Hvad er DNA?
Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvilke baser indgår i DNA? • A. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil • B. Adenin, Gytosin, Caranin, Thymil • C. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin • D. Aranin, Guamil, Catamil, Uranin 3 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvilke baser indgår i DNA? • A. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil • B. Adenin, Gytosin, Caranin, Thymil • C. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin • D. Aranin, Guamil, Catamil, Uranin 4 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvilken er den komplementære streng til denne DNA streng? 3’ CTACTA 5’ A. 5’ CGTAAG 3’ B. 5’ GATGAT 3’ C. 3’ GATGAT 5’ D. 5’ TGTGCA 3’ 5 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvilken er den komplementære streng til denne DNA streng? 3’ CTACTA 5’ A. 5’ CGTAAG 3’ B. 5’ GATGAT 3’ C. 3’ GATGAT 5’ D. 5’ TGTGCA 3’ 6 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Dagens program 9:00 – 9:30 Introduktion – udtagning af celler 9:30 – 11:30 Vi går i lab. Start af PCR reaktion/Støbning af geler 11:30 – 12:45 Vi går sammen til frokost og ser lidt af DTU 12:45 – 13:00 At studere på DTU 13:00 – 13:30 Loading af agarosegeler 13:30 – 14:30 Foredrag i Biotéket 14:30 – 15:00 Resultater 15:00 – 15:30 Evaluering og afslutning Ca. 15:30 Tak for i dag 7 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Dagens øvelse Ekstrahere Amplificere Visualisere DNA 8 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce DNA og gener 9 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Transposoner • ALU transposon – Cirka 300 basepar lang – Findes i hver af jer 500 - 2.000 gange – Vi undersøger jeres kromosom 16, lokus PV-92 10 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Alu transposoner hos en kvinde Grøn (probe) = Alu sekvenser Rød (TOPRO-3) = andet DNA 11 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvorfor transposoner? • Hvorfor tror I, der findes transposoner? 12 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Transposoner og essentielle gener • Hvad tror i der sker hvis et transposon ødelægger et essentielt gen i en celle? Brystkræft Hæmofili Alzheimer’s 13 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce 1. trin – ekstraktion af cellemateriale • Celler fra jer ekstraheres fra mundhulen • Saltvand skylles rundt i munden (kraftigt) i 30 sek. og spyttes ud i kop • 1 ml overføres til eppendorfrør med pipette og tages med i lab NaCl 14 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce 30 sekunders nedtælling 30 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Spyt ud i koppen igen 15 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Pipette indstilling 16 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Ekstraktion af DNA 17 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Master-Mix til 3 PCR-reaktioner • • • • • • 18 66 µl H 2O 40 µl Primermix (PM) 16 µl dNTP 32 µl GC buffer 2 µl Phusion DNA polymerase(enzym) 156 µl i alt – dvs. mere end 3 gange 39 µl DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Amplifikation af DNA • 39 µl MasterMix og 1 µl DNA fra jer blandes i PCR-rør • Blandingen sættes i PCR-maskinen DNA MasterMix 19 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Støbning af agarosegel • 0,4 g agarose • 50 ml TAE-buffer • Blandningen koges i microovn • Flasken køles til ca. 60 ºC • SYBR-Safe tilsættes (HUSK HANDSKER) • Gelen hældes i kar 20 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Regler i laboratoriet • Brug jeres fornuft • Husk at vaske hænder • Bær kittel hele tiden • Ingen mobil, smykker, mad og drikke • Læs og forstå, hvad I skal først • Spørg hvis du er i tvivl 1 Det er ikke altid bedst, at blive færdig først Ind i laboratoriet!!! 21 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad er DNA? DNA – DeoxyRibonucleic Acid 5’ Adenin - A Puriner Guanin - G Rygrad/Backbone Cytosin - C Pyrimidiner Thymin - T 3’ 22 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad er DNA? Baseparring 5’ 3’ 23 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad er DNA? Retning af DNA Pi Pi Pi Pi Pi Pi Pi Pi Pi Pi 24 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvor findes DNA? Prokaryoter Eukaryoter (Bakterier) (Dyr og planter) DNA Cellekerne Cytoplasma Mitokondrion/grønkorn 25 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad er rækkefølgen i det centrale dogme? 1 DNA 2 RNA 3 PROTEIN A. 1. Translation 2. Replikation 3. Transkription B. 1. Replikation 2. Translation 3. Transkription C. 1. Transkription 2. Replikation 3. Translation D. 1. Replikation 2. Transkription 3. Translation 26 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad er rækkefølgen i det centrale dogme? 1 DNA 2 RNA 3 PROTEIN A. 1. Translation 2. Replikation 3. Transkription B. 1. Replikation 2. Translation 3. Transkription C. 1. Transkription 2. Replikation 3. Translation D. 1. Replikation 2. Transkription 3. Translation 27 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad er et gen? Et gen er den basale enhed af arvelighed i en levende organisme 28 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad er DNA replikation? DNA replikation er kopiering af DNA før celledeling 29 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Den genetiske kode DNA 5’ ATG AA A CTC TAT CCG AGT TAA 3’ Transkription RNA 5’ AUG AAACUC UAU CCG AGU UAA Translation O Peptid sekvens 3’ N Methionin O N Lysin Leucin Tyrosin Prolin Serin Stop (Start codon) O N N 30 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet O EduForce Hvad er PCR? Polymerase Chain Reaction PCR er en metode til opformering af DNA ved brug af en termostabil DNA polymerase Thermus aquaticus PCR blev opfundet af Kary Banks Mullis i 1983 Han blev tildelt Nobelprisen i kemi for sin opfindelse i 1993 31 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad skal der bruges i en PCR? Primere DNA dNTPpolymerase - Nukleotider T G C T C G 5’ 3’ 5’ DNA template PCR fragment - produkt 32 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad laver PCR maskinen? Tid 33 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Området der ønskes ampliciceret Eksponentiel stigning i antal kopier 35 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce PCR – Polymerase Chain Reaction 36 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Det humane genom • 23 kromosom-par • Hele det haploide humane genom fylder over 3 milliarder basepar med ca. 22.000 gener • 1.5% af DNA’et koder for proteiner • E. colis genom er på ca. 4.6 mio. basepar og med ca. 4.400 gener 37 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvad kræver en PCR af et nyt gen? • Kendte sekvenser til primere • Template DNA Over 1.000 organismers totale DNA (genom) findes på nettet! Find DNA’et på en netdatabase, fx GenBank og bestil passende primers 40 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce PCR i den virkelige verden Amplicering af DNA er meget anvendt: 41 • Faderskabstest • Retsmedicin • Artsbestemme bakterier • Gensplejsning DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Gelelektroferese DNA-ladder Brønde til PCR produkter 1 2 3 1000 900 800 700 Størrelse i bp 600 500 400 300 200 100 Agarose gel Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 42 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce PCR-produkter • Kromosom 16 415 bp Transposon 715 bp • Genotype: + +, - -, + - 44 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Diskuter med din sidemand • Tegn på det udleverede billede hvordan båndet for de tre genotyper vil se ud. Husk: • Regel 1: DNA løber fra - + • Regel 2: Store DNA fragmenter løber langsommer end små DNA fragmenter Fragmentlængder: Transposon: 300bp Gen: 415bp 45 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Gelelektroferese DNA-ladder Brønde til PCR produkter +- ++ -- 1000 900 800 700 Størrelse i bp 600 500 400 300 200 100 Agarose gel Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 46 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Resultater - diskussion DNA-ladder +- ++ PCR produkter -- 1000 900 800 700 Størrelse i bp 600 500 400 300 Genotype + + 715 bp Genotype - 415 bp 200 100 Agarose gel Genotype + 715bp + 415 bp Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 47 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Resultater M 1 2 3 Homozygot 48 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Homozygot Heterozygot EduForce Resultater og evaluering 49 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Fejlkilder Ekstraktion af DNA • Ingen eller for få celler intet eller for lidt template DNA • Ineffektiv lysering af celler Amplifikation af gen • Manglende komponenter i PCR mix - intet kan undværes • Denatureret DNA polymerase ingen opformering Gelelektroforese • Viskositet af gel • Loading af brønde – hvis ladder er fin • Hvis der ses primer skyldes det formentlig mislykket PCR reaktion • Manglende SybrSafe ingen visualisering 50 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvem er morderen? 51 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce Hvem er faderen? 52 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet EduForce
© Copyright 2024