הגורמת לנשירת , לימוד בקרת תהליך יצירת רקמת ניתוק במנגו . חנטים מוקדמת S
דו"ח לתוכנית מחקר מספר 203070908 לימוד בקרת תהלי יצירת רקמת ניתוק במנגו ,הגורמת לנשירת חנטי מוקדמת. Study of abscission zone formation and fruitlet abscission in mango מוגש לקר המדע הראשי במשרד החקלאות ולהנהלת מועצת הצמחי – ענ פירות ע"י ורד יריחימובי :המחלקה למטעי מינהל המחקר החקלאי בית דג Vered Irihimovitch. : Horticulture Department. The Institute of Plant Sciences – ARO Bet Dagan 50250 E-mail: [email protected] סיוו תשס"ט מאי 2010 הממצאי בדו"ח זה הינ תוצאות ניסויי. הניסויי מהווי המלצות לחקלאי כ!/לא חתימת החוקר : 1 תקציר: במנגו ,כמו בגידולי סובטרופי נוספי )כגו אבוקדו( נשירת חנטי המתרחשת בשלבי מוקדמי לאחר ההפריה ,הינה אחד הגורמי המשפיעי על הקטנת כמות היבול .במהל& תהלי& זה נוצרת בי העוק לחנט רקמת ניתוק )ר"נ( ,בה עולה פעילות אנזימי מפרקי דופ .תהלי& הניתוק מבוקר ע"י הורמוני שוני ,ידוע כי בעוד אתיל משרה את תהלי& ההתנתקות ,אוקסי מעכב תהלי& זה .בעבודות שנערכו במנגו נמצא קשר ישיר בי עלייה בסינטזת אתיל ,בפרי המתפתח ,ובי נשירת חנטי .במקביל נמצא כי נשירת חנטי ,קשורה לירידה בריכוזי אוקסי בפירות המתפתחי .מספר ניסיונות רב נער& במטרה לצמצ את תופעת הנשירה אול עד כה לא פותח פרוטוקול יעיל במידה מספקת .מחקר זה הציע ללמוד את השינויי המולקולרי המתרחשי במהל& היווצרות ר"נ בעת נשירת חנטי במנגו .בשנת המחקר החולפת התמקדנו ב א שיבוט של גני המעורבי במסלול החישה ויצירת אתיל במנגו ולימוד דג ביטויי במהל& התפתחות ר"נ .ב אפיו השפעת אוקסי על בקרת גני אלו. המחקר בוצע במערכת אקספלנטי מנותקי )ענפוני נושאי חנטי( והשריית תהליכי ניתוק בוצעה ה ע"י טיפולי באתרל וה ע"י טיפול בגז אתיל .במסגרת העבודה בשנה החולפת שיבטנו באופ מלא ג ממנגו המקודד לקולט לאתיל מסוג .ERS1הג מקודד לחלבו בעל 629חומצות אמיניות )ח"א( וחולק הומולוגיה של 69-79% ברמת החלבו ע חלבוני ERS1ממיני צמחי שוני .בהתא כונה ג זה על ידינו .MERS1בדיקות לבחינת דג ביטוי הג ה במהל& יצירת ר"נ וה במהל& הבשלת פרי מעידות כי ג זה עשוי לשחק תפקיד מרכזי בעיקר במהל& יצירת ר"נ ,ולאו דווקא במהל& הבשלת פרי ,אול עדי יש צור& בביסוס התוצאות הנ"ל. לצור& בחינת השפעת אוקסי על מהל& יצירת ר"נ ערכנו ניסיונות בה בוצע טיפול מקדי בטריפטופא ,שהינו פרקורסור של אוקסי ,לפני השריית תהליכי ניתוק .תוצאותינו הראו כי טיפול זה מנע במידה מסויימת נשירת חנטי אשר הושרתה ע"י אתרל ה במנגו וה באבוקדו .ההחלטה לעבוד בנושא זה במקביל ג במנגו וג באבוקדו מנומקת בהמש&. 2 .1מבוא ותאור הבעייה. בגידולי סובטרופיי רבי ,נשירת פרי הינה אחד הגורמי המשפיעי על כמות היבול .במנגו ,נשירת חנטי מסיבית בשלבי מוקדמי של התפתחות הפרי ,הינה אחד הגורמי המרכזיי המשפיעי על הקטנת כמות היבול. אומדני במנגו מורי כי 90%מכלל הפירות החונטי נושרי ,לכ ,צמצו נשירת חנטי באחוזי בודדי בלבד, עשוי להשפיע באופ משמעותי על כמות היבול .הסיבות לנשירת חנטי הינ רבות ותלויות בגורמי רבי כגו אי התא עצמי ,הפלת עובר ,תחרות בי פירות מתפתחי ועוד .במהל& תהלי& נשירת חנטי במנגו נוצרת בי העוק לחנט רקמת ניתוק )ר"נ( .ברקמה זו ,עולה פעילות אנזימי פירוק דופ התא ,הגורמי לריכו& למלת הביניי, להפרדת תאי ולהתנתקות החנט .תהלי& הניתוק מבוקר ע"י הורמוני שוני ,הפועלי לעיתי באופ אנטגונסטי. לדוגמה ,ידוע כי בעוד אתיל משרה את תהלי& ההתנתקות ,אוקסי מעכב תהלי& זה .בהתא לכ& נית לבקר את תהליכי הנשירה על ידי יישו טכנולוגיות אגרוטכניות הכוללות שימוש בהורמוני צמחיי ו/או חומרי המזרזי או מעכבי ביוסינטזה של הורמוני שוני .בשני האחרונות נערכו מספר ניסיונות במטרה לצמצ את תופעת נשירת החנטי במנגו על ידי ריסוס באוקסיני ,במעכבי אתיל שוני ובפוליאמיני ,אול למיטב ידיעתנו עדי לא נמצא פתרו יעיל במידה מספקת לבעיה חקלאית זו .מאיד& ,הידע הקיי במנגו לגבי התהליכי המולקולרי המתרחשי במהל& הנשירה בר"נ ובחנט ,אשר עשוי לתרו להבנת הבעיה ,מצומצ ביותר .זאת ,לעומת מידע רב הקיי לגבי התהליכי הללו בעצי פרי אחרי כגו :הדרי ,תפוח ואפרסק .הבנה עמוקה יותר ברמה המולקולרית של אופ יצירת רקמת ניתוק בעת נשירת חנטי בכלל ,ובמנגו בפרט ,עשויה לתרו בעתיד למציאת פתרונות יעילי יותר לבעיה זו .סקירת ידע כללית ,רלוונטית לחלקה של העבודה שנערכה במעבדתינו במסגרת תוכנית זו ,מוצגת להל: שינויי ביוכימי ,ומולקולרי הקשורי ביצירת רקמת ניתוק. התנתקות הינה חלק מתהלי& התפתחותי המתרחש בשלבי שוני בחיי הצמח ובו איברי כגו :עלי ,פרחי, חנטי ופירות ניתקי מצמח הא .תהלי& זה חל באזור מוגדר בו נוצרת רקמת ניתוק )ר"נ().(Abscission zone תאי רקמת הניתוק נבדלי מורפולוגית מתאי אחרי ,הבדלי אלו ניתני לזיהוי לפני תחילת תהלי& ההתנתקות ) .(1-3תהלי& ההתנתקות מלווה בשינוי במער& הפעילות של חלבוני שוני ,השינוי הבולט ביותר בא לידי ביטוי בעלייה חדה ברמת הפעילות של צלולואזות (EGs) ,β 1-4 endogluconasesופקטינאזות polygalacturonases ) (PGsהפעילות בפירוק דופ התא ) .(4-6כמו כ בתהלי& ההתנתקות פועלי אנזימי רבי נוספי ,כ& לדוגמה הוצע כי חלבוני אקספנסי ,הידועי בפעילות במהל& התפתחות פרי ומהל& הבשלתו ,פעילי ג כ בר"נ ותורמי לריכו& דפנות התאי בתהלי& הניתוק ) .(7-8כמו כ ,דווח על עלייה בביטוי חלבוני )PR Pathogenesis-Related (Proteinsוחלבוני (methallothionines) MT-like proteinsבר"נ ) ,(9-11חלבוני אלו מתפקדי ככל הנראה כחלבוני הגנה ברקמת צמח הא הקרובה לאזור הניתוק במש& תהלי& הניתוק ולאחריו. תפקיד אתיל! בתהלי הניתוק :אינטראקציות אתיל+אוקסי משחקות תפקיד מרכזי בבקרת תהליכי התנתקות. ידוע כי להורמוני אלו אפקטי אנטגוניסטי ,בעוד אוקסי מונע יצירת ר"נ ,אתיל משרה תהלי& זה .מקובל לחשוב כי כל עוד נמש& טרנספורט תקי של אוקסי מרקמות כגו עלי צעירי או זרעי פירות ,אל עבר אזור ר"נ, נמנע תהלי& הניתוק .לעומת זאת ,בעקבות שינויי פיסיולוגי כגו הזדקנות ,או בעקבות תנאי עקה ,עולה רמת האתיל באזור ר"נ ומושרה תהלי& ההתנתקות ) .(3,12תפקידו המרכזי של אתיל כמשרה תהליכי התנתקות הוכח בעבודות רבות .קשר ישיר בי עלייה בסינטזת אתיל בחנטי מתפתחי ונשירת הודג באבוקדו אפרסק ומנגו ) .(13-15כמו כ ,נמצא כי טיפול באתיל אקסוגני עודד/השרה תהליכי ניתוק ,בעוד שימוש בחומרי המעכבי 3 סינטזת אתיל מנע תהליכי אלו .מחקרי רבי מורי כי לאתיל תפקיד מפתח בהשריית ביטוי גני המקודדי לאנזימי הפעילי בתהלי& הניתוק .כ& לדוגמה נמצא כי ביטוי הגני המקודדי לצלולאזות ופקטינאזות בר"נ עולה בתגובה לאתיל ) .(16-17כמו כ ,דווח כי ביטויי של גני נוספי באזור ר"נ ,כגו גני המקודדי לחלבוני ,PRתלוי ג כ באתיל ) .(11הוצאת לפועל של תהליכי המשרי יצירת ר"נ באזור הניתוק ,תלויה ביכולתו של אזור זה לחוש אתיל .חישה זו תלויה בביטוי ובפעילות רצפטורי לאתיל .רצפטורי לאתיל מקודדי במספר מיני ע"י משפחות גני ,לדוגמא דווח על חמישה גני בארבידופסיס ושישה גני בעגבנייה המקודדי לרצפטורי אתיל שוני ) .(18שפעול של התהליכי המובילי ליצירת ר"נ חל במקביל לעלייה בביטוי ובפעילות אנזימי המעורבי במסלול הסינטזה של אתיל .ככלל סינטזת אתיל תלויה בביטוי הגני המקודדי לאנזימי + ) ACC synthase (ACSו ) .ACC oxidase (ACOבמחקרי שנערכו באפרסק ובתפוח הודג קשר ישיר בי עלייה בסינטזת אתיל בר"נ ,עלייה ברמת השעתוק של הגני ACSו ACO +ונשירת חנטי ופרי ) .(21,22אחד היעדי המאתגרי בחקר תהליכי התנתקות הינו זיהוי גני המקודדי לאנזימי הפעילי בסינטזת אתיל ,ו/או לרצפטור לאתיל המבוטאי באופ דיפרנציאלי בר"נ של עלה או של פרי .מידע זה עשויי להיות בעל ער& חקלאי ועשוי לאפשר בעתיד מניפולציה של תזמו תהלי& הניתוק או השריית/מניעת תהלי& זה ברקמות מסוימות. נשירת חנטי ויצירת ר"נ בעת נשירת חנטי במנגו +למרות חנטה מרובה במנגו ,אחוז הפרי הנותר עד להבשלה נמו& .תהליכי נשירה מתרחשי במהל& כל תקופת התפתחות הפרי ,אול נשירת חנטי מסיבית בשלבי מוקדמי ) 3- 4שבועות( לאחר ההפריה ,הינה הגור המרכזי המשפיע על הקטנת כמות היבול ) .(23-24ידוע כי עוצמת נשירת החנטי במנגו משתנה מז לז ,השונות הקיימת בי זני המנגו מורה כי מרכיב גנטי עשוי להשפיע על תהלי& הנשירה. באר תופעה זו מהווה בעיקר בעיה חקלאית בזני 'קית' )'' ,('Keittקנט' )' ('Kentו'מאיה' )') ('Mayaמיכאל נוי – דיווח אישי( .מספר היבטי הקשורי לתופעת נשירת חנטי במנגו נחקרו בשני האחרונות .בעבודות שנערכו בזני ' :טומי +אטקינס' ו' +קנט' נמצא קשר ישיר בי עלייה בסינטזת אתיל ,בפרי המתפתח ,ובי נשירת חנטי ) .(15במקביל נמצא כי נשירת חנטי מוגברת ,קשורה בירידה בריכוזי אוקסי בפירות המתפתחי ) .(24כאמור, הידע הקיי לגבי התהליכי המולקולרי המתרחשי במנגו במהל& הנשירה בר"נ ובחנט מצומצ ביותר .עד כה שובטו במנגו מספר ESTsהמקודדי ל כאורה ל oxidase ACC +ו ,ACC synthase -ביטויי של ESTsאלו נחקר בעיקר בהקשר לתהלי& הבשלת פרי ,אול אי מידע לגבי תפקוד בתהליכי ניתוק .בנוס ,שובט ממנגו הג METR1 המקודד לרצפטור לאתיל .ג זה הינו הומולוגי לרצפטור ETR1מעגבנייה ,ונמצא,כי כמו בעגבנייה ג במנגו רמת הביטוי של הג עולה במהל& הבשלת פרי ובעקבות פציעה ) .(25תוצאות אנליזת Southernמורות כי ככל הנראה קיימי במנגו גני נוספי המקודדי לרצפטורי לאתיל .למיטב ידיעתנו לא נחקר תפקיד רצפטור METR1 בתהליכי ניתוק וכמו כ לא זוהו במנגו גני נוספי המקודדי לרצפטור לאתיל. .2מטרות המחקר :הצור& במניעת נשירת חנטי ובהעלאת ייבול ,הינו אחד מהיעדי המרכזי בענ המנגו .מספר לא מבוטל של מחקרי נער& עד כה ,באר ובעול ,בכדיי לנסות לפתור בעיה חקלאית זו ע"י יישו חומרי צמיחה ומעכבי שוני .לעומת זאת ,באופ מפתיע ,הידע אודות התהליכי המולקולרי המבקרי את תהלי& הניתוק ונשירת החנטי במנגו ,אשר עשוי לתרו להבנת הבעיה ,הינו מועט .מחקר זה הציע להתמקד בלימוד תהליכי המולקולרי המבקרי את יצירת ר"נ בעת נשירת חנטי במנגו ,נושא שעד כה לא נחקר .מטרות היעד לשנת המחקר הנוכחית היו א .המש& שיבוט של גני המעורבי במסלול החישה והיצירה של אתיל ממנגו ולימוד דג 4 שעתוק במהל& התפתחות ר"נ בעת נשירת חנטי .ב +אפיו השפעת אוקסי על בקרת גני אלו ועל תהלי& היווצרות ר"נ במנגו. .3פירוט עיקרי הניסויי ותוצאות )אפריל 2009אפריל :(2010 א שיבוט מלא של ג! ממנגו המקודד לרצפטור לאתיל! מסוג : ERS1חלבוני המתפקדי כקולטני )רצפטורי( לאתיל הינ חלבוני ממברנלי בה מצויי אתר הקישור לאתיל בקצה ה N +טרמילי של החלבו ואילו בקצהו הקרבוקסילי של החלבו מצויי שני דומיניי עיקריי :דומי המתפקד כ"סנסור" בעל פעילות עצמית של היסטידי קינאז ודומי המתפקד כ"קבל" ,receiverהמבקר את העברת הסיגנל הלאה .ככלל ,הרצפטורי לאתיל מקודדי ע"י משפחת גני הנחלקת לשתי משפחות :רצפטורי דמויי ETR1ורצפטורי דמויי ETR2בעלי מבנה היסטידי קינאז דגנרטיבי ,ERS1 .הינו רצפטור לאתיל הנמנה על משפחת רצפטורי דמויי ,ETR1חלבו זה נבדל מETR1+ מכיוו שאינו מכיל את אזור ה .receiver+בעבודות שנערכו במיני צמחי שוני נמצא כי ל ERS1תפקיד בקרתי ה בתהליכי ניתוק וה בתהליכי הבשלה .כאמור ,עד כה שובט ממנגו הג METR1המקודד לרצפטור לאתיל ונמצא כי רמת ביטויו עולה במהל& הבשלת פרי ובעקבות פציעה ) .(25אי מידע לגבי דג ביטויו ותפקידו האפשרי בתהליכי ניתוק .גני נוספי ממנגו המקודדי לרצפטורי לאתיל עדי לא רוצפו במלוא ולא אופיינו .בכדיי לנסות ולהתחקות אחר רצפטורי נוספי לאתיל ערכנו חיפוש במאגר ,NCBIחיפוש זה הוביל למציאת ESTיחיד ממנגו, המקודד למקטע חלבו המראה הומולוגיה לרצפטור לאתיל .בשנה שעברה דיווחנו כי הגברנו מקטע ESTזה מ+ cDNAוהשלמנו באופ חלקי את ריצו הג בשיטת . 3'RACEבמהל& שנה זו הושל ריצו הג השל ע"י 5'RACE 5 הג השל ששובט על ידינו מקודד לחלבו בעל 629חומצות אמיניות )ח"א( וחולק הומולוגיה של 69-79%ברמת החלבו ע חלבוני ERS1ממיני שוני )איור .(1אנליזות פילוגנטיות שערכנו אימתו ג ה את זהות הגני )לא מוצג( ,בהתא ג זה כונה על ידינו ) .MERS1 (Mangifera ERS1כפי שנית לראות באיור 1חלבו ה ERS1ממנגו מכיל בקצה ה C-טרמינלי את הדומיני His Kinaseו HATPaseהמאפייני רצפטורי לאתיל ובקצהו הN+ טרמינלי שלושה אזורי הידרופובי אשר מהווי לכאורה אזורי חוצי ממברנה .כמו כ החלבו מכיל את ח"א השמורות C4ו C6הנחוצות לצור& קישור דיסולפידי ויצירת חלבו דימרי; ח"א C65 ,I62 ,A31ו A102הדרושות לפעילות תקינה של החלבו ,וח"א השמורה H354העוברת אוטופוספורילציה. ב איפיו! דג הביטוי של MERS1במהל הבשלת פרי ובמהל יצירת ר"נ .לצור& השראת תהליכי ניתוק בוצעו בשנת המחקר הראשונה ניסויי במערכת אקספלנטי מנותקי )ענפוני נושאי חנטי( מהז 'קיט' .הענפוני טופלו ע"י ריסוס בריכוזי אתרל שוני ) (0.1-0.3%בשילוב ע ) .Triton-X (0.05 %נמצא כי הטיפול באתרל ) (0.3%היה האפקטיבי ביותר בהשריית ניתוק חנטי .בבדיקות ראשוניות שערכנו מצאנו כי לאחר הטיפול באתרל חלה עלייה בביטוי הגני המקודדי לרצפטור לאתיל METR1 :ו24 MERS1ש' לאחר הטיפול באתרל ,ה באזור ר"נ ) ,(AZבאזור הסמו& לר"נ ) (NAZובזרעי החנטי ,במקביל לעלייה בביטוי MACS1ו ) MACS2ראה דו"ח קוד(. בהמש& ,בשנה זו ,בכדיי להרחיב את התמונה לגבי אופ ביטוי ,MERS1בדקנו את דג ביטוי הג ג במהל& הבשלת פרי .לצור& הבדיקה נקטפו פירות מעצי מנגו מהזני "קיט" ו"קנט" ואוחסנו ב 20 +מ"צ לפרקי זמ שוני .ייצור האתיל ומידת התרככות הפירות נבדקו בפרקי זמ שוני לאחר קטי .בדיקת ייצור אתיל נערכה בפרות בודדי .כל פרי נאט למש& שעה בצנצנות של 5 ליטר .גז האתיל נדג בעזרת מזרק ונבדק בגז כרומטוגר .כפי שנית לראות באיור ,2הפירות מהז "קנט" הגיעו לרמת התרככות כמעט מלאה בשלב שבירת הצבע ) ,(CBשבעה ימי לאחר קטי .במקביל ,נמדדה עלייה קלימקטרית ברמת ייצור האתיל בפרק זמ זה. בדיקות בז "קיט" הראו וראיביליות גדולה ברמת ייצור האתיל במדג )לא מוצג( ולכ המשכנו באפיו מולקולרי של פירות מז "קנט" בלבד. בדיקת ביטוי הגני המקודדי לרצפטור לאתיל ERS1ו ETR1נבדקה תחילה ע" אנליזת .sq-RT-PCRאנליזת ביטוי הג ברקמת הציפה של הפירות שנדגמו הראתה ביטוי כמעט קונסטיטוטיבי של שני הגני ע עלייה מתונה בביטויי בשלב CB וירידה מסויימת ,או חזרה לרמה בזלית ,לאחר מכ .תוצאות דומות הושגו כאשר האנליזה בוצעה בזרעי הפירות )לא מוצג( 6 איור מס' - 3אנליזת sq-RT-PCRלאפיון ביטוי הגנים METR1ו MERS1בציפת פירות מהזן " קנט" בשלבים שונים לאחר קטיף. MERS1 cDNAאשר סונטז מ RNAשהופק מציפת הפרי, שימש להגברת מקטעי הגנים METR1 ו MERS1-ע"י 30מחזורי PCRולהגברת מקטע הגן MACTע"י 25מחזורי .PCR METR1 MACT ;G- green; CB- color break R-ripen; OR-over ripe OR R CB G בהמש& ערכנו ג אנליזת Northernלבדיקת ביטוי MERS1ברקמת הציפה של הפירות ,בזמני שוני לאחר קטי, ע"י שימוש בפרוב ספציפי מקצה ה 3'UTRשל הג .כביקורת ,באותה ממברנה הוספו דוגמאות מאזור ר"נ ),(AZ מהאזור הסמו& לר"נ ) (NAZומזרעי החנטי ,לפני ואחרי השראת ניתוק ע"י אתרל )ראה דו"ח קוד( .להפתעתינו התוצאות שקיבלנו באנליזה זו לא תאמו לתוצאות אנליזת ה sq-RT-PCR +המודגמת באיור .3כפי שנית ביטויו של MERS1עלה בצורה חדה ה באזור ר"נ ,ה באזור הסמו& לרקמת הניתוק ובמידה מסויימת ג כ ברקמת הזרע של החנטי לאחר הטיפול באתרל )איור .(4אול ,לא נצפתה כלל עלייה ברמת ה mRNA+עבור MERS1במהל& הבשלת פרי .מכייו שתוצאות אנליזות הNorthern+ מספקות אינפורמציה רבה יותר אנו עורכי חזרות נוספות בכדיי לבסס או לסתור תוצאות אלו. ג השריית ניתוק חנטי ע"י טיפול באתיל! .כאמור שלבי עבודה הראשוניי שביצענו בשנה החולפת איפשרו קביעת תנאי טיפול אופטימלי לצור& השריית תהליכי ניתוק ע"י ריסוס באתרל .אתרל הינו חומר אשר לאחר קליטתו ע"י הצמח מתפרק לאתיל ,חומצה הידרוכלורית ולפוספאט .האתיל המופרש ,לאחר פירוק האתרל ,עשוי להשרות תהליכי ניתוק ואמנ מתוצאות הניסויי שערכנו נית היה להסיק כי הטיפול באתרל הינו אפקטיבי לצור& השריית ר"נ במערכת האקפלנטי .בר ,אחת הבעיות בשימוש באתרל בניסויי כגו אלו ,הינה העובדה כי הוא ממשי& להתפרק לאור& זמ ולכ מדידות אתיל לאחר טיפול אינ משקפות בהכרח יצירת אתיל אנדוגני .בכדיי להתגבר על מכשול זה ובכדיי לבדוק קורלציה בי עלייה בביטוי אתיל אנדוגני )הנוצר ע"י החנטי( וביטוי גני המשתתפי בסינטזת אתיל ובקליטתו במהל& יצירת ר"נ ,ערכנו ניסויי במתוכנת שונה .במסגרת זו הזרקנו אתיל )(100 ppm למערכת סגורה שבה הושמו ענפוני נושאי חנטי מהז 'קנט' .לאחר 12ש' באווירה רוויות אתיל הועברו הענפוני לחדר אחסו ,נקודת זמ זו הוגדרה כזמ אפס .בדיקות אינדקס הצמדות חנטי וקביעת רמת האתיל אנדוגני, המופרש ע"י החנטי ,בוצעו בהמש& .בדיקת ייצור אתיל נערכה בענפוני בודדי נושאי חנטי ,כל ענפו נאט למש& שעה בצנצנות קטנות ) 0.5ליטר( וגז האתיל נבדק בגז כרומטוגר .התוצאות מוצגות באיור .5כפי שנית לראות ,טיפול בגז אתיל גר לניתוק מסיבי של חנטי ) (98%לעומת ביקורת 72ש' לאחר הטיפול .במקביל ,נצפתה 7 עלייה ברמת האתיל האנדוגני ,המופרש ע"י החנטי 24 ,ש' לאחר טיפול .במערכת הביקורת לא חלו שינויי מובהקי ברמת האתיל האנדוגני המופרש .לאחר העמדת מערכת הניסוי החדשה הועמד ניסוי במתכונת דומה בקנה מידה גדול שכלל כ 250 +ענפוני נושאי חנטי )בביקורת ובטיפול( .מניסוי זה דגמנו בזמ אפס לאחר 24ו 48ש' ,רקמות מאזור ר"נ ) ,(AZומרקמת הציפה והזרע של החנטי .הרקמות הוקפאו בחנק נוזלי ושימשו להפקת .RNA RNAשהופק מאות דוגמאות ,היה אמור לשמש לבדיקת ביטויי של הגני המקודדי לקולטני אתיל ושל ההגני המשתתפי בסינטזת אתיל, באנליזת ב .real-time PCRבשל בעיות טכניות אי בידינו תוצאות מאות בדיקות ואנו חוזרי כעת על הבדיקות. ד .אפיו! השפעת אוקסי! על תהלי היווצרות ר"נ במנגו ובאבוקדו– העמדת מערכת המחקר לצור& לימוד השפעת אוקסי על תהלי& היווצרות ר"נ במנגו ,הצענו בתוכנית המחקר המקורית לרסס ענפוני נושאי חנטי באוקסי סינטטי )בתכשיר המסחרי הדרונל( או לחילופי בטריפטופ ,חומצה אמינית המהווה פרקוסור לאוקסי .יש לציי כי לאחרונה דווח על שימוש בטריפטופא לצור& מניעת נשירת חנטי ו/או לצור& הגדלת פרי וייבול במספר גידולי חקלאיי .כמו כ ,כא המקו לציי כי בעבודת מחקר אשר אנחנו מבצעי באבוקדו 'האס' )במסגרת תוכנית מדע (203+0708מצאנו כי יישו טריפטופא בסו פריחה הראה אפקט בולט )בריכוזי של ,20 80 ,50ח"מ( ,השפיע באופ חיובי וגר לעלייה ברמת הייבול .תוצאות הניסויי שביצענו באבוקדו הצביעו על כ& שהגדלת היבול לאחר יישו טריפטופא לא חלה כתוצאה מהגדלת גודל הפירות ,כי א כתוצאה ממניעת נשירה חנטי מיד לאחר פריחה .בעקבות ממצאי חיובי אלו ,החלטנו להתמקד בבחינת השפעת טיפולי טריפטופא בריכוזי שוני על נשירת חנטי ועל תהלי& היווצרות ר"נ ג במנגו .הניסויי בוצעו בהיק מצומצ במערכת אקפלנטי מנותקי מהז "קנט" .במקביל העמדנו מערכת ניסוי באבוקדו באקפלנטי מנותקי מהז "האס". הניסויי בוצעו באופ הבא :בחלק מהענפוני נושאי החנטי בוצע ריסוס מקדי בטריפטופא ) (50 ppmולאחר 24ש' רוססו הענפוני באתרל בכדיי להשרות תהליכי ניתוק .ענפוני נושאי חנטי אשר לא רוססו כלל )לא בטריפטופא ולא באתרל( שימשו כ"מערכת ביקורת פנימית" .בכדיי לקבוע את מדד הצמדות החנטי ,נספרו החנטי הנותרי על הענפוני .באיור 6מוצגות תוצאות הניסוי. 8 כפי שנית לראות ,טיפולי הטריפטופא המקדי מנעו במידה מסויימת נשירת חנטי אשר הושרתה ע"י אתרל 96 .ש' לאחר הטיפול המקדי בטריפטופא נמדדו 50%נשירה לעומת 35%נשירת חנטי במנגו ,ו 50%נשירה לעומת 27% באבוקדו. בטיפול ה"ביקורת" נשירת החנטי לאחר 96ש' הייתה נמוכה ביותר ) ( >5%ומכא נית להסיק כי השפעת קטי הענפוני מהע על השריית יצירת ר"נ הייתה זניחה. בימי אלו אנו מבצעי ניסויי במתכונת דומה ,בקנה מידה גדול יותר ,המלווי בדגימת רקמות מאזור ר"נ ) ,(AZומרקמת הציפה והזרע של החנטי. .4דיו! וכיווני עבודה עתידי המתכונני לעונה הבאה א לימוד דג השעתוק של ג! ממנגו המקודד לקולט! לאתיל! מסוג ERS1במהל התפתחות ר"נ בעת נשירת חנטי :אנו מדווחי כא על שיבוטו המלא של ג ממנגו ) (MERS1החולק הומולוגיה גבוהה ע גני המקודדי לקולט לאתיל מסוג ERS1במיני צמחי שוני .בכדיי לבדוק את הארגו הגנומי של MERS1הוגבר הג מדנ"א שהופק מעלי באמצעות פרימרי מקצה ' 3וקצה ' .5אנו מסיימי כעת את ריצו האינטרוני והאקסוני שבג ובהמש& נבצע אנליזת Sothernבכדיי לקבוע הא הג מופיע כעותק יחיד או כנציג של משפחת גני. כמצויי במבוא ,על פי הספרות לג זה תפקיד בקרתי ה בהשריית תהליכי ניתוק וה במהל& הבשלת פרי .אנליזות קודמות שערכנו הראו כי לאחר טיפול באתרל התעתק של ג זה ושל ג נוס המשמש כקולט לאתיל ),( METR1 עולי לאחר הטיפול באתרל ה באזור ר"נ ,באזור הסמו& לרקמת הניתוק ובזרעי החנטי .ממצאי אלו מרמזי כי לשני הרצפטורי תפקיד בקרתי בהשריית תהלי& ניתוק במנגו בעת נשירת חנטי. על פי הספרות ,רצפטורי לאתיל פועלי כהומודימרי ) ETR1:ETR1לדוגמה( אשר בהעדר אתיל נמצאי במצב "אקטיבי" ) .(18מצב זה גורר זרחו של חלבו דמויי Raf-kinaseהמכונה CTR1הפועל כבקר שלילי של תגובות לאתיל .קישור אתיל לרצפטורי מונע את פעילות הרצפטורי ואת פעילות CTR1וע"י כ& מתאפשרת התגובה האופיינית לאתיל .באופ מעניי ,בעבודה שנערכה לאחרונה בארבידופסיס דווח כי רצפטורי לאתיל עשויי לפעול ג כ כהטרודימרי )לדוגמה , (26)(ETR1:ERS1ממצא זה עשויי להסביר את הצור& בביטויי של מספר גני 9 המקודדי לרצפטורי לאתיל ,בהשריית יצירת ר"נ .בכדיי להרחיב את התמונה לגבי אופ פעילותו של ERS1 בדקנו ג כ את אופ ביטוי הג במהל& הבשלת פרי .התוצאות שקיבלנו ע"י אנליזת sq-RT-PCRהראו ביטוי כמעט קונסטיטוטיבי של MERS1ע עלייה מתונה בשלב שבירת הצבע ,שלב בו נמדדה עלייה ברמת האתיל המופרש ע"י הפרי .מאיד& תוצאות אנליזת Northernהראו תמונה שונה ,לפי אנליזה זו ,רמת הג המקודד ל MERS1אינה עולה במהל& הבשלת פרי ,זאת לעומת עלייה ניכרת בבטוי הג בר"נ לאחר השראת תהליכי ניתוק ע"י אתרל .התוצאות שהתקבלו באנליזת Northernיכולות להצביע על ביטוי דיפרנציאלי של MERS1במהל& יצירת ר"נ ובמהל& הבשלה, אול יש לערו& ביקורת נוספות הכוללת נרמול התגובה ע פרוב כנגד 18srRNAוהגבה ע פרוב כנגד ,METR1 אשר ידוע כי ביטויו עולה במהל& הבשלת פרי .אנו עורכי אנליזות אלו בימי אלו. ב השריית ניתוק חנטי ע"י טיפול באתיל! .בכדיי לבדוק קורלציה בי עלייה בביטוי אתיל אנדוגני )הנוצר ע"י החנטי( וביטוי גני המשתתפי בסינטזת אתיל ובקליטתו במהל& יצירת ר"נ הושרו תהליכי ניתוק במערכת של אקספלנטי מבודדי ע"י טיפול באתיל )ולא באתרל( .טיפול ב 100 ppm +אתיל נמצא אפקטיבי בהשריית תהליכי ניתוק .בדיקות אתיל שערכנו עומדות בקנה אחד ע תוצאות שפורסמו בספרות ) (15המורות כי לאחר טיפול באתיל חיצוני ,חלה עלייה בהפרשת אתיל מחנטי הפרי המובילה להשראת תהליכי ניתוק חנטי .כאמור ,בשל בעיות טכניות עדי אי בידינו תוצאות של אנליזת דג הביטוי של הגני המקודדי ל METR1 , MERS1ולגני המקודדי ל ASC 1-2במערכת זו ואנו מקווי כי במש& השנה נשלי אנליזה זו. ג שיבוט גני נוספי ממנגו המשתתפי בהעברת סיגנל האתיל! .ניסנו לשבט ע"י שימוש בפרימרי דגנרטיבי גני נוספי ממנגו המשתתפי בהעברת סיגנל האתיל כגו ג המקודד ל ,CTR1ניסיונות אלו לא צלחו .כמו כ לא הצלחנו לשבט מקטע ג המקודד ל .ACO+ניסיונות לשיבוט של גני אלו ימשיכו בשנה הבאה .אנו מודעי לכ& כי חוסר ההצלחה בשיבוט גני אלו מעכב את הבנת התמונה הכללית. ד .אפיו! השפעת אוקסי! על תהלי היווצרות ר"נ במנגו ובאבוקדו– העמדת מערכת המחקר .כפי שצויי במבוא ידוע כי בעוד אתיל משרה את תהלי& ההתנתקות ,אוקסי מעכב תהלי& זה .בהתא ,בניסוי שערכנו במנגו מהז 'קנט' ,הראנו כי טיפול מקדי בטריפטופא ,פרקוסור של אוקסי ,מנע במידה מסויימת נשירת חנטי אשר הושרתה ע"י אתרל .אפקט דומה וא דומיננטי יותר נמצא כאשר הניסוי בוצע במערכת של אקספלנטי מנותקי באבוקדו מז 'האס' )איור .(6אנו מבצעי כעת ניסויי במתכונת דומה ,בקנה מידה גדול יותר ,המלווי בדגימת רקמות מאזור ר"נ ) ,(AZומרקמת הציפה והזרע של החנטי .הניסויי ייערכו במקביל ג במנגו וג באבוקדו. ההחלטה לעבור ולעבוד בנושא זה במקביל ג כ באבוקדו התבצעה בשל העובדות הבאות :א .ג באבוקדו כמו במנגו נמצא קשר ישיר בי עלייה בסינטזת אתיל ,בפרי המתפתח ,ובי נשירת חנטי ) (15 ,13ב .בניגוד למצב הקיי במנגו ,הגני המעורבי בסינטזת אתיל והגני הקשורי במעבר האותות באבוקדו ידועי ואי צור& לשבט תחילה ג .דג ביטויי של גני אלו נחקר באופ מקי בשני האחרונות בפרי אבוקדו במהל& הבשלה במעבדתה של ד"ר עדנה פסיס ) ,(27+28אול אי מידע לגבי אופ ביטויי ביצירת ר"נ בנשירת חנטי. אנו סבורי כי החלטה זו תאפשר להעמיק את הידע אודות בקרת תהליכי יצירת ר"נ הגורמת לנשירת חנטי מוקדמת בגידולי סובטרופי. 10 רשימת ספרות מצוטטת 1- Bonghi C, Ramina A (2000) Biochemical and molecular aspects of fruitlet abscission. Plant Growth Regulation 31: 35-42. 2- Roberts JA, Elliott KA, Gonzalez-Carranza ZH (2002) Abscission, dehiscence, and other cell separation processes. Annu Rev Plant Biol 53: 131-158. 3- Taylor JE, Whitelaw CA (2001) Signals in abscission. New Phytologist 151: 323-339. 4- Greenberg J, Goren R, Riov J (1975) The role of cellulase and polygalacturonase in abscission of young and mature Shamouti orange fruit. Plant Physiol 34: 1-7. 5- Pandita VK, Jindal KK (1991) Enzymatic and anatomical changes in abscission zone cells of apple fruit induced by etephon. Biol. Plant 33: 20-25. 6- Bonghi C, Rascio N, Ramina A, Casadoro G (1992) Cellulase and polygalacturonase involvement in the abscission of leaf and fruit explants of peach. Plant Mol Biol 20: 839-848. 7- Cho HT, Cosgrove DJ (2000) Altered expression of expansin modulates leaf growth and pedicel abscission in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 9783-9788. 8- Belfield EJ, Ruperti B, Roberts JA McQueen-Mason S (2005) Changes in expansin activity and gene expression during ethylene-promoted leaflet abscission in Sambucus nigra. J Exp Bot 56: 817-823. 9- Coupe SA, Taylor JE Roberts JA (1995) Characterization of an mRNA encoding a metallothionein-like protein that accumulates during ethylene-promoted abscission of Sambucus nigra L. leaflets. Planta 197: 442-447. 10- Ruperti B, Cattivelli L, Pagni S, Ramina A (2002) Ethylene-responsive genes are differentially regulated during abscission, organ senescence and wounding in peach (Prunus persica). J Exp Bot 53: 429-437. 11- Eyal Y, Meller Y, Lev-Yadun S, Fluhr R (1993) A basic-type PR-1 promoter directs ethylene responsiveness, vascular and abscission zone-specific expression. Plant J 4: 225-234. 12- Sexton R, Roberts JA (1982) Cell biology of abscission. Annu Rev Plant Physiol 33: 133-162. 13- Davenport TL, Manners M (1983) Nucellar senescence and ethylene production as they related to avocado fruitlet abscission. J Exp Bot 33: 815-825. 14- Miller AN, Krizek BA, Walsh CS (1988) Whole fruit ethylene evolution and ACC content. J Amer Soc Hort Sci 113: 119-124. 15- Nunez-Elisea R, Davenport TL Mango fruitlets abscission as influenced by enhanced ethylene biosynthesis. Plant Physiol 82: 991-994. 11 16 - Kalaitzis P, Solomos T, Tucker ML (1997) Three different polygalacturonases are expressed in tomato leaf and flower abscission, each with a different temporal expression pattern. Plant Physiol 113: 1303-1308. 17- del Campillo E, Bennett AB (1996) Pedicel breakstrength and cellulase gene expression during tomato flower abscission. Plant Physiol 111: 813-820. 18 –Wang KL, Li H, Ecker JR (2002) Ethylene biosynthesis and signaling networks. Plant Cell S: 131-151 19- Payton S, Fray RG, Brown S, Grierson D (1996) Ethylene receptor expression is regulated during fruit ripening, flower senescence and abscission. Plant Mol Biol 217: 131-137. 20- Rasori A, Ruperti B, Bonghi C, Tonutti P, Ramina A (2002) Characterization of two putative ethylene receptor genes expressed during peach fruit development and abscission. J Exp Bot 53: 2333-2339. 21- Dal Cin V, Danesin M, Boschetti A, Dorigoni A, Ramina A (2005) Ethylene biosynthesis and perception in apple fruitlet abscission (Malus domestica L. Borck). J Exp Bot 56: 2995-3005. 23- Singh Z, Agrez V (2002) Fruit set, retention and yield of mango in relation to ethylene. Acta Hort 575: 805-811. 24- Singh Z, Malik AU, Davenport TL (2005) Fruit drop in mango. Horticultural Reviews 31: 111153 25- Gutierez-Martinez P, Lopez-Gomez R, Gomez-Lim MA (2001) Identification of an ETR1homologue from mango fruit expressing during fruit ripening and wounding. J.Plant Physiol. 158: 101-108. 26- Geo Z, Wen CK, Binder BM, Chen YF, Chang J, Chiang YH, Kerris RJ, Chang C and Schaller GE (2008) Heteromeric interactions among ethylene receptors mediate signaling in Arabidopsis. J Biol Chem 283: 23801-23810. 27- Hershkovitz V, Friedman H, Goldscmidt EE, Feygenberg and Pesis E (2009). The role of the embryo and ethylene in avocado fruit mesocarp discoloration. J Exp Bot 60:791-799. 27- Hershkovitz V, Friedman H, Goldscmidt EE, and Pesis E (2009). Induction of ethylene in avocado fruit in response to chilling stress on tree. J. Plant Physiol. 166: 1855-1862. 12 סיכו ע שאלות מנחות נא להתייחס לכל השאלות בקצרה ולעניי ,ב 3+עד 4שורות לכל שאלה )לא תובא בחשבו חריגה מגבולות המסגרת המודפסת(. שיתו הפעולה של& יסייע לתהלי& ההערכה של תוצאות המחקר. הערה :נא לציי הפנייה לדו"ח א נכללו בו נקודות נוספות לאלה שבסיכו. מטרות המחקר תו התייחסות לתוכנית העבודה :מחקר זה הציע ללמוד את השינויי המולקולרי המתרחשי במהל& היווצרות ר"נ בעת נשירת חנטי במנגו .מטרות היעד לשנת המחקר הנוכחית היו א .המש& שיבוט של גני המעורבי במסלול החישה והיצירה של אתיל ממנגו ולימוד דג שעתוק במהל& התפתחות ר"נ בעת נשירת חנטי .ב +אפיו השפעת אוקסי על בקרת גני אלו ועל תהלי& היווצרות ר"נ במנגו. עיקרי הניסויי והתוצאות :המחקר בוצע במערכת אקספלנטי מנותקי )ענפוני נושאי חנטי( מהז 'קנט' והשריית תהליכי ניתוק בוצעה ה ע"י טיפולי באתרל וה ע"י טיפול בגז אתיל .במסגרת העבודה בשנה החולפת שיבטנו באופ מלא ג ממנגו המקודד לקולט לאתיל מסוג .ERS1הג מקודד לחלבו בעל 629חומצות אמיניות )ח"א( וחולק הומולוגיה של 69-79%ברמת החלבו ע חלבוני ERS1ממיני צמחי שוני ,בהתא כונה ג זה על ידינו .MERS1 בדיקות לבחינת דג ביטוי הג ה במהל& יצירת ר"נ וה במהל& הבשלת פרי מעידות כי ג זה עשוי לשחק תפקיד מרכזי בעיקר במהל& יצירת ר"נ ,ולאו דווקא במהל& הבשלת פרי ,אול כפי שמצויי בדיו עדי יש צור& בביסוס התוצאות הנ"ל .לצור& בחינת השפעת אוקסי על מהל& יצירת ר"נ ,ערכנו ניסיונות בה בוצע טיפול מקדי בטריפטופא ,פרקורסור של אוקסי ,לפני השריית תהליכי ניתוק .תוצאותינו הראו כי טיפול זה מנע במידה מסויימת נשירת חנטי ,אשר הושרתה ע"י אתרל ,ה במנגו וה באבוקדו .ההחלטה לעבוד בנושא זה במקביל ג במנגו וג באבוקדו מנומקת בהמש&. מסקנות מדעיות וההשלכות לגבי יישו המחקר והמשכו .הא הושגו מטרות המחקר לתקופת הדוח? מטרות המחקר אשר הוצבו לתקופת הדוח הושגו באופ חלקי .עדי אי מסקנות מדעיות חד משמעיות – יש צור& בביסוס נוס של התוצאות .השלכות יישומיות לגבי יישו טיפול טריפטופא למניעת נשירת חנטי תיתכנה ,אול יש לציי כי אופיו של המחקר אינו יישומי בעיות שנותרו לפתרו! ו/או שינויי )טכנולוגיי ,שיווקיי ואחרי( שחלו במהל העבודה; התייחסות המש המחקר לגביה! ,הא יושגו מטרות המחקר בתקופה שנותרה לביצוע תוכנית המחקר? א .יש עדי צור& לבסס את התוצאות שהתקבלו כפי שמצויי בדיו. ב .היק המטרות שהוצג בתוכנית המחקר המקורית היה רחב מאוד – ובהתא צמצמו את מטרות המחקר. ג .בשל חוסר ההצלחה בשיבוט גני נוספי ממנגו המעורבי במסלול החישה והיצירה של אתיל )כדוגמת (CTR1הוחלט לעבור ולעבוד במקביל ג באבוקדו בנושא זה וזאת בשל העובדות הבאות :א .ג באבוקדו כמו במנגו נמצא קשר ישיר בי עלייה בסינטזת אתיל ,בפרי המתפתח ,ובי נשירת חנטי ב .בניגוד למצב הקיי במנגו ,הגני המעורבי בסינטזת אתיל והגני הקשורי במעבר האותות באבוקדו ידועי ואי צור& לשבט תחילה ג .דג ביטויי של גני אלו נחקר באופ מקי בשני האחרונות בפרי אבוקדו במהל& הבשלה אול אי מידע לגבי אופ ביטויי ביצירת ר"נ בנשירת חנטי. אנו סבורי כי החלטה זו תאפשר להעמיק את הידע אודות בקרת תהליכי יצירת ר"נ הגורמת לנשירת חנטי מוקדמת בגידולי סובטרופי. הפצת הידע שנוצר בתקופת הדו"ח :פרסומי בכתב ציטט ביבליוגרפי כמקובל בפרסו מאמר מדעי; פטנטי יש לציי! ש ומס' פטנט; הרצאות וימי עיו! יש לפרט מקו ,תארי ,ציטוט ביבליוגרפי של התקציר כמקובל בפרסו מאמר מדעי. אי עדי פרסומי בנושא ,מאמר קצר נמצא בשלב הכנה. Ish-Shalom, M, Dahan, Y and Irihimovitch V. Molecular cloning of Mangifera indica L. cDNA encoding an ERS1-homologue. (Short communication – in preparation). פרסו הדוח :אני ממלי לפרס את הדוח) :סמ אחת מהאופציות( רק בספריות ללא הגבלה )בספריות ובאינטרנט( חסוי – לא לפרס ממליצה עדי! לא לפרס הא בכוונת& להגיש תוכנית המש& בתו תקופת המחקר הנוכחי? כ* +לא – לא במנגו ,ייתכ שתוגש תוכנית באבוקדו. *יש לענות על שאלה זו רק בדוח שנה ראשונה במחקר שאושר לשנתיי ,או בדוח שנה שניה במחקר שאושר לשלוש שני 13 14
© Copyright 2024