(12) Oversettelse av europeisk patentskrift
NO/EP2243821 (12) Oversettelse av (11) NO/EP 2243821 B1 europeisk patentskrift (19) NORGE NO (51) Int Cl. C11D 3/386 (2006.01) A61L 2/16 (2006.01) A61L 2/18 (2006.01) A61L 12/14 (2006.01) B65B 5/00 (2006.01) C11D 3/00 (2006.01) C11D 7/42 (2006.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert 2015.05.04 (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet 2014.11.26 (86) Europeisk søknadsnr 09290293.1 (86) Europeisk innleveringsdag 2009.04.20 (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato 2010.10.27 (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Realco SA, Avenue Albert Einstein 15, 1348 Louvain La Neuve, BE-Belgia Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), 147, rue de l'Université, 75338 Paris Cedex 07, FR-Frankrike (72) Oppfinner Boels, Gauthier, rue Docteur Roux, 9, 1070 Bruxelles, BE-Belgia Blackman, Gordon, rue Blois Eloi, 23, 1380 Lasnes, BE-Belgia Faille, Christine, rue de Loos, 21, 59000 Lille, FR-Frankrike Lequette, Yannick, rue de Carency, 62144 Mont-Saint-Eloi, FR-Frankrike Clarisse, Martine, rue des Ecoles, 32, 59390 Lys-lez-Lannoy, FR-Frankrike (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 0104 OSLO, Norge (54) Benevnelse (56) Anførte publikasjoner Produkt og metode for elliminering av biofilmer WO-A-92/13807 US-A1- 2003 205 247 Trudi M. Foreman ET AL: "Effects of charged water-soluble polymers on the stability and activity of yeast alcohol dehydrogenase and subtilisin Carlsberg", Biotechnology and Bioengineering, vol. 76, no. 3, 1 November 2001 (2001-11-01), pages 241-246, XP055126700, ISSN: 00063592, DOI: 10.1002/bit.1187 NO/EP2243821 1 Fremgangsmåte for fjerning av biofilmer Teknisk område Foreliggende oppfinnelse angår området fjerning av biofilmer. Mer spesielt angår 5 oppfinnelsen et preparat og en fremgangsmåte for å fjerne biofilmer. Beskrivelse av den kjente teknikk Hygiene inntar en stadig økende rolle i næringsmiddelindustrien, når det gjelder sykehus, og spesielt det kirurgiske området, i installasjoner for drikkevannsfremstilling 10 og avsalting av vann, ved behandling av prosessvann, og spesielt når det gjelder vann som benyttes i kjøletårn, og på nødvendige områder for det daglige liv, f.eks. kontaktlinser. Man observerer hyppig, under sirkulasjon av vann over en bærer, at mikroorganismer sirkulerer fritt i vannet, og kan adherere til overflaten. Disse mikroorganismer kan så utvikle en ekstracellulær adhesiv blanding av polymere 15 substanser. En populasjon av mikroorganismer som adhererer til en overflate, og som er omhyllet av en slik matriks, kalles en biofilm. Man observerer uheldigvis at denne matriks er meget motstandsdyktig, og kan utgjøre en barriere for de midler som virker mot mikroorganismene. De klassiske behandlinger på basis av natriumhydroksid og/eller omfattende forskjellige biocider, virker ikke på tilstrekkelig 20 effektiv måte, fordi de ikke trenger inn i biofilmen gjennom hele dens tykkelse, eller hindres av visse molekyler som utgjør denne matriks. Behandlingen er således ikke spesielt effektiv på overflaten av biofilmen. Videre kan denne siste muliggjøre andre mikroorganismer, og særlige patogener, som per se ikke til å begynne med ikke er tilstede. 25 Man kjenner fra WO 98(26807 en fremgangsmåte for enzymatisk behandling av en biologisk film. I denne prosess bringer man biofilmen i kontakt med et vaskepreparat omfattende én eller flere hydrolaser, for å fjerne eller frigjøre biofilemn fra overflaten. I et andre trinn blir biofilmen brakt i kontakt med et baktericid desinfeksjonsmiddel, 30 for å destruere bakteriecellene som er tilstede i filmen. Imidlertid er den samtidige bruk av disse to preparater opphavet til en inaktiveringsgrad av visse enzymer i sluttblandingen. Hurtigheten og effektiviteten for vaskingen kan således forbedres ved å benytte et preparat der inaktivering av enzymer ikke skjer. 35 Dokumentet WO92/13807 beskriver også et preparat for enzymatisk behandling av biofilmer. NO/EP2243821 2 Man kjenner fra US 2003/0205247 en anvendelse av vandige oppløsninger inneholdende enzymer for vasking av lagrings- eller fermenteringsbeholdere, inneholdende ett eller flere enzymer valgt blant de følgende: lakkaser, peroksidaser, oksydoreduktaser, transferaser, isomeraser, lyaser, eller ligaser. Virkningsområdene 5 for de ovenfor nevnte oppløsninger er relativt snevre, og spesielt for bryggerier. Disse løsninger egner seg ikke for vasking av et stort spektrum av biofilmer. Det foreligger således et behov for et preparat og en fremgangsmåte som er i stand til å fjerne biofilmer, som er effektivt innen et rimelig tidsrom, virker på et stort 10 spektrum av biofilmer som fremstilles av en bred klasse av mikroorganismer, eller mikroorganismegrupper, som er ikke skadelige for biofilmbærere, og som virker for å forhindre utvikling av biofilmer, og på biofilmer som har bestått i l ang tid, og som har oppnådd en betydelig kohesjons- og resistensevne. 15 Oppsummering av oppfinnelsen Foreliggende oppfinnelse angår en løsning på ett, flere, eller alle manglene ved den konvensjonelle teknikk, og som kan gi ytterligere fordeler som ikke kunne oppnås med de kjente preparater eller prosesser. 20 Foreliggende oppfinnelse angår et preparat for å fjerne biofilmer som er tilstede på et substrat. Preparatet karakteriseres ved at det omfatter en detergenskomponent inneholdende ek sekvestrant, og en enzymatisk komponent inneholdende minst én protease, og minst én lakase, der preparatet karakteriseres ved at detergenskomponenten i tillegg inneholder et fuktemiddel og et dispergeringsmiddel, 25 og at den enzymatiske komponent videre omfatter minst én polysakkaridase. Sammensetningen av et preparat omfattende en detergenskomponent og en enzymatisk komponent ifølge oppfinnelsen tillater, på overraskende måte, signifikant å forbedre hurtigheten og effektiviteten for fjerningen av en biofilm. Dette preparat 30 tillater å eliminere hele eller så å si hele biofilmen. Videre kan preparatet virkes på biofilmer, selv om de er modne, eller har en langt fremskreden utviklingssyklus, og er utviklet i flere rom eller av flere forskjellige mikroorganismer. Kombinasjonen av en detergenskomponent og en enzymatisk komponent ifølge oppfinnelsen, tillater således effektivt å virke på en biofilm. Detergensen eliminerer en overflatedel av biofilmen, og 35 fukter eller trenger inn i de organiske strukturer av biofilmen, noe som favoriserer tilgjengeligheten av den enzymatiske komponent som sprøgjør og nedbryter biofilmmatriksen. Denne kombinerte virkning favoriserer tilgjengeligheten for NO/EP2243821 3 preparatet når det gjelder de dypere sjikt, og tillater en optimal løsgjøring av biofilmen mens man bevarer substratet. I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen, kan det nevnte preparat 5 være en oppløsning med en pH-verdi som ligger omtrent mellom 8 og 11, fortrinnsvis omtrent mellom 9,5 og 10,5, og helt spesielt tilnærmet ligger mellom 9,5 og 10. pHverdien for det nevnte preparat innvirker på vesentlig måte på effektiviteten vis a vis biofilmen. En oppløsning av det nevnte preparat der pH-verdien ligger omtrent mellom 8 og 11, tillater således på overraskende måte å fjerne hele eller så å si hele 10 biofilmen. Alternativt kan preparatet foreligge i fast form, og så oppløses før bruk i et oppløsningsmiddel for å oppnå en oppløsning viss pH-verdi omtrent ligger mellom 8 og 11. Fortrinnsvis omfatter det en enzymatiske preparat en andel av protease som ligger 15 mellom 10 og 50 %, en andel av lakkase som ligger mellom 5 og 35 %, og en andel polysakkaridase i en mengde mellom 5 og 20 %. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kan det enzymatiske preparat inneholdende mellom 1 og 10 proteaser, fortrinnsvis mellom 1 og 5 proteaser, og mer spesielt kan det inneholde 2, 3, 4 eller 5 proteaser. 20 Ikke-begrensende eksempler på proteaseenzym fra klassen EC 3.4, og som kan benyttes ifølge oppfinnelsen er aminopeptidasene og (EC 3.4.11), dipeptidasene (EC 3.4.13), dipeptidylpeptidasene og tripeptidylpeptidasene (EC 3.4.14), peptidyldipeptidasene (EC 3.4.15), serinkarboksypeptidasene (EC 3.4.16), 25 metallokarboksypeptidasene (EC 3.4.17), cysteinkarboksypeptidasene (EC 3.4.18), omegapeptidasene (EC 3.4.19), serinendopeptidasene (EC 3.4.21), cysteinendopeptidasene (EC 3.4.22), aspartinendopeptidasene (EC 3.4.23), metalloendopeptidasene (EC 3.4.24), treoninendopeptidasene (EC 3.4.25), og endopeptidasene fra klassen EC 3.4.99. Fortrinnsvis hører proteasene til klassen EC 30 3.4.21. Proteasene er kommersielt tilgjengelige, og i forskjellige former, inkludert pulvere, granulat, suspensjoner, eller flytende oppløsninger. Lakkasene som benyttes ifølge oppfinnelsen hører til klassene EC 1.10.3.2. Lakkasene er enzymer som inneholder kobber, og som har som funksjon å oksidere et substrat i nærvær av oksygen. Mer spesielt er lakkasene oksydoreduktaser som funksjonerer med 35 molekylært oksygen som elektronakseptor. Den minst ene polysakkaridase som benyttes ifølge oppfinnelsen er et enzym som har som funksjon å bryte forbindelsene i polysakkaridene. Fortrinnsvis kan den minst ene polysakkaridase være en alfa- NO/EP2243821 4 amylase, cellulase, hemi-cellulase, glukosidase, beta-glukanase, eller pektinase. Mer spesielt kan den minst ene polysakkaridase være være en alfa-amylase som hører til klassen EC 3.2.1.1 med en funksjon for å splitte (1-4)-alfa-glykosidiske bindinger i polysakkaridene som inneholder tre eller flere alfa-(1-4)-D-glukoseenheter. 5 Fortrinnsvis kan det enzymatiske preparat omfatte en andel av lakkase på rundt 30 %, en andel av protease på rundt 30 %, en andel av alfa-amylase på rundt 10 %. I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform, og hvis det enzymatiske preparat omfatter to proteaser, kan lakkaseandelen være rundt 30 %, den totale andel av 10 proteaser rundt 30 %, og andelen av alfa-amylaser rundt 10 %. I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform, og hvis det enzymatiske preparat omfatter to proteaser, kan andelen av lakkase være 30 %, den totale andel av proteaser 30 %, andelen av alfa-amylaser 10 %. For eksempel kan forholdet mellom hver protease ligge mellom 1:2 og 2:1, fortrinnsvis er forholdet mellom hver protease 1:1. 15 Enzymene som er tilstede i det enzymatiske preparat kan ha en ytterligere virkning på biofilmen. For eksempel oppviser lakkasen en høy effektivitet på urenheter som ikke angripes av alfa-amylasen eller proteasene. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kan det enzymatiske 20 preparat være en oppløsning, eller foreligge i fast form. Fortrinnsvis er det enzymatiske preparat en oppløsning der pH-verdien kan ligge mellom 8 og 10. Fortrinnsvis er det enzymatiske preparat en vandig oppløsning, der pH-verdien kan ligge mellom 8,5 og 9,5; mer spesielt kan pH-verdien ligge rundt 9,0. Alternativt kan det enzymatiske preparat foreligge i fast form, som f.eks. et lyofilisat, pulvere, 25 granuler, eller enhver annen form som tillater oppløseliggjøring av preparatet i et oppløsningsmiddel for oppløsning i et slikt. Oppløsningsmidlet kan være vann eller en vandig, sur, basisk, eller nøytral oppløsning. Den vandige oppløsning kan f.eks. inneholde ett eller flere preparater som f.eks. detergenser. 30 Detergenskomponenten omfatter en sekvestrant, en dispersant og et fuktemiddel. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kan detergenskomponenten være en oppløsning, eller foreligge i fast form. Fortrinnsvis er detergenskomponenten en vandig oppløsning, viss pH-verdi ligger mellom 11,0 og 14,0, og mer foretrukket mellom 12,0 og 14,0, helt spesielt mellom 12,8 og 13,8. Fortrinnsvis omfatter 35 detergenskomponenten en andel av sekvestrant, som ligger mellom 1 og 10 %, en andel av dispersant, som ligger mellom 1 og 10 %, og en andel fuktemiddel som ligger mellom 1 og 15 %. Sekvestranten er et kjemisk stoff som har evnen til å danne NO/EP2243821 5 komplekser med mineralioner som de fikserer i en form som forhindrer deres presipitering ved de vanlige reaksjoner. Som eksempel kan sekvestranten være etylendiamintetraeddiksyre, glukondeltalakton, natriumglukonat, kaliumglukonat, kalsiumglukonat, sitronsyre, fosforsyre, vinsyre, natriumacetat, sorbitol, eller en 5 forbindelse som inneholder et fosforatom. Fortrinnsvis kan sekvestranten være et fosforoksid som fosfonat, fosfinat, eller fosfat, eller et salt derav, et amin, eller et aminoksid, som bærer i strukturen minst én funksjonell gruppe som fosfin, fosfinoksid, fosfinitt, fosfonitt, fosfitt, fosfonat, fosfinat, eller fosfat, eller et salt av disse. Mer foretrukket kan sekvestreringsmiddel være et fosfonat eller et salt derav, et amin eller 10 et aminoksid, omfattende minst, i sin struktur, en funksjonell gruppe som fosfin, fosfinoksid, fosfinitt, fosfonitt, fosfitt, fosfonat, fosfinat, eller fosfat, eller et salt derav. Som ikke-begrensende eksempel kan fosfonat av ha den generelle formel R1(R2O)(R3O)P=O der R1, R2 og R3 uavhengig er valgt blant grupper som hydrogen, alkyl, substituert alkyl, eventuelt substituert alkylamin, eventuelt substituert 15 aminoalkyl, aryl eller substituert aryl. Som ikke-begrensende eksempel kan aminet eller aminoksidet omfattende én, to eller tre substituenter med den generelle formel CR4R5W, der R4 og R5 uavhengig er valgt blant gruppene hydrogen, alkyl, substituert alkyl, eventuelt substituert alkylamino, eventuelt substituert aminoalkyl, aryl eller substituert aryl, og W er valgt blant gruppene fosfonat, fosfinat, eller fosfat. 20 Sekvestranten kan foreligge i form av et salt av natrium, kalsium, litium, magnesium eller kalium; fortrinnsvis kan sekvestranten foreligge i form av natrium-, kalsium- eller kaliumsalt. Dispersanten er et kjemisk stoff som har evnen til å forbedre separasjonen av partiklene i en suspensjon for å forhindre agglutinering, aggregering og/eller dekantering. Dispersanten kan være en polymer som er oppløselig eller delvis 25 oppløselig i vann, som f.eks. polyetylenglykol, cellulosederivat, eller en polymer omfattende minst én akrylsyredel eller akrylesterdel. Fortrinnsvis er dispersanten en polymer omfattende minst én akrylsyredel eller akrylesterdel med den generelle formel -(CH2-CH-COOR)-, der R kan være hydrogen, alkyl eller substituert alkyl, aryl eller substituert aryl. Spesielt er dispersanten en polymer med en molekylmasse Mw 30 mellom 500 og 10000. Mer spesielt er dispersanten en homopolymer av akrylsyre. Spesielt kan dispersanten være en homopolymer av akrylsyre med en molekylmasse mellom 2000 og 6000. Fuktemidlet er en kjemisk amfifil substans, eller et preparat omfattende en slik kjemisk amfifil substans, som modifiserer overflatespenningen mellom to overflater. Fuktemidlet har til formål å favorisere utspredningen av en 35 væske på et faststoff. Fuktemidlet kan være anionisk, kationisk, ikke-ionisk eller zwitterionisk. Fortrinnsvis kan fuktemidlet være et anionisk eller ikke-ionisk fuktemiddel, dvs. at den hydrofile del er negativt ladet, eller omfatter ingen NO/EP2243821 6 nettoladning, eller kan være et preparat omfattende et anionisk fuktemiddel. Mer spesielt kan fuktemidlet være Tween, en ester av sakkarose, eller et fuktemiddel omfattende et natriumalkylsulfat og en alkohol. 5 Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å fjerne biofilmer som er tilstede på et substrat, og som karakteriseres ved at den omfatter de følgende trinn: a) å tilveiebringe et detergenspreparat inneholdende en sekvestrant, en dispersant, og et fuktemiddel; og enzymatisk preparat inneholdende minst én protease, minst én lakkase, og minst én polysakkaridase, b) å oppløse eller fortynne detergenspreparatet i vann, 10 c) å oppløse det enzymatiske preparat i oppløsningen dannet i trinn b), for å gi en oppløsning av nevnte preparat ifølge oppfinnelsen, b’) å oppløse eller fortynne det enzymatiske preparat i vann, c’) oppløse detergenspreparatet i oppløsningen som er dannet i trinn b’) for å gi 15 oppløsningen ifølge oppfinnelsen, d) anvendelse av oppløsningen av preparatet som er dannet i trinn c) eller c’) på substrat i et tidsrom på 15 minutter til 4 timer. Alternativt kan trinnene b) og c), eller b’) og c’) gjennomføres samtidig, for å gi en 20 oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis omfatter fremgangsmåten de følgende trinn: a) å tilveiebringe en detergenskomponent inneholdende en sekvestrant, en dispergant, og et fuktemiddel; og et enzymatisk preparat inneholdende minst en 25 protease, minst en lakkase, og minst en polysakkaridase, b) å oppløse eller fortynne detergenskomponenten i vann, c) oppløse den enzymatiske komponent i oppløsningen som dannes i trinn b) for å gi oppløsningen av nevnte preparat ifølge oppfinnelsen, og d) anvendelse av oppløsningen av preparatet som er dannet under trinn c) på 30 substratet i et tidsrom på 15 minutter til 4 timer. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen ligger pH-verdien for oppløsningen som dannes i trinn a) mellom rundt 11,0 og 14,0, fortrinnsvis mellom rundt 12,0 og 14,0, og spesielt mellom 12,8 og 13,8. Fortrinnsvis er temperaturen for 35 oppløsningen av detergenspreparatet som dannes under trinn a) mellom 35oC og 50oC. NO/EP2243821 7 I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen har oppløsningen av preparatet som dannes i trinn c) en pH-verdi som ligger mellom rundt 8 og 11, fortrinnsvis mellom 9,5 og 10,5, og spesielt mellom 9,5 og 10. 5 I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen anvendes preparatet ifølge oppfinnelsen på et substrat som er dekket av en biofilm i rundt 30 til 50 minutter. Fortrinnsvis omfatter detergenskomponenten en andel av sekvestrant som ligger mellom 1 og 10 %, en andel av dispersant som ligger mellom 1 og 10 %, og en andel 10 av fuktemiddel som ligger mellom 1 og 15 %. Fortrinnsvis omfatter den enzymatiske komponent en andel av protease som ligger mellom 10 og 50 %, en andel av lakkase som ligger mellom 5 og 35 %, og en andel av polysakkaridase som ligger mellom 5 og 20 %. Mer spesielt kan minst én polysakkaridase være en alfa-amylase. 15 Foreliggende fremgangsmåte tillater effektivt å fjerne eller hele eller så å si hele biofilmen, hvorved det kun på substratet etterlates isolerte celler uten beskyttelse av matriksen. En etterfølgende virkning av biocidet tillater å destruere mikrobestammen. En siste desinfiseringsfase er således mer effektiv etter anvendelse av en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen enn etter anvendelse av en vaskefase som ikke 20 tillater fullstendig fjerning av matriksen. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, omfatter fremgangsmåten således et siste trinn med anvendelse av et biocid. For eksempel kan biocidet, på ikke-begrensende måte, være av oksiderende type som paraeddiksyre, med hydrogenperoksid, kaliummonopersulfat, natriumhypokloritt. Ifølge oppfinnelsen vil anvendelse av et biocid skje etter 25 anvendelse av preparatet ifølge oppfinnelsen, for å unngå deaktivering av enzymene som er tilstede i preparatet, på grunn av biocidene. Oppfinnelsen omfatter likeledes anvendelse av preparatet ifølge oppfinnelsen for å fjerne biofilmer på et substrat. Preparatet kan benyttes i lukkede installasjoner, eller 30 ved nedsenking. Mer spesielt angår oppfinnelsen anvendelsen av det nevnte preparat for vasking av underlag og overflater, for vasking på stedet, eller ved nedsenking. Vasking ved nedsenking er spesielt benyttet for å vaske kirurgisk materiell eller kontaktlinser. Preparatet ifølge oppfinnelsen kan benyttes for vasking av tekniske og prosessvannkretser, vekslere for luftkondisjonering, eller i næringsmiddelindustrien. 35 I henhold til ett aspekt angår oppfinnelsen en innretning for fjerning av en biofilm på et substrat, og som karakteriseres ved at den omfatter minst én prøve av en NO/EP2243821 8 detergenskomponent i oppløsning eller i fast form, inneholdende en sekvestrant, en dispersant og et fuktemiddel, og minst én prøve av en enzymatisk komponent i oppløsning eller i fast form, inneholdende minst én protease, minst én lakkase, og minst én polysakkaridase. Fortrinnsvis kan prøven av enzymatisk komponent omfatte 5 en proteaseandel mellom 10 og 50 %, en lakkaseandel mellom 5 og 35 %, og en polysakkaridaseandel mellom 5 og 20 %. Fortrinnsvis kan nevnte minst ene polysakkaridase være en alfa-amylase. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kan den enzymatiske komponentdel inneholdende mellom 1 og 10 proteaser, fortrinnsvis mellom 1 og 5 proteaser, og helt spesielt kan den inneholde 1, 10 2, 3, 4 eller 5 proteaser. I henhold til en annen foretrukket utførelsesform kan den enzymatiske komponentdel som finnes i innretningen omfatte to proteaser. Hvis delen av enzymatisk komponent omfatter to proteaser, kan andelen av lakkase fortrinnsvis være 30 %, den totale andel proteaser kan være rundt 30 %, andelen alfa-amylase kan være rundt 10 %. Hvis fortrinnsvis prøven av enzymatisk komponent omfatter to 15 proteaser, kan lakkaseandelen være 30 %, den totale andel av proteaser være 30 %, andelen av alfa-amylase være 10 %. For eksempel kan forholdet mellom hver protease ligge mellom 1:2 og 2:1, fortrinnsvis er forholdet mellom hver protease 1:1. Hvis andelen av enzymatisk komponent som inneholdes i innretningen er en oppløsning, kan pH-verdien for denne ligge mellom 8 og 10, fortrinnsvis kan pH- 20 verdien ligge mellom 8,5 og 9,5, og helt spesielt kan pH-verdien være rundt 9,0. Fortrinnsvis omfatter andelen av detergenskomponent en andel av sekvestrant som ligger rundt 1 til 10 %, en andel av dispersant som ligger mellom rundt 1 og 10 %, og en andel fuktemiddel som ligger mellom rundt 1 og 15 %. Som eksempel kan sekvestranten være etylendiamintetraeddiksyre, glukonodeltalakton, natriumglukonat, 25 kaliumglukonat, kalsiumglukonat, sitronsyre, fosforsyre, vinsyre, natriumacetat, sorbitol, en forbindelse omfattende et fosforatom. Fortrinnsvis kan sekvestranten være et oksid av fosfor som fosfonat, fosfinat eller fosfat, eller et salt derav, et amin eller et aminoksid, eller et salt derav, inneholdende minst, i strukturen, en funksjonell gruppe som fosfin, fosfinoksid, fosfid, fosfonitt, fosfitt, fosfonat, fosfinat eller fosfat. Mer 30 spesielt kan sekvestranten være et fosfonat eller et salt derav, et amin eller et aminoksid, eller et salt derav, omfattende, i sin struktur, minst en funksjonell gruppe som fosfin, fosfinoksid, fosfinitt, fosfonitt, fosfitt, fosfonat, fosfinat eller fosfat. Som ikke-begrensende eksempel kan fosfonatet ha den generelle formel R1(R2O)(R3O)P=O der R1, R2 og R3 uavhengig er valgt blant gruppene hydrogen, alkyl, substituert alkyl, 35 eventuelt substituert alkylamino, eventuelt substituert aminoalkyl, aryl eller substituert aryl. Som ikke-begrensende eksempler kan aminer eller aminoksid omfatte én, to eller tre substituenter med den generelle formel CR4R5W der R4 og R5 uavhengig NO/EP2243821 9 er valgt blant gruppene hydrogen, alkyl, substituert alkyl, eventuelt substituert alkylamino, eventuelt substituert aminoalkyl, aryl eller substituert aryl, og W er valgt fra gruppen fosfonat, fosfinat eller fosfat. Sekvestranten kan foreligge i form av et salt av natrium, kalsium, litium, magnesium eller kalium; fortrinnsvis kan sekvestranten 5 foreligge i form av et salt av natrium, kalsium eller kalium. Dispersanten kan være en polymer som er oppløselig eller delvis oppløselig i vann, som f.eks. polyetylenglykol, derivater av cellulose, eller en polymer omfattende minst én akrylsyre- eller akrylesterdel. Fortrinnsvis er dispersanten en polymer omfattende minst én akrylsyreeller akrylesterdel med den generelle formel -(CH2-CH-COOR)-, der R kan være 10 hydrogen, et alkyl eller et substituert alkyl, et aryl eller et substituert aryl. Spesielt er dispersanten en polymer med en molekylmasse Mw som ligger mellom rundt 500 og 10000. Mer spesielt er dispersanten en homopolymer av akrylsyre. Spesielt kan dispersanten være en homopolymer av akrylsyre med en molmasse mellom 2000 og 6000. Fuktemidlet kan være anionisk, kationisk, ikke-ionisk, eller zwitterionisk. 15 Fortrinnsvis kan fuktemidlet være anionisk eller ikke-ionisk, det vil si at den hydrofile del er negativt ladet, eller ikke har noen nettoladning, eller kan være et preparat omfattende et anionisk fuktemiddel. Mer spesielt kan fuktemidlet være et preparat omfattende et natriumalkylsulfat og en alkohol. Hvis delen av detergenskomponenten er en oppløsning, er pH-verdien for denne mellom 11,0 og 14,0, og mer spesielt 20 mellom 12,0 og 14,0, helt spesielt mellom 12,8 og 13,8. Kort beskrivelse av figurene Figur 1 viser en graf som viser mengden av celler av en stamme av pseudomonas fluorescens som er tilstede på et substrat etter påføring av forskjellige 25 behandlingsoppløsninger. Figur 2 er en graf som viser mengden av celler av en stamme av Bacillus mycoides som er tilstede på et substrat etter påføring av forskjellige behandlingsoppløsninger. 30 Figur 3 viser en graf som viser mengden av celler av en stamme Bacillus cereus som er tilstede på et substrat etter påføring av forskjellige behandlingsoppløsninger. Figur 4 viser bilder av overflaten av et substrat, opptatt med et epifluorescensmikroskop, etter påføring av forskjellige oppløsninger for behandling på 35 substratet, dekket med en biofilm av stammen Pseudomonas fluorescens. NO/EP2243821 10 Figur 5 viser bilder av overflaten av et substrat, opptatt med et epifluorescensmikroskop, etter påføring av forskjellige oppløsninger for behandling på substratet, dekket med en biofilm av stammen av Bacillus mycoides. 5 Figur 6 viser bilder av overflaten av et substrat, opptatt med et epifluorescensmikroskop, etter påføring av forskjellige oppløsninger for behandling på substratet dekket med en biofilm av stammen Bacillus cereus. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen 10 Eksempel 1 Beskrivelse av valget av betingelser for testen: testene gjennomføres innenfor rammen av en vaskeprosedyre på stedet (NEP) på et industrielt pilotanlegg. Biofilmene er utviklet på en plan flate av en inokssylinder, perforert i sitt sentrum. Denne sylinder fremtvinger når den er innført i kanalanlegg med en indre diameter lik 15 sylinderens ytre diameter, fremtvinger en brå reduksjon av diameteren av denne, og tvinger væsken til å passere via perforeringen i sentrum. Denne innsnevring medfører strømningsforstyrrelser, og skaper også dødsoner på overflaten av sylinderen. Disse dødsoner er gunstige for dannelse av en biofilm, og i tillegg ugunstige for dennes mekaniske løsrivning på grunn av strømningen. Dette representerer således typisk 20 soner som er vanskelige for fjerning av en biofilm. Det benyttes tre distinkte stammer_ Pseudomonas fluorescens (levert av University of Cornell, Department of Food Sciences, Ithaca, New York, 14853, USA (Kathryn J. Boor, [email protected])), Bacillus mycoides (levert av laboratorie AFSSA i Malson-Alfort, Frankrike (Brigitte Carpentier, [email protected])), Bacillus cereus (levert av INRA-UR638, 25 Laboratoire de Génie des Procédés et Technologies Allmentaires, Villeneuve d’Ascq, Frankrike (Christine Faille, [email protected])). Et vekstmedium fremstilles som følger: ekstrakter av pulverkjøtt (Biokar) oppløses i destillert vann til 0,1 % og steriliseres. 20 ml inokulum med 5 x 107 CFU/ml i en 30 oppløsning av tryptikase soyabuljong (TSB, Biokar) anbringes på overflaten av sylindrene. Sylindrene inkuberes i et fuktig kammer ved 30oC i 2 timer for å tillate adhesjon av cellene. Deretter blir TSB-oppløsningen trukket fra, og erstattet med 20 ml kjøttvekstmedium, og sylindrene inkuberes i 24 timer ved 30oC. Vekstmediet blir så erstattet med friskt medium på basis av kjøtt, og sylindrene blir på ny inkubert i 24 35 timer. Vaskeprosedyren består i å innføre sylindrene som er kontaminert med biofilm i snevre kanalveier i et industrielt pilotanlegg vasket ved sirkulasjon (kalt prosedyre for vasking på stedet – NEP). Behandlingsoppløsningene sirkuleres i 30 minutter ved 45oC NO/EP2243821 11 i en mengde på 300 l/t. For to av stammene blir prøvene også gjennomført med en mengde på 600 l/t. Hver prøve repeteres tre ganger, og det etableres et middel. Utviklingen og elimineringen av biofilmene følges ved mikroskopisk observasjon, og ved kvantitering av levedyktige celler som er tilstede på sylindrene ved telling på et 5 tryptikase soyaagarmedium etter løsrivning av cellene. Beskrivelse av protokollen for fremstilling av preparatet Detergenspreparatet fremstilles ved i et på forhånd bestemt vannvolum å blande et fosfonat, et polyakrylat, og et anionisk fuktemiddel. De respektive andeler i 10 detergenskomponenten er 3 %, 4 % og 3 %. pH-verdien for oppløsningen bringes til 13,3 ved fortynning. En oppløsning av den enzymatiske komponent fremstilles. Denne omfatter en andel på 30 % proteaser (EC 3.4.21), 30 % lakkase (EC 1.10.3.2) og 10 % alfa-amylase (EC 3.2.1.1). pH-verdien for oppløsningen av den enzymatiske komponent bringes til 9 ved progressiv tilsetning av en kaliumhydroksidoppløsning. 15 Oppløsningen av preparatet ifølge oppfinnelsen fremstilles ved til vann å sette detergenskomponenten og den enzymatiske komponent. Oppløsningen av nevnte preparat ifølge oppfinnelsen omfatter 1 % av detergenskomponenten, og 0,05 % av den enzymatiske komponent. pH-verdien for oppløsningen for dette preparat ifølge oppfinnelsen er rundt 10. 20 Beskrivelse av testene og deres resultater Test med stammen av Pseudomonas fluorescens Grafen som er vist i figur 1 viser mengden biofilm som er tilstede på veggen av sylinderen etter påføring av behandlingsoppløsninger ifølge de betingelser som er 25 angitt ovenfor. Substratoverflatene er dekket med en biofilm dannet av stammen Pseudomonas fluorescens. Initialmengden for biofilmen som er tilstede før behandling, er angitt som A1 i figur 1. Tre oppløsninger blir så sammenliknet: en oppløsning kun omfattende vann (B1), en oppløsning av 0,5 % natriumhydroksid (C1) og en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen (D1). Oppløsningene påføres i en mengde 30 av 300 l/t, og ved en temperatur på 45oC. Oppløsning (B1) omfattende vann tillater å evaluere den mekaniske løsrivning av biofilmene på grunn av strømningen. Man observerer her at biofilmen er resistent mot mekanisk løsrivning, fordi mengdene av biofilm er identiske (kurvene A1 og B1). Anvendelsen av en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen tillater en betydelig reduksjon av biofilm (kurve D1, 103 CFU) i 35 forhold til en oppløsning av natriumhydroksid (kurve C1, 105 CFU). Preparatet ifølge oppfinnelsen er således mer effektivt enn en referansebehandling (natriumhydroksidoppløsning) på en biofilm som er resistent mot mekanisk løsrivning. NO/EP2243821 12 Figur 4 viser flere bilder av overflaten av et substrat, tatt ved hjelp av et epifluorescensmikroskop etter påføring av forskjellige oppløsninger for behandling i en mengde av 300 l/t. Bilde (A4) viser overflaten av substratet behandlet med en vannoppløsning, bilde (B4) viser overflaten av substratet underkastet behandling med 5 en 0,5 % natriumhydroksidoppløsning, og bilde (C4) viser overflaten av substratet, og underkastet en behandling med preparatet ifølge oppfinnelsen. Disse verdier viser klart at preparatet ifølge oppfinnelsen har fjernet hele matriksen av biofilmene (diffus farging) og har ikke etterlatt, på overflaten, noen isolerte celler eller små grupper av celler fordelt i et enkelt sjikt, eller beskyttet av en matriks. 10 Natriumhydroksidoppløsningen har hva den angår ikke kunnet tillate fullstendig fjerning av matriksen (diffus farging), noe som hele tiden delvis beskytter restceller. En etterfølgende desinfiseringsfase er således meget mer effektiv etter anvendelsen av en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen. 15 Test med stammen Bacillus mycoides Grafen som er vist i figur 2 viser mengden av biofilm som er tilstede på sylinderveggen etter påføring av behandlingsoppløsninger ifølge de betingelser som er angitt ovenfor. Substratoverflatene er dekket av en biofilm dannet av stammen Bacillus mycoides. Mengden biofilm som er tilstede før behandlingen er vist i kurven 20 (A2). Fem oppløsninger blir deretter sammenliknet: en oppløsning kun omfattende vann (B2), en oppløsning av 0,5 % natriumhydroksid (C2), en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen (D2 og F2), og en 2 % natriumhydroksyloppløsning (E2). Oppløsningene (A2) og (D2) påføres i en mengde på 300 l/t, mens oppløsningene (E2-F2) påføres i en mengde på 600 l/t. Biofilmen av Bacillus mycoides 25 er relativt sensibel mot mekanisk avrivning, og mengden reduseres med 90 % ved påføring av oppløsning (B2). Anvendelsen av oppløsningen av preparatet ifølge oppfinnelsen (D2 og F2) vises ved ekvivalente ytelser for natriumhydroksid (C2 og E2) uansett mengde 300 l/t eller 600 l/t. Figur 5 viser flere bilder av overflaten av substratet tatt opp med et epifluorescensmikroskop etter påføring av forskjellige 30 oppløsninger for behandling i en mengde av 300 l/t. Bilde (A5) viser overflaten av substratet etter behandling med en vannoppløsning, bilde (B5) viser overflaten av substratet etter en behandling med en oppløsning på 0,5 % natriumhydroksid, og bilde (C5) viser overflaten av substratet etter behandling med et preparat ifølge oppfinnelsen. Disse verdier viser klart at preparatet ifølge oppfinnelsen så å si 35 fullstendig har fjernet biofilmmatriksen, og ikke etterlatt annet enn isolerte celler eller små grupper av celler fordelt i et enkelt sjikt, men ikke beskyttet av noen matriks. Natriumhydroksidoppløsningen har ikke tillatt en mer effektiv fjerning av biofilmen. NO/EP2243821 13 Den etterfølgende behandling med en desinfiserende oppløsning er således mer effektiv hvis en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen benyttes på forhånd. Test med stammen Bacillus cereus 5 Grafen som er vist i figur 3 viser mengden av biofilm som er tilstede på sylinderveggen etter påføring av behandlingsoppløsninger under de betingelser som er angitt ovenfor. Overflatene av substratet er dekket av en biofilm dannet av stammen Bacillus cereus. Mengden biofilm som er tilstede før behandlingen er vist i kurve A3. Fem oppløsninger sammenliknes: en oppløsning omfattende vann (B3), en 0,5 % 10 natriumhydroksidoppløsning (C3), en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen (D3 og F3), og en oppløsning av en 2 % natriumhydroksid (E3). Oppløsningene B3, C3, D3 påføres i en mengde på 300 l/t, mens oppløsningene E3 og F3 påføres i en høyere mengde (600 l/t). En høyere mengde påvirker den mekaniske løsrivning. Biofilmen Bacillus cereus motstår totalt en mekanisk avrivning (kurve A3 og B3). Preparatet 15 ifølge oppfinnelsen viser en meget høyere effektivitet i en mengde på 300 l/t, i forhold til en 0,5 % natriumhydroksidoppløsning (kurve C3), og dette selv ved en mengde på 600 l/t, i forhold til en mer konsentrert natriumhydroksidoppløsning (kurve E3). Figur 6 viser flere bilder av overflaten av et substrat, tatt med et epifluorescensmikroskop etter påføring av forskjellige behandlingsoppløsninger. Bilde (A6) viser overflaten av 20 substratet underkastet en vannoppløsning, bilde (B6) viser overflaten av substratet underkastet en 0,5 % natriumhydroksidoppløsning, og bilde (C6) viser overflaten av substratet underkastet en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen. Disse bilder viser på ny at preparatet ifølge oppfinnelsen så å si helt fjerner biofilmmatriksen, og kun lar tilbake isolerte celler eller små grupper av celler for del i et enkeltsjikt, ikke 25 beskyttet av noen matriks. Natriumhydroksidoppløsningen tillater ikke noen effektiv fjerning av biofilmen. Desinfiseringsfasen av substratet etter fjerningsfasen for biofilmen er således meget mer effektiv etter påføring av en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen, under denne fjerningsfase. 30 De forskjellige tester som er gjennomført i dette eksemplet viser effektiviteten for preparatet ifølge oppfinnelsen, for å fjerne en biofilm fra et substrat. Preparatet ifølge oppfinnelsen viser seg mer effektivt enn en oppløsning av natriumhydroksid, som i dag benyttes i den kjente teknikk. Preparatet ifølge oppfinnelsen viser seg likeledes mer effektivt for flere typer biofilm, som stammer fra forskjellige bakterier. Preparatet 35 ifølge oppfinnelsen medfører således en effektiv løsning på de problemer som er nevnt i den kjente teknikk, slik fagmannen vet. NO/EP2243821 14 Eksempel 2 Prøver ble likeledes gjennomført på to industriproduksjonslinjer (industri for fremstilling av smør og margarin). Plater av rustfritt stål (8*1 cm) ble anbrakt i 15 dager i produksjonskretser som sporadisk oppviste kontaminering. Disse plater blir så 5 underkastet fremstillingssykler og standard vasking for disse installasjoner. Nærværet av biofilm i installeringen bestemmes ved utviklingen av en biofilm på platene. En spesifikk vaskeprosedyre på stedet, og med bruk av preparatet ifølge oppfinnelsen, gjennomføres på installasjonen, i nærvær av de forurensede plater, og der effektiviteten vises ved fjerning av biofilmene som dannes på platene. Nærværet og 10 betydningen av biofilmene på platene bestemmes i et laboratorium ved farging av platene, og en sammenlikning av den oppnådde farge med en visuell skala (metoden HYDROBIO, BKG), samt ved optisk mikroskopi (40x og 100x). To vaskeprotokoller testes: den første protokoll har tjent som referanse, og tilsvarer 15 en anvendelse av oppløsninger som er kjent i teknikken, den andre protokoll tilsvarer og føyer til en anvendelse av en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen. Særlig omfatter protokoll I de følgende trinn: vasking med vann, vasking med alkali, skylling, sanitering (eller desinfisering), og sluttskylling. Protokoll I anvendes hver 32. 20 time i løpet av en uke. Vaskingen med vann gjennomføres i løpet av 15 minutter ved en temperatur mellom 60 og 65oC. Alkalivaskingen tillater å rengjøre kanaliseringene for organisk materiale som er tilstede på grunn av en fremstillingssyklus. Dette trinn gjennomføres med en 3,5 % natriumhydroksidoppløsning, som påføres i løpet av 2 timer og 15 minutter, ved en temperatur mellom 70 og 75oC. Saniteringstrinnet 25 tillater å fjerne germer som eventuelt fremdeles er tilstede, men ikke beskyttet av biofilmmatriksen. Dette trinn omfatter en oppløsning av Deptil OX med konsentrasjon 1,5 % (HYPRED) i løpet av 2 timer og 15 minutter ved en temperatur mellom 20 og 25oC. Oppløsningen av Deptil OX inneholder en blanding av pereddiksyre og hydrogenperoksid. Skylletrinnene gjennomføres i løpet av 15 minutter ved en 30 temperatur mellom 20 og 25oC. Protokoll II skiller seg fra protokoll I, idet den omfatter et spesifikt vasketrinn før saniteringstrinnet (eller desinfiseringen). Videre blir protokoll II ikke påført mer enn én gang. Det spesifikke vasketrinn består i en anvendelse av en oppløsning av preparatet 35 ifølge oppfinnelsen. Denne blanding påføres i 30 minutter ved en temperatur mellom 40 og 45oC. De oppnådde resultater er oppført i tabell 1. NO/EP2243821 15 Tabell 1 Mengde biofilm ifølge Mengde biofilm ifølge protokoll I (g/m2) protokoll II (g/m2) Produksjonslinje 1 25 <5 Produksjonslinje 2 25 til 35 <5 Protokoll I tillater ikke å begrense og forhindre veksten av biofilm uansett saniterings 5 (desinfiserings) trinn. Biofilmen som dannes på de rustfrie plater av stål i løpet av installeringen, er således meget resistente. Anvendelsen av protokoll II inkluderer et spesifikt vasketrinn med en oppløsning av preparatet ifølge oppfinnelsen, og har tillatt en eliminering som er mer effektiv for denne biofilm (under detekteringsgrensen). De er således påvist en overlegen effektivitet for den spesifikke vasking som synes å løse 10 problemene fra den kjente teknikk. NO/EP2243821 16 PATENTKRAV 1. Preparat for fjerning av biofilmer som er tilstede på et substrat, der preparatet omfatter en detergenskomponent inneholdende en sekvestrant, og en enzymatisk 5 komponent inneholdende minst én protease og minst én lakkase, karakterisert ved at detergenspreparatet i tillegg inneholder et fuktemiddel og en dispersant, og at den enzymatiske komponent omfatter i tillegg minst én polysakkaridase. 10 2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at preparatet er en oppløsning med en pH-verdi som ligger mellom rundt 8 og 11. 3. 15 Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den enzymatiske komponent omfatter en proteaseandel som ligger mellom 10 og 50 %, en lakkaseandel mellom 5 og 35 %, og en polysakkaridaseandel mellom 5 og 20 %. 4. 20 Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert 5. ved at minst én polysakkaridase er en alfa-amylase. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at detergenskomponenten omfatter en sekvestrantandel på mellom 1 og 10 %, en dispergantandel på mellom 1 og 10 %, og en 25 fuktemiddelandel mellom 1 og 15 %. 6. Fremgangsmåte for fjerning av biofilmer på et substrat, karakterisert ved at den omfatter de følgende trinn: a) å tilveiebringe et detergenspreparat omfattende en sekvestrant, en 30 dispersant og et fuktemiddel; og en enzymatisk komponent inneholdende minst en protease, minst en lakkase, og minst en polysakkaridase, b) å bringe detergenskomponenten i oppløsning i vann, c) å bringe den enzymatiske komponentoppløsning fra trinn b) for å gi en oppløsning av preparatet i henhold til kravene 1til 5, eller 35 b’) å bringe i oppløsning eller fortynning av den enzymatiske komponent i vann, NO/EP2243821 17 c’) bringe i oppløsning detergenskomponenten i oppløsningen dannet i trinn b’) for å gi en oppløsning av preparatet i henhold til kravene 1 til 5, d) påføring av oppløsningen av preparatet dannet i trinnene c) eller c’) på substratet i en periode på 15 minutter til 4 timer. 5 7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den videre omfatter et trinn etter påføring av et biocid på substratet. 10 8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at pH-verdien for nevnte preparat ligger mellom 8 og 11. 9. 15 Anvendelse av et preparat ifølge kravene 1 til 5, for fjerning av biofilmer tilstede på et substrat. 10. Anvendelse ifølge krav 9, av et preparat ifølge kravene 1 til 5 for vasking av preparater og overflater, for vasking på stedet, eller neddypping. 20 11. Anvendelse ifølge krav 10, der vaskingen ved neddypping benyttes for å vaske kirurgisk materiell. 12, Innretning for fjerning av biofilmer på et substrat, karakterisert 25 ved at den omfatter minst én innretning med en detergenskomponent i oppløsning eller i fast form, inneholdende en sekvestrant, en dispersant og et fuktemiddel, og minst ett element av en enzymatisk komponent i oppløsning eller i fast form, inneholdende minst en protease, minst en laktase, og minst en polysakkaridase. 30 13. Innretning ifølge krav 12, karakterisert ved at den enzymatiske komponentandel er en vandig oppløsning viss pH-verdi ligger mellom 8 og 10. 14. 35 Innretning ifølge krav 12 eller 13, karakterisert ved at prøven av detergentkomponenten er en vandig oppløsning viss pH ligger mellom 12,8 og 13,8. NO/EP2243821 18 1/3 NO/EP2243821 19 2/3 NO/EP2243821 20 3/3
© Copyright 2024