatile compounds, poultry, shelf life
« 13 »
Comparison of cellular uptake of red blood cell and platelet originated
extracellular vesicles into PC-3 and HUVEC cells
Annika Koponen
Supervisors: Ph.D. Saara Laitinen, Ph.D. Erja Kerkelä and Ph.D. Tapani Viitala
BIOCHEMISTRY
Cells react to different stimuli by secreting membrane composed extracellular vesicles
(EVs), which are found in blood and other body fluids. EVs have a significant role in
mediating intercellular communication. They carry functional molecules such as RNA
and proteins from their cell of origin, which can be internalized into recipient cells and
cause changes in their phenotype. Because of EVs ability to function as molecular
vehicles, they are of therapeutic interest and could possibly be harnessed to deliver
drugs to target cells in diseases such as cancer.
The aim of our study is to compare the cellular uptake of red blood cell (RBC) and
platelet originated EVs into PC-3 prostate cancer cells and human umbilical vein
endothelial cells (HUVEC). RBC and platelet EVs are obtained from Finnish Red Cross
Blood Service, were they are isolated by ultracentrifugation from blood products of
healthy donors. EV particle concentration and size distribution is determined with
nanoparticle tracking analysis (NTA). The interactions of EVs with PC-3 and HUVEC
cells is studied mainly by surface plasmon resonance (SPR), which is a label free
method traditionally used for real-time surface interaction studies. A promising novel
approach for using SPR is to study nanoparticle-cell interactions with living cells, as
done in this study. To further elucidate the uptake and localization of EVs after
internalization into the cells, we use fluorescent dyes and confocal microscope. The
possible intracellular delivery of EVs to different target organelles such as ER and
early-/late endosomes, is illustrated with labelled organelle specific antibodies. Viability
tests are performed to examine the overall impact of RBC and platelet EVs on both PC3 and HUVEC cells after EV exposure.
The study is still ongoing but SPR measurements have already strongly suggested that
both RBC and platelet EVs are internalized by PC-3 cancer cells in an EV concentration
dependent manner. Due to unfortunate inefficiency with HUVEC cell adhesion onto
SPR sensors, no usable SPR data is yet available for their uptake analysis. Thus, further
experiments are needed before the comparison between RBC and platelet EV uptake
into PC-3 and HUVEC cells can truly be performed.
Keywords: extracellular vesicles, EV uptake, EV internalization, cell-EV interaction,
surface plasmon resonance
« 14 »
ErbB4:n JM-a CYT-1 - ja JM-a CYT-2 -alamuotojen yhteissignalointi
Fred Saarinen
Ohjaajat: FT Kari Kurppa ja prof. Klaus Elenius
BIOKEMIA
ErbB4 on reseptorityrosiinikinaasi ja kuuluu ErbB-reseptoriperheeseen, jonka muut
jäsenet ovat EGFR/ErbB1, ErbB2 ja ErbB3. ErbB4 välittää solun ulkopuolisia
signaaleja solun sisälle ja säätelee solun keskeisiä toimintoja kuten proliferaatiota,
kasvua, erilaistumista ja kuolemaa. ERBB4-geenista ilmentyy neljä eri alamuotoa: JM-a
CYT-1; JM-a CYT-2; JM-b CYT-1 ja JM-b CYT-2, mikä johtuu m-RNA:n eksonien
vaihtoehtoisesta silmukoinnista. Alamuotojen signalointi ja puoliintumisajat ovat
erilaiset. ErbB4:n alamuotojen toimintaa on aikaisemmin tutkittu lähes poikkeuksetta
erikseen, vaikka kudoksissa alamuodot ilmentyvät harvoin yksin. Tämän tutkimuksen
tarkoituksena on tutkia, miten ErbB4:n A1 ja A2 signaloivat yhdessä.
Koemallina käytettiin Ba/F3-solulinjaa, jossa ErbB-reseptoreja ei ilmennetä
endogeenisesti. A1 ja A2 transfektoitiin Ba/F3-soluihin retrovirustransfektiolla joko
erikseen tai yhdessä. Ba/F3-A1-, -A2- ja -A1/A2-solujen proliferaatiota ja proliferaation
aikaista solusignalointia tutkittiin ErbB4-ligandin, neureguliinin (NRG), läsnä ja poissa
ollessa. Alamuotojen aiheuttamaa solusignaloinnin aktiivisuutta tutkittiin
tarkastelemalla pI3K/Akt-, Erk- ja mTOR-signaalireittejä. Reseptorin puoliintumisaikaa
tutkittiin inhiboimalla proteiinisynteesiä soluissa sykloheksamidilla(CHX).
Ba/F3-A1/A2-solut proliferoituivat voimakkaammin kuin Ba/F3-A1- tai Ba/F3-A2solut. Solusignalointi oli aktiivisempaa Ba/F3-A1/A2-soluissa kuin Ba/F3-A2-soluissa,
kun solusignalointia tutkittiin usean päivän ajan. Alle tunnin aikapisteissä
solusignaloinnissa ja reseptorien puoliintumisajoissa ei havaittu eroja.
Tulosten perusteella signalointi on erilaista, kun ErbB4 A1- ja A2-alamuotoja
ilmennetään yhdessä. Tällä on merkitystä alamuotojen biologian ymmärtämisessä.
Asiasanat: ErbB4, signalointi, JM-a CYT-1, JM-a CYT-2, reseptorityrosiinkinaasi
120 vuotta kilpailukykyä osaamisesta
« 15 »
Herpes simplex -viruksen neurovirulenssigeeni aktivoi eksosomien tuottoa
epiteelisoluissa
Elina Ryödi
Ohjaajat: FT Outi Heikkilä ja LKT, dos. Veijo Hukkanen
BIOKEMIA
Herpes simplex -virus (HSV) on yleinen ihmisen virus, jota esiintyy kahta tyyppiä:
HSV-1 ja HSV-2. HSV on hyvin adaptoitunut isäntäänsä, aiheuttaen vain harvoin
äkillisiä, tappavia infektioita. Primääri-infektion jälkeen virus kulkeutuu tuntohermon
ganglioon ja jää sinne muodostaen latentin eli piilevän infektion. Toisinaan HSV voi
aktivoitua uudelleen esimerkiksi elimistön alentuneen puolustuskyvyn takia.
Eksosomit ovat pieniä solun ulkopuolelleen erittämiä kalvo-organelleja, jotka
vaikuttavat solujen keskinäisessä viestinnässä. Ne kuroutuvat irti solukalvosta ja
vaikuttavat paikallisesti tai kulkeutuvat verenkierron mukana. Myös virusinfektoituneet
solut erittävät eksosomeja, jotka voivat kuljettaa viruksen proteiineja ja
nukleiinihappoja naapurisoluihin joko helpottaen virusinfektion leviämistä tai herättäen
immuunivasteita virusta vastaan.
Tässä erikoistyössä tutkittiin eksosomien merkitystä HSV-1 -infektiossa käyttäen
HaCaT-epiteelisolulinjaa. Tutkimusta varten tuotettiin ja puhdistettiin HSV-1 luonnonkanta sekä kaksi siitä johdettua, geeniterapiavektoreiksi soveltuvaa
poistogeenistä virusta, joista oli poistettu neurovirulenssigeeni γ134,5. Viruspreparaatti
puhdistettiin ultrasentrifugaatiolla tiheysgradientissa. Virusfraktioista määritettiin
proteiinipitoisuus sekä infektiivisen viruksen määrä. Näiden perusteella valittiin
edelleen fraktiot Western blot -analyysiin, jossa analysoitiin valittujen fraktioiden virusja eksosomiproteiineja.
Tutkimuksissa havaittiin, että HSV-1 -luonnonkannalla ja poistogeenisillä kannoilla
saatiin gradienttipuhdistuksessa erilaiset jakaumat. Proteiini- ja infektiivisyysprofiilit
olivat selvästi erilaiset verrattaessa luonnonkantaa ja γ134,5-deleetioviruksia. Western
blot -analyyseissä selvisi, että luonnonkannan viruksilla infektoidut solut erittivät
eksosomeja, ja virus- sekä eksosomiproteiinit paikantuivat samoihin fraktioihin. Sen
sijaan γ134,5-deleetiovirusinfektioissa ei erittynyt eksosomeja. Jos viruksesta taas oli
poistettu jokin muu geeni kuin neurovirulenssigeeni, eksosomeja erittyi, mikä viittaa
siihen, että eksosomien tuotto HSV-infektiossa on riippuvainen neurovirulenssigeenistä.
Asiasanat: Herpes simplex, eksosomi, neurovirulenssi, viruspuhdistus
« 16 »
Characterization of long non-coding RNAs in regulatory T helper cell polarization
Venla Kumpulainen
Supervisors: Adj. Prof. Omid Rasool and Prof. Riitta Lahesmaa
BIOCHEMISTRY
Regulatory T helper cells (Treg) play important role in controlling and suppressing other
immune cells by secreting multiple different cytokines. Depending on the signaling
environment and the cytokine stimulation, T helper (T H) cells are polarized toward
different subtypes including TH1, TH2, TH17 and Treg cells. The process of the T cell
differentiation is complex and is mediated through a series of overlapping networks that
include the signaling network, the epigenetic and transcription factor (TF) control
mechanisms at genome and proteome level. Recently, the discovery of the emerging
role of regulatory long non-coding RNAs (lncRNAs) in T cell differentiation added yet
another layer of complexity. Since the balance between different T H subtypes is
essential for the correct immune responses, it’s of major importance to understand and
unravel the detailed mechanisms behind the TH polarization.
The aim of this project was to characterize and study the functional role of T H cell
specific lncRNAs focusing on Treg. Here we used naïve CD4+ T lymphocytes isolated
from human umbilical cord blood which were polarized by culturing under different
cytokine conditions. Based on RNA sequencing data, a number of T reg-specific and
differentially regulated lncRNAs were selected for this study which included qRT-PCRbased lncRNA and miRNA expression, cellular localization, TGFβ titration and knockdown experiments.
Out of 11 initially selected lncRNAs, lncVK1 (upregulated in Treg & TH17) and lncMV2
(upregulated in TH17), represented the two best hits. lncVK1 is a new and unannotated
lncRNA identified here by RACE-PCR experiments. Our data showed lncVK1 to reside
mainly in the nucleus and to be induced by TGFβ, which is the driving cytokine for T reg
and TH17 cell differentiation. On the other hand, lncMV2 was mainly cytoplasmic.
Sequence analysis showed that lncMV2 contains a binding site for microRNA 31
(miR31), which is known to regulate Treg cell polarization and thus we compared the
expression profile of miR31 with lncMV2. For other functional studies, LNA-based
antisense oligos were used to knockdown the lncRNAs and measure the effect on
FOXP3 which is a major Treg driving TF. Unfortunately it was not possible to obtain
conclusive results from the few experiments done within the timeframe of this project
and currently the study is ongoing and carried out by others in the group. Identification
of the signaling mechanisms involved in T cell differentiation is important for
understanding and possibly therapeutically modulating these processes involved in
several immune mediated diseases.
Keywords: regulatory T helper cells, lncRNA, polarization
« 17 »
Kemiantuotannon suodatusprosessien optimointi diagnostiikkateollisuudessa
Mikko Talvi
Ohjaaja: DI Anne-Maarit Hiekka
BIOTEKNIIKKA (DI)
Korkealaatuisten reagenssien valmistus vaatii epäpuhtauksien, kuten liukenemattoman
materiaalin ja mikrobien poistamista. Suodatus on prosessi, jossa nesteestä tai kaasusta
erotetaan partikkeleita fyysisesti kuljettamalla liuos suodattimen läpi. Suodattimet ovat
yleisiä
kemiantuotannossa
niiden
edullisuuden,
monipuolisuuden
ja
helppokäyttöisyyden vuoksi. Wallac Oy on PerkinElmer konserniin kuuluva yritys, joka
tarjoaa diagnostisia ratkaisuja sairauksien seulontaan erityisesti vastasyntyneistä.
Yrityksen reagenssientuotanto koostuu useasta eri osastosta, joista yksin
kalibraattorivalmistuksessa on käytössä 29 erilaista suodatinmallia. Käytössäolevista
suodattimista osan valmistus on päättymässä, prosesseille ei ole määritelty
vaihtoehtoisia suodattimia, työskentely on monimutkaista ja kustannukset ovat korkeat.
Työn tavoitteena oli etsiä prosesseihin uudet yhtenäiset suodattimet ja varmistaa uusien
suodattimien soveltuvuus.
Ongelma kartoitettiin tutustumalla ohjeisiin sekä haastattelemalla osaston esimiehiä,
työntekijöitä ja asiantuntijoita. Uusi suunnitelma laadittiin kolmen eri
suodatinvalmistajan haastatteluiden ja materiaalien pohjalta. Suodattimien soveltuvuus
varmistettiin suodattamalla 4 ruiskusuodatettavaa liuosta, 4 laimennospohjaa ja 4
antigeeniliuosta. Liuosten laadunvalvonta toteutettiin spektrofotometrisesti, Victorfluorometrilla ja AutoDELFIA-määritysalustalla. Soveltuvat suodatinkoot selvitettiin
skaalaustestillä.
Suodatinten määrää vähennettiin yhtenäistämällä samankaltaisissa prosesseissa
käytettäviä suodattimia ja karsimalla ylimääräisiä esisuodatusvaiheita. Tämä onnistui
suodattimilla, joissa on sisäinen esisuodatin ts. kaksoiskalvorakenne. Testattavaksi
valittiin kaksoiskalvollinen ruiskusuodatin, karkea esisuodatin ja kaksoiskalvollinen
loppusuodatin. Testiliuokset suodattuivat ongelmitta. Suodosten laadunvalvonta osoitti,
etteivät uudet suodattimet merkittävästi sitoneet antigeeneja. Skaalaustestin perusteella
osaston kaikkiin suodatusprosesseihin valittiin yhteensä 4 eri suodatinta ja näistä
jokaiselle vaihtoehtoinen suodatinmalli yhteensä 3 eri suodatinvalmistajalta. Työllä
arvioitiin saavutettavan jopa 15% vuotuiset säästöt suodatinkustannuksissa, minkä
lisäksi epäsuoraa säästöä syntyy työskentelyn tehostumisella.
Asiasanat: suodatus, suodatin, prosessinoptimointi
« 18 »
Antigeeniosoitustestin kehitys Clostridium difficile -infektiolle
Jenna Mäkilä
Ohjaajat: FM Juha Koskinen, FT Janne Koskinen ja FM Etvi Juntunen
BIOTEKNIIKKA (DI)
Clostridium difficile
-bakteerin
aiheuttama
suolistoinfektio on
yleisin
terveydenhuoltoon liittyvä ripulin aiheuttaja. C. difficile muodostaa ääriolosuhteita
kestäviä itiöitä, jotka leviävät helposti erityisesti sairaaloissa ja hoivakodeissa.
C. difficile -bakteerit voivat kolonisoida paksusuolen, jos suoliston oma
bakteeritasapaino on häiriintynyt esimerkiksi antibioottikuurin aikana. Varsinaiset oireet
C. difficile -infektiossa (CDI) johtuvat bakteerin tuottamista toksiineista A ja B, joita
tuottaa vain osa C. difficile -kannoista. Taudinkuva vaihtelee oireettomasta
kolonisaatiosta ripuliin ja pahimmillaan paksusuolentulehdukseen. Koska
C. difficilen kantajuus voi olla paikoin yleistä eikä CDI:tä voida erottaa kliinisten
oireiden perusteella muista ripulinaiheuttajista, on tärkeää varmistaa taudinaiheuttaja
diagnostisella testillä oikean hoidon varmistamiseksi.
Diplomityön tavoitteena oli tutkia automatisoidun mariPOC-testijärjestelmän
soveltuvuutta CDI:n diagnostiikkaan. Työssä kehitettiin ArcDiaTM TPX
-määritystekniikkaan moniparametrinen antigeeniosoitustesti, jossa C. difficile
-infektio osoitetaan ulostenäytteestä. Kohteena CDI:n osoituksessa ovat bakteerin
pintaproteiini glutamaatti-dehydrogenaasia (GDH) sekä toksiinit A ja B, joilla
todennetaan bakteerikannan tuottavan toksiineja. Kehitetyn testin suorituskykyä
arvioitiin vertaamalla sitä markkinoilla oleviin lateraalivirtauspikatesteihin.
Kehitetyn C. difficile -testin analyyttinen herkkyys GDH:lle oli 9,3·104 bakt/ml, toksiini
A:lle 0,3 pM ja toksiini B:lle 0,6 pM. Testin herkkyys kliinisillä näytteillä oli GDH:lle
99 % verrattuna markkinoilla oleviin lateraalivirtauspikatesteihin ja toksiineille A/B 64
% verrattuna PCR:ään (toksiini B geeni). Herkkyydet olivat kirjallisuuden mukaan
linjassa muiden antigeeniosoitustestien kanssa. Kehitetty testi ei ristireagoinut
yleisimpien suolistobakteerien tai suolistoinfektiota aiheuttavien mikrobien kanssa.
Tulokset osoittivat, että mariPOC-testijärjestelmä soveltuisi hyvin CDI:n osoitukseen
ulostenäytteestä.
Asiasanat: Clostridium difficile, toksiini, antibiootti, antigeeniosoitustesti, TPXmääritystekniikka
« 19 »
RNA:n tunnistukseen perustuvan helppokäyttöisen norovirustestin kehittäminen
Jiri Vainio
Ohjaajat: Olli Mikkonen (FM) ja Antti-Heikki Tapio (FM)
Abacus Diagnostica Oy
BIOTEKNIIKKA (DI)
Akuutti gastroenteriitti eli äkillinen ruuansulatuskanavan tulehdus on yksi maailman
yleisimmistä sairauksista. Sen tavallisimpana aiheuttajana pidetään helposti tarttuvaa
norovirusta (NoV). Viidestä noroviruksen genoryhmästä kolmen (GI, GII, GIV)
tiedetään infektoivan ihmisiä GII:n ollessa selvästi vallitseva. NoV ei yleensä ole
hengenvaarallinen, eikä virusinfektion taltuttamiseen tarvita erityisiä hoitotoimenpiteitä.
Gastroenteriitin aiheuttajan selvittäminen on kuitenkin tärkeää mm. epidemiatilanteissa
leviämisen estämiseksi, sekä yleisesti riskiryhmiin kuuluvien potilaiden seulonnassa.
Diplomityössä
kehitettiin
yksivaiheiseen
käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioon (RT-PCR) perustuva NoV-testi kaupalliselle GenomEra
CDX™ -määritysalustalle (Abacus Diagnostica Oy). Testin homogeeninen
tunnistusmenetelmä perustuu NoV:n RNA:n monistamiseen käänteiskopioija- ja DNApolymeraasientsyymeillä,
sekä
sekvenssispesifisillä
oligonukleotidi-alukkeilla.
Monistustuotteiden muodostumista havainnoidaan fluoresoivilla lantanidikelaateilla
leimatuilla Taqman-koettimilla reaaliajassa. Käytetyt menetelmät mahdollistavat tarkan
ja luotettavan tulosten tulkinnan. Testiä varten kehitettiin myös yksinkertainen
ulostenäytteiden esikäsittelymenetelmä, jonka ansiosta aikaa vievää RNA:n eristystä ei
tarvita.
Työ aloitettiin ulostetta sietävien entsyymien etsimisellä, minkä jälkeen siirryttiin
oligonukleotidien suunnitteluun ja testaukseen. Huolimatta useista mutaatioista eri
NoV-kantojen välillä, in silico -analyysien, sekä PCR-testausten avulla löydettiin oligot,
joilla testi kykenee havaitsemaan luotettavasti NoV:n eri genotyypit. GI ja GII -oligojen
välillä ei havaittu ristireagointia. GenomEra-konseptin mukaisesti monistusreaktiossa
tarvittavat komponentit kuivataan reaktiolastuille valmiiksi, jolloin käyttäjän tarvitsee
vain lisätä näyte. Kehitetyllä näytteen esikäsittelymenetelmällä ulosteesta saadaan
suoraan
RT-PCR-yhteensopiva
näyte
laimennuksella,
sekä
lyhyellä
kuumennuskäsittelyllä. Kuumennus hajottaa viruskapsidin, jolloin NoV:n RNA
vapautuu liuokseen käänteiskopioijan ulottuville.
Asiasanat: Norovirus (NoV), käänteiskopiointi-PCR (RT-PCR), näytteen esikäsittely,
uloste, kuivakemia
« 20 »
Glykoproteiinispesifisten vasta-aineiden kehittäminen munasarjasyövän
seulontaan
Laura Kivimäki
Ohjaaja: FT Janne Leivo
BIOTEKNIIKKA (DI)
Munasarjasyöpä on maailmanlaajuisesti seitsemänneksi yleisin naisilla havaittava syöpä
ja kahdeksanneksi yleisin kuolemaan johtava syöpä. Munasarjasyövällä on
gynekologisista syövistä korkein kuolleisuus. CA-125 on suurikokoinen glykoproteiini
ja ainut laajassa käytössä oleva munasarjasyövän biomerkkiaine. Sen ongelmina ovat
puutteet spesifisyydessä ja sensitiivisyydessä. Usein munasarjasyöpä on jo levinnyt
laajalle potilaan saadessa diagnoosin, sillä syövän alkuvaihetta sairastavilla alle puolella
CA-125:n pitoisuus on huomattavasti koholla. CA-125:n kohonnut pitoisuus ei
myöskään aina kerro munasarjasyövästä, sillä esimerkiksi endometrioosia tai kirroosia
sairastavien CA-125-pitoisuudet ovat usein koholla. CA-125:llä on syöpäspesifisiä
glykosylaatiomuotoja, sillä syövän edetessä solun pintaproteiinien glykosylaatiomuodot
muuttuvat.
Diplomityön tavoitteena oli löytää CA-125:lle uusia vasta-aineita, jotka tunnistaisivat
spesifisesti CA-125:n syövästä johtuvia glykosylaatiomuutoksia. Tämä tehtiin
seulomalla ja rikastamalla Turun yliopistolla luodusta synteettisestä vastaainekirjastosta syöpäperäistä CA-125:ttä tunnistavat vasta-aineet faaginäyttötekniikan
avulla. Lupaavimpien vasta-aineiden geenit kloonattiin tuottovektoriin. Escherichia coli
-soluissa tuotettiin alkaalisen fosfataasin ja vasta-aineiden muodostamia
fuusioproteiineja, joita testattiin lektiini-immunomäärityksessä. Lektiinit oli konjugoitu
Eu-nanopartikkelien pintaan.
Faaginäyttötekniikalla onnistuttiin löytämään useita lupaavia vasta-aineklooneja, joista
parhaat valittiin jatkoseulontaan. Parasta lektiinivasta-aineparia testattiin kliinisillä
munasarjasyöpä- ja endometrioosinäytteillä. Kliinisillä näytteillä testattaessa tämä
lektiinivasta-ainepari
antoi
korkeamman
signaalin
syöpänäytteille
kuin
endometrioosinäytteille. Jatkossa vasta-ainetta on testattava lisää kliinisillä näytteillä,
jotta voidaan varmistua sen syöpäspesifisyydestä.
Asiasanat: Munasarjasyöpä,
glykosylaatio syövässä
CA-125,
faaginäyttötekniikka,
immunomääritys,
« 21 »
Paikkaisomerian vaikutus triasyyliglyserolien rasvahappojen imeytymiseen
terveillä ja metabolista oireyhtymää sairastavilla
Annamari Kumpulainen
Ohjaajat: FM Anu Nuora ja prof. (vt) Kaisa Linderborg
ELINTARVIKEKEMIA
Palmitiinihapon (16:0) runsas saanti on liitetty kohonneeseen sydän- ja verisuonitautien
riskiin. Palmitiinihapon sijainti triasyyliglyserolirungossa saattaa kuitenkin vaikuttaa
aterianjälkeisen
lipemian
voimakkuuteen.
Palmuöljy
sisältää
runsaasti
triasyyliglyserolien reuna-asemissa (sn-1/3) sijaitsevaa palmitiinihappoa. Suuri osa
elintarvikkeiden palmuöljystä on vaihtoesteröityä, sillä vaihtoesteröinti vaikuttaa rasvan
sulamisominaisuuksiin. Vaihtoesteröidyssä palmuöljyssä on enemmän palmitiinihappoa
triasyyliglyserolirungon keskiasemassa (sn-2), kuin alkuperäisessä palmuöljyssä.
Erikoistyön tarkoituksena oli tutkia palmuöljyä ja vaihtoesteröityä palmuöljyä
sisältävien aterioiden vaikutusta aterianjälkeiseen rasva-aineenvaihduntaan metabolista
oireyhtymää sairastavilla sekä terveillä miehillä. Tutkimus oli osa isompaa Aucklandin
yliopiston (Uusi-Seelanti) ja Turun yliopiston välistä yhteistyöprojektia.
Uudessa-Seelannissa toteutettuun kliiniseen ravitsemustutkimukseen osallistui 20
tervettä ja 20 metabolista oireyhtymää sairastavaa, iältään 45–60 –vuotiasta miestä.
Tutkimus oli kaksoissokotettu vaihtovuorotutkimus, jossa kukin tutkimushenkilöistä
nautti neljä erilaista aamiaista. Aamiaiset sisälsivät joko palmuöljyä, vaihtoesteröityä
palmuöljyä, auringonkukkaöljyä tai naudan rasvaa. Aamiaisen nauttimisen jälkeen
tutkimushenkilöiltä otettiin verinäytteitä viiden tunnin ajan. Verinäytteiden
kylomikronit eristettiin ultrasentrifugoimalla ja kylomikronifraktion lipidit uutettiin
kloroformi-metanolimenetelmällä.
Uutosta
saatujen
triasyyliglyserolien
rasvahappokoostumus analysoitiin metyyliestereinä kaasukromatografisesti.
Tutkimuksen tavoitteena on selvittää, alentaako koostumukseltaan kiinteämpi
vaihtoesteröity palmuöljy veren aterianjälkeistä triasyyliglyserolipitoisuutta verrattuna
tavalliseen palmuöljyyn, ja onko vaste erilainen terveillä ja metabolista oireyhtymää
sairastavilla. Aikaisempien tutkimusten perusteella voidaan odottaa, että metabolista
oireyhtymää sairastavilla triasyyliglyserolien siirtyminen verestä kudoksiin on
hidastunut terveisiin verrattuna. Toisena tavoitteena on selvittää, eroaako eri
rasvahappojen imeytymisnopeus tai poistumisnopeus verestä aterianjälkeisen tilan
aikana.
Asiasanat:
palmuöljy,
kaasukromatografia
metabolinen
oireyhtymä,
rasvahappokoostumus,
« 22 »
Lajikkeen vaikutus mustaherukan fenolisiin yhdisteisiin
Heta Haikonen
Ohjaajat: FM Ye Tian, FT Oskar Laaksonen, ja prof. Baoru Yang
ELINTARVIKEKEMIA
Tämän työn tarkoitus on tutkia mustaherukkalajikkeen vaikutusta fenolisten
yhdisteiden, kuten antosyaniinien, flavonolien ja fenolisten happojen pitoisuuteen.
Tutkimukset osoittavat fenolisilla yhdistellä olevan terveysvaikutuksia, joten kiinnostus
niiden lisäämiseen ruokavaliossa on kasvanut. Fenolisilla yhdisteillä on myös todettu
olevan antioksidatiivisia ja antimikrobisia vaikutuksia. 21 lajiketta kahdelta eri
satovuodelta tullaan analysoimaan tässä tutkimuksessa. Tässä vaiheessa
antosyaanikoostumus on tutkittu vuonna 2015 viljellyistä mustaherukkanäytteistä.
Kevään 2016 aikana myös vuoden 2014 mustaherukkanäytteistä tullaan tutkimaan
antosyaanit ja myös muita fenolisia yhdisteitä kummaltakin satovuodelta.
Antosyaniinianalyysissä kutakin lajiketta punnittiin 5 g neljänä rinnakkaisnäytteenä 50
ml:n falcon-putkiin. Marjat murskattiin ja uutettiin kolmesti (15mL MeOH/HCl (99:1).
Uuttoliuoksen lisäyksen jälkeen putkea ravisteltiin 1,5 min, minkä jälkeen sitä
sentrifugoitiin 10 min (3400g). Supernatantit kerättiin jokaisesta kolmesta uuttokerrasta
ja yhdistettiin 50 ml mittapulloon joka täytettiin lopuksi merkkiin uuttoliuoksella. 1 ml
näytettä suodatettiin 0,45 µm suodattimella ja analysoitiin HPCL-DAD -laitteistolla,
jossa oli Phenomenexin Aeris PEPTIDE 3.6 µm XB-C18 -kolonni. Ajoliuos A oli 5%
muurahaishappo ja ajoliuos B asetonitriili. Ajoliuosten gradienttiohjelma oli: 0–1 min,
4–6% B; 1–2 min, 6–8% B; 2–6 min, 8–9% B; 6–10 min, 9–10%; 10–14 min, 10–11%
B; 14–20 min, 11–18% B; 20–21 min, 18–24% B; 21–28 min, 24–80% B; 28–29 min,
80–20% B; 29–31 min, 20–4% B; 31–35 min, 4% B. Antosyaanipiikkejä havaittiin 15.
Tulokset analysoitiin Unscrambler-ohjelman pääkomponenttianalyysillä ja SPSSohjelmalla. Pääkomponenttianalyysi osoitti Ben Tirran -lajikkeen eroavan muista
poikkeuksellisen suurella antosyaanien 14 ja 15 -pitoisuudella. Ben Dorain, Ben Gairn,
Ben Tron, 8872-1, Dainiai ja Tisel erosivat muista suuremman antosyaniinipitoisuuden
vuoksi. Tämän erottumisen syy ei vaikuta olevan lajikkeiden lähisukulaisuus eikä
alkuperämaa. Muut fenoliset yhdisteet on tutkittava ennen johtopäätöksien tekemistä.
yksisuuntaisessa ANOVA + LSD post-hoc –testissä havaittiin tilastollisesti merkitsevän
eron skotlantilaisten ja suomalaisten, liettualaisten ja latvialaisten lajikkeiden välillä.
Asiasanat: antosyaani, fenoliset yhdisteet, mustaherukka, HPLC-DAD
« 23 »
Sakeuttamisaineiden vaikutus vähäsokeristen mehutuotteiden
sokerikoostumukseen ja uuden analyysimenetelmän validointi
Jonna-Kaisa Pyykkö
Ohjaajat: FM Marika Kalpio ja Dos. Jukka-Pekka Suomela sekä Laatu- ja
Laboratoriovastaava Hannele Nurminen (Eckes- Granini Finland Oy Ab)
ELINTARVIKEKEMIA
Appelsiini-, banaani-, omena- ja ananasmehu sisältävät kolmea pelkistävää sokeria,
fruktoosia, glukoosia ja sakkaroosia. Rypälemehu sisältää edellä mainittujen sokerien
lisäksi maltoosia ja galaktoosia. Tomaattimehussa on vain fruktoosia ja glukoosia.
Monosakkaridien rakenteessa oleva karbonyyliryhmä aiheuttaa pelkistävän vaikutuksen.
Karbonyyliryhmän pelkistyessä hydroksyyliryhmäksi syntyy sokerialkoholeja kuten
sorbitolia. Sorbitolia on pieniä määriä esim. omena- ja päärynämehuissa.
UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) on ympäristöystävällisempi
vaihtoehto kuin perinteinen HPLC- menetelmä, koska liuotin jätettä muodostuu
vähemmän. UHPLC- tekniikalla saadaan tarkemmin erotettua pieniä pitoisuuksia ja
ajoliuoksen kulutus pienenee. Lisäksi sokeriprofiilin analysointiin kuluu vähemmän
aikaa, jolloin menetelmä voidaan ottaa osaksi tuotannossa olevan mehun
laadunvarmistusta. Validoinnilla osoitetaan analyysimenetelmän soveltuvuus
käyttötarkoitukseen. Toistomittauksen avulla selvitetään menetelmän sisäinen
toistettavuus ja uusittavuus. Validoinnissa määritetään myös lineaarinen mittausalue,
toteamisraja (LOD) ja määritysraja (LOQ).
Työssä seurataan pektiinin, ksantaanikumin ja tärkkelyksen vaikutusta tuotteiden
sokeriprofiiliin. Sokerittomista mehuista valittiin kaksi makua, tiivisteistä, soseista ja
keitoista yksi maku jokaisesta. Analysoitaville mehuille tehdään kolmessa eri
lämpötilassa(+4 °C, +25 °C ja +30 °C) kahdeksan viikkoa kestävä säilyvyyskoe ja
analysoidaan sokeriprofiilit uudella työssä validoitavalla UHPLC- menetelmällä.
Säilyvyyskokeen tarkoituksena on seurata, tapahtuuko mehuissa pitkäketjuisten
sokerien happohydrolyysiä. UHPLC- menetelmä sokerien analysointiin tulisi osaksi
omavalvontaa. Tuotantoprosessissa olevista mehuista saatavan sokeriprofiilin
perusteella voitaisiin muokata tapahtuvaa valmistusprosessia. Työ on toteutettu
yhteistyössä Eckes- Granini Finland Oy Ab:n kanssa.
Asiasanat: mehut, pelkistävät sokerit, sakeuttamisaine, UHPLC, validointi
« 24 »
Flavonoliglykosidit ja aistittava laatu suomalaisissa ja virolaisissa tyrnimarjoissa
(Hippophae rhamnoides)
Merja Nylander
Ohjaajat: MSc (tech.) Xueying Ma, FT Oskar Laaksonen ja prof. Baoru Yang
ELINTARVIKEKEMIA
Tyrnimarjoissa on fenolisiin yhdisteisiin kuuluvia flavonoleja, jotka usein esiintyvät
kasvisoluissa flavonoliglykosideina. Ne suojelevat kasvisoluja hapettumiselta ja
mikrobeilta. Marjoista on löydetty isoramnetiinia, kversetiiniä, myrisetiinia ja
kemferolia. Tyrneissä on monia ihmisen terveydelle hyödyllisiä yhdisteitä, mutta
makuominaisuudet vaikuttavat ihmisten halukkuuteen syödä marjoja. Tyrnejä
kuvaillaankin usein happamiksi, karvaiksi, vähän makeiksi ja joskus myös
epämiellyttäviksi. Flavonoliglykosidien yhteys tyrnin makuominaisuuksiin on vielä
heikosti tunnettu. Tiedetään kuitenkin, että flavonoliglykosidit ovat astringoivia.
Mahdollisen yhteyden selvittämiseksi tarvitaan sekä kemiallisia että aistinvaraisia
tutkimuksia.
Tutkimuskohteena on suomalaisten ja virolaisten tyrnimarjojen kuoriosien ja
hedelmälihan flavonoliglykosidit. Työn tavoitteena on selvittää, miten eri
tyrnilajikkeiden flavonoliglykosidit eroavat toisistaan, ja miten ne ovat yhteydessä
marjan makuominaisuuksiin. Raisan, Pertsikin, Terhin ja Tytin marjat kerättiin Turussa
elokuussa 2015. Terhin ja Tytin ylikypsät marjat kerättiin lokakuussa 2015. Virolaiset
lajikkeet olivat Botanitšeskaja-Lybitelskaya, Vorobyevskaya, BotanitšeskajaLjubitelskaja, Trofimovskaja, Hergo, Leikora ja Askola. Flavonoliglykosidit eristettiin
kolmesti uuttamalla, ja yhdisteet analysoitiin erittäin korkean erotuskyvyn
nestekromatografialla.
Tutkimus on alkuvaiheessa, joten lopullisia tuloksia ei ole. Suomalaisista marjoista
havaittiin samoja flavonoliglykosideja, joista yleisimmät olivat isoramnetiini-3-Osoforosidi-7-O-ramnosidi, isoramnetiini-3-O-glukosidi-7-O-ramnosidi, isoramnetiini-3O-rutinosidi ja isoramnetiini-3-O-glukosidi. Myös muita flavonoliglykosideja oli, ja ne
tullaan tunnistamaan massaspektrometrialla. Tarkkoja flavonoliglykosidien määriä ei
ole vielä laskettu. Seuraavaksi tutkimuksessa koulutetaan raati, joka arvioi marjojen
makuominaisuuksia. Flavonoliglykosidien yhteyttä marjojen makuominaisuuksiin
tullaan tarkastelemaan tilastollisilla menetelmillä.
Asiasanat: aistittava laatu, astringoivuus, flavonoliglykosidit, Hippophae rhamnoides,
nestekromatografia, tyrni, uutto
« 25 »
Synteettisen biologian sovellukset tehokkaampien syanotuottokantojen
kehityksessä - RBS:n vaikutus translaatiotehokkuuteen
Edita Mulaku
Ohjaajat: FM Kati Thiel ja FT Pauli Kallio
BIOKEMIA
Fotosynteettiset syanobakteerit voidaan valjastaa tuottamaan erilaisia lopputuotteita,
kuten biopolttoaineita - suoraan vedestä ja hiilidioksidista käyttäen hyväksi auringon
energiaa. Tutkimuksen tavoitteena on rakentaa tehokkaita, helposti muokattavia ja
optimoitavia
biopolttoaineiden
tuottokantoja,
käyttäen
isäntäorganismina
syanobakteeria Synechocystis sp. PCC6803.
Käytämme hyväksemme synteettisen biologian menetelmiä kehittäessämme uusia
työkaluja erilaisten syanobakteereille soveltuvien ekspressiokonstruktien kokoamiseen
ja arvioimiseen. Tämän työn tavoitteena on määrittää erilaisten RBS-sekvenssien (engl.
ribosomal binding site, RBS) vaikutusta translaation aloitustehokkuuteen Synechocystis
sp. PCC6803:a. RBS on osa mRNA:n säätelyaluetta, joka ohjaa ribosomin sitoutumista
ja määrää siten translaation tasolla proteiinin ekspressiotehokkuuden. Erilaisia RBSsekvenssejä ei ole aikaisemmin systemaattisesti vertailtu syanobakteereiden
ylituottosysteemeissä, ja tavoitteenamme on nyt (i) identifioida parhaat sekvenssit
maksimaalisen translaatiotehokkuuden saavuttamiseksi, (ii) löytää sarja eri
tehokkuuksilla toimivia RBS-sekvenssejä, sekä (iii) tutkia koodaavan alueen
vaikutuksia translaatiotehokkuuteen.
Työssä vertaillaan 13 erilaisen RBS-sekvenssin vaikutusta kahden eri
fluoresenssiproteiinin (sYFP2 ja GFPm3) ekspressiotehokkuuteen Synechocystis sp.
PCC6803:ssa. Tulokset ovat osoittaneet että (i) ekpressiokontruktit ja niiden
rakentamiseen käytetyt työkalut toimivat suunnitelman mukaan, ja että (ii)
translaatiotehokkuutta (ja siten RBS-sekvenssien toimintaa) voidaan luotettavasti,
toistettavasti ja nopeasti kvantitoida fluoresenssin avulla suoraan soluista. Vaikka
kaikkia ekspressiokonstrukteja ei vielä ole tutkittu, on selvää että (iii) erilaisten RBSsekvenssien välillä on selviä eroja. Kehitettyjä työkaluja ja tutkimuksen antamaa tietoa
voidaan suoraan käyttää hyväksi ekspressiokonstruktien – ja siten fotosynteettisten
tuottosysteemien -optimoimisessa.
Asiasanat: synteettinen biologia, RBS, Synechocystis sp. PCC6803
« 26 »
Calcium induced proteome changings in isolated chloroplasts of Arabidopsis
thaliana
Azfar Ali Bajwa
Ph.D. Andrea Trotta, Ph.D. Docent Marjaana Suorsa and Academy Prof. Eva-Mari Aro
MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY
Calcium is a well-known regulator of various biological processes, such as
photosynthesis, in response to environmental challenges. Its role as secondary
messenger in signaling has been emphasized recently. The calcium-dependent signalling
network includes a large number of proteins interacting at different levels with several
targets. Although post translational modifications of the targets can be identified by
proteomics methods, the next challenge is to describe a signaling pathway by
integrating different systems biology approaches.
In this work, a novel method of calcium-dependent phosphorylation assay was
established. We have used ionomycin which is a calcium specific ionophore that
enabled to mimic the natural calcium concentrations in chloroplast during light (150nM)
and transition to dark (15 µM). Next, Difference In Gel Electrophoresis (DIGE) was
used to screen and map differentially expressing proteins between chloroplasts treated
with low and high levels of calcium. Furthermore, protein spots and their phosphosites
were identified by mass spectrometry.
The work presented here focuses on the targets of the calcium signaling in
photosynthesis. FNR1 and ATPD were found to be phosphorylated only in high calcium
treated chloroplasts, whilst FTSH2 (VAR2) and PsaE were found to be phosphorylated
only in low calcium treated chloroplasts. Novel phosphosites are also reported here. In
future, my work will form the basis for further studies to describe the signaling
pathway(s) and to better understand the regulation of photosynthesis.
Keywords: calcium dependent phosphorylation, ionomycin, phosphoproteomics
« 27 »
Design of synthetic biology tools in Synechocystis sp.PCC 6803: Evaluating the
effect of gene order in multi-gene operons
Natalija Petrova
Supervisors: Ph.D. Pauli Kallio and MSc Hariharan Dandapani
MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY
During the past years cyanobacteria have increasingly gained scientific attention as
photosynthetic microbial factories for producing different chemical compounds, such as
potential biofuels or their precursors. The main advantages of using cyanobacteria
include (i) their ability to use solar energy and CO2 as the sole carbon source for the
production of desired end-products and (ii) relatively simple demands in respect to
cultivation, which is not dependent on biomass-based substrates or land space which
could be dedicated for food production. In addition, cyanobacteria are rather easily
modifiable, and a large repertoire of molecular biology methods has already been
described. However, the main challenge remains to be the overall efficiency of the
production systems, and consequently, there is an urgent need for more efficient tools
and optimized expression systems towards the development of economically viable
biotechnological platforms.
This study focuses on evaluating factors associated with multi-gene operons as a part of
developing superior expression systems in cyanobacteria. The aim is to elucidate the
effect of gene order on the relative expression levels of individual gene products in
synthetic operons. The approach is to use synthetic biology tools to assemble a selection
of parallel operons carrying all possible combinations of three different fluorescent
marker genes (GFP, YFP, iRFP). The expression levels are then quantitatively evaluated
by the corresponding fluorescent signals produced in the cyanobacterial host
Synechocystis sp PCC 6803 in vivo.
All the two-gene combinations and the three-gene combinations of the three fluorescent
marker genes have been assembled as individual operons (12 different combinations
altogether), which have further been introduced into an expression plasmid compatible
with cyanobacteria. Transformation of the expression plasmids into the host
Synechocystis sp PCC 6803, and the following selection and verification are still under
progress. In the subsequent phase of the study, the resulting 12 strains will be quantified
and compared for YFP, GFP and iRFP signals using a fluorescence plate reader. This
study will provide us information on the optimal structure of multi-gene operons in
Synechocystis and will help us improve our strategies when engineering cyanobacteria
for future biotechnological applications.
Keywords: Synechocystis sp PCC6803, fluorescent protein, multi-gene operon, gene
order
« 28 »
Do the secreted molecules of the gut bacterium Faecalibacterium prausnitzii
inhibit the fat accumulation in hepatocytes in vitro?
Sanja Vanhatalo
Supervisors: M.Sc. Eveliina Munukka, Ph.D. Satu Pekkala,
Prof. Pentti Huovinen
MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY
Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a metabolic disorder in which fat
accumulates in liver due to causes other than excessive alcohol use. Fat accumulation
leads to cell dysfunction, lipotoxicity and apoptosis and can finally cause severe liver
injury. NAFLD, the most common chronic liver disease worldwide, is a disease in
which gut microbiota seems to play an important role. In previous studies our research
group has discovered that the abundance of specific gut bacterium Faecalibacterium
prausnitzii is lower in NAFLD patients. F. prausnitzii is one of the most abundant
bacterial species in a healthy human gut and a decreased amount of fecal F. prausnitzii
has been associated also to other diseases such as inflammatory bowel disease.
Two main aims of our project was to find out does the growth media of F. prausnitzii
possess beneficial effects on hepatocytes in vitro and to find dietary factors that
stimulate the growth and production of bioactive molecules of F. prausnitzii. F.
prausnitzii (ATCC 27766) was cultured in YCFAG medium in anaerobic chambers.
The effects of various fibres and PUFAS were studied by following changes in optical
density at 600 nm during 25h. As a model for fatty liver, human hepatocyte-derived cell
line HepG2 was used and the fat accumulation was induced with the mix of oleicpalmitic acid. The growth media supernatant of F. prausnitzii was applied on the
HepG2 cells together with oleic-palmitic acid mix. To quantify the amount of
intracellular fat, Oil Red O staining was used.
From growth stimulation studies we were able to identify a fibre that clearly stimulates
the growth of F. prausnitzii. The growth media supernatant of F. prausnitzii did not
inhibit the HepG2 fat accumulation in vitro compared to control YCFAG. To reliably
confirm that the beneficial characteristics of F. prausnitzii on metabolic health do not
apply in vitro, the method requires further optimization because of the complexity of
YCFAG media. Also it is likely that he effects of F. prausnitzii on liver are mediated by
the adipose tissue, which is something we are looking in future studies.
Keywords: Nonalcoholic fatty liver disease, Faecalibacterium prausnitzii
« 29 »
Homogeeninen PCR-monianalyyttimääritys XLA- ja SCID-oireyhtymille
Julia Saha
Ohjaajat: FT dos. Alice Ylikoski, FM Ville Laitala ja FT Ari Lehmusvuori
BIOTEKNIIKKA (DI)
SCID-oireyhtymässä (engl. severe combined immundenficiency) potilaalla ei kehity
toimivia T-imusoluja. TREC (engl. T-cell receptor excision circles) korreloi elimistön
T-imusolujen määrään, joten alhainen TREC-pitoisuus potilaan veressä on osoitus
SCID-oireyhtymästä. X-kromosomiin liittyvävässä agammaglobulinemiassa (XLA)
elimistö ei kykene tuottamaan toimivia B-imusoluja. KREC (engl. kappa-deleting
recombination circles) on verrannollinen B-imusolujen määrään veressä ja KRECanalyyttiä käytetään merkkiaineena XLA:lle. Ilman toimivia T-imusoluja ja/tai Bimusoluja elimistön puolustuskyky heikkenee. Vastasyntyneen ensimmäisenä
elinvuotena XLA voi aiheuttaa vakavia vaurioita elimiin erityisesti keuhkoihin ja SCIDoireyhtymä on kuolemaan johtava. XLA:han ja SCID-oireyhtymään on olemassa
hoitokeino, jos sairaudet saadaan diagnosoitua pian syntymän jälkeen.
Diplomityön tarkoituksena oli kehittää uusi vastasyntyneiden seulontaan soveltuva
homogeeninen PCR-monianalyyttimääritys lisäämällä XLA-detektio PerkinElmerin
kaupalliseen SCID-oireyhtymää diagnosoivaan määritykseen. PCR-määrityksellä
pyritään havaitsemaan kuivatusta veritäplänäytteestä yhtäaikaisesti kolme analyyttiä:
TREC- ja KREC-merkkiaineet sekä monistuskontrollina toimiva beta-aktiini. Työssä
testattiin aikaerotteista fluorometriaa hyödyntäen Eu-leimattuja KREC koettimia
erilaisilla FRET-vastaanottajaleimoilla (engl. fluorescence resonance energy transfer) ja
valittiin detektioherkkyyden sekä määritysten yhdistämisen kannalta potentiaalisin
koetin. PCR-monistuksen parametreja optimoitiin kolmianalyyttimallille sopiviksi ja
määrityskonseptia testattiin potilasnäytteillä.
Diplomityössä saatiin onnistuneesti kehitettyä KREC:iä tunnistava määrityskonsepti
sekä kolmianalyyttimäärityksen toimintamalli, jolla diagnosoitiin potilasnäytteistä
yhtäaikaisesti XLA:ata ja SCID-oireyhtymää.
Asiasanat: KREC, TREC, SCID, XLA, PCR, vastasyntyneiden seulonta, aikaerotteinen
fluorometria, FRET
« 30 »
Puolijohdetransistoripohjaisen sensoritekniikan kehittäminen reaaliaikaiseen
PCR-määritykseen
Anssi Kerko
Ohjaajat: FT Ari Lehmusvuori, DI Matti Kaisti
BIOTEKNIIKKA (DI)
Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR, engl. quantitative realtime PCR) on yksi molekyylibiologian perusmenetelmistä, jolla voidaan mitata DNA:n
monistumista reaktiossa sykleittäin. qPCR on kvantitatiivinen menetelmä, jonka avulla
on mahdollista määrittää tuntemattoman näytteen DNA-kopiomäärä. Kvantitatiivisuus
tekee mahdolliseksi sekä geeniekspression määrittämisen tutkimuksessa, että
esimerkiksi patogeenipitoisuuden määrittämisen diagnostiikassa. Vallitsevat tekniikat
qPCR:n toteuttamiseksi perustuvat fluoresoivien leimamolekyylien käyttöön. Tekniikat
ovat tarkkoja ja luotettavia, mutta fluoresenssin mittaaminen tekee laitteista
monimutkaisia ja kalliita.
Viimevuosina sähköiseen mittaukseen perustuvat qPCR-tekniikat ovat olleet kasvavan
kiinnostuksen kohteena. Sähköisen mittauksen suurin etu piilee halvoissa ja pienissä
komponenteissa, mikä on ratkaisevaa erityisesti vieritestauslaitteissa. Erikoistyön
tavoitteena oli kehittää sähköinen sekvenssispesifinen DNA-sensori käyttäen
kanavatransistoria detektiossa. Kanavatransistorin puolijohdekanavan sähkönjohtavuus
määräytyy hilan ja lähteen välisen potentiaalieron aiheuttaman sähkökentän mukaan.
Hilan läheisyyteen tulevat varaukselliset molekyylit muuttavat sähkökenttää hilassa,
mikä puolestaan vaikuttaa transistorin läpi kulkevan sähkövirran määrään, jota voidaan
helposti mitata. Koska DNA on negatiivisen fosfaattirunkonsa johdosta varauksellinen
molekyyli, voidaan kanavatransistoria käyttää sen detektiossa.
Työssä valmistettiin itsejärjestyvä oligonukleotidikerros kultapinnalle, joka oli kytketty
kanavatransistorin hilalle. Yksi kerroksen komponenteista on 5’-tiolimuokatu kohdeDNA:lle komplementaarinen oligonukleotidikoetin. Kohde-DNA:n hybridisaatio
koettimeen tuo sen riittävän lähelle hilaa mahdollistaen teoriassa sähköisen detektion.
Ennen sähköisiä mittauksia varmistettiin koetinkerroksen muodostuminen. Eri
valmistajien kultapinnoille valmistetuille koetinkerroksille lisättiin kohdeoligoilla
pinnoitettuja Eu3+-nanopartikkeleita ja mitattiin sitoutuneiden partikkeleiden
fluoresenssi. Havaittiin eroja eri valmistajien kultapinnoille tehtyjen koetinkerrosten
toimivuudessa. Sähköiset mittaukset aloitetaan parhailla kultapinnoilla.
Asiasanat: qPCR, DNA-sensori, kanavatransistori
« 31 »
Europium(III) akseptorina käänteisviritteisessä resonanssienergiansiirrossa
Milla Wall
Ohjaajat: FM Satu Lahtinen ja prof. Tero Soukka
BIOTEKNIIKKA DI
Lantanideja, kuten Europium(III)-kelaatteja (Eu III-kelaatti), käytetään aikaerotteisesti
mitattavissa FRET-määrityksissä. EuIII-kelaatin pitkä elinikä pidentää myös akseptorina
käytetyn lyhyt elinikäisen orgaanisen värin elinikää, mikä mahdollistaa aikaerotteiset
mittaukset. EuIII-kelaatteja voidaan kuitenkin hyödyntää akseptoreina, kun donorina
käytetään upkonvertoivaa nanopartikkelia (engl. upconverting nanoparticle, UCNP).
Koska EuIII-kelaatin luminesenssin elinikä on pidempi kuin donorina käytettävän
UCNP:n, voidaan käänteisviritteiseen resonanssienergiansiirtoon (engl. upconverting
resonance energy transfer, UC-RET) perustuva EuIII-kelaatin herkistetty emissio mitata
jopa UCNP:n emission sammuttua. Lisäksi Eu III-kelaatin suuri Stokesin siirtymä
mahdollistaa suuremman leimakonsentraation käytön ilman
orgaanisille väreille tyypillistä self-quenching-ilmiötä. Tämän työn tarkoituksena oli
lisätä UC-RET-emissiota nostamalla Eu III-kelaatin määrää reaktiossa leimaamalla
biomolekyyli useammalla Eu III-kelaatilla.
UC-RET emission intensiteettiä tutkittiin homogeenisen määrityksen avulla.
Määrityksessä käytettiin streptavidiinipintaisia, UV-alueella emittoivia UCNP:eita ja
yhden tai kahdeksan vapaata aminoryhmää sisältäviä muokattuja oligonukleotideja.
Oligonukleotidit leimattiin suoraan fluoresoivalla, aminoreaktiivisella Eu III-kelaatilla ja
ne sitoutuivat UCNP:ien pintaan biotiinin avulla. UC-RET-kompleksi viritettiin
käyttäen 980 nm:n laserdiodia ja herkistetty emissio mitattiin 615 nm:ssä. Kontrollina
käytettiin biotinyloitua EuIII-kelaattia (bio-EuIII).
Diplomityössä osoitettiin, että herkistetyn emission intensiteetti oli suurempi
korkeamman leima-asteen oligonukleotideilla, mutta oli silti matalampi kuin kontrollina
käytetyn bio-Eu:n herkistetty emissio. Tämä saattaa johtua siitä, että bio-Eu pääsee
tehokkaammin sitoutumaan lähemmäs UCNP:n pintaa pienen kokonsa ansiosta, milloin
energian siirto on tehokkaampaa. Suurikokoisiaoligonukleotideja ei mahdu yhtä lähelle
UCNP:n pintaa, jolloin herkistetty emissio on matalampi. Tutkimusta jatketaan
pinnoittamalla UCNP:ita leimatuille oligonukleotideille komplementaarisilla
oligonukleotideilla, jotta välimatkaa UCNP:n ja Eu III-kelaatin välillä saadaan
pienemmäksi ja UC-RET olisi tehokkaampaa.
Asiasanat: UC-RET, EuIII-kelaatti, herkistetty emissio
« 32 »
Paksusuolen syövän CEA:lle spesifinen lektiininanopartikkelimääritys
Joonas Terävä
Ohjaajat: FM Henna Kekki ja prof. Kim Pettersson
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Paksusuolen syöpä on, ihosyöpiä lukuun ottamatta, kolmanneksi yleisin syöpä naisilla
ja miehillä. Varmin paksusuolen syövän diagnoosi saadaan tähystämällä, joka aiheuttaa
suurta epämukavuutta potilaalle, vie aikaa ja on kallista. Yksi yleisimmin käytetyistä
paksusuolen syövän merkkiaineista on karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA).
Huonon herkkyyden ja spesifisyyden takia CEA:n kokonaispitoisuuden mittaamisella ei
niinkään ole diagnostista arvoa, vaan sitä käytetään lähinnä syövän tarkkailussa. CEA
on glykoproteiini. Proteiinien glykosylaatio muuttuu syöpäsoluissa. Lektiinit ovat
glykaani-rakenteisiin sitoutuvia proteiineja, joiden tehtävät luonnossa vaihtelevat
myrkkyinä toimimisesta syöpäsolujen tunnistamiseen nisäkkäiden elimistössä.
28 lektiinin sitoutumista syöpäsolujen tuottamaan CEA:han (cCEA) tutkittiin
heterogeenisen kaksipuolisen immunomäärityksen periaatteella, sillä eroavaisuudella,
että leimavasta-aineen sijaan detektiossa käytettiin lektiinein päällystettyjä Eunanopartikkeleja. Sitojina käytettiin CEA:n vastaisia vasta-aineita. Työssä lisäksi
tutkittiin cCEA:n tunnistavien lektiinien sitoutumista terveissä soluissa tuotettuun
CEA:han (bCEA) sekä verrattiin terveiden yksilöiden plasmanäytteitä potilasnäytteisiin.
Seitsemän lektiinin havaittiin sitoutuvan cCEA:han. Terveiden yksilöiden
plasmanäytteissä muilla paitsi kolmella lektiinillä seitsemästä havaittiin suurta hajontaa
näytteiden välillä. Näistä kaksi lektiiniä, MBL (engl. mannose-binding lectin) ja DCsign (engl. DC-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin)
valittiin määrityksen suorituskyvyn takia bCEA-määrityksiin spesifisyyden
määrittämiseksi. MBL havaittiin spesifiseksi cCEA:lle kaikkien määrityksessä
käytettyjen sitojien kanssa. DC-sign oli spesifinen vain yhdellä sitojalla. Terveiden
yksilöiden ja potilaiden välillä havaittiin kummallakin lektiinillä tilastollisesti
merkittävä ero. Määrityksellä voidaan erottaa terveiden solujen ja syöpäsolujen
tuottama CEA. Määrityksen käytön soveltuvuus diagnostiseksi testiksi seulontaan tai
syövän tarkkailuun vaatii jatkotutkimuksia.
Asiasanat: CEA, glykosylaatio, lektiini, nanopartikkeli, paksusuolen syöpä
KIITOKSET!
Adesso Nutraceuticals
ArcDia
Aromtech
Bioferme
Bioteekki
Citylab
CRST
Fazer
Hidex
HyTest
Kaivogen
Medix Biochemica
Oligomer
Orion Pharma
Pernod Ricard Finland
Tekniikan Akateemiset (TEK)
NUORET TUTKIJAT 2016
http://www.utu.fi/nuorettutkijat
Biokemian laitos