Växters effektorutlösta försvars funktion och evolution Fredrik
Växters effektorutlösta försvars funktion och evolution Ett uthålligt skydd mot patogener? Fredrik Dölfors Independent Project in Biology Självständigt arbete i biologi, 15 hp, vårterminen 2014 Institutionen för biologisk grundutbildning, Uppsala universitet Innehållsförteckning Sammandrag ..................................................................................................................................... 1 Inledning........................................................................................................................................... 1 Effektorutlösta försvarets struktur och funktion .............................................................................. 2 NB-LRR-proteinstruktur och domänfunktioner ........................................................................... 3 R-gener agerar med direkt (gen-gen) och indirekt (vakt) interaktion .......................................... 4 Evolutionära processer i växt-patogensystem .................................................................................. 5 Selektion i jordbrukssystem och naturliga populationer .............................................................. 6 Positiv selektion av fördelaktiga alleler (biologisk kapprustning) ............................................... 7 Samevolution med balanserande selektion (röda drottningen) .................................................... 8 Genetiska mekanismer i olika perspektiv ................................................................................... 10 Diskussion ...................................................................................................................................... 12 Tack ................................................................................................................................................ 14 Referenser....................................................................................................................................... 14 Sammandrag Diversiteten bland gener som ger resistens (R) mot infektionssjukdomar är mycket stor i växtriket, särskilt i den effektorutlösta klassen av försvaret. Denna artikel beskriver interaktioner mellan växters effektorutlösta fösvar och patogeners effektorproteiner och undersöker evolutionära och genetiska mekanismer för uppkomsten av ny resistens. R-genprodukter har en typisk domänstruktur och interagerar både direkt och indirekt med patogeners effektorproteiner. Vid kontakt med ett effektorprotein utlöses en försvarsrespons som kan förhindra fortsatt patogen tillväxt. Flera genetiska mekanismer verkar samtidigt på R-gener, något som resulterar i en hög hastighet för uppkomst av nya R-varianter. Den intima samevolution som existerar hos många patogen-växtsystem formar det evolutionära utvecklingsmönstret av R-gener. Diversifierande positiv selektion via den biologiska kapprustningsmodellen och bevarande negativ frekvensberoende selektion är båda viktiga samevolutionära processer. Denna artikel indikerar att växters immunförsvar är anpassningsbart och robust, men belyser också den kunskapsbrist som råder inom resistensforskningen. Inledning Växters immunförsvar är uråldrigt och har följt en självständig evolutionär bana (Yue et al. 2012). När en patogen, till exempel en bakterie, svamp eller nematod tagit sig förbi mekaniska hinder och in i en växtcell möts den av inducerbara toxiner och två klasser av R-proteiner. Den ena R-genklassen är ett mönsterutlöst försvar (PUF) av membrangenomspännande försvarsproteiner med mönsterigenkänningsreceptorer. Receptorerna har affinitet för bevarade strukturella motiv hos mikrober (MAMP, microbe-associated molecular pattern) som till exempel det bakteriella flagellproteinet eller kitin i svampceller (Erbs et al. 2008, Liu et al. 2012). PUF är ett generellt vaktsystem som patogener kan undgå genom att utsöndra effektorproteiner, proteiner som nedreglerar receptorernas aktivitet (Aslam et al. 2008, Jakobek et al. 1993). Effektorerna aktiverar dock istället den andra stora klassen av R-proteiner, det effektorutlösta försvaret (EUF), den klass som den här artikeln fokuserar på. EUF består av nukleärt lokaliserade R-gener med tillhörande R-proteiner som finns fritt flytande i växtcellens cytosol (Armstrong et al. 2005). Denna grupp av R-gener kallas NB-LRR på grund av att dess proteiner oftast innehåller en nukleotidbindande (NB) domän och en domän med leucinrika repetitioner (LRR). Hädanefter refereras R-gener enbart till de effektorutlösta generna med NB-LRR-struktur. NB-LRR-gener kodar för proteiner som verkar med direkt och indirekt interaktion med effektorproteiner. Vid kontakt kan en mängd signalvägar initieras som kan leda till en hypersensitiv respons (HR), en lokalt inducerad celldöd som förhindrar att patogenen sprider sig i växten (Jia et al. 2000). Effektorer med känd R-geninteraktion kallas avirulensproteiner (Avr), och benämns med denna term genom artikeln. R-gener evolverar mycket snabbt, något som är en viktig faktor för växters överlevnad då många patogener har en större population och kortare generationstid än sin värd, därmed har de också större anpassningspotential (Gandon & Michalakis 2002). I dagsläget är det oklart hur växter och patogener påverkar varandras utveckling. Denna information är viktig i bedömningen om det finns ett uthålligt försvar hos växter och kan ha mycket stor betydelse för hur stor den årliga skördavkastningen blir och bevarandet av vilda växter. Oavsiktlig introduktion av invasiva patogena arter är ett erkänt problem med både ekologiska och ekonomiska följder (Perrings et al. 2002). Detta är problematiskt då resistensgener i monokulturer av sädesslag i dagens jordbruk, till 1 exempel vete, inte varit motståndskraftiga mot den introducerade patotypen (Hovmøller et al. 2002). Skulle patogener spridas i större utsträckning kan konsekvenserna öka, inte minst för redan hotade arter i naturen (Perrings et al. 2002). Detta är något som gör frågan om hållbar långtida resistens en prioritering för forskningen inom växters immunitet. Med denna motivation undersöks här den underliggande genetiska variationen och evolutionära mekanismer för växters isolatspecifika resistensgener. I den första delen introduceras mångfalden och strukturen av R-gener och avslutas med de viktiga hypoteser som artikeln bygger på. I den andra delen diskuteras ämnet utifrån ett evolutionärt perspektiv. Med denna inblick och exempel från naturen och jordbrukssystem dras slutsatser om R-gener kan ge ett uthålligt skydd mot patogener. Effektorutlösta försvarets struktur och funktion Effektorutlösta NB-LRR-gener delas vanligen upp i flera funktionella familjer beroende på vilka övriga aktiva domäner som är kopplade till dem i proteinet. Gemensamt är att de har en central roll inom växters immunförsvar, de anses stamspecifika och evolverar tillsammans med ett specifikt patogenisolat, en genetisk variant eller patotyp av en infekterande mikroorganism. NBLRR-gener och dess motparter hos patogenen (Avr) är därmed exempel som följer gen-förgenhypotesen (GFG-hypotesen), föreslagen av Harold Henry Flor (1942). Flor utvecklade hypotesen för att förklara nedärvningen av patogenicitet och resistens utgående från studier av linrostsvampens (Melampsora lini) interaktion med lin (Linum usitatissimum). I sin översiktsartikel ”Current Status of the Gene-For-Gene Hypothesis” (1971) beskriver Flor ett antagonistiskt patogen-värd-system där varje infektionsgen hos patogenen har en motsvarande resistensgen hos värdväxten. Teorin utvecklades sedan vidare av Vanderplank (1978) för att förklara den biokemiska processen för patogenicitet och resistens med Avr-/R-proteininteraktion. Dessa hypoteser ligger som grund för stora delar av denna artikel och har varit viktiga för nutida molekylär karaktärisering av patogen-värdinteraktioner. Diversiteten av R-gener är stor i växtriket och det effektorutlösta försvaret med NB-LRR-motiv innehåller den största gruppen. I en omfattande helgenomstudie av risvarianten (Oryza sativa var. japonica), utförd av Zhou et al. (2004), fann de 480 NB-LRR-gener uppdelade i 93 olika genfamiljer, medan man i angiospermerna backtrav (Arabidopsis thaliana var. Col-0) och tornlusern (Medicago truncatula) hittills har funnit 149 (Meyers et al. 2003) respektive 490 (Song & Nan 2014) sådana gener. Det totala antalet gener i arterna väntas vara ändå fler. Vidare fann Zhou et al. (2004) att NB-LRR-gener typiskt är polymorfa med flera alleler vardera och finns i ett antal duplikat per genom. Diversifierande drivkrafter diskuteras djupare under ”Evolutionära processer i växt-patogensystem”. Nedan presenteras R-genernas domäner, funktioner och interaktioner med Avr-proteiner. 2 NB-LRR-proteinstruktur och domänfunktioner Gener för effektorutlöst resistens mot patogener kodar generellt för en NB-domän och en LRRdomän tillsammans med varierande N-terminaldomäner (Figur 1). De varierande domänerna Toll/interleukin 1-receptorlik domän (TIR) och coiled coil (CC) är vanliga bland R-proteiner, men dess funktioner är ännu ej klarlagda och ämnet är mycket debatterat (Krasileva et al. 2010). Både TIR- och CC-domäner i L6-proteinet hos lin respektive MLA-proteinet hos korn har visats associera med andra TIR respektive CC-domäner och bilda ett komplex kallat en homodimer. Denna interaktion verkar viktig för signalaktivering och HR. Då dimerisering förhindrats att ske uteblir HR (Bernoux et al. 2011, Maekawa et al. 2011). För att komplicera situationen ytterliggare har CC-domänen i risproteinet Pikm-1 visats Figur 1. Tecknad generell proteinstruktur hos effektorutlösta interagera direkt med Avr-Pik-Dresistensproteiner. X= skiftande domän, NBS binder ATP och LRR proteinet från Magnaporthe binder till patogena attackmolekyler. N och C står för N- och Cgrisea, en sporsäckssvamp som terminal. Bild omritad från McHale et al. (2006). bland andra infekterar ris (Kanzaki et al. 2012). Antal gener En intressant observation är att TIR-NB-LRR-gener verkar vara mycket vanliga hos gymnospermer, dikotyledona angiospermer och återfinns även hos basala angiospermer, men har inte observerats i öppna läsramar hos monokotyledoner som äkta gräsväxter. Detta har tolkats som att monokotyledoner har förlorat 270 Ris TIR-domänen (Cannon et al. 2002, 240 Tornlusern Zhang et al. 2014). Gräsväxters 210 karaktäristiska R-genstruktur med kända motiv är istället CC-NB-LRR 180 (Bai et al. 2002). Zhou et al. (2004) 150 fann 159 NB-LRR-gener med CC120 motiv och 261 stycken med ett okänt icke-TIR-motiv i risvarianten 90 japonica, vilket pekar på den 60 rådande kunskapsbristen om växters 30 immunförsvar (Figur 2). Notera även i Figur 2 att TIR-domänen (T) saknas 0 hos ris men är mycket vanlig hos XNL CNL TNL NL TN N angiospermen tornlusern. Grupper av resistensgener Figur 2. Antalet resistensgener med vanliga domänkombinationer Det behövs inte bara mer information hos ris jämfört med tornlusern. N = nukleotidbindningsdomän, L = leucinrik repetition, X = okänt motiv, T= toll/interleukin 1om TIR- och CC-domänerna, NBreceptorlik domän och C = coiled coil. Kombinationer med domänens roll och mekanism är inte förekomst under 10 stycken och pseudogener visas ej. Data av ris heller fullständigt klarlagd för något är från Zhou et al. (2004) och tornlusern från Song & Nan (2014). protein. Vad man vet är att dess aminosyrasekvenser varierar något mellan olika R-gener, men att funktionen är väl bevarad genom evolutionär tid. NB-domäner är involverade i bindning av ett flertal energikatalysatorer som ATP och GTP (Tameling et al. 2002). Eftersom NB-domäner bibehållits i en mer eller mindre konstant struktur över lång tid och är direkt kopplade till ATP-/GTP-aktivitet är det troligt 3 att de innehar en viktig roll för initieringen av signaltransduktionen som sker från igenkänning av en patogen attack till utlösandet av en försvarsrespons (Meyers et al. 1999, Rairdan et al. 2008). R-proteinet är inaktivt då ADP är bundet till NB-domänen och aktiveras vid bytet till ATP. Troligen ändrar bytet proteinets form och exponerar LRR-domänen till cellens cytosol där den kan interagera med Avr-proteiner. Den exakta funktionen av ATP-bindning och hydrolys och vad som aktiverar signaltransduktionen är dock ännu inte känt (DeYoung & Innes 2006, Williams et al. 2011). Många växtpatologer är eniga om att igenkänning av patogener mycket ofta beror av LRRdomänaktivitet (Bahadur & Basak 2014, Hammond-Kosack & Jones 1997, Jia et al. 2000, Krasileva et al. 2010), men även TIR- och andra icke-LRR-domäner har visats influera specificiteten till Avr-proteiner (Cesari et al. 2013, Luck et al. 2000). LRR-domänen karaktäriseras av ett hypervariabelt antal leucinrika sekvensrepetitioner och enbaspolymorfi (SNP, single nucleotide polymorphism på engelska), basvariation mellan två alleler där en substitution skiljer dem åt. LRR-domänen i Pi-ta-genen hos ris består av en konsensussekvens av omkring tio trinukleotidrepetitioner med motivet -LxxLxx-. Längden varierar dock mellan 16 till 75 baspar (bp) beroende på hur många insättningar och borttagningar (indels) som ändrat sekvensen (Bryan et al. 2000, Costanzo & Jia 2009) R-gener agerar med direkt (gen-gen) och indirekt (vakt) interaktion Sedan GFG-hypotesen lades fram har ett febrilt sökande pågått efter evolutionär och mekanistisk information om hur ett sådant system skulle kunna fungera. R-proteiner och motsvarande Avrproteiner kan interagera med direkt protein-proteininteraktion och därmed följer EUF Flors och Vanderplanks modell. Till skillnad från det första inducerbara försvaret, PUF, som är ett generellt försvar, så finns det också nutida stöd för att NB-LRR-proteiner är specifika för en eller ett fåtal effektor(er). Flera studier har kopplat samman samtida uttryck av en NB-LRR-gen och motsvarande Avr-gen och påvisat direkt interaktion. R-proteinerna har även påvisats vara fria proteiner i växtcellers cytosol där Avr-proteiner frisläpps. (Armstrong et al. 2005, Dodds et al. 2004, Jia et al. 2000). Det första exemplet av direkt interaktion mellan Avr- och R-gen beskrevs genom en utförlig studie av Jia et al. (2000). De introducerade reportergen (GUS) och en alltid aktiv version av AvrPita, en effektorgen från M. grisea, till två resistenta (Pi-ta) och två mottagliga (pi-ta) kultivarer av ris. De två pi-ta-kultivarerna gjordes mottagliga genom att ändra aminosyran serin till alanin på position 918 i LRR-domänen. Båda Pi-ta-växter med intakt LRR-domän utvecklade lokal HR (visat genom lokal celldöd och reducerad GUS-aktivitet) och friskhetstecken i övrigt medan båda kultivarer med LRRA918-substitution visade svåra sjukdomssymptom efter fyra dagars inokulation. För att visa att just Pi-ta var ansvarig för igenkännandet av patogenen utfördes ett jäst-tvåhybridtest med HIS3 som reportergen. Samma princip användes även av Catanzariti et al. (2010) som tas upp i nästa exempel nedan. Catanzariti et al. (2010) testade ifall det fanns någon koppling mellan R-genen M hos lin och effektorgenen AvrM hos CH5-patotypen av linrostsvamp. Studien utfördes med bland annat jäst två-hybridmetoden, ett molekylärt protokoll som är framtaget för att studera proteinproteininteraktioner. Experimentet testade ifall protein från R-genen, M, kunde binda till proteiner från någon av fem alleler av AvrM från svampen (AvrM-A till -E). Om proteinerna interagerar in vitro visas det genom transkription av en reportergen med efterföljande western4 blot (immunoblot). Resultaten visade att AvrM-A och -D tillsammans med M uttryckte reportergenen HIS3 vilket anses stödja hypotesen för direkt interaktion mellan en R-gen och korresponderande Avr-gen. Deras resultat tyder också på att R-gener har specificitet för en till ett fåtal Avr-alleler. I en efterföljande analys visades AvrM-A inducera en M-beroende HR in planta då virginiatobak (Nicotiana tabacum) transformerats med M-genen från lin och inokulerats av Agrobacterium tumefaciens med en AvrM-klon från linrostsvamp. Båda ovanstående exempel rapporterade att LRR-domänen på NB-LRR-generna var ansvarig för igenkänning av de patogena proteinerna. Värt att nämna från den sistnämnda studien är att även då proteininteraktion och HR kunde påvisas in vitro och in planta så var interaktionen och responsen påvisade med separata försök. Experimentet kopplade inte värdväxtens HR direkt till just den proteininteraktion de fann. Detta betyder att andra, okända faktorer har kunnat spela stor roll för den resistens som rapporterats. Indirekt interaktion mellan patogener och värdar har beskrivits med vad som kallas vakthypotesen (inte att förväxla med PUF). Funktionen av Avr-proteiner beskrivs i ett vaktscenario ha proteasaktivitet (spjälkande av proteiner) och nedreglerar växtens försvar genom att störa specifika intercellulära proteiners normala aktivitet i växtcellen. Exempel på detta har beskrivits med bakterien Pseudomonas syringae och dess typ III-effektorprotein AvrRpt2. Rproteiners uppgift i denna modell är att skydda Avr-proteinernas angreppsmål. R-proteinet bevakar målproteinets funktion och integritet genom att binda till det och skicka en signal som utlöser HR vid avvikelser. Teorin är logisk i det faktum att det hittats ~149 patotypspecifika NBLRR-gener i backtrav (kultivar Col-0) medan redan antalet patotyper av en virulent bakterie (Psedudomonas viridiflava) (som infekterar växten) överstiger det antalet (Jakob et al. 2002). Det förhållandevis låga antalet R-gener skulle kunna motsvara antalet intercellulära angreppsmål hos värdväxten. Ett exempel som visar en sådan interaktion har studerats mellan backtravs RIN4, RPM1, RPS2-proteiner och AvrRpt2 från P. syringae. Mackey et al. (2003) visade att det patogena receptorproteinet RIN4 som kontrollerar immunrespons via negativ återkoppling attackeras av AvrRpt2 och skyddas av NB-LRR-proteinerna RPM1 och RPS2. Först när AvrRpt2 förstörde RIN4 aktiverades antingen RPM1 eller RPS2, vilket i samtliga fall ledde till HR. Studier likt denna visar återigen den mångfald av system naturlig selektion kan åstadkomma, och att ingenting bör tas ”svart på vitt” i naturen. Det senaste inom diskussionen kring vilken interaktionshypotes som bäst beskriver verkligheten tas upp under sektionen ”Diskussion”. Nedan avhandlas växt-patogensystem vidare utifrån ett evolutionärt perspektiv eftersom det kan tyckas att ”ingenting inom biologin är begripligt, om det inte betraktas mot bakgrund av evolutionen”- Theodosius Dobzhansky (1973). Evolutionära processer i växt-patogensystem Mångfalden av resistensgener speglar troligen de intima relationerna mellan patogener och växter och det stora antalet patogenvarianter som förekommer. De grundläggande interaktionerna har nu diskuterats, men vilka processer styr utvecklingen? Och hur uppkommer genvariationen? Ett uttalande av Kimura & Crow (1964) lyder översatt till svenska: ”Med hundratals nukleotider, var och en kapabel till bassubstitutioner och andra möjliga permutationer uppkomna genom sekvensomarrangemang, insättningar och borttagningar blir antalet möjliga genvarianter astronomiska”. Sålunda, om en patogen får en enda fördelaktig enbassubstitution som ger en 5 konformationell ändring i de transkriberade effektorproteinerna kan infektionssannolikheten hos värdväxten teoretiskt öka markant. Ett empiriskt bevis på att enbassubstitutioner av betydelse kan förekomma finns dokumenterat av Bryan et al. (2000) där de jämförde risväxters resistens mot M. grisea i Pi-ta/Avr-pita-systemet. En SNP i TCG-kodonet på position 918 i LRR-domänen som kodar för serin bildar GCG, vilket kodar för alanin. De påvisade precis som Jia et al. (2000) att växter med vildtyp-Pi-ta var resistenta och de med T/G-SNP i LRRA918-lokuset var mottaglig för infektion. Nutida forskningsresultat visar att komplexa samevolutionära processer verkar på patogena system i växtriket, åtminstone mellan patogener och värdar med en intim och varaktig relation. Detta synsätt är överensstämmande med flera besläktade teorier. Den biologiska kapprustningen och röda-drottninghypotesen beskriver båda den utveckling som ständigt måste ske vid antagonistiska interaktioner. Vad som skiljer dem åt är den drivande evolutionära kraften. Positiv selektion driver på kapprustningen och negativ frekvensberoende selektion (NFS) driver röda drottningen (Thrall et al. 2012). I båda fallen kan relationen fortgå med en gen-för-genvis utveckling. Dessa hypoteser tillsammans med genetiska mekanismer för uppkomst av ny genetisk variation diskuteras nedan med syftet att förstå hur diversiteten som finns i växtriket har uppkommit och ge insikt om framtida resistenskapacitet. Selektion i jordbrukssystem och naturliga populationer En faktor som bör nämnas vid diskussion kring utvecklingen av resistens och dess komplexitet är att den genetiska variationen i jordbrukssystem inte nödvändigtvis återspeglar den hos naturliga populationer. I naturliga populationer finns det normalt både större interspecifik artvariation och intraspecifik genetisk variation. Domesticerade växter uppvisar mindre genetisk variation på grund av artificiell selektion för åtråvärda egenskaper och den genetiska flaskhals som associeras till den processen. Det har nyligen visats att mellan 80% till 90% av genvariationen hos risvarianterna indica och japonica försvann efter domesticeringen (Zhu et al. 2007). Att genetiskt likartade grödor ofta odlas i monokulturer betyder också att om kultivaren är mottaglig för en sjukdomsalstrande patogen ökar risken att större delar av skörden påverkas. Ökande sjukdomskänslighet är något som typiskt ses i naturen hos populationer som påverkats av demografiska processer som minskar genetisk diversitet (som genetisk flaskhalseffekt och drift) (Spielman et al. 2004). Det finns dock data som föreslår att vilda och domesticerade arter evolverar med liknande processer (till exempel samevolution), men med en annan dynamik. Jordbrukaren odlar givetvis en kultivar som är tålig mot sjukdomar tills dess att en patogen övervinner dess resistens. Om stor del av odlingen inte längre är resistent byts kultivaren ut. Detta sätter ny press på patoger i jordbruksfältet som åter upplever skiftande allelfrekvenser. En studie av Zhan et al. (2012) visade att frekvensen av virulensalleler hos Rhynchosporium secalis, en patogen svamp på korn, skiftade över tid i jordbrukssystem i Storbritannien. De studerade prover från svampen som tagits över 21 års tid på olika fält och fann en cyklisk omsättning av sju virulensalleler. Antalet alleler i en given patotyp ökade även över tid och detta korrelerade positivt till antalet använda kultivarer över undersökningsperioden. Detta resultat indikerar att en samevolutionär analog existerar i jordbrukssystem, lik den process som väntas ske mellan många växter och patogener i naturliga system. 6 Positiv selektion av fördelaktiga alleler (biologisk kapprustning) Hur växt-patogeninteraktioner formas studeras med stort intresse sedan JBS Haldane skrev artikeln Disease and evolution (1949). Interaktionen involverar antagonistisk selektion mellan båda parter. Patogenen försöker infektera värden som i sin tur försöker neutralisera patogenen. I den första fasen i den biologiska kapprustningen utgör patogenen en selektiv kraft mot växten som antingen upptäcker den och överlever eller selekteras bort. Vid ihärdigt patogentryck ökar en resistent växtgenotyps frekvens snabbt i populationen genom positiv selektion, detta kallas för ett selektivt svep (Lee et al. 2009, Woolhouse et al. 2002). Som Figur 3 illustrerar kan den fördelaktiga haplotypen fixeras över få generationer genom att de växter som överlever till att proliferera sprider sin genotyp samtidigt som mottagliga växters genotyp då försvinner ur den effektiva genpoolen. X-axeln i figuren visar ett hypotetiskt tidsintervall och varje sigmoid kurva är en nyuppkommen allel. I fas två utgör den nu resistenta växt-populationen en selektiv kraft mot patogenen som ej längre kan infektera värdväxten. Patogenen genomgår nu en liknande haplotypsållning som Figur 3. Illustration av hur selektiva svep på få generationer kan fixera växten i fas ett. Om en ny en fördelaktig allel på bekostnad av andra alleler. Grå och svarta linjer virulent allel finns eller är allelfrekvenser av nya fördelaktiga alleler hos pathogen respektive uppkommer så börjar förloppet växtvärd. Bild omarbetad från Woolhouse et al. (2002) med tillstånd om på nytt (Kanzaki et al. 2012). från Macmillan Publishers Ltd: Nature Genetics De studier som har rapporterat stöd för positivt selekterade R-gener har ofta analyserat skillnader mellan antalet ickesynonyma (dN) och synonyma (dS) SNPs i gensekvenser från LRR-domänen. En ickesynonym SNP är en bassubstitution i ett kodon som ändrar aminosyra medan en synonym SNP är en bassubstitution som resulterar i samma aminosyra. Metoden (dN/dS) användes bland andra av Bittner-Eddy et al. (2000) för att bevisa positiv selektion i backtravs RPP13-gen som ger resistens mot mjöldagg (som orsakas av den biotrofa oomyceten Peronospora parasitica). De utförde testet mellan tre LRR-regioner i tre alleler av genen och fann dN/dS-värden som indikerade positiv selektion i alla jämförelser. Grundidén med dN/dS-testet är att om utvecklingen sker neutralt ackumulerar ickesynonyma och synonyma mutationer med samma hastighet (dN/dS = 0). Om det i en jämförelse av SNP-data mellan analoga gensekvenser finns fler ickesynonyma mutationer än förväntat (dN/dS > 1) så har dessa ackumulerat med påverkan från någon segregerande kraft. Detta kan vara en signal för selektion av fördelaktiga mutationer (Yang & Bielawski 2000). På grund av att demografiska processer ofta skapar liknande genetiska signaler som selektion gör, så är det dock svårt att särskilja dem med genetisk data. Därmed krävs det att många relevanta test och simuleringar är överensstämmande för att påvisa olika typer av selektion (och utesluta demografi). I en släktskapsanalys utförd av Chen et al. (2010) användes dN/dS-metoden för att se ifall positivt selekterad basvariation fanns mellan backtravs och lyrtravs (Arabidopsis lyrata) R-gener. 7 De påvisade att ~60% av alla R-gener som återfinns hos båda släktingarna utvecklades med positiv selektion och att de flesta baspolymorfierna var lokaliserade inom en LRR-domän. Hur stor tillit som kan läggas på resultatet är dock osäkert eftersom de endast använde sig av dN/dSmetoden och inte tillämpade någon djupare analys. En stärkande faktor i artikeln är dock att skribenterna baserat sina divergerande värden på analys mellan enstaka domäner (upp till 100 kodon) istället för att ha analyserat hela gener samtidigt. Detta undviker missvisande tolkningar av resultat eftersom kontrasterande selektion mellan kodon i en hel gen kan resultera i snedvridna resultat (Nei & Gojobori 1986, Parmley & Hurst 2007). Positiv selektion kan vara en viktig kraft som utövats på växtpopulationer, men kan inte vara ansvarig för den stora diversitet vi ser hos R-gener eftersom den generellt tar bort allelvariation. Mutationshastigheten för introduktion av nya SNPs kan inte heller förklara variationen då den inte är större i R-gener än för något annat lokus (Kuang et al. 2004). Hos sexuellt reproducerande växter behöver även mutationen ske i det meristem som producerar gameten för att föras vidare till nästa generation, noterat i en översiktsartikel av Walbot & Evans (2003). Sannolikheten för fixering av en mutation är även relativt låg (Kimura, 1962). Andra krafter måste därför vara av betydelse för utvecklingen av ny resistens/avirulens och hastig anpassning, men vilka? Samevolution med balanserande selektion (röda drottningen) För att en population ska kunna inneha genetisk variation inom en resistensgen måste någon bevarande kraft verka på alleler som förlorat eller aldrig gett någon fördel. Extrem intraspecifik poymorfism har demonstrerats för många, ofta mycket gamla NB-LRR-gener (överensstämmande med balanserande selektion), däribland backtravs RPP13 (Rose et al. 2004), LR10 i emmer (Triticum dicoccoides) (Sela et al. 2012) och RCR3 i vildtomat (Solanum peruvianum) (Horger et al. 2012). Denna typ av selektion kan bevara allelvariation genom överdominans (heterozygot fördel) eller NFS (sällsynt fördel). Heterozygot fördel kan dock till exempel inte stämma för RPP13, RPP5 och övriga R-gener i backtrav, korn och vete på grund av hög frekvens av självbefruktning (Allard & Adams 1969, Noël et al. 1999). Självbefruktning ger en hög sannolikhet att två alleler är identiska via nedärvning. En population av frekvent självbefruktande individer har därför en stor andel homozygota (och i övrigt genetiskt lika) individer. Detta lämnar oss kvar med teorin om NFS som verkar med fluktuerande selektiva krafter. Förloppet av en samevolutionär cykel med NFS har beskrivits med flera modeller, den matematiska laggfasmodellen, utvecklad av Nee (1989), är en av dem (Figur 4). En enkel biallelisk tolkning av modellen kan återges enligt följande resonemang, baserat på Yang et al. (2013): Låt en hypotetisk patogen infektera en växtvärd. Patogenen och växtvärden har båda (två) alleler för virulens respektive resistens. Allelerna är specifika för ett protein enligt gen-förgenmodellen. Patogenpopulationen lyckas med hjälp av avirulensallel Avr+ infektera växtpopulationen. Växtpopulationens motsvarande resistensallel, R+, ökar då snabbt i frekvens vilket får Avr+ att tappa sin effektivitet. Denna selekteras då emot till fördel för allel Avr – , en allel som växternas högfrekventa R+ ej kan binda till. Tanken är att Avr+ inte försvinner helt ur genpoolen då den selekteras emot, utan finns kvar i mycket låg frekvens. Effekten av patogenens dominanta allelbyte på växtpopulationen är att den Avr – -kompatibla resistensallelen R – då ökar i frekvens (och R+ minskar). Eftersom patogenens allel snabbt tappar sin fördel kommer den selekteras emot. Här kommer den sällsynta fördelen för den ursprungliga avirulensallelen (Avr+) in. Växtpopulationen är lokalt anpassad till den nu vanligaste allelen (Avr –) och alltså inte motståndskraftig mot Avr+ längre. Patogener som har den lågfrekventa allelen lyckas nu infektera 8 växter med större framgång igen så att frekvensen av Avr + åter stiger i populationen. Cykeln börjar nu om på nytt då växtpopulationens motsvarande R+-allel stiger i frekvens (Yang et al. 2013). På så vis bevaras och återanvänds ”gamla” Figur 4. Illustration av en samevolutionär cykel enligt en biallelisk eller förbrukade alleler i laggfasmodell med negativ frekvensberoende selektion. Grå och svart linje är populationer över tid enligt allelfrekvens (y-axel) för de två patogena respektive värd-allelerna över tid (xaxel). Alleler är lika frekventa vid interceptet med x-axeln (y = 0) och den ena NFS. Då den grå linjen i Figur 4 närmar sig sitt ymax- dominerar vid y = 0,5. Den andra dominerar vid y = -0,5. Omarbetad från Nee (1989) med tillstånd från Elsevier; Journal of Theoretical Biology. eller ymin-värde är + patogenens Avr respektive Avr –dominerande. Vid interceptet med x-axeln är Avr+ och Avr – lika frekventa. Samma resonemang gäller för växtpopulationen (svart linje). Illustrationen saknar ett tidsintervall för det är irrelevant, men i verkligheten skulle, i extrema fall, minst en generation löpa för dominansbyte av en allel. Tre av NFS-teorins förutsägelser har testats i en undersökning av Siemens & Roy (2005). De testade ifall parasiter och patogener är lokalt anpassade till den vanligaste värd-haplotypen, om antalet lyckade angrepp är färre hos värdpopulationer med stor genetisk diversitet och om värdens fitness beror på dess genotypfrekvens (lägre fitness om högfrekvent). De använde tre populationer av den apomiktiskt förökande arten Arabis holboelli och dess interaktion med en rostsvamp och flera herbivorer. Apomixis betyder att växten förökar sig via fröproduktion, men dess frön är ej fertiliserade. Under förloppet av studien fann de att rostsvampen var lokalt adapterad till växtvärden och att total parasitism var lägre för växtpopulationen med störst genetisk variation. Resultaten visar potential för negativ frekvensberoende selektion men är svårtolkade då de även inkluderade herbivorer utan någon intim relation med växten. De baserade även tolkningen av resultaten på få inventeringstillfällen. Studien utfördes också tillsynes utan någon kontrollplot. De bästa exemplen i modern tid som påvisar samevolution med NFS kommer från studier på sötvattensmoluskers och andra evertebraters interaktioner med patogener. Dybdahl & Lively (1998) lyckades exempelvis påvisa både en samevolutionär cykel med laggfas och negativ frekvensberoende selektion i en naturlig gastropodpopulation. Ett liknande exempel finns bland växtpatogena studier. En sex år lång fältstudie tillsammans med kontrollerade växthusexperiment har utförts på lin/linrostsvamp-systemet av Thrall et al. (2012). De använde sex olika växtpopulationer för infektionsinventering. Vid fem tillfällen/säsong mättes infektionsgrad och mellan 30-50 patotyper isolerades/population. Under inokulationsstudierna i växthus utfördes totalt 14400 parvisa inokulationer med alla patotyper de isolerade över inventeringsfasen. Ett vigoröst testande visade bland annat att både växt- och patogen-populationer evolverade mycket snabbt och att Avr-alleler återanvändes efter de blivit ineffektiva i stil med Figur 4 ovan (istället för de selektiva svep av enbart nya alleler som predikteras av kapprustningshypotesen). De lämnar alltså klara tecken på att samevolution via NFS kan vara evolutionärt stabil i 9 experimentella förhållanden, nu återstår att se om resultaten är replikerbara och även stämmer för naturliga system. Andra tecken på bevarandet av R-gendiversitet genom balanserande selektion skulle kunna vara ett överflöd av mellanfrekventa basvariationer som segregerat för mycket länge sedan. Detta kan upptäckas med koalescensstudier där tiden till närmsta anfader simuleras (Tian et al. 2002). I en mycket extensiv studie av Kuang et al. (2004) rapporterades att två alleler från sallats (Lactuca sativa) resistensgenkandidater TDM och TC8 var snarlika två alleler från släktingen vildsallats (L. saligna) homologa gener LA8 och LB3, trots att de är två skilda arter. Denna transspecifika likhet i resistensgener är ett exempel på hur balanserad selektion troligen bevarat allelvariation över lång tid, även över gränsen för artbildning. Genetiska mekanismer i olika perspektiv Flera studier har rapporterat att hastigheten för uppkomst av ny resistens inte handlar om någon unik evolutionär mekanism eller ökad hastighet av nya punktmutationer. En stor del av genvariationen uppkommer genom att ett flertal klassiska genetiska omarrangemang verkar samtidigt och resulterar i hastig utveckling (Lee et al. 2009, Mondragon-Palomino & Gaut 2005, Paterson et al. 2009, Yang et al. 2013, Zhang et al. 2014). Några mekanismer som nyligen rapporterats för utvecklingen av nya effektiva alleler är felparning vid replikation och rekombination, ektopisk rekombination, ojämn överkorsning, alternativ splitsning av RNA-transkript och inversioner. Dessa påverkar oftast LRR-domänen. För uppkomsten av nya gener är olika typer av duplikation (med mikroRNA-interaktion), och transposonaktivitet vanligast. Efter duplikation divergerar genkopior vidare med ovanstående mekanismer. Några av dessa mekanismer diskuteras nedan. En vanlig mekanism för diversifiering av LRR-domäner är replikationsslirande (slip strand mispairing på engelska). Detta resulterar i indels som förlänger eller förkortar LRR-domänen och då påverkar bindningsspecificitet till Avr-protiner (Figur 5). Denna mekanism har nyligen observerats hos bland annat homolga Pi2/9-gener mellan ris, durra, backtrav och grusskafting (Brachypodium distachyon) (Wu et al. 2012). Ojämn överkorsning och ektopisk rekombination (ickereciprokt utbyte respektive utbyte av DNA-segment mellan icke-homologa loci) under meios har påvisats hos sallat, ris och backtrav (Kuang et al. 2004, Meyers et al. 2003). Wu et al. (2012) rapporterade nyligen en mosaik av LRR-motiv där flera återfanns på flera Figur 5. Proteinstrukturförutsägelse av LRR-domänen från sallats loki, både inom och mellan gener. R-gen DM3. Bild omarbetad från Michelmore et al. (2013). Detta skulle kunna ske vid ektopisk rekombination/genkonversion. De påvisade även heterogen utvecklingshastighet mellan gener inom famijen Pi2/9 i ris, noterat via stor nukleotiddiversitet. Tillsammans indikerar studiernas 10 resultat att genkonversion och ojämn överkorsning har varit viktiga processer för utvecklingen av R-gener och att en kombination av olika genetiska processer resulterar i en hastighetsskillnad i utveckling mellan underfamiljer. Totalt elva splitsningsvarianter av RNA-transkript från Pi-ta i ris har funnits, varav två med helt utbytt C-terminal. Detta visar att post-transkriptionell splitsning, och inte bara gen eller allelvariation kan vara en bidragande mekanism för diversifiering av patogenresistens hos växter (Costanzo & Jia 2009). R-gener hos backtrav (Lawrence et al. 1995, Whitham et al. 1994), böna (Phaseolus vulgaris) (Ferrier-Cana et al. 2005) och tomat (Solanum lycopersicum) (Schornack et al. 2004) använder också splitsningsvarianter, men dess relevans för uthålligt skydd mot sjukdom är oklar (Severing et al. 2011). Genduplikation är också en diversifierande kraft. Duplicering kan ske av korta sekvenser till hela gener, genblock och genom. Vid duplikation kan gener antingen kopieras till ett närliggande lokus eller flyttas till ett avlägset lokus via till exempel transposition och sedan divergera vidare via andra vanliga mutagena krafter (Luo et al. 2012). Det har visats att 60% av gräsväxters Rgener ingår i familjer som är arrangerade i täta grupperingar av divergerande kopior. Paterson et al. (2009) visade i en helgenomstudie att upp till 79% av genomet hos majs (Zea mays) och 55% hos durra består av duplicerade retrotransposoner. Att många gener med repetitiva LRRsekvenser ligger fysiskt tätt tillsammans runt ett lokus kan bidra till en dynamisk evolution/adaptivitet. Tät packning som formar en lång sekvens med hypervarierande repetitioner ger rekombination utrymme att omarrangera och skapa nya sekvenser (Zhang et al. 2014). På den största intragenomiska skalan hittas duplikation av kromosomsegment och hela genom (polyploidisering). Efter en polyploidisering händer det dock att delar av det kopierade materialet försvinner genom selektiv genradering och genetisk drift (Paterson et al. 2009, Zhang et al. 2014). Studier har nu visat att de extra R-generna som blivit kvar efter en segmentduplikation mycket ofta blir mål för diploidiseringsresistenta mikroRNA, korta RNA-strängar med genreglerande aktivitet som inte är känsliga för genradering. En föreslagen funktion för detta är att reglera doseringen av duplicerad R-gentranskription (Zhai et al. 2011, Zhang et al. 2014). Det är frestande att spekulera att denna funktionella plasticitet kan vara en mekanism som tillåter bevarandet av överflödiga gener med adaptiv poteintial, utan någon större fitnesskostnad. Duplikationer kan lämna spår som är synliga i ett genom över evolutionär tidsskala och kan till och med bevaras över artbildningsprocesser. I en studie av Yang et al. (2013) antog de att om samevolution-hypotesen med cyklisk NFS (återvinning av alleler) var korrekt borde paraloga Rgener mot M. grisea kunna hittas i avlägsna släktingar till ris. Paralog betyder att homologa gener är besläktade genom duplikation. Efter en omfattande fylogenetisk studie av fyra välsekvenserade genom (majs, durra, grusskafting och ris) valdes de fem snabbast evolverande genfamiljerna ut till vidare analys. Paraloga gener av RP3/Pc från alla arter utom ris, Rp1/Pi37 från majs och AC134922 från ris klonades in till riskultivarerna Shin2 och TP309 för resistensexperiment. Yang et al. (2013) fann totalt 28 helt nya R-gener mot infektion av M. grisea. Från dessa var 15 stycken paraloga R-gener från andra arter. Förutom att ge resistens mot M. grisea i ris ger durras Pc-Bgen resistens mot rotrost från Periconia circinata i sitt ursprungliga genom och RP3 i majs ger resistens mot rostsjuka från Puccinia sorghi. Detta är ett unikt fynd som visar att även fast det är 41-47 miljoner år sedan ris och durra delade en gemensam förfader (Paterson et al. 2004), så har transspecifika gener (gener som överlevt artbildning) behållit en resistensfunktion över lång tid. 11 Diskussion Denna artikel har med olika exempel från samtida forskningsresultat diskuterat funktion och evolution av det effektorutlösta försvaret hos växter för att belysa möjligheten för uthållig resistens hos vilda och domesticerade växter. Artikeln visar att utvecklingen av ny resistens är snabb på grund av de många genetiska mekanismer som verkar på generna. Denna artikel visar också att dynamiken mellan R-gener och Avr-gener i många fall är cyklisk och att R-alleler kan stanna kvar i en population över lång tid, även efter dess effektivitet minskat. Många av de paraloga duplikationshändelser som beskrivits är uråldriga och återfinns mellan avlägset besläktade arter. Detta stödjer teorin att röda-drottninghypotesen (GFG-specificitet med NFS och cyklisk allelomsättning) är en viktig kraft som påverkar samevolutionen i växt-patogensystem. Det ger också tecken på att adaptiv genetisk variation inte eroderar bort över tid. Fler tecken på uthållighet kommer av att upplagringen av gener via exempelvis duplikationer utgör en pool för potentiell framtida resistens då generna/allelerna kan återanvändas och hastigt omarrangeras så nya varianter uppstår. Att varje gen normalt har många alleler som ständigt förändras pekar också på att de kan evolvera i takt med patogenens utveckling. En allel kan i många fall även motstå flera liknande patotyper. Ett av de exempel denna artikel tagit upp är backtravs allel RPP13-ND som år 2000 gav resistens mot 5 patotyper av oomyceten P. parasitica vilken orsakar mjöldagg, så försvaret är flexibelt. Fler bevis på plasticitet kommer av att NB-LRR-gener visats interagera med både direkt och indirekt interaktion, R-genpar kan interagera och ge resistens och ett Rprotein har ofta affinitet för fler än ett Avr-protein. Denna plasticitet är dock inkompatibel med GFG-hypotesen som diskuterats i artikeln. Fenomenet att en R-allel kan binda flera olika effektorproteiner (Bittner-Eddy et al. 2000, Cesari et al. 2013) tyder på att R-alleler inte är helt specifika för ett protein. Förutom RPP13-ND så kan protein från R-allelen RGA5-A i ris exempelvis binda direkt till både Avr-Pia och Avr1-CO39 från M. grisea (Cesari et al. 2013). GFG-hypotesen kan dock möjligen förutse observationen att flera R-gener kan interagera för medge resistens mot en patogen om genpar från växtvärden interagerar med genpar från patogenen (Cesari et al. 2013, Vy et al. 2014). Att genpar interagerar tillsammans för att ge resistens kan indikera att försvaret är en kvantitativ egenskap (quantitative trait på engelska) vilket öppnar upp nya möjligheter att studera försvaret. Det finns även ett oförklarat fenomen inom vakthypotesen som också diskuterats i den här artikeln. De vaktade växtproteinerna anses vara i en evolutionärt instabil situation, något som granskats i en perspektivartikel av Hoorn & Kamoun (2008). De postulerar att två olika selektiva krafter motverkar varandra på det vaktade proteinets interaktionsdomän beroende på om en effektiv R-gen finns eller inte. Om det finns ett försvar bör evolutionen gynna en starkare interaktion mellan Avr-protein och det vaktade proteinet för att ge starkare respons. Om inget försvar finns bör evolutionen gynna minskad affinitet till Avr-proteinet för att undgå dess destruktiva effekt (Hoorn & Kamoun 2008). Denna typ av instabilitet kan påverka den evolutionära uthålligheten av systemet. En högre grad av komplexitet än tidigare förmodat börjar lyftas fram och visar ett behov av att modifiera de grundläggande hypoteserna. Hypoteserna är dock ännu inte motbevisade och är fortfarande användbara som grund för fortsatta studier. I naturlig miljö existerar fortfarande stora, hälsosamma populationer med olikartad intraspecifik genetisk och interspecifik artvariation, något som är viktigt för att kunna evolvera och samexistera. I extensiva jordbrukssystem av genetiskt homogena monokulturer där risken för 12 infektion är större finns också tecken på uthålligt försvar. Riskultivarer innehållande de effektorutösta R-generna Pi-ta och Pi-k som ger försvar mot M. grisea odlas över stora delar av världen på grund av att singlettgenerna visats vara resistenta mot många patotyper av svampen. Av enbart Pi-ta har 220 alleler funnits (Thakur et al. 2013) som tillsammans ger uthållig resistens mot de tio mest frekventa, och minst sju andra patotyper i Amerika (Jia et al. 2009). Thakur et al. (2013) meddelar att Pi-ta-genen och dess variation även är effektiv i olika delar av Indien. I Yunnan (Kina) analyserades nyligen 218 isolat av M. grisea. Där hittades Avr-pita i medel hos ~59% av isolaten (Li et al. 2014) vilket tyder på att Pi-ta är mycket viktig världen över och ger uthållig resistens, även om antropogen spridning av patogener ökar. Denna artikel bearbetade endast NB-LRR-klassen av resistensgener och dessa har visats ineffektiva mot obligat nekrotrofa patogener. Effektorutlöst HR kan inte begränsa deras tillväxt eftersom dessa organismer behöver döda celler för att kolonisera en växt (Faris et al. 2010). Hos backtrav motverkas dessa patogener med hjälp av att producera små doser av camalexin, ett toxin som förhindrar både nekrotrof bakterie- och svamp-tillfäxt (Veronese et al. 2004). Även andra typer av försvar existerar. Sammantaget indikerar exemplen ett stabilt och uthålligt försvar i naturen. Det händer dock att ingen resistensgen klarar av patogentrycket (PUF inkluderat), särskilt om abiotisk stress verkar samtidigt. För att förbättra situationen i agrikulturella system utan gentekniska ingrepp eller kemisk bekämpning föreslås här test av en odlingsstrategi där hög artdiversitet placeras ut på fälten. På så sätt kan förluster minskas då mottagliga bestånd av grödor blir mer utspridda och får möjlighet att undgå kontakt med patogenen. För att inte hindra skördeffektivitet kan en mångfald av arvslinjer av samma kultivar med liknande genetisk bakgrund, men olika R-gener istället odlas samtidigt med en slumpvis placering. Olika R-gener bör också bytas ut över tid för att förhindra att multiresistenta patogener uppstår. Detta skulle kunna skapa ett diversifierande selektionstryck på patogenen som då får det svårt att nå en fitnesstopp i det evolutionära landskapet. Därmed kan samevolutionscykeln möjligen brytas och tiden som en R-gen är effektiv förlängas (Zhan et al. 2012). Utvecklingen av metoder för att hastigt kunna se vilka patogena Avr-gener som är aktiva i ett jordbruksfält skulle möjligen kunna hjälpa till att effektivisera en strategisk utplacering av resistensgener. Exempelvis kan mikromatriser eller RT-PCR (polymeras-kedjereaktion med omvänd transkription) användas. Framtida studier åläggs att avgöra effektiviteten av dessa strategier. Något som saknas inom resistensforskningen är storskaliga helgenomstudier och interaktionsstudier om resistens över interspecifik nivå. Experimentella bevis för röda drottningen (NFS med cyklisk omsättning av alleler) har hittills mestadels behandlat parvisa system med konstanta populationsstorlekar där effektorproteiner visat intim relation till specifika Avrproteiner (Gokhale et al. 2013). I framtiden skulle det därför vara intressant att se hur uthållig växtresistensen är i ett system innehållande flera växtarter och fler än en patogen (större ekologisk komplexitet). En viktig generaliseringsbegränsning inom samevolution via rödadrottninghypotesen är nämligen att modellen förutsätter konstant populationsstorlek. Den teoretiska modellen blir instabil när stokasticitet introduceras i form av populationsfluktuationer hos värden (Gokhale et al. 2013). Inkluderar modellen fler än en patogen eller en till trofisk nivå (herbivori på växtvärden till exempel) kan även den evolutionära dynamiken bli kaotisk (Dercole et al. 2010). En syntes mellan populationsekologi och evolutionsgenetik skulle kunna komma nära verklig komplexitet och besvara många återstående frågor inom resistensforskningen. Detta 13 har även föreslagits i en opinionsartikel av Johnson & Stinchcombe (2007). Finns det ett uthålligt försvar mot ett potentiellt ökat patogentryck? Det behövs mer detaljerad kunskap om de cellulära resistensmekanismerna, R-proteindomäners funktion, vad som reglerar R-genuttryck och om hur R-gener och patogener utvecklas i ett evolutionärt perspektiv för att kunna studera och med säkerhet bedöma om ett uthålligt försvar finns. De teorier och bevis som granskats i denna artikel visar dock att det effektorutlösta försvaret är välutvecklat, anpassningsbart och robust i naturen. Även fast det finns många fall där grödor och naturliga populationer inte är resistenta/ toleranta så stärker nutida resultat hypotesen om att ett uthålligt försvar (åtminstone inom jordbruket) skulle kunna nås inom snar framtid. Tack Jag vill tacka Lage Cerenius, Natalie Boqvist och Ylva Sortelius för värdefulla kommentarer på tidigare versioner av artikeln och institutionen för biologisk grundutbildning vid Uppsala Universitet som gjorde artikeln möjlig. Referenser Allard RW, Adams J. 1969. Population Studies in Predominantly Self-Pollinating Species. XIII. Intergenotypic Competition and Population Structure in Barley and Wheat. The American Naturalist 103: 621–645. Armstrong MR, Whisson SC, Pritchard L, Bos JIB, Venter E, Avrova AO, Rehmany AP, Böhme U, Brooks K, Cherevach I et al. 2005. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102: 7766–7771. Aslam SN, Newman MA, Erbs G, Morrissey KL, Chinchilla D, Boller T, Jensen TT, De Castro C, Ierano T, Molinaro A et al. 2008. Bacterial Polysaccharides Suppress Induced Innate Immunity by Calcium Chelation. Current Biology 18: 1078–1083. Bahadur RP, Basak J. 2014. Molecular modeling of protein–protein interaction to decipher the structural mechanism of nonhost resistance in rice. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 32: 669–681. Bai J, Pennill LA, Ning J, Lee SW, Ramalingam J, Webb CA, Zhao B, Sun Q, Nelson JC, Leach JE, Hulbert SH. 2002. Diversity in Nucleotide Binding Site–Leucine-Rich Repeat Genes in Cereals. Genome Research 12: 1871–1884. Bernoux M, Ve T, Williams S, Warren C, Hatters D, Valkov E, Zhang X, Ellis JG, Kobe B, Dodds PN. 2011. Structural and Functional Analysis of a Plant Resistance Protein TIR Domain Reveals Interfaces for Self-Association, Signaling, and Autoregulation. Cell Host & Microbe 9: 200–211. Bittner-Eddy PD, Crute IR, Holub EB, Beynon JL. 2000. RPP13 is a simple locus in Arabidopsis thaliana for alleles that specify downy mildew resistance to different avirulence determinants in Peronospora parasitica. The Plant Journal 21: 177–188. Bryan GT, Wu KS, Farrall L, Jia Y, Hershey HP, McAdams SA, Faulk KN, Donaldson GK, Tarchini R, Valent B. 2000. A Single Amino Acid Difference Distinguishes Resistant and 14 Susceptible Alleles of the Rice Blast Resistance Gene Pi-ta. Plant Cell Online 12: 2033– 2045. Cannon SB, Zhu H, Baumgarten AM, Spangler R, May G, Cook DR, Young ND. 2002. Diversity, Distribution, and Ancient Taxonomic Relationships Within the TIR and NonTIR NBS-LRR Resistance Gene Subfamilies. Journal of Molecular Evolution 54: 548– 562. Catanzariti A-M, Dodds PN, Ve T, Kobe B, Ellis JG, Staskawicz BJ. 2010. The AvrM Effector from Flax Rust Has a Structured C-Terminal Domain and Interacts Directly with the M Resistance Protein. Molecular Plant-Microbe Interactions 23: 49–57. Cesari S, Thilliez G, Ribot C, Chalvon V, Michel C, Jauneau A, Rivas S, Alaux L, Kanzaki H, Okuyama Y et al. 2013. The Rice Resistance Protein Pair RGA4/RGA5 Recognizes the Magnaporthe oryzae Effectors AVR-Pia and AVR1-CO39 by Direct Binding. The Plant Cell Online 25: 1463–1481. Chen Q, Han Z, Jiang H, Tian D, Yang S. 2010. Strong Positive Selection Drives Rapid Diversification of R-Genes in Arabidopsis Relatives. Journal of Molecular Evolution 70: 137–148. Costanzo S, Jia Y. 2009. Alternatively spliced transcripts of Pi-ta blast resistance gene in Oryza sativa. Plant Science 177: 468–478. Dercole F, Ferriere R, Rinaldi S. 2010. Chaotic Red Queen coevolution in three-species food chains. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 277: 2321–2330. DeYoung BJ, Innes RW. 2006. Plant NBS-LRR proteins in pathogen sensing and host defense. Nature immunology 7: 1243–1249. Dodds PN, Lawrence GJ, Catanzariti A-M, Ayliffe MA, Ellis JG. 2004. The Melampsora lini AvrL567 Avirulence Genes Are Expressed in Haustoria and Their Products Are Recognized inside Plant Cells. Plant Cell Online 16: 755–768. Dybdahl MF, Lively CM. 1998. Host-Parasite Coevolution: Evidence for Rare Advantage and Time-Lagged Selection in a Natural Population. Evolution 52: 1057–1066. Erbs G, Silipo A, Aslam S, De Castro C, Liparoti V, Flagiello A, Pucci P, Lanzetta R, Parrilli M, Molinaro A. 2008. Peptidoglycan and muropeptides from pathogens Agrobacterium and Xanthomonas elicit plant innate immunity: structure and activity. Chemistry & Biology 15: 438–448. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, Fellers JP, Meinhardt SW, Rasmussen JB, Xu SS et al. 2010. A unique wheat disease resistance-like gene governs effector-triggered susceptibility to necrotrophic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences 107: 13544–13549. Ferrier-Cana E, Macadré C, Sévignac M, David P, Langin T, Geffroy V. 2005. Distinct posttranscriptional modifications result into seven alternative transcripts of the CC–NBS– LRR gene JA1tr of Phaseolus vulgaris. Theoretical and Applied Genetics 110: 895–905. Flor HH. 1942. Inheritance of pathogenicity in Melampsora lini. Phytopathology 32: 653–669. Flor HH. 1971. Current Status of the Gene-For-Gene Concept. Annual Review of Phytopathology 9: 275–296. Gandon S, Michalakis Y. 2002. Local adaptation, evolutionary potential and host–parasite coevolution: interactions between migration, mutation, population size and generation time. Journal of Evolutionary Biology 15: 451–462. Gokhale CS, Papkou A, Traulsen A, Schulenburg H. 2013. Lotka–Volterra dynamics kills the Red Queen: population size fluctuations and associated stochasticity dramatically change host-parasite coevolution. BMC Evolutionary Biology 13: 254. 15 Haldane JBS. 1949. Disease and evolution. Supplement to La Ricerca Scientifica 19: 68–76. Hammond-Kosack KE, Jones JDG. 1997. Plant Disease Resistance Genes. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48: 575–607. Hoorn RAL van der, Kamoun S. 2008. From Guard to Decoy: A New Model for Perception of Plant Pathogen Effectors. Plant Cell Online 20: 2009–2017. Horger AC, Ilyas M, Stephan W, Tellier A, van der Hoorn RAL, Rose LE. 2012. Balancing Selection at the Tomato RCR3 Guardee Gene Family Maintains Variation in Strength of Pathogen Defense. PLoS Genetics, doi: 10.1371/journal.pgen.1002813 Hovmøller MS, Justesen AF, Brown JKM. 2002. Clonality and long-distance migration of Puccinia striiformis f.sp. tritici in north-west Europe. Plant Pathology 51: 24–32. Jakob K, Goss EM, Araki H, Van T, Kreitman M, Bergelson J. 2002. Pseudomonas viridiflava and P. syringae —Natural Pathogens of Arabidopsis thaliana. Molecular Plant-Microbe Interactions 15: 1195–1203. Jakobek JL, Smith JA, Lindgren PB. 1993. Suppression of Bean Defense Responses by Pseudomonas syringae. Plant Cell Online 5: 57–63. Jia Y, Lee FN, McClung A. 2009. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease 93: 639–644. Jia Y, McAdams SA, Bryan GT, Hershey HP, Valent B. 2000. Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance. The EMBO Journal 19: 4004–4014. Johnson MTJ, Stinchcombe JR. 2007. An emerging synthesis between community ecology and evolutionary biology. Trends in Ecology & Evolution 22: 250–257. Kanzaki H, Yoshida K, Saitoh H, Fujisaki K, Hirabuchi A, Alaux L, Fournier E, Tharreau D, Terauchi R. 2012. Arms race co-evolution of Magnaporthe oryzae AVR-Pik and rice Pik genes driven by their physical interactions. The Plant Journal72: 894–907. Kimura M. 1962. On the Probability of Fixation of Mutant Genes in a Population. Genetics 47: 713–719. Kimura M, Crow JF. 1964. The Number of Alleles That Can Be Maintained in a Finite Population. Genetics 49: 725–738. Krasileva KV, Dahlbeck D, Staskawicz BJ. 2010. Activation of an Arabidopsis Resistance Protein Is Specified by the in Planta Association of Its Leucine-Rich Repeat Domain with the Cognate Oomycete Effector. Plant Cell Online 22: 2444–2458. Kuang H, Woo SS, Meyers BC, Nevo E, Michelmore RW. 2004. Multiple Genetic Processes Result in Heterogeneous Rates of Evolution within the Major Cluster Disease Resistance Genes in Lettuce. The Plant Cell Online 16: 2870–2894. Lawrence GJ, Finnegan EJ, Ayliffe MA, Elli JG. 1995. The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis bacterial resistance gene RPS2 and the tobacco viral resistance gene N. The Plant Cell Online 7: 1195–1206. Lee S, Costanzo S, Jia Y, Olsen KM, Caicedo AL. 2009. Evolutionary Dynamics of the Genomic Region Around the Blast Resistance Gene Pi-ta in AA Genome Oryza Species. Genetics 183: 1315–1325. Li JB, Lu L, Jia Y, Li C. 2014. Effectiveness and durability of the rice Pi-ta gene in Yunnan province of China. Phytopathology, http://dx.doi.org/10.1094/PHYTO-11-13-0302-R Liu T, Liu Z, Song C, Hu Y, Han Z, She J, Fan F, Wang J, Jin C, Chang et al. 2012. Chitininduced dimerization activates a plant immune receptor. Science 336: 1160–1164. 16 Luck JE, Lawrence GJ, Dodds PN, Shepherd KW, Ellis JG. 2000. Regions outside of the Leucine-Rich Repeats of Flax Rust Resistance Proteins Play a Role in Specificity Determination. The Plant Cell 12: 1367-1378. Luo S, Zhang Y, Hu Q, Chen J, Li K, Lu C, Liu H, Wang W, Kuang H. 2012. Dynamic Nucleotide-Binding Site and Leucine-Rich Repeat-Encoding Genes in the Grass Family. Plant Physiology 159: 197–210. Mackey D, Belkhadir Y, Alonso JM, Ecker JR, Dangl JL. 2003. Arabidopsis RIN4 Is a Target of the Type III Virulence Effector AvrRpt2 and Modulates RPS2-Mediated Resistance. Cell 112: 379–389. Maekawa T, Cheng W, Spiridon LN, Töller A, Lukasik E, Saijo Y, Liu P, Shen QH, Micluta MA, Somssich IE et al. 2011. Coiled-Coil Domain-Dependent Homodimerization of Intracellular Barley Immune Receptors Defines a Minimal Functional Module for Triggering Cell Death. Cell Host & Microbe 9: 187–199. Meyers BC, Dickerman AW, Michelmore RW, Sivaramakrishnan S, Sobral BW, Young ND. 1999. Plant disease resistance genes encode members of an ancient and diverse protein family within the nucleotide-binding superfamily. The Plant Journal 20: 317–332. Meyers BC, Kozik A, Griego A, Kuang H, Michelmore RW. 2003. Genome-Wide Analysis of NBS-LRR–Encoding Genes in Arabidopsis. Plant Cell Online 15: 809–834. Michelmore RW, Christopoulou M, Caldwell KS. 2013. Impacts of Resistance Gene Genetics, Function, and Evolution on a Durable Future. Annual Review of Phytopathology 51: 291– 319. Mondragon-Palomino M, Gaut BS. 2005. Gene Conversion and the Evolution of Three LeucineRich Repeat Gene Families in Arabidopsis thaliana. Molecular Biology and Evolution 22: 2444–2456. Nee S. 1989. Antagonistic co-evolution and the evolution of genotypic randomization. Journal of Theoretical Biology 140: 499–518. Nei M, Gojobori T. 1986. Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions. Molecular Biology and Evolution 3: 418–426. Noël L, Moores TL, van der Biezen EA, Parniske M Daniels MJ, Parker JE, Jones JDG. 1999. Pronounced Intraspecific Haplotype Divergence at the RPP5 Complex Disease Resistance Locus of Arabidopsis. Plant Cell Online 11: 2099–2111. Parmley JL, Hurst L. 2007. How Common Are Intragene Windows with K A > K S Owing to Purifying Selection on Synonymous Mutations? Journal of Molecular Evolution, doi: 10. 1007/s00239-006-0207-7. Paterson AH, Bowers JE, Bruggmann R, Dubchak I, Grimwood J, Gundlach H, Haberer G, Hellsten U, Mitros T, Poliakov A et al. 2009. The Sorghum bicolor genome and the diversification of grasses. Nature 457: 551–556. Paterson AH, Bowers JE, Chapman BA. 2004. Ancient polyploidization predating divergence of the cereals, and its consequences for comparative genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 9903–9908. Perrings C, Williamson M, Barbier EB, Delfino D, Dalmazzone S, Shogren J, Simmons P, Watkinson A. 2002. Biological Invasion Risks and the Public Good: an Economic Perspective. Conservation Ecology, URL: http://www.consecol.org/vol6/iss1/art1/. Rairdan GJ, Collier SM, Sacco MA, Baldwin TT, Boettrich T, Moffett P. 2008. The coiled-coil and nucleotide binding domains of the potato Rx disease resistance protein function in pathogen recognition and signaling. The Plant Cell Online, 20: 739-751. 17 Rose LE, Bittner-Eddy PD, Langley CH, Holub EB, Michelmore RW, Beynon JL. 2004. The Maintenance of Extreme Amino Acid Diversity at the Disease Resistance Gene, RPP13, in Arabidopsis thaliana. Genetics 166: 1517–1527. Schornack S, Ballvora A, Gürlebeck D, Peart J, Ganal M, Baker B, Bonas U, Lahaye T. 2004. The tomato resistance protein Bs4 is a predicted non-nuclear TIR-NB-LRR protein that mediates defense responses to severely truncated derivatives of AvrBs4 and overexpressed AvrBs3. The Plant Journal 37: 46–60. Sela H, Spiridon LN, Petrescu A-J, Akerman M, Mandel-Gutfreund Y, Nevo E, Loutre C, Keller B, Schulman AH, Fahima T. 2012. Ancient diversity of splicing motifs and protein surfaces in the wild emmer wheat (Triticum dicoccoides) LR10 coiled coil (CC) and leucine-rich repeat (LRR) domains. Molecular Plant Pathology 13: 276–287. Severing EI, van Dijk ADJ, van Ham RCHJ, 2011. Assessing the contribution of alternative splicing to proteome diversity in Arabidopsis thaliana using proteomics data. BMC plant biology, doi:10.1186/1471-2229-11-82. Siemens DH, Roy BA. 2005. Tests for Parasite-mediated Frequency-dependent Selection in Natural Populations of an Asexual Plant Species. Evolutionary Ecology 19: 321–338. Song H, Nan Z. 2014. Genome-wide analysis of nucleotide-binding site disease resistance genes in Medicago truncatula. Chinese Science Bulletin 59: 1129–1138. Spielman D, Brook BW, Briscoe DA, Frankham R. 2004. Does Inbreeding and Loss of Genetic Diversity Decrease Disease Resistance? Conservation Genetics 5: 439–448. Tameling WIL, Elzinga SDJ, Darmin PS, Vossen JH, Takken FLW, Haring MA, Cornelissen BJC. 2002. The Tomato R Gene Products I-2 and Mi-1 Are Functional ATP Binding Proteins with ATPase Activity. Plant Cell Online 14: 2929–2939. Thakur S, Gupta YK, Singh PK, Rathour R, Variar M, Prashanthi SK, Singh AK, Singh UD, Chand D, Rana JC et al. 2013. Molecular diversity in rice blast resistance gene Pi-ta makes it highly effective against dynamic population of Magnaporthe oryzae. Functional & Integrative Genomics 13: 309–322. Thrall PH, Laine A-L, Ravensdale M, Nemri A, Dodds PN, Barrett LG, Burdon JJ. 2012. Rapid genetic change underpins antagonistic coevolution in a natural host-pathogen metapopulation. Ecology Letters 15: 425–435. Tian D, Araki H, Stahl E, Bergelson J, Kreitman M. 2002. Signature of balancing selection in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 11525–11530. Vanderplank JE. 1978. Genetic and molecular basis of plant pathogenesis. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg. Veronese P, Chen X, Bluhm B, Salmeron J, Dietrich R, Mengiste T. 2004. The BOS loci of Arabidopsis are required for resistance to Botrytis cinerea infection. The Plant Journal 40: 558–574. Vy TTP, Hyon G-S, Nga NTT, Inoue Y, Chuma I, Tosa Y. 2014. Genetic analysis of host– pathogen incompatibility between Lolium isolates of Pyricularia oryzae and wheat. Journal of General Plant Pathology 80: 59–65. Walbot V, Evans MMS. 2003. Unique features of the plant life cycle and their consequences. Nature Reviews Genetics 4: 369–379. Whitham S, Dinesh-Kumar SP, Choi D, Hehl R, Corr C, Baker B. 1994. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to toll and the interleukin-1 receptor. Cell 78: 1101–1115. 18 Williams SJ, Sornaraj P, deCourcy-Ireland E, Menz RI, Kobe B, Ellis JG, Dodds PN, Anderson PA. 2011. An Autoactive Mutant of the M Flax Rust Resistance Protein Has a Preference for Binding ATP, Whereas Wild-Type M Protein Binds ADP. Molecular Plant-Microbe Interactions 24: 897–906. Woolhouse MEJ, Webster JP, Doming E, Charlesworth B, Levin BR. 2002. Biological and biomedical implications of the co-evolution of pathogens and their hosts. Nature Genetics 32: 569–577. Wu K, Xu T, Guo C, Zhang X, Yang S. 2012. Heterogeneous evolutionary rates of Pi2/9 homologs in rice. BMC Genetics 13: 73. Yang Z, Bielawski JP. 2000. Statistical methods for detecting molecular adaptation. Trends in ecology & evolution 15: 496–503. Yang S, Li J, Zhang X, Zhang Q, Huang J, Chen J-Q, Hartl DL, Tian D. 2013. Rapidly evolving R genes in diverse grass species confer resistance to rice blast disease. Proceedings of the National Academy of Sciences 110: 18572-18577 Yue J-X, Meyers BC, Chen J-Q, Tian D, Yang S. 2012. Tracing the origin and evolutionary history of plant nucleotide-binding site–leucine-rich repeat (NBS-LRR) genes. New Phytologist 193: 1049–1063. Zhai J, Jeong D-H, Paoli ED, Park S, Rosen BD, Li Y, González AJ, Yan Z, Kitto SL, Grusak MAl. 2011. MicroRNAs as master regulators of the plant NB-LRR defense gene family via the production of phased, trans-acting siRNAs. Genes & Development 25: 2540– 2553. Zhan J, Yang L, Zhu W, Shang L, Newton AC. 2012. Pathogen Populations Evolve to Greater Race Complexity in Agricultural Systems - Evidence from Analysis of Rhynchosporium secalis Virulence Data. PLoS ONE, doi 10.1371/journal.pone.0038611. Zhang R, Murat F, Pont C, Langin T, Salse J. 2014. Paleo-evolutionary plasticity of plant disease resistance genes. BMC Genomics 15: 187. Zhu Q, Zheng X, Luo J, Gaut BS, Ge S. 2007. Multilocus Analysis of Nucleotide Variation of Oryza sativa and Its Wild Relatives: Severe Bottleneck during Domestication of Rice. Molecular Biology and Evolution 24: 875–888. 19
© Copyright 2024